ES2198410T3 - Cepas recombinantes de hongos filamentosos libres de gen marcador de seleccion: un metodo para obtener dichas cepas y su utilizacion. - Google Patents
Cepas recombinantes de hongos filamentosos libres de gen marcador de seleccion: un metodo para obtener dichas cepas y su utilizacion.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN SISTEMA LIBRE DE MARCADORES DE SELECCION QUE PUEDE SER USADO PARA INTRODUCIR MODIFICACIONES GENETICAS EN BACTERIAS, LEVADURAS Y HONGOS. EL SISTEMA PUEDE EMPLEARSE PARA INTRODUCIR O BORRAR GENEROS DESEADOS O FRAGMENTOS DE ADN EN EL GENOMA DE LAS ESPECIES HUESPED INDICADAS SIN DEJAR NINGUN ADN NO DESEADO POR EJEMPLO EL MARCADOR DE SELECCION USADO PARA LA SELECCION DE TRANSFORMADORES U OTRO ADN USADO PARA CLONAR. DE ESTA MANERA SE HAN DESARROLLADO CEPA QUE CONTIENEN SOLO GENES DESEADOS INTRODUCIDOS EN LUGARES CROMOSOMIOS DESEADOS. DE MODO SIMILAR, LOS FRAGMENTOS DE ADN HAN SIDO BORRADOS O SUSTITUIDOS EN LUGARES DESEADOS.
Description
Cepas recombinantes de hongos filamentosos libres
de gen marcador de selección: un método para obtener dichas cepas
y su utilización.
La presente invención da a conocer cepas fúngicas
filamentosas recombinantes libres de gen marcador de selección, un
método para obtenerlas y la utilización de dichas cepas. El método
descrito en la presente invención se utiliza además para mejorar
cepas.
Existe un interés social creciente en cuanto al
uso de la tecnología del ADN recombinante. Una de las áreas de
aplicación más prometedoras de la tecnología del ADN recombinante
es la mejora de cepas. Desde los primeros días de los procesos de
producción por vía fermentativa ha tenido lugar una continua
demanda de mejora en la productividad de las cepas utilizadas para
tal fin.
Los programas clásicos de mejora de cepas para
microorganismos empleados a escala industrial se basan
principalmente en la mutagénesis aleatoria seguida de selección.
Los procedimientos de mutagénesis se han descrito ya extensamente;
incluyen la utilización de luz UV, NTG o EMS como mutágenos. Estos
métodos se encuentran ampliamente descritos en, por ejemplo,
``Biotechnology: a comprehensive treatise in 8 vol.'' Volumen
I, Microbian fundamentals, capítulo 5b, editorial Chemie GmbH,
Weinheim, Alemania.
Los métodos de selección se desarrollan por lo
general alrededor de un ensayo conveniente y son de la mayor
importancia a la hora de discriminar entre cepas de tipo salvaje y
de tipo mutante.
Se ha concluido que estos métodos clásicos están
limitados en cuanto a su potencial para la mejora. Hablando en
términos generales, las rondas consecutivas de mejora de cepas
acaban por reducir el crecimiento esperado en la obtención de los
productos deseados. Esto es debido, al menos en parte, al carácter
aleatorio de los métodos de mutagénesis empleados. Aparte de
mutaciones deseadas, estos métodos ocasionan también mutaciones
indeseables y que pueden influir negativamente en otras
características de las cepas.
En vista de estos inconvenientes, es comprensible
que el uso de los métodos de ADN recombinante se acogiese como una
considerable mejora. En general, los métodos de ADN recombinante
utilizados en programas de mejora de cepas se dirigen a aumentar la
expresión génica de los productos deseados.
Los productos génicos pueden ser proteínas que
son de interés en sí mismas o, por otra parte, también es posible
que los productos génicos codificados sirvan como proteínas
reguladoras en la síntesis de otros productos.
Las cepas pueden mejorarse introduciendo
múltiples copias de genes que codifiquen la proteína deseada en
organismos huésped específicos. Sin embargo, también es posible
aumentar el nivel de expresión génica introduciendo genes
reguladores.
Los genes se introducen utilizando vectores que
sirven como vehículos para tal fin. Dichos vectores pueden ser
plásmidos, cósmidos o fagos. El vector puede estar capacitado para
la expresión de los genes, en cuyo caso el vector es generalmente
autorreplicante. Sin embargo, también puede estar capacitado sólo
para la integración. Otra característica del vector es que, si el
producto de expresión no puede seleccionarse fácilmente a partir de
sus propiedades fenotípicas modificadas, se le puede equipar con un
marcador que le permita ser seleccionado con facilidad.
No se han aislado vectores de todos los
microorganismos conocidos, bien debido a que no es posible hallar
vector alguno en el organismo o bien debido a que se pueden
utilizar vectores disponibles de otros organismos introduciendo
poca o ninguna modificación. Lo mismo es aplicable para los genes
marcadores de selección.
El uso extendido y la subsiguiente difusión de
genes marcadores específicos está siendo objeto de debate
recientemente. Esto es debido especialmente al descubrimiento de
que el uso de antibióticos y marcadores de selección de
antibióticos ocasiona una propagación no deseada de cepas que se
han vuelto resistentes a ellos, lo que hace necesario el continuo
desarrollo de otros nuevos, aun más potentes.
Por lo tanto, no es sorprendente que, en la
producción a gran escala, exista una tendencia general al uso de
microorganismos recombinantes que no contengan genes de resistencia
a los antibióticos o, más en general, la menor cantidad posible de
ADN extraño.
Lo ideal sería que los microorganismos
transformados contuviesen sólo el o los genes deseados, fragmentos
de los mismos o modificaciones en el gen y asimismo la menor
cantidad posible o la total ausencia de restos del ADN utilizado
para la clonación.
El documento WO 93/01283 da a conocer células
vegetales libres de gen marcador recombinante, de las que se
escinden genes marcadores utilizando el sistema bacteriófago P1
Cre/Lox.
La presente invención da a conocer un gen
marcador de selección que puede ser delecionado de nuevo fácilmente
del organismo huésped recombinante. La eliminación de dicho gen
marcador se basa en la selección de dominante.
El marcador se utiliza en hongos
filamentosos.
Las ventajas de la aplicación de los marcadores
de selección aquí utilizados se basan en el siguiente principio
consistente en dos etapas:
- a)
- se integra el gen en el genoma del organismo huésped y se seleccionan células recombinantes,
- b)
- la célula transformada se cultiva en un sustrato, el cual, mediante la actividad codificada del gen marcador, se convierte en un producto letal para la célula.
Las células seleccionadas serán recombinantes y
se habrá eliminado el gen marcador de selección.
En términos generales, la presente invención da a
conocer células fúngicas filamentosas que presentan una
modificación en el genoma caracterizada porque la alteración se
introduce utilizando el gen amdS o el cADN derivado del
mismo.
Un ejemplo de un gen marcador de selección que
puede utilizarse para este fin es un gen de la acetamidasa. Este
gen se obtiene preferentemente de hongos filamentosos,
especialmente de Aspergillus y particularmente de
Aspergillus nidulans.
La invención muestra además la introducción,
deleción o modificación de elementos de ADN o de genes heterólogos
u homólogos en los hongos filamentosos utilizando el gen de
acetamidasa (amdS) como marcador. Posteriormente se elimina
el gen de amdS. El gen de amdS y los genes deseados
se introducen preferentemente en sitios específicos.
La invención da a conocer un vector que
contiene:
- a)
- un fragmento de ADN que se desea, destinado a la introducción en el genoma huésped,
- b)
- opcionalmente una secuencia de ADN que permita al vector integrarse (en un sitio específico) en el genoma de la cepa huésped,
- c)
- un gen que codifique una acetamidasa (por ejemplo el gen de amdS de A. nidulans) entre repeticiones de ADN.
La invención da conocer además hongos
filamentosos transformados con dicho vector.
La invención da a conocer por tanto hongos
filamentosos recombinantes libres de gen marcador de selección.
Específicamente, la invención muestra hongos
filamentosos que contienen genes introducidos en sitios específicos
y sin la presencia de ningún otro ADN extraño. Por tanto, el método
también es adecuado para recrear modificaciones repetidas del
genoma del huésped, por ejemplo la introducción secuencial de
múltiples copias de un gen en los loci predeterminados.
La invención proporciona un método para obtener
cepas fúngicas filamentosas recombinantes libres de gen marcador de
selección, método que comprende las siguientes etapas:
- a)
- integración en el genoma de la cepa de un fragmento de ADN deseado y un marcador de selección,
- b)
- selección de los recombinantes,
- c)
- deleción del marcador de selección utilizando preferentemente una recombinación interna entre las secuencias flanqueantes del mismo,
- d)
- contraselección basada en la ausencia del marcador de selección.
Aunque este es el método preferido para la
obtención de cepas fúngicas filamentosas recombinantes libres de
gen marcador de selección, la invención también presenta
variaciones de este método, por ejemplo:
El fragmento de ADN deseado y el marcador de
selección pueden estar presentes en dos moléculas de ADN distintas
aplicando el método de cotransformación. El marcador de selección
no se integra necesariamente en el genoma de la cepa, sino que
puede estar presente en una molécula de ADN en estado episomal
pudiendo ser eliminado.
La presente invención aclara además que este gen
marcador puede delecionarse del genoma de los organismos
transformados sin dejar huellas, es decir ADN utilizado para la
clonación.
La invención da a conocer también el uso del gen
de amdS para la deleción de un gen deseado del cromosoma de
un organismo ``huésped'' de un hongo filamentoso. Específicamente
se emplean las siguientes cepas: Aspergillus,
Trichoderma y Penicillium.
El método mostrado en la presente invención
proporciona cepas recombinantes con modificaciones genómicas
obtenidas mediante repetición del procedimiento con los mismos o
con otros vectores.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
A= Apa I; \+ Ba= Bam HI; \+ B= Bgl II; \+
Bs= Bss HII; \+ E= Eco RI;\cr H= Hin d III; \+
K= Kpn I; \+ N= Nde I; \+ N= Not I; \+
Ps= Pst I;\cr P= Pvu II; \+ Sa= Sal I; \+
Sc= Sca I; \+ S= Sma I; \+ Sn= Sna BI;\cr
Spe= Spe I; \+ Sp= Sph I; \+ Ss= Sst II; \+
Xb= Xba I; \+
X= Xho I.\cr}
T. = secuencia de terminación LAC4
Muestra el mapa de restricción del plásmido
pamdS-1. Este plásmido contiene el cADN del
gen de amdS de A. nidulans.
Muestra, esquemáticamente, la deleción libre de
gen marcador del locus glaA de A. niger utilizando el
vector de reemplazamiento génico pGBDEL4L. La parte esencial del
vector de reemplazamiento génico pGBDEL4L contiene el gen de
amdS bajo control del promotor gpdA clonado entre
repeticiones (región 3' no codificadora del gen glaA).
Figuras
3-9
Muestran, esquemáticamente, la ruta de
construcción de pGBDEL4L según lo descrito posteriormente en el
Ejemplo 1.
A. Productos de digestión Kpn I de
transformantes pGBDEL4L #41 (banda 1), #24 (banda 2), #23 (banda 3)
y #19 (banda 4) y la cepa huésped A. niger CBS 513.88
(banda 5) y productos de digestión BamH I de transformantes
pGBDEL4L #41 (banda 6), #24 (banda 7), #23 (banda 8), #19 (banda
9) y la cepa huésped A. niger CBS 513.88 (banda 10),
examinados con fragmento de promotor glaA marcado con
^{32}P y estudio de xilanasa.
B. Productos de digestión Kpn I de
GBA-102 (banda 1) y las cepas de
GBA-102 tras una selección con fluoroacetamida:
GBA-107 (banda 2) y GBA-108 (banda
3) y productos de digestión BamH I de GBA-102
(banda 4) y las cepas GBA-102 tras una selección
con fluoroacetamida: GBA-107 (banda 5) y
GBA-108 (banda 6), examinados con fragmento de
promotor glaA marcado con ^{32}P y estudio de
xilanasa.
A. Representación esquemática de tramos de
fragmento BamH I y KpnI del locus glaA de tipo
salvaje en Aspergillus niger CBS 513.88.
B. Representación esquemática de tramos de
fragmento BamH I y KpnI del locus glaA
truncado en transformante #19 (= GBA-102).
C. Representación esquemática de tramos de
fragmento BamH I y KpnI del locus glaA
truncado en transformantes GBA-102 tras la
eliminación del gen amdS (= GBA-107 y
GBA-108).
\newpage
A. Muestra esquemáticamente la integración del
gen glaA en la región 3' no codificadora del locus
glaA truncado de A. niger GBA-107.
B. Muestra el resultado de la recombinación
interna entre las secuencias glaA 3' que flanquean el gen de
amdS.
Figuras
13-24
Muestran esquemáticamente la ruta de construcción
del vector de integración pGBGLA30, según lo descrito
posteriormente en el Ejemplo 2.
Productos de digestión Bgl II de
transformantes pGBGLA30 #107-9 (banda 1),
#107-7 (banda 2) y #107-5 (banda 3),
la cepa huésped A. niger GBA-107 (banda 4) y
la cepa progenitora A. niger CBS 513.88 (banda 5) y
productos de digestión KpnI de transformantes pGBGLA30
#107-9 (banda 6), #107-7 (banda 7) y
#107-5 (banda 8), la cepa huésped A. niger
GBA-107 (banda 9) y la cepa progenitora A.
niger CBS 513.88 (banda 10), examinados con fragmento de
promotor glaA marcado con ^{32}P.
A. Representación esquemática de los tramos de
fragmento KpnI y BglII del locus glaA de tipo
salvaje en Aspergillus niger CBS 513.88.
B. Representación esquemática de los tramos de
fragmento KpnI y BglII del locus glaA truncado
en Aspergillus niger GBA-107.
C. Representación esquemática de los tramos de
fragmento KpnI y BglII del locus glaA truncado
con una única copia de pGBGLA30 integrada en la región 3' no
codificadora de glaA así como en transformantes
#107-5 (= GBA-119) y #
107-9 (= GBA-122).
D. Representación esquemática de los tramos de
fragmento KpnI y BglII del locus glaA truncado
en transformantes GBA-119 y GBA-122
tras la eliminación del gen de amdS (=
GBA-120, GBA-121,
GBA-123 y GBA-124).
A. Productos de digestión BglII de A.
niger CBS 513.88 (banda 10), GBA-107 (banda 9),
GBA-119 (banda 8) y las cepas
GBA-119 tras una selección con fluoroacetamida:
#AG5-7 (= GBA-120) (banda 5),
#AG5-5 (= GBA-121) (banda 6) y
#AG5-6 (banda 7); GBA-122 (banda 4)
y las cepas GBA-122 tras una selección con
fluoroacetamida: #AG9-1 (= GBA-123)
(banda 3), #AG9-2 (banda 2) y
#AG9-4 (= GBA-124) (banda 1),
examinados con fragmento no codificador de glaA 3'' marcado
con ^{32}P.
B. Productos de digestión KpnI de A.
niger CBS 513.88 (banda 10), GBA-107 (banda 9),
GBA-119 (banda 8) y las cepas de
GBA-119 tras una selección con fluoroacetamida:
#AG5-7 (= GBA-120) (banda 5),
#AG5-5 (= GBA-121) (banda 6) y
#AG5-6 (banda 7); GBA-122 (banda 4)
y las cepas de GBA-122 tras una selección con
fluoroacetamida: #AG9-1 (= GBA-123)
(banda 3), #AG9-2 (banda 2) y
#AG9-4 (= GBA-124) (banda 1),
examinados con fragmento no codificador de glaA 3'' marcado
con ^{32}P.
Muestra esquemáticamente la ruta de construcción
de pGBGLA50.
Figuras
29-33
Muestran esquemáticamente la ruta de construcción
de pGBGLA53.
La presente invención da a conocer la utilización
de un marcador para preparar cepas huésped de hongos filamentosos
recombinantes libres de gen marcador de selección. El gen marcador
de selección puede utilizarse en un vector de ADN episomal. Sin
embargo, en la presente invención, el gen marcador se integra en el
genoma de la cepa huésped preferentemente. La ventaja del marcador
seleccionable de la presente invención es que es de tipo dominante
no antibiótico. Otra ventaja del marcador de selección de la
presente invención es que puede eliminarse fácilmente del hongo
filamentoso huésped transformado. La deleción del marcador se basa
en un proceso de selección de dominante. Como tal, el marcador de
selección de la presente invención es dominante y bidireccional.
Que se sepa, es el único marcador de selección disponible que sea
bidireccional y dominante en ambas direcciones.
En la presente descripción utilizamos el término
``gen marcador de selección''. Con este término queremos dar a
entender que se trata del ADN que codifica la proteína marcadora en
una forma funcional, sin importar si se trata del gen real o del
cADN derivado del mismo. El gen o el cADN se utiliza dependiendo
del organismo huésped y los posibles problemas de splicing,
es decir de corte y ensamblaje.
En la presente invención utilizamos el término
``vector''. Con éste nos referiremos a cualquier molécula de ADN
que pueda introducirse en un huésped determinado, sin importar si
el vector se integra en el genoma de la célula del hongo
filamentoso huésped o permanece de forma episomal. El vector
contiene un gen marcador seleccionable funcional en el huésped o
puede proceder de un proceso de cotransformación con otra molécula
de ADN que contenga tal gen marcador de selección.
La presente descripción hace uso de los términos
``fragmentos de ADN o genes heterólogos u homólogos deseados''. Con
ello quiere decirse un fragmento de ADN que puede obtenerse de la
cepa del hongo filamentoso huésped o de otra especie o cepa. El
fragmento de ADN deseado puede contener cualquier elemento
genético, partes o combinaciones del mismo, como por ejemplo un gen
(parte codificadora o locus completo), un cADN, un promotor, un
terminador, un intrón, una secuencia señal, cualquier secuencia de
ADN reguladora o secuencia de reconocimiento de proteínas ADN -
enlazantes. El fragmento también puede ser una secuencia de ADN que
haya sido modificada, es decir contenga una o más alteraciones en
sus nucleótidos (por ejemplo inserciones, deleciones,
sustituciones).
La presente invención utiliza además el término
``introducción'' de un fragmento de ADN o gen deseado. Con esto
quiere decirse una inserción, deleción, sustitución de secuencias
de ADN deseadas en una célula de hongo filamentoso huésped
determinada.
El término ``modificación genética'' utilizado en
la presente invención se refiere a cualquier modificación de las
secuencias de ADN en una célula de hongo filamentoso huésped
determinada que sea resultado de la introducción de cualquiera de
los fragmentos de ADN deseados arriba mencionados dentro de la
célula huésped, mediante procesos de transformación o
cotransformación preferentemente.
En general, todas estas modificaciones genéticas
pueden realizarse utilizando el método presentado en la invención
seguido de una deleción del gen marcador de selección. Debido al
hecho de que la cepa del hongo filamentoso recombinante que
contiene tal modificación genética no contiene el gen marcador de
selección, el procedimiento descrito en la presente invención puede
repetirse, de modo que las modificaciones arriba sugeridas puedan
combinarse en la cepa del hongo filamentoso recombinante. Por
último, el procedimiento de la presente invención puede aplicarse
repetidas veces, hasta el punto de obtener una cepa del hongo
filamentoso recombinante de la que se hayan eliminado todas las
características indeseables mediante deleción o inactivación de los
elementos genéticos correspondientes y que contenga aquellas
características deseadas, a los niveles apropiados, mediante una
introducción secuencial de los fragmentos de ADN correspondientes,
en el número de copias deseado y en los loci predeterminados y
definidos preferentemente.
El gen de acetamidasa (amdS) de A.
nidulans permite al A. nidulans desarrollarse con la
acetamida como única fuente de nitrógeno presente. Para aquellos
microorganismos que carecen de la posibilidad o sólo tienen una
capacidad muy limitada de utilizar la acetamida como única fuente de
nitrógeno, el gen de acetamidasa puede ser utilizado, en principio,
como un marcador de selección, siempre que la acetamida sea
absorbida por las células. El gen de amdS se ha empleado con
éxito como gen marcador en Aspergillus (Kelly y Hynes (1985)
EMBO J. 4, 475-479; Christensen y col.
(1988) Bio/technology 6, 1419-1422),
Penicillium (Beri y Turner (1987) Curr. Genet.
11, 639-641), Trichoderma (Pentillä y
otros (1987) Gene 61, 155-164) y
Neurospora (Yashimoto y col. (1992) Mol. Gen. Genet.
236, 121-124).
El gen de amdS de A. nidulans es
capaz de convertir la acetamida en amoníaco y ácido acético. Esta
propiedad le permite al A. nidulans crecer en un medio que
contenga acetamida como única fuente de nitrógeno o de Carbono.
Otra propiedad del gen de amdS es que
también es capaz de convertir la fluoroacetamida en amoníaco y
ácido fluoroacético. Sin embargo, el ácido fluoroacético es tóxico
para la célula. Esto permite la producción de cepas de hongos
filamentosos recombinantes libres de gen marcador. La propiedad de
transformar la fluoroacetamida permite la contraselección de las
células del hongo filamentoso transformadas. El gen de amdS
se introduce en la cepa huésped del hongo filamentoso y se integra
en el genoma mediante una recombinación homóloga. Las cepas así
transformadas se seleccionan en un medio que contiene acetamida
como única fuente de N. Posteriormente, se cultivan en un medio que
contiene fluoroacetamida y urea (u otras fuentes de N determinadas
apropiadas) como únicas fuentes de N. Las cepas del hongo
filamentoso supervivientes habrán sufrido así una deleción del gen
de amdS.
La presente invención utiliza el gen de
amdS del A. nidulans como gen marcador de
acetamidasa. Las propiedades relevantes proporcionadas por la
acetamidasa codificada por el gen de amdS del A.
nidulans, es decir la capacidad de hidrolizar acetamida en
amoníaco y acetato, así como la capacidad de liberar ácido
fluoroacético de la fluoroacetamida, pueden obtenerse también con
acetamidasas procedentes de otras fuentes. Por lo tanto, la
utilización de un gen marcador de acetamidasa no está limitada al
gen de amdS del A. nidulans, sino que incluye
cualquier secuencia de ADN que codifique una acetamidasa
funcional.
La frecuencia de la deleción del marcador se
incrementa considerablemente aumentando la capacidad del gen para
la recombinación homóloga intracromosómica. Para lograr esto, el
gen de amdS se coloca preferentemente entre repeticiones de
ADN. Estas repeticiones no tienen por qué estar ambas
necesariamente presentes en el vector, sino que pueden integrarse
mediante un entrecruzamiento simple. Como opción alternativa también
es posible omitir repeticiones flanqueantes y confiar en otros
mecanismos para la eliminación o inactivación del gen marcador. Sin
embargo, en este caso el resultado puede ser menos predecible y es
posible que no se logre una eliminación, sino más bien una mera
inactivación, del gen marcador.
El vector puede construirse de modo que, tras la
deleción del gen marcador, no quede en el cromosoma de la cepa
huésped ningún ADN extraño (excepto el ADN deseado). La invención
da a conocer un vector que comprende:
- a)
- un fragmento de ADN deseado destinado a ser introducido en el genoma del hongo filamentoso huésped,
- b)
- opcionalmente una secuencia de ADN que permita al vector integrarse (en un sitio específico) en el genoma de la cepa huésped,
- c)
- un gen que codifique una acetamidasa (por ejemplo el gen de amdS de A. nidulans) entre repeticiones de ADN.
Pueden obtenerse los mismos resultados si el
fragmento de ADN destinado a ser introducido en el genoma del hongo
filamentoso huésped y el gen marcador de selección (por ejemplo el
gen de acetamidasa) están presentes en dos moléculas de ADN
diferentes sometidas a un proceso de cotransformación, en cuyo caso
la molécula de ADN que contiene el marcador seleccionable no se
integra necesariamente en el genoma del hongo filamentoso huésped,
sino que puede estar presente en una molécula de ADN episomal.
Las secuencias utilizadas para la integración tal
y como se mencionan en el punto b) se utilizan en el caso de que se
desee una integración en un sitio específico (o mejor en un locus
específico). Sin embargo, si tal secuencia no está presente en el
vector puede integrarse en el genoma. Esto no influye en la
capacidad para la deleción del gen marcador seleccionable.
La contraselección dominante arriba descrita
puede emplearse en el desarrollo de cepas industriales de hongos
filamentosos de diversas formas. La utilización de un marcador de
selección dominante resulta particularmente ventajosa en el
desarrollo de cepas de hongos filamentosos mejoradas debido al
hecho de que estas cepas suelen ser con frecuencia diploides o
poliploides.
El vector utilizado para la integración del gen
de amdS contiene preferentemente otro gen de interés. La
invención permite así además la introducción de genes extraños u
homólogos o los elementos de ADN que se deseen en los hongos
filamentosos huésped elegidos utilizando el gen de amdS como
marcador. Posteriormente se elimina el gen de amdS. El gen de
amdS y los genes o elementos de ADN deseados se introducen
preferentemente en sitios específicos, después de lo cual se
procede a la deleción del gen de amdS.
En particular, la invención da a conocer
organismos que contienen genes introducidos en sitios específicos y
sin la presencia de ningún otro ADN extraño. La invención se
utiliza para la integración de múltiples copias de un gen o un
elemento de ADN deseado en los loci genómicos que hayan sido
predeterminados.
La invención proporciona un método para obtener
una selección de cepas recombinantes de hongos filamentosos libres
de gen marcador, tal método comprende las siguientes etapas:
- \bullet
- integración de un gen o de un elemento de ADN deseado y un marcador de selección mediante recombinación homóloga entre secuencias incorporadas en un cartucho de expresión (pistola génica) y secuencias en el cromosoma del huésped,
- \bullet
- selección utilizando el gen marcador de selección que es dominante,
- \bullet
- deleción del gen marcador de selección utilizando regiones flanqueantes del mismo
- \bullet
- selección basada en la ausencia del gen marcador (contraselección).
La presente invención muestra además que este gen
marcador puede eliminarse de los cromosomas de los organismos
transformados sin dejar huellas, es decir ADN de clonación. Por
otra parte, la invención muestra también que es posible obtener
resultados similares, si no idénticos, si el gen o elemento de ADN
deseado y el marcador de selección están presentes en dos moléculas
de ADN diferentes sometidas a un proceso de cotransformación.
Por último, la invención da a conocer el uso del
gen de amdS para la deleción de un gen determinado del
cromosoma de un organismo ``huésped'' de tipo hongo filamentoso
``huésped''.
En vista de todo lo expuesto anteriormente, el
método de la presente invención resulta ideal para, pero no sin
estar limitado a, la clonación y expresión de genes que codifiquen
proteínas utilizadas en ramas como alimentación, piensos o
aplicaciones farmacéuticas o también de genes implicados en la
biosíntesis de antibióticos y de otras sustancias bioactivas, es
decir cualquier proceso que implique proteínas recombinantes y/u
organismos huésped que estén sujetos a requisitos de registro
estrictos.
Las técnicas actuales permiten ya encontrar
ejemplos de tales proteínas, entre las que se incluyen: quimosina,
fitasa, xilanasas, amilasas, celulasas y hemicelulasas, citoquinas
y otras proteínas farmacéuticas, etc.
El mismo método se emplea para la deleción de
genes que codifican proteínas que a su vez influyen en los niveles
de producción de aquellas proteínas deseadas, de nuevo sin dejar
ningún gen marcador en el genoma. Entre tales proteínas se incluyen
proteasas que digieren activamente los productos deseados que están
altamente expresados en la cepa huésped y que, por lo tanto, tienen
un potencial reducido para producir y/o secretar las proteínas
deseadas. Un método preferente para la deleción de un gen
determinado utilizaría un modelo de ADN que contuviera los
siguientes elementos en un orden 5' a 3': secuencias 5' del gen a
ser eliminado, directamente fusionadas con secuencias 3' del mismo,
seguidas por un gen marcador seleccionable funcional situado
``downstream'' (preferentemente un gen de acetamidasa), seguido
``downstream'' de nuevo por secuencias 3' del gen a eliminar. En
este caso, ambas secuencias 3' del gen que se va a delecionar se
eligen de tal modo que formen repeticiones flanqueantes del gen
marcador seleccionable. La transformación de este modelo de ADN y
la subsiguiente sustitución de la copia cromosómica del gen a
eliminar por tal estructura de ADN con puntos de entrecruzamiento
en las secuencias 5' y 3' del gen a eliminar dan como resultado tal
supresión del gen en cuestión. Una posterior recombinación
intracromosómica entre las repeticiones flanqueantes del gen
marcador de selección y una contraselección de estos recombinantes
da como resultado final una cepa de hongo filamentoso libre de gen
marcador seleccionable, en la que se ha eliminado tal gen. El
modelo de ADN utilizado para ello puede elegirse de modo que en la
cepa que porta la deleción no quede ADN extraño ni trazas de la
modificación genética.
La invención da a conocer igualmente
microorganismos de tipo hongo filamentoso recombinantes libres de
gen marcador de selección. Tales microorganismos pueden contener,
tras la utilización de la tecnología aquí presentada, una copia
adicional de un gen deseado (bien homólogo o bien heterólogo).
Estos microorganismos pueden retransformarse una y otra vez
mediante aplicación secuencial de la misma tecnología para insertar
o eliminar copias adicionales de los mismos o de otro/s gen/es de
interés.
Los microorganismos también pueden estar
caracterizados por tener uno o varios genes predeterminados
eliminados o alterados del modo que sea deseado.
El método de la presente invención hace posible
el ajuste fino en la producción de las proteínas deseadas. Esta
posibilidad se debe a la facilidad con que pueden realizarse
repetidas rondas de inserción y deleción. El método hace posible la
inserción o deleción del número deseado de copias génicas. Así
pues, las proteínas se producen en las cantidades y a las
velocidades deseadas. Esto resulta particularmente útil para
producir mezclas de proteínas o enzimas.
Aunque ya es conocido que el gen de acetamidasa
es capaz de la conversión de acetamida como única fuente de
nitrógeno en Aspergillus, aquí se muestra que el gen de
acetamidasa se elimina fácilmente del genoma del Aspergillus
transformado. Para lograr esto, el gen de amdS se clona
entre repeticiones directas. En principio puede emplearse cualquier
repetición directa que permita una recombinación interna. En los
ejemplos posteriores, esto se muestra clonando el gen de
amdS entre secuencias 3' de ADN no codificadoras de
amiloglucosidasa (glaA).
Se demuestra que el gen de amdS puede
integrarse y eliminarse sobre un cultivo en placa en un medio que
contenga fluoroacetamida y urea como fuentes de nitrógeno.
Se demuestra además que el gen de
amiloglucosidasa puede suprimirse del genoma de Aspergillus.
Para ello se construye un vector de reemplazamiento que contenga
una parte del promotor glaA, una secuencia de ADN sintética
con codones de terminación en cada uno de los tres marcos de
lectura, el gen de amdS de A. nidulans bajo el control
del promotor fosfato de 3-gliceraldehído
deshidrogenasa del A. nidulans, y estando el gen de
amdS flanqueado por secuencias no codificadoras de
glaA 3'. Tras la transformación de A. niger, el
vector se integra mediante entrecruzamiento doble, sustituyendo así
eficazmente el gen de amiloglucosidasa. Después de la selección por
la actividad de amdS, las cepas transformadas se cultivan en
placa con fluoroacetamida y urea. El resultado de la selección son
cepas en las que se ha eliminado el gen de amdS.
Este ejemplo tiene como objetivo ilustrar la
posibilidad de utilizar el gen de amdS para suprimir un gen
determinado del genoma de una cepa de Aspergillus. Otros
genes pueden eliminarse o modificarse de manera similar.
En otro ejemplo se demuestra que un gen puede
insertarse libre de marcadores en un sitio predeterminado en el
genoma. Para ello se construye un vector de integración que
contenga el locus glaA de A. niger y el gen
amdS flanqueado por dos repeticiones no codificadoras de
glaA 3'.
El vector se integra ahora en el locus de
amiloglucosidasa. Tras una selección con fluoroacetamida, el gen de
amdS se elimina. De este modo se integra una copia génica en
un locus específico sin dejar ADN marcador.
De lo anterior se deduce que los procedimientos
aquí descritos permiten al técnico en la materia integrar o
suprimir genes deseados en los loci predeterminados sin dejar
señales de ningún ADN marcador de selección.
Este método puede emplearse para la amplificación
y el reemplazamiento génico.
Una aplicación particularmente importante sería
la integración de genes deseados. Seguida de una mejora de cepas
por métodos clásicos, después de la cual los genes que puedan verse
afectados negativamente por estas técnicas clásicas de mejora se
sustituyen por copias no afectadas del gen de interés sin pérdida
de nivel de expresión génica.
Se espera que el sistema arriba descrito para
Aspergillus proporcione los mismos resultados con otras
cepas de hongos filamentosos, cuya incapacidad para crecer en
acetamida como única fuente de nitrógeno es bien sabida. La
utilización del gen de amdS como marcador de selección se ha
descrito para, entre otros, Penicillium y
Trichoderma. Además, el gen de amdS puede utilizarse
incluso en hongos filamentosos que sean capaces de utilizar
acetamida como única fuente de N, aunque sea pobremente. En este
caso, el escaso remanente de células no transformadas puede
reprimirse mediante la inclusión de CsCl en el medio de selección
(Tilburn, J. y col. (1983) Gene, 26,
205-221). Por lo tanto, se espera que el sistema
sea aplicable a hongos filamentosos en general.
Las ventajas del sistema de la presente invención
son diversas. A continuación se indican aquellas más notables:
- \bullet
- Esta demostrado que el sistema de amdS es universalmente aplicable en hongos filamentosos, siendo necesario sólo que el huésped en cuestión no pueda crecer, o pueda hacerlo tan sólo pobremente, en acetamida como única fuente de C o de N pero pueda utilizar bien acetato o bien amoníaco como únicas fuentes de C o de N, respectivamente.
- \bullet
- El sistema de amdS constituye el único sistema de selección bidireccional y dominante. Esta característica es sumamente conveniente para el uso en cepas poliploides o aneuploides, lo que suele ser con frecuencia el caso en productos aislados naturales y/o cepas de hongos filamentosos industriales.
- \bullet
- Tras una mejora clásica de las cepas, cualesquiera copias mutadas del gen deseado pueden reemplazarse fácilmente por copias no mutadas mediante reemplazamiento génico, esto se debe al hecho de que los genes deseados se han integrado en loci bien definidos. Los genes se reemplazan por genes no mutados sin afectar al nivel de expresión génica.
- \bullet
- Debido a la capacidad para introducir múltiples integraciones en loci bien definidos y, por lo tanto, no aleatorios, es posible asegurarse de que no aparecen características indeseables en la cepa del hongo filamentoso durante la amplificación génica.
- \bullet
- El creciente interés referido a la posible liberación de diferentes marcadores de selección al entorno se supera con el sistema presentado. No es necesario que en las cepas de producción del hongo filamentoso esté presente ningún gen marcador seleccionable así como tampoco que aparezcan otras secuencias de ADN innecesarias o no pretendidas tras la introducción ya sea de los genes deseados ya sea de otras modificaciones genéticas.
En los ejemplos aquí descritos, las técnicas de
clonación molecular estándar, tales como aislamiento y
purificación de ácidos nucleicos, electroforesis de ácidos
nucleicos, modificación enzimática, segmentación y/o amplificación
de ácidos nucleicos, transformación de E. coli, etc., se
realizaron según lo descrito en la bibliografía (Sambrook y col.
(1989) ``Molecular Cloning: a laboratory manual'', Cold
Spring Harbour Laboratories, Cold Spring Harbour, Nueva York; Innis
y col. (eds.) (1990) ``PCR protocols, a guide to methods and
applications'' Academic Press, San Diego). La síntesis de
oligodesoxinucleótidos y el análisis secuencial del ADN se
realizaron en un sintetizador Applied Biosystems 380B y en un
secuenciador 373A, respectivamente, de acuerdo con los manuales de
usuario proporcionados por el fabricante.
La transformación de A. niger se realizó
según el método descrito por Tilburn, J. y col. (1983) Gene
26, 205-221 y Kelly, J. & Hynes, M.
(1985) EMBO J., 4, 475-479 con las
siguientes modificaciones:
- -
- se cultivaron esporas durante 16 horas a 30ºC en un agitador rotatorio a 300 rpm en medio esencial mínimo de Aspergillus. El medio mínimo de Aspergillus consta de los siguientes componentes: por litro: 6 gr de NaNO_{3}; 0,52 gr de KCl; 1,52 gr de KH_{2}PO_{4}; 1,12 ml de KOH 4M; 0,52 gr de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O; 10 gr de glucosa; 1 gr de \alpha-aminoácidos; 22 mg de ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O; 11 mg de H_{3}BO_{3}; 5 mg de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O; 1,7 mg de CoCl_{2}\cdot6H_{2}O; 1,6 mg de CuSO_{4}\cdot5H_{2}O; 5 mg de MnCl_{2}\cdot4H_{2}O; 1,5 mg de Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O; 50 mg de EDTA; 2 mg de riboflavina; 2 mg de tiamina\cdotHCl; 2 mg de nicotinamida; 1 mg de piridoxina.HCl; 0,2 mg de ácido pantoténico; 4 \mug de biotina; 10 ml de solución de penicilina (5000 IU/ml)/estreptomicina (5000 UG/ml) (Gibco);
- -
- para la formación de protoplastos se utilizó sólo Novozym 234 (Novo Industri), y no helicasa;
- -
- tras la formación de protoplastos (60-90 minutos) se añadió una disolución tampón KC (KCl 0,8 M, ácido cítrico 9,5 mM, pH 6,2) hasta un volumen de 45 ml y la suspensión de protoplastos se centrifugó a 2.500 rpm a 4ºC durante 10 minutos en un rotor de cubo oscilante. Los protoplastos fueron resuspendidos en 20 ml de tampón KC. A continuación se añadieron 25 ml de tampón STC (sorbitol 1,2 M, Tris-HCl 10 mM pH 7,5, CaCl_{2} 50 mM) y posteriormente se centrifugó la suspensión de protoplastos a 2.500 rpm a 4ºC durante 10 minutos en un rotor de cubo oscilante, se lavó en tampón STC y se resuspendió en tampón STC con una concentración de 10^{8} protoplastos/ml;
- -
- a 200 \mul de la suspensión de protoplastos se le añadió el fragmento de ADN, en un volumen de 10 \mul en una disolución tampón TE (Tris-HCl 10 mM pH 7,5, EDTA 0,1 mM), y posteriormente 100 \mul de una solución de PEG (20% PEG 4000 (Merck), sorbitol 0,8 M, Tris-HCl 10 mM pH 7,5, CaCl_{2} 50 mM);
- -
- tras incubar la suspensión de ADN-protoplastos a temperatura ambiente durante 10 minutos, se añadieron lentamente 1,5 ml de solución de PEG (60% PEG 4000 (Merck), Tris-HCl 10 mM pH 7,5, CaCl_{2} 50 mM), agitando repetidas veces los tubos. Después de incubación a temperatura ambiente durante 20 minutos, las suspensiones se diluyeron con 5 ml de tampón STC, se mezclaron por inversión y se centrifugaron a 2.000 rpm a temperatura ambiente durante 10 minutos. Los protoplastos se resuspendieron suavemente en 1 ml de sorbitol 1,2 M y se cultivaron sobre placas en un medio de regeneración selectivo consistente en un medio esencial mínimo de Aspergillus sin riboflavina, tiamina\cdotHCl, nicotinamida, piridoxina\cdotHCl, ácido pantoténico, biotina, \alpha-aminoácidos ni glucosa, pero con acetamida 10 mM como única fuente de nitrógeno, sacarosa 1 M, solidificado con agar bacteriológico #1 al 2% (Oxoid, Inglaterra). Después de un cultivo de 6-10 días a 30ºC, las placas se replicaron sobre placas de acetamida selectivas consistentes en un medio de regeneración selectivo de Aspergillus con glucosa al 2% en lugar de sacarosa y agarosa al 1,5% en lugar de agar. Después de 5-10 días de cultivo a 30ºC se aislaron los transformantes individuales.
La transformación de A. oryzae se realizó
según el método descrito por Christensen, T. y col. en la Solicitud
de Patente Europea 0 238 023 A2.
La transformación de T. reesei se realizó
según el método descrito por Penttillä M., Knowles, J. (1987)
Gene 61 155-164.
Se utiliza el procedimiento de transformación de
protoplastos con el interferón alfa-PEG. La
preparación de los protoplastos y la transformación de P.
chrysogenum se realizó según el método descrito por Gouka y
col., Journal of Biotechnology 20 (1991),
189-200, con las siguientes modificaciones:
- -
- Después de la transformación, los protoplastos se cultivaron en placas con un medio de regeneración selectivo consistente en un medio esencial mínimo de Aspergillus, estabilizado osmóticamente con sacarosa 1,2 M, y que contiene acetamida al 0,1% como única fuente de nitrógeno y solidificado con agar bacteriológico #1 al 1,5% (Oxoid, Inglaterra).
- -
- Tras 5-8 días de incubación a 25ºC aparecieron los transformantes.
El aislamiento de ADN de Aspergillus y
Trichoderma se realizó según el procedimiento descrito por
Yelton y col. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. 81,
1470-1474.
El aislamiento de ADN de Penicillium se
realizó según el procedimiento descrito por Kolar y col.,
Gene 62 (1988), 127-134.
El marcador de amdS, en la mayoría de los
ejemplos relativos a Aspergillus, Trichoderma y
Penicillium, se clona entre repeticiones consistentes en una
parte de la región 3' no codificadora del gen de amiloglucosidasa.
La eliminación del marcador de selección de amdS se
consiguen mediante recombinación interna entre las secuencias 3' no
codificadoras de glaA que flanquean el marcador de selección
de amds o bien mediante recombinación homóloga entre las
repeticiones que se crean por integración vía un único proceso de
entrecruzamiento. La selección de las células que han perdido el
marcador de selección de amdS se logra mediante cultivo en
placa que contenga fluoroacetamida. Las células que hospedan el gen
de amdS metabolizan la fluoroacetamida para formar amonio y
fluoroacetato, que es tóxico para la célula. Por consiguiente, sólo
aquellas que hayan perdido el gen de amdS son capaces de
crecer en placas que contengan fluoroacetamida.
En el caso de la eliminación del marcador de
amdS de transformantes de Aspergillus, se cultivaron
esporas de estos transformantes sobre placas en un medio de
regeneración selectivo (arriba descrito) que contenía
fluoroacetamida 32 mM y urea 5 mM en lugar de acetamida 10 mM,
glucosa al 1,1% en lugar de sacarosa 1M y agar bacteriológico #1 al
1,1% en lugar de al 2% (Oxoid, Inglaterra). Después de
7-10 días de cultivo a 35ºC se recolectaron
colonias individuales y se cultivaron sobre placas de agar patata
dextrosa al 0,4% (Oxoid, Inglaterra).
En el caso de la eliminación del marcador de
amdS de transformantes de Trichoderma, se cultivaron
esporas de estos transformantes en placas en medio esencial mínimo
no selectivo (por litro: 20 gr de glucosa, 5 gr de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 15 gr de KH_{2}PO_{4}, 0,6 gr
de MgSO_{4}, 0,6 gr de CaCl_{2}, 0,005 gr de
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,0016 gr de MnSO_{4}\cdotH_{2}O,
0,0014 gr de ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,002 gr de CoCl_{2}; pH
5,5), completado con fluoroacetamida 10 mM. Después de
5-10 días a 30ºC, se recolectaron las colonias y se
cultivaron sobre placas de agar patata dextrosa al 0,4% (Oxoid,
Inglaterra).
En el caso de la eliminación del marcador de
amdS de transformantes de Penicillium, se cultivaron
esporas de estos transformantes sobre placas en medio selectivo,
compuesto de un medio esencial mínimo de Aspergillus con
fluoroacetamida 10 mM y glucosa al 5%, solidificado con agar
bacteriológico #1 al 1,5% (Oxoid, Inglaterra). Después de
5-10 días de cultivo a 25ºC aparecieron colonias
resistentes.
Se recolectaron esporas de cepas de A.
niger de control y recombinantes cultivando las esporas o los
micelios sobre placas de PDA (Potato Dextrose Agar (agar patata
dextrosa), Oxoid), preparadas según las instrucciones del
proveedor. Tras un cultivo de 3-7 días a 30ºC, se
recolectaron esporas después de añadir Triton X-100
al 0,01% a las placas. Después de lavar con agua esterilizada, se
inocularon aproximadamente 10^{7} esporas de las cepas de control
y transformantes seleccionadas en matraces agitadores, junto con 20
ml de medio de precultivo líquido cuyo contenido por litro era: 30
gr de maltosa\cdotH_{2}O; 5 gr de extracto de levadura; 10 gr
de caseína hidrolizada; 1 gr de KH_{2}PO_{4}; 0,5 gr de
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O; 3 gr de Tween 80; 10 ml de penicilina
(5000 IU/ml)/estreptomicina (5000 UG/ml); pH 5,5. Estos cultivos se
desarrollaron a 34ºC durante 20-24 horas. Se
inocularon de 5 a 10 ml de este cultivo en 100 ml de medio de
fermentación que contenía, por litro: 70 gr de maltodextrina; 25 gr
de caseína hidrolizada; 12,5 gr de extracto de levadura; 1 gr de
KH_{2}PO_{4}; 2 gr de K_{2}SO_{4}; 0,5 gr de
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O; 0,03 gr de ZnCl_{2}; 0,02 gr de
CaCl_{2}; 0,01 gr de MnSO_{4}\cdot4H_{2}O; 0,3 gr de
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O; 10 ml de penicilina (5000
IU/ml)/estreptomicina (5000 UG/ml); ajustado a un pH de 5,6 con
H_{2}SO_{4} 4N. Estos cultivos se desarrollaron a 34ºC durante
5-10 días. Se tomaron muestras para el análisis de
la producción de glucoamilasa en distintos momentos durante la
fermentación. Se centrifugaron las muestras del caldo de
fermentación (10 minutos, 10.000rpm) y se recolectaron los
sobrenadantes.
La actividad de glucoamilasa se determinó
incubando 10 \mul de una muestra del sobrenadante de cultivo,
diluida seis veces, en NaAc/HAc 0,032 M, pH 4,05, con 115 \mul de
p-nitrofenilo-á-D-glucopiranosido
(Sigma) al 0,2% (p/v) en NaAc/HAc 0,032M, pH 4,05. Después de 30
minutos de incubación a temperatura ambiente, se añadieron 50
\mul de Na_{2}CO_{3} 0,3 M y se midió la absorción a una
longitud de onda de 405 nm. La A_{405nm} es una medida de la
producción de glucoamilasa.
En este ejemplo, un gen diana de A. niger
se reemplazará mediante la transformación del A. niger con
un vector de reemplazamiento, que se integra en su genoma mediante
un proceso de recombinación homóloga de doble entrecruzamiento. El
vector de reemplazamiento comprende una región de ADN homóloga al
locus diana, que presenta una interrupción por un gen marcador
seleccionable flanqueado por repeticiones de ADN.
En este ejemplo se utiliza el plásmido pGBDEL4L
para eliminar la región codificadora y una parte (proximal) de la
región promotora de glaA. Este vector comprende una parte
del locus genómico glaA del A. niger, donde las
secuencias codificadoras de glaA, así como una parte de las
secuencias promotoras de glaA, se reemplazan por el gen de
amdS de A. nidulans bajo el control del promotor
gpdA de A. nidulans como marcador de selección,
flanqueado por secuencias de glaA no traducidas en 3' como
repeticiones directas. La transformación de A. niger con este
vector dirige el reemplazamiento del gen glaA por el gen
marcador de amdS. Realizando una contraselección con
fluoroacetamida en estos transformantes, según lo descrito en los
procedimientos experimentales, se eliminará de forma apropiada el
gen marcador amdS mediante una recombinación interna entre
las repeticiones de ADN glaA 3', lo que resulta en una cepa
recombinante de \DeltaglaA libre de gen marcador, que
finalmente no posee ninguna secuencia de ADN extraña (para una
vista esquemática, véase la figura 2).
El vector de reemplazamiento pGBDEL4L contiene la
parte 5' de la región promotora de amiloglucosidasa (glaA)
de A. niger, una secuencia de ADN sintética de 16 pb que
proporcionan codones de terminación en los tres marcos de lectura,
el gen de acetamidasa (amdS) de A. nidulans bajo el
control del promotor de
gliceraldehído-3-fosfatodeshidrogenasa
(gpdA) de A. nidulans, flanqueado a ambos lados por
secuencias no codificadoras de glaA 3'.
Para obtener el vector de deleción final pGBDEL4L
primero se obtuvieron varios subclones del locus de glaA. En
la figura 3 puede observarse una vista esquemática. El locus
glaA de A. niger se sometió a una clonación molecular
y que ya se había descrito anteriormente (EP 0 463 706 A1). El
plásmido pAB6-1 contiene el locus glaA
completo de A. niger en un fragmento de HindIII de
15,5 kb clonado en el sitio de pUC19 (Yanisch-Perron
y col., Gene 33 (1985)
103-119, y está disponible en, por ejemplo,
Boehringer Mannheim, Alemania). Se digirió pAB6-1
con EcoRI y el fragmento de ADN de EcoRI de 1,8 kb en
la secuencia inmediata ``corriente arriba'' del gen glaA se
aisló mediante electroforesis en gel de agarosa y se ligó en pUC19
digerido con EcoRI y posteriormente se transfirió a E.
coli y se sometió a una clonación molecular. El plásmido
resultante se denominó pAB6-3 (figura 3A). Para
construir el plásmido pAB6-4, que es otro subclón de
pAB6-1, se digirió pAB6-1 con
HindIII y BglII. El fragmento de ADN de 4,6 kb de
tamaño que comprende el promotor glaA y una parte de la
secuencia codificadora de glaA se aisló mediante
electroforesis en gel de agarosa y se ligó en pUC19, que había sido
digerido previamente con HindIII y BamHI (figura 3B).
Como resultado de este procedimiento de clonación se destruyeron de
forma apropiada los sitios de BamHI y de BglII en
pAB6-4.
Posteriormente, tras digerir el plásmido
pAB6-4 con HindIII y EcoRI y llenar
los extremos cohesivos 5' utilizando ADN polimerasa de E.
coli, el fragmento de ADN promotor glaA de 1,8 kb se
aisló mediante electroforesis en gel de agarosa, se ligó en
pAB6-3, que fue digerido parcialmente con
EcoRI, y se trató con ADN polimerasa de E. coli para
generar los extremos romos, la mezcla resultante se transfirió a
E. coli para una clonación molecular. El plásmido derivado
(denominado pAB6-31) contiene un fragmento promotor
de glaA de 3,6 kb con un sitio de EcoRI destruido en
el medio, pero que aún posee el sitio de EcoRI (ahora único
en este fragmento de ADN) situado inmediatamente ``corriente
arriba'' del sitio de iniciación ATG de glaA (figura
4).
El gen de amdS de A. nidulans aquí
utilizado se halla localizado en un fragmento de
EcoRI-KpnI de aproximadamente 4 kb de tamaño en el
plásmido pGW325 (Wernars y col., thesis (1986) Agricultural
University, Wageningen, Holanda). Este fragmento de ADN de
EcoRI-KnpI que contiene el gen amdS,
flanqueado por sus propias secuencias reguladoras, se sometió a
clonación molecular en los sitios apropiados de pUC19 según lo
descrito por Verdoes y col. (Transgenic Res. 2
páginas 84-92, 1993), dando como resultado
pAN4-1. Se digirió pAN4-1 con
EcoRI y KpnI, el fragmento de ADN de 4 kb de tamaño
que contenía el gen amdS se aisló mediante electroforesis en
gel de agarosa, se ligó en pAB6-31 digerido con
EcoRI y KpnI y la mezcla así obtenida se transfirió a
E. coli para una clonación molecular. El plásmido obtenido
se denominó pAB6S (figura 5) y contiene un fragmento de ADN
promotor glaA de 3,8 kb y el fragmento amdS de 4
kb.
En un primer momento, el plásmido pAB6S se
digirió parcialmente con SalI, y se ligó al oligonucleótido
sintético derivado TN0001 (Nº ID SEC: 3), que presenta la siguiente
secuencia:
TN0001 (Nº ID SEC: 3): 5' TCGATTAACTAGTTAA
3'
y posteriormente se digirió con EcoRI. El
fragmento de ADN que comprende el pUC19, el promotor glaA y
las secuencias génicas de amdS se purificó y aisló mediante
electroforesis en gel de agarosa. Del plásmido
pAB6-1, digerido con SalI, se aisló también
el fragmento de ADN de glaA flanqueante en 3' de 2,2 kb
mediante electroforesis en gel de agarosa y se ligó al
oligonucleótido sintético arriba mencionado, tratado con
polinucleótido quinasa T4, posteriormente digerido con EcoRI
y ligado al fragmento de ADN ya mencionado aislado de pAB6S. La
mezcla resultante de ADN se transfirió a E. coli y se
sometió a una clonación molecular. El plásmido derivado se denominó
pGBDEL1 y se muestra en la figura 6. Mediante este procedimiento se
logró destruir el sitio de restricción de SalI e introducir
codones de terminación en todos los marcos de lectura
simultáneamente.
Para obtener un fragmento de ADN de
aproximadamente 1 kb de tamaño, que contuviera secuencias de ADN no
codificadoras de glaA 3' situadas inmediatamente ``corriente
abajo'' del codón de terminación del gen glaA y estuviera
flanqueado por sitios de restricción adecuados, se realizó una
amplificación PCR. En esta amplificación PCR se utilizó como molde
el plásmido pAB6-1 y como cebadores dos
oligonucleótidos derivados sintéticos:
Oligo AB2154 (Nº ID SEC: 4):
5' AACCATAGGGTCGACTAGACAATCAATCCATTTCG
3'
(una secuencia no codificadora de glaA 3'
situada inmediatamente ``corriente abajo'' del codón de
terminación)
y
Oligo AB2155 (Nº ID SEC: 5):
5' GCTATTCGAAAGCTTATTCATCCGGAGATCCTGAT
3'
(una secuencia no codificadora de glaA 3'
alrededor del sitio de EcoRI aprox. 1 kb situada ``corriente
abajo'' del codón de
terminación).
La PCR se realizó según lo descrito por Saiki
y col. (Science 239, 487-491,
1988) y de acuerdo con el proveedor de
TAQ-polimerasa (Cetus). En un amplificador de ADN
(Perkin-Elmer/Cetus) se realizaron veinticinco
ciclos de amplificación (cada 2 minutos a 55ºC; 3 minutos a 72ºC y
2 minutos a 94ºC). El fragmento de ADN amplificado en 1 kb se
digirió con HindIII y SalI, se purificó mediante
electroforesis en gel de agarosa, se precipitó con etanol y
posteriormente se clonó en los sitios de restricción de pGBDEL1. El
plásmido así obtenido se denominó pGBDEL2 (figura 7A,B).
Para obtener el vector de reemplazamiento génico
de glaA final pGBDEL4L se intercambió la región promotora de
amdS de pGBDEL2 por el promotor de gpdA de A.
nidulans, más potente. La fusión de la secuencia promotora de
gpdA con la secuencia codificadora del gen amdS se
realizó por el método de Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR).
Para esta fusión por PCR se utilizaron dos moldes diferentes: el
plásmido pAN7-1 (Punt y col., Gene
56, 117-124, 1987), que contenía el gen
hph de E. coli bajo el control del promotor
gpdA del A. nidulans y el terminador trpC de
A. nidulans, y el plásmido pAN4-1, que
contenía el gen amdS de A. nidulans bajo el control
de sus propias secuencias reguladoras. Como cebadores se utilizaron
cuatro oligonucleótidos sintéticos, que presentaban las siguientes
secuencias:
Oligo AB 2977 (Nº ID SEC: 6):
5' TATCAGGAATTCGAGCTCTGTACAGTGACC
3'
(un oligonucleótido específico de promotor
gpdA 5', situado a aproximadamente 80 pb ``corriente
arriba'' del codón de iniciación de ATG del gen hph de E.
coli)
Oligo AB2992 (Nº ID SEC: 7):
5' GCTTGAGCAGACATCACCATGCCTCAATCCTGGGAA
3'
Oligo AB2993 (Nº ID SEC: 8):
5' TTCCCAGGATTGAGGCATGGTGATGTCTGCTCAAGC
3'
(ambas secuencias son complementarias entre sí y
contienen 18 pb del extremo 3' del promotor gpdA y 18 pb de
la parte 5' de la región codificadora de
amdS)
Oligo AB2994 (Nº ID SEC: 9):
5' CTGATAGAATTCAGATCTGCAGCGGAGGCCTCTGTG
3'
(una secuencia específica de amdS
alrededor del sitio BglII, situada aproximadamente 175 pb
``corriente abajo'' del codón de iniciación de
ATG)
Para fusionar la región promotora gpdA de
880 pb a la secuencia codificadora de amdS se realizaron dos
PCR separadas: la primera amplificación con pAN7-1
como molde y los oligonucleótidos AB 2977 (Nº ID SEC: 6) y AB2993
(Nº ID SEC: 8) como cebadores para amplificar el fragmento de ADN
de 880 pb que comprendía el promotor gpdA flanqueado en el
margen 3' por 18 nucleótidos complementarios al extremo 5' del gen
amdS, y la segunda reacción PCR con pAN4-1
como molde y los oligonucleótidos AB2992 (Nº ID SEC: 7) y AB2994
(Nº ID SEC: 9) como cebadores para amplificar un fragmento de ADN
de 200 pb de tamaño que comprendía la parte 5' del gen amdS
flanqueado en el extremo 5' por 18 nucleótidos complementarios al
extremo 3' del promotor gpdA.
En la figura 8A puede observarse una vista
esquemática de estas amplificaciones. Los dos fragmentos generados
se purificaron posteriormente mediante electroforesis en gel de
agarosa, se precipitaron con etanol y se utilizaron como moldes en
una tercera reacción PCR con los oligonucleótidos AB 2977 (Nº ID
SEC: 6) y AB2994 (Nº ID SEC: 9) como cebadores. El fragmento de ADN
resultante se digirió con EcoRI, se purificó mediante
electroforesis en gel de agarosa y tras precipitación con etanol y
se clonó en el sitio de EcoRI de pTZ18R (United States
Biochemicals). El plásmido resultante se denominó pGBGLA24 (figura
8B).
Para intercambiar la secuencia promotora
amdS de pGBDEL2 por la secuencia promotora de gpdA,
el fragmento de ADN de EcoRI/BglII de aproximadamente
1 kb de tamaño de pGBGLA24 se aisló mediante electroforesis en gel
de agarosa, tras una digestión con las enzimas de restricción
apropiadas, y se ligó en los sitios EcoRI y BglII de
pGBDEL2. El vector de reemplazamiento génico de glaA
resultante se denominó pGBDEL4L (figura 9).
Antes de la transformación de A. niger con
pGBDEL4L, se eliminaron las secuencias de E. coli mediante
digestión con HindIII y XhoI y electroforesis en gel
de agarosa. La cepa de A. niger CBS 513.88 (depositada el 10
de octubre de 1988) se transformó con 2,5, 5 ó 10 \mug de
fragmento de ADN mediante procedimientos como los descritos en
procedimientos experimentales, utilizando acetamida como única
fuente de nitrógeno en placas selectivas. Se purificaron varias
veces transformantes de A. niger individuales sobre placas
selectivas con contenido mínimo esencial en acetamida. Se
recolectaron esporas de los transformantes individuales mediante un
cultivo de aproximadamente 5 días a 30ºC en placas de agar dextrosa
patata al 0,4% (Oxoid, Inglaterra). Se realizaron análisis Southern
para verificar la presencia del locus de glaA truncado. Se
aisló el ADN de alto peso molecular de varios transformantes, se
digirió con BamHI y KpnI y posteriormente se
fraccionó mediante electroforesis en un gel de agarosa al 0,7%.
Después de la transferencia a filtros de nitrocelulosa, se realizó
una hibridación según los procedimientos estándar, utilizando dos
sondas marcadas con ^{32}P: un fragmento de promotor de
glaA de XhoI/SalI aislado del plásmido
pAB6-4 (arriba descrito, figura 3A) y una sonda que
reconoce secuencias de xilanasa endógenas (Solicitud de Patente
Europea
\hbox{0 463 706 A).} En la figura 10A se
muestran a modo de ejemplos los resultados de sólo 4 transformantes
(#19, #23, #24, #41) y la cepa de control A. niger CBS
531.88. Para una mejor comprensión de esta autorradiografía, la
figura 11 ofrece una representación esquemática que muestra el
tamaño de los fragmentos de hibridación en los loci de glaA
intactos y truncados.
En el locus de glaA intacto son
característicos un fragmento de hibridación de 3,5 kb en un
producto de digestión de BamHI y un fragmento de hibridación
de 4,5 kb en un producto de digestión de KpnI (véase figura
11A). En un locus de glaA truncado, el fragmento de
hibridación de BamHI de 3,5 kb y el fragmento de hibridación
de KpnI de 4,5 kb se hallan ausentes y han sido reemplazados
por un fragmento de hibridación de BamHI de 5,5 kb y un
fragmento de hibridación de KpnI de 6,3 kb. En este ejemplo,
como puede observarse en la figura 10A, el transformante #19
presenta el patrón esperado de un locus de glaA truncado
(figura 11B). Este transformante se denominó
GBA-102.
En los otros transformantes no se ha producido
reemplazamiento alguno del gen de glaA. Las bandas de
hibridación pobre: 4, 8 y 15 kb en el producto de digestión de
KpnI y 7 y 12 kb en el producto de digestión de
BamHI, en relación con las secuencias de xilanasa como
control interno.
El gen de amdS del transformante A.
niger GBA-102 se eliminó de nuevo según lo
descrito en la sección Experimental. La eliminación del gen marcador
de selección de amdS en sólo 2 cepas recombinantes
supervivientes se verificó mediante análisis Southern del ADN
cromosómico. El ADN de alto peso molecular se aisló, se digirió con
BamHI y KpnI y posteriormente se separó mediante
electroforesis en un gel de agarosa al 0,7%. Después de una
transferencia a nitrocelulosa, se realizó una hibridación según los
procedimientos estándar utilizando las sondas descritas en la
sección anterior. En la figura 11C puede observarse una
representación esquemática de los fragmentos de hibridación. Los
resultados de los análisis Southern se presentan en la figura 10B.
La presencia de un fragmento de hibridación de BamHI de 5,2
kb y un fragmento de hibridación de KpnI de 3,4 kb, con la
pérdida concomitante del fragmento de BamHI de 5,5 kb y el
fragmento de hibridación KpnI de 6,3 kb, es específica para
la ausencia del marcador de selección amdS. Los fragmentos
de hibridación de 7 y 12 kb más débiles en un producto de digestión
de BamHI y los fragmentos de KpnI de 4, 8 y 15 kb se
refieren de nuevo al locus de xilanasa endógena. Ambas cepas
presentan el patrón esperado. En estas cepas recombinantes, que se
denominaron GBA-107 y GBA-108, las
secuencias de glaA predeterminadas se eliminan correctamente
y finalmente las cepas no poseen ningún gen marcador de selección.
Ambas cepas pueden reutilizarse para eliminar o insertar otros
genes o elementos de ADN utilizando el mismo tipo de vector.
En este ejemplo se describe la introducción de un
gen en el genoma de A. niger utilizando aproximadamente el
mismo enfoque y los mismos procedimientos que los descritos en el
ejemplo anterior. Además del gen o elemento de ADN deseado, el
vector contiene secuencias de ADN homólogas al genoma huésped para
dirigir el vector a un locus genómico predeterminado del huésped,
mediante un entrecruzamiento simple. Este tipo de vector comprende
un gen marcador de selección flanqueado también por repeticiones de
ADN. El gen marcador de selección de los transformantes derivados
con este vector puede eliminarse de nuevo y de forma apropiada
aplicando el procedimiento de contraselección. Como ejemplo se
describe la introducción de una copia de gen glaA, que se
integra en el locus de glaA truncado en la cepa de
GBA-107 \DeltaglaA recombinante de A.
niger derivada en el Ejemplo 1 (para un dibujo esquemático,
véase figura 12).
El vector de integración pGBGLA30 consta del gen
de amiloglucosidasa (glaA) de A. niger bajo el
control del promotor nativo y del gen de amdS de A.
nidulans bajo el control del promotor de gpdA de
A.nidulans flanqueado por secuencias 3' no codificadoras de
glaA para dirigir la integración en la región 3' no
codificadora de glaA y eliminar el gen marcador de selección
amdS por medio de una contraselección.
Un fragmento de promotor de glaA de
XhoI/EcoRI de 1,8 kb de pAB6-1
(figura 13) se subclonó en los sitios SmaI y EcoRI de
pTZ19R (United States Biochemicals). El extremo saliente 5' del
sitio XhoI del fragmento de promotor de glaA se
rellenó utilizando el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I de
E. coli antes de la clonación en pTZ19R. Mediante este
procedimiento de clonación se destruye el sitio SmaI y se
restaura el sitio XhoI. El plásmido así obtenido se denominó
pGBGLA5 (figura 13).
Para introducir sitios de restricción apropiados
(AatII, SnaBI, AsnI y NotI) y destruir
el sitio XhoI en el promotor de glaA, el fragmento
sintético consistente en los dos oligonucleótidos AB3657 (Nº ID SEC:
10) y AB3658 (Nº ID SEC: 11):
se insertó en los sitios de HindIII y
XhoI de pGBGLA5. El plásmido así obtenido se denominó
pGBGLA26 (figura
14).
A continuación, el fragmento de EcoRI de
3,4 kb de pAB6-1 que contenía la parte 3' restante
del promotor de glaA, la secuencia codificadora de
glaA y parte de la secuencia 3' no codificadora de
glaA se clonó al sitio de EcoRI de pGBGLA26. Este
nuevo plásmido se denominó pGBGLA27 (figura 15). Este plásmido se
digirió parcialmente con EcoRI y el fragmento sintético
compuesto de los oligonucleótidos AB3779 (Nº ID SEC: 12) y AB3780
(Nº ID SEC: 13):
se insertó en el sitio de EcoRI en el
extremo de la secuencia 3' no codificadora glaA del gen de
glaA. Mediante este paso de clonación se destruyó el sitio
de EcoRI y se introdujo un sitio de restricción de
ApaI y XhoI. El plásmido resultante se denominó
pGBGLA42 (figura
16).
La amplificación de las secuencias 3' no
codificadoras de glaA de 2,2 kb y el ajuste concomitante de
los sitios de restricción apropiados se realizó mediante el método
de Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR).
En estas reacciones PCR, se utilizó como molde el
plásmido pAB6-1 que contiene el locus de
glaA completo y como cebadores se diseñaron cuatro
oligonucleótidos sintéticos con la siguiente secuencia:
Oligo AB3448 (Nº ID SEC: 14):
5' GTGCGAGGTACCACAATCAATCCATTTCGC
3'
(una secuencia específica 3' no codificadora de
glaA, localizada inmediatamente ``corriente abajo'' del
codón de terminación del gen
glaA)
Oligo AB3449 (Nº ID SEC: 15):
5' ATGGTTCAAGAACTCGGTAGCCTTTTCCTTGATTCT
3'
(una secuencia específica 3' no codificadora de
glaA alrededor del sitio de KpnI, aprox. 1 kb
``corriente abajo'' del codón de
terminación)
Oligo AB3450 (Nº ID SEC: 16):
5' AGAATCAAGGAAAAGGCTACCGAGTTCTTGAACCAT
3'
(una secuencia específica 3' no codificadora de
glaA alrededor del sitio de KpnI, aprox. 1 kb
``corriente abajo'' del codón de
terminación)
Oligo AB3520 (Nº ID SEC: 17):
5' ATCAATCAGAAGCTTTCTCTCGAGACGGGCATCGGAGTCCCG
3'
(una secuencia específica 3' no codificadora de
glaA, aprox. 2,2 kb ``corriente abajo'' del codón de
terminación)
Para destruir el sitio de KpnI
aproximadamente 1 kb ``corriente abajo'' del codón de terminación
del gen de glaA y cambiar el sitio de SalI
aproximadamente 2,2 kb ``corriente abajo'' del codón de terminación
del gen de glaA a un sitio de XhoI, se realizaron dos
reacciones en cadena de polimerasa separadas: la primera reacción
con los oligonucleótidos AB3448 (Nº ID SEC: 14) y AB3449 (Nº ID
SEC: 15) como cebadores para amplificar un fragmento de ADN de
aproximadamente 1 kb localizado inmediatamente ``corriente abajo''
del codón de terminación del gen glaA, y la segunda reacción
con los oligonucleótidos AB3450 (Nº ID SEC: 16) y AB3520 (Nº ID
SEC: 17) como cebadores para amplificar un fragmento de ADN de
aproximadamente 1,2 kb inmediatamente ``corriente abajo'' del sitio
de KpnI en la región 3' no codificadora de glaA,
ambas con pAB6-1 como molde. En la figura 17A puede
observarse una vista esquemática de estas amplificaciones. La PCR se
realizó según lo descrito en el Ejemplo 1. Se efectuaron
veinticinco ciclos de amplificación (cada 1 minuto a 55ºC; 1,5
minutos a 72ºC y 1 minuto a 94ºC).
Los dos fragmentos de ADN generados por PCR se
purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa y
precipitación con etanol y posteriormente se utilizaron como moldes
en la tercera PCR con los oligonucleótidos AB3448 (Nº ID SEC: 14) y
AB3520 (Nº ID SEC: 17) como cebadores para generar el fragmento de
fusión. Se efectuaron veinticinco ciclos de amplificación (cada
uno: 2 minutos a 55ºC; 3 minutos a 72ºC; 2 minutos a 94ºC) en un
amplificador de ADN (Perkin-Elmer/Cetus). El
fragmento de ADN amplificado se purificó mediante electroforesis en
gel de agarosa y precipitación con etanol y posteriormente se
subclonó en sitio SmaI de pTZ18R. El plásmido obtenido se
denominó pGBGLA17 (figura 17B).
Para fusionar esta región ajustada 3' no
codificadora de glaA al gen de amdS, se subclonó una
parte del gen de amdS de pGBDEL4L a pSP73 (Promega). Para
esta construcción, se digirió pGBDEL4L con BglII y
HindIII, el fragmento 3' no codificador de
amdS/glaA se aisló mediante electroforesis en gel de
agarosa y se subclonó a los sitios apropiados de pSP73 (Promega).
El plásmido resultante se denominó pGBGLA21 (figura 18).
La región 3' no codificadora de glaA de
aproximadamente 1 kb de tamaño de este plásmido fue intercambiada
por la región 3' no codificadora de glaA de 2,2 kb de
pGBGLA17. pGBGLA17 y pGBGLA21 fueron digeridas con KpnI y
HindIII. El fragmento de ADN de la región 3' no codificadora
de glaA de 2,2 kb de pGBGLA17 y el fragmento de ADN de 4,9
kb de pGBGLA21 se aislaron mediante electroforesis en gel de
agarosa, se ligaron y posteriormente se sometieron a una clonación
molecular mediante una transferencia de la mezcla obtenida a E.
coli. El plásmido así derivado se denominó pGBGLA22 (figura
19).
El gen de amdS con la región 3' no
codificadora de glaA extendida se completó con el promotor
gpdA y se fusionó a la parte remanente del gen amdS.
pGBGLA22 se digirió con BglII y HindIII, el fragmento
de ADN de la región 3' no codificadora de amdS/glaA
de 4,4 kb se aisló mediante electroforesis en gel de agarosa,
posteriormente se ligó con el plásmido pGBGLA24, digerido con
BglII y HindIII, y se transfirió a E. coli. El
plásmido así derivado se denominó pGBGLA25 (figura 20).
pGBGLA25 fue parcialmente digerido con
EcoRI y, en el sitio de EcoRI del promotor
gpdA, se insertó el fragmento sintético compuesto de los dos
oligonucleótidos AB3781 (Nº ID SEC: 18) y AB3782 (Nº ID SEC:
19):
Este nuevo plásmido se denominó pGBGLA43 (figura
21). En este paso de clonación, el sitio de restricción de
EcoRI localizado justo delante del promotor gpdA fue
destruido por la introducción de un sitio de restricción de
ApaI.
El plásmido pGBGLA43 se digirió con ApaI y
XhoI, y el fragmento de ADN de 5,3 kb que comprendía el
promotor gpdA/el gen amdS/la región 3' no
codificadora de glaA se aisló mediante electroforesis en gel
de agarosa, posteriormente se ligó con pGBGLA42, digerido con
ApaI y XhoI, y se transfirió a E. coli. El
plásmido derivado se denominó pGBGLA28 (figura 22).
Antes de realizar la clonación, el fragmento de
ADN de la región 3' no codificadora de glaA (situado a
aproximadamente 2,2 kb ``corriente abajo'' del codón de terminación
del gen glaA, denominada región 3'' no codificadora de
glaA) se amplificó y se equipó con sitios de restricción
adecuados utilizando el método PCR.
Para esta reacción PCR se utilizó como molde el
plásmido pAB6-1 y como cebadores se diseñaron dos
oligonucleótidos sintéticos con la siguiente secuencia:
Oligo AB3746 (Nº ID SEC: 20):
5' TGACCAATAAAGCTTCTCGAGTAGCAAGAAGACCCAGTCAATC
3'
(una secuencia específica 3'' en parte no
codificadora de glaA alrededor del sitio de SalI
situada a aproximadamente 2,2 kb ``corriente abajo'' del codón de
terminación del gen
glaA)
Oligo AB3747 (Nº ID SEC: 21):
5'
CTACAAACGGCCACGCTGGAGATCCGCCGGCGTTCGAAATAACCAGT
3'
(una secuencia específica 3'' en parte no
codificadora de glaA alrededor del sitio de XhoI
situada a aproximadamente 4,4 kb ``corriente abajo'' del codón de
terminación del gen
glaA)
Se realizaron veinticinco ciclos de amplificación
(cada uno: 1 minuto a 55ºC; 1,5 minutos a 72ºC; 1 minuto a 94ºC) en
un amplificador de ADN (Perkin-Elmer/Cetus). En la
figura 23A puede observarse una representación esquemática de esta
amplificación. El fragmento de ADN así obtenido se digirió con
HindIII, se purificó mediante electroforesis en gel de
agarosa y precipitación con etanol y se subclonó en ambas
orientaciones en el sitio de HindIII de pTZ19R. Los
plásmidos resultantes se denominaron pGBGLA29A y pGBGLA29B (figura
23).
El paso final comprende la inserción de la
secuencia 3'' no codificadora glaA de pGBGLA29A en el
plásmido pGBGLA28. Para ello, se digirió pGBGLA29A con
HindIII y NotI. El fragmento de la región 3' no
codificadora de glaA de 2,2 kb de tamaño se aisló mediante
electroforesis en gel de agarosa, posteriormente se ligó a
pGBGLA28, digerido con HindIII y NotI, y se
transfirió a E. coli. El vector de integración derivado se
denominó pGBGLA30 (figura 24).
Antes de la transformación se eliminaron las
secuencias de E. coli del vector de integración pGBGLA30
mediante digestión con XhoI y electroforesis en gel de
agarosa. La cepa de A. niger GBA-107 se
transformó con 5 o bien 10 \mug de fragmento de ADN mediante
procedimientos como los descritos en la sección experimental. Se
purificaron varias veces transformantes de A. niger
individuales en placas selectivas con contenido en acetamida.
Después de un cultivo de aproximadamente 5 días a 30ºC en placas de
agar dextrosa patata al 0,4% (Oxoid, Inglaterra), se recolectaron
esporas de los transformantes individuales. Se realizaron análisis
Southern para verificar si se había producido la integración en la
región 3' no codificadora de glaA del locus endógeno
truncado de glaA. El ADN de alto peso molecular de diversos
transformantes se aisló, se digirió con KpnI o bien
BglII y posteriormente se fraccionó mediante electroforesis
en un gel de agarosa al 0,7%. Después de una transferencia a
filtros de nitrocelulosa, se realizó una hibridación según los
procedimientos estándar. Como sonda se utilizó un fragmento de
promotor de glaA de XhoI/SalI de aprox. 0,7 kb
marcado con ^{32}P aislado del plásmido pAB6-4
(descrito en el Ejemplo 1). En la figura 25 se muestran, a modo de
ejemplos, los resultados de sólo 3 transformantes
(#107-5, #107-9 y
#107-7) y la cepa de referencia A. niger
GBA107 y su ancestro A. niger CBS 531.88. Para una mejor
comprensión de la autorradiografía, la figura 26A,B,C ofrece una
representación esquemática que muestra el tamaño de los fragmentos
de hibridación del locus de glaA intacto, del locus de
glaA truncado y del locus de glaA truncado con una
única copia de pGBGLA30 integrada en la región 3' no codificadora
predeterminada de glaA.
En el locus de glaA intacto es
característico un fragmento de hibridación de 4,5 kb en un producto
de digestión de KpnI y un fragmento de hibridación de 10 kb
en un producto de digestión de BglII. En el locus de
glaA truncado de A. niger GBA-107 es
característico un fragmento de hibridación de 3,4 kb en un producto
de digestión de KpnI y un fragmento de hibridación de 13 kb
en un producto de digestión de BglII. En el caso de una
integración del vector pGBGLA30 en la región 3' del locus de
glaA truncado, en un producto de digestión de KpnI se
espera un fragmento de hibridación de 6,7 kb adicional junto al
fragmento de hibridación de 3,4 kb y en un producto de digestión de
BglII el fragmento de hibridación de 13 kb está ausente y
aparece sustituido por un fragmento de hibridación de 14,5 kb. Como
puede observarse en la figura 25, los transformantes
#107-5 y #107-9 presentan el patrón
de hibridación esperado de una única copia de pGBGLA30 integrada en
la región 3' no codificadora predeterminada del locus truncado de
glaA. El patrón de hibridación del transformante
#107-7 indica la integración de la copia de
pGBGLA30 en otro sitio del genoma de A. niger
GBA-107. Los transformantes con la copia de
pGBGLA30 correctamente integrada se denominaron
GBA-119 y GBA-122 y se utilizaron
para eliminar posteriormente de forma apropiada el gen marcador de
selección de amdS.
El gen marcador de selección amdS de los
transformantes A. niger GBA-119 y
GBA-122 se eliminó de nuevo según lo descrito en la
sección experimental. La eliminación del gen marcador de selección
de amdS en varias cepas recombinantes supervivientes se
verificó mediante análisis Southern del ADN cromosómico. El ADN de
alto peso molecular se aisló, se digirió con KpnI o bien
BglII y posteriormente se separó mediante electroforesis en
un gel de agarosa al 0,7%. Después de una transferencia a
nitrocelulosa, se realizó una hibridación según los procedimientos
estándar. Como sonda se utilizó el fragmento 3'' no codificador de
gla HindIII/NotI de 2,2 kb marcado con
^{32}P aislado del plásmido pGBGLA29A (antes descrito, figura
24).
En la figura 26 puede observarse una
representación esquemática de los fragmentos de hibridación. En la
figura 27A,B se muestran los resultados de sólo 3 cepas
recombinantes supervivientes de A. niger
GBA-119 (#AG5-5,
#AG5-6 y #AG5-7), así como de 3
cepas recombinantes supervivientes de A. niger
GBA-122 (#AG9-1,
#AG9-2 y #AG9-4) y las cepas de
referencia A. niger CBS 531.88 y A. niger
GBA-107.
En la cepa A. niger CBS 531.88 se observa
un fragmento de hibridación de 6,9 kb en un producto de digestión
de KpnI y un fragmento de hibridación de 6,9 kb en un
producto de digestión de BglII. En la cepa A. niger
GBA-107 se observa un fragmento de hibridación de
6,9 kb en un producto de digestión de KpnI y un fragmento de
hibridación de 13 kb en un producto de digestión de BglII.
En las cepas A. niger GBA-119 y
GBA-122 con una única copia de pGBGLA30 integrada
en la región 3' no codificadora de glaA se observa una banda
de hibridación de 8 kb y otra de 6,7 kb en un producto de digestión
de KpnI y una banda de hibridación de 14,5 kb y otra de 7,6
kb en un producto de digestión de BglII.
De la eliminación correcta del gen marcador de
selección de amdS son específicas la presencia de un
fragmento de hibridación de 6,7 kb y otro de 8,5 kb en un producto
de digestión de KpnI y una pérdida concomitante del
fragmento de hibridación de 8 kb. En un producto de digestión de
BglII, un fragmento de hibridación de 14,5 kb y otro de 6,9
kb, con una pérdida concomitante del fragmento de hibridación de
7,6 kb, son específicos de la ausencia del gen marcador de
selección amdS. Como puede observarse en la figura 27, las
cepas #AG5-7, #AG5-5,
#AG9-1 y #AG9-4 presentan el patrón
de hibridación esperado con el gen marcador de selección
amdS correctamente eliminado. Estas cepas se denominaron
GBA-120, GBA-121,
GBA-123 y GBA-124 respectivamente.
Los patrones de hibridación de las cepas #AG5-6 y
#AG9-2 indican una pérdida de la copia de pGBGLA30
completa, cuyo resultado es la cepa progenitora A. niger
GBA-107, con sólo un locus de glaA
truncado.
Las cepas A.niger GBA-120,
GBA-121, GBA-123 y
GBA-124 se ensayaron en cuanto a su capacidad para
producir glucoamilasa en fermentaciones en un matraz con agitador.
Como cepas de referencia se ensayaron A. niger CBS 531.88,
GBA-107, GBA-119 y
GBA-122. Las fermentaciones en matraz con agitador
y el ensayo de glucoamilasa se realizaron según lo descrito en la
sección experimental. En las cepas GBA-119 a
GBA-124 se midieron niveles que oscilaban entre
150-200 U/ml. Estos niveles de glucoamilasa eran los
esperados y comparables a los niveles obtenidos con la cepa
progenitora de tipo salvaje no transformada A. niger CBS
531.88.
En este ejemplo se describe la introducción de un
gen en el genoma de A. niger utilizando aproximadamente el
mismo tratamiento y los mismos procedimientos que los descritos en
el ejemplo anterior. La principal diferencia es que el gen en
cuestión y el gen marcador de selección están situados en dos
vectores separados y que estos vectores aparecen cotransformados en
A. niger. Además del gen en cuestión o el gen marcador, los
vectores contienen secuencias homólogas de ADN al genoma huésped
para dirigir los vectores a un locus genómico predeterminado del
huésped, mediante un suceso de entrecruzamiento simple. Realizando
una contraselección con fluoroacetamida en estos
(co)transformantes (según lo descrito en los procedimientos
experimentales), el gen marcador amdS se eliminará
apropiadamente mediante un suceso de recombinación interna entre
las repeticiones de ADN creadas mediante integración vía un suceso
de entrecruzamiento simple.
El vector con el gen en cuestión pGBGLA53
consiste en el gen de fitasa de A. ficuum bajo el control
del promotor de glucoamilasa (glaA) de A. niger
flanqueado por secuencias 3' no codificadoras de glaA para
dirigir la integración a la región 3' no codificadora de
glaA. El vector con el gen marcador de selección pGBGLA50
consiste en el gen amdS de A. nidulans bajo el
control del promotor gpdA de A. nidulans flanqueado
por secuencias 3' no codificadoras de glaA para dirigir la
integración a la región 3' no codificadora de glaA.
La construcción de pGBGLA50 comprende un paso de
clonación. El plásmido pGBGLA29A se digirió con HindIII y
los extremos cohesivos se llenaron utilizando el fragmento Klenow
de la ADN polimerasa de E. coli. A continuación, el
fragmento de la región 3'' no codificadora de glaA de 2,2 kb
se aisló mediante electroforesis en gel de agarosa, posteriormente
se ligó en pGBGLA43, digerido con ApaI, y se trató con ADN
polimerasa T4 para generar extremos romos, y se transfirió a E.
coli. El plásmido derivado con el fragmento de ADN de la región
3'' no codificadora de glaA en la orientación correcta se
denominó pGBGLA50 (figura 28).
El primer paso en la vía de construcción de
pGBGLA53 es la subclonación de dos fragmentos, que comprenden el
promotor de glaA fusionado con la secuencia codificadora del
gen de fitasa de A. ficuum casi completa. Para ello, el
plásmido pGBGLA42 se digirió con HindIII y EcoRI y el
fragmento de promotor 5' de glaA HindIII/EcoRI
de 1,8 kb se aisló mediante electroforesis en gel de agarosa. El
plásmido pFYT3 (Solicitud de Patente Europea 0 420 358 A1) se
digirió con EcoRI y BglII y el fragmento de
EcoRI/BglII de 1,6 kb que comprendía la parte 3' del
promotor glaA fusionada con la parte 5' del gen de fitasa se
aisló mediante electroforesis en gel de agarosa y se ligó, junto
con el fragmento 5' de promotor de glaA
HindIII/EcoRI de 1,8 kb, aislado de pGBGLA42, a los
sitios de HindIII y BglII de pSp73 (Promega). El
plásmido resultante se denominó pGBGLA49 (figura 29).
El siguiente paso es la clonación de un fragmento
de ADN de la región 3' no codificadora de glaA a pGBGLA49.
Antes de realizar la clonación, este fragmento de ADN de la región
3' no codificadora de glaA (situado a aproximadamente 2,2 kb
``corriente abajo'' del codón de terminación del gen glaA)
se amplificó y se equipó con sitios de restricción adecuados
utilizando el método PCR.
Para esta reacción PCR se utilizó como molde el
plásmido pAB6-1 y como cebadores se diseñaron dos
oligonucleótidos sintéticos con la siguiente secuencia:
\newpage
Oligo AB4234 (Nº ID SEC: 22):
5' GAAGACCCAGTCAAGCTTGCATGAGC
3'
(una secuencia 3' no codificadora de glaA,
situada a aproximadamente 2,2 kb ``corriente abajo'' del codón de
terminación del gen
glaA)
Oligo AB4235 (Nº ID SEC: 23):
5' TGACCAATTAAGCTTGCGGCCGCTCGAGGTCGCACCGGCAAAC
3'
(una secuencia 3' no codificadora de glaA
situada a aproximadamente 4,4 kb ``corriente abajo'' del codón de
terminación del gen
glaA)
Se realizaron veinticinco ciclos de amplificación
(cada uno: 1 minuto a 94ºC; 1 minuto a 55ºC; 1,5 minutos a 72ºC) en
un amplificador de ADN (Perkin-Elmer). En la figura
30A puede observarse una representación esquemática de esta
amplificación. El fragmento así obtenido se digirió con
HindIII, se purificó mediante electroforesis en gel de
agarosa y se subclonó al sitio de HindIII de pTZ19R. El
plásmido resultante se denominó pGBGLA47 (figura 30).
El plásmido pGBGLA47 se digirió con
HindIII y NotI, el fragmento de ADN 3'' no
codificador de glaA de 2,2 kb se aisló mediante
electroforesis en gel de agarosa y se clonó a los sitios
HindIII y NotI de pGBGLA49. El plásmido resultante se
denominó pGBGLA51 (figura 31).
El último paso en la vía de construcción de
pGBGLA53 es la clonación del fragmento de ADN que comprende la
parte restante de la secuencia codificadora de fitasa fusionada con
el fragmento de ADN 3' no codificador de glaA situado
inmediatamente ``corriente abajo'' del codón de terminación del gen
glaA. Antes de realizar la clonación, la parte remanente del
gen de fitasa y el fragmento de ADN 3' no codificador de
glaA situado inmediatamente ``corriente abajo'' del codón de
terminación del gen glaA se fusionaron y equiparon con
sitios de restricción adecuados utilizando el método PCR. En la PCR
se utilizó como molde el plásmido pAB6-1 y como
cebadores dos oligonucleótidos sintéticos con la siguientes
secuencias:
Oligo AB4236 (Nº ID SEC: 24):
| \hskip2cm 5' TGACCAATAAAGCTTAGATCTGGGGGTGATTGGGCGGAGTGTTTTGCTT |
| \hskip2cm AGACAATCAATCCATTTCGC 3' |
(36 pb de la secuencia codificadora de fitasa,
comenzando en el sitio de BglII hasta el codón de
terminación fusionada con la región 3' no codificadora de
glaA que comienza inmediatamente ``corriente abajo'' del
codón de terminación del gen
glaA)
Oligo AB4233 (Nº ID SEC: 25):
5' TGACCAATAGATCTAAGCTTGACTGGGTCTTCTTGC
3'
(una secuencia 3' no codificadora de glaA
situada a aproximadamente 2,2 kb ``corriente abajo'' del codón de
terminación del gen
glaA)
Se realizaron veinticinco ciclos de amplificación
(cada uno: 1 minuto a 94ºC; 1 minuto a 55ºC; 1,5 minutos a 72ºC) en
un amplificador de ADN (Perkin-Elmer). En la figura
32A puede observarse una representación esquemática de esta
amplificación. El fragmento así obtenido se digirió con
HindIII, se purificó mediante electroforesis en gel de
agarosa y se subclonó en ambas orientaciones al sitio de
HindIII de pTZ19R. Los plásmidos resultantes se denominaron
pGBGLA48 y pGBGLA52 (figura 32B).
El plásmido pGBGLA52 se digirió con BglII
y parcialmente con BamHI, el fragmento de ADN 3' no
codificador de fitasa/glaA de 2,2 kb se aisló mediante
electroforesis en gel de agarosa y se clonó en el sitio de
BglII de pGBGLA51. El plásmido derivado con el fragmento de
ADN 3' no codificador de fitasa/glaA de 2,2 kb en la
orientación correcta se denominó pGBGLA53 (figura 33).
Antes de la transformación, se eliminaron las
secuencias de E. coli de pGBGLA50 y pGBGLA53, mediante una
digestión con XhoI y HindIII respectivamente, seguida
de una electroforesis en gel de agarosa. La cepa de A. niger
GBA-107 se transformó con, respectivamente, 1 \mug
de fragmento de pGBGLA50 más 1 \mug de fragmento de pGBGLA53, 1
\mug de fragmento de pGBGLA50 más 5 \mug de fragmento de
pGBGLA53, y 1 \mug de fragmento de pGBGLA50 más 10 \mug de
fragmento de pGBGLA53, utilizando el procedimiento de
transformación descrito en la sección experimental.
\newpage
Se aislaron y se purificaron los transformantes
individuales y se realizó un análisis southern, utilizando los
mismos productos de digestión y las mismas sondas que los descritos
en el Ejemplo 2 para verificar la integración tanto de pGBGLA50
como de pGBGLA53. En aproximadamente un 10-20% de
los transformantes analizados, tanto pGBGLA50 como pGBGLA53 se
habían integrado en el genoma de la cepa huésped de A. niger
GBA-107. El transformante que mostraba el patrón de
integración correcto, con una única copia de pGBGLA50 y una única
copia de pGBGLA53, integradas ambas en la región 3' no codificadora
predeterminada de glaA del locus de glaA truncado, se
utilizó para eliminar posteriormente el gen marcador de selección
amdS.
Realizando una contraselección con
fluoroacetamida (según lo descrito en los procedimientos
experimentales), se eliminó el gen marcador amdS por medio
de un proceso de recombinación interna entre las repeticiones de ADN
que fueron creadas mediante integración vía entrecruzamiento simple
(es decir las secuencias 3' no codificadoras de glaA). La
correcta eliminación de únicamente el gen marcador amdS se
verificó mediante un análisis Southern, utilizando los mismos
productos de digestión y las mismas sondas que en el Ejemplo 2.
Este ejemplo describe la introducción libre de
gen marcador del gen glaA o el gen de fitasa en A.
oryzae NRRL3485. Se transformó A. oryzae NRRL3485 según
lo descrito en la sección experimental, utilizando los mismos
vectores y el mismo método que los descritos en los Ejemplos 2 y 3.
Se aislaron y purificaron transformantes individuales y se realizó
un análisis Southern del ADN cromosómico de varios transformantes
para verificar las integraciones de, el vector pGBGLA30 o los
vectores pGBGLA50 y pGBGLA53 respectivamente. En el análisis
Southern se utilizaron los mismos productos de digestión y las
mismas sondas que los descritos en el Ejemplo 2.
En el caso de la integración del vector pGBGLA30
se utilizó un transformante con una única copia de pGBGLA30
integrada en el genoma de la cepa huésped A. oryzae NRRL3485
para eliminar el gen amdS correctamente. Se realizó una
contraselección en placas con contenido de fluoroacetamida según lo
descrito en la sección experimental. La eliminación correcta del gen
amdS se verificó mediante un análisis Southern de ADN
cromosómico de varias cepas resistentes a la fluoroacetamida. Se
utilizaron los mismos productos de digestión y las mismas sondas
que los descritos en el Ejemplo 2.
En el caso de la cotransformación de los vectores
pGBGLA50 y pGBGLA53, se utilizó un transformante con una única
copia tanto de pGBGLA50 como de pGBGLA53 integrada en el genoma
huésped para eliminar el gen marcador amdS correctamente. Se
realizó una contraselección, utilizando placas de fluoroacetamida,
según lo descrito en la sección experimental. La eliminación
correcta del gen marcador amdS (por ejemplo el vector
pGBGLA50) se verificó mediante un análisis Southern de ADN
cromosómico de varias cepas resistentes a la fluoroacetamida,
utilizando los mismos productos de digestión y las mismas sondas
que los descritos en el Ejemplo 2.
Este ejemplo describe la introducción libre de
gen marcador del gen glaA o el gen de fitasa en la cepa de
Trichoderma reesei QM9414 (ATCC 26921). Se transformó T.
reesei QM9414 según lo descrito en la sección experimental,
utilizando los mismos vectores y el mismo enfoque que los descritos
en los Ejemplos 2 y 3. Se aislaron y purificaron transformantes
individuales y se realizó un análisis Southern de ADN cromosómico
de varios transformantes para verificar la integración de el vector
pGBGLA30 o los vectores pGBGLA50 y pGBGLA53 respectivamente. En el
análisis Southern se utilizaron los mismos productos de digestión y
las mismas sondas que los descritos en el Ejemplo 2.
En el caso de la integración del vector pGBGLA30
se utilizó un transformante con una única copia de pGBGLA30
integrada en el genoma de la cepa huésped T. reesei QM9414
para eliminar el gen amdS correctamente. Se realizó una
contraselección en placas con contenido de fluoroacetamida según lo
descrito en la sección experimental. La eliminación correcta del gen
amdS se verificó mediante un análisis Southern de ADN
cromosómico de varias cepas resistentes a la fluoroacetamida.
En el caso de la cotransformación de los vectores
pGBGLA50 y pGBGLA53 se utilizó un transformante con una única copia
tanto de pGBGLA50 como de pGBGLA53 integrada en el genoma huésped
para eliminar el gen marcador amdS correctamente. Se realizó
una contraselección, utilizando placas de fluoroacetamida, según lo
descrito en la sección experimental. La eliminación correcta del
gen marcador amdS (por ejemplo el vector pGBGLA50) se
verificó mediante un análisis Southern de ADN cromosómico de varias
cepas resistentes a la fluoroacetamida, utilizando los mismos
productos de digestión y las mismas sondas que los descritos en el
Ejemplo 2.
En este ejemplo se describe la introducción libre
de gen marcador de un gen en el genoma de P. chrysogenum
mediante cotransformación.
En el proceso de cotransformación se ofrecen 2
fragmentos distintos de ADN a los protoplastos, siendo uno de ellos
el marcador de selección amdS, en presencia del cual tiene
lugar la primera selección de transformante según lo descrito en la
sección experimental, y siendo el segundo otro fragmento de ADN de
interés, por ejemplo uno que codifique una determinada enzima que
sea de interés. Ambos fragmentos de ADN se integrarán en los
cromosomas y se mantendrán y expresarán de forma estable en cierto
número de transformantes.
El gen marcador de selección amdS puede
seguidamente eliminarse de forma selectiva de los transformantes
purificados aplicando el procedimiento de contraselección descrito
en la sección experimental, mientras que el segundo fragmento de
ADN permanecerá integrado de forma estable en los cromosomas del
transformante.
Como ejemplo para ilustrar la aplicabilidad
general del método se describe la introducción libre de gen
marcador estable de un gen niaD que permite a un huésped
niaD crecer en nitrato como única fuente de nitrógeno.
El huésped para esta cotransformación es una cepa
niaD de P. chrysogenum que carece de nitrato reductasa
y, por lo tanto, es incapaz de crecer en placas que contienen
nitrato como única fuente de nitrógeno. Estas cepas pueden
obtenerse fácilmente mediante procedimientos bien conocidos (Gouka
y col., Journal of Biotechnology 20 (1991),
189-200 y referencias de dicho documento).
Durante la cotransformación (procedimiento
descrito en la sección experimental) se ofrecen simultáneamente a
los protoplastos dos fragmentos de ADN: el fragmento de restricción
de EcoRI de 7,6 kb de pGBGLA28 que contiene el gen marcador de
selección amdS y el fragmento de restricción de EcoRI de
6,5 kb de pPC1-1, que contiene el gen niaD de
P. chrysogenum. Antes de la transformación, ambos fragmentos
se habían separado de las secuencias de vector de E. coli
mediante electroforesis en gel de agarosa y purificación de este
gel mediante electroelución.
La primera selección de transformantes se realizó
en placas selectivas que contenían acetamida como única fuente de
nitrógeno, según lo descrito en la sección experimental.
Entre los transformantes se hallan
cotransformantes mediante una réplica de esporas de los
transformantes purificados en placas con nitrato como única fuente
de nitrógeno.
Aproximadamente un 20-60% de los
transformantes sometidos a réplica en placa fueron capaces de
crecer en este medio, lo que indica que en estos transformantes no
sólo el gen marcador de selección amdS se había integrado en
el genoma y se hallaba expresado sino que también lo había hecho el
gen niaD.
El gen marcador de selección amdS se
elimina posteriormente de los cotransformantes mediante una
contraselección con fluoroacetamida.
Para una selección directa del fenotipo
amdS^{-}/niaD^{+}, se empleó un medio que
contenía fluoroacetamida 10 mM.
Se cultivaron esporas en placa, con una densidad
de 10^{4} esporas por placa.
Después de 5-7 días de incubación
a 25ºC pudieron identificarse colonias resistentes a la
fluoroacetamida en forma de colonias uniformes claramente
diferenciadas del fondo borroso. El fenotipo niaD^{+} de
los recombinantes se demuestra porque existe crecimiento de las
colonias en el medio de fluoroacetamida, que contenía nitrato como
única fuente de nitrógeno. El fenotipo amdS^{-} de los
recombinantes se confirmó por la falta de crecimiento de los mismos
en placas que contenían acetamida como única fuente de nitrógeno.
Entre un 0,1 y un 2% del número original de esporas cultivadas en
placa presentaban el fenotipo deseado.
Los análisis Southern de ADN cromosómico de
varias cepas resistentes a la fluoroacetamida confirmaron que el
gen marcador amdS había sido eliminado del genoma de P.
chrysogenum.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Gist-brocades B.V.
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Wateringseweg 1
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Delft
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAIS: Holanda
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 2611 XT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Cepas recombinantes libres de gen marcador de selección: método para su obtención y utilización de estas cepas
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NUMERO DE SECUENCIAS : 37
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- REQUISITOS DEL SISTEMA INFORMATICO:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- SOPORTE: disquete
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- COMPUTADOR: IBM PC compatible
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, versión #1.25 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Nº ID SEC: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- CONTRASENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB3100
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCTAATCTAGA ATGCCTCAAT CCTGAA
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Nº ID SEC: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- CONTRASENTIDO: SÍ
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB3101
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGACAGTCGAC AGCTATGGAG TCACCACA
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Nº ID SEC: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- CONTRASENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: TN0001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTCGATTAACT AGTTAA
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Nº ID SEC: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB2154
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipAACCATAGGG TCGACTAGAC AATCAATCCA TTTCG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Nº ID SEC: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- CONTRASENTIDO: SÍ
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB2155
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGCTATTCGAA AGCTTATTCA TCCGGAGATC CTGAT
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Nº ID SEC: 9:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- CONTRASENTIDO: SÍ
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB2994
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCTGATAGAAT TCAGATCTGC AGCGGAGGCC TCTGTG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Nº ID SEC: 10:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- CONTRASENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB3657
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipAGCTTGACGT CTACGTATTA ATGCGGCCGC T
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Nº ID SEC: 11:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- CONTRASENTIDO: SÍ
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB3658
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTCGAAGCGGC CGCATTAATA CGTAGACGTC A
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Nº ID SEC: 12:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- CONTRASENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB3779
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipAATTGGGGCC CATTAACTCG AGC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Nº ID SEC: 13:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- CONTRASENTIDO: SÍ
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB3780
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipAATTGCTCGA GTTAATGGGC CCC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Nº ID SEC: 14:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- CONTRASENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB3448
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGTGCGAGGTA CCACAATCAA TCCATTTCGC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Nº ID SEC: 15:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- CONTRASENTIDO: SÍ
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB3449
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipATGGTTCAAG AACTCGGTAG CCTTTTCCTT GATTCT
\hfill
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Nº ID SEC: 16:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- CONTRASENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB3450
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipAGAATCAAGG AAAAGGCTAC CGAGTTCTTG AACCAT
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Nº ID SEC: 17:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- CONTRASENTIDO: SÍ
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB3520
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipATCAATCAGA AGCTTTCTCT CGAGACGGGC ATCGGAGTCC CG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Nº ID SEC: 18:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- CONTRASENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB3781
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipAATTGGGGCC CAGCGTCC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Nº ID SEC: 19:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- CONTRASENTIDO: SÍ
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB3782
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipAATTGGACGC TGGGCCCC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Nº ID SEC: 20:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 43 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- CONTRASENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB3746
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTGACCAATAA AGCTTCTCGA GTAGCAAGAA GACCCAGTCA ATC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Nº ID SEC: 21:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 47 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- CONTRASENTIDO: SÍ
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB3747
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCTACAAACGG CCACGCTGGA GATCCGCCGG CGTTCGAAAT AACCAGT
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Nº ID SEC: 22:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- CONTRASENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB4234
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGAAGACCCAG TCAAGCTTGC ATGAGC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Nº ID SEC: 23:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 43 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- CONTRASENTIDO: SÍ
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB4235
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTGACCAATTA AGCTTGCGGC CGCTCGAGGT CGCACCGGCA AAC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Nº ID SEC: 24:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 69 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- CONTRASENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB4236
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTGACCAATAA AGCTTAGATC TGGGGGTGAT TGGGCGGAGT GTTTTGCTTA
\hfill
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGACAATCAAT CCATTTCGC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Nº ID SEC: 25:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- CONTRASENTIDO: SÍ
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB4233
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTGACCAATAG ATCTAAGCTT GACTGGGTCT TCTTGC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Nº ID SEC: 26:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- CONTRASENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB3514
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCTGCGAATTC GTCGACATGC CTCAATCCTG GG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Nº ID SEC: 27:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- CONTRASENTIDO: SÍ
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB3515
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGGCAGTCTAG AGTCGACCTA TGGAGTCACC ACATTTC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Nº ID SEC: 28:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- CONTRASENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB3701
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCTGCGAATTC GTCGACACTA GTGGTACCAT TATAGCCATA GGACAGCAAG
\hfill
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Nº ID SEC: 29:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 70 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- CONTRASENTIDO: SÍ
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB3700
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGCTCTAGAGC GCGCTTATCA GCTTCCAGTT CTTCCCAGGA TTGAGGCATT
\hfill
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTTTAATGTTA CTTCTCTTGC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Nº ID SEC: 30:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- CONTRASENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB3702
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCTGCGAATTC GTCGACACTA GTGGTACCAT CCTTTTGTTG TTTCCGGGTG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Nº ID SEC: 31:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 70 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- CONTRASENTIDO: SÍ
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB3703
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGCTCTAGAGC GCGCTTATCA GCGGCCAGTT CTTCCCAGGA TTGAGGCATT
\hfill
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGTATATGAGA TAGTTGATTG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Nº ID SEC: 32:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 55 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- CONTRASENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB3704
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGCTCTAGAAG TCGACACTAG TCTGCTACGT ACTCGAGAAT TTATACTTAG
\hfill
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipATAAG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Nº ID SEC: 33:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- CONTRASENTIDO: SÍ
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB3705
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTGCTCTAGAT CTCAAGCCAC AATTC
\hfill
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Nº ID SEC: 34:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- CONTRASENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB3965
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCTGCTACGTA ATGTTTTCAT TGCTGTTTTA C
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Nº ID SEC: 35:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- CONTRASENTIDO: SÍ
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB3966
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCCGCCCAGTC TCGAGTCAGA TGGCTTTGGC CAGCCCC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Nº ID SEC: 36:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- CONTRASENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB3825
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCGCGCTTATC AGCGGCCAGT TCTTCCCAGG ATTGAGGCAT ATGT
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Nº ID SEC: 37:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- CONTRASENTIDO: SÍ
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: AB3826
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: Nº ID SEC: 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCTAGACATAT GCCTCAATCC TGGGAAGAAC TGGCCGCTGA TAAG
\hfill
Claims (25)
1. Un vector que contiene un gen marcador
dominante, bidireccional y contraseleccionable, que está flanqueado
por repeticiones de ADN directas, lo que permite la recombinación
interna en el genoma de un hongo filamentoso.
2. Un vector según la reivindicación 1, en el que
las repeticiones de ADN directas se eligen entre de la secuencia 5'
o 3' del ADN a eliminar del genoma.
3. Un vector según la reivindicación 1 ó 2, en el
que el gen marcador de selección es un gen de acetamidasa.
4. Un vector según la reivindicación 3, en el que
el gen de acetamidasa es de origen fúngico.
5. Un vector según la reivindicación 4, en el que
el gen de acetamidasa procede de una especie de
Aspergillus.
6. Un vector según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el vector contiene también un
fragmento de ADN deseado.
7. Un vector según la reivindicación 6, en el que
el fragmento de ADN deseado contiene un elemento genético
seleccionado de entre los del grupo compuesto por: un gen, un cADN,
un promotor, un terminador, un elemento regulador, un intrón, una
secuencia de reconocimiento para una proteína de unión a ADN, un
sitio de traducción-iniciación, un sitio de
restricción y combinaciones de los mismos.
8. Un vector según la reivindicación 7, en el que
el fragmento de ADN deseado contiene una secuencia que codifica una
quimosina, una fitasa, una xilanasa, una lipasa, una amilasa, una
proteasa o una \beta-galactosidasa.
9. Un hongo filamentoso recombinante transformado
con el vector según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
8.
10. Un hongo filamentoso recombinante según la
reivindicación 9, que comprende como mínimo dos vectores distintos
según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
11. Un hongo filamentoso recombinante según la
reivindicación 9 ó 10, en el que el vector se integra en el genoma
de dicho hongo filamentoso a través de una recombinación homóloga
específica.
12. Un hongo filamentoso recombinante según una
cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que el hongo
filamentoso es una especie de Aspergillus,
Trichoderma o Penicillium.
13. Un método para obtener un hongo filamentoso
recombinante libre de gen marcador de selección, que comprende los
siguientes pasos:
- (a)
- integración en el genoma del hongo filamentoso de un fragmento de ADN deseado y un gen marcador de selección dominante y bidireccional,
- (b)
- selección de los transformantes,
- (c)
- deleción del gen marcador de selección mediante recombinación entre repeticiones flanqueantes del gen marcador de selección, y
- (d)
- contraselección basada en la ausencia del gen marcador de selección.
14. Un método según la reivindicación 13,
caracterizado porque una secuencia 5' ó 3' del gen marcador
de selección se clona, lo cual crea una repetición con una
secuencia que es 3' ó 5' de la secuencia a ser eliminada del
genoma.
15. Un método según la reivindicación 13 ó 14, en
el que el fragmento de ADN deseado contiene un elemento genético
seleccionado de entre el grupo compuesto por: un gen, un cADN, un
promotor, un terminador, un elemento regulador, un intrón, una
secuencia de reconocimiento para una proteína de unión a ADN, un
sitio de traducción-iniciación, un sitio de
restricción y combinaciones de los mismos.
16. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 13 ó 14, en el que los pasos a) a d) se repiten en
los hongos filamentosos recombinantes obtenidos, utilizando el
mismo fragmento de ADN o bien uno diferente que se desee.
17. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 16, en el que el gen marcador de selección es
un gen de acetamidasa.
18. Un método según la reivindicación 17, en el
que el gen marcador de selección es un gen de acetamidasa de origen
fúngico.
19. Un método según la reivindicación 18, en el
que el gen marcador de selección es un gen de acetamidasa de una
especie de Aspergillus.
20. Un método para la producción de un compuesto
bioactivo, método que comprende el paso de realizar el cultivo del
hongo filamentoso producido según el método de una cualquiera de
las reivindicaciones 13 a 19.
21. Un método según la reivindicación 20, en el
que el compuesto bioactivo es una proteína.
22. Un método según la reivindicación 20, en el
que el compuesto bioactivo es un antibiótico.
23. Utilización de un hongo filamentoso producido
por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19
para la producción de un compuesto bioactivo.
24. Utilización según la reivindicación 23, en el
que el compuesto bioactivo es una proteína.
25. Utilización según la reivindicación 23, en el
que el compuesto bioactivo es un antibiótico.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP93202195 | 1993-07-23 | ||
| EP93202195 | 1993-07-23 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2198410T3 true ES2198410T3 (es) | 2004-02-01 |
Family
ID=8214006
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES94201896T Expired - Lifetime ES2198410T3 (es) | 1993-07-23 | 1994-06-30 | Cepas recombinantes de hongos filamentosos libres de gen marcador de seleccion: un metodo para obtener dichas cepas y su utilizacion. |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (2) | EP0635574B1 (es) |
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