ES2320706T3 - Procedimiento para la produccion de un medicamento especifico para celulas y/o tejidos y/o fases de enfermedad. - Google Patents
Procedimiento para la produccion de un medicamento especifico para celulas y/o tejidos y/o fases de enfermedad. Download PDFInfo
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Abstract
DNAzimas, caracterizadas porque ellas se componen de - un dominio catalítico con la secuencia de nucleótidos GGCTAGCTACAACGA o con una secuencia modificada que tiene un efecto biológico comparable, que corta al ARNm de T-bet en cada uno de los sitios de enlace de purina - pirimidina a los que está unido, - un dominio de fijación al substrato derecho, que sigue al extremo 3'' del dominio catalítico, y - un dominio de fijación al substrato izquierdo, que sigue al extremo 5'' del dominio catalítico, siendo los dos dominios de fijación al substrato en cada caso complementarios con dos regiones del ARNm de T-bet, de manera tal que ellos se hibridan con el ARNm, - son activas in vivo y - contienen la secuencia de td69 GGCAATGAA GGCTAGCTACAACGA TGGGTTTCT o de td70 TCACGGCAA GGCTAGCTACAACGA GAACTGGGT.
Description
Procedimiento para la producción de un
medicamento específico para células y/o tejidos y/o fases de
enfermedad.
El presente invento se refiere a un
procedimiento para la producción de un medicamento específico para
células y/o tejidos y/o fases de enfermedad, que es apropiado para
el tratamiento de inflamaciones crónicas.
Las inflamaciones crónicas constituyen un
círculo de problemas médicos cada vez más grande, con un alto
impacto socioeconómico. Entre ellas se cuentan en particular los
siguientes conjuntos de enfermedades:
- -
- enfermedades autoinmunitarias y enfermedades del círculo de formas reumáticas (manifestaciones, entre otros sitios, en la piel, los pulmones, los riñones, el sistema vascular, el sistema nervioso, el tejido conjuntivo, el aparato locomotor y el sistema endocrino)
- -
- reacciones alérgicas de tipo inmediato y asma
- -
- enfermedades pulmonares obstructivas crónicas (COPD)
- -
- arteriosclerosis
- -
- psoriasis y eccema por contacto
- -
- reacciones crónicas de rechazo después del trasplante de un órgano o de una médula ósea.
Muchas de estas enfermedades muestran en las
últimas décadas una prevalencia creciente, no solamente en las
naciones industriales, sino en parte por todo el mundo. Así, en
Europa, América del Norte, Japón y Australia, entre tanto, más de
un 20% de la población padece de enfermedades alérgicas y asma. Las
enfermedades pulmonares obstructivas crónicas son en el momento
actual causa de muerte más frecuente en quinto lugar por todo el
mundo y según los cálculos de la WHO (Organización Mundial de la
Salud) en el año 2020 constituirán la causa de muertes más
frecuente en tercer lugar. La arteriosclerosis, con las enfermedades
secuelas infarto cardiaco, ictus y enfermedad de obstrucción
arterial periférica, ocupan en la estadística de morbidez y
mortalidad por todo el mundo una posición dominante. La psoriasis y
el eccema por contacto son, en general, conjuntamente con la
neurodermitis, las enfermedades inflamatorias crónicas más
frecuentes en la piel.
A causa de las interacciones, que hasta hoy en
día se han entendido sólo insuficientemente, entre factores
medioambientales y una disposición genética,se llega a regulaciones
erróneas persistentes del sistema inmunitario. En este contexto se
pueden establecer para estas diferentes enfermedades los siguientes
principios comunes:
- (A)
- Se llega al desarrollo de una respuesta inmunitaria excesiva contra antígenos que normalmente son inocuos para los seres humanos. Estos antígenos pueden ser partes componentes del medio ambiente (p.ej. alergenos, tales como polen, pelos de animales, productos alimenticios, ácaros, sustancias químicas tales como sustancias conservantes, colorantes y agentes de limpieza). En estos casos se desarrolla en los pacientes una reacción alérgica. En el caso, p.ej., de fumadores activos y pasivos de cigarrillos se llega a enfermedades pulmonares obstructivas crónicas (COPD). Por otra parte, el sistema inmunitario, puede reaccionar, sin embargo, también contra ciertos componentes del propio organismo, reconocer a éstos como ajenos y poner en marcha una reacción inflamatoria contra ellos. En estos casos se desarrolla una enfermedad autoinmunitaria. En cualquier caso unos antígenos no tóxicos inocuos son reconocidos falsamente como ajenos o respectivamente peligrosos y se pone en marcha una desmesurada reacción inflamatoria.
- (B)
- Las enfermedades transcurren en fases, entre las que se cuentan la iniciación, la progresión, es decir el avance de la reacción inflamatoria, y la destrucción asociada con ello y la reconstrucción con pérdida de la funcionalidad del órgano (la denominada remodelación).
- (C)
- Las enfermedades muestran unas características de acentuamiento sub-fenotípicas, que son específicas para ciertos pacientes.
- (D)
- En los procesos de iniciación, mantenimiento y en los de destrucción y remodelación participan persistentemente ciertos componentes de la inmunidad congénita y adquirida. Bajo la influencia de la inmunidad congénita (componentes importantes: células que presentan antígenos con sus diversas poblaciones y el sistema de complemento) se llega a una activación y una diferenciación de las células del sistema inmunitario adaptable (componentes importantes: linfocitos T y B). Las células T toman a su cargo funciones primordiales en la evolución ulterior, al diferenciarse ellas en efectores altamente especializados. En este contexto ellas activan y adquieren determinados mecanismos de los efectores, entre los que se cuentan en particular las siguientes funciones: producción de anticuerpos, control de la funcionalidad de células efectoras del sistema inmunitario (tales como p.ej. granulocitos neutrófilos, basófilos y eosinófilos), retroacoplamiento a funciones del sistema inmunitario congénito, influjo sobre la funcionalidad de células no hematopoyéticas, tales como p.ej. las del epitelio, del endotelio, del tejido conjuntivo, de los huesos y de los cartílagos, y sobre todo células neuronales. En este contexto se llega a una interacción especial entre los sistemas inmunitario y nervioso, a partir de la cual se ha desarrollado el concepto de la interacción neuro-inmunológica en el caso de inflamaciones crónicas.
A causa de la complejidad y la multiplicidad de
los cuadros patológicos, que acompañan a las inflamaciones
crónicas, se deben establecer para un medicamento óptimo, destinado
al tratamiento de las enfermedades, los siguientes requisitos:
- (1)
- Las enfermedades se manifiestan en (sub)-fenotipos que son específicos para ciertos pacientes. Por lo tanto, los medicamentos deben de presentar una alta especificidad para ciertos pacientes o respectivamente para ciertos casos.
- (2)
- Las enfermedades transcurren en estadios y fases. Los medicamentos deben de poseer, por lo tanto, una especificidad para ciertos estadios o respectivamente para ciertas fases.
- (3)
- Las enfermedades son reguladas por células diferentemente especializadas. Por lo tanto, los medicamentos deben de dar lugar a una intervención específica para ciertas células.
- (4)
- Las enfermedades se manifiestan en diferentes órganos y compartimientos. Por lo tanto, los medicamentos deben de poseer una especificidad para ciertos compartimientos o respectivamente para ciertos órganos.
- (5)
- Los medicamentos deben de ser apropiados para una terapia a largo plazo. Así, se deben de impedir reacciones del sistema inmunitario contra los medicamentos.
- (6)
- El perfil de efectos colaterales de los medicamentos debe de estar en una relación aceptable en los contextos medicinal y ético con el grado de gravedad, el pronóstico y la evolución de las enfermedades.
Ninguna de las terapias consagradas contra
enfermedades crónicas, que hoy en día están disponibles, cumple de
modo óptimo estos criterios. A partir del documento de patente
alemana DE 695 11 245 T2 se conoce el tratamiento con una
inmunoglobulina A y a partir del documento DE 695 18 667 T2 se
conoce la inhibición de la fosfolipasa A_{2} (PLA_{2}) y/o de
la transacilasa independiente de la coenzima A
(CoA-IT). En el punto central de los conceptos
terapéuticos hoy en día consagrados, se presentan para esta
enfermedad la terapia anti-inflamatoria
inespecífica, así como la supresión inmunitaria. Así, muchas de las
sustancias que tienen un efecto anti-inflamatorio
inespecífico, que se emplean, tales como ibuprofeno, ácido
acetilsalicílico y paracetamol, o bien no son suficientemente
eficaces o están vinculadas con una alta tasa de efectos colaterales
indeseados. Los esteroides, por el contrario, tienen ciertamente
una potencia más alta del efecto, pero ellos, por su parte, están
vinculados con efectos colaterales graves, tales como hipertono,
diabetes y osteoporosis. Los medicamentos supresores de inmunidad
de la generación más reciente, tales como p.ej. la ciclosporina y el
tacrolimus, muestran una toxicidad hepática y nefrológica.
Esta situación ha conducido a la búsqueda y a la
prueba clínica de un gran número de más nuevas moléculas, que deben
de intervenir más específicamente en las regulaciones erróneas
inmunológicas y biológicas celulares. Entre ellas se cuentan las
citocinas, los receptores de citocinas y las
anti-citocinas. Los problemas, que están vinculados
con estos más recientes enfoques terapéuticos, incluyen una
defectuosa especificidad para ciertas células y ciertos órganos, el
desarrollo de indeseadas reacciones inmunitarias contra estas
moléculas, así como una defectuosa actividad en el caso de
diferentes fenotipos.
En los últimos tiempos se está intentando
emplear una nueva clase de moléculas catalíticas, las denominadas
"DNAzimas" (Santoro, 1997) como agentes terapéuticos para la
desactivación de unos genes, cuya expresión provoca enfermedades.
Las DNAzimas son unas moléculas monocatenarias, que en principio se
pueden fijar a zonas complementarias de los ARN y desactivan a
éstas por disociación. El empleo específico de DNAzimas como agentes
terapéuticos presupone, no obstante, que han de ser conocidos con
mucha exactitud los genes causantes de las enfermedades y sus ARNm
(mensajeros). Esto hasta ahora ocurre solamente en los casos de unas
pocas enfermedades.
La DNAzima descrita en el documento de solicitud
de patente internacional WO 01/11023A1 fija al mONA de RelA (p65) y
por consiguiente está dirigida contra el factor de transcripción
NF-\kappaB, y en el documento WO 00/42173 se
divulga una DNAzima que fija al ARNm de EGR-1. El
documento WO 99/50452 divulga una DNAzima 10-23 que
se puede utilizar en un procedimiento de diagnóstico para el
descubrimiento de mutaciones de ácidos nucleicos.
Ninguna de las moléculas antisentido y de las
DNAzimas, que se conocen hasta el momento actual, se puede utilizar
para la producción de un medicamento destinado al tratamiento de
inflamaciones crónicas en pacientes.
Es misión del presente invento poner a
disposición unos medicamentos que sean específicos para células y/o
tejidos y/o fases de enfermedad, los cuales conduzcan a la
desactivación funcional de moléculas de ácidos ribonucleicos de
factores de transcripción y de factores de las rutas de transducción
de señales, cuya expresión participa en la generación de reacciones
inflamatorias crónicas y de enfermedades autoinmunitarias, y que
sean apropiados para el tratamiento de reacciones inflamatorias
crónicas y de enfermedades autoinmunitarias, habiendo sido
eliminadas las desventajas expuestas en el estado de la técnica.
Además de esto es una misión del invento poner a
disposición un procedimiento para la producción de medicamentos que
sean específicos para células y/o tejidos y/o fases de enfermedad,
que identifique a moléculas de ácidos ribonucleicos de factores de
transcripción y de factores de las rutas de transducción de señales,
cuya expresión participa en la generación de reacciones
inflamatorias crónicas y enfermedades autoinmunitarias, y las
desactive funcionalmente en células dianas.
El problema planteado por esta misión se
resuelve conforme al invento mediante unas DNAzimas específicas de
acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, un procedimiento de acuerdo
con la reivindicación 6, y un medicamento, así como su utilización
de acuerdo con las reivindicaciones 7 a 9.
La ventaja del invento consiste en una
desactivación funcional de moléculas de ácidos ribonucleicos de
factores de transcripción y de factores de las rutas de
transducción de señales para la diferenciación y/o la expresión de
citocinas, que participan en la generación de las reacciones
inflamatorias crónicas y de las enfermedades autoinmunitarias
mediante específicas/os DNAzimas y/o siRNA. Esta estrategia se
distingue con respecto a los enfoques convencionales, pero también
con respecto a los enfoques terapéuticos génicos, por unas
elevadísimas especificidades y selectividades para células y/o
tejidos y/o fases de enfermedad, por una alta estabilidad de las
moléculas y por una antigenicidad despreciable. Se proporcionan las
premisas óptimas para una terapia a largo plazo desarrollada a
medida en los casos de pacientes con enfermedades inflamatorias
crónicas.
Otros detalles y otras ventajas preferentes del
presente invento son observables a partir de las siguientes Figuras
y de la memoria descriptiva. En ellas, muestran
La Fig. 1: Una representación esquemática de la
transducción de señales en el caso de la diferenciación de células
CD4^{+} para dar una célula TH1 o respectivamente TH2 (modificada
de acuerdo con Ho I.C. y Glimcher L.H., Cell 2002; 109:
S109-S120).
La Fig. 2: La secuencia de nucleótidos del
dominio catalítico de la DNAzima 10-23 y la fijación
a un ARN diana mediante un apareamiento según
Watson-Crick (R = A o G; Y = U o C, N = A, G, U o
G). La flecha indica el sitio de disociación en el ARNm diana.
La Fig. 3: Una agrupación (pool) de moléculas de
ácidos ribonucleicos específicos según la etapa b), en particular
de las DNAzimas td 1 hasta td 70 contra T-bet y sus
secuencias de ácidos nucleicos (A = adenina, G = guanina, C =
citosina, T = timina).
La Fig. 4: Las secuencias de nucleótidos de
genes T-bet humanos en la alineación
- Secuencia 1:
- T-bet humano procedente del banco de datos Nº.: NM_013351.
- Secuencia 2:
- T-bet humano (secuenciado a partir de SK de pBluescript).
Las bases divergentes están provistas de un
fondo gris. Las localizaciones de cebadores para la clonación de
T-bet están subrayadas. Las localizaciones de
cebadores para la cuantificación relativa en el LightCycler están
contorneadas. La localización de las DNAzimas td54 y td69 está al
mismo tiempo provista de un fondo gris y subrayada, además la td70
está resaltada en letras escritas en negrita (A = adenina, G =
guanina, C = citosina, T= timina).
La Fig. 4A: La secuencia de nucleótidos 1 del
gen T-bet de la Figura 4, en ella están dibujados
como provistos de un fondo gris en cada caso los pares de
nucleótidos GT y AT, entre los cuales se encuentran unos sitios
adicionales de corte con DNAzimas.
La Fig. 5: Una electroforesis en gel muestra la
disociación de un ARNm diana (aquí un ARNm de T-bet)
con moléculas de ácidos ribonucleicos específicos según la etapa
b), aquí DNAzimas modificadas [(td54m (pista 3), td69m (pista 4) y
td70rn (pista 5)]. Las DNAzimas modificadas (0,25 \muM) se incuban
durante 30 min a 37ºC con un ARNm de T-bet (0,025
\muM) transcrito in vitro, en un volumen de 10 \mul con
la siguiente composición de reacción: 50 mM de Tris de pH 7,4, 150
mM de NaCl, 10 mM de MgCl_{2}. A continuación, los productos se
separan mediante una electroforesis en gel. La pista M contiene un
patrón de longitudes de 3.000 bases y 2.000 bases llevado a cabo
conjuntamente, la pista 2 contiene como testigo un ARNm sin la
adición de una DNAzima. La flecha A apunta hacia la banda con un
substrato (aquí un ARNm de T-bet). La flecha B
apunta hacía el producto de disociación de mayor tamaño. El segundo
producto de disociación es más pequeño y ya no se presenta en esta
reproducción.
La Fig. 6: Cualificación de las cantidades de
los ARNm de T-bet y de GAPDH en el LightCycler
(Ciclador luminoso), a partir de células tratadas con las DNAzimas
td54 (A), td69 (B) y td70 (C). Unas células Jurkat E6.1 se
transfectan dos veces con un intervalo de 24 h, o bien con las
DNAzimas td54 (A), td69 (B) y td70 (C) que son específicas para
T-bet o con una DNAzima sin sentido como testigo (no
representada). A continuación se purifica el ARN, se lleva a cabo
una transcripción inversa y el ADN obtenido se introduce en el
LightCycler. Como patrón interno sirve la GAPDH (curvas de trazos).
Se muestran en cada caso determinaciones cuádruples (en 4 veces) de
células tratadas con DNAzimas específicas para
T-bet o con la DNAzima sin sentido. Las curvas de
línea continua muestran la cantidad de T-bet en las
células tratadas con DNAzimas específicas para
T-bet, y las líneas de puntos muestran la cantidad
de T-bet en las células tratadas con una DNAzima sin
sentido.
Fig. 7: Diagrama de la cuantificación relativa
de un ARNm de T-bet en células Jurkat E6.1.
Unas células Jurkat E6.1 se transfectan dos
veces con las DNAzimas específicas para T-bet td54,
td69 y td70, y se aísla el ARN después de 48 h. Después de una
transcripción inversa, la cantidad de ARNm se determina mediante el
LightCycler. Como testigo sirve una DNAzima sin sentido. La
cuantificación relativa de los ARNm del T-bet y de
GAPDH se efectúa de acuerdo con las instrucciones [descritas en el
User Bulletin #2 [Boletín del usuario nº 2] (ABI Prism 7700
Sequence detection System User [Sistema de detección de secuencias]
Bulletin #2 (2001). Cuantificación relativa de la expresión de
genes.
Http://docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/04303859.pdf)]
En este caso la cantidad de ARNm de
T-bet procedente del experimento testigo con una
DNAzima sin sentido, se equipara a 100%.
La Figura 1 muestra en una representación
esquemática modificada según Ho I.C. y Glimcher L.H.-(Cell 2002;
109: S109-S120) las conexiones de la transducción de
señales en el caso de la diferenciación de células CD4^{+} para
dar una célula TH1 o respectivamente TH2. La estimulación a través
del receptor de células T mediante el correspondiente complejo de
péptido y MHC, induce la expansión clonal y la diferenciación
programada de linfocitos T CD4^{+} para dar células cooperantes T
[del inglés T Helper (TH)] TH1 o TH2. La diferenciación de estos
dos subtipos se efectúa basándose en sus perfiles de citocinas. Las
células TH1 producen interferón \gamma (INF\gamma),
interleucina 2 (IL-2) y el factor \beta de
necrosis de tumores, mientras que, por el contrario, las células
TH2 segregan IL-4, IL-5,
IL-9 e IL-13. Unas infecciones
bacterianas y víricas inducen una respuesta inmunitaria, que es
dominada por células TH1. Por el otro lado, las células TH2 regulan
la producción de IgE contra parásitos. En este caso existe un
equilibrio entre células TH1 y TH2. La destrucción de este
equilibrio provoca enfermedades, así, una respuesta excesiva de
células TH1 está asociada con enfermedades autoinmunitarias,
mientras que para las enfermedades alérgicas se presenta como
fundamento una respuesta aumentada de células TH2.
Es conocido que las citocinas de TH1 están
implicadas en la patogénesis de enfermedades autoinmunitarias tales
como p.ej. uveítis autoinmunitarias, encefalomielitis alérgica
experimental, diabetes mellitus del tipo 1 o la enfermedad de
Crohn, mientras que las citocinas de TH2 (IL A,
IL-5, IL-13 o respectivamente
IL-9) participan en la generación de enfermedades
inflamatorias crónicas de las vías respiratorias, tales como p.ej.
eosinofilia de las vias respiratorias, hipersecreción de mucosidad
e hiperreactividad de las vías respiratorias. El fundamento de
estas enfermedades son unas alteraciones patofisiológicas durante la
producción de citocinas características mediante células TH que son
específicas para antígenos. Así, unos ratones transgénicos, que
sobreexpresan constitutivamente en los epitelios de las vías
respiratorias las citocinas de TH2 IL-4,
IL-5, IL-13 o respectivamente
IL-9, muestran unas reacciones inflamatorias
alérgicas típicas. Unas subpoblaciones de células TH2 en los
pulmones y en las vías respiratorias provocan en células TH2, en un
modelo con animales, los síntomas característicos del asma
bronquial.
De modo sorprendente se encontró que para el
tratamiento específico para células y/o tejidos de inflamaciones
crónicas y/o de enfermedades autoinmunitarias, son apropiados de una
manera ideal unos factores de transcripción y unos factores de las
rutas de transducción de señales para la diferenciación y/o la
expresión de citocinas, que participan en la generación de las
reacciones inflamatorias crónicas y de enfermedades
autoinmunitarias, tales como p.ej. el factor de transcripción
T-bet, que es específico para células TH1, y el
factor de transcripción GATA-3, que es específico
para células TH2.
El factor de transcripción
T-bet, que es específico para células TH1, es
responsable sobre todo de la diferenciación de células T CD^{+}
naives (ingenuas) para dar células TH1. Su expresión es controlada a
través de las rutas de transducción de señales del receptor de
células T (TZR) y a través del complejo de receptor de
INF\gamma/STAT1. El T-bet transactiva al gen
endógeno de INF\gamma e induce la producción de INF\gamma.
Además de esto, él induce la regulación en sentido ascendente de la
expresión de proteínas de cadenas de IL-12R\beta2
y conduce a la remodelación con cromatina de alelos individuales de
INF\gamma. La función in vivo del T-bet es
confirmada en ratones Knock-Out (es decir
desactivados para expresión) (T-bet^{-/-}).
Aún cuando los ratones deficientes en T-bet
presentan un desarrollo normal de linfocitos, las células T
CD4^{+} procedentes de estos ratones no producen nada de
INF\gamma, ni sobre la estimulación con
anti-CD3/CD28 ni con PMA/ionomicina. Los ratones
deficientes en T-bet no muestran ninguna respuesta
inmunitaria contra una infección causada por L. major, y la
cantidad de citocinas de TH2 es aumentada. Se conoce la función de
un T-bet en células T mucosales en el caso de la
generación de enfermedades intestinales inflamatorias. Unas
investigaciones en un modelo con animales muestran un empeoramiento
de la colitis en ratones con SCID (acrónimo de Severe Combined
Immunodeficiency = inmunodeficiencia combinada grave)
reconstituidos después de una transducción retrovírica de
T-bet en células T CD4^{+}CD26L^{+}, a la
inversa la transferencia de células T deficientes en
T-bet no conduce a ninguna inducción de
colitis.
El factor de transcripción T-bet
induce específicamente el desarrollo de células TH1 y controla la
producción de INF\gamma en estas células. Mediante la inhibición
del T-bet, el equilibrio entre células TH1 y TH2 se
desplaza en favor de las células TH2.
Otros factores de transcripción, que desempeñan
un cierto cometido en la diferenciación para dar células TH1 o
respectivamente TH2 y que participan en la generación de las
reacciones inflamatorias crónicas y de las enfermedades
autoinmunitarias, presentan una expresión en una célula diana que se
diferencia en comparación con la expresión de una célula testigo, y
se emplean conforme al invento asimismo para el diseño de
específicas/os DNAzimas y/o siRNA para el empleo terapéutico en el
caso de enfermedades inflamatorias crónicas:
- \bullet
- STAT4, STAT5a und STAT1 (acrónimo de signal transducer and activator of transcription = transductor de señales y activador de la transcripción)
- \bullet
- c-Rel
- \bullet
- CREB2 (acrónimo de cAMP response element-binding protein 2 = proteína 2 que se fija a elementos de respuesta a cAMP)
- \bullet
- ATF-2, ATF-2
- \bullet
- Hlx
- \bullet
- IRF-1 (acrónimo de interferon regulatory factor-1 = factor 1 regulador de interferón)
- \bullet
- c-Maf
- \bullet
- NFAT (acrónimo de Nuclear factor of activated T cells = factor nuclear de células T activadas)
- \bullet
- NIP45 (acrónimo de NF-AT interacting protein 45 = proteína interactiva con NFAT 45)
- \bullet
- AP1 (acrónimo de Activator Protein 1 = proteína activadora 1)
- \bullet
- Mel-18
- \bullet
- SKAT-2 (acrónimo de SCAN box, KRAB domain associated with a Th2 phenotype = caja SCAN, dominio KRAB asociado con un fenotipo de Th2))
- \bullet
- CTLA-4 (acrónimo de Cytolytic T lymphocyte-associated antigen 4 = antígeno 4 asociado con linfocitos T citolíticos).
Otros factores de las rutas de transducción de
señales, que son responsables de la diferenciación y/o expresión de
citocinas, y que participan en la generación de las reacciones
inflamatorias crónicas y de las enfermedades autoinmunitarias,
presentan una expresión en una célula diana que se diferencia en
comparación con la expresión de una célula testigo, y se emplean
conforme al invento asimismo para el diseño de específicas/os
DNAzimas y/o siRNA para el empleo terapéutico en el caso de
enfermedades inflamatorias crónicas.
- \bullet
- Src kinase = cinasa de Src
- \bullet
- Tec kinase = cinasa de Tec
- Rlk (Txk en seres humanos)
- Itk
- Tec
- \bullet
- RIBP (acrónimo de Rlk/Itk-binding protein = proteína que se fija a Rlk/Itk)
- \bullet
- PLC\gamma (acrónimo de phospholipase C\gamma1)
- \bullet
- MAP (acrónimo de Mitogen-activated protein kinase = cinasa de la proteína activada por mitógenos)
- ERK
- JNK
- P38
- \bullet
- MKK (acrónimo de MAP kinase kinase = cinasa de cinasa de MAP)
- MKK1
- MKK2
- MKK3
- MKK4
- MKK6
- MKK7
- \bullet
- Rac2
- \bullet
- GADD45 (acrónimo de Growth arrest and DNA damage gene 45 = gen 45 de detención del crecimiento y de daño para el ADN)
- GADD45\beta
- GADD45\gamma
- \bullet
- SOCS (acrónimo de Suppressors of cytokine signalling = supresores de la señalización de citocinas)
- \bullet
- CIS (acrónimo de Cytokine-induced SH2 protein = proteína SH2 inducida por citocinas)
- SOCS1
- SOCS2
- SOCS3
- \bullet
- JAK (acrónimo de Janus kinase cinasa de Janus)
- JAK1
- JAK3
- \bullet
- NIP45 (acrónimo de NF-AT interacting protein = proteína 45 que interactúa con el NFAT)
Conforme al invento se pone a disposición un
medicamento que es específico para células y/o tejidos y/o fases de
enfermedad, el cual es apropiado para el tratamiento de enfermedades
crónicas.
El medicamento interviene preferentemente en los
puntos de intervención de la cascada compleja de las regulaciones
erróneas inmunológicas y biológicas celulares que se presentan como
fundamento de las reacciones inflamatorias crónicas y de las
enfermedades autoinmunitarias. De manera especialmente preferida,
éstos son unos puntos de intervención de la regulación de la
diferenciación de los factores de transcripción participantes, tales
como por ejemplo el factor de transcripción T-bet,
que es específico para células TH1. El efecto terapéutico
conseguido consiste en una desactivación funcional de moléculas de
ARNm mediante específicas/os DNAzimas y/o siRNA. Esta estrategia
ofrece una serie de ventajas frente a enfoques convencionales, pero
también terapéuticos génicos: unas elevadísimas especificidades y
selectividades, una alta estabilidad de las moléculas y una
antigenicidad despreciable. Se proporcionan las premisas óptimas
para una terapia a largo plazo ajustada a medida en el caso de
pacientes con enfermedades inflamatorias crónicas.
Conforme al invento se pone a disposición un
procedimiento para la producción de un medicamento específico para
células y/o tejidos y/o fases de enfermedad, que comprende las
siguientes etapas:
- a)
- La identificación de moléculas de ácidos ribonucleicos, cuya expresión en una célula diana se diferencia en comparación con la expresión en una célula testigo
- b)
- El diseño de moléculas de ácidos ribonucleicos específicos, que se fijan a moléculas de ácidos ribonucleicos procedentes de la etapa a) y las desactivan funcionalmente
- c)
- La incorporación de las moléculas de ácidos ribonucleicos específicos, procedentes de la etapa b), en células dianas
- d)
- La formulación de las moléculas de ácidos ribonucleicos específicos procedentes de la etapa b) y/o de una célula diana procedente de la etapa c), en un medicamento.
El concepto de "específico para células y/o
tejidos y/o fases de enfermedad" significa, en el sentido del
presente invento, el hecho de que el medicamento, producido mediante
el procedimiento conforme al invento, es eficaz en lo esencial
solamente en el caso de un determinado tipo de células (células
dianas) y/o en determinados tejidos u órganos y/o en determinadas
fases de la enfermedad, y posee una influencia despreciable sobre
otras células (células testigos), otros tejidos u otros órganos. De
manera preferida, el medicamento es eficaz en el caso de por lo
menos 2/3 de las células dianas. De manera más grandemente preferida
es eficaz en por lo menos un 80% y de una manera sumamente
preferida en por lo menos un 98% de las células dianas. Además, se
prefiere que el medicamento sea eficaz en el caso de a lo sumo 10%
de las células testigos, de manera más grandemente preferida en el
caso de a lo sumo 5% y de una manera sumamente preferida en el caso
de < 1% de las células testigos.
El concepto de "identificación de moléculas de
ácidos ribonucleicos, cuya expresión en una célula diana se
diferencia en comparación con la expresión en una célula testigo"
comprende en el presente invento los siguientes puntos:
- i)
- Las células dianas son células presentes en tejidos y órganos que, tal como es conocido, conducen a la generación de una enfermedad, contribuyen a ella o refuerzan a ésta, que mantienen procesos que conservan la enfermedad, contribuyen a ellos o refuerzan a éstos, o respectivamente que conducen a secuelas tardías de una enfermedad, contribuyen a ellas o las refuerzan. Entre éstas se cuentan por ejemplo unas células, que tienen determinados factores de transcripción, segregan hormonas, citocinas y factores de crecimiento específicas/os, o unas células con receptores superficiales típicos.
- ii)
- Las células dianas pueden ser aisladas por ejemplo mediante unas tecnologías, que se basan en la fijación de anticuerpos específicos. Aquí se utilizan unas perlas magnéticas (en inglés magnetic beads) obtenibles de la entidad Miltenyi (Macs-System), Dynal (DynaBeads) o BD-Bioscience (iMAG). Alternativamente, esto se efectúa a través de una purificación de las células mediante anticuerpos marcados por fluorescencia en dispositivos clasificadores de células, por ejemplo de la entidad Cytomation (MOFLO) o BD-Bioscience (FACSVantage). La pureza de las células dianas está situada de manera preferida en por lo menos un 80%, de manera más grandemente preferida en por lo menos un 95% y de manera sumamente preferida en por lo menos un 99%.
- iii)
- Unos procedimientos para el aislamientos de los ARN se describen p.ej. en las citas de Sambrook y Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual [Clonación molecular, un manual de laboratorio], 3ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory (2001), Nueva York, y de Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology [Protocolos actuales en biología molecular], John Wiley & Sons (1998), Nueva York. Además es posible para un experto con conocimientos medios utilizar para el aislamiento de los ARN unos estuches disponibles comercialmente (de la tecnología de la sílice) p.ej. el RNeasy Kit de la entidad Qiagen. Además se prefiere purificar directamente un ARNm procedente de las células diana mediante la utilización de estuches comerciales, por ejemplo de las entidades Qiagen (Oligotex mRNA Kit), Promega (PolyATract mRNA Isolation System = sistema de aislamiento de ARNm poliAtract) o Miltenyi (mRNAdirect).
- iv)
- La identificación de los ARNm's que son distintos diferencialmente, es decir los ARNm's cuya expresión en las células diana ha aumentado en comparación con la célula testigo, se efectúa por ejemplo con chips génicos adquiridos comercialmente (p.ej. MWG, de CLONTECH)] o con un procedimiento de hibridación en filtros (p.ej. de Unigene) de acuerdo con los datos de los fabricantes. Alternativamente se producen ARNm's diferenciales mediante una hibridación substractiva de los ADNc (ADN cromosomales) que han resultado previamente a partir de los ARNm mediante una reacción con RT (acrónimo de Reverse Transcriptase = transcriptasa inversa). Entre estos procedimientos conocidos para un experto en la especialidad se cuentan por ejemplo el método SSH (de la entidad Clontech) o el método RDA. A una forma de utilización asimismo preferida pertenece la combinación de una tecnología de chips y de una hibridación substractiva. La identificación de los genes expresados diferencialmente se efectúa mediando empleo de la tecnología de los chips con ayuda de programas obtenibles comercialmente, p.ej. con el programa Vector Xpression de la entidad InforMax. En el caso del empleo de una hibridación substractiva, después del aislamiento de los genes expresados diferencialmente con ayuda de procedimientos habituales, que son usuales para un experto en la especialidad, tales como clonación y subsiguiente secuenciación (véanse p.ej. las citas de Sambrook y Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory (2001), Nueva York, y de Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1998), Nueva York), se efectúa una compensación de secuencias en un banco de datos tal como p.ej. el banco de genes (www.ncbi.nlm.nih.gov).
- La expresión en la célula diana se diferencia en comparación con la expresión en una célula testigo. En una forma de realización del procedimiento conforme al invento, la expresión en la célula diana ha aumentado en comparación con la expresión en una célula testigo, de manera preferida por lo menos en un factor de 1,5. En una forma de realización especialmente preferida, la expresión en la célula diana en comparación con la expresión en una célula testigo ha aumentado en por lo menos un factor de 5, y en una forma de realización preferida en la mayor parte de los casos, la expresión es detectable solamente en la célula diana, pero no en la célula testigo.
El concepto de "diseño de moléculas de ácidos
ribonucleicos, que se fijan a moléculas de ácidos ribonucleicos
procedentes de la etapa a) y las desactivan funcionalmente"
comprende, en el sentido del presente invento, la utilización de
enzimas de ADN (DNAzimas) que desactivan a los ARN, y/o de ARN
interferidores pequeños (siRNA de small interfering RNA), que
desactivan funcionalmente a moléculas de ácidos ribonucleicos.
El concepto de DNAzimas comprende en este caso,
conforme al invento, unas moléculas de ADN, que reconocen
específicamente y disocian a la secuencia diana del ácido nucleico,
tanto de un ADN como también de un ARN.
Un modelo general de DNAzimas lo constituye el
modelo "10-23". Las DNAzimas del modelo
10-23 - también designadas como "DNAzimas
10-23" - poseen un dominio 25 catalítico de 15
ácidos desoxirribonucleicos, que es flanqueado por dos dominios de
fijación a substratos. La longitud de los dominios de fijación a
substratos es variable, ellos son o bien iguales o de diferente
longitud. En una forma de realización preferida, la longitud de los
dominios de fijación a substratos está situada entre 6 y 14
nucleótidos.
En una forma de realización especialmente
preferida, los dominios de fijación a substratos son totalmente
complementarios con respecto a la región, que flanquea al sitio de
disociación. Con el fin de fijar a los ARN dianas y disociarlos, la
DNAzima, sin embargo, no debe ser indispensablemente complementaria
por completo. Unas investigaciones in vitro muestran que las
DNAzimas del tipo 10-23 disocian al ARNm diana en
secuencias con la sucesión de purina - pirimidina.
Con el fin de utilizar las DNAzimas en el
tratamiento de enfermedades, se prefiere que las DNAzimas sean
estabilizadas lo mejor que sea posible contra la degradación en el
cuerpo (en la sangre, en el medio intracelular, etc). Una forma de
realización preferida es la introducción de una inversión
3'-3' junto a uno o varios extremos de la DNAzima.
El concepto de la inversión 3'-3' designa a un
enlace covalente de fosfato entre los carbonos 3' del nucleótido
terminal y del nucleótido colindante. Este tipo de enlace está en
contraposición con el enlace normal de fosfato entre los carbonos
3' y 5' de nucleótidos que se suceden unos a otros. De modo
correspondiente, se prefiere que el nucleótido situado junto al
extremo 3' sea inverso con respecto del dominio de fijación al
substrato que colinda con el extremo 3' del dominio catalítico.
Adicionalmente a las inversiones, las DNAzimas pueden contener
nucleótidos o compuestos de nucleótidos modificados. Los nucleótidos
modificados contienen p.ej. compuestos de
N3'-P5'-fosforamidato, sustituciones
con 2'-O-metilo y compuestos de
péptidos y ácidos nucleicos. Sun preparación es habitual para un
experto en la especialidad.
Aunque los sitios potenciales de corte con
DNAzimas se presentan ubicuamente, éstos con frecuencia están
bloqueados por medio de la estructura secundaria de los ARN y por
consiguiente son inaccesibles para la DNAzimas. Por lo tanto, a
partir de una agrupación (pool) de DNAzimas se seleccionan las que
son libremente accesibles a sus sitios de corte. Estas DNAzimas
seleccionadas son activas, disocian al ARNm diana y lo desactivan
por consiguiente funcionalmente. La eficiencia de la disociación de
los ARNm mediante las DNAzimas individuales es mostrada o bien
mediante ensayo individual de cada una de las DNAzimas o mediante
ensayo acoplado de varias DNAzimas en "ensayos Multiplex"
(descritos p.ej. en la cita de Cairns y colaboradores, 1999).
El concepto de siRNA comprende unas moléculas de
ARN bicatenarias con una longitud de 21-23 bases,
que conducen a una degradación específica de los ARNm's dianas
complementarios tanto in vitro como también in vivo.
Es conocido para un experto en la especialidad con ayuda de la
bibliografía (p.ej.
http://www.mpibpc.gwdg.de/abteilungen/
100/105/index.html), producir moléculas de siRNA, partiendo de la secuencia del ARNm diana.
100/105/index.html), producir moléculas de siRNA, partiendo de la secuencia del ARNm diana.
La probabilidad de que entre tres moléculas de
siRNA seleccionadas se encuentre por lo menos una que sea muy
activa (inhibición del ARN diana en por lo menos un 80%) se indica
en la bibliografía con un valor de por lo menos 70%. Si a partir de
una agrupación de moléculas de siRNA se seleccionan las que conducen
a una degeneración específica del ARNm diana complementario tanto
in vitro como también in vivo.
El concepto de "incorporación de las moléculas
de ácidos ribonucleicos específicos procedentes de la etapa b) en
células dianas" comprende en el sentido del presente invento la
transfección de vectores, en particular de plásmidos, cósmidos,
virus o bacteriófagos, que contienen las moléculas de ácidos
ribonucleicos específicas conformes al invento, que más arriba se
han descrito, en las células diana. De manera preferida, los
vectores son apropiados para la transformación de células animales
y humanas y permiten la integración de las moléculas de ácidos
ribonucleicos conformes al invento. Unos procedimientos para la
transfección, tales como p.ej. la lipofección mediante el
DMRIE-C de la entidad Invitrogen, son conocidos para
un experto en la especialidad a partir de la bibliografía.
Fundamentalmente son apropiados para ello también unos vectores
liposomales. Las moléculas dianas son factores de transcripción,
células que segregan hormonas, citocinas y factores del
crecimiento, pero también células que llevan sobre la superficie los
receptores expresados.
Como células testigos en el sentido del invento
se hace uso de células sanas del tejido diana, células de igual
tipo procedentes de otros compartimientos del mismo paciente o
también procedentes de individuos sanos.
La cultivación de la célula diana se efectúa en
unos medios nutritivos, que están adaptados de manera
correspondiente a las necesidades de la célula diana según el valor
del pH, la temperatura, la concentración de sales, antibióticos,
vitaminas, elementos trazas y aireación.
El concepto de paciente se refiere de igual
manera a seres humanos y animales vertebrados. Por consiguiente, el
medicamento se puede utilizar en las medicinas humana y
veterinaria.
El concepto de "formulación de las moléculas
de ácidos ribonucleicos específicos procedentes de la etapa b) o de
una célula diana procedente de la etapa c) en un medicamento"
comprende unas composiciones que son farmacéuticamente aceptables,
las cuales contienen modificaciones y profármacos (en inglés
"prodrugs"), siempre y cuando que ellas no provoquen, después
de una valoración médica confiable, ninguna toxicidad excesiva, ni
irritaciones ni tampoco reacciones alérgicas en un paciente. El
término "profármaco" se refiere a compuestos que son
transformados para el mejoramiento de la ingestión, tal como por
ejemplo mediante hidrólisis en la sangre.
De manera preferida, la formulación hace posible
que las moléculas de ácidos ribonucleicos específicos sean
administradas a los pacientes en forma de una composición
farmacéuticamente aceptable, o bien por vía oral, rectal,
parenteral, intravenosa, intramuscular o subcutánea, o
intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, intratecal,
intravascular, local (polvos para espolvorear, pomadas o gotas) o en
una forma para atomización (en inglés "spray").
Las formas de dosificación para la
administración local del medicamento de este invento incluyen
pomadas, polvos para espolvorear, formulaciones de atomización o
agentes de inhalación. El componente activo se mezcla en
condiciones estériles con una sustancia de vehículo fisiológicamente
aceptable y con posibles agentes conservantes, tampones o agentes
de expansión, según sean las necesidades.
El tipo de la dosificación es determinado por el
médico que realiza el tratamiento, de un modo correspondiente a los
factores clínicos. Es conocido para un experto en la especialidad
que el tipo de la dosificación es dependiente de diferentes
factores, tales como p.ej. el tamaño corporal, el peso, la
superficie corporal, la edad, el sexo, o la salud general del
paciente, pero también del agente que se ha de administrar
especialmente, de la duración y del tipo de la administración y de
otros medicamentos que se administren posiblemente de modo
paralelo.
El medicamento producido con el procedimiento
conforme al invento, tiene una alta especificidad para pacientes,
enfermedades, estadios o respectivamente fases. Él produce una
intervención específica para ciertas células y es específico para
ciertos compartimientos y órganos. No resulta ninguna reacción, o
resultan solo muy pequeñas reacciones, del sistema inmunitario
contra el medicamento, y el perfil de efectos colaterales está en
una relación aceptable con el grado de gravedad, el pronóstico y la
evolución de la enfermedad.
El medicamento se puede administrar para la
terapia contra todos los conjuntos de enfermedades que van
acompañadas por inflamaciones crónicas, tales como p.ej.
enfermedades autoinmunitarias, enfermedades del círculo de formas
reumáticas (manifestaciones, entre otros sitios, en la piel, los
pulmones, los riñones, el sistema vascular, el sistema nervioso, el
tejido conjuntivo, el aparato locomotor y el sistema endocrino),
reacciones alérgicas de tipo inmediato y asma, enfermedades
pulmonares obstructivas crónicas (COPD), arteriosclerosis, psoriasis
y un eccema por contacto, así como contra reacciones crónicas de
rechazo después del trasplante de un órgano y de una médula
ósea.
\vskip1.000000\baselineskip
i) Como células dianas se utilizan las células
CD4^{+} naives (ingenuas) que son responsables de la generación
de reacciones inflamatorias crónicas.
ii) Las células dianas CD4^{+} se aíslan sobre
perlas magnéticas (de las entidades Miltenyi (sistema
Macs-System), Dynal (DynaBeads) o BDBioscience
(iMAG), alternativamente mediante anticuerpos marcados por
fluorescencia en dispositivos clasificadores de células, por
ejemplo de las entidades Cytomation (MOFLO) o
BD-Bioscience (FACS-Vantage).
iii) El aislamiento de los ARN se efectúa de
acuerdo con un método clásico, véanse Sambrook y Russell, Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbor
Laboratory (2001), Nueva York y Ausubel y colaboradores, Current
Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1998), Nueva
York.
Alternativamente, se utiliza un estuche RNeasy
Kit de la entidad Qiagen, o se efectúa un aislamiento directo del
ARNm a partir de células diana CD4^{+} con el estuche de ARNm
Oligotex mRNA Kit de las entidades Qia-20 gen, de
acuerdo con los datos del fabricante.
iv) La identificación de los ARNm's, que son
distintos diferencialmente, es decir los ARNm's cuya expresión en
la célula diana ha aumentado en comparación con la célula testigo,
se efectúa mediante chips génicos (p.ej. MWG, CLONTECH), y la
identificación de los genes expresados diferencialmente se efectúa
mediante un programa Vector Xpression de la entidad
Infor-Max.
Los procedimientos de hibridación en filtros
(p.ej. de Unigene) se efectúan de acuerdo con los datos del
fabricante. Al aislamiento de los genes expresados diferencialmente
le siguen una clonación, una secuenciación (de acuerdo con
prescripciones clásicas, véase p.ej. Sambrook y Russell, Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbor
Laboratory (2001), y la compensación de secuencias en el banco de
datos de genes (www.ncbi.nlm.nih.gov).
La expresión de T-bet en la
célula diana (célula Th1) se diferencia en comparación con la
expresión en una célula testigo (por ejemplo una célula Th0).
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 3 muestra la agrupación de las td1 -
td78, conforme al invento, de DNAzimas específicas contra un ARNm
de T-bet. La DNAzimas tienen una longitud total de
33 nucleótidos, correspondiendo el dominio catalítico central a
base de 15 nucleótidos (en letras minúsculas) al dominio catalítico
de la conocida DNAzima 10-23 (Figura 2). Este
dominio catalítico es flanqueado por dos dominios de fijación de
fijación al substrato, derecho e izquierdo, que se componen en cada
caso de 9 nucleótidos (en letras mayúsculas). La secuencia de
nucleótidos de los dominios de fijación al substrato, derecho e
izquierdo, es diferente y varía en los casos de las DNAzimas td1
hasta td78, de manera tal que se efectúa una fijación diversamente
específica mediante un apareamiento según
Watson-Crick al ARNm de T-bet.
La Figura 2 muestra el modelo general para la
fijación de la DNAzima 10-23 a un ARN diana
arbitrario marcado en N, apuntando la flecha hacia el sitio de
disociación en el ARNm diana.
Puesto que a partir de la bibliografía es
conocido que las DNAzimas disocian más efectivamente al ARNm diana
con enlaces de purina - uracilo que a los enlaces de purina -
citosina, se construyen preferiblemente 5 DNAzimas que disocian
enlaces de purina - uracilo.
El modelo mostrado en la Figura 2 puede ser
transferido en su modo de funcionamiento a la fijación de las
DNAzimas td1 hasta td78 a un ARNm de T-bet.
Las DNAzimas td1 hasta td78 se emplean en estado
sin modificar para ensayos in vitro, para ensayos en un
cultivo celular provisto de modificaciones (adquirido
comercialmente de la entidad Eurogentec).
Como modificaciones para la estabilización y la
protección se emplean:
- 1)
- Una timidina inversa estabilizadora situada en el extremo 3'
- 2)
- una marcación con FAM en el extremo 5' para la valoración de la eficiencia de transcripción de las células mediante un análisis por FACS.
Para la representación de las propiedades de
disociación de las DNAzimas y la desactivación funcional de los
ARNm diana de los ARNm de T-bet se efectúa una
transcripción in vitro de los ARNm de T-bet
procedentes de EDTA - sangre entera humana mediante un
mini-estuche
QlAamp-RNA-Blood-Mini-Kit
(de Qiagen, Alemania) de acuerdo con los datos del fabricante.
La Figura 4 muestra la secuencia de nucleótidos
de un T-bet humano, como se puede deducir de los
registros en los bancos de datos
[PubMed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi? db =
nucleótidos)] Nº: NM_013351, secuencia 1.
La transcripción inversa se efectúa
con el cebador de avance
CGGCCCGCTGGA-GAGGAAGC y
con el cebador inverso CACACACCCACACACAACC de
acuerdo con una prescripción patrón (ThermoScript de Invitrogen),
siendo amplificado un producto de PCR [de Polymerase Chain Reaction
= reacción en cadena de la polimerasa] con una longitud de 2.450
nucleótidos. Este producto de PCR es clonado mediante procedimientos
clásicos en el plásmido pBluescript-SK (de
Stratagene) y es secuenciado para la comprobación.
La Figura 4 muestra una comparación de la
secuencia de T-bet Nº: NM_013351 (Secuencia 1) y de
la secuencia secuenciada (Secuencia 2). En este caso se muestra que
ambas secuencias no son totalmente idénticas, sino que se han
intercambiado bases individuales. La Secuencia 2 de ácido nucleico
del T-bet procedente de la Figura 4 forma en este
invento el fundamento para la construcción de DNAzimas contra un
ARNm de T-bet.
La Figura 4A muestra la secuencia de nucleótidos
de la Secuencia 1 del gen de T-bet humano procedente
de la Figura 4 y allí están dibujados como provistos de fondo gris
en cada caso dos nucleótidos GT o respectivamente AT, entre los
cuales están situados otros sitios potenciales de corte con
DNAzimas.
La producción de un ARNm de
T-bet se efectúa después de una linealización del
plásmido pBluescript-SK que contiene
T-bet, por disociación con la enzima de restricción
Xba I (de Fermentas) y mediante una transcripción in vitro
de acuerdo con los datos del fabricante (Ambion). El ARNm de
T-bet se presenta con una longitud de 2.550
nucleótidos en total.
Los experimentos de disociación in vitro
de los ARNm de T-bet con las DNAzimas (td1 hasta
td78) se llevan a cabo en un volumen de 10 \mul con la siguiente
composición de reacción: 50 mM de Tris de pH 7,4, 150 mM de NaCl,
10 mM de MgCl_{2}, 0,25 \muM de DNAzimas y 0,025 \muM de ARNm
de GATA-3 transcritos in vitro (en una
relación del substrato a la DNAzima de 1:10). Las tandas de reacción
se incuban a 37ºC para las células indicadas en cada caso. Por
medio de la adición de un tampón de carga de muestras de ARN
(RNA-Sample-Loading-Buffer)
(de Sigma) que contiene formamida y EDTA, se detiene la reacción.
Las muestras desnaturalizadas son separadas en geles de
TAE-agarosa al 1,3% y son analizadas en un aparato
transiluminador con UV.
La Figura 5 muestra como resultado de la
electroforesis en gel la disociación de los ARNm diana de
T-bet con DNAzimas modificadas
[td54-M (pista 3), td69-M (pista 4),
td70-M (pista 5)]. La pista 2 contiene como testigo
un ARNm diana de T-bet sin la adición de una
ADNzima. Un patrón de longitudes llevado a cabo conjuntamente
(pista M) muestra unos tamaños de las bandas de 2.000 pb (pares de
bases) y 3.000 pb (pares de bases). Las flechas apuntan hacia A, la
banda con el substrato (aquí un ARNm de T-bet) y
hacia B, uno de los dos productos de disociación (el otro producto
de disociación no puede verse en esta Figura).
La comparación entre la totalidad de las 78
DNAzimas muestra que son especialmente activas las td54, td69 y
td70 y que las modificaciones no disminuyen la efectividad de las
DNAzimas.
La siguiente Tabla muestra la clasificación en 4
grupos de las DNAzimas td 1 hasta td 78 frente a 3 ARNm de
T-bet. Esta clasificación en grupos se efectúa
basándose en ensayos de actividad in vitro de las DNAzimas
contra los ARNm de T-bet, que se llevaron a cabo.
Grupo 1: alta actividad de disociación, Grupo 2: actividad
intermedia de disociación, Grupo 3: débil actividad de disociación y
Grupo 4: ninguna actividad medible de disociación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las DNAzimas td54, td69 y td70 son utilizadas en
células dianas con y sin las modificaciones descritas.
Para esto, unas células Jurkat E6.1 (células de
leucemia celular T aguda humana) se cultivan en un medio RPMI con
100 U/ml de penicilina, 0,1 mg/ml de estreptomicina y 10% de FKS a
37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5% humedecida. Las
transfecciones se llevan a cabo en placas de 6 pocillos. Para esto,
2x10^{6} células Jurkat E6.1 se transfieren a un medio de cultivo
de células Opti-MEM-I (de
Invitrogen) y se transfectan mediante DMRIE-C (de
Invitrogen) con las DNAzimas modificadas (0,3 \muM) (de acuerdo
con los datos del fabricante, la entidad Invitrogen). Después de
una incubación durante 10 horas en un armario de fertilización en
las condiciones anteriores, se añade a esto un medio RPMI (con las
adiciones arriba indicadas) y se prosigue la incubación durante 14
horas más. Las células se lavan con un medio
Opti-MEM y a continuación se transfectan de nuevo
de acuerdo con el protocolo arriba descrito. Después de cada
transfección, la eficiencia de transfección es valorada mediante un
análisis FACS (de citometría de flujo).
Después de la transfección de células Jurkat
E6.1, se determina cuantitativamente la cantidad de ARNm de
T-bet con relación a una expresión de ARNm de GAPDH
mediante una PCR en tiempo real (en el LightCycler, de Roche) con
el fin de obtener informaciones acerca de la efectividad in
vitro de las DNAzimas.
Para los análisis en el LightCycler, el ARN
procedente de las células Jurkat E6.1 se purifica mediante un
estuche RNeasy Mini Kit (de Qiagen, Alemania) y seguidamente se
normaliza fotométricamente. Después de una transcripción inversa
con SuperScript II (de Gibco) de acuerdo con los datos del
fabricante, sigue el análisis cuantitativo de los ARNm de
T-bet y de GAPDH en el LightCycler. El volumen total
para la PCR es de 20 \mul, allí están contenidos 1 \mul de un
ADN, en cada caso 1 \mul (0,5 \muM) de cebadores del mismo
sentido y antisentido, así como 10 \mul de una mezcla QuantiTect
SYBR Green PCR Master Mix (de Qiagen, Alemania).
\vskip1.000000\baselineskip
Los cebadores de PCR utilizados para
T-bet son:
del mismo sentido
5'-CCCACCATGTCCTACTACCG-3'
antisentido
5'-GCAATCTCAGTCCACACCAA-3'.
\vskip1.000000\baselineskip
Los cebadores de PCR para GAPDH son:
del mismo sentido
5'-TCTTCTTTTGCGTCGCCAG-3'
y antisentido
5'-AGCCCCAGCCTTCTCCA-3'.
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones de PCR son: desnaturalización
(15 min a 95ºC), amplificación (15 s a 95ºC, 25 s a 59ºC, 25 s a
72ºC de 50 ciclos) y luego una extensión final (del inglés Final
Extention) 2 min a 72ºC. La subsiguiente curva de fusión es
generada de la siguiente manera: 0 s a 95ºC, 15 s a 60ºC y luego la
temperatura se aumenta en escalones de 0,2ºC hasta llegar a 97ºC,
al mismo tiempo se mide de una manera continua la fluorescencia. La
curva de fusión sirve para el testigo interno, puesto que todos los
productos de PCR tienen una temperatura específica de
fusión.
fusión.
El verde SYBR Green es un colorante fluorescente
(contenido en la QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix), que se fija
a un ADN bicatenario. Cuando durante la extensión se ha duplicado el
ADN, el SYBR Green se fija a él y genera una señal de fluorescencia
dependiente de la fijación, que es detectada por el LightCycler al
final de cada extensión. Cuanto más alta sea la cantidad de material
de partida, tanto más tempranamente es detectada la elevación
significativa de la fluorescencia. El Software del LightCycler
representa gráficamente las intensidades de fluorescencia reunidas
contra los ciclos.
En la Fig. 6 se representan unas curvas de
amplificación en LightCycler de los ARNm de T-bet y
de GAPDH después del tratamiento de células Jurkat E6.1 con las
DNAzimas td54m, td69m y td70m, en comparación con las tratadas con
una DNAzima sin sentido.
El respectivo "punto de cruce" (Ct),
definido como el ciclo de PCR, en el cual la fluorescencia se
diferencia por primera vez significativamente con respecto de la
fluorescencia de fondo, es determinado manualmente con el método de
puntos de ajuste Fit-Point del software del
LightCycler. La cuantificación relativa de los ARNm de
T-bet y de GAPDH en células tratadas con DNAzimas,
en comparación con células tratadas con una DNAzima sin sentido, es
llevada a cabo de acuerdo con las instrucciones descritas en el
boletín del usuario #2 (ABI Prism 7700 Sequence detection System
User Bulletin #2 (2001) Relative quantification of gene expression
http://docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/
04303859.pdQf). En este caso la cantidad de ARNm de
T-bet procedente del ensayo testigo se equipara a
100%. Los datos de la cuantificación relativa se representan
gráficamente en la Fig. 7.
En comparación con el tratamiento con una
DNAzima sin sentido se muestra que la DNAzima td69m conduce a una
supresión de 81,3% y la DNAzima td70m conduce a una supresión de
81,0%, al contrario de lo cual la DNAzima td54m no tiene ningún
efecto supresor sobre un ARNm de T-bet.
Esto significa que la DNAzima td54m no es activa
in vivo, al contrario de lo cual las DNAzimas td69m y td70m
también desactivan en el medio celular a los ARNm de
T-bet. La reducción específica de los ARnm de
T-bet in vivo mediante las DNAzimas td69m y
td70m constituye por consiguiente una herramienta terapéutica
efectiva para el tratamiento de enfermedades inflamatorias
crónicas.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis de diferentes DNAzimas con un
dominio de fijación al substrato que es específico para
T-bet, muestra que las DNAzimas td69 y td70 inhiben
específicamente in vivo la expresión de T-bet
y son apropiadas como ácidos ribonucleicos específicos para la
producción de un medicamento que es específico para células y/o
tejidos y/o fases de enfermedad.
Para esto, la td69 (GGCAATGAAggctagctacaacga
TGGGTTTCT) o la td70
(TCACGGCAAggctagctacaacga-GAACTGGGT) o células
transfectadas con td69m o respectivamente td70m, son provistas, en
una composición farmacéutica, de un soporte o vehículo
farmacéuticamente aceptable, por ejemplo liposomas o polímeros
biodegradables.
Alternativamente a las DNAzimas, para la
inhibición específica de la expresión de T-bet y
para la producción de un medicamento específico para células y/o
tejidos y/o fases de enfermedad, se propone el empleo de un
siRNA.
\newpage
Preferiblemente, se trata de un siRNA para la
inhibición de T-bet humano. La producción del siRNA
es conocida para un experto en la especialidad y se describe en la
bibliografía. Un ejemplo de secuencias de siRNA:
Es observable para un experto en la
especialidad, que con el conocimiento del presente invento se pueden
producir también DNAzimas o respectivamente siRNAs ligeramente
específicas/os como medicamentos en los casos de enfermedades
inflamatorias crónicas y de enfermedades autoinmunitarias, que están
dirigidas contra otros factores de transcripción, que desempeñan un
cierto cometido en el caso de la diferenciación para dar células TH1
o respectivamente TH2, por ejemplo STAT4, STAT5a, STAT1,
c-Rel, CREB2, ATF-2,
ATF-2, Hlx, IRF-1,
c-Maf, NFAT, NIP45, AP1, Mel-18,
SKAT-2, CTLA-4, o que están
dirigidos contra otros factores de las rutas de transducción de
señales para la diferenciación y/o expresión de citocinas, por
ejemplo cinasa de Src, cinasa de Tec, Rlk (Txk en un ser humano),
Itk, Tec, RIBP, PLC\gamma, cinasa de MAP, ERK, JNK, P38, MKK,
MKK1, MKK2, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, Rac2, GADD45, GADD45\beta,
GADD45y, SOCS, CIS, SOCS1, SOCS2, SOCS3, JAK, JAK1, JAK3, NIP45.
Estas proteínas presentan una expresión en una
célula diana que ha aumentado en comparación con la expresión de
una célula testigo.
<110> Philipps-Universität
(Universidad Phillips) Marburg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para la producción de
un medicamento específico para células y/o tejidos y/o fases de
enfermedad
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/DE2004/002197
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2004-10-01
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> DE 10346487.5
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-10-02
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 80
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Versión 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td1 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td2 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 33
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td3 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td4 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td5 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td6 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td7 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td8 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td9 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td10 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td11 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td12 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td13 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td14 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td15 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td16 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td17 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td18 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td19 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td20 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td21 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td22 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td23 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td24 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td25 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td26 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td27 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td28 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td29 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td30 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td31 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td32 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td33 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td34 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td35 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td36 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td37 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td38 DNAzyme against,
T-bet mRNA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td39 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td40 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td41 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td42 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td43 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td44 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td45 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td46 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td47 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td48 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td49 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td50 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td51 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td52 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td53 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td54 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td55 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td56 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td57 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td58 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td59 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td60 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td61 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td62 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td63 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td64 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td65 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
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<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td66 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td67 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td68 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td69 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td70 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td71 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td72 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td73 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td74 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td75 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td76 contra ARNm de
T-bet
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<222> (1)..(33)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
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\hskip1cm
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<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td77 contra ARNm de
T-bet
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
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<400> 77
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\hskip1cm
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<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DNAzima td78 contra ARNm de
T-bet
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<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 78
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\hskip1cm
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<210> 79
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<211> 2588
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> td54 sitio de fijación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (952)..(970)
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> td69 sitio de fijación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1096)..(1114)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> td70 sitio de fijación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1100)..(1118)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
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<210> 80
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<211> 2450
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mutación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (134)..(134)
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mutación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (310)..(310)
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<220>
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<221> td54 sitio de fijación
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<222> (952)..(970)
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<220>
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<222> (1096)..(1114)
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<220>
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<221> mutación
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<222> (1399)..(1399)
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<220>
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<221> mutación
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<222> (1556)..(1556)
\newpage
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<400> 80
Claims (9)
1. DNAzimas, caracterizadas porque ellas
se componen de
- un dominio catalítico con la secuencia de
nucleótidos GGCTAGCTACAACGA o con una secuencia modificada que
tiene un efecto biológico comparable, que corta al ARNm de
T-bet en cada uno de los sitios de enlace de purina
- pirimidina a los que está unido,
- un dominio de fijación al substrato derecho,
que sigue al extremo 3' del dominio catalítico, y
- un dominio de fijación al substrato izquierdo,
que sigue al extremo 5' del dominio catalítico, siendo los dos
dominios de fijación al substrato en cada caso complementarios con
dos regiones del ARNm de T-bet, de manera tal que
ellos se hibridan con el ARNm,
- son activas in vivo y
- contienen la secuencia de td69 GGCAATGAA
GGCTAGCTACAACGA TGGGTTTCT o de td70 TCACGGCAA GGCTAGCTACAACGA
GAACTGGGT.
2. DNAzimas de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizadas porque ellas cortan el dominio catalítico del
ARNm de T-bet junto a un sitio de enlace de purina -
uracilo.
3. DNAzimas de acuerdo con las reivindicaciones
1 y 2, caracterizadas porque ellas han sido estabilizadas
contra la descomposición en el organismo mediante la introducción de
una inversión 3-3'.
4. DNAzimas de acuerdo con las reivindicaciones
1 a 3, caracterizadas porque ellas han sido estabilizadas
contra la descomposición en el organismo mediante la introducción de
nucleótidos o compuestos de nucleótidos modificados.
5. DNAzimas de acuerdo con las reivindicaciones
1 a 4, caracterizadas porque ellas tienen como modificación
una timidina inversa junto al extremo 3' y/o una marcación con FAM
junto al extremo 5'.
6. Procedimiento para la producción de un
medicamento destinado al tratamiento de inflamaciones crónicas,
caracterizado porque
- se determinan unas células dianas, en las
cuales la expresión de un ARNm de T-bet es más alta
que que en células corporales sanas,
- se desarrollan unas DNAzimas eficaces in
vivo de acuerdo con la reivindicación 1, las cuales se fijan a
un ARNm de T-bet y lo desactivan funcionalmente,
- las DNAzimas eficaces in vivo se
introducen en células dianas y
- se formulan unos medicamentos que contienen
las DNAzimas eficaces in vivo.
7. Medicamentos que contienen una DNAzima de
acuerdo con las reivindicaciones 2 a 5 y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
8. Utilización de una DNAzima de acuerdo con
una o varias de las reivindicaciones 1 a 5, para la producción de
un medicamento destinado al tratamiento de inflamaciones
crónicas.
9. Utilización de una DNAzima de acuerdo con
una o varias de las reivindicaciones 1 a 5, para la producción de
un medicamento destinado a la inhibición específica de la expresión
de T-bet en células dianas de pacientes para el
tratamiento de inflamaciones crónicas.
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