ES2320524T3 - Homologos cdc27 de la arabidopsis thaliana. - Google Patents

Homologos cdc27 de la arabidopsis thaliana. Download PDF

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Abstract

Método para incrementar la capacidad de almacenamiento en plantas, que comprende la etapa de transformación de las células vegetales con el ADN codificante por una proteína vegetal CDC27 seleccionada de: a) una o más de las secuencias de aminoácido seleccionadas del grupo que consiste de aquellas dadas por SEQ ID NOS 5, 11, 13; o b) un análogo funcional de esta, seleccionado de una o más secuencias de aminoácido que tiene al menos 90%, 95% o 98% de identidad del aminoácido con aquellas de a), en donde 100 a 220 aminoácidos se suprimen en el Nterminal de dicha proteína CDC27 o análogo funcional de esta.

Description

Homólogos CDC27 de la Arabidopsis thaliana.
La presente invención se relaciona con un método para incrementar la capacidad de almacenamiento en plantas por transformación de células vegetales con un ADN codificante por una muteina CDC27 de la planta de acuerdo con la principal reivindicación y reivindicaciones dependientes de esta. La invención también se relaciona con células vegetales, plantas, que comprenden el citado ADN y la progenie de estas. De acuerdo con las reivindicaciones 12-16.
La regulación del ciclo celular en plantas se entiende deficientemente. La mayoría de los conocimientos relativos a la regulación de la replicación del ADN, también conocida como la fase-S de la regulación del ciclo celular se origina a partir de los datos experimentales obtenidos en células de levadura y de mamífero. Sin embargo, la importancia de comprender la regulación del ciclo celular en las células vegetales se hace cada vez más importante en la agricultura, por ejemplo para controlar el crecimiento de las plantas en condiciones de estrés, para obtener resistencia contra los parásitos que bloquean o modulan la regulación del ciclo celular, o para mejorar la producción de los cultivos importantes agrícolamente. Además, podría ser de interés intervenir en la regulación del ciclo celular, permitiendo otras rondas de replicación del ADN, pero simultáneamente impidiendo que otro ciclo celular progrese mediante el bloqueo de la posterior mitosis. De esta manera, se pueden obtener células que tienen múltiples conjuntos de su material genético, de tal manera que las plantas con una alta velocidad de endoreduplicación se pueden generar. El término "endoreduplicación" significa replicación recurrente del ADN sin la consiguiente mitosis y citocinesis.
De los experimentos en levadura, se conoce que la replicación del ADN y la mitosis se acoplan a los eventos en el ciclo celular. Paulovich et al., 1997; Cell 88, 315-321. Además de los mecanismos para controlar el principio de la replicación del ADN, otros mecanismos contribuyen para la restricción de la replicación del ADN, que ocurre solamente una vez durante el ciclo celular. Por ejemplo, las proteínas CDC16, CDC23 y CDC27 son parte de un complejo de alto peso molecular, conocidas como el complejo que promueve la anafase (APC) o ciclosoma, (ver Romanowski and Maine, Trends in Cell Biology 6, 184-188, 1996, and Wuarin and Nurse, Cell 85, 785-787 (1996), ambos incorporados aquí por referencia). El complejo en la levadura se compone de al menos 8 proteínas, la TPR (repeticiones de tetratricopéptidos) que contienen las proteínas CDC16, CDC23 y CDC27, y otras cinco subunidades denominadas APC1, APC2, APC4, APC5 y APC7 (Peters et al. 1996, Science 274, 1199-1201). Las dianas APC sus sustratos para la degradación proteolítica por catálisis de la unión de las moléculas de ubiquitina con estos sustratos. La proteólisis APC-dependiente se necesita para la separación de los cromatidios hermanos en la transición meta- a anafase y para la salida final de la mitosis. Entre los APC-sustratos están la proteína inhibidor de la anafase Pdslp y ciclinas mitóticas tales como ciclina B, respectivamente (Ciosk et al. 1998, Cell 93, 1067-1076; Cohen-Fix et al. 1996, Genes Dev 10, 3081-3093; Sudakin et al. 1995, Mol Biol Cell 6, 185-198; Jorgensen et al. 1998, Mol Cell Biol 18, 468-476; Townsley and Ruderman 1998, Trends Cell Biol 8, 238-244). Para llegar a ser activa como una ubiquitina-ligasa, al menos CDC16, CDC23 y CDC27 necesitan ser fosforilados en la M-fase (Ollendorf and Donoghue 1997, J Biol Chem 272, 32011-32018). APC activada persiste durante toda la G1 del posterior ciclo celular para prevenir la aparición prematura del reciclado tipo-B, lo que podría resultar en una entrada incontrolada en la fase-S (Irniger and Nasmyth 1997, J Cell Sci 110, 1523-1531). Se ha demostrado que las mutaciones en levadura en uno de al menos dos de los componentes de APC, CDC16 y CDC27, pueden resultar en sobrereplicación de ADN sin que intervengan pasajes a través de las fases-M (Heichman and Roberts 1996, Cell 85, 39-48). CDC16, CDC23 y CDC27 todas son repeticiones de tetratricopéptidos (TPR) que contienen proteínas. Una secuencia consenso mínima sugerida del motivo TPR es como sigue: X_{3}-W-X_{2}-LG-X_{2}-Y-X_{8}-A-X_{3}-F-X_{2}-A-X_{4}-P-X_{2} (Lamb et al. 1994, EMBO J 13, 4321-4328; X indica cualquier aminoácido, Xn un tramo de n de tales aminoácidos). Sin embargo, los residuos consenso pueden presentar degeneración significante y poca o ninguna homología está presente en residuos no-consenso. La hidrofobicidad y tamaño de los residuos consenso, en lugar de su identidad, parece ser importante. Los motivos TPR están presentes en una amplia variedad de proteínas funcionales en levadura y eucariotas superiores en la mitosis (incluyendo los componentes de la proteína APC CDC16, CDC23 y CDC27), transcripción, empalme, importación de la proteína y neurogénesis (Goebl and Yanagida 1991, Trends Biochem Sci 16, 173-177). El TPR forma una estructura \alpha-helicoidal, las repeticiones en tándem se organizan en una estructura superhelicoidal, idealmente convienen como interfaces para el reconocimiento de la proteína (Groves and Barford 1999, Curr Opin Struct Biol 9, 383-389). Dentro de la \alpha-hélice, dos dominios anfipáticos usualmente se presentan, uno en el terminal-NH_{2} y el otro cerca del terminal-COOH (Sikorski et al. 1990, Cell 60, 307-317).
Con el fin de comprender los mecanismos que juegan un papel en regulación del ciclo celular de la planta, en particular la replicación del ADN, y de comprender la endoreduplicación en plantas, los presentes inventores aislaron varias novedosas secuencias de ADN de la planta, codificadas por las proteínas novedosas, o novedosas secuencias de aminoácido de estas involucradas en la modulación de la replicación del ADN, utilizando cebadores de PCR degenerados con base en conocidas secuencias genómicas o de cADN, por ejemplo de levadura, mamíferos e insectos.
La "Capacidad de modular la replicación del ADN en plantas" se debe entender como la capacidad de una proteína para alterar el mecanismo de replicación del ADN natural en la citada planta, por ejemplo favoreciendo o reduciendo la expresión de la replicación del ADN en cierto modo, diferente de la situación natural, o a una extensión superior o inferior con respecto a la situación natural. La situación natural se debe entender como la situación en donde la replicación del ADN tiene lugar en las plantas, en las cuales la mecánica de replicación del ADN no se afecta por la introducción de material genético foráneo. Tal alteración incluye la mediación, por ejemplo del principio de la replicación del ADN, la velocidad y extensión de replicación del ADN, el tiempo de replicación del ADN en el ciclo celular, acoplamiento o desacoplamiento de la replicación del ADN con/a partir de la actual división celular posterior, etcétera.
Proteínas
Utilizando los oligonucleótidos degenerados como cebadores de amplificación, con base en regiones de secuencias conservadas de los genes homólogos CDC27 de Schizosaccharomyces pombe y de Aspergillus Nidulans, drosófila y humano, los presentes inventores sorprendemente encontraron novedosas proteínas CDC27 y secuencias de aminoácido. Se hace referencia a los ejemplos.
De esta manera, novedosos cADNs y proteínas que comprenden una o más novedosas secuencias de aminoácido se encontraron.
Utilizando oligonucleótidos CDC27 degenerados, una secuencia de cADN de Arabidopsis thaliana denominada CDC27A1 se encontró, que en comparación en los bancos de datos mencionados anteriormente, mostraba alta homología con una Arabidopsis thaliana secuencia de ADN genómico (número de acceso AC 001645). De nuevo, la secuencia codificante de CDC27A1 (SEQ ID NO 9), encontrada por los presentes inventores, indica la presencia de dos regiones codificantes adicionales en la Arabidopsis CDC27, el gen, correspondiente con las secuencias de aminoácido dadas por SEQ ID NOS 6 y 7. De esta manera, novedosas proteínas que modulan la replicación del ADN en plantas se encontraron, que comprenden una o más de las novedosas secuencias de aminoácido mencionadas anteriormente.
El novedoso exón codificado por la secuencia de aminoácido SEQ ID No 6 (VNLQLLARCYLSNQAYSAYYILK) es parte de un único dominio terminal-NH2 conservado en homólogos CDC27 de diferente origen. El único dominio se localiza secuencia arriba de la unidad TPR terminal-NH_{2} de CDC27 (Tugendreich et al. 1993, Proc Natl Acad Sci USA 90, 10031-10035). El papel de este dominio no se conoce actualmente, pero su conservación sugiere que es indispensable para la función de CDC27. El TPR terminal-NH_{2} de CDC27 no se repite en tándem y se extiende los residuos de aminoácidos 174 a 202 en la SEQ ID No 5. Las proteínas, que comprenden esta novedosa secuencia de exón de acuerdo con la invención por consiguiente pueden promover la acción del sustrato-APC y con ello permitir la replicación del ADN. Por otra parte, un péptido que comprende la novedosa secuencia de exón se puede utilizar para ocupar la región de enlace de los sustratos para el complejo APC, y con ello inhibir las interacciones complejo-sustrato, resultando en la inactivación de APC y para la poliploidización/endoreduplicación.
La novedosa secuencia de aminoácido SEQ ID No 7 (AYMERLILPDELVTEENL) se localiza justo antes del último (10º) TPR de CDC27 abarcando los residuos de aminoácidos 670-703 en la SEQ ID No 5.
Analizando los patrones de expresión de CDC27A1, los presentes inventores adicionalmente identificaron la existencia de una segunda isoforma del gen CDC27A1. Dicha isoforma, denominada CDC27A2 se caracteriza en que un fragmento de 33 nucleótidos presentes en CDC27A1 (nucleótidos 1029-1061 de la SEQ ID NO 9) se pierden en CDC27A2. La secuencia del nucleótido del cADN de CDC27A2 se da en la SEQ ID NO 14, la correspondiente secuencia de aminoácido de la proteína CDC27A2 se define en la SEQ ID NO 11. SEQ ID NO 11 es diferente de SEQ ID NO 5 en entonces la secuencia de aminoácido "AIPDTVTLNDP" (SEQ ID NO 12) presentes en CDC27A1 está ausente en CDC27A2.
Otro gen similar a CDC27 a partir de la Arabidopsis thaliana se identificó por los presentes inventores vía clonación in silico. El gen, denominado CDC27B tienen un número de acceso GenBank AC006081 y se anota como CDC27. Sin embargo, bajo el aislamiento y caracterización del cADN correspondiente, los presentes inventores observaron entonces la secuencia de aminoácido pronosticada y presentada en GenBank es carente del tramo de 161 aminoácidos de terminal-NH_{2} como se suministra en la SEQ ID NO 10.
La secuencia de cADN de CDC27B se define en la SEQ ID NO 15 y la secuencia de aminoácido derivada de la proteína CDC27B se da en la SEQ ID NO 13. La proteína CDC27B de cuerpo entero comprende un péptido 75% idéntico al péptido según se define en la SEQ ID NO 6. Como se discute anteriormente, SEQ ID NO 6, y de esta manera también SEQ ID NO 10, son parte de un único dominio terminal-NH_{2} conservado en los homólogos de CDC27 de diferente origen.
El efecto de mutaciones en un diferente de la serie tándem de TPRs puede ser muy específico. Por ejemplo, una mutación puntual en el dominio TPR 7º más altamente conservado de la levadura CDC27, resulta en una reducida en gran medida afinidad para la interacción con la levadura CDC23, pero no para la interacción con la levadura CDC16 o CDC27 de tipo salvaje. Una sola inserción del aminoácido en el mismo dominio destruye la \alpha-hélice y suprime la interacción con CDC27de tipo salvaje así como CDC16 (Lamb et al. 1994, EMBO J 13, 4321-4328). Por otra parte, experimentos detallados con la CDC16 que contiene TPR humano y homólogos de CDC27 y otra proteína que contiene TPR que regulan la actividad de APC, PP5, revelaron que las proteínas TPR muestran enlaces discriminados con otras proteínas TPR. Más específicamente para CDC27, la deleción del primer dominio TPR en esta proteína suprime el enlace CDC16, pero no el enlace PP5 (Ollendorff and Donoghue 1997, J Biol Chem 272, 32011-32018). Estudios de mutagénesis con la levadura CDC23 mostraron que solo unos pocos residuos en o cerca la mayor unidad TPR 6ª canónica resulta en defectos sensibles a la temperatura (Sikorski et al. 1993, Mol Cell Biol 13, 1212-1221). Los dominios TPR separados, de esta manera parecen estar involucrados en las interacciones específicas con otras proteínas y muy pocas alteraciones limitadas en estos dominios parecen ser toleradas.
Cualquier modulación errónea de la actividad de APC, por ejemplo por mutaciones en la SEQ ID No 6 como parte de una secuencia conservada en las proteínas CDC27 y/o SEQ ID No 7 que es un novedoso motivo TPR truncado putativo en CDC27, probablemente resultará en pérdida de control sobre la ciclos de replicación del ADN normal vía los mecanismos descritos anteriormente. Las mutaciones en CDC27 pueden ciertamente provocar la sobrereplicación de ADN y de esta manera la generación de células poliploides (Heichmann and Roberts 1996, Cell 85, 399-48). Tal endoreduplicación puede ser relacionado con la expansión celular (Traas et al. 1998, Curr Opin Planta Biol 1, 498-503) y, de esta manera, una capacidad de almacenamiento superior en tales células poliploides. Esta ventajosa propiedad es altamente deseada en plantas de cultivo o partes de plantas tales como semillas, raíces, tubérculos y
frutas.
La modulación de dicha secuencia de aminoácido podría deteriorar la formación de APC funcional, dado que cdc27 comprende una citada mutación no obstante tendría la capacidad de interactuar con el sustrato y con ello la titulación del sustrato, conduciendo a la supresión de la función APC en la célula vegetal, resultando en las células poliploides.
Se debe entender, que las proteínas que modulan la replicación del ADN de acuerdo con la presente invención, que comprenden una o más de las secuencias de aminoácido mencionadas anteriormente, o que tienen 90% de identidad del aminoácido con ello, pueden originar de la especie de la planta así como a partir de otra especie siempre y cuando las citadas proteínas son capaces de modular la replicación del ADN en una o más especies de plantas.
El término "proteínas" se debe entender como cualquier secuencia de aminoácido que tiene una función biológica, opcionalmente modificada mediante, por ejemplo glicosilación. La proteína de acuerdo con la presente invención preferiblemente comprende una o más de las secuencias de aminoácido de acuerdo con A), siendo la identidad respectiva del aminoácido preferiblemente al menos del 90%.
El término "proteína" incluye moléculas de polipéptido de cadena individual así como complejos de múltiples-polipéptidos, donde los polipéptidos constituyentes individuales se unen por medios covalentes o no-covalentes. El término "polipéptido" incluye péptidos de dos o más aminoácidos en longitud, que usualmente tienen más de 5, 10 o 20 aminoácidos.
Se deberá entender que las secuencias de aminoácido de la invención no se limitan a las secuencias obtenidas a partir de la proteína particular pero también incluyen secuencias homólogas obtenidas a partir de cualquier fuente, por ejemplo proteínas de plantas relacionadas, homólogos celulares y péptidos sintéticos, así como variantes o derivados de estos.
De esta manera, la presente invención cubre las variantes, homólogos o derivados de las secuencias de aminoácido de la presente invención, así como las variantes, homólogos o derivados de la secuencia del nucleótido codificante por las secuencias de aminoácido de la presente invención.
En el contexto de la presente invención, una secuencia homóloga se toma para incluir una secuencia de aminoácido que es al menos 90% idéntica, preferiblemente al menos 95 o 98% idéntica al nivel de aminoácido sobre al menos 18, preferiblemente todos los aminoácidos dentro de las secuencias como se muestra en la SEQ ID Nos 2, 3, 4, 6 y 7 en la lista de secuencias en este documento. En particular, la homología usualmente se debería considerar con respecto a aquellas regiones de la secuencia conocida por ser esencial para las funciones discutidas anteriormente de las novedosas secuencias de aminoácido mejor que las secuencias vecinas no-esenciales.
Aunque la homología también se puede considerar en términos de similitud (i.e. residuos de aminoácidos que tienen propiedades químicas/funciones similares), en el contexto de la presente invención se prefiere expresar homología en términos de identidad de la secuencia.
Las comparaciones de homología se pueden conducir por ojo, o más usualmente, con la ayuda de programas de comparación de secuencias disponible fácilmente. Estos programas de ordenador comercialmente disponibles pueden calcular el % de homología entre dos o más secuencias.
El % de homología se puede calcular sobre las secuencias contiguas, i.e. una secuencia se alinea con la otra secuencia y cada aminoácido en una secuencia directamente comparada con el aminoácido correspondiente en la otra secuencia, un residuo a la vez. Esta se denomina una alineación "ininterrumpida". Usualmente, tales alineaciones ungapped se realizan solamente sobre un número de residuos relativamente pequeño (por ejemplo menos de 50 aminoácidos contiguos).
Aunque este es un método muy simple y consistente, falla en que no tiene en consideración que, por ejemplo, en un caso contrario idénticos pares de secuencias, una inserción o deleción causará que los siguientes residuos de aminoácidos se pondrán fuera de alineación, de esta manera resultando potencialmente en una gran reducción en % de homología cuando una alineación global se realiza. En consecuencia, la mayoría de los métodos de comparación de secuencias se diseñan para producir alineaciones óptimas que tengan en consideración posibles inserciones y deleciones sin penalizar excesivamente la puntuación de homología completa. Esto se logra invirtiendo "huecos" en la alineación de la secuencia para tratar de maximizar la homología local.
Sin embargo, estos métodos más complejos asignan "penalizaciones por hueco" para cada hueco que ocurre en la alineación, así que, para el mismo número de idénticos aminoácidos, una alineación de la secuencia con tan pocos huecos como sea posible - que reflejan una mayor relevancia entre las dos secuencias comparadas - logrará una puntuación mayor que una con muchos huecos. "valores de hueco afines" usualmente se utilizan que cargan un costo relativamente alto para la existencia de un hueco y una penalización más pequeña por cada residuo posterior en el hueco. Este es el sistema de puntuación de hueco más comúnmente utilizado. Altas penalizaciones por hueco producirán por supuesto alineaciones optimizadas con menos huecos. La mayoría de los programas de alineación permitirán que las penalizaciones por hueco sean modificadas. Sin embargo, se prefiere utilizar los valores por defecto cuando se utiliza dicho software por comparaciones de secuencia. Por ejemplo cuando se utiliza el paquete GCG Wisconsin Bestfit (ver abajo) la penalización por defecto de hueco para las secuencias de aminoácido es -12 por un hueco y -4 por cada extensión.
El cálculo de % máximo de homología, por consiguiente, en primer lugar requiere la producción de una alineación óptima, teniendo en cuenta las penalizaciones por hueco. Un apropiado programa de ordenador para llevar a cabo tal alineación es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387). Ejemplos de otros software que pueden realizar comparaciones de secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete BLAST (ver http: //www.ncbi.nih.gov/BLAST/), FASTA (Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410; FASTA es disponible para la búsqueda en línea en, por ejemplo, http://www.2.ebi.ac.uk.fasta3) y el paquete GENEWORKS de herramientas de comparación. Sin embargo se prefiere utilizar el programa GCG Bestfit.
Aunque el % de homología final se puede medir en términos de identidad, el proceso de alineación por si mismo usualmente no es con base en una comparación de pares todo-o-nada. En lugar, generalmente se utiliza, una escala de matriz de puntuación de similitud, que asigna puntajes a cada comparación por emparejamiento con base en la similitud química o distancia evolutiva. Un ejemplo de este tipo de matriz de uso común es la matriz BLOSUM62 - la matriz por defecto para el paquete de programas BLAST. Los programas GCG Wisconsin generalmente utilizan, ya sean los valores por defecto públicos o una tabla de comparación de símbolos personalizados si se suministran (ver el manual de usuarios para más detalles). Se prefiere utilizar los valores por defecto públicos para el paquete GCG, o en el caso de otro software, la matriz por defecto, tal como BLOSUM62.
Una vez el software ha producido una alineación óptima, es posible calcular el % de homología, preferiblemente % de identidad de la secuencia. El software lo hace normalmente como parte de la comparación de secuencia y genera un resultado numérico.
Variantes y Derivados de Polipéptido
Los términos "variante" o "derivado" en relación con las secuencias de aminoácido de la presente invención incluyen cualquier sustitución de, variación de, modificación de, reposición de, deleción de o adición de uno (o más) aminoácidos a partir de o con la secuencia que proporcionan la secuencia de aminoácido resultante tiene actividad similar como los polipéptidos presentados en las listas de secuencias.
Las secuencias de la invención se pueden modificar para utilizar en la presente invención. Usualmente, se hacen modificaciones que mantienen la actividad de la secuencia. Las sustituciones de aminoácido se pueden hacer, por ejemplo de 1, 2 o 3 a 10, 20 o 30 sustituciones proporcionadas entonces la secuencia modificada retiene la actividad relevante. Por ejemplo, la actividad de la quinasa se debería mantener en tal variante de un péptido de acuerdo con la invención que comprende la SEQ ID NO 2. Las sustituciones de aminoácido pueden incluir el uso de análogos que no ocurren naturalmente, por ejemplo para incrementar la vida media del plasma sanguíneo de un polipéptido administrado terapéuticamente.
Las sustituciones conservadoras se pueden hacer, por ejemplo de acuerdo con la siguiente Tabla. Los aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna y preferiblemente en la misma línea en la tercera columna pueden ser sustituidos por cada otra:
1
Las proteínas de la invención se hacen usualmente por medio recombinante. Sin embargo, también se pueden hacer por medio sintético utilizando técnicas bien conocidas por aquellos de habilidad, tales como síntesis de fase sólida. Las proteínas de la invención también se pueden producir como proteínas fusión, por ejemplo para ayudar en la extracción y purificación. Ejemplos de patrones de proteínas fusión incluyen glucationa-S-transferasa (GST), 6xHis, GAL4 (dominios de enlace de ADN y/o activación transcripcional) y \beta-galactosidasa. También puede ser conveniente incluir un sitio de división proteolítica entre el patrón de proteína fusión y la secuencia de proteína de interés para permitir la eliminación de las secuencias de la proteína fusión. Preferiblemente la proteína fusión no impedirá la función de la proteína de la secuencia de interés.
Las proteínas de la invención pueden ser en una forma aislada sustancialmente. Se deberá entender entonces que la proteína se puede mezclar con portadores o diluentes que no interferirán con el propósito pretendido de la proteína y aún se estimará como aislado sustancialmente. Una proteína de la invención también puede ser en una forma purificada sustancialmente, en el caso que, generalmente comprenderá la proteína en una preparación en la cual más del 90%, por ejemplo 95%, 98% o 99% de la proteína en la preparación es una proteína de la invención.
La proteína identificada en la presente invención comprende la secuencia de aminoácido como se suministra en la SEQ ID NO 5 o NO 11 o NO 13, o tiene la SEQ ID NO 5 es la secuencia de aminoácido completa (727 AA) de la novedosa planta CDC27A1 que comprende la SEQ ID NOS 6 y 7 y 12 (AA 37-60 y AA 711-727 y AA 344-354 respectivamente). SEQ ID NO 11 es la secuencia de aminoácido completa (716 AA) de la planta novedosa CDC27A2 que comprende SEQ ID NOS 6 y 7 (AA 37-60 y AA 700-716, respectivamente) pero carece de SEQ ID NO 12.
SEQ ID NO 13 es la secuencia de aminoácido completa (739 AA) de la planta novedosa CDC27B que comprende la SEQ ID NO 10 (AA-1-161) que por sí misma comprende un péptido 75% idéntico a la SEQ ID NO 6 (AA 36-59).
Aunque las proteínas identificadas en la presente invención pueden no ser de origen vegetal, como se indica anteriormente, la proteína de acuerdo con la presente invención es preferiblemente una proteína vegetal CDC27, o un análogo funcional de esta. Un análogo funcional se debe entender como cualquier proteína o péptido que tiene efectos biológicos similares como una proteína vegetal CDC27, independientemente del origen de estos.
Muteina
En otra modalidad, la presente invención describe una muteina de la proteína identificada en la presente invención, dicha muteina que comprende al menos una sustitución, deleción o adición de aminoácido, que afecta el efecto replicativo del ADN de la citada proteína.
Como ya se indicó anteriormente, las proteínas de acuerdo con la presente invención son de alto interés para una mejora de por ejemplo cultivos agrícolas o resistencia a parásitos. Por sustitución, deleción o adición de aminoácidos a la proteína de acuerdo con la presente invención, el efecto modulante de estos, se puede afectar, lo que puede conducir a propiedades deseables o mejoradas de la proteína.
Las proteínas modulantes que replican el ADN de acuerdo con la invención también pueden comprender uno o más dominios de repeticiones de tetratricopéptidos (TPR). Tales dominios han sido identificados en CDC27 (regiones de aminoácido 174-202, 403-431, 432-465, 466-499, 500-533, 534-567, 568-601, 602-635, 636-669, 670-703 en la SEQ ID No 5; delineamiento de regiones con base en el homólogo de la levadura CDC27; Lamb et al. 1994, EMBO J 13, 4321-4328) así como en CDC16, CDC23 y muchas otras proteínas (Goebl and Yanagida 1991, Trends Biochem Sci 16, 173-177). La función de estos dominios TPR es permitir que la proteína interactúe con otras proteínas en el complejo que promueve la anafase (APC). En la proteína CDC27 de acuerdo con la presente invención, un novedoso dominio TPR o similar a TPR ha sido identificado que incluye la SEQ ID No 7. El análisis de mutación en dominios TPR de la levadura CDC27 ha revelado que TPRs intactos son necesarios para la función de CDC27 (Lamb et al. 1984, EMBO J 13, 4321-4328) y, de esta manera, también para una APC funcional. En la ausencia de la función de CDC27, la síntesis de ADN se hace sin acoplamiento de la progresión del ciclo celular resultando en el establecimiento de las células poliploides (Heichman and Roberts 1996, Cell 85, 39-48).
Secuencias de ADN
Además, la presente invención describe una secuencia de ADN no-genómico, codificante por una proteína o muteina o péptido de acuerdo con la presente invención, o la secuencia complementaria de esta. Estas secuencias son particularmente útiles en la generación de vectores de ADN para multiplicar la secuencia de ADN o para introducir la citada secuencia en un organismo huésped, con el fin de obtener la proteína codificada. Además dichas secuencias o partes de estas son ventajosamente utilizadas para identificar y aislar las secuencias homólogas a partir de otra especie biológica.
La secuencia de ADN es preferiblemente sustancialmente libre de secuencias que intervienen la secuencia codificante, y es preferiblemente cADN.
Las secuencias de ADN de la invención comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican las secuencias de aminoácido de la invención.
Refiriéndose a la fig 1, la invención describe una secuencia de cADN, que comprende la secuencia de ADN según se suministra por la SEQ ID NO 9 o SEQ ID NO 14 o SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 9, es la secuencia de cADN de CDC27 de Arabidopsis thaliana, incluye las secuencias codificantes para las recientemente identificadas secuencias de aminoácido (SEQ ID NOS 6 y 7 y 12) como se discute anteriormente. SEQ ID NO 14 es la secuencia de cADN de CDC27A2 de Arabidopsis thaliana e incluye las secuencias codificantes para las secuencias de aminoácido recientemente identificadas (SEQ ID Nos 6 y 7) como se discute anteriormente pero carece de la secuencia codificante para la secuencia de aminoácido recientemente identificada (SEQ ID NO 12). La SEQ ID NO 15 es la secuencia de cADN de CDC27B de Arabidopsis thaliana e incluye las secuencias codificantes para la secuencia de aminoácido recientemente identificada (SEQ ID NO 10) como se discute anteriormente.
La presencia de las secuencias de aminoácido como se identifica en la presente invención en las proteínas que modulan la replicación del ADN de CDC27, puede jugar un importante papel en la función biológica de las citadas proteínas. También, las secuencias de acuerdo con SEQ ID NOS 9 y 14 y 15, o partes de estas, se pueden utilizar ventajosamente para aislar e identificar las secuencias homólogas de estas. Tal secuencia de ADN codifica para una secuencia de aminoácido que hasta ahora no se conocía que era parte de CDC27. La secuencia de ADN, correspondiente a los nucleótidos 109-181 y 2125-2148 de SEQ ID NO 9 codifican para novedosas secuencias de aminoácido de la planta CDC27A1, de Arabidopsis thaliana. La secuencia de ADN, correspondiente a los nucleótidos 109-181 y 2092-2148 de SEQ ID NO 14 codifica para las novedosas secuencias de aminoácido de la planta CDC27A2 de Arabidopsis thaliana. La secuencia de ADN, correspondiente a los nucleótidos 1-483 de SEQ ID NO 15 codifica para la novedosa secuencia de aminoácido de planta CDC27B de Arabidopsis thaliana. Dichas secuencias de ADN pueden por consiguiente en particular ser empleadas para identificar y aislar los genes o fragmentos de genes de otras plantas u organismos que son homólogos a la secuencia de CDC27 discutida anteriormente.
Sondas y cebadores
En otra modalidad, las secuencias de ADN descritas en la invención se pueden utilizar como cebadores para utilizar en una técnica de amplificación de ácido nucleico. Dichos cebadores se pueden utilizar en una técnica de amplificación particular para identificar y aislar sustancialmente moléculas homólogas de ácido nucleico a partir de otras especies de planta. El diseño y uso de dichos cebadores se conoce por alguien de habilidad en el oficio.
Vectores
Los polinucleótidos descritos en la invención se pueden incorporar en un vector replicable recombinante. El vector se puede utilizar para replicar el ácido nucleico en una célula huésped compatible. De esta manera en otra modalidad, la invención proporciona un método para fabricar polinucleótidos de la invención, mediante la introducción de un polinucleótido de la invención en un vector replicable, introduciendo el vector en una célula huésped compatible, y el cultivo de la célula huésped bajo condiciones a las cuales se produce la replicación del vector. El vector se puede recuperar a partir de la célula huésped. Las células huésped apropiadas incluyen bacterias tales como E. coli, levadura, líneas celulares de mamífero y otras líneas celulares eucarióticas, por ejemplo células Sf9 de insecto.
Preferiblemente, un polinucleótido de la invención en un vector se liga operablemente a una secuencia control que es capaz de proporcionar la expresión de la secuencia codificante por la célula huésped, i.e. el vector es un vector de expresión. El término "ligado operablemente" significa entonces que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar en su forma propuesta. Una secuencia reguladora "ligada operablemente" a una secuencia codificante se liga de tal forma que la expresión de la secuencia codificante se logra bajo condición compatible con las secuencias control.
Las secuencias control se pueden modificar, por ejemplo mediante la adición de otros elementos reguladores transcripcionales para hacer que el nivel de transcripción se controle por las secuencias control, más sensibles a los moduladores transcripcionales.
Los vectores de la invención pueden ser transformados o transfectados en una célula huésped apropiada, como se describe a continuación para proporcionar la expresión de una proteína de la invención. Este proceso puede comprender el cultivo de una célula huésped transformada con un vector de expresión como se describe anteriormente bajo condiciones, para proporcionar la expresión por el vector de una secuencia codificante que codifica la proteína, y opcionalmente la recuperación de la proteína expresada. Los vectores pueden ser por ejemplo, vectores de plásmido o virus proporcionados con un origen de replicación, opcionalmente un promotor para la expresión del citado polinucleótido y opcionalmente un regulador del promotor. Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables, por ejemplo un gen de resistencia a la ampicilina en el caso de un plásmido bacteriano o un gen de resistencia a la neomicina para un vector de mamífero. Los vectores se pueden utilizar, por ejemplo, para transfectar o transformar una célula huésped. Las secuencias control ligadas operablemente a las secuencias que codifican la proteína de la invención incluyen promotores/potenciadores y otras señales de regulación de la expresión. Estas secuencias control se pueden seleccionar por ser compatibles con la célula huésped para la cual el vector de expresión se diseña para utilizarlo. El término promotor es bien conocido en el oficio y abarca las regiones de ácido nucleico que oscilan en tamaño y complejidad a partir de promotores mínimos a promotores incluyendo elementos y potenciadores secuencia arriba.
El promotor usualmente se selecciona de promotores que son funcionales en células de mamífero, aunque los promotores procarióticos y los promotores funcionales en otras células eucarióticas se pueden utilizar. El promotor usualmente se deriva a partir de las secuencias promotor de genes virales o eucarióticos. Por ejemplo, pueden ser un promotor derivado del genoma de una célula en la cual la expresión está ocurriendo. Con relación a los promotores neucarióticos, pueden ser promotores que funcionan de una manera ubicua (tal como promotores de \alpha-actina, b-actina, tubulina) o, alternativamente, una manera de tejido-específico (tal como promotores de los genes para piruvato quinasa). Se prefieren particularmente, los promotores específicos de tejido específico para tejido seleccionado de las células vegetales, ver abajo en la sección "plantas transgénicas".
También puede ser ventajoso para los promotores que sean inducibles, para que los niveles de expresión del gen heterólogo, puedan ser regulados durante el tiempo de vida de la célula. Inducible significa que los niveles de expresión obtenidos utilizando el promotor, pueden ser regulados.
Además, cualquiera de estos promotores puede ser modificado mediante la adición de otras secuencias reguladoras, por ejemplo secuencias potenciadoras. Los promotores quiméricos que también se pueden utilizar comprenden elementos de secuencias a partir de dos o más promotores diferentes descritos anteriormente.
Por consiguiente, la invención se relaciona con vectores de ADN, particularmente plásmidos, cósmidos, virus, bacteriófagos y otros vectores que se utilizan convencionalmente en ingeniería genética que comprenden una secuencia de ADN de acuerdo con la invención. Los métodos que son bien conocidos por aquellos de habilidad en el oficio se pueden utilizar para construir varios plásmidos y vectores: ver por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory (1989) N.Y. and Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994). Dicho vector además preferiblemente comprende un promotor, funcional en las células vegetales, ligado operablemente a la secuencia de ADN, de acuerdo con la invención. Con tal vector, la secuencia de ADN de acuerdo con la invención se puede expresar en las células vegetales y puede modular la replicación del ADN en las citadas células.
Identificación de derivados, variantes y homólogos de las proteínas de la invención que interactúan con el ciclo celular
En otra modalidad, la presente invención se relaciona con un método para identificar y/o obtener las proteínas capaces de modular la replicación del ADN en plantas, que comprende un ensayo de selección de dos-híbridos, utilizando secuencias del polinucleótido CDC27 como un cebo y una biblioteca de cADN de un cultivo de suspensión celular como presa.
El ensayo de dos-híbridos de levadura es una estrategia genética desarrollada para identificar proteínas (codificadas por los cADNs, las "presas") capaces de interactuar in vivo con una proteína conocida (el "cebo"). Las interacciones entre proteínas se detectan a través de la reconstitución de la actividad de un activador de transcripción y la posterior expresión de un gen indicador. El cultivo celular puede ser a partir de cualquier organismo que posea proteínas que interactúen con el ciclo celular, tal como animales, preferiblemente mamíferos. Particularmente se prefieren cultivos en suspensión de células vegetales tales como de la Arabidopsis. Las moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas o péptidos identificados para interactuar con CDC27 en el ensayo mencionado anteriormente, se pueden obtener fácilmente y secuenciar por métodos conocidos en el oficio. Por consiguiente, la presente invención también se relaciona con una secuencia de ADN que codifica una proteína que interactúa con el ciclo celular obtenible por el método de la invención.
Plantas transgénicas
Para analizar el campo de aplicación industrial de la invención, se pueden hacer plantas transformadas, utilizando la secuencia del nucleótidos de acuerdo con la invención. Tal transformación del nuevo(s) gen(s), proteínas o variantes/muteinas inactivadas de estas, tendrán positivamente o negativamente un efecto sobre la división celular. Los métodos para modificar los niveles de expresión y/o la actividad son conocidos por aquellos de habilidad en el oficio e incluyen por ejemplo sobreexpresión, co-supresión, el uso de ribozimas, estrategias sentido y anti-sentido, metodologías de silenciamiento del gen. "cadena codificante" se refiere a la-cadena de una molécula de ADN bicatenario que es homóloga a un mRNA transcrito de esta. La "cadena anti-codificante" contiene una secuencia invertida que es complementaria a aquella de la "cadena codificante".
Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención son en particular útiles para la manipulación genética de células vegetales con el fin de modificar las características de plantas y para obtener plantas con fenotipos modificados, preferiblemente mejorados o útiles. De modo semejante, la invención también se puede utilizar para modular la división celular y el crecimiento de células, preferencialmente células vegetales, en cultivos in vitro. Una planta transformada puede, de esta manera, ser obtenida mediante transformación una célula vegetal con un gen que codifica un polipéptido afectado o fragmento de este, solo o en combinación. Para este propósito, promotores de tejido específico, en una construcción o que se presenta como una construcción separada en adición a la secuencia afectada, se pueden utilizar. De esta manera, la presente invención se relaciona con un método para la producción de plantas transgénicas, células vegetales o tejido vegetal que comprenden la introducción de una molécula de ácido nucleico o vector de la invención en el genoma de dicha planta, célula vegetal o tejido
vegetal.
La invención además se relaciona con un método para modular la replicación del ADN en las células vegetales, partes de la planta o plantas, confiriendo a una o más células vegetales, la capacidad para proporcionar una proteína, o una muteina de esta, de acuerdo con la invención, en una cantidad suficiente para modular la replicación del ADN y/o para bloquear la mitosis de las citadas células. En particular, la dicha capacidad se confiere a una o más células vegetales, por
a) transformación de una o más células vegetales con ADN de acuerdo con la invención o con un vector de acuerdo con la invención,
b) mantenimiento o cultivo de las células vegetales con el fin de regenerar partes de la planta o plantas a partir de las células transformadas
c) incubación de las células, partes de la planta o plantas en condiciones, que permiten la expresión del ADN de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, para producir una proteína de acuerdo con la invención o una muteina de esta, de acuerdo con la invención. Para la expresión de las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención en orientación sentido o antisentido en las células vegetales, las moléculas se colocan bajo el control de elementos reguladores, que aseguran la expresión en las células vegetales. Estos elementos reguladores pueden ser heterólogos u homólogos con respecto a la molécula de ácido nucleico que se expresa, así como, con respecto a la especie de la planta que se transforma. En general, tales elementos reguladores comprenden un promotor activo en las células vegetales. Para obtener la expresión en todos los tejidos de una planta transgénica, preferiblemente se utilizan, promotores constitutivos, tales como el promotor 35 S de CaMV (Odell, Nature 313 (1985), 810-812) o promotores de los genes de la poliubiquitina del maíz (Christensen, Planta Mol. Biol. 18 (1982), 675-689). Con el fin de lograr la expresión en tejidos específicos de una planta transgénica es posible utilizar promotores de tejido específico (ver, por ejemplo, Stockhaus, EMBO J. 8 (1989), 2245-2251). También son conocidos los promotores que son específicamente activos en tubérculos de patatas o en semillas de diferentes especies de plantas, tales como maíz, Vicia, trigo, cebada etc. Los promotores inducibles se pueden utilizar con el fin de ser capaces de controlar exactamente la expresión. Un ejemplo para promotores inducibles son los promotores de genes que codifican proteínas de choque térmico. También los elementos reguladores microspora-específicos y sus usos han sido descritos (WO96/16182). Adicionalmente, se puede emplear el sistema-Tet inducible químicamente (Gatz, Mol. Gen. Genet. 227 (1991); 229-237). Otros promotores apropiados se conocen por alguien de habilidad en el oficio y se describen, por ejemplo, en Ward (Planta Mol. Biol. 22 (1993), 361-366). Los elementos reguladores, además pueden comprender potenciadores funcionales transcripcionales y/o de traducción en células vegetales. Adicionalmente, los elementos reguladores pueden incluir señales de terminación de la transcripción, tales como una señal poli- A, que conduce a la adición de una cola poli A para el transcrito que puede mejorar su estabilidad.
Los métodos para la introducción de ADN foráneo en las plantas también son bien conocidos en el oficio. Estos incluyen, por ejemplo, la transformación de células vegetales o tejidos con T-ADN utilizando Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium tumefaciens, la fusión de protoplastos, transferencia de gen directo (ver, por ejemplo, EP-A 164 575), inyección, electroporación, métodos biolísticos como bombardeo de partícula, transformación mediada por el polen, transformación mediada por el virus de ARN de la planta, transformación mediada por el liposoma, transformación utilizando embriones inmaduros degradados de enzima o heridos, o callo embriogénico degradado de enzima o herido y otros métodos conocidos en el oficio.
En general, las plantas que pueden ser modificadas de acuerdo con la invención y que, o bien muestran la sobreexpresión de una proteína de acuerdo con la invención o una reducción de la síntesis de tal proteína se pueden derivar de cualquier especie de planta deseada. Pueden ser plantas monocotiledóneas o plantas dicotiledóneas, preferiblemente pertenecen a la especie de planta de interés en agricultura, cultivo de árboles de madera u horticultura de interés, tales como plantas de cultivo (por ejemplo maíz, arroz, cebada, trigo, arroz, avena etc.), patatas, plantas que producen aceite (por ejemplo aceite de semilla de colza, girasol, nuez de guisante, soja, etc.), algodón, remolacha azucarera, caña de azúcar, plantas leguminosas (por ejemplo alubias, guisantes etc.), plantas que producen madera, preferiblemente árboles, etc.
La invención además se relaciona con una progenie de tales plantas y para material de plantas tales como raíces, flores, fruta, hojas, polen, semillas, semilleros o tubérculos, obtenibles de la planta de acuerdo con la invención. La invención además se relaciona con una célula vegetal, transformada con un vector de acuerdo con la presente invención, o que comprende ADN de acuerdo con la presente invención. La invención también se relaciona con plantas, obtenibles por el método de acuerdo con la presente invención y con la progenie de tal planta y con el material de plantas, tal como raíces, flores, fruta, hojas, polen, semillas, semilleros o tubérculos, obtenibles de la planta de acuerdo con la invención.
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Mutantes
En otras modalidades de la invención, se utiliza la expresión de mutantes negativos dominantes de CDC27, para modular la replicación del ADN en las células vegetales, tejido vegetal, órganos de la planta y/o plantas completas. Estas modalidades involucran la sobreexpresión de una muteina o gen mutante de acuerdo con la presente invención, que inhibirá la función de un alelo del tipo salvaje cuando se expresa en la misma célula, por consiguiente el fenotipo de una planta transgénica, órgano de planta o célula vegetal que expresa el mutante será aquel de una progresión del ciclo celular bloqueado. Herskowitz, Nature 329: 219-222 (1987), revisiones de la inactivación de genes por interferencia en el nivel de la proteína, que se logra a través de la expresión de elementos genéticos específicos que codifican un polipéptido que comprende ambos dominios intactos, funcionales de la proteína del tipo salvaje así como dominios no-funcionales de la misma proteína del tipo salvaje. Tales péptidos se conocen como proteínas mutantes negativas dominantes. Ejemplos de mutantes negativos dominantes se suministran a continuación.
Mutantes CDC27 - Endoreduplicación
Una modalidad de la invención involucra la regulación reductora de CDC27. Otra modalidad de la invención involucra la regulación reductora de CDC27 resultando en la supresión del complejo APC, la modulación de replicación del ADN y/o bloqueo de mitosis. Esto se puede lograr por la expresión de mutantes puntuales de CDC27. Una estrategia alternativa se puede concebir involucrando una muteina CDC27 que consiste de un bloque de repeticiones en tándem de TPR. Tal muteina no obstante, es viva para interactuar con otra proteína que contiene TPRs a partir de la APC tal como CDC16 y CDC23 o proteínas reguladoras APC tales como PP5. Como tal, proteínas componentes de APC o proteínas reguladoras de APC probablemente se titulan y la función de APC normal se impide. Basándose en resultados ya obtenidos a partir de experimentos diseñados para delinear los dominios TPR involucrados en la interacción entre dos proteínas TPR (Lamb et al. 1984, EMBO J 13, 4321-4328; Ollendorf and Donoghue 1997, J Biol Chem 272, 32011-32018), esta estrategia podría por cierto confirmarse valiosa. La sobreexpresión de la muteina CDC27s, vía el efecto sobre la APC, se pueden utilizar para mejorar la endoreduplicación en las células vegetales, tejidos vegetales, órganos de la planta, o plantas completas. Por ejemplo, como se describe anteriormente, una muteina CDC27 en donde la SEQ ID No 7 ha sido mutada, conduciendo a la incapacidad de esta muteina para unir con otros factores de la APC pueden ser mencionados. La proteína mutada sería aún capaz de interactuar con el sustrato, con ello la titulación de la APC, aboliendo o al menos reduciendo seriamente la función de APC, conduciendo a la formación de células poliploides. También, las mutaciones en la SEQ ID No 6 o 10 podrían suministrar la muteina incapaz de interactuar con el sustrato pero aún ser capaz de unir con los otros factores del complejo-APC. El resultado es la generación de un dominante negativo, como el complejo no sería capaz de conducir a la destrucción de componentes claves de la mecánica del ciclo celular, responsable para controlar el número de los ciclos de replicación del
ADN.
Por manipulación del nivel de endoreduplicación se puede incrementar la capacidad de almacenamiento de, por ejemplo, células del endosperma. De esta manera, otro aspecto de la invención actual es que una o más secuencias de ADN, vectores o proteínas, secuencias reguladoras o moléculas de ADN recombinante de la invención se puedan utilizar para modular, por ejemplo, endoreduplicación en las células de almacenamiento, tejidos de almacenamiento y/u órganos de almacenamiento de plantas o partes de estas.
Los órganos de almacenamiento blanco preferidos y partes de estos, para la modulación de endoreduplicación son, por ejemplo, semillas (como a partir de cereales, cultivos de semillas para aceite), raíces (como en la remolacha azucarera), tubérculos (como en la patata) y frutas (como en vegetales y especies frutales). Adicionalmente, se espera que aumente la endoreduplicación en órganos de almacenamiento y partes de estos se correlacionan con una mayor capacidad de almacenamiento y, como tal, con un mejor rendimiento. En aún otra modalidad de la invención, una planta con endoreduplicación modulada en la planta completa o partes de esta se pueden obtener a partir de una única célula vegetal por transformación de la célula, de una manera conocida por alguien de habilidad, con los medios descritos anteriormente.
Mutantes CDC27 - Plantas estériles
Otra modalidad de la invención se relaciona con un método para modular la replicación del ADN y la generación resultante de plantas estériles macho o hembra. Esto se podría lograr por la expresión de mutantes negativos dominantes de cdc27 bajo el control de promotores muy específicos - ya sea a partir de gametofitos macho o hembra - para bloquear la división celular y desestabilizar la meiosis. Las plantas resultantes deberían ser naturalmente estériles.
Plantas poliploides
Otra modalidad de la invención se relaciona con la generación de células poliploides de la planta, partes de la planta o plantas.
Si por ejemplo, las células vegetales se transforman con un vector, que comprende la secuencia codificante de planta CDC27, de acuerdo con la presente invención, bajo el control de un promotor apropiado y opcionalmente otros elementos que controlan la expresión, estas células vegetales pueden producir CDC27. Cuando las citadas células vegetales producen proteína CDC27 en una suficiente cantidad, rondas extra de replicación del ADN pueden tomar lugar después de la mitosis, conduciendo a células poliploides.
Caracterización de los genes CD27
La arquitectura de los genes CDC27 se ilustran en las figuras 1 y 3. Los exones se encajonan. Los números arriba de la caja indican la longitud del exón, el número abajo y entre las dos cajas indica la longitud del intrón. En la figura 1 y 3, la arquitectura genómica de los genes CDC27A1 y CDC27B, respectivamente, de Arabidopsis thaliana se describen según se explica anteriormente. El segundo y el dieciseisavo (último) exón (negro en la figura 2) comprenden novedosas secuencias codificantes y no se identificaron en la secuencia CDC27A1 genómica conocida de Arabidopois thaliana (ver text). La secuencia total comprende 2184 nucleótidos, correspondientes a 727 aminoácidos. Los primeros 5 exones (negro en la figura 5) y parte del 6º exón (negro en la figura 5) comprenden novedosas secuencias codificantes y no se identificaron en la secuencia CDC27B genómica conocida de Arabidopsis thaliana (ver text). La secuencia total comprende 2151 nucleótidos, correspondientes a 716 aminoácidos.
En la figura 2, se describe la secuencia completa de cADN de CDC27A1, como se identifica en la presente invención, con la respectiva secuencia de aminoácido codificada. Las líneas verticales en la secuencia del nucleótido indican los límites del exón, i.e. ^{2}|^{3} es el límite entre los exones 2 y 3. Los límites del exón se derivan a partir de las secuencias CDC27A1 genómicas (ver ejemplo 1). 2. Tales líneas también se dibujan en la secuencia de aminoácido, aunque, como se indica anteriormente, los aminoácidos, que flanquean tal línea vertical, pueden ser codificados parcialmente por el exón adyacente. La posición exacta de la línea vertical no es posible en tal caso y se fija en la izquierda o la derecha de tal aminoácido de una manera arbitraria. Ver ejemplo 1, para más detalles. Una alineación de las secuencias de aminoácido CDC27A1 (SEQ ID NO 5) y CDC27B (SEQ ID NO 13) se da en la Figura 4 con indicación de la SEQ ID NOS 6, 7, 10 y 12. Dichas secuencias CDC27A1 y CDC27B son 49% idénticas cuando se introducen huecos en las secuencias para asegurar la alineación óptima y la máxima identidad.
En las figuras 5 y 6, se ilustra la expresión de genes CDC27A y CDC27B. La figura 5A muestra la expresión de los genes CDC27A (ambos CDC27A1 y CDC27A2 se detectan; indicados por las flechas) en varios tejidos de Arabidopsis thaliana: 1- semilleros decolorados; 2-flores; 3-brotes; 4-troncos; 5-hojas; 6-raices; siliques; - control negativo. La figura 7B muestra la expresión de genes CDC27A en cultivos de raíz de Arabidopois thaliana tratados con diferentes sustancias: ácido 1-abscísico (ABA); ácido 2-2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D); 3-hidroxiurea; 4-quinetina; 5-quinetina + ácido 1-naftalenoacético (NAA); 6-NAA; 7-orizalina; 8-ayuno; 9-raices control sin tratar; -control negativo. La figura 6A muestra la expresión del gen CDC27B en varios tejidos de Arabidopsis thaliana como se esquematiza en la Figura 5A. La figura 5B ilustra la expresión del gen CDC27B en cultivos de raíz de Arabidopois tratados con diferentes sustancias como se esquematiza en la Figura 5B.
La invención será además ilustrada por los siguientes ejemplos, que no tienen la intención de limitar el alcance de la invención.
Aunque en general las técnicas mencionadas aquí son bien conocidas en el oficio, se puede hacer referencia en particular a Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc. Además, las explicaciones científicas y consideraciones en los ejemplos se dan solamente por razones de ilustración, pero sin estar vinculadas al mismo.
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Ejemplo 1
Aislamiento del gen de Arabidopsis CDC27A1 y cADN
Las regiones conservadas de los genes homólogos CDC27 publicados (Sikorski et al., 1991 Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology vol LVI, 663-673, 1991) se utilizaron para sintetizar los oligonucleótidos degenerados para amplificar el cADN de Arabidopsis CDC27. Los oligonucleótidos fueron como sigue:
1 (sentido):
5' TGG GTA/C/G/T TTA/G GCA/C/G/T A/CAA/G GG 3'
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2 (sentido):
5' ATG GAA/C/G/T G/ATT/C/A TA/TC/T AGA/C/G/T AC 3'
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3 (antisentido)
5' AGA/G CAT/C TAT/C AAT/C GCA/C/G/T TGG 3'
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4 (antisentido)
5' TA T/A/G AC/T CAT A/C/G/TCC C/TAA A/C/G/CC A/GAA 3'
La primera cadena de cADN preparada a partir de brotes de flores se utilizó como plantilla en reacciones PCR anidadas. La primera reacción se realizó utilizando el par de oligos 1 y 4, y la segunda reacción utilizando oligos 2 y 3. Las condiciones de PCR fueron como se describen (Ferreira et al., 1991, Planta Cell 3, 531-540), excepto que la temperatura de hibridación de la primera reacción fue 45ºC, y para la segunda reacción, 37ºC se utilizó. Un fragmento de aproximadamente 300 bp se eluyó a partir de gel agarosa y se clonó en pGEM-T. De los 16 clones secuenciados, dos mostraron alta homología con la secuencia publicada de CDC27s (Sikorski et al., 1991 Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology vol LVI, 663-673, 1991). Este fragmento luego se utilizó para seleccionar una biblioteca de cADN lambda gt10 preparada a partir de plantas de Arabidopsis completas. El cADN diana aislado, aproximadamente 2,5 kb, se secuenció completamente, mediante el método dideoxi y se muestra en la fig 4 y en la SEQ ID nr 9. Se utilizó, una combinación de enzimas de restricción y oligonucleótido subclonadas para producir las plantillas para la secuenciación.
El cADN CDC27A1 de Arabidopsis contiene un marco de lectura abierto, que codifica un polipéptido de 727 aminoácidos (figura 4). Con el programa de búsqueda SRS, los bancos de datos EMBL y EMBL nuevos fueron seleccionados para secuencias génicas, homólogas a la presente secuencia de CDC27 de cADN. Una secuencia genómica a partir de Arabidopsis thaliana (número de acceso AC001645) se encontró, que comprende 14 exones, codificantes para una proteína de 727 AA. Con el paquete GCG versión 9.1, la presente cADN-secuencia se comparó con la dicha secuencia genómica de Arabidopsis (1) utilizando el programa "mejor ajuste". Parece que el presente cADN comprende información codificante adicional para dos novedosos exones, a saber, el segundo y último exón del gen CDC27 de la Arabidopsis (exones 2 y 16 en la fig 4).
Las secuencias de aminoácido codificadas por el segundo y último exón se describen en la SEQ ID NOS 6 y 7 respectivamente.
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Ejemplo 2
Mutantes de CDC27
Varios tipos de muteina CDC27s se pueden considerar:
(1) Inserción de un aminoácido tal como prolina (P) en la secuencia de aminoácido SEQ ID No 7, por ejemplo detrás del residuo tirosina (Y) conduce a una pérdida-de-función de la APC. Se cree que tal inserción deforma el pronosticado (\alpha-hélice del novedoso dominio similar a TPR del cual la SEQ ID No 7 es parte y causa una alteración de la estructura tri-dimensional completa de CDC27, con ello la titulación de las proteínas funcionales de la APC, tales como CDC16 o CDC 23, da lugar a la pérdida de función de APC. En consonancia con estos resultados, la alteración de la estructura \alpha-hélice en una de las unidades TPR de levadura CDC27 ha sido probada, y de cualquiera de las unidades TPR se ha hecho la hipótesis, que destruye la función de CDC27 (Lamb et al. 1984, EMBO J. 13, 4321-4328).
(2) Deleción del terminal-NH_{2} 100 a 220 o 200 a 220 aminoácidos de CDC27 también conduce a pérdida de función de la APC por la titulación de moléculas tales como sustratos APC o reguladores APC. Este dominio abarca la secuencia conservada de aminoácido SEQ ID No 6 así como la primera unidad TPR de CDC27. Deleción de esta secuencia en CDC27 humano abroga el enlace de por ejemplo CDC16, pero no de aquel de por ejemplo PP5, una proteína reguladora APC (Ollendorff and Donoghue 1997, J Biol Chem 272, 32011-32018).
(3) muteinas CDC27 que consisten del terminal-NH_{2} dominio conservado (que contiene la SEQ ID No6) y 1, 2 o más de las unidades TPR secuencia abajo.
(4) muteinas CDC27 que consisten del novedoso dominio similar a TPR (concluyendo con la SEQ ID No7) precedido por 1, 2 o más de las unidades TPR secuencia arriba.
Muteinas descritas en (3) y (4) actúan como aquellos descritos en (1) o (2).
Las mutantes puntuales en (1) se obtienen por mutagénesis específica puntual utilizando el kit de mutagénesis específica puntual PCR-basado ExSite (Stratagene, La Jolla, CA). La fidelidad de la mutagénesis se confirma por secuenciación. Deleción de mutantes en (2), (3) y (4) se obtienen por PCR de alta fidelidad (Expand High Fidelity PCR System, Boehringer, Mannheim) utilizando cebadores diseñados para amplificar los tramos deseados de la secuencia de CDC27 del nucleótido. Los cebadores incluyen extensiones reconocidas por endonucleasas de restricción para permitir la fácil clonación en un vector tal como pUC18. Las secuencias amplificadas se comprueban mediante la determinación de la secuencia del nucleótido.
La expresión de dichas muteinas CDC27 en una planta completa, un tejido vegetal, un órgano de planta o una célula vegetal causará el mal funcionamiento de la APC y de esta manera ciclos repetitivos de la síntesis del ADN sin que intervenga la mitosis. Esta endoreduplicación resulta en un poliploide fenotipo.
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Ejemplo 3
Transferencia de un casete de expresión a un casete de expresión de A. thaliana, como se describe a continuación se transfiere a un vector binario tal como pGSC1704 y el resultante vector de la electroporación en el Agrobacterium tumefaciens C58C1RifR (pGV2260). Los transformables se seleccionan de medio que contiene estreptomicina/espectinomicina y se verifican para la presencia del vector binario transformado integral. Arabidopsis thaliana Col-0 se transforma con la cepa seleccionada de A. tumefaciens, mediante el método de inmersión floral (Clough and Bent 1998, Planta J 16, 735-743). Las plantas transgénicas se seleccionaron después de la germinación de la semilla en la presencia de higromicina.
Endoreduplicación - muteina CDC27s
Cualquiera de las muteinas se liga operablemente a un promotor constitutivo tal como el promotor CaMV 35S (Kay et al. 1987, Science 236, 1299-1302) o a un promotor específico de semilla con endosperma, como de una proteína de almacenamiento de semilla de albúmina 2S (Guerche et al. 1990, Planta Cell 2, 469-478) o con el promotor BLZ2 (Carbonero et al, 1999 in press) y con una señal de poliadenilación. Tales casetes de expresión se transfieren a A. thaliana como se describe anteriormente. Las líneas transformables seleccionadas tienen una común alta velocidad de células de endoreduplicación (promotor CaMV 35S) y/o producen semillas con una alta cantidad de células poliploides del endosperma (promotor albúmina 2S). La endoreduplicación o el poliploidismo se evalúan de varias formas.
(1) La microscopia confocal se aplica para medir el diámetro nuclear. Las células poliploides normalmente tienen núcleo aumentado con el fin de hospedar el contenido de ADN aumentado.
(2) El contenido de ADN de células vegetales se determina por citometría de flujo (Galbraith et al. 1991, Planta Physiol 96, 985-989).
(3) La actividad que degrada la ciclina B de la APC se determina como se describe por King et al. (1995, Cell 91, 279-288).
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Ejemplo 4
Análisis de la expresión del gen CDC27 por RT-PCR
La primera-cadena cADN, se preparó a partir de ARN aislado de diferentes tejidos de Arabidopsis thaliana (semilleros decolorados, flores, brotes de flores; troncos; hojas; raíces; siliques) y de cultivos de raíz de Arabidopsis thaliana tratados por 48 h con diferentes sustancias químicas (ácido abscísico10^{-6} M; ácido 2,4-diclorofenoxiacético10^{-7} M; hidroxiurea 100 mM; quinetina 10^{-6} M; quinetina 10^{-6} M + ácido 1-naftalenoacético10^{-6} M; ácido 1-naftalenoacético
10^{-6} M; 2% (peso/volumen) de orizalina). PCR se realizó con estos cADNs utilizando cebadores específicos de CDC27A (cebador sentido 5' CCG TAG TGC TAG AAT AGC A 3' y cebador antisentido 5' AGT CAG CGT TGA AGT c3') o cebadores específicos de CDC27B (cebador sentido 5' TCT CTC GAG GAA GAA AGG CAA CAA 3' y cebador antisentido 5' GGT TCT TGG AGT AGC TAT GGT TTC 3'). Los fragmentos resultantes generados por PCR se separaron en un gel agarosa, se transfirieron a una membrana de nylon y se hibridizaron con una sonda marcada ^{32}P de ADN de CDC27A o CDC 27B. Los resultados se muestran en la Figura 5 para CDC27A donde las flechas indican la presencia de 2 bandas, que difiere por 30 nucleótidos. La secuenciación de ambos fragmentos mostraba que son idénticas, excepto para la inserción de 30 bp. La figura 6 ilustra los resultados para CDC27B.
Los dibujos en la Figuras 5 y 6 son representantes de 3 experimentos independientes. Ambos genes se expresan en todos los tejidos vegetales, pero en niveles reducidos en flores abiertas y siliques. La expresión de ambos genes no se afecta drásticamente por tratamientos de hormonas, excepto para una reducción en niveles de expresión observada cuando las raíces se incubaron con 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético). Se utilizaron cebadores específicos de ubitiquina en reacciones RT-PCR separados, utilizando la misma primera cadena de cADNs y, después de la hibridación, las señales de la ubiquitina se utilizaron para normalizar los experimentos con CDC27A y CDC27B (no se muestran los datos). Mientras los resultados de los experimentos con hidroxiurea y orizalina que se muestran sugieren una reducción en los niveles de expresión de CDC27A cuando las raíces se tratan con hidroxiurea. Si estos experimentos se normalizan con los resultados de los experimentos de ubiquitina la diferencia no es significante. Sin embargo, una disminución en la expresión de CDC27B se observa en raíces tratadas de hidroxiurea, aún cuando los resultados se normalizan con ubiquitina. Este resultado indicaría que la expresión de CDC27B podría ser ciclo celular regulado.
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Ejemplo 9
Aislamiento de un cADN del CDC27A2 del Arabidopsis
Los productos RT-PCR obtenidos con los cebadores específicos de CDC27A según se definen en el Ejemplo 8 se clonaron. Los clones CDC27A correspondientes con los transcritos de tamaños diferentes (ver la Figura 7) se identificaron y sus secuencias del nucleótido se determinaron. Esto revela que ambos tipos de clones CDC27A tuvieron secuencias de nucleótido idénticas con la excepción de un tramo de 33 nucleótidos que estuvo ausente del cADN de CDC27A más pequeño. Por lo tanto, el cADN de CDC27A más largo se refiere como CDC27A1 (SEQ ID NO 9) dado que el cADN de CDC27A más pequeño se refiere como CDC27A2 (SEQ ID NO 14).
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Ejemplo 10
Aislamiento de un gen de CDC27B de Arabidopsis y cADN
Por medio de la clonación in silicon un segundo homólogo CDC27 de Arabidopsis thaliana se identificó con número de acceso AC006081 de GenBank. El software GeneMark se utilizó para predecir la estructura exón-intrón del gen (ver la Figura 3) y se observó que la secuencia de aminoácido de la proteína derivada del marco de lectura abierto pronosticado comprende un extra de 161 aminoácidos en el terminal-NH_{2} según se compara con la secuencia GenBank. Posteriormente la región codificante se aisló por PCR sobre cADN utilizando el cebador que se sitúa inmediatamente fuera del marco de lectura abierto pronosticado. Un producto del tamaño esperado se obtuvo, se clonó y su secuencia de nucleótido se determinó para confirmar el marco de lectura abierto pronosticado. Los cebadores utilizados para clonar el marco de lectura abierto fueron: cebador sentido 5' TCT CTC GAG GAA GAA AGG CAA CAA 3' y cebador antisentido 5' GGT TCT TGG AGT AGC TAT GGT TTC 3'. El nuevo homólogo CDC27 de Arabidopsis se refiere como CDC27B.
Las proteínas CDC27A1 y CDC27B se alinean en la Figura 4 y son solamente el 49% idéntica.
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Referencias citadas en la descripcion Esta lista de referencias citada por el aspirante es solamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de la patente Europea. Aún cuando se ha tenido gran cuidado en recopilar las referencias, los errores u omisiones no se pueden excluir y la EPO desconoce toda responsabilidad a este respecto. Documentos de patentes citadas en la descripción
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<110> CropDesign N.V.
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Universidade Federal do Rio de Janeiro 
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<120> proteínas que modulan la replicación del ADN de la planta
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<130> A0040067
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<140>
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<141>
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<150> EP99202214.5
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<151> 1999-07-05
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<160> 15
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 5
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<211> 728
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<212> PRT
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<213> Arabidopsis thaliana 
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<400> 5
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2
3
4 
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<210> 6
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<211> 24
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:péptido
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<400> 6
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5 
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<210> 7
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<211> 18
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:péptido
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<400> 7
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6 
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<210> 9
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<211> 2434
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<212> ADN
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<213> Arabidopsis thaliana 
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<400> 9
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7
8 
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<210> 10
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<211> 161
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:péptido
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<400> 10
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<212> PRT
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<213> Arabidopsis thaliana 
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<400> 11
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11
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<210> 12
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<211> 12
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<212> PRT <213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:péptido
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<400> 12
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<210> 13
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<211> 739
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<212> PRT
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<213> Arabidopsis thaliana 
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<400> 13
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<210> 14
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<211> 2401
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<212> ADN
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<213> Arabidopsis thaliana 
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<400> 14
18 
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<210> 15
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<211> 2220
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<212> ADN
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<213> Arabidopsis thaliana 
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<400> 15
20

Claims (16)

1. Método para incrementar la capacidad de almacenamiento en plantas, que comprende la etapa de transformación de las células vegetales con el ADN codificante por una proteína vegetal CDC27 seleccionada de:
a) una o más de las secuencias de aminoácido seleccionadas del grupo que consiste de aquellas dadas por SEQ ID NOS 5, 11, 13; o
b) un análogo funcional de esta, seleccionado de una o más secuencias de aminoácido que tiene al menos 90%, 95% o 98% de identidad del aminoácido con aquellas de a), en donde 100 a 220 aminoácidos se suprimen en el N-terminal de dicha proteína CDC27 o análogo funcional de esta.
2. Método de la reivindicación 1, en donde 200 a 220 aminoácidos se suprimen en el N-terminal de dicha proteína CDC27 o en el análogo funcional de esta.
3. Método de la reivindicación 1 o 2, en donde el ADN codifica la proteína vegetal CDC27 que tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO 13, en donde 100 a 220 aminoácidos se suprimen en el N-terminal de dicha proteína CDC27.
4. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la capacidad de almacenamiento se incrementa en las células de almacenamiento, tejidos de almacenamiento y/u órganos de almacenamiento de la citada planta.
5. Método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la capacidad de almacenamiento se incrementa en células del endosperma, las semillas, raíces, tubérculos y/o frutas.
6. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la capacidad de almacenamiento aumentada da un rendimiento mejorado.
7. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dichas plantas se obtienen por:
a) transformación de una o más de las células vegetales con ADN codificante por una proteína vegetal CDC27 o un análogo funcional de esta de acuerdo con la reivindicación 1, en donde 100 a 220 aminoácidos se suprimen en el N-terminal de dicha proteína CDC27 o de dicho análogo funcional, estando dicho ADN ligado operablemente a un promotor funcional en las células vegetales;
b) cultivo de las células vegetales de a) con el fin de regenerar como partes de la planta o plantas a partir de dichas células transformadas; o
c) cultivo de partes de la planta o plantas de b) en condiciones que permiten la expresión de dicho ADN para producir la citada proteína CDC27 o análogo funcional de esta.
8. Método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicho promotor es un promotor constitutivo.
9. Método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicho promotor es un promotor específico del tejido.
10. Método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicho promotor es un promotor específico de la semilla.
11. Método para la producción de plantas transgénicas, células vegetales o tejido vegetal que tienen capacidad de almacenamiento aumentada, que comprende la introducción de un ADN codificante por una proteína vegetal CDC27 o un análogo funcional de esta, de acuerdo con la reivindicación 1 en donde 100 a 220 aminoácidos se suprimen en el N-terminal de dicha proteína CDC27 o análogo funcional de esta.
12. La célula de la planta que tiene capacidad de almacenamiento aumentada, transformada con un ADN codificante por una proteína vegetal CDC27 o un análogo funcional de esta, de acuerdo con la reivindicación 1 en donde 100 a 220 aminoácidos se suprimen en el N-terminal de dicha proteína CDC27 o análogo funcional de esta.
13. Planta que tiene capacidad de almacenamiento aumentada, obtenible por el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, planta que comprende el ADN codificante por una proteína vegetal CDC27 o un análogo funcional de esta, de acuerdo con la reivindicación 1, en donde 100 a 220 aminoácidos se suprimen en el N-terminal de dicha proteína CDC27 o análogo funcional.
14. Planta de acuerdo con la reivindicación 13, planta que es una planta monocotiledónea o planta dicotiledónea, preferiblemente una planta de cultivo, tal como maíz, arroz, cebada, trigo, avena de centeno; o en donde dicha planta es una planta que produce aceite, tal como aceite de semilla de colza, girasol, maní, soja; o en donde dicha planta es una planta leguminosa, tal como alubias, guisantes; o en donde dicha planta es una planta que produce madera, tal como árboles; o en donde la planta es la patata, el algodón, la remolacha azucarera o la caña de azúcar.
15. La progenie de una planta de acuerdo con la reivindicación 13 o 14, que comprende un ADN codificante por una proteína vegetal CDC27 o un análogo funcional de esta, de acuerdo con la reivindicación 1 en donde 100 a 220 aminoácidos se suprimen en el N-terminal de dicha proteína CDC27 o análogo funcional de esta.
16. Material vegetal tal como raíces, flores, fruta, hojas, tallos, polen, semillas, semilleros, o tubérculos, obtenidos a partir de una planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13-15, que comprende las células vegetales de acuerdo con la reivindicación 12.
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