ES2322765T3 - Agonistas del receptor ep2. - Google Patents
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Abstract
Compuesto seleccionado a partir de uno de los siguientes: **(Ver fórmula)** o una sal o solvato del mismo.
Description
Agonistas del receptor EP_{2}.
La presente invención se refiere a ciertos
estereoisómeros del AH-13205, el ácido
(\pm)-trans-2-[4-(1-hidroxihexil)-fenil]-5-oxo-ciclopentanoheptanoico
y su utilización como agonistas del receptor EP_{2}. La presente
invención también se refiere a las composiciones farmacéuticas que
comprenden estos estereoisómeros, y la utilización de estos
estereoisómeros y estas composiciones para tratar diversas
enfermedades.
Los prostanoides comprenden las prostaglandinas
(PGs) y los tromboxanos (Txs) y sus receptores se pueden clasificar
en cinco clases diferentes (DP, EP, FP, IP y TP) en base a su
sensibilidad hacia cinco prostanoides naturales, PGD_{2},
PGE_{2}, PGF_{2 \alpha}, PGI_{2} y TxA_{2}, respectivamente
(Coleman, R.A., Prostanoid Receptors, IUPHAR compendio de
caracterización y clasificación de receptores, 2ª edición,
338-353, ISBN
0-9533510-3-3,
2000). Los receptores EP (cuyo ligando endógeno es la PGE_{2}) se
encuentran subdivididos en cuatro tipos denominados EP_{1},
EP_{2}, EP_{3} y EP_{4}. Estos cuatro tipos de receptores EP
se han clonado y son distintos tanto a nivel molecular como
farmacológico (Coleman, R.A., 2000).
Los agonistas EP_{2} se han mostrados eficaces
en el tratamiento de cierto número de afecciones, que incluyen
(pero no limitan por ello) la dismenorrea (WO 03/037433), el parto
prematuro (GB 2.293.101), el glaucoma (WO 03/040126), la
hipertensión ocular (WO 03/040126), los desórdenes inmunológicos (WO
03/037433), la osteoporosis (WO 98/27976 y WO 01/46140), el asma
(WO 03/037433), la alergia (WO 03/037433), la enfermedad ósea (WO
02/24647), la reparación ósea (WO 98/27976 y WO02/24647), la
fertilidad (Breyer, R.M., et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 905,
221-231 (2000)), la disfunción sexual masculina (WO
00/40248), la disfunción sexual femenina (US 6.562.868), la
enfermedad del periodonto (WO 00/31084), la úlcera gástrica (US
5.576.347) y la enfermedad renal (WO 98/34916).
Un agonista EP_{2} conocido con buena
selectividad es el butaprost:
\vskip1.000000\baselineskip
El AH-13205, el ácido
(\pm)-trans-2-[4-(1-hidroxihexil)-fenil]-5-oxo-ciclopentanoheptanoico,
es conocido como un agonista EP_{2} (por ejemplo, véase Hillock,
C.J. y Crankshaw, D.J., European Journal of Pharmacology, 378,
99-108 (1999)).
También se le puede llamar ácido
7-{2-[4-(1-hidroxihexil)-fenil]-5-oxo-ciclopentil}-heptanoico
(las fuentes se agregaron para la identificación), y tiene la
siguiente estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Esta estructura tiene tres átomos de carbono
quirales y, por lo tanto, ocho estereoisómeros posibles. Cuando los
grupos en el pentanona cíclica se encuentran en una relación trans,
ésta da lugar a cuatro estereoisómeros que son los principales y
cuando los grupos están en una relación cis, da lugar a cuatro
estereoisómeros de menor importancia.
Los cuatro estereoisómeros principales tienen
las siguientes estructuras:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los presentes solicitantes han sido capaces de
separar los cuatro estereoisómeros principales uno de otro y han
determinado sus actividades relativas. Sin embargo, las tentativas
iniciales para separar estos estereoisómeros no fueron
exitosas.
Las tentativas se llevaron a cabo en una mezcla
con todos los estereoisómeros en su forma ácida utilizando una
columna CLAR quiral, utilizando una variedad de fases estacionarias
y fases móviles comercialmente disponibles, pero éstas fueron
infructuosas.
Se llevaron a cabo muchas tentativas de
separación en las dos mezclas de ésteres producidos en el Ejemplo 1
de más adelante, utilizando una columna CLAR quiral dentro de una
variedad de fases estacionarias comercialmente disponibles y fases
móviles, pero en el mejor de los casos este procedimiento fue
acertado a nivel analítico y la separación no fue posible a escala
preparatoria.
Finalmente, sin embargo, las tentativas de
separar los estereoisómeros como ésteres fueron acertadas tal y
como se describe más adelante en el Ejemplo 2.
Los presentes inventores también han concebido
una ruta de síntesis estereoselectiva para los estereoisómeros de
interés.
\newpage
En un primer aspecto, la presente invención
proporciona un compuesto seleccionado a partir de una de las formas
siguientes:
o una sal o solvato del
mismo.
En un segundo aspecto, la presente invención
proporciona el ácido
trans-2-[4-(1-hidroxihexil)-fenil]-5-oxo-ciclopentanoheptanoico,
del que al menos el 90% en peso se selecciona a partir de una de
las formas siguientes:
o una sal o solvato del
mismo.
En un tercer aspecto, la presente invención
proporciona el ácido
2-[4-(1-hidroxihexil)-fenil]-5-oxo-ciclopentanoheptanoico,
del que al menos el 80% en peso se encuentra en una de las formas
siguientes:
o una sal o solvato del
mismo.
Un aspecto adicional de la presente invención
proporciona un compuesto de cualquiera de los aspectos primero a
tercero, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para
utilizar en un procedimiento de terapia.
Otro aspecto de la presente invención
proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto
de cualquiera de los aspectos primero a tercero, o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo junto con un portador o un
diluyente farmacéuticamente aceptable.
Un aspecto adicional de la presente invención
proporciona la utilización de un compuesto de cualquiera de los
aspectos primero a tercero, o una sal farmacéuticamente aceptable
del mismo en la preparación de un medicamento para el tratamiento
de una afección aliviada por el agonismo de un receptor EP_{2}.
Este aspecto también proporciona un compuesto de cualquiera de los
aspectos primero a tercero, o una sal farmacéuticamente aceptable
del mismo, para utilizar en un procedimiento de tratamiento de una
afección aliviada por el agonismo del receptor EP_{2}.
Otro aspecto de la presente invención
proporciona procedimientos para sintetizar los compuestos de la
presente invención, o intermedios relevantes, mediante los
procedimientos expuestos más adelante.
Las afecciones que se pueden tratar mediante el
agonismo de un receptor EP_{2} se encuentran analizadas
anteriormente, e incluyen particularmente la dismenorrea, el parto
prematuro, el glaucoma, la osteoporosis, el asma, la alergia, la
enfermedad ósea, la reparación ósea, la infertilidad, la disfunción
sexual masculina, la disfunción sexual femenina, la enfermedad del
periodonto, la úlcera gástrica y la enfermedad renal.
Es conocido que los agonistas del receptor EP
son capaces de inhibir la activación de células T y la liberación
de citoquinas proinflamatorias, aunque el receptor EP implicado en
la mediación de estos efectos en las células T humanas no se haya
definido previamente. Los presentes inventores han descubierto que
los agonistas EP_{2} inhiben la activación de las células T
humanas (proliferación) e inhiben la liberación de múltiples
citoquinas proinflamatorias incluyendo la
interleuquina-2 (IL-2), el factor de
necrosis tumoral (TNF_{\alpha}) y el interferón gamma
(IFN\gamma). Este perfil de actividad sugiere con fuerza que los
agonistas del receptor EP_{2} serán útiles en el tratamiento de
los desórdenes inmunológicos e inflamatorios, que incluyen, pero no
limitan por ello, la psoriasis, la artritis psoriática, la
dermatitis, la artritis reumatoide, el rechazo de trasplantes, la
enfermedad inflamatoria intestinal, el lupus eritematoso sistémico,
la enfermedad de Graves, la escleroderma, la esclerosis múltiple,
la diabetes de tipo I, y el rechazo de trasplantes, y
particularmente la psoriasis (Griffiths, C., Current Drugs Targets
- Inflammation & Allergy, 3, 157-161, (2004);
Lebwohl, M., Lancet, 361, 1197-1204 (2003); Salim,
A- & Emerson, R., Curr. Open. Investig. Drug, 2(11),
1546-8 (2001)). Por lo tanto, una afección
adicional que se puede aliviar mediante agonismo de un receptor
EP_{2} es la
psoriasis.
psoriasis.
Además, los presentes inventores han demostrado
también que los agonistas del receptor EP_{2} inhiben la
liberación de la citoquina proinflamatoria, el TNF_{\alpha} de
monocitos humanos y los macrófagos alveolares. Este perfil de
actividad añade más evidencia a la visión de que esos agonistas del
receptor EP2 serán útiles en el tratamiento de desordenes
inmunológicos e inflamatorios y particularmente, enfermedades
pulmonares inflamatorias (que incluyen, pero no limitan por ello:
el asma, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, el síndrome de
dificultad respiratoria aguda, la fibrosis pulmonar y la fibrosis
cística).
Además, los aspectos de la presente invención se
refieren a la utilización de los agonistas EP_{2} tal y como se
proporcionan en los aspectos primero a tercero para tratar las
afecciones mejoradas mediante la inhibición de la producción de la
IL-2 y/o el IFN\gamma y la utilización de un
agonista EP_{2} en la preparación de un medicamento para el
tratamiento de una afección aliviada mediante la inhibición de la
producción de la IL-2.
En algunas realizaciones, los compuestos
descritos anteriormente pueden mostrar selectividad por los
receptores EP_{2} en relación con los otros tres receptores EP, es
decir, el EP_{1}, el EP_{3} y el EP_{4}. Esta selectividad
tiene en cuenta el objetivo del efecto de los compuestos de la
presente invención, con los posibles beneficios en el tratamiento
de ciertas afecciones.
La presente invención se encontrará descrita con
referencia a las figuras que se adjuntan, en las que:
la Figura 1a representa el espectro CD de la
prostaglandina E_{2} (PGE_{2}) (0,7 mg/ml) en etanol utilizando
una cubeta de 1,0 cm de camino óptico;
la Figura 1b representa el espectro UV de la
PGE_{2} (0,7 mg/ml) en etanol utilizando una cubeta de 1,0 cm de
camino óptico;
la Figura 2a representa el espectro CD del
(R)-1-(4-bromofenil)-hexan-1-ol
(R-BPH) (línea continua en la figura) (0,7 mg/ml) y
el
(S)-1-(4-bromofenil)-hexan-1-ol
(S-BPH) (línea discontinua en la figura) (0,7 mg/ml)
en etanol utilizando una cubeta de 1,0 cm de camino óptico;
la Figura 2b representa el espectro UV del
R-BPH (línea continua en la figura) (0,7 mg/ml) y el
S-BPH (línea discontinua en la figura) (0,7 mg/ml)
en etanol utilizando una cubeta de 1,0 cm de camino óptico (nótese
que las líneas continua y discontinua se cubren en esta
figura);
la Figura 3a representa el espectro CD de cada
uno de los cuatro trans-estereoisómeros del Ejemplo
4 (compuestos A, C, E y G) (todos 19 mg/ml) en etanol utilizando una
cubeta de 1,0 cm de camino óptico;
la Figura 4 representa la variación en el
porcentaje de [^{3}H]PGE_{2} desplazado con la
concentración de cinco compuestos de ensayo en un ensayo de la
capacidad de unión a los receptores EP_{2} humanos;
la Figura 5 representa la variación en la
concentración de la estimulación siguiente del AMP cíclico mediante
cinco compuestos de ensayo en un ensayo de estimulación del receptor
EP_{2} humano;
la Figura 6 representa el efecto sobre la
actividad miometrial humana del AH-13205;
la Figura 7 representa la variación en el
porcentaje de inhibición de las contracciones inducidas por
estimulación eléctrica de campo (EFS) con las concentraciones del
AH-13205 y el vehículo liberador o sólo el vehículo
liberador en un ensayo de la actividad miometrial humana;
la Figura 8 representa la variación en el
porcentaje de las contracciones de control inducidas por
estimulación eléctrica de campo (EFS) con concentraciones de los
tres compuestos de prueba en un ensayo de la actividad miometrial
humana;
la Figura 9 representa la variación de la
producción de IL-2 con la concentración de cuatro
compuestos de ensayo en un ensayo de linfocitos;
la Figura 10 representa la variación de la
producción de IL-2 con la concentración de tres
agonistas del receptor EP_{2} en un ensayo de linfocitos;
la Figura 11 representa la variación del
interferón gamma liberado con la concentración de tres agonistas
del receptor EP_{2} en un ensayo de linfocitos;
la Figura 12 representa la variación de la
producción del TNF_{\alpha} en respuesta a los tres agonistas del
receptor EP_{2} en un ensayo de linfocitos;
la Figura 13 representa la variación de la
proliferación celular en respuesta a los tres agonistas del receptor
EP_{2} en un ensayo de linfocitos;
la Figura 14 representa la variación de la
producción del TNF_{\alpha} en respuesta a tres compuestos de
ensayo en un ensayo de monocitos;
la Figura 15 representa la variación de la
producción del TNF_{\alpha} en respuesta a dos compuestos de
ensayo en un ensayo de macrófagos alveolares;
A menos que se especifique lo contrario,
anteriormente se encuentran incluidas formas iónicas, sales,
solvatos y formas protegidas bien conocidas de estos sustituyentes.
Por ejemplo, una referencia al ácido carboxílico (-COOH) también
incluye la forma aniónica (-COO^{-}) (carboxilato), una sal o
solvato del mismo, así como formas protegidas convencionales. De
modo parecido, una referencia a un grupo hidroxilo incluye también
la forma aniónica (-O^{-}), una sal o solvato del mismo, así como
formas protegidas convencionales de un grupo hidroxilo.
Puede ser conveniente o deseable preparar,
purificar y/o manejar una sal correspondiente del compuesto activo
como, por ejemplo, una sal farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de
sales farmacéuticamente aceptables se analizan en Berge, et
al., J. Pharm. Sci., 66, 1-19 (1977).
Por ejemplo, si el compuesto es aniónico, o
tiene un grupo funcional que puede ser aniónico (por ejemplo, -COOH
puede ser -COO^{-}), entonces se puede formar una sal con un
catión adecuado. Ejemplos de cationes inorgánicos adecuados
incluyen, pero no limitan por ello, los iones metálicos alcalinos
tales como el Na^{+} y el K^{+}, los cationes alcalinotérreos
tales como el Ca^{2+} y el Mg^{2+}, y otros cationes tal como
el Al^{3+}. Ejemplos de cationes orgánicos adecuados incluyen,
pero no limitan por ello, el ión amonio (es decir, NH_{4}^{+})
y los iones amonio substituidos (por ejemplo, NH_{3}R^{+},
NH_{2}R_{2}^{+}, NHR_{3}^{+}, NR_{4}^{+}). Ejemplos
de iones amonio substituidos adecuados son los derivados de: la
etilamina, la dietilamina, la diciclohexilamina, la trietilamina, la
butilamina, la etilendiamina, la etanolamina, la dietanolamina, la
piperazina, la bencilamina, la fenilbencilamina, la colina, la
meglumina y la trometamina, así como aminoácidos, tales como la
lisina y la arginina. Un ejemplo de un ión amonio cuaternario común
es el N(CH_{3})_{4}^{+}.
Puede ser conveniente o deseable preparar,
purificar y/o manejar un solvato correspondiente del compuesto
activo. El término "solvato" se utiliza en la presente
invención en el sentido convencional para referirse a un complejo
del soluto (por ejemplo, compuesto activo, sal del compuesto activo)
y el disolvente. Si el disolvente es agua, el solvato se puede
referir convenientemente como un hidrato como, por ejemplo, un
monohidrato, un dihidrato, un trihidrato, etc.
Puede ser conveniente o deseable preparar,
purificar y/o manejar el compuesto activo en una forma químicamente
protegida. El término "forma químicamente protegida" se utiliza
en la presente invención en el sentido químico convencional y se
refiere a un compuesto en el que uno o más grupos funcionales
reactivos se encuentran protegidos contra reacciones químicas no
deseables bajo condiciones especificadas (por ejemplo, pH,
temperatura, radiación, disolvente, y similares). En la práctica,
se emplean procedimientos químicos bien conocidos para hacer
reversiblemente no reactivo un grupo funcional, que de otra forma
sería reactivo, bajo condiciones especificadas. En una forma
químicamente protegida, uno o más grupos funcionales reactivos se
encuentran bajo la forma de un grupo protegido o de protección
(también conocido como grupo enmascarado o que enmascara o grupo
bloqueado o de bloqueo). Protegiendo a un grupo funcional reactivo,
se pueden llevar a cabo las reacciones que implican a otros grupos
funcionales reactivos desprotegidos, sin afectar al grupo protegido;
el grupo de protección se puede eliminar, generalmente en una etapa
posterior, sin afectar substancialmente al resto de la molécula.
Véase, por ejemplo, Protective Groups in Organic Synthesis (T.
Green y P. Wuts; 3ª Edición; John Wiley e Hijos, 1999).
Una gran variedad de dichos procedimientos de
"protección", "bloqueo" o "enmascaramiento" son
ampliamente utilizados y bien conocidos en síntesis orgánica. Por
ejemplo, un compuesto que tiene dos grupos funcionales reactivos no
equivalentes, que serían ambos reactivos bajo condiciones
especificadas, se puede derivatizar para dejar "protegido" uno
de los grupos funcionales y, por lo tanto, no reactivo, bajo
condiciones especificadas; así de protegido, el compuesto se puede
utilizar como un reactivo que tiene de hecho solamente un grupo
funcional reactivo. Después de que sea completa la reacción deseada
(que implica al otro grupo funcional), el grupo protegido puede ser
"desprotegido" para volverlo a su funcionalidad original.
Por ejemplo, un grupo hidroxi se puede proteger
como un éter (-OR) o un éster (-OC(=O)R) como, por ejemplo:
un t-butil éter; un bencil, benzhidril
(difenilmetil), o tritil (trifenilmetil) éter; un trimetilsilil o
t-butildimetilsilil éter; o un acetil éster
(-OC(=O)CH3, -OAc).
Por ejemplo, un grupo ácido carboxílico se puede
proteger como un éster como, por ejemplo: un alquil
C_{1-7} éster (por ejemplo, un metil éster; un
t-butil éster); un haloalquil
C_{1-7} éster (por ejemplo, un trihaloalquil
C_{1-7} éster); a alquilsilil
tri-C_{1-7} - alquil
C_{1-7} éster; o un aril
C_{5-20} - alquil C_{1-7} éster
(por ejemplo, un bencil éster; un nitrobencil éster); o como una
amida como, por ejemplo, una metil amida.
Puede ser conveniente o deseable preparar,
purificar y/o manejar el compuesto activo en forma de un
profármaco. El término "profármaco", tal y como se utiliza en
la presente invención, se refiere a un compuesto que, cuando se
metaboliza (por ejemplo, in vivo), produce el compuesto
activo deseado. Normalmente, el profármaco es inactivo, o menos
activo que el compuesto activo, pero puede proporcionar ventajosas
propiedades de manejo, de administración o metabólicas.
A menos que se especifique lo contrario, una
referencia a un compuesto particular también incluye profármacos
del mismo.
Por ejemplo, algunos profármacos son ésteres del
compuesto activo (por ejemplo, un éster lábil metabólicamente
aceptable fisiológicamente). Durante el metabolismo, el grupo éster
(-C(=O)OR) se parte para producir el fármaco activo. Dichos
ésteres se pueden formar mediante la esterificación, por ejemplo, de
cualquiera de los grupos ácido carboxílico (-C(=O)OH) en el
compuesto parental, con, cuando proceda, protección previa a
cualquier otro grupo reactivo presente en el compuesto parental,
seguido por la desprotección, si procede.
Ejemplos de dichos ésteres lábiles
metabólicamente incluyen los de la fórmula -C(=O)OR, en la
que R es:
alquilo C_{1-7} (por ejemplo,
-Me, -Et, -nPr, -iPr, -nBu, -sBu, -iBu, -tBu);
aminoalquilo C_{1-7} (por
ejemplo, aminoetilo;
2-(N,N-dietilamino)etilo;
2-(4-morfolino)etilo);
hidroxi o polihidroxi alquilo
C_{1-7} (por ejemplo,
2-hidroxietilo, 2,3-dihidroxipropilo
(glicerilo)) y aciloxi-alquilo
C_{1-7} (por ejemplo, aciloximetilo; aciloxietilo;
pivaloiloximetilo; acetoximetilo; 1-acetoxietilo;
1-(1-metoxi-1-metil)etil-carboniloxietilo;
1-(benzoiloxi)etilo;
isopropoxi-carboniloximetilo;
1-isopropoxi-carboniloxietilo;
ciclohexil-carboniloximetilo;
1-ciclohexil-carboniloxietilo;
ciclohexiloxi-carboniloximetilo;
1-ciclohexiloxi-carboniloxietilo;
(4-tetrahidropiraniloxi)-carboniloximetilo;
1-(4-tetrahidropiraniloxi)-carboniloxietilo;
(4-tetrahidropiranil)-carboniloximetilo;
y
1-(4-tetrahidropiranil)-carboniloxietilo).
Además, algunos profármacos se activan
enzimáticamente para producir el compuesto activo, o un compuesto
que, sobre la reacción química adicional, produzca el compuesto
activo (por ejemplo, como en ADEPT, GDEPT, LIDEPT, etc.). Por
ejemplo, el profármaco puede ser un derivado del azúcar u otro
conjugado glucósido, o puede ser un derivado de éster de
aminoácido.
El término "tratamiento", tal y como se
utiliza en la presente invención, en el contexto de tratar una
afección, se refiere generalmente al tratamiento y la terapia, tanto
de un ser humano como de un animal (por ejemplo, en aplicaciones
veterinarias), en el que se consigue un cierto efecto terapéutico
deseado, por ejemplo, la inhibición del progreso de la afección, e
incluye una reducción en el tipo de progreso, un alto en el tipo de
progreso, la mejora de la afección, y la cura de la afección.
También se incluye el tratamiento como medida profiláctica (es
decir, la profilaxis).
El término "cantidad terapéuticamente
efectiva", tal y como se utiliza en la presente invención, se
refiere a aquella cantidad de un compuesto activo, o a una forma de
material, composición o dosificación que comprende un compuesto
activo, que es efectiva para producir un cierto efecto terapéutico
deseado, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable, cuando
se administra según un régimen de tratamiento deseado. Los
intervalos de dosis adecuadas se encontrarán normalmente en el
intervalo desde 0,01 hasta 20 mg/kg/día, preferentemente desde 0,1
hasta 10 mg/kg/día, aunque la dosis pueda ser tan baja como desde
aproximadamente 0,00001 hasta 1 mg/día en el caso de la
administración ocular tópica.
\vskip1.000000\baselineskip
Las composiciones se pueden formular para
cualquier ruta y medio adecuados de administración. Los portadores
o los diluyentes aceptados farmacéuticamente incluyen los utilizados
en las formulaciones adecuadas para la administración oral, rectal,
nasal, tópica (incluyendo la bucal, la ocular y la sublingual),
vaginal o parenteral (incluyendo la subcutánea, la intramuscular,
la intravenosa, la intradérmica, la intratecal y la epidural). Las
formulaciones se pueden presentar convenientemente en forma de
dosificaciones unitarias y se pueden preparar mediante cualquiera
de los procedimientos bien conocidos en la técnica farmacéutica.
Dichos procedimientos incluyen la etapa de traer en asociación el
ingrediente activo con el portador que constituye uno o más
ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan
trayendo uniformemente e íntimamente el ingrediente activo con los
portadores líquidos o los portadores sólidos finalmente divididos, o
ambos, y, entonces, si es necesario, formando el producto.
Para las composiciones sólidas, se pueden
utilizar los portadores sólidos no tóxicos convencionales que
incluyen, por ejemplo, los grados farmacéuticos de manitol, lactosa,
celulosa, derivados de la celulosa, almidón, estearato de magnesio,
sacarina sódica, talco, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio, y
similares. El compuesto activo tal y como se ha definido
anteriormente se puede formular como supositorios utilizando como
portador, por ejemplo, los polialquilenglicoles, los triglicéridos
acetilados y similares. Las composiciones líquidas
farmacéuticamente administrables se pueden preparar, por ejemplo,
mediante la disolución, la dispersión, etc., de un compuesto activo
tal y como se ha definido anteriormente y los coadyuvantes
farmacéuticos opcionales en un portador, tal como, por ejemplo,
agua, dextrosa acuosa salina, glicerol, etanol, polioxol ésteres y
similares, para formar de este modo una solución o una suspensión.
Si se desea, la composición farmacéutica a administrar puede
también contener cantidades menores de sustancias auxiliares no
tóxicas tales como agentes humectantes o emulsionantes,
amortiguadores de pH y similares, como, por ejemplo, el acetato
sódico, el monolaurato de sorbitano, el oleato de la
trietanolamina, etc.. Son conocidos los procedimientos actuales de
preparación de dichas formas de dosificación, o serán evidentes,
para los expertos en la técnica; por ejemplo, véase Remington's
Pharmaceutical Sciences, 20ª Edición, pub. Lippincott, Williams
& Wilkins, 2000. La composición o la formulación que se
administra contendrán, en cualquier caso, una cantidad de
compuesto(s)
activo(s) en una cantidad efectiva para aliviar los síntomas del sujeto que está siendo tratado.
activo(s) en una cantidad efectiva para aliviar los síntomas del sujeto que está siendo tratado.
Se pueden preparar las formas o las
composiciones de dosificación que contienen el ingrediente activo
en el intervalo del 0,25% al 95% con el equilibrio preparado a
partir del portador no tóxico.
Para la administración oral, una composición no
tóxica farmacéuticamente aceptable se encuentra formada por la
incorporación de cualquiera de los excipientes empleados normalmente
tales como, por ejemplo, los grados farmacéuticos de manitol,
lactosa, celulosa, derivados de la celulosa, sodio cruzado de
carmellosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco,
glucosa, sacarosa, carbonato del magneso, y similares. Dichas
composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones,
comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de
liberación sostenida, y similares. Dichas composiciones pueden
contener un 1% - 95% de ingrediente activo, más preferentemente un
2% - 50%, mucho más preferentemente 5% - 8%.
La administración parenteral se caracteriza
generalmente mediante inyección, tanto subcutánea, intramuscular
como intravenosa. Los inyectables se pueden preparar en formas
convencionales, como soluciones líquidas o suspensiones, formas
sólidas adecuadas para la solución o la suspensión en un líquido
antes de la inyección, o como emulsiones. Los excipientes adecuados
son, por ejemplo, el agua, el salino, la dextrosa, el glicerol, el
etanol o similares. Además, si se desea, las composiciones
farmacéuticas a administrar contienen también cantidades menores de
sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o
emulsionantes, amortiguadores de pH y similares, como, por ejemplo,
el acetato sódico, el monolaurato del sorbitano, el oleato de la
trietanolamina, el acetato sódico de la trietanolamina, etc.
El porcentaje de compuesto activo contenido en
dichas composiciones parentales es altamente dependiente en la
naturaleza específica del mismo, así como la actividad del compuesto
y las necesidades del sujeto. Sin embargo, se emplean porcentajes
de ingrediente activo desde el 0,1% al 10% en solución, y serán más
altos si la composición es un sólido que será diluido
posteriormente a los porcentajes mencionados anteriormente.
Preferentemente, la composición comprenderá 0,2 - 2% de agente
activo en solución. Las formulaciones adecuadas para la
administración transdérmica incluyen los geles, las pastas, las
pomadas, las cremas, las lociones y los aceites, así como las
placas, los emplastos adhesivos, los vendajes, los apósitos, los
depósitos y los reservorios.
Las pomadas se preparan normalmente a partir del
compuesto activo y una base de pomada parafínica o miscible en
agua.
Las cremas se preparan normalmente a partir del
compuesto activo y una base de crema aceite en agua. Si se desea,
la fase acuosa de la base de crema puede incluir, por ejemplo, al
menos aproximadamente el 30% en peso de un alcohol polihídrico, es
decir, un alcohol que tenga dos o más grupos hidroxilo tales como
el propileneglicol, el
butano-1,3-diol, el manitol, el
sorbitol, el glicerol y el polietilenglicol y sus mezclas. Las
formulaciones tópicas pueden incluir idealmente un compuesto que
potencie la absorción o la penetración del compuesto activo a través
de la piel u otras áreas afectadas. Ejemplos de dichos
potenciadores de penetración dérmica incluyen el dimetilsolfóxido y
los análogos relacionados. Las formulaciones adecuadas para la
administración vaginal se pueden presentar como pesarios, tapones,
cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones por pulverización
que contienen además el compuesto activo, tales como portadores
apropiados conocidos por la técnica.
Los colirios, para administración ocular tópica,
comprende preferentemente entre el 0,001% y el 20% del agente
activo con el resto preparado a partir de portadores bien conocidos
tales como agua o salino, u otros aditivos, tal y como se tratará
más adelante.
Las composiciones oculares típicas pueden
incluir:
- (a)
- preservantes antimicrobianos - los preservantes adecuados incluyen: el cloruro de benzalconio, el timerosal, el clorobutanol, el metilparaben, el propilparaben, el alcohol feniletílico, el edetato disódico, el ácido sórbico, el onamer, u otros agentes conocidos por los expertos en la técnica. Dichos preservantes se emplean normalmente en una concentración entre aproximadamente el 0,001% y aproximadamente el 1,0% en peso;
- (b)
- agentes solubilizantes, tales como el Polisorbato 20, 60 y 80; el Plurónico F-68, F-84 y P-103; el Tiloxapol; el Cremofor; el sulfato de sodio y dodecilo; el glicerol; el PEG 400; el propilenglicol; las ciclodextrinas; u otros agentes conocidos por los expertos en la técnica. Dichos cosolventes se emplean normalmente en una concentración entre aproximadamente el 0,01% y aproximadamente el 2% en peso; y
- (c)
- agentes de viscosidad, tales como el alcohol polivinílico, la polivinil-pirrolidona, la metil-celulosa, la hidroxipropil-metilcelulosa, hidroxietil-celulosa, la carboximetil-celulosa, la hidroxipropil-celulosa, u otros agentes conocidos por los expertos en la técnica. Dichos agentes se emplean normalmente en una concentración entre aproximadamente el 0,01% y aproximadamente el 2% en peso.
\vskip1.000000\baselineskip
Otros componentes opcionales, denominados a
veces "ingredientes inactivos", incluyen el cloruro sódico, el
dihidrogenofosfato de sodio monohidrato y/o anhidro, aceite de
ricino hidrogenado polioxil 40, la trometamina, el ácido bórico, el
manitol, el edetato disódico, el hidróxido sódico y/o el ácido
clorhídrico para ajustar el pH y agua depurada.
Las formulaciones oculares que contienen
prostaglandinas se encuentran descritas en, entre otras, las
patentes: US 5.889.052; US 4.599.353; US 6.011.062; US 6.235.781; US
5.849.792; US 5.631.287, que se encuentran en la presente invención
como referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos de la fórmula 1:
en la que 1000
representa una estereoquímica en cada centro quiral, y los grupos en
la pentanona son trans con respecto a la otra, se pueden sintetizar
a partir del compuesto de la fórmula
2:
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\vskip1.000000\baselineskip
que tiene la misma estereoquímica
en cada centro quiral, en el que R' representa un grupo alquilo
C_{1-7} (una fracción monovalente obtenida
mediante la eliminación de un átomo de hidrógeno de un átomo de
carbono de un compuesto hidrocarburo que tiene de 1 a 7 átomos de
carbono como, por ejemplo, metilo (C_{1}), etilo (C_{2}),
propilo (C_{3}), butilo (C_{4}), pentilo (C_{5}), hexilo
(C_{6}) y heptilo (C7)) mediante la reducción del doble enlace y
la desprotección del ácido y el alcohol utilizando técnicas
estándar, por ejemplo, la reducción se puede llevar a cabo con
hidrógeno, paladio en carbón vegetal en un disolvente tal como el
acetato de etilo a temperatura y presión normales. Un grupo
protector alcohol particularmente preferido es un grupo sililo, tal
como el tert-butildimetilsililo (TBDMS), que se
puede eliminar, por ejemplo, con ácido o codisolvente acuosos,
cuyas condiciones pueden también desproteger al grupo ácido. Estas
reacciones se pueden llevar a cabo en cualquier orden. El doble
enlace se puede encontrar en orientación cis- o trans-, o en una
mezcla de
éstas.
Los compuestos de la fórmula 2 se pueden
sintetizar mediante la retención de un enolato de la fórmula 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
que tiene la misma estereoquímica
en cada uno de los dos centros quirales con un compuesto de la
fórmula
4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que X es un grupo saliente,
tal como un haluro o un mesilato, y R' es como el de la fórmula 2,
en presencia de una base fuerte, tal como la Li
Oi-Pr a temperatura
ambiente.
Los cuatro enolatos de la fórmula 3 se pueden
generar a partir de la
ciclopent-2-enona (fórmula 5):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
mediante la reacción con un
compuesto de la fórmula
6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
que tiene la misma estereoquímica
en el centro quiral, en presencia de un catalizador de un metal de
transición, preferentemente Rh(I), en presencia de un
ligando quiral, tal como el BINAP
(2,2'-Bis(difenilfosfino)-1,1'-binaftilo).
Utilizando el S-BINAP se producirían los enolatos de la
fórmula
3a:
\vskip1.000000\baselineskip
mientras que utilizando el
R-BINAP se producirían los enolatos de la fórmula
3b:
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos de la fórmula 6 se pueden generar
in situ a partir de la reacción de los compuestos de la
fórmula 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
que tiene la misma estereoquímica
en el centro quiral, con
ClTi(Oi-Pr)_{3}, antes de la
reacción de los compuestos de las fórmulas 5 y 6. Esta reacción se
puede llevar a cabo generalmente según los procedimientos descritos
en Hayashi, T., et al., JACS, 124,
12102-12103 (2002), tal como 1,6 equivalentes del
compuesto de la fórmula 6 al compuesto de la fórmula 5, con el 3%
del catalizador en tetrahidrofurano a 20ºC durante 1 hora bajo una
atmósfera
inerte.
Los compuestos de la fórmula 7 se pueden generar
a partir del correspondiente compuesto de bromo de la fórmula
8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
con la misma estereoquímica en el
centro quiral, mediante el tratamiento con un
litio-alquilo, en un disolvente como, por ejemplo,
el
THF.
Los compuestos de la fórmula 8 se realizan
mediante los compuestos de protección de la fórmula 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
con la misma estereoquímica en el
centro quiral, utilizando condiciones estándar, que retiene la
estereoquímica del centro quiral, por ejemplo, mediante la reacción
con
TBDMSCl.
Los estereoisómeros individuales del compuesto 9
se pueden realizar a partir de un compuesto de la fórmula 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
mediante reducción enantioselectiva
(por ejemplo, véase Brown, H.C., et al. J. Am. Chem. Soc.,
110, 1539-1546 (1988)), o mediante reducción del
racemato del compuesto 9 seguido de resolución
óptica.
Los compuestos de la fórmula 4 se conocen de la
síntesis de las prostaglandinas naturales, por ejemplo, Suzuki, M.,
et al., J. Am. Chem. Soc., 107, 3348-3349
(1985), y se pueden sintetizar mediante una variedad de rutas.
\newpage
Una ruta, basada en una ruta descrita en Taber,
D.F., et al., J. Org. Chem., 62, 194-198
(1997), es como sigue:
Otros posibles procedimientos utilizan
diferentes agentes alquilantes para el alcohol propargílico (y se
ilustran más adelante), pero la preparación de los agentes
alquilantes requiere una etapa adicional. Un ejemplo de ello es la
alquilación del orto éster del bromobutirato (Patterson, J.W., et
al., Synthesis, 1985, 337-338). El orto éster
del ácido 5-hexinoico se ha hecho reaccionar con
BuLi/formaldehído para dar el mismo producto intermedio (Syn.Comms.
1989, página 1509). Otra posible ruta adicional puede implicar la
reacción directa del ácido 5-hexinoico
(comercialmente disponible, Aldrich) con la base y el
formaldehído.
Una ruta alternativa a los cuatro compuestos de
la fórmula 1 es a partir de los compuestos de la fórmula 11:
en la que los centros quirales
tienen la misma estereoquímica, mediante la reacción primero con
hidruro sódico y después con base fuerte, tal como el amiduro de
potasio o el butil-litio, para formar el dianión
(Weiler, L., J. Am. Chem. Soc., 92, 6702-6704
(1970) y véase, por ejemplo, Modern Synthetic Reactions, 2ª Edición
1972, H.O. House, página 553), que se pueden entonces hacer
reaccionar con haloheptanoato para dar el cetoéster sustituido
(Huckin, S.N. y Weiler, L., Can. J. Chem., 52, 2157 (1974)), que
posteriormente se puede hidrolizar y descarboxilar utilizando
condiciones estándar, por ejemplo, mediante el tratamiento con
yoduro de litio en colidina o el tratamiento con cianuro sódico en
DMSO (véase Modern Synthetic Reactions, 2ª Edición 1972, H.O. House,
páginas 511-517). Puede ser necesario reemplazar el
haloheptanoato por un agente alquilante más reactivo tal como el
haluro alílico de la fórmula 4, seguido por la reducción del doble
enlace.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Los compuestos de la fórmula 11 se pueden
sintetizar a partir de los compuestos de la fórmula 12:
que tiene la misma estereoquímica
en cada uno de los dos centros quirales, mediante la reacción con
carbonato de dimetilo y una base, tal como el hidruro sódico, en un
disolvente tal como el tolueno o el THF, con calentamiento
suave.
Los compuestos de la fórmula 12 se pueden
sintetizar a partir de la
ciclopent-2-enona (fórmula 5):
mediante la adición de ácido
borónico (véase Takaya, Y., et al., J. Am. Chem. Soc., 120,
5579-5580 (1998) y Hayashi, T., Synlett, SI,
879-887 (2001)) de un compuesto de la fórmula
13:
con la misma estereoquímica en el
centro quiral, en presencia de un catalizador de un metal de
transición, preferentemente Rh(I), en presencia de un
ligando quiral, preferentemente el BINAP. Las condiciones adecuadas
incluyen la utilización del 3% de catalizador y ligando quiral en
dioxano acuoso a 60ºC durante 20
horas.
Por analogía con el precedente químico
establecido, la utilización de S-BINAP produce los
compuestos de la fórmula 12a:
mientras que la utilización de
R-BINAP produce los compuestos de la fórmula
12b:
Los compuestos de la fórmula 13 se pueden
generar a partir de los compuestos de la fórmula 8, con la misma
estereoquímica en el centro quiral, mediante técnicas estándar.
Dichas técnicas incluyen el primer tratamiento con un reactivo de
intercambio de litio, por ejemplo, el
t-butil-litio, en un disolvente, por
ejemplo, el THF, a una temperatura adecuada (para el
butil-litio en THF, -78ºC). Ello es seguido
mediante el tratamiento con un reactivo de boro apropiado como, por
ejemplo, el B(O^{i}-Pr)_{3},
seguido por la hidrólisis como, por ejemplo, mediante el hidróxido
de potasio (Thompson, W.J. y Gaudino, J., J. Org. Chem., 49,
5237-5243 (1984)).
\global\parskip1.000000\baselineskip
Una ruta alternativa a partir de los compuestos
de la fórmula 13 a los compuestos de la fórmula 11 donde los
centros quirales tienen la misma estereoquímica es la reacción de
los compuestos de la fórmula 13 con el
ciclopent-2-enona metilcarboxi
sustituido de la fórmula 14:
mediante la adición de ácido
borónico, en presencia de un catalizador de un metal de transición,
preferentemente Rh(I), en presencia de un ligando quiral.
Las condiciones adecuadas incluyen la utilización del 3% de
catalizador y ligando quiral en dioxano acuoso a 60ºC durante 20
horas, es decir, las condiciones de reacción similares utilizadas
para el acoplamiento del compuesto 5 con los compuestos de la
fórmula
13.
Una ruta alternativa adicional a los cuatro
compuestos de la fórmula 1 es a partir de los compuestos de la
fórmula 15:
donde los centros quirales tienen
la misma estereoquímica, mediante la reacción con una base fuerte,
tal como el hidruro sódico, por ejemplo, en DMF, para formar un
monoanión, que puede entonces reaccionar con el haloheptanoato para
dar el cetoéster sustituido, que posteriormente se puede hidrolizar
y descarboxilar utilizando condiciones estándar, por ejemplo,
mediante el tratamiento con yoduro de litio en colidina o el
tratamiento con cianuro sódico en DMSO (véase Modern Synthetic
Reactions, 2ª Edición 1972, H.O. House, páginas
511-517). La combinación trans en la ciclopentanona
surge debido al impedimento
estérico.
Los compuestos de la fórmula 15 se pueden
sintetizar mediante el acoplamiento de los compuestos de la fórmula
13, con la misma estereoquímica en el centro quiral, con el
ciclopent-2-enona metilcarboxi
sustituido de la fórmula 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Funk, R.L., et al., J. Am.
Chem. Soc, 115, 8849-8850 (1993)), en presencia de
un catalizador de un metal de transición, preferentemente
Rh(I), en presencia de un ligando quiral, preferentemente el
BINAP. Las condiciones adecuadas incluyen la utilización del 3% de
catalizador y ligando quiral en dioxano acuoso a 60ºC durante 20
horas, es decir, las condiciones de reacción similares utilizadas
para el acoplamiento del compuesto 5 con los compuestos de la
fórmula
13.
Alternativamente, la síntesis estereoselectiva
del ácido
(1R,2S)-2-[4-(1-(S)-hidroxihexil)-fenil]-5-oxo-ciclopentanoheptanoico
(fórmula 17) se puede conseguir mediante la ruta de síntesis
general siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Un compuesto de la fórmula 17 se puede formar a
partir del compuesto 18 en el que el grupo -OH en la cadena lateral
4-hexil-fenilo se protege mediante
un grupo protector.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Tal y como se ha mencionado anteriormente, un
grupo protector alcohol particularmente preferido es un grupo
sililo, tal como el tert-butildimetilsililo (TBDMS),
que se puede eliminar, por ejemplo, con ácido y un codisolvente
acuosos como, por ejemplo, el THF.
\newpage
Los compuestos de la fórmula 18 se pueden formar
a partir de los compuestos de la fórmula 19 mediante la eliminación
del grupo carboximetilo y la hidrólisis del éster de heptanoato.
Ello se puede conseguir, por ejemplo, mediante la reacción con el
yoduro de litio y la
2,4,6-trimetil-piridina
(colidina).
El compuesto 19 se puede sintetizar mediante la
adición de la cadena lateral heptil-etil éster a un
compuesto de la fórmula 20.
Ello se puede conseguir mediante el tratamiento
de un compuesto de la fórmula 20 con una base adecuada para
eliminar el átomo de hidrógeno adyacente al grupo -CO_{2}Me. La
base preferida para esta reacción es el NAH en disolvente anhidro,
tal como el DME.
La adición posterior de heptanoato de etilo,
activada en la posición 7, al compuesto resultante da un compuesto
de la fórmula 19. Preferentemente, el heptanoato de etilo se activa
con un átomo del halógeno en los posición 7. Más preferentemente,
este átomo del halógeno es un átomo del bromo. Puede ser también
necesario incluir un catalizador durante la adición del heptanoato
de etilo activado. Dicho catalizador es preferentemente yoduro
sódico.
Los compuestos de la fórmula 20 se pueden formar
a partir de los compuestos de la fórmula 21 mediante una reacción
de transesterificación.
\vskip1.000000\baselineskip
La formación del éster metílico del compuesto 20
se puede conseguir calentando el compuesto 21 con metanol en un
recipiente sellado.
Los compuestos de la fórmula 21 se pueden formar
mediante la adición 1,4- a un compuesto carbonilo insaturado de la
fórmula 22.
Ello se puede conseguir mediante la reacción de
un reactivo organometálico de la fórmula 23 con un compuesto de
cobre (I) seguido por la adición a un compuesto de la fórmula
22.
donde M en la fórmula 23 representa
un elemento que es menos electronegativo que el cobre.
Preferentemente M es Li, MgX, BR_{2} y ZnX, donde X es un átomo
de
halógeno.
El reactivo de cobre (I) utilizado en la
reacción de acoplamiento de los compuestos de las fórmulas 22 y 23
es preferentemente un cuprato aniónico y es más preferentemente el
LiCu-(2-Th)CN (conocido como
2-tienilcianocuprato de litio).
Un compuesto de la fórmula 23 se puede formar
mediante la reacción de un haluro de la fórmula 24 mediante
reacciones de formaciones organometálicas estándar.
En la fórmula 24, X es un átomo de halógeno y es
preferentemente I ó Br.
Los compuestos de la fórmula 22 se pueden formar
a partir de materias primas fácilmente disponibles mediante el
procedimiento descrito en Tetrahedron 1996, 52,
971-986.
Por conveniencia, muchas fracciones químicas se
representan utilizando abreviaciones bien conocidas que incluyen,
pero no limitan por ello, el metilo (Me), el etilo (Et), el
n-propilo (nPr), el iso-propilo
(iPr), el n-butilo (nBu), el
sec-butilo (sBu), el iso-butilo
(iBu), el tert-butilo (tBu), el
n-hexilo (nHex), el ciclohexilo (cHex), el fenilo
(Ph), el bifenilo (biPh), el bencilo (Bn), el naftilo (naph), el
metoxi (MeO), el etoxi (EtO), el benzoilo (Bz), el
tetrahidropiranilo (THP) y el acetilo (Ac).
Por conveniencia, muchos compuestos químicos se
representan utilizando abreviaciones bien conocidas que incluyen,
pero no limitan por ello, el metanol (MeOH), el etanol (EtOH), el
iso-propanol (i-PrOH), la
metiletilcetona (MEK), el éter o el dietiléter (Et_{2}O), el ácido
acético (AcOH), el diclorometano (cloruro de metileno, DCM), el
acetonitrilo (ACN), el ácido trifluoroacético (TFA), la
dimetilformamida (DMF), el tetrahidrofurano (THF), el acetato de
etilo (EA), el 1,2-dimehoxietano (DME) y el
dimetilsulfóxido (DMSO).
La selectividad del compuesto para hacer
agonistas los receptores EP_{2} sobre los otros receptores EP (es
decir, EP_{1}, EP_{3}, EP_{4}) se puede cuantificar dividiendo
el Ki para EP_{2} (véase más adelante) por el Ki para los otros
receptores EP (véase más adelante). El coeficiente inverso
resultante es preferentemente 10 o más, más preferentemente 100 o
más.
Los espectrómetros RMN se registraron con un
Bruker AV300 o un Bruker DPX400. Los espectros de masas se
registraron con un Espectrómetro de Masas Cuadrupolo Simple de
Waters ZMD. La actividad óptica se midió con un Polarímetro 341 de
Perkin Elmer.
\vskip1.000000\baselineskip
(a) (i) Síntesis de la
1-(4-bromofenil)-hexan-1-ona
(1)
A una mezcla agitada y enfriada con hielo de
AlCl_{3} (83 g) y bromobenceno (200 ml) bajo nitrógeno se añadió
gota a gota cloruro de hexanoilo (75 ml) durante un periodo de 30
minutos. La mezcla se calentó entonces hasta los 80ºC (exterior)
durante 1,5 horas, momento el que la solución había cambiado a color
rojo oscuro. Se permitió entonces enfriar la mezcla antes de ser
vertida en 600 ml de agua helada y después se extrajo con DCM (800
ml). Se lavaron después los extractos orgánicos con salmuera, se
secaron (MgSO_{4}) y se concentraron en vacío. El concentrado se
trató entonces con iso-hexano (1 l) y se dejó en el
congelador toda la noche, donde tuvo lugar la cristalización. El
sólido, levemente de color blanco, se filtró y se lavó con hexano
más frío, para producir el compuesto de título (84 g).
^{1}H RMN (CDCl_{3}, \delta): 0,95 (3H,
t); 1,4 (4H, m); 1,75 (2H, m); 2,95 (2H, t); 7,6 (2h, d); 7,85 (2H,
d).
\vskip1.000000\baselineskip
(a) (ii) Síntesis de
(S)-1-(4-Bromofenil)-hexan-1-ol
(S-BPH) (2a)
A una solución de cloruro de
(-)-DIP
[B-clorodiisopinocamfeilborano] (13,5 g) en THF
anhidro (20 ml), enfriada hasta los -25ºC, se añadió una solución
de
1-(4-bromofenil)-hexan-1-ona
(10 g) en THF anhidro (20 ml) durante unos 5 - 10 minutos,
manteniendo la temperatura por debajo de los -20ºC. La mezcla se
mantuvo a -25ºC durante las siguientes 6 horas y después se agrega
a una mezcla agitada enérgicamente de dietalonamina (12 ml) y
trietilamina (10 ml) en éter (250 ml). La mezcla se dejó agitar
durante toda una noche, se lavó con ácido hidroclórico diluido,
salmuera, se secó sobre sulfato sódico y se evaporó en vacío. Se
obtuvo el compuesto 2a (4,5 g; punto de fusión 70ºC - 71ºC) después
de la cromatografía en columna de gel de sílice del residuo en
diclorometano seguido por la recristalización a partir de
heptano.
[\alpha]_{D}^{24} = -26,5 (c =
4,00; CHCl_{3})
^{1}H RMN (CDCl_{3}, \delta): 0,85 (3H,
t); 1,2-1,9 (9H, m); 4,6 (1H, t); 7,15 (2H, d); 7,45
(2H, d).
CLAR (Chiracel OD 250 x 4,6 mm, hexano eluyente:
IPA 99:1, caudal 0,5 ml/min, \lambda = 254 nm): 44 minutos, 100%
enantioselectiva.
\vskip1.000000\baselineskip
(a) (iii) Síntesis de
(R)-1-(4-Bromofenil)-hexan-1-ol
(R-BPH) (2b)
El compuesto 2b (4 g; punto de fusión 70ºC -
71ºC) se realizó a partir de cloruro de (+)-DIP
[B-clorodiisopinocamfeilborano] (13,5 g) y
1-(4-bromofenil)-hexan-1-ona
(10 g) mediante un procedimiento análogo al descrito en el Ejemplo
1 (a) (ii).
[\alpha]_{D}^{24} = +27,3 (c = 4,06;
CHCl_{3})
Relación masa/carga (EIMS): 256, 258
^{1}H RMN (CDCl_{3}, \delta): 0,85 (3H,
t); 1,2-1,9 (9H, m); 4,6 (1H, t); 7,15 (2H, d); 7,45
(2H, d).
CLAR (Chiracel OD 250 x 4,6 mm, hexano eluyente:
IPA 99:1, caudal 0,5 ml/min, \lambda = 254 nm): 47 minutos, 100%
enantioselectiva.
La estereoquímica absoluta de los compuestos 2a
y 2b se asignó por analogía con un procedimiento existente en la
literatura, para reducir las cetonas aromáticas de cadena larga,
descrito por Brown, H.C., et al. J. Am. Chem. Soc., 110,
1539-1546 (1998). Los alcoholes se demostraron para
ser esencialmente homoquirales mediante la CLAR quiral.
\vskip1.000000\baselineskip
(a) (iv) Síntesis alternativa de
(S)-(-)-1-(4-bromofenil)-hexan-1-ol
(S-BPH) (2a)
Se agitó BH_{3}.THF (1 M en THF, 234 ml, 234
mmol) bajo nitrógeno y se enfrió hasta los -10ºC antes de ser
tratado con
(R)-2-metil-CBS-oxazaborolidina
(24 ml, 24 mmol). Después de dejarlo agitar durante 20 minutos, se
añadió
1-(4-bromofenil)hexan-1-ona
(1) (48,3 g) como una solución en THF (379 ml) durante un período de
1 hora, y a partir de entonces se dejó durante unos 20 minutos
adicionales que evolucionara antes de enfriar bruscamente con
cuidado con MeOH (100 ml) - H_{2}. Es recomendable llevar a cabo
el enfriamiento en el RT ya que el MeOH reacciona lentamente a
-10ºC. La mezcla se concentró entonces en vacío, se redisolvió
después en MeOH (300 ml) y se trató con HCl (2 M en Et_{2}O, 40
ml). La solución se agitó durante 5 minutos antes de concentrarse
en vacío, triturándola con Et2O y eliminando el sólido mediante
filtración. Las aguas madre se concentraron otra vez en vacío
recristalizándose entonces a partir de hexano (480 ml, 10 vol.) a
-10ºC para producir el compuesto del título en forma de un sólido
blanco esponjoso (20,7 g).
\vskip1.000000\baselineskip
(b) (i) Síntesis de
(S)-1-(4-Bromofenil)-1-(tert-butildimetilsililoxi)-hexano
(3a)
\newpage
Una mezcla de S-BPH (2a) (10 g),
cloruro del tert-butildimetilsililo (7 g) e
imidazol (3,7 g) se agitaron en dimetilformamida anhidra (100 ml)
durante 16 horas. Se dividió la mezcla entre éter de petróleo y agua
y se separaron las capas. La capa orgánica se lavó con agua,
salmuera, se secó sobre sulfato sódico y se evaporó en vacío. El
compuesto 3a (14,5 g) se obtuvo en forma de un aceite después de la
cromatografía en columna del residuo en éter de
petróleo.
petróleo.
Relación masa/carga (EIMS): 370, 372
^{1}H RMN (CDCl_{3}, \delta): -0,2 (3H,
s); 0,0 (3H, s); 0,85 (9H, s); 0,85 (3H, t); 1,25 (6H, m) 1,55 (2H,
m); 4,6 (1H, m); 7,1 (2H, d); 7,4 (2H, d).
\vskip1.000000\baselineskip
(b) (ii) Síntesis de
(R)-1-(4-Bromofenil)-1-(tert-butildimetilsililoxi)-hexano
(3b)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto 3b (18,5 g) se obtuvo a partir de
R-BPH (2b) (12,5 g) mediante un procedimiento
análogo al descrito en el Ejemplo 1 (b) (i).
Relación masa/carga (EIMS): 370, 372
^{1}H RMN (CDCl_{3}, \delta): -0,2 (3H,
s); 0,0 (3H, s); 0,85 (9H, s); 0,85 (3H, t); 1,25 (6H, m) 1,55 (2H,
m); 4,6 (1H, m); 7,1 (2H, d); 7,4 (2H, d).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Este compuesto conocido, que se encuentra
comercialmente disponible, se preparó en tres etapas a partir del
2-oxociclopentano-carboxilato de
etilo mediante los procedimientos de Bagli, J. et al., J.
Org. Chem., 1972, 37, 2132-2138 y Bernady, K.F., J.
Org. Chem., 1980 45, 4702-4715.
\newpage
(d) (i) Síntesis de diaestereómeros de éster
metílico de ácido
2-{4-[1-(R)-(tert-butildimetilsililoxi)-hexil]-fenil}-5-oxociclopentanoheptanoico
(mezcla trans:cis 3:1 aproximada) (6b)
A una solución de
(R)-1-(4-bromofenil)-1-(tert-butildimetilsililoxi)-hexano
(3b) (7,2 g) en éter dietílico anhidro (100 ml) se añadió
tert-butil-litio (1,5 M en hexanos;
28 ml) gota a gota a -78ºC, sin permitir que la temperatura
superara los -60ºC. La mezcla se dejó a -78ºC durante unas 3 horas
adicionales. Un sólido acuoso de pentino cobre (1) (2,5 g) en éter
dietílico anhidro (56 ml) se trató con triamida hexametilfosfórica
(8 ml) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante varios
minutos hasta formar una solución. Esta solución recién preparada
se agregó ahora gota a gota a la solución de
aril-litio a -78ºC y se dejó durante una hora más a
-78ºC, con lo que se agregó una solución de
2-(6-carbometoxihexil)-ciclopent-2-en-1-ona
(5) (4 g) en éter dietílico anhidro. La mezcla de reacción se
mantuvo a -78ºC durante 15 minutos y luego a -25ºC hasta -10ºC
durante una hora más. La mezcla fría se dividió rápidamente entre
ácido hidroclórico diluido y éter, se separó la capa orgánica, se
lavó con salmuera, se secó sobre sulfato sódico y se evaporó en
vacío. Se obtuvieron los componentes 6b (7,2 g) como una mezcla 3:1
aproximada de isómeros trans:cis seguido de cromatografía en
columna de gel de sílice del residuo en diclorometano:éter de
petróleo 2:1 y luego en acetato de etilo:éter de petróleo 3:17.
^{1}H RMN (CDCl_{3}, \delta) -
diaestereómeros trans-: -0,25 (3H, s); 0,0 (3H, s); 0,85 (9H, s);
0,8-2,0 (22H, m); 2,2-2,6 (6H, m);
2,95 (1H, m); 3,65 (3H, s); 4,6 (1H, m); 7,15 (2H, d); 7,25 (2H,
d).
^{1}H RMN (CDCl_{3}, \delta) -
diaestereómeros cis-: -0,27 (3H, s); -0,02 (3H, s); 0,85 (9H, s);
0,8-2,0 (22H, m); 2,2-2,6 (6H, m);
3,55 (1H, m); 3,65 (3H, s); 4,6 (1H, m); 7,0 (2H, d); 7,15 (2H,
d).
\vskip1.000000\baselineskip
(d) (ii) Diaesterómeros de éster metílico de
ácido
2-{4-[1-(S)-(tert-butildimetilsililoxi)-hexil]-fenil}-5-oxo-ciclopentanoheptanoico
(mezcla trans:cis 3:1 aproximada) (6a)
El compuesto del título y su diaestereóisomero,
y aproximadamente el 30% de su isómero cis (7,3 g) se hicieron a
partir de
(S)-1-(4-bromofenil)-1-(tert-butildimetilsililoxi)-hexano
(3a) (7,2 g) y
2-(6-carbometoxihexil)-ciclopent-2-en-1-ona
(5) (4 g) mediante un procedimiento análogo al descrito en el
Ejemplo 1(d)(i).
^{1}H RMN (CDCl_{3}, \delta) -
diaestereómeros trans: -0,25 (3H, s); 0,0 (3H, s); 0,85 (9H, s);
0,8-2,0 (22H, m); 2,2-2,6 (6H, m);
2,95 (1H, m); 3,65 (3H, s); 4,6 (1H, m); 7,15 (2H, d); 7,25 (2H,
d).
^{1}H RMN (CDCl_{3}, \delta) -
diaestereómeros cis: -0,27 (3H, s); -0,02 (3H, s); 0,85 (9H, s);
0,8-2,0 (22H, m); 2,2-2,6 (6H, m);
3,55 (1H, m); 3,65 (3H, s); 4,6 (1H, m); 7,0 (2H, d); 7,15 (2H,
d).
\vskip1.000000\baselineskip
(d) (iii) Síntesis alternativa de
diaesterómeros de éster metílico de ácido
2-{4-[1-(R)-(tert-butildimetilsililoxi)-hexil]-fenil}-5-oxo-ciclopentanoheptanoico
(mezcla trans:cis 3:1 aproximada) (6b)
Una mezcla de
(R)-1-(4-bromofenil)-1-(tert-butildimetilsililoxi)-hexano
(3b) (0,8 g), virutas de magnesio (0,11 g), un cristal de yodo y
1,2-dibromoetano (5 ml) en THF anhidro (4 ml) se
calentó hasta reflujo para iniciar la reacción, y luego se mantuvo
a 35ºC durante 2 horas para formar la solución de reactivo de
Grignard. Se agitan cloruro de litio (0,125 g) y el complejo
bromuro de cobre (1) \cdot sulfuro de dimetilo (0,61 g) en THF
anhidro (4,5 ml) durante unos pocos minutos y luego se enfrió hasta
los -78ºC con lo cual se añadió gota a gota la solución de reactivo
de Grignard. La mezcla resultante se dejó durante 5 minutos a -78ºC
y luego se añadió cloruro de trimetilsililo (0,38 g) seguido por
una solución de
2-(6-carbometoxihexil)-ciclopent-2-en-1-ona
(0,18 g) en THF anhidro (1,5 ml). La mezcla se dejó a -78ºC durante
15 minutos, a 0ºC durante 30 minutos y luego se permitió calentarla
hasta temperatura ambiente durante una hora. La mezcla se reenfrió
hasta los -20ºC con lo cual se añadió ácido clorhídrico diluido (4
ml) y la mezcla se agitó enérgicamente durante dos minutos. La
mezcla enfriada se dividió entre éter de petróleo y solución de
cloruro amónico saturada y se separaron las capas. La capa orgánica
se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato sódico y se evaporó en
vacío. Se aislaron los compuestos 6b (0,20 g) como una mezcla de
isómeros cis y trans seguido de cromatografía en columna de gel de
sílice del residuo en éter de petróleo: acetato de etilo 4:1.
^{1}H RMN (CDCl_{3}, \delta) -
diaestereómeros trans: -0,25 (3H, s); 0,0 (3H, s); 0,85 (9H, s);
0,8-2,0 (22H, m); 2,2-2,6 (6H, m);
2,95 (1H, m); 3,65 (3H, s); 4,6 (1H, m); 7,15 (2H, d); 7,25 (2H,
d).
^{1}H RMN (CDCl_{3}, \delta) -
diaestereómeros cis: -0,27 (3H, s); -0,02 (3H, s); 0,85 (9H, s);
0,8-2,0 (22H, m); 2,2-2,6 (6H, m);
3,55 (1H, m); 3,65 (3H, s); 4,6 (1H, m); 7,0 (2H, d); 7,15 (2H,
d).
\vskip1.000000\baselineskip
(e) (i) Síntesis de diaesterómeros de éster
metílico de ácido trans- y
cis-2-[4-(1-(S)-hidroxihexil)-fenil]-5-oxo-ciclopentanoheptanoico
(7a) (Mezcla 1)
A: éster metílico de ácido
(1S,2R)-2-[4-(1-(S)-hidroxihexil)-fenil]-5-oxo-ciclopentanoheptanoico
[SRS]
B: éster metílico de ácido
(1R,2R)-2-[4-(1-(S)-hidroxihexil)-fenil]-5-oxo-ciclopentanoheptanoico
[RRS]
C: éster metílico de ácido
(1R,2S)-2-[4-(1-(S)-hidroxihexil)-fenil]-5-oxo-ciclopentanoheptanoico
[RSS]
D: éster metílico de ácido
(1S,2S)-2-[4-(1-(S)-hidroxihexil)-fenil]-5-oxo-ciclopentanoheptanoico
[SSS]
\vskip1.000000\baselineskip
Se agitaron diaesterómeros de éster metílico de
ácido
2-{4-[1-(S)-(tert-butildimetilsililoxi)-hexil]-fenil}-5-oxo-ciclopentanoheptanoico,
(6a) (0,2 g; de composición trans:cis 3:1 aproximada) en una mezcla
de THF (3,5 ml) y ácido clorhídrico diluido (2 M; 1 ml) durante 20
horas a 25ºC. La mezcla de reacción se añadió a salmuera y se
extrajo dos veces con diclorometano. Las capas orgánicas combinadas
se secaron sobre sulfato sódico y se evaporaron en vacío. Se obtuvo
el compuesto 7a (Mezcla 1) (0,095 g) en forma de un aceite (de
composición trans:cis 95:5 aproximada) seguido de cromatografía en
columna de gel de sílice del residuo en éter de petróleo: acetato
de etilo 3:1 y luego en diclorometano:metanol 200:3.
Relación masa/carga (EIMS): 402
^{1}H RMN (CDCl_{3}, \delta) - sólo
diaestereómeros trans: 0,8-2,0 (23H, m);
2,2-2,6 (6H, m); 2,95 (1H, m); 3,65 (3H, s); 4,65
(1H, t); 7,25 (2H, d); 7,35 (2H, d).
\vskip1.000000\baselineskip
(e) (ii) diaesterómeros de éster metílico de
ácido trans y
cis-2-[4-(1-(R)-hidroxihexil)-fenil]-5-oxo-ciclopentanoheptanoico
(7b) (Mezcla 2)
\vskip1.000000\baselineskip
E: éster metílico de ácido
(1S,2R)-2-[4-(1-(R)-hidroxihexil)-fenil]-5-oxo-ciclopentanoheptanoico
[SRR]
F: éster metílico de ácido
(1R,2R)-2-[4-(1-(R)-hidroxihexil)-fenil]-5-oxo-ciclopentanoheptanoico
[RRR]
G: éster metílico de ácido
(1R,2S)-2-[4-(1-(R)-hidroxihexil)-fenil]-5-oxo-ciclopentanoheptanoico
[RSR]
H: éster metílico de ácido
(1S,2S)-2-[4-(1-(R)-hidroxihexil)-fenil]-5-oxo-ciclopentanoheptanoico
[SSR]
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos 7b (0,15 g; de composición
trans:cis 95:5 aproximada) se hicieron a partir de diaesterómeros
de éster metílico de ácido
2-{4-[1-(R)-(tert-butildimetilsililoxi)-hexil]-fenil}-5-oxo-ciclopentanoheptanoico
(0,3 g; de composición trans:cis 3:1 aproximada) (6b) mediante un
procedimiento análogo al descrito en el Ejemplo 1(e)(i).
Relación masa/carga (EIMS): 402
^{1}H RMN (CDCl_{3}, \delta) - sólo
isómero trans: 0,8-2,0 (23H, m);
2,2-2,6 (6H, m); 2,95 (1H, m); 3,65 (3H, s); 4,65
(1H, t); 7,25 (2H, d); 7,35 (2H, d).
\vskip1.000000\baselineskip
La CLAR de una muestra de 90 mg de la mezcla 1 o
la mezcla 2 del éster en una fase inmóvil quiral (ChiralPak AD,
Daicel Chemical Industries, Japón) utilizando una fase estacionaria
de etanol al 100% produjo la separación completa en una columna de
25 cm en longitud por 2 cm de diámetro interno, en aproximadamente
una hora. Una muestra de 1 g o cualquier mezcla se separaron en
once operaciones consecutivas de 90 mg (caudal de 4 ml/min;
detección a 230 nm). Los ésteres recuperados se hidrolizaron
entonces a ácidos tal y como sigue. El éster metílico (0,45 g) en
tetrahidrofurano en agua a 4:1 v/v (40 ml) se trató con hidróxido
del litio 1 M en agua (1,37 ml, 1,2 eq.) agregado gota a gota y la
solución se agitó durante toda una noche a temperatura ambiente. La
solución se concentró en vacío, se diluyó con agua, se acidificó a
pH \sim1 y se extrajo en acetato de etilo. El extracto se secó
sobre sulfato de magnesio, se filtró y se concentró en vacío a 30ºC
para dar el ácido en forma de un aceite. Las recuperaciones de
ácidos a partir de 1 g de cada mezcla de ésteres metílicos fueron:
del Pico 1, mezcla 1: 0,392 g; del Pico 2, mezcla 1: 0,427 g; del
Pico 1, mezcla 2: 0,433 g y del Pico 2, mezcla 2: 0,381 g.
Las rotaciones ópticas se registraron para los
ácidos derivados de cada uno de los picos de éster metílico
indicados. Los ácidos obtenidos de los picos aislados se refieren de
aquí en adelante como Pico m, ácido de la Mezcla m, para mayor
claridad.
Pico 1, ácido de la mezcla 1
[\alpha]^{25} -422,4 (365 nm), -142,9
(436 nm), -57,3 (546 nm), -47,9 (578 nm), -45,1 (589 nm)
(c = 0,6275, CHCl_{3}; camino óptico 100
mm)
\vskip1.000000\baselineskip
Pico 2, ácido de la mezcla 1
[\alpha]^{25} +314,9 (365 nm), +80,6
(436 nm), +22,7 (546 nm), +17,3 (578 nm), +16,0 (589 nm)
(c = 1,365, CHCl_{3}; camino óptico 100
mm)
\vskip1.000000\baselineskip
Pico 1, ácido de la mezcla 2
[\alpha]^{25} -299,4 (365 nm), -77,8
(436 nm), -22,2 (546 nm), -16,9 (578 nm), -15,5 (589 nm)
(c = 0,81, CHCl_{3}; camino óptico 100 mm)
\vskip1.000000\baselineskip
Pico 2, ácido de la mezcla 2
[\alpha]^{25} +422,6 (365 nm), +140,6
(436 nm), +55,5 (546 nm), +45,9 (578 nm), +42,9 (589 nm)
(c = 0,885, CHCl_{3}; camino óptico 100
mm)
\vskip1.000000\baselineskip
La pureza química se determino mediante RMN y
LC-MS; la pureza quiral se determinó mediante CLAR
quiral tal y como se describe más adelante. La ^{1}H RMN
(CDCl_{3}) confirmó la estructura del ácido y mostró la presencia
de sólo una traza del éster metílico; se encontraba siempre presente
un nivel bajo de impureza, probablemente el isómero cis, junto con
el acetato de etilo residual.
La ^{13}C RMN mostró diferencias muy pequeñas
entre los diaestereómeros de los ésteres. El pico 1, ácido de la
mezcla 1 y el pico 2, ácido de la mezcla 2, se muestran para ser
enantiómeros, al igual que el pico 2, ácido de la mezcla 1 y el
pico 1, ácido de la mezcla 2. Ello se correlaciona con los datos de
rotación óptica para cada compuesto mostrado anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron 0,45 g de éster metílico (tal y
como se separó en el Ejemplo 2) en 40 ml de una solución 4:1 v/v de
THF en agua; se añadieron 1,37 ml de solución de hidróxido de litio
1 M (1,2 eq.) gota a gota, y la solución se agitó entonces durante
toda una noche a temperatura ambiente. Se examinó entonces la
reacción mediante CL-EM, que normalmente muestra la
formación limpia del ácido libre, habiendo solamente una traza de
éster. Se llevó a cabo la concentración de la reacción bajo
condiciones de vacío para eliminar el THF, y se agregó más agua; la
solución agitada se trató gota a gota con ácido hidroclórico 1 M
para alcanzar un pH \sim1, y se equilibró después la solución con
acetato de etilo; se eliminó la capa acuosa, y se lavó la capa de
acetato de etilo con salmuera, se secó sobre sulfato de magnesio, se
filtró, y se evaporó bajo condiciones de vacío. El aceite residual
se transfirió a un frasco pesado en un poco de acetato de etilo, y
se eliminó el disolvente bajo una corriente del nitrógeno; se ubicó
después la muestra en una pistola de secado y se bombeada durante
toda una noche a 30ºC/1 mbar.
La ^{1}H RMN (CDCl_{3}) confirmó la
estructura del producto como el ácido libre, y mostró normalmente
la presencia de sólo una traza de éster metílico; estaba siempre
presente un nivel bajo de impureza, probablemente del isómero cis,
al igual que el acetato de etilo residual.
La pureza quiral del producto se evaluó
reesterificando una pequeña muestra de cada uno de los cuatro
isómeros ácidos separados y analizando después los ésteres mediante
CLAR quiral analítica. Se disolvieron aproximadamente 5 mg del
ácido en éter y se trataron con una solución recién preparada del
diazometano en éter, para dar un color amarillo permanente. Después
de permanecer durante 30 minutos a temperatura ambiente, se hizo
pasar aire a la solución hasta secarse bajo atmósfera de nitrógeno y
se redisolvió en etanol para la CLAR quiral. Las condiciones
utilizadas para el análisis fueron: columna analítica ChiralPak AD
(25 cm por 0,46 cm), etanol al 100% como fase estacionaria, caudal
de 0,25 ml/min, detección UV (230 nm) a temperatura ambiente. Los
tiempos normales de retención para cada isómero fueron: Pico 1,
ácido de la mezcla 1: 23,5 minutos; Pico 2, ácido de la mezcla 1:
56 minutos; Pico 1, ácido de la mezcla 2: 23,7 minutos; Pico 2,
ácido de la mezcla 2: 35 minutos. La pureza quiral de cada muestra
fue esencialmente del 100%.
\vskip1.000000\baselineskip
La estereoquímica absoluta de los
estereoisómeros AH-13205 se determinó asignando la
configuración absoluta de la unión de la cadena lateral ácida y la
ciclopentanona utilizando dicroísmo circular. Los cuatro
estereoisómeros del AH-13205, que tienen todos la
configuración trans de las dos cadenas laterales en la
ciclopentanona, se han separado (pico 1, ácido de la mezcla 1; pico
2, ácido de la mezcla 1; pico 1, ácido de la mezcla 2 y pico 2,
ácido de la mezcla 2); éstos son aceites a temperatura ambiente.
También se analizaron los estándares para ayudar
en la asignación de la configuración absoluta. Éstos eran la
prostaglandina E_{2} (PGE_{2}), el
(S)-1-(4-bromofenil)-hexan-1-ol
(S-BPH) y el
(R)-1-(4-bromofenil)-hexan-1-ol
(R-BPH) (véase más adelante).
Las muestras se almacenaron a temperatura
ambiente y se disolvieron en etanol al 100% y se diluyeron hasta
las concentraciones que se muestran en la tabla 1 antes del
análisis.
Se utilizó una cubeta de cuarzo con un camino
óptico de 1,0 cm para el análisis de la PGE_{2}, el
R-BPH y el S-BPH. Se utilizó una
cubeta de cuarzo con un camino óptico de 0,1 cm para el análisis de
los cuatro estereoisómeros AH-13205. Los volúmenes
de etanol se midieron con una micropipeta de Gilson, para la que se
encuentran calibrados si se utilizan rápidamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cumplieron los criterios de calibración de la
exactitud de la longitud de onda. El análisis del
d-10-camforsulfonato amónico (ACS)
acuoso 0,06% peso/volumen mostró una intensidad de señal dentro de
lo especificado y, por lo tanto, no se hizo necesario ningún factor
de escala.
La línea de base del agua correspondiente se
restó de cada espectro de muestra, y se pusieron a cero los
espectros dentro la región de 360 - 400 nm, que estaba fuera de la
banda de absorción.
Los ensayos individuales de UV y CD se llevaron
a cabo para todas las muestras. Los datos restados y puestos a cero
de la línea de base UV y CD para la PGE_{2} y los
R-/S-BPH estándares se representan en las Figuras
1a, 1b, 2a y 2b. Los datos para los cuatro estereoisómeros del
AH-13205 se representan en la Figura 3a y la Figura
3b. Los resultados se resumen en la Tabla 2.
Las muestras estereoisoméricas (pico 1, ácido de
la mezcla 1; pico 2, ácido de la mezcla 1; pico 1, ácido de la
mezcla 2 y pico 2, ácido de la mezcla 2) tienen dos o tres
transiciones de interés, una debida a la transición n \rightarrow
\pi* a \sim290 nm y una debida a la transición \pi
\rightarrow \pi* del anillo aromático a aproximadamente 260 nm
y la siguiente transición por debajo de esta región. La PGE_{2}
se utilizó como modelo para la parte n \rightarrow \pi* de la
molécula y los R-/S-BPH como modelos de la parte
\pi \rightarrow \pi*. Las absorbancias \pi \rightarrow
\pi* eran débiles y no interferían con el análisis de la banda
n\rightarrow \pi*.
Se espera que el CD inducido para la PGE_{2}
sea dominado por el \alpha- de la cadena a la del carbonilo. El
análisis utilizando la regla de octante estándar muestra que esta
cadena se encuentra en el octante -z, +y y -x
y, de este modo, haciendo -xyz (y, por lo tanto, la curva CD
prevista) negativo. Ello se observó experimentalmente (Tabla 2).
Las muestras pico 1, ácido de la mezcla 1 y pico 1, ácido de la
mezcla 2 mostraron curvas CD negativas y, por lo tanto, teniendo la
misma estereoquímica absoluta en la unión de la cadena lateral como
la PGE_{2}. Las muestras pico 2, ácido de la mezcla 1 y pico 2,
ácido de la mezcla 2 mostraron curvas CD positivas y, por lo tanto,
teniendo la estereoquímica absoluta opuesta de la PGE_{2} en esta
unión.
Tanto mediante la confrontación con patrones con
el PGE_{2} como con la correlación de la regla de octante, las
muestras pico 1, ácido de la mezcla 1 y pico 1, ácido de la mezcla 2
se ha demostrado que tienen la misma configuración absoluta que la
PGE_{2} en el carbono \alpha- al carbonilo que es el punto del
conexión de la cadena lateral ácida a la ciclopentanona. Las
muestras pico 2, ácido de la mezcla 1 y pico 2, ácido de la mezcla
2 tienen la configuración opuesta a la PGE_{2} en este punto.
Estos resultados se representan en la Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
La determinación de la estereoquímica absoluta
mediante estos estudios de CD se encuentra de acuerdo con los
resultados previstos en la síntesis estereoselectiva descrita para
el compuesto 17 [RSS], tal y como se predijo mediante la
comparación con los resultados existentes en la literatura sobre las
síntesis estereoselectivas relacionadas utilizando el compuesto
(22).
Mientras que la estereoquímica en la posición 1
de la cadena hexilo en la cadena lateral
4-(1-hidroxihexil)-fenilo se conoce
a partir de las materias primas, las asignaciones en la Tabla 3
permiten que sea determinada la estereoquímica de cada uno de los
isómeros. Estos resultados se representan a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de
(S)-1-(4-bromofenil)-1-(tert-butildimetil-sililoxi)-hexano
(1,8 g) en THF anhidro (24 ml) se añadió a -78ºC
tert-butil-litio (1,7 M en pentano;
5,6 ml) permaneciendo la temperatura por debajo de -65ºC. Después
de agitar durante 2 horas a -78ºC, se añadió
2-tienilcianocuprato de litio (0,25 M en THF; 19,2
ml) y la mezcla se dejó a -78ºC durante una hora. Se añadió
entonces una solución de ácido
5-oxo-ciclopentenocarboxílico,
éster
(1R,2S,3R,4S)-{3-[N-bencenosulfonil-N-(3,5-dimetilfenil)amino]-2-bornilo}
(1,7 g) en THF anhidro (15 ml) y la mezcla resultante se dejó a
-78ºC durante 75 minutos. Se añadió entonces una solución saturada
de cloruro amónico (15 ml) y se permitió calentar la mezcla hasta
los 10ºC - 15ºC durante la siguiente hora. Se agregó una solución
adicional saturada de cloruro amónico y se extrajo la mezcla dos
veces con acetato de etilo. Los extractos orgánicos combinados se
lavaron con la solución de cloruro amónico y posteriormente con
salmuera y luego se secaron sobre sulfato sódico y se evaporaron en
vacío. Se obtuvo el éster
(1R,2S,3R,4S)-{3-[N-bencenosulfonil-N-(3,5-dimetilfenil)amino]-2-bornilo}
del ácido
(1R,2S)-2-{4-[1-(S)-(tert-butildimetilsililoxi)hexil]-fenil}-5-oxo-ciclo-pentanocarboxílico
(1,8 g) como una espuma seguido de cromatografía en columna de gel
de sílice del residuo en éter de petróleo: éter dietílico
3:1.
3:1.
^{1}H RMN (CDCl_{3}, \delta): (una mezcla
de formas ceto y enol) -0,3, -0,15, -0,1, 0,0, 0,1, 0,35, 0,45, 0,55
(8s); 0,75-2,8 (c); 3,7 (m), 4,1 (m); 4,55 (m); 5,25
(dd); 5,5-5,8 (2 br s); 6,8 (d);
6,95-7,5 (c); 11,0 (protón enol, s).Espectro de Masa
(relación masa/carga) ES^{+}: 836,6 (M+Na)^{+}
\vskip1.000000\baselineskip
Una solución de éster
(1R,2S,3R,4S)-{3-[N-bencenosulfonil-N-(3,5-dimetilfenil)amino]-2-bornilo}
del ácido
(1R,2S)-2-{4-[1-(S)-(tert-butildimetilsililoxi)-hexil]-fenil}-5-oxo-ciclopentanocarboxílico (1,1 g) en metanol anhidro (60 ml) se calentó hasta los 150ºC en un tubo sellado durante 3 horas. Después de la evaporación del disolvente en vacío, se obtuvo el éster metílico del ácido (1R,2S)-2-{4-[1-(S)-(tert-butildimetilsililoxi)-hexil]-fenil}-5-oxo-ciclopentanocarboxílico (390 mg) como un aceite seguido de cromatografía en columna de gel de sílice del residuo en diclorometano:éter de petróleo 2:1.
(1R,2S)-2-{4-[1-(S)-(tert-butildimetilsililoxi)-hexil]-fenil}-5-oxo-ciclopentanocarboxílico (1,1 g) en metanol anhidro (60 ml) se calentó hasta los 150ºC en un tubo sellado durante 3 horas. Después de la evaporación del disolvente en vacío, se obtuvo el éster metílico del ácido (1R,2S)-2-{4-[1-(S)-(tert-butildimetilsililoxi)-hexil]-fenil}-5-oxo-ciclopentanocarboxílico (390 mg) como un aceite seguido de cromatografía en columna de gel de sílice del residuo en diclorometano:éter de petróleo 2:1.
^{1}H RMN (CDCl_{3}, \delta): forma ceto
-0,2 (3H, s); 0,0 (3H, s); 0,85 (9H, s); 0,85 (3H, t);
1,1-1,7 (8H, c); 1,95 (1H, c); 2,5 (3H, c); 3,35
(1H, d); 3,7 (3H, s); 3,8 (1H, m); 4,6 (1H, t); 7,15 (2H, d); 7,25
(2H, d).
Espectro de Masa (relación masa/carga) ES^{+}:
611,6 (M+Na)^{+}
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de éster metílico del ácido
(1R,2S)-2-{4-[1-(S)-(tert-butildimetilsililoxi)-hexil]-fenil}-5-oxo-ciclopentanocarboxílico
(390 mg) en DME anhidro (3,5 ml) se añadió hidruro sódico
(dispersión al 60% en aceite; 39 mg). Después de dejarla durante
una hora, se añadieron 7-bromoheptanoato de etilo
(0,3 ml) y una cantidad catalítica de yoduro sódico y la mezcla se
calentó a reflujo durante 20 horas.
Después de enfriarla, la mezcla se añadió a la
solución de cloruro amónico y se extrajo dos veces con
diclorometano. Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre
sulfato sódico y se evaporaron en vacío. El residuo se recogió en
cloroformo anhidro (10 ml) y se añadieron unos pocos cristales de
ácido para-toluenosulfónico monohidratado.
Después de agitar durante una hora, se añadió
una solución de bicarbonato sódico y se separó la capa orgánica, se
secó sobre sulfato sódico y se evaporó, en vacío. Se obtuvo el éster
etílico del ácido
(2S)-1-metoxicarbonil-2-{4-[1-(S)-(tert-butildimetilsililoxi)-hexil]-fenil}-5-oxo-ciclopentanoheptanoico
(290 mg) como un aceite seguido de cromatografía en columna de gel
de sílice del residuo en éter dietílico 0% - 5% en
diclorometano.
^{1}H RMN (CDCl_{3}, \delta): -0,2 (3H,
s); 0,0 (3H, s); 0,85 (9H, s); 0,85 (3H, t); 1,1-1,8
(20H, c); 2,0 (1H, c); 2,3 (4H, c); 2,6 (2H, c); 3,4 (3H, s); 3,45
(1H, m); 4,15 (2H, q); 4,6 (1H, t); 7,15 (2H, d); 7,25 (2H,d).
Espectro de Masa (relación masa/carga) ES^{+}:
455,4 (M+Na)^{+}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Una mezcla de éster etílico del ácido
(2S)-1-metoxicarbonil-2-{4-[1-(S)-(tert-butildimetilsililoxi)-hexil]-fenil}-5-oxo-ciclopentanoheptanoico
(290 mg) e hidrato de yoduro de litio (650 mg) en
2,4,6-colidina (4 ml) se calentó a reflujo durante 3
horas.
Después de refrescar la mezcla, se agregó a
acetato de etilo y se lavó dos veces con ácido hidroclórico diluido
y salmuera, se secó sobre sulfato sódico y se evaporó en vacío. Se
obtuvo el ácido
(1R,2S)-2-{4-[1-(S)-(tert-butildimetilsililoxi)-hexil]-fenil}-5-oxo-ciclopentanoheptanoico
(190 mg) como un aceite seguido de cromatografía en columna de gel
de sílice del residuo en éter de petróleo: acetato de etilo
4:1.
^{1}H RMN (CDCl_{3}, \delta): -0,2 (3H,
s); 0,0 (3H, s); 0,85 (9H, s); 0,85 (3H, t); 1,0-2,3
(24H, c); 2,45 (1H, c); 2,9 (1H, m); 4,6 (1H, t); 7,15 (2H, d);
7,25 (2H, d).
Espectro de Masa (relación masa/carga) ES^{+}:
525,4 (M+Na)^{+}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Una solución de ácido
(1R,2S)-2-{4-[1-(S)-(tert-butildimetilsililoxi)-hexil]-fenil}-5-oxo-ciclopentanoheptanoico
(190 mg) en THF (4 ml) y ácido clorhídrico 2 M (1,1 ml) se agitó
durante 20 horas a 30ºC. Se añadió la mezcla a agua y se extrajo
dos veces con diclorometano. Se secaron las capas orgánicas
combinadas sobre el sulfato sódico y se evaporaron en vacío. Se
obtuvo el ácido
(1R,2S)-2-[4-(1-(S)-hidroxihexil)-fenil]-5-oxo-ciclopentanoheptanoico
(115 mg) como un aceite seguido de cromatografía en columna de gel
de sílice del residuo en éter de petróleo : acetato de etilo
5:2.
^{1}H RMN (CDCl_{3}, \delta): 0,85 (3H,
t); 1,0-2,3 (24H, c); 2,45 (1H, c); 2,9 (1H, m); 4,6
(1H, t); 7,25 (2H, d); 7,35 (2H, d).
Espectro de Masa (relación masa/carga) ES^{-}:
387,3 (M-H)^{-} [\alpha]^{25}
-416,0 (365 nm), -139,5 (436 nm), -54,9 (546 nm), -45,6 (578 nm),
-42,4 (589 nm) (c = 0,51, CHCl_{3}; camino óptico 100 mm)
\vskip1.000000\baselineskip
La capacidad de los compuestos de unirse al
receptor EP_{2} humano y su selectividad contra el resto de los
receptores EP se pueden demostrar en los experimentos de competición
y desplazamiento de uniones de radioligandos utilizando líneas
celulares transfectadas de manera estable con los receptores EP
humanos. La capacidad de los compuestos de estimular el receptor
EP_{2} se puede demostrar en un ensayo funcional del segundo
mensajero AMP cíclico, en linfocitos y monolitos humanos primarios o
en el miometrio humano.
\vskip1.000000\baselineskip
Las membranas se prepararon a partir de las
células transfectadas de manera estable con el cADN del receptor EP
humano. En resumen, las células se cultivaron hasta confluenciar, se
rasparon desde los frascos de cultivo, y se centrifugaron (800 g, 8
minutos, 4ºC). Las células se lavaron dos veces en solución tampón
de homogeneización helada que contenía 10 mM de
Tris-HCl, 1 mM de EDTA\cdot2Na, 250 mM de
sacarosa, 1 mM de PMSF, 0,3 mM de indometacina, pH 7,4,
homogeneizadas y recentrifugadas como antes. El sobrenadante se
almacenó en el hielo y los gránulos se rehomogeneizaron y se
hicieron girar. Se reunieron los sobrenadantes y se centrifugaron a
40.000\cdotg durante 10 minutos a 4ºC. Los gránulos de la membrana
resultantes se almacenaron a -80ºC hasta su utilización.
Para el ensayo, las membranas que expresaban
receptores EP_{4}, EP_{3}, EP_{2} o EP_{1} humano se
incubaron en placas del Millipore (MHVBN45) que contenían la
solución tampón del ensayo, [^{3}H]PGE_{2} radiomarcado
y de 0,1 nM a 10.000 nM de concentraciones de compuestos. Las
incubaciones se llevaron a cabo a temperaturas adecuadas y durante
espacios de tiempo adecuados para permitir que se alcance el
equilibrio. La unión no específica se determinó en presencia de 10
\muM de PGE_{2}. Las formas libre y unida del radiomarcado se
separaron mediante un equipo de filtración por colector al vacío
utilizando soluciones tampón apropiadas de lavado, y el
radiomarcado unido se determinó mediante recuento de centelleo. Los
componentes de cada una de las soluciones tampón se encuentran
incluidos en la Tabla 4 siguiente.
La afinidad o el pK_{i} de cada compuesto para
cada receptor se calcularon a partir de la concentración que
provocaba el 50% del desplazamiento del radioligando (IC50),
utilizando la ecuación de Cheng-Prusoff:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Este enfoque sigue lo expuesto en Kenakin, T.P.,
Pharmacologic analysis of drug receptor interaction, Raven Press,
Nueva York, 2ª edición.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se describe un ensayo in
vitro para determinar el efecto de los compuestos sobre la
producción de ciclasa, es decir, para determinar su eficacia
funcional en el receptor EP_{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron para estos ensayos las células HEK
que expresaban de manera estable el receptor EP_{2} humano. Las
células HEK-EP_{2} se cultivaron en placas de 96
pocillos cubiertas de poli-L-lisina
con una densidad de 50.000 células/pocillo, y creciendo hasta la
confluencia en atmósfera humedecida de 95% O_{2}/5% CO_{2} a
37ºC. El medio de cultivo fue DMEM complementado con un 10% de suero
fetal bovino, 100 U/ml de penicilina, 100 ng/ml de
estreptotomicina, 2,5 \mug/ml de fungizona, 2 mM de glutamina, 250
\mug/ml de geneticina y 200 \mug/ml de zeocina.
Al alcanzar la confluencia, los medios de
cultivo se aclararon utilizando DMEM sin adiciones, antes de que se
agregaran 175 ml de solución tampón de ensayo (DMEM que contiene 1
mM de
3-isobutil-1-metilxantina
y 3 \muM de indometacina) a cada pocillo. Se dejó incubar durante
1 hora antes de que las células se estimularan con los compuestos de
prueba (por triplicado) a concentraciones finales desde 10^{-9} M
hasta 10^{-5}M durante 15 minutos. Se puso fin al ensayo mediante
la adición de 25 ml de ácido clorhídrico 1 M. Se congelaron
entonces las placas durante un mínimo de 12 horas o hasta que se
requiera para el ensayo de desplazamiento de radioligandos.
\vskip1.000000\baselineskip
Las placas se descongelaron rápidamente a 37ºC,
y se neutralizaron con 25 ml de hidróxido sódico 1 M. Se
transfirieron 30 ml de sobrenadante a placas Millipore (MAFNOB) de
96 pocillos cubiertas con 0,1% de polietilenimina. Se diluyeron
estos sobrenadantes mediante la adición de 90 ml de la solución
tampón de ensayo de AMP cíclico (50 mM de Tris, 5 mM de EDTA, pH
7,0). Se construyó una curva estándar del AMP cíclico (desde
10^{-11} M hasta 10^{-5} M). Se agregaron 15 \mul de proteína
quinasa dependiente de la 3',5'-cAMP (concentración
final de 8 mg/pocillo), y 15 \mul de
[^{3}H]-CAMP (concentración final de 2 nM/pocillo)
en cada pocillo.
Se incubaron las placas en hielo durante 2
horas, antes de que se separaran los radiomarcados en forma unida y
libre mediante filtración en vacío, recogiendo en el colector
Millipore, utilizando agua helada como solución tampón de
terminación. Se dejaron secar durante toda una noche las placas del
filtro, antes de la adición de 50 \mul de Microscint. La
radioactividad se determinó utilizando el contador de centelleo
Trilux de Microbeta. La acumulación de AMP cíclico se determinó a
partir de la curva estándar, y los valores se determinaron como
pmoles de cAMP/pocillo.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se describe un ensayo funcional
in vitro, utilizando el músculo liso miometrial humano, para
determinar la afinidad de los compuestos de prueba en el receptor
EP2 en tejidos humanos.
Las secciones del miometrio humano se prepararon
a partir de muestras de tiras longitudinales de músculo miometrial
de útero extraído quirúrgicamente (2 mm de ancho por 10 mm de
longitud) que luego se cortaron y se suspendieron entre ganchos de
acero inoxidable en las cámaras de órganos que contenían solución de
Krebs oxigenada (95% O_{2}/5% CO_{2}) a 37ºC. La composición de
la solución de Krebs era tal y como sigue: NaCl (118,2 mM), KCl
(4,69 mM), MgSO_{4}\cdot7H_{2}O (1,18 mM), KH_{2}PO_{4}
(1,19 mM), glucosa (11,1 mM), NaHCO_{3} (25,0 mM),
CaCl_{2}\cdot6H_{2}O (2,5 mM), indometacina (3 x 10^{-6}
M).
Los tejidos se colocaron bajo una tensión
equivalente a 25 mN y se dejaron durante una noche en temperatura
ambiente. Al día siguiente, los tejidos se mantuvieron a 37ºC, se
lavaron y se colocaron bajo una tensión de 15 mN y después se dejó
que se equilibraran durante un período de al menos 30 minutos. Se
registraron las respuestas utilizando transductores isométricos
conectados a un ordenador Macintosh de Apple mediante un interfaz
de MacLab. Después de 60 minutos, se estimularon eléctricamente las
secciones del músculo del miometrio humano (15 ms de duración de
impulso, durante 10 segundos cada 100 segundos a 15V y 0,5 Hz - 40
Hz) utilizando electrodos paralelos de hilo de platino y un
estimulador de impulsos D330 de Multistim. Sobre la estimulación
eléctrica, las tiras de músculo liso miometrial
humano respondieron con una rápida contracción. Una vez se había
estabilizado la respuesta a la estimulación eléctrica (las
respuestas estimuladas difirieron por no más de un 10%), se
expusieron las tiras a concentraciones cada vez mayores de los
compuestos de prueba (1x10^{-7} M a 1x10^{-4} M, incubado
durante al menos 15 minutos en cada concentración). Al final del
experimento, se utilizó la aplicación de nitroprusiato sódico (SNP,
donante del óxido nítrico que provoca la relajación del músculo
liso) (1x10^{-4} M) para producir una respuesta relajatoria
estándar. Para determinar la afinidad de los compuestos, se calculó
la concentración del compuesto de prueba requerida para producir los
efectos medio máximos (EC_{50}), al igual que la respuesta máxima
(calculada como un porcentaje de la respuesta estándar producida
con el SNP).
\vskip1.000000\baselineskip
En estas pruebas, se determinó la afinidad de
los cuatro estereoisómeros separados de AH-13205, y
se representan los resultados en la Figura 4 (los datos se
demuestran como la media \pm desviación estándar para 4
experimentos). El estereoisómero aislado en el pico 1 de la mezcla 1
demostró ser el más potente, teniendo un pKi de 7,1.
Los resultados completos de las pruebas de unión
se representan en la Tabla 5 como valores de pKi:
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de esta Tabla, se puede ver que el Pico
1, ácido de la mezcla 2, es el más selectivo de los
estereoisómeros.
\vskip1.000000\baselineskip
En estas pruebas, se evaluó el efecto de los
estereoisómeros separados y el AH-13205 en la
producción de AMP cíclico mediada por la estimulación del receptor
EP humano. Todos los compuestos mostraron la misma respuesta
máxima, pero su potencia difirió, tal y como se representa en la
Figura 5 y en la Tabla 6 (los datos se representan como la media
\pm desviación estándar para 4 experimentos).
Se mostró la utilización del
AH-13205 para inhibir las contracciones inducidas
eléctricamente en el miometrio humano - los puntos A, B y C se
corresponden con la adición de cantidades cada vez mayores de
AH-13205 (10^{-6} M, 10^{-5} M y 10^{-4} M)
(Figura 6). La potencia del efecto se encontraba de acuerdo con la
interacción en un receptor prostaglandina EP_{2}, pues el
vehículo que contenía el AH-13205 demostró no tener
ningún efecto (Figura 7).
Se investigaron los efectos de los dos
estereoisómeros más potentes (Pico 1, ácido de la Mezcla 1 y Pico
1, ácido de la Mezcla 2), y se compararon con los efectos del
AH-13205. Pico 1, ácido de la Mezcla 1, Pico 1,
ácido de la Mezcla 2 y AH-13205, provocaron todos la
inhibición dependiente de la concentración de la respuesta
provocada por la EFS. Los pEC_{50}s eran de 5,9 \pm 0,2 (n = 7),
5,3 \pm 0,1 (n = 6) y 5,3 \pm 0,2 (n = 7) (Figura 8). No habían
diferencias significativas entre los efectos inhibitorios máximos
observados, con la inhibición de las contracciones inducidas por la
EFS del 56 \pm 5% (Pico 1, ácido de la Mezcla 1), el 57 \pm 2%
(Pico 1, ácido de la Mezcla 2) y el 49 \pm 5%
(AH-13205). El SNP provocó la inhibición adicional
encima de los compuestos, equivalentes al 60% - 70% de la respuesta
EFS de control. El efecto inhibitorio del SNP cambió radicalmente
durante un período de lavado de 60 - 80 minutos pero no cambiaron
los efectos inhibitorios de los compuestos probados.
Además, se investigó el efecto de la
terbutalina, un agonista del \beta-adrenoceptor,
en las contracciones inducidas por la EFS del miometrio, y demostró
no tener ningún efecto inhibitorio significativo sobre las
contracciones provocadas por la EFS (el 98 \pm 5% de la
contracción inducida por la EFS de control en 10^{-4} M, n = 7
donantes).
Los linfocitos son leucocitos mononucleares, que
participan en la respuesta inmune específica a los antígenos
extraños y en la manifestación de enfermedades autoinmunes. Los
linfocitos T producen la IL-2, un factor clave para
la activación y proliferación de linfocitos, en respuesta a la
estimulación de los antígenos mediante el complejo receptor de
células T CD3, y la vía implicada en esta respuesta es la vía
NF-AT. Esta respuesta se puede demostrar in
vitro utilizando anticuerpos monoclonales selectivos con
especificidad a las moléculas CD3 en las células T. Se diseñó un
ensayo de linfocitos para modelar esta respuesta y determinar el
efecto del compuesto de prueba en la producción de la
IL-2 mediante células T estimuladas con
anti-CD3 aisladas de la sangre periférica. El
ensayo utiliza una dosis subóptima de un anticuerpo monaclonal
anti-CD3 (OKT3, 25 ng/ml) inmovilizado en una placa
de 96 pocillos para estimular una respuesta de las células T. El
nivel de IL-2 liberado en los sobrenadantes del
cultivo celular se cuantificó utilizando un ELISA en sándwich
estándar. De modo parecido, se pueden medir también en el mismo
ensayo otras citoquinas tales como el TNF_{\alpha} y el
IFN\gamma. El ensayo se puede prolongar hasta un periodo de tiempo
de 72 horas si se puede observar la proliferación de linfocitos en
respuesta al anticuerpo anti-CD3 y, por lo tanto, se
puede examinar el efecto de los compuestos modulatorios
inmunes.
Los monocitos son fagocitos mononucleares
periféricos que participan en las respuestas inflamatorias. La
producción del TNF_{\alpha} mediante monocitos juega un importante
papel en las respuestas inflamatorias y puede provocar un
considerable daño en los tejidos si el nivel permanece sin control.
La inhibición de la secreción del TNF_{\alpha} mediante monocitos
activados puede proporcionar una terapia atractiva para el
tratamiento de afecciones inflamatorias.
Uno de los activadores microbianos de liberación
del TNF_{\alpha} más potentes es el lipopolisacárido (LPS) y su
respuesta se realiza mediante la vía NF-KB. Se
estableció un ensayo in vitro con 96 pocillos para determinar
los efectos de los compuesto de prueba en la secreción del
TNF_{\alpha} inducido por el LPS mediante monocitos sanguíneos
periféricos humanos. El nivel del TNF_{\alpha} en los
sobrenadantes del ensayo se cuantificó utilizando un ELISA en
sándwich estándar.
Las células mononucleares sanguíneas periféricas
humanas de voluntarios sanos se aislaron del resto de la sangre
mediante la técnica de centrifugación en gradiente de densidad de
Ficoll-Hypaque y adherencia al plástico. Se utilizó
la fracción no adherente de linfocitos para establecer el ensayo de
linfocitos y se recuperaron entonces los monocitos adherentes
mediante raspado y se utilizaron posteriormente en el ensayo de
monocitos.
Se sembraron entonces los linfocitos en una
placa de 96 pocillos precubiertos de anticuerpo monoclonal
anti-CD3 (OKT3) en 25 ng/ml e inmediatamente se
añadieron los compuestos de prueba (Pico 1, ácido de la mezcla 1;
Pico 1, ácido de la mezcla 2; racemato de AH-13205;
PGE_{2}) en diluciones adecuadas a los correspondientes pocillos
según el diseño experimental. La placa se incubó durante 24 horas a
37ºC en una atmósfera con un 5% de CO_{2} y se recuperaron los
sobrenadantes mediante el análisis ELISA al final del período de
incubación. Los niveles de IFN\gamma se evaluaron utilizando el
equipo de ensayo de series de citoquinas humanas de 16 pocillos de
ProteoPlex según las instrucciones del fabricante.
Para la medida de la proliferación de linfocitos
impulsada por los anticuerpos monoclonales anti-CD3
inmovilizados, se estableció el ensayo de la misma forma que para
la medida de la liberación de IL-2, excepto en que
se cultivaron las células durante 72 horas en presencia o ausencia
de los compuestos de prueba. Cuatro horas antes de la finalización
del ensayo de proliferación, se añadió una solución novedosa de
compuesto tetrazolio, suministrada por Promega en el formato del
Equipo de Ensayo de Proliferación Celular, a cada pocillo
individual según las instrucciones del fabricante. La placa se
colocó entonces de nuevo en el incubador para permanecer 4 horas y
la reacción colorimétrica se midió utilizando un espectrofotómetro
y una longitud de onda absorbente de 490 nm (SpectraMax, Molecular
Devices) según las instrucciones del fabricante.
Para el ensayo de monicitos, se introdujeron las
células en placas de 96 pocillos y se pretrataron durante 1 hora a
37ºC/5% de CO_{2} con el compuesto de prueba (Pico 1, ácido de la
mezcla 1; Pico 1, ácido de la mezcla 2; racemato de
AH-13205), seguido por la adición del LPS (100
ng/ml) para iniciar la reacción. Se incubó la placa durante 24
horas y se recuperaron los sobrenadantes para la medida de la
producción de TNF_{\alpha} mediante el ELISA.
Se cortó en pequeñas trozos el parénquima
pulmonar humano y se perfundió con solución tampón de fosfato
salino helada (PBS) para eliminar la sangre y la mucosidad
contaminantes. Se cortaron entonces los tejidos con tijeras en
presencia de Medio Mínimo Fundamental complementado con penicilina,
estreptomicina, L-glutamina y desoxirribonucleasa
(0,25 mg/ml). Se agitaron cuidadosamente los tejidos cortados para
desplazar los macrófagos. Se obtuvo entonces una suspensión cruda
de células mediante la eliminación de los tejidos con un filtro
estéril (150 \mum de tamaño de poro). Se centrifugó la suspensión
de células resultante y se recogieron los gránulos de células. Se
drenaron las células de sangre roja contaminante con solución tampón
de lisis de células rojas y se lavaron dos veces las células
remanentes con PBS mediante centrifugación. Se purificaron entonces
los macrófagos alveolares a partir de esta preparación utilizando
un procedimiento de selección positivo para células que llevan
moléculas CDl4 utilizando un Separador VarioMac® y la respectiva
selección positiva de reactivos y columnas suministradas por
Miltenyi Biotec Ltd según las instrucciones del fabricante.
Para el ensayo, se resuspendieron los macrófagos
alveolares en el medio de cultivo completo compuesto de RPMI1640
complementado con un 10% de suero fetal bovino,
L-glutamina y antibióticos. Se introdujeron entonces
las células en placas de 24 pocillos (4 x 105 células/pocillo) y se
incubaron durante toda una noche a 37ºC en una atmósfera con un 5%
de CO_{2} para permitir la adherencia celular. Se eliminó entonces
el medio agotado de las placas y se enjuagaron las placas
brevemente con medio fresco antes de la adición de las soluciones
de los compuestos de prueba. Se incubaron los compuestos de prueba
con las células durante 30 minutos antes de la adición del LPS de
E. Coli (1 \mug/ml). Se incubaron las placas de ensayo en
una incubadora humidificada a 37ºC en una atmósfera con un 5% de
CO_{2} durante 24 horas. La liberación del TNF_{\alpha} mediante
las células en los sobrenadantes del cultivo se cuantificó mediante
un equipo para el ELISA (Sistema de Desarrollo del ELISA de
TNF_{\alpha} humano DuoSet®), suministrado por R + D Systems
(Europa) según las instrucciones del fabricante. Se incluyó la
indometacina 3 \muM en todos los tratamientos para inhibir la
posible liberación de la prostaglandina E_{2} endógena.
La Figura 9 representa el resultado de la
producción de la IL-2 mediante los tres compuestos
de prueba dados como la media de cuatro donantes (excepto el pico
1, ácido de la mezcla 2 que se ha probado solamente en un donante).
Estos resultados se resumen en la tabla 7.
Estos resultados muestran que los agonistas
EP_{2} inhiben la producción de la IL-2
dependiendo de la concentración mediante las células T activadas
por el OKT3. El orden de las potencias en el ensayo es PGE_{2}
> Pico 1, ácido de la Mezcla 1 > AH-13205
(racemato) según sus respectivos valores de EC_{50}.
La Figura 10 representa el resultado dado como
la media de tres a cinco donantes de producción de la
IL-2 mediante tres agonistas del receptor EP_{2}.
Estos resultados se resumen en la tabla 8.
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\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados muestran que los agonistas
EP_{2} inhiben la producción de la IL-2
dependiendo de la concentración mediante las células T activadas
por el OKT3. El orden de las potencias en el ensayo es PGE_{2}
> butaprost > Pico 1, ácido de la Mezcla 1 según sus
respectivos valores de EC_{50}.
La Figura 11 representa el resultado de dos
donantes de interferón gamma liberado mediante el Pico 1, ácido de
la Mezcla 1. Estos resultados muestran que los agonistas EP_{2}
inhiben dependiendo de la concentración el interferón gamma
liberado.
La Figura 12 representa el resultado dado como
la media de tres donantes de producción de TNF_{\alpha} mediante
tres agonistas del receptor EP_{2}. Estos resultados se resumen en
la tabla 9.
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\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados muestran que los agonistas
EP_{2} inhiben la producción del TNF_{\alpha} dependiendo de la
concentración mediante los linfocitos. El orden de las potencias en
el ensayo es PGE_{2} > butaprost > Pico 1, ácido de la
Mezcla 1 según sus respectivos valores de EC_{50}.
La Figura 13 representa el resultado dado como
la media de tres donantes de proliferación de linfocitos mediante
tres agonistas del receptor EP_{2}. Estos resultados se resumen en
la tabla 10.
Estos resultados muestran que los agonistas
EP_{2} inhiben la proliferación de linfocitos dependiendo de la
concentración. El orden de las potencias en el ensayo es PGE_{2}
> butaprost > Pico 1, ácido de la Mezcla 1 según sus
respectivos valores de EC_{50}.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 14 representa el resultado dado como
la media de tres donantes. Estos resultados se resumen en la tabla
11.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados muestran que los agonistas
EP_{2} inhiben la producción del TNF_{\alpha} dependiendo de la
concentración mediante los monocitos estimulados por LPS. El orden
de las potencias, según sus respectivos valores de EC_{50}, es
Pico 1, ácido de la Mezcla 1 > Pico 1, ácido de la Mezcla 2 >
AH-13205 (racemato).
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 15 representa el resultado dado como
la media de tres donantes. Estos resultados se resumen en la tabla
12.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados muestran que los agonistas
EP_{2} inhiben la producción del TNF_{\alpha} dependiendo de la
concentración mediante los macrófagos. El orden de las potencias,
según sus respectivos valores de EC_{50}, es PGE_{2} > Pico
1, ácido de la Mezcla 1.
\newpage
Figuras 2a y
2b
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Figuras 3a y
3b
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
7
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Figura
8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
11
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
Figura
12
\newpage
Figura
13
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
14
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Figura
15
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto
el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este
respecto.
\vskip1.000000\baselineskip
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\bulletBERNADY, K.F. J. Org.
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[0092]
Claims (11)
1. Compuesto seleccionado a partir de uno de los
siguientes:
o una sal o solvato del
mismo.
2. Ácido
(trans-2-[4-(1-hidroxihexil)-fenil]-5-oxo-ciclopentanoheptanoico,
en el que al menos el 90% en peso se selecciona a partir de una de
las siguientes formas:
o una sal o solvato del
mismo.
3. Ácido
2-[4-(1-hidroxihexil)-fenil]-5-oxo-ciclopentanoheptanoico,
en el que al menos el 80% en peso se encuentra en una de las
siguientes formas:
o una sal o solvato del
mismo.
\newpage
4. Compuesto según cualquiera de las
Reivindicaciones 1 a 3, o una sal farmacéuticamente aceptable del
mismo, para utilizar en un procedimiento de terapia.
5. Composición farmacéutica que comprende un
compuesto según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con un portador o un
diluyente farmacéuticamente aceptables.
6. Utilización de un compuesto según cualquiera
de las Reivindicaciones 1 a 3, o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo en la preparación de un medicamento para el
tratamiento de una afección aliviada por el agonismo de un receptor
EP_{2}.
7. Utilización según la Reivindicación 7, en la
que la afección aliviada por el agonismo de un receptor EP_{2} se
selecciona a partir del grupo consistente en: glaucoma, dismenorrea
y parto prematuro.
8. Utilización de un agonismo de un receptor
EP_{2} según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo en la preparación de un
medicamento para el tratamiento de una afección aliviada por la
inhibición de:
- (i)
- activación de células T humanas (proliferación);
- (ii)
- liberación de IL-2, o
- (iii)
- liberación de IFN\gamma.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Utilización según la Reivindicación 8, en la
que la afección es una afección aliviada por la inhibición de:
- (ii)
- liberación de IL-2, o
- (iii)
- liberación de IFN\gamma.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Utilización de un agonismo de un receptor
EP_{2} según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo en la preparación de un
medicamento para el tratamiento de psoriasis.
11. Compuesto según cualquiera de las
Reivindicaciones 1 a 3, o una sal farmacéuticamente aceptable del
mismo, para utilizar en un procedimiento de tratamiento de una
afección aliviada por el agonismo de un receptor EP_{2}.
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