ES2320281T3 - Gen amds de aspergillus niger que codifica para una acetamidasa. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION DESCRIBE NUEVOS GENES AMDS PROCEDENTES DE HONGOS, EN LOS CUALES NO SE CONOCIA ANTERIORMENTE LA PRESENCIA DE UN GEN AMDS, COMO ASPERGILLUS NIGER Y PENICILLIUM CHRYSOGENUM. LOS NUEVOS GENES AMDS, SE PUEDEN UTILIZAR COMO GENES MARCADORES SELECCIONABLES HOMOLOGOS, EN LA TRANSFORMACION DE DICHOS HONGOS. ALTERNATIVAMENTE, LOS GENES AMDS CLONADOS, SE PUEDEN UTILIZAR PARA INACTIVAR LA COPIA ENDOGENA DEL GEN, CON EL FIN DE REDUCIR EL RUIDO DE FONDO EN LOS EXPERIMENTOS DE TRANSFORMACION.
Description
Gen amdS de Aspergillus niger que
codifica para una acetamidasa.
La presente invención se relaciona con el campo
de la biología molecular, en particular la invención está
relacionada con los genes marcadores de selección para ser usados en
la transformación de organismos.
El gen amdS de Aspergillus
nidulans es probablemente el marcador de selección más
frecuentemente usado para la transformación de hongos filamentosos
y ha sido aplicado en la mayoría de los hongos filamentosos con
importancia industrial tales como por ejemplo, el Aspergillus
niger (Kelly y Hynes 1985, EMBO J. 4:
475-479), Penicillium chrysogenum (Beri y
Turner 1987, Curr. Genet. 11:
639-641), Trichoderma reesei
(Pentillä y otros. 1987, Gene 61: 155-164,
Aspergillus oryzae (Christensen y otros 1988, Bio/technology
6: 1419-1422) y Trichoderma harzianum
(Pe'er y otros 1991, Soil Biol. Biochem. 23:
1043-1046.
La popularidad del gen amds como marcador
de selección es lo probablemente un resultado del hecho de que este
es el único gen marcador no antibiótico disponible que puede ser
usado como marcador de selección dominante en la transformación de
hongos. Los marcadores de selección dominantes proporcionan la
ventaja de que pueden ser usados directamente en cualquier cepa sin
el requerimiento para las cepas receptoras mutantes. Los genes con
resistencia a los antibióticos no son, sin embargo, preferidos para
ser usados en las cepas industriales porque las autoridades
regulatorias en la mayoría de los países objetan el uso de los
marcadores antibióticos en vista de los riesgos potenciales de la
diseminación de los genes con resistencia a los antibióticos en la
biosfera debido al uso a gran escala de cepas para la producción que
portan tales genes.
El gen amdS ha sido usado como un
marcador dominante incluso con hongos que se sabe que contienen un
gen amdS endógeno, es decir, A. nidulans (Tilburn y
otros 1983, Gene 26: 205-221) y A.
oryzae (Gomi y otros 1991, Gene 108:
91-98). En estos casos el fondo de los no
transformantes se puede eliminar por la inclusión de ClCs en el
medio de selección. Además, los transformantes de alto número de
copias son proporcionados con una ventaja para crecer sobre los no
transformantes (cuando la acetamida es la única fuente de nitrógeno)
debido a la mayor dosificación de genes.
Además de los genes amdS de A. nidulans y
A. oryzae, por casualidad se encontró una secuencia en el
genoma de levadura Saccharomyces cerevisiae, la cual muestra
homología con el gen amdS de A. nidulans (Chang y
Abelson 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7180). La secuencia
similar a amdS se encontró que no era esencial para la
levadura. Sin embargo no se conoce si el gen de levadura similar a
amdS realmente codifica una proteína con actividad amidasa
lo cual permitiría usar el gen como marcador de selección. Los genes
amdS no se han encontrado en otros hongos, a pesar de los
intentos por detectar tales genes mediante la hibridación
heteróloga usando el gen amdS de A. nidulans como sonda (ver
por ejemplo Kelly y Hynes 1985 EMBO J.
4:475-479). Esto concuerda con la
observación de que, en contraste con A. nidulans y A. oryzae,
la mayoría de los hongos crecen muy poco, o nada, en acetamida (ver
por ejemplo Beri y Turner 1987, Curr. Genet. 11:
639-641; Pentillä y otros 1987, Gene 61:
155-164. La clonación y la secuenciación de dos
genes bacterianos con actividad acetamidasa ha sido reportado, es
decir, aquellos de Pseudomonas aeruginosa (Brammar y otros
1987, FEBS Lett. 215: 291-294) y de
Mycobacterium smegatis (Mahenthiralingam y otros 1993, J.
Gen. Microbiol. 139: 575-583). Sin embargo
estas acetamidasas bacterianas parecen no estar relacionadas con las
acetamidasas fúngicas antes mencionadas ya que no se han podido
detectar similitudes de secuencias y las acetamidasas bacterianas
son también mucho más pequeñas que sus contrapartidas fúngicas. No
han aparecido reportes sobre el uso de estas acetamidasas
bacterianas como marcadores de selección.
Además de su carácter dominante, el marcador de
selección amdS proporciona la ventaja de ser un marcador
bidireccional. Esto significa que conjuntamente con la selección
positiva para la presencia del gen amdS usando acetamida
como única fuente de nitrógeno y carbono, se puede aplicar una
contra selección usando fluoracetamida para seleccionar contra la
presencia del gen amdS (Hynes y Pateman 1970, Mol. Gen.
Genet. 108: 107-106). La contra selección
con fluoracetamida ha sido aplicada para curar cepas genéticamente
manipuladas a partir de construcciones recombinantes que portan el
gen amdS (por ejemplo, Ward y otros 1993, Appl. Microbiol.
Biotechnol. 39: 738-743).
Una desventaja del marcador amdS es el
hecho de que el gen amdS de A. nidulans es un gen
heterólogo en hongos industriales tales como A. niger, A.
oryzae, T. reesei y P. chrysogenum. Aunque esto puede
parecer trivial para la mayoría de los biólogos moleculares, las
autoridades regulatorias a menudo objetan que cepas de producción
que contienen el gen amdS de A. nidulans poseen una
nueva (el gen es heterólogo) e innecesaria (el gen marcador no es
necesario una vez que se ha obtenido la cepa transformada)
propiedad, cuyos riesgos no se puede prever. Desafortunadamente el
único hongo filamentoso industrial para el cual un gen amdS
homólogo está disponible es A. oryzae.
Hemos abordado previamente este problema
desarrollando un método para obtener cepas de producción fúngicas
recombinantes que están libres de marcadores de selección
(EP-A-O 635 574). En este método la
bidireccionalidad del marcador amdS es usada para eliminar
el marcador de casetes de expresión especialmente construidos una
vez que estos han sido introducidos en el genoma fúngico. El método
es, sin embargo, menos compatible con los de alto número de copias
los cuales a menudo son necesarios en las cepas de producción
industrial. Debido a estas situaciones, un marcador de selección
dominante y homólogo pudiera aún ser requerido.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención revela nuevas secuencias
de ADN que codifican genes de acetamidasas de otros hongos aparte
de Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae y Saccharomyces
cerevisiae.
La invención también revela construcciones de
ADN recombinante que comprenden secuencias de ADN que codifican las
acetamidasas de la invención, así como células recombinantes que
contienen estas construcciones.
La invención además revela células recombinantes
en las cuales se ha inactivado una copia endógena del gen que
codifica para la acetamidasa de la invención.
En una realización adicional, la invención
revela un proceso en el cual las células recombinantes de la
invención se cultivan con el propósito de obtener un producto de
interés.
Finalmente, la invención revela métodos para
obtener los genes de acetamidasa de la invención, así como métodos
para la inactivación de copias endógenas de estos genes de
acetamidasas.
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- Comparación de los aminoácidos de fragmentos de consenso internos de amdS de los genes amdS de A. nidulans, A. oryzae, S. cerevisiae, A. niger y P. chrysogenum.
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- Identidades posicionales de los aminoácidos entre cada uno de los fragmentos de consenso internos de amdS de la Figura 1A.
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- Mapa de restricción parcial del clon de fago \lambdaAMD-1 y los subclones pGBAMD-2, pGBAMD-3 y pGBAMD-4.
Las abreviaturas usadas para las enzimas de
restricción:
- \quad
- B=BamHI, X=XbaI, P=PstI, S=SmaI, Sp=SpeI, K=KpnI, E=EcoRI.
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- Digesto con BamHI de dos transformantes pGBAMD-4 (carriles 1 y 2) de dos transformantes pGBAMD-3 (carriles 3 y 4) y de la cepa parental A. niger CBS 513.88 (carril 5) sondado con un fragmento EcoRI/BamHI marcado con ^{32}P aislado de pGBAMD-1.
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- Muestra de manera esquemática el vector pGBAMD-11 de reemplazo del gen amdS.
Las abreviaturas usadas para las enzimas de
restricción:
- \quad
- B=BamHI, Sp=SpeI, K=KpnI, E=EcoRI, S=SmaI, N=NotI, H=HindIII.
\vskip1.000000\baselineskip
Varios de los términos usados en la presente
descripción y reivindicaciones son definidos de la siguiente
manera.
El término gen es aquí definido como una
secuencia de ADN que codifica un polipéptido, independientemente de
si la secuencia de ADN es un ADNc o una secuencia de ADN genómico la
cual puede contener uno o más intrones.
\newpage
El termino gen del marcador de selección
(o gen del marcador seleccionable) es aquí definido como un gen que
codifica un polipéptido que proporciona un fenotipo a las células
que contienen dicho gen de manera que el fenotipo permita tanto
positiva como negativamente la selección o cribado de las células
que contienen el gen del marcador de selección. El gen del marcador
de selección puede ser usado para distinguir entre células
transformadas y células no transformadas o puede ser usado para
identificar las células que han experimentado recombinación u otros
tipos de modificaciones genéticas.
Una acetamidasa es aquí definida como una
enzima que es capaz de catalizar la hidrólisis de la acetamida en
ácido acético y amoniaco, y/o la cual es capaz de catalizar la
hidrólisis de compuestos de amidas relacionados tales como
acrilamida o aminoácidos \omega.
Un gen amdS es aquí definido como un gen,
el cual se obtiene preferiblemente de eucariotas, más
preferiblemente de un hongo, y el cual codifica para un polipéptido
que es una acetamidasa tal como se definió anteriormente.
Preferiblemente un gen amdS muestra una similitud de
secuencia con uno o más de los tres genes amdS conocidos en
el arte, es decir, el gen amdS de A. nidulans, A.
oryzaeo el gen similar a amdS de S. cerevisiae.
Una descripción más exacta de la similitud de secuencia mediante el
uso de la identidad posicional de aminoácidos de un fragmento
consenso interno de amdS es proporcionada a continuación. Un
gen amdS codifica preferiblemente una proteína de alrededor
de 500 a 600 aminoácidos, más preferiblemente de alrededor de 520 a
570 aminoácidos y lo más preferiblemente de alrededor de 540 a 550
aminoácidos. Un gene amdS por lo tanto está contenido
generalmente dentro de un fragmento de ADN de alrededor de 2.0 kb.
Por supuesto que la presencia de intrones en un gen amdS
genómico puede incrementar la longitud hasta por ejemplo alrededor
de 2.5 kb o más.
El término gen homólogo es aquí definido
como un gen que se obtiene de una cepa que pertenece a la misma
especie, incluyendo variantes de estas, que la cepa que contiene
realmente el gene. Preferiblemente, las cepas donantes y aceptoras
son idénticas. Debe ser entendido que lo mismo aplica para los
polipéptidos codificados por genes homólogos. Los fragmentos y
mutantes de genes también son considerados homólogos cuando el gen a
partir del cual se derivan los fragmentos o los mutantes es un gen
homólogo. También las combinaciones no naturales de secuencias
regulatorias y secuencias de codificación se consideran homólogas
siempre y cuando la secuencia de codificación sea homóloga. Sigue
que el término heterólogo aquí se refiere a los genes o polipéptidos
para los cuales las cepas donantes y aceptoras no pertenecen a la
misma especie o variantes de esta.
El término endógeno es aquí definido como
una copia natural de un gene en el genoma del organismo en
cuestión.
El término hongo se refiere aquí a todos los
miembros de la división Eumicota o al reino Hongos y de esta manera
incluye todos los hongos filamentosos y las levaduras.
En vista de los recientes cambios de
nomenclatura para el Aspergilli negro, el término
Aspergillus niger es aquí definido como que incluye todos
los Aspergillis (negro) que puedan encontrase en el Grupo
Aspergillus niger como se definió por Raper y Fennell (1965,
En: The Genus Aspergillus, The Williams & Wilkins
Company, Baltimore, pp 293-344). Similarmente,
también para las otras especies de Aspergillus nos
referiremos a los grupos de Aspergillus según se definió por
Raper y Fennell supra, de tal modo que incluye todas las
especies y variantes incluidas por estos autores en un grupo
particular.
La presente solicitud describe la clonación de
los genes amdS de hongos que no se conocía previamente que
contuvieran genes amdS. La comparación de las tres secuencias
de amdS disponibles fue usada para identificar regiones
conservadas en las secuencias de aminoácido de amdS. Las
regiones conservadas son aquí definidas como fragmentos peptídicos
cortos, por ejemplo 3-12 o más aminoácidos, los
cuales muestran un alto grado de conservación, es decir más del 80%
de identidad, en las secuencias de aminoácidos de acetamidasas de
diversos organismos y los cuales se pueden usar para identificar
nuevos genes de acetamidasas, basados en el hecho de que en la
nueva acetamidasa estos fragmentos de péptidos también estarán
conservados. Basándose en estas regiones conservadas se diseñaron
oligonucleótidos degenerados que fueron usados como cebadores en
experimentos usando la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) en
el ADN genómico aislado de A. niger. Bajo determinadas
condiciones de PCR fueron obtenidos los fragmentos amplificados los
cuales fueron subclonaron y secuenciados. El análisis de la
secuencia claramente identificó los fragmentos amplificados por PCR
como derivados del gen amdS de A. niger en virtud de
la homología de las secuencias de aminoácidos codificados a las
secuencias de aminoácidos de amdS (traducidas) conocidas (ver
Figura 1A).
El fragmento de amdS de A. niger
obtenido por PCR, el cual solamente contenía una pequeña parte del
gen amdS (aproximadamente 500 bp) fue usado como sonda de
hibridación para cribar una librería genómica de A. niger
con el objetivo de obtener fragmentos clonados de ADN genómico que
contuvieran el gen amdS de este hongo completo (ver por
ejemplo la Figura 2 para A. niger). Fragmentos de
restricción en los clones genómicos que hibridaron con la sonda de
PCR fueron subclonados en plásmidos y sometidos a análisis de
secuencia. La secuencia de nucleótidos resultante del gen
amdS genómico de A. niger es presentado en SEQ ID NO:
18. En ausencia de la secuencia de ADNc correspondiente no se
pueden determinar las posiciones exactas de los intrones en la
secuencia genómica. Por lo tanto no se ha deducido la secuencia de
aminoácido predicha. Sin embargo, la traducción de los tres marcos
de lectura de la secuencia genómica permitió identificar varias
áreas (además de aquellas correspondientes a los fragmentos de PCR
mencionados anteriormente que codifican los fragmentos de consenso
internos) que tienen una significativa identidad posicional de
aminoácidos con las secuencias de aminoácidos de amdS que
son conocidas.
La presente divulgación de la presencia de un
gen amdS en A. niger ofrece un incentivo para la
identificación de genes amdS en otros organismos,
preferiblemente hongos, que hasta el momento no se conoce que
contengan genes amdS. Los candidatos preferidos son los
hongos con importancia industrial tales como los hongos
filamentosos pertenecientes al grupo del Aspergillus niger,
el grupo del Aspergillus glaucus, el Aspergillus
terreus, el Aspergillus restrictus, el grupo del
Aspergillus fumigatus, el grupo del Aspergillus
cervinus, el grupo del Aspergillus ornatus, el grupo del
Aspergillus clavatus, el grupo del Aspergillus
versicolor, el grupo del Aspergillus ustus, el grupo
del Aspergillus wentii, el grupo del Aspergillus
ochraceus, el grupo del Aspergillus candidus, el grupo
del Aspergillus cremeus, el grupo del Aspergillus
sparsus, especies de Trichoderma tales como T.
reesei y T. harzianum, especies de Mucor tales
como M.miehei, especies de Rhizopus, especies de
Phanerochaete, especies de Neurosporas, especies de
Humicola, especies de Claviceps, especies de
Sordaria, especies de Ustilago, especies de
Fusarium, especies de Schizophyllum, especies de
Penicillium tales como P. chrysogenum, especies de
Cephalosporium, especies de Acremonium y hongos
comestibles tales como Agaricus bisporus, y levaduras
tales como especies de Kluyveromyces, especies de
Yarrowia, especies de Candida, especies de
Hansenula y Pichia. Ya que muchos de los hongos antes
mencionados crecen en su hábitat natural descomponiendo el material
vegetal, no es inverosímil que también las plantas expresaran genes
involucrados en el metabolismo de compuestos similares a la
acetamida. Por lo tanto, pueden contener también un gen para la
acetamidasa.
Los genes amdS de la invención exhiben
similitud de secuencia con otros genes (similares a) amdS.
Esta similitud en la secuencia se define mejor por la identidad
posicional de aminoácidos de un fragmento de consenso interno de
las proteínas codificadas por los genes amdS. El fragmento de
consenso interno es el fragmento de ADN (o proteína) que se
corresponde con un fragmento en el gen amdS de A.
nidulans que codifica los aminoácidos 125 a 226 (o el fragmento
proteico correspondiente), cuya secuencia de aminoácidos es
proporcionada en SEQ ID NO: 1. Para determinar la identidad
posicional de los aminoácidos, la secuencia de aminoácidos
(codificada) de los fragmentos de consenso interno son alineados,
introduciendo desfases si es necesario para obtener la máxima
identidad, tal como se muestra en la Figura 1A. La identidad
posicional de aminoácidos de dos secuencias amdS se expresa
posteriormente como el porcentaje de aminoácidos idénticos en la
secuencia completa del fragmento de consenso interno de la más corta
de las dos secuencias de amdS (Figura 1B). Usando la
identidad posicional de aminoácidos, los genes amdS de la
invención se definen como secuencias de ADN que codifican proteínas
que comprenden una secuencia de aminoácido cuya identidad posicional
de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, y SEQ ID NO:3 es
menos de 80%, preferiblemente menos de 90%, más preferiblemente
menos de 95% y lo más preferiblemente menos de 100%, y de las cuales
la identidad posicional de los aminoácidos con una de las
secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 3,
SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:5 es más de 30%, preferiblemente más de
35%, más preferiblemente más de 40% y lo más preferiblemente más de
45%.
Las nuevas secuencias de amdS de la
presente invención pueden usarse conjuntamente con secuencias de
amds ya disponibles para definir con mayor precisión las
regiones conservadas en las secuencias de aminoácidos de
amdS y clasificar los tipos de sustituciones que han ocurrido
en aquí. Esto facilitará el diseño de oligonucleótidos degenerados
mejorados lo cual incrementará la oportunidad de obtener nuevos
genes amdS por PCR o por experimentos de hibridación.
Aún cuando el método preferido para clonar
nuevos genes amdS es el método de la presente invención, es
decir, el uso de oligonucleótidos degenerados en una PCR sobre ADN
genómico (o ADNc) y posterior cribado-hibridación,
de las librerías de ADN (genómico o ADNc) para obtener el gen
amdS completo, también se pueden usar otros métodos para la
clonación de nuevos genes amdS. Tales métodos pueden incluir
PCR inversa, hibridación heteróloga, hibridación con
oligonucleótidos (degenerados), complementación (heteróloga) de
mutantes negativas de amdS, o incluso cribar librerías de
expresión con anticuerpos apropiados.
Los nuevos genes amdS de la invención,
por ejemplo aquellos de A. niger, o de uno de los otros
hongos mencionados anteriormente, pueden ser usados como un gen
marcador de selección homólogo, el cual es entendido aquí que
significa que el gen amdS es usado para seleccionar
transformantes de la misma especie que la especie de donde el gen
amdS fue originalmente derivado. Esto ofrece la ventaja de
que los transformantes obtenidos no contienen un gen marcador de
selección extraño. En principio esto permite construir cepas
recombinantes que no contienen ningún ADN extraño con excepción del
absolutamente necesario, es decir, el gen (heterólogo) que se quiere
expresar.
En una realización adicional de la invención, el
promotor natural del gen amdS homólogo es sustituido por un
promotor diferente. Este promotor de sustitución, el cual es
referido aquí como el promotor extraño, puede ser más fuerte que el
promotor natural de amdS o puede ser regulado de una manera
diferente. De cualquier manera, la sustitución del promotor natural
de amdS tiene la intención de facilitar la selección de
transformantes por ejemplo, incrementando las ventajas para el
crecimiento de los transformantes sobre los no transformantes
cuando crecen en acetamida o compuestos de amida relacionados como
única fuente de N o C. Preferiblemente los promotores extraños son
también homólogos para el huésped en el cual ellos son usados. Los
promotores extraños apropiados pueden ser derivados de genes que
codifican enzimas glicolíticas o enzimas involucradas con el
metabolismo del alcohol, tales como los promotores de los genes que
codifican las enzimas fosfoglicerato cinasas,
gliceraldehido-fosfasto deshidrogenasa,
triosa-fosfato cinasa, piruvato cinasa o alcohol
deshidrogenasa.
En aún una realización adicional de la
invención, las secuencias de los genes amdS nuevos son usadas
para inactivar la copia endógena (o copias) del gen amdS en
el genoma del organismo a partir del cual se deriva el nuevo gen
amdS. Hasta aquí se puede construir un vector de inactivación
usando la secuencia del nuevo gen amdS para dirigir el
vector hacia una copia endógena del gen por recombinación homóloga.
La inactivación puede ser entonces causada ya sea por sustitución
de, o por inserción dentro del gen amdS endógeno. La
inactivación del gen amdS endógeno proporciona la ventaja de
que reduce el fondo de células no transformadas en las
transformaciones que usan un gen amdS como marcador de
selección para la introducción de un gen de interés.
Alternativamente el locus de amdS endógeno puede servir como
un sitio definido de integración para aquellos genes que se desean
expresar.
Los genes amdS homólogos de la invención
pueden ser usados en muchos de los diferentes procedimientos de
transformación disponibles para cualquier experto en la materia,
incluyendo entre otros la transformación directa de integración así
como los vectores de replicación autónoma, transformaciones
simultáneas en las cuales el ADN a ser trasformado y el marcador de
selección no están físicamente unidos, y la transformación y
posterior tratamiento de los transformantes para obtener cepas
recombinantes MARKER GENE FREE^{TM} como se describió en
EP-A1-0 635 574, la cual se
incorpora aquí como referencia.
La invención también revela un método de cultivo
de células, al menos una proporción del cual consiste de células de
acuerdo a la invención, en un medio de cultivo, donde el medio de
cultivo comprende acetamida como única fuente de carbono y/o
nitrógeno, así como un método en donde dicho cultivo resulta en el
enriquecimiento de la proporción de células de acuerdo a la
invención.
La presente invención también revela células
vivas de acuerdo a la invención, preferiblemente células fúngicas,
con la capacidad de crecer bien en un medio de cultivo que contiene
acetamida como única fuente de nitrógeno y/o carbono y donde dicha
capacidad no es el resultado de la expresión de un gen heterólogo de
acetamidasa, sino que es causada por la expresión, o
preferiblemente la sobre expresión, de un gen de acetamidasa
homólogo. La capacidad de una célula de crecer bien en un medio de
cultivo que contiene acetamida como única fuente de carbono y/o
nitrógeno es definido aquí como la capacidad de crecer más rápido
que las células de tipo natural correspondientes, en donde el tipo
natural se entiende que significa tipo natural con respecto a su
genotipo para la acetamidasa.
La presente invención permite la preparación de
células recombinantes las cuales contienen un gen amdS
homólogo recombinante y/o no contiene una copia activa de un gen
amdS endógeno. Usualmente estas células recombinantes
comprenden adicionalmente otros genes de interés para ser expresados
y/o genes endógenos de interés los cuales han sido inactivados.
Cualquiera de estas células recombinantes puede ser usada en
procesos para la producción de un producto de interés. Tal proceso
usualmente incluiría los pasos de cultivar las células
recombinantes en un medio contributivo para la producción del
producto de interés y la recuperación de dicho producto del medio
de cultivo. Los productos de interés pueden ser proteínas, tales
como una enzima, y/o metabolitos primarios, tales como CO_{2},
alcohol o ácidos orgánicos, y/o metabolitos secundarios, tales como
antibióticos o carotenoides. El producto de interés puede ser
también las propias células recombinantes, es decir, la biomasa
obtenida en el proceso.
Los siguientes ejemplos son dados para ilustrar
la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
En los ejemplos descritos aquí, las técnicas
convencionales de clonación molecular tales como aislamiento y
purificación de ácidos nucléicos, electroforesis de ácidos
nucléicos, modificación enzimática, escisión y/o amplificación de
ácidos nucléicos, transformación de E. coli, etc., se
realizaron como se describe en la literatura (Sambrook y otros.
(1989) "Molecular Cloning: a laboratory manual", Cold Spring
Harbour Laboratories, Cold Spring Harbour, New York; Innis y otros.
(eds) (1990) "PCR protocols, a guide to methods and
applications" Academic Press, San Diego). La síntesis de los
oligonucleótidos y el análisis de secuencia de ADN fueron realizados
en un secuenciador de ADN 373A y sintetizador de ADN 380B de
Applied Biosystems respectivamente, de acuerdo con los manuales
para usuarios suministrados por los fabricantes.
\vskip1.000000\baselineskip
La transformación de A. niger se realizó
de acuerdo con el método descrito por Tilburn J. y otros. (1983)
Gene 26: 205-221 y Kelly, J. & Hynes, M.
(1985) EMBO J. 4, 475-479 con las siguientes
modificaciones:
- -
- se crecieron las esporas durante 16 horas a 30ºC en un agitador rotatorio a 300 rpm en medio mínimo para Aspergillus. El medio mínimo para Aspergillus consta de los siguientes componentes: Por litro: 6 g NaNO_{3}; 0.52 g KCl; 1.52 g KH_{2}PO_{4}; 1.12 ml 4M KOH; 0.52 g MgSO_{4}.7H_{2}O; 10 g glucosa; 1 g casaminoácidos; 22 mg ZnSO_{4}.7H_{2}O; 11 mg H_{3}BO_{3}; 5 mg FeSO_{4}.7H_{2}O; 1.7 mg CoCl_{2}.6H_{2}O; 1.6 mg CuSO_{4}.5H_{2}O; 5 mg MnCl_{2}.4H_{2}O; 1.5 mg NaMoO_{4}.2H_{2}O, 50 mg EDTA; 2 mg riboflavina; 2 mg tiamina. HCl; 2 mg nicotinamida, 1 mg piroxidina.HCl; 0.2 mg ácido pantoténico; 4 \mug de biotina; 10 ml penicilina (5000 UI/ml)/Solución de Estreptomicina (5000 UG/ml) (Gibco).
- -
- solo se usó Novozym 234 (Novo Industri) para la formación de protoplastos, la helicasa no se usó;
- -
- después que se formaron los protoplastos (60-90 minutos) se añadió una solución tamponada KC (0.8 M KCl, 9.5 mM ácido cítrico, pH6.2) hasta un volumen de 45 ml y la suspensión de protoplastos se centrifugó a 2500 g a 4ºC durante 10 minutos en un rotor de ángulo libre. Los protoplastos se resuspendieron en 20 ml de la solución tamponada KC. Además se añadieron 25 ml de solución tamponada STC (1.2 M sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH7.5, 50 mM CaCl_{2}) y posteriormente la suspensión de protoplastos se centrifuga a 2500 g a 4ºC durante 10 minutos en rotor de ángulo libre, se lava en solución tamponada STC y se resuspende nuevamente en solución tamponada STC a una concentración de 10^{8} protoplastos/ml;
- -
- a 200 \mul de la suspensión de protoplastos se le adiciona el fragmento de ADN disuelto en un volumen de 10 \mul de solución tamponada TE (10 mM Tris-HCl pH7.5, 0.1 mM EDTA) y posteriormente se añaden 100 \mul de una solución de PEG (20% PEG 4000 (Merck), 0.8 M sorbitol, 10 mM Tris-Hcl pH7.5, 50 mM CaCl_{2});
- -
- después de incubar la suspensión de protoplastos con el ADN a temperatura ambiente durante 10 minutos, se añaden lentamente 1.5 ml de una solución de PEG (60% PEG 4000 (Merck), 10 mM Tris-HCl pH7.5, 50 mM CaCl_{2}), con mezclado repetido de los tubos. Después de incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos, las suspensiones se diluyen con 5 ml de solución tamponada STC, se mezclan por inversión y se centrifugan a 2000 g a temperatura ambiente durante 10 minutos. Los protoplastos fueron resupendidos delicadamente en 1 ml de 1.2 M de sorbitol y se colocaron en placas que contienen un medio de regeneración selectivo que consiste de medio mínimo de Aspergillus, sin riboflavina, tiamina.HCl, nicotinamida, piridoxina.HCl, ácido pantoténico, biotina, casaminoácidos y glucosa pero con 10 mM de acetamida como única fuente de nitrógeno, 1 M sacarosa, solidificado con 2% de agar bacteriológico #1 (Oxoid, England).
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación del crecimiento durante
6-10 días a 30ºC, las placas fueron replicadas en
placas acetamida selectivas que consisten en medio selectivo
Aspergillus para regeneración con 2% de glucosa en lugar de
sacarosa y 1.5% de agarosa en lugar de agar. Se aislaron
transformantes individuales después de 5-10 días de
crecimiento a 30ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
El aislamiento de ADN de Aspergillus se
realizó según el procedimiento descrito por Yelton, y otros (1984),
Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 1470-1474.
\vskip1.000000\baselineskip
ADN cromosómico aislado de A. niger CBS
513.88 fue parcialmente digerido con Sau3AI, ligado a los sitios
BamHI de los brazos de \lambdaEMBL3 (por ejemplo Promega),
empaquetado y transfectado a E. coli según Sambrook y otros
(1989) "Molecular Cloning: a laboratory manual", Cold Spring
Harbour Laboratories, Cold Spring
Harbour.
Harbour.
\vskip1.000000\baselineskip
La remoción del marcador de selección
amdS de A. nidulans se alcanza por recombinación
interna entre las repeticiones 3' no codificadoras del amdS
de A. niger que flanquean el marcador de selección
amdS de A. nidulans. La selección de las células que
han perdido el marcador de selección amdS es lograda
mediante el crecimiento sobre placas que contienen fluoracetamida.
Las células que contienen el gen amdS metabolizan la
fluoracetamida en amoníaco y fluoracetato el cual es tóxico para las
células de manera que sólo las células que han perdido el gen
amdS serán capaces de crecer en las placas que contienen
fluoracetamida.
En el caso de remoción del marcador amdS
de los transformantes de Aspergillus, las esporas de estos
transformantes se colocaron en placas sobre medio de regeneración
selectivo (descrito previamente) que contiene 32 mM de
fluoracetamida y 5mM de urea en lugar de 10 mM de acetamida, 1.1% de
glucosa en lugar de 1 M de sacarosa y 1.1% en lugar de 2% de agar
bacteriológico #1 (Oxoid, England). Después de 7-10
días de crecer a 35ºC las colonias individuales se cosecharon y se
colocaron en placas sobre 0.4% de agar de dextrosa de la patata
(Oxford,
England).
England).
\newpage
Ejemplo
1.1
Las mezclas de oligonucleótidos correspondientes
a las cadenas de ADN codificadoras y no codificadoras fueron
diseñadas en secuencias de aminoácidos bien conservadas de los genes
amdS de Aspergillus nidulans (Corrick M.C., Twomey
A.P., Hynes M.J. (1987) Gene 53: 63-71),
Aspergillus oryzae (Gomi K., Kitamoto K., Kumagai C.
(1991) Gene 108: 91-98) y el amdY de
Saccharomyces cerevisiae (Chang T.H., Abelson J. (1990)
Nucleic Acids Res. 18: 7180). Estas mezclas de
oligonucleótidos tienen las siguientes secuencias:
Mezclas de oligonucleótidos fueron usadas en la
PCR con ADN cromosomal de A. niger CBS 513.88 como plantilla.
Las combinaciones de dos oligonucleótidos mezclados 4078/4082;
4079/4080 y 4079/4082 (100 pmoles de cada uno) respectivamente
fueron usadas en reacciones con un volumen de reacción de 50 \mul
que además contenía 0.5 \mug de ADN cromosomal de A. niger
CBS 513.88, 100 nmoles de dNTP's, solución tamponada de reacción
Amplitaq (Perkin Elmer) y 1 U de Amplitaq (Perkin Elmer). Las
condiciones de reacción de PCR fueron las siguientes: Después de
desnaturalizar durante 1 min. a 94ºC, se añade la Amplitaq a 72ºC. A
continuación se llevaron a cabo 30 ciclos cada uno de 2 min. a
94ºC; 2 min. a XºC (X= 65º-50ºC; cada dos ciclos se disminuye 1ºC)
3 min. a 72ºC y finalmente seguido de 7 min. a 72ºC.
Los productos de la reacción se analizaron por
electroforesis usando un gel de agarosa al 1% de TBE. Solamente la
combinación de la mezcla de oligonucleótidos 4078 y 4082 resultó en
un producto de reacción de una longitud aproximada de 500 pb. Este
fragmento de PCR se digirió con BamHI y EcoRI, se purificó por
electroforesis en agarosa, se precipitó en etanol y se clonó en los
sitios BamHI y EcoRI de pTZ18R (United States Biochemicals). El
plásmido resultante se denominó pGBAMD-1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1.2
Una librería genómica de A. niger CBS
513.88, construida en \lambda-EMBL3 tal como se
describió en la sección experimental, fue cribada usando un
fragmento EcoRI/BamHI radio-marcado con ^{32}P
aislado de pGBAMD-1. La hibridación con el
fragmento EcoRI/BamHI radio-marcado con ^{32}P
aislado de pGBAMD-1 se llevó a cabo durante toda la
noche a 65ºC en solución tamponada de hibridación que contenía
4xSSC, 5x solución de Denhardt, 0.1% SDS y 100 \mug/ml de ADN de
timo de ternera desnaturalizado por calor. Después de la
hibridación, los filtros se lavaron en 4xSSC/0.1% SDS, 2xSSC/0.1%
SDS y 1xSSC/0.1% SDS at 65ºC.
Se identificaron cuatro placas que hibridaron
con el fragmento de PCR, las cuales se aislaron y purificaron.
Estos clones de fagos se denominaron \lambdaAMD1 y
\lambdaAMD4.
Ejemplo
1.3
Se construyó un mapa de restricción parcial para
uno de los cuatro clones de fago, es decir \lambdaAMD1. El ADN
del fago aislado se digirió con varias enzimas de restricción, se
corrió en un gel de 0.7% de agarosa, se transfirió a nitrocelulosa
(0.2 \mum; Schlecher & Schull) y se hibridó con el fragmento
EcoRI/BamHI radio-marcado con ^{32}P aislado de
pGBAMD-1. A partir de los resultados obtenidos, se
construyó un mapa parcial de restricción (ver Figura 2).
Ejemplo
1.4
El clon de fago \lambdaAMD-1
contenía un inserto que se suponía lo suficientemente largo como
para comprender el gen amdS completo. Varios fragmentos de
este clon de fago \lambdaAMD-1 fueron subclonados
tanto en pTZ18R como en pTZ19R (United States Biochemicals).
Primero, se aisló un fragmento EcoRI de aproximadamente 2.3 kb de
\lambdaAMD-1 por digestión del ADN de fago con
EcoRI, seguido por electroforesis en agarosa. El fragmento
se clonó en el sitio EcoRI de pTZ18R. El plásmido resultante
fue designado pGBAMD-2.
Seguidamente, el fragmento SpeI/KpnI de
aproximadamente 5 kb fue aislado por digestión del ADN del fago con
SpeI y KpnI seguido por electroforesis en agarosa. El
fragmento SpeI/KpnI de aproximadamente 5 kb se clonó
en los sitios XbaI y KpnI de pTZ19R. En este paso de
la clonación tanto el sitio SpeI como el sitio XbaI
fueron destruidos. El plásmido resultante fue designado
pGBAMD-3.
Finalmente, el fragmento KpnI de
aproximadamente 8 kb fue aislado por digestión del ADN del fago con
KpnI, seguido por electroforesis en agarosa. El fragmento
aislado se clonó en el sitio KpnI de pTZ19R. El plásmido
resultante fue designado pGBAMD-4. Una visión
esquemática de los diferentes subclones se da en la Figura 2.
Ejemplo
1.5
Con el fin de determinar si el fragmento aislado
por PCR era parte del gen amdS de A. niger fue
determinada la secuencia de dicho fragmento (presentada en SEQ ID
NO:16), fue traducida a una secuencia de aminoácidos y comparada
con la secuencia de aminoácidos de los genes amdS de A.
nidulans, A. oryzae y el gen amdY de S.
cerevisiae (ver Figura 1A). Se encontró una homología
considerable entre el fragmento de PCR y parte de los genes
amdS y amdY. Por tanto se concluyó que el fragmento de
PCR es una parte del gen amdS homólogo del A. niger.
Para obtener la secuencia nucleotídica completa del locus
amdS de A. niger, la secuencia de parte (alrededor de
2.8 kb) del fragmento SpeI/KpnI de
pGBAMD-3 también fue determinada. Esta secuencia se
presenta en SEQ ID NO:18.
Con el objetivo de determinar si el gen
amdS de A. nidulans homólogo al de A. niger
podría ser usado como gen marcador de selección en las
transformaciones de A. niger, el ADN de los subclones
pGBAMD-2, pGBAMD-3 y
pGBAMD-4 que contienen probablemente la secuencia
completa de la región codificadora del gen amdS de A.
niger con más o menos secuencias regulatorias (secuencias de
promotor y terminador) se usó para transformar A. niger CBS
513.88 de acuerdo a los métodos descritos en la sección
experimental.
Ejemplo
2.1
El A. niger CBS 513.88 se transformó con
10, 20 y 50 \mug de ADN de los plásmidos pGBAMD-2,
pGBAMD-3 y pGBAMD-4 de acuerdo al
método descrito en la sección experimental. Solamente con los
plásmidos pGBAMD-3 y pGBAMD-4 se
obtuvieron transformantes que pudieron crecer en acetamida como
única fuente de nitrógeno.
Ejemplo
2.2
Para verificar que los transformantes
regenerados eran transformantes genuinos que habían incorporado el
ADN del plásmido dos transformantes pGBAMD-3 de
A. niger y dos transformantes pGBAMD-4 de
A. niger fueron analizados usando análisis Southern. A
partir de estos transformantes y de la cepa huésped de A.
niger no transformada, el ADN de alto peso molecular fue
aislado, digerido con BamHI, separado por electroforesis en
gel de agarosa y transferido a nitrocelulosa. El ADN transferido fue
hibridado con un fragmento EcoRI/BamHI
radio-marcado con ^{32}P aislado de
pGBAMD-1. Los resultados se presentan en la Figura
3.
Es característico del gen amdS endógeno
un fragmento de hibridación de aproximadamente 9 kb (ver Figura 3
carril 5). El plásmido pGBAMD-3 se caracteriza por
un fragmento de hibridación de aproximadamente 5 kb y el plásmido
pGBAMD-4 se caracteriza por un fragmento de
hibridación de aproximadamente 7.5 kb. Como puede ser observado en
la Figura 3, carriles 3, 4, y carriles 1 y 2, fragmentos de
hibridación característicos de la presencia de
pGBAMD-3 y pGBAMD-4,
respectivamente, son detectados en los transformantes. Por lo tanto
se puede concluir que el gen amdS de A. niger se
puede usar como un marcador de selección en las transformaciones de
A. niger.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo describe la remoción de la región
de codificación de amdS de A. niger y una parte
(proximal) del promotor de amdS con un vector de remplazo el
cual se integra al genoma de A. niger mediante una doble
recombinación homóloga de entrecruzamiento. El vector de remplazo
comprende una región de ADN homóloga al locus diana interrumpido
por el gen de un marcador de selección que esta flanqueado por
repeticiones de ADN.
El vector de remplazo comprende una parte del
locus genómico del amdS de A. niger, donde las
secuencias codificadoras de amdS así como una parte de las
secuencias promotoras de amdS se remplazan por el gen
amdS de A. nidulans bajo el control del promotor gpdA
de A. nidulans como marcador de selección flanqueado por
secuencias 3' no traducidas de amdS de A. niger como
repeticiones directas. La transformación de A. niger con
este vector conduce el remplazo del gene amdS de A.
niger por el gen amdS de A. nidulans. Mediante la
realización de la contra-selección con
fluoracetamida de estos transformantes, como se describe en los
procedimientos experimentales, el gen amdS de A.
nidulans es adecuadamente eliminado por un evento de
recombinación interna entre las repeticiones 3' del amdS de
A. niger resultando en una cepa recombinante
\DeltaamdS MARKER GENE FREE^{TM} que no contiene ninguna
secuencia de ADN foránea.
Ejemplo
3.1
El primer paso en la ruta de construcción del
vector de remplazo del gen amdS de A. niger es la
construcción de un plásmido con un apropiado sitio de clonación
múltiple. Para lograr esto, el plásmido pTZ18R (United States
Biochemicals) se digirió con EcoRI y HindIII y el
fragmento de aproximadamente 2.8 kb se purificó por electroforesis
de agarosa y se precipitó en etanol y este fragmento se clonó con
dos fragmentos sintéticos diferentes de dos oligonucleótidos. Un
fragmento sintético comprende los sitios de reconocimiento para las
enzimas de restricción NotI, EcoRI, KpnI,
BglII, SmaI y HindIII y tiene la siguiente
secuencia:
El plásmido resultante fue designado
pGBAMD-5.
El otro fragmento sintético comprende los sitios
de reconocimiento para los sitios de restricción NotI,
HindIII, KpnI, SpeI, BamHI, PstI
y NotI y tiene la siguiente secuencia:
El plásmido resultante fue designado
pGBAMD-6.
Seguidamente, el fragmento
BamHI/SmaI de pGBAMD-4 con una talla
aproximada de 2.5 kb, que comprende la región 3' no codificadora
del gen amdS de A. niger se clonó en el sitio
BglII y SmaI de pGBAMD-5. En este
paso de clonación ambos sitios tanto BglII como BamHI
se destruyeron. El nuevo plásmido se denominó
pGBMDA-7. Este plásmido fue digerido con
EcoRI y KpnI y en estos sitios se ligó con el
fragmento de aproximadamente 3.1 kb que comprende el gen amdS
de A. nidulans bajo el control del promotor gpdA de A.
nidulans aislado de pGBGLA25 (EP 0 635 574 A1). El nuevo
plásmido se denominó pGBAMD-8.
El plásmido pGBAMD-6 se digirió
con BamHI y PstI y en estos sitios se ligó con el
fragmento BamHI/PstI de aproximadamente 2 kb y
aislado de pGBAMD-4 y que comprende parte de la
región 3' no codificadora del gen amdS. El plásmido resultante se
denominó pGBAMD-9.
Seguidamente, el plásmido
pGBAMD-9 se digirió con KpnI y SpeI y
en estos sitios se ligó el fragmento KpnI/SpeI de
aproximadamente 2.7 kb aislado de pGBAMD-4 y que
comprende parte de la región 5' del promotor del gen amdS.
El plásmido resultante se denominó pGBAMD-10.
Finalmente, el plásmido pGBAMD-8
se digirió con NotI y en este sitio se ligó con el fragmento
de aproximadamente 4.7 kb aislado de pGBAMD-10 y
que comprende una parte 5'de la región del promotor y parte de la
secuencia 3' no codificadora ambas del gen amdS. El plásmido
resultante con el fragmento clonado en la orientación correcta es
nombrado pGBAMD-11 y es el vector de remplazo que se
usa para eliminar el gen amdS de A. niger cuando se
usa la estrategia del MARKER GENE FREE^{TM}.
Ejemplo
3.2
Antes de la transformación de A. niger
con pGBAMD-11, las secuencias de E. coli se
removieron por digestión HindIII y electroforesis en gel de
agarosa. La cepa de A. niger CBS 513.88 (depositada el 10
Octubre de 1988) fue transformada con cualquiera de 2.5, 5 o 10
\mug del fragmento de ADN por los procedimientos descritos en los
procedimientos experimentales usando acetamida como única fuente de
N en las placas de selección. Los transformantes individuales de
A. niger fueron purificados varias veces sobre placas mínimas
conteniendo acetamida selectiva. Se colectaron las esporas de los
transformantes individuales haciéndolas crecer en placas de agar de
dextrosa de patata al 0.4% (Oxoid, England) durante 5 días a 30ºC.
Análisis Southern fueron realizados para verificar la presencia del
locus amdS truncado.
Ejemplo
3.3
El gen amds de A. nidulans se
removió nuevamente de los transformantes generados tal como se
describe en la sección Experimental. La remoción correcta del gen
del marcador de selección amdS de A. nidulans se
verificó por análisis Southern del ADN cromosómico de varias cepas
resistentes a la fluoracetamida.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Gist-brocades B.V.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Wateringseweg 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Delft
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Holanda
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 2611XT
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: +31-15-2799111
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFÁX: +31-15-2793957
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Gen amdS de Aspergillus niger que codifica para una acetamidasa.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 19
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR COMPUTADORA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO MEDIO: Disco Blando (Floppy)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- COMPUTADORA: PC Compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA DE COMPUTACIÓN: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 102 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Aspergillus nidulans
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- AISLADO INDIVIDUAL: amdS-ICF
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 102 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Aspergillus oryzae
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- AISLADO INDIVIDUAL: amdS-ICF
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 104 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Saccharomyces cerevisiae
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- AISLADO INDIVIDUAL: amdY-ICF
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 111 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Aspergillus niger
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- AISLADO INDIVIDUAL: amdS-ICF
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 4
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 102 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Penicillium chrysogenum
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- AISLADO INDIVIDUAL: amdS-ICF
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 5
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB4078
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB4079
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB4080
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB4081
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB4082
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 56 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 56 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB5224
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 542 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Aspergillus niger
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: CBS 513.88
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: amdS-ICF
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 384 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Penicillium chrysogenum
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Wisconsin 54-1255
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: amdS-ICF
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2869 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Aspergillus niger
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: CBS 513.88
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: amdS
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3315 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Penicillium chrysogenum
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Wisconsin 54-1255
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: amdS
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (12)
1. Una secuencia de ADN que codifica una
acetamidasa, dicha secuencia de ADN comprendiendo una secuencia de
ADN de acuerdo a la SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:18.
2. Una secuencia de ADN según reivindicación 1,
en donde la secuencia de ADN es un gen derivado de Aspergillus
niger.
3. Una construcción de ADN recombinante que
comprende la secuencia de ADN de acuerdo a la reivindicación 1 o el
gen de acuerdo a la reivindicación 2.
4. Una construcción de ADN recombinante de
acuerdo a la reivindicación 3 operativamente unido a un promotor,
el cual es natural para dicho gen.
5. Una construcción de ADN recombinante de
acuerdo a la reivindicación 3 operativamente unido a un promotor,
el cual es extraño para dicho gen.
6. Una construcción de ADN recombinante de
acuerdo a las reivindicaciones 3 a 5 que además comprende un gen de
interés.
7. Un vector de inactivación que usa el gen de
acuerdo a la reivindicación 2, para dirigir el vector hacia la
copia endógena del gen por recombinación homóloga.
8. Una acetamidasa codificada por el gen de
acuerdo a la reivindicación 2.
9. Una acetamidasa que comprende una secuencia
de acuerdo a la SEQ ID NO:4.
10. Una célula que comprende una construcción
de ADN de acuerdo a las reivindicaciones 3 a 7.
11. Un proceso para la producción de un producto
deseado que comprende los pasos de
- a.
- cultivar una célula de acuerdo a la reivindicación 10 bajo condiciones conducentes a la producción de dicho producto, y
- b.
- recuperar el producto.
12. Un proceso para el aislamiento de un gen de
acetamidasa en donde la secuencia de ADN usada es la secuencia de
acuerdo a la reivindicación 1.
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