ES2322974T3

ES2322974T3 - Formulaciones de igf-1 de cargas elevadas y reducidas en liposomas multivesiculares.

Info

Publication number: ES2322974T3
Application number: ES98945974T
Authority: ES
Inventors: Bret A. Shirley; Maninder Hora; Qiang Ye; Nandini Katre; John Asherman
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc; Pacira Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc; Pacira Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1997-09-08
Filing date: 1998-09-08
Publication date: 2009-07-02
Anticipated expiration: 2018-09-08
Also published as: EP1021167A1; AU9310098A; DE69840576D1; PT1021167E; EP1021167A4; ATE422878T1; WO1999012522A1; US6306432B1; JP2001515852A; EP1021167B1

Abstract

Liposoma multivesicular que contiene factor I de crecimiento similar a insulina (IGF-I) y que presenta múltiples cámaras no concéntricas con membranas distribuidas en forma de red continua en la totalidad de las cámaras, obtenible mediante un procedimiento que comprende las etapas de: (a) formar una emulsión de agua en aceite a partir de dos componentes inmiscibles, siendo los dos componentes inmiscibles: (1) un componente lípido que comprende por lo menos un solvente orgánico, por lo menos un lípido anfipático y un lípido neutro sin un grupo de cabeza hidrofílico, y (2) un primer componente acuoso que comprende IGF-I en un intervalo de concentraciones de carga reducida de entre 1 mg/mL y 33 mg/mL, o un intervalo de concentraciones de carga elevada de entre 40 mg/mL y 300 mg/mL; en la que el componente acuoso presenta una osmolaridad comprendida en el intervalo de entre 160 mOsm y 320 mOsm, o de entre 5 mOsm y 150 mOsm; y un pH comprendido en el intervalo de entre 1 y 5, o de entre 2 y 4,8, para intervalos de concentración de carga reducida o elevada, respectivamente; (b) dispersar la emulsión de agua en aceite que contiene el IGF en un segundo componente acuoso para formar esférulas de solvente; y después (c) eliminar el solvente orgánico de las esférulas de solvente para formar los liposomas multivesiculares suspendidos en el segundo componente acuoso.

Description

Formulaciones de IGF-I de cargas elevadas y reducidas en liposomas multivesiculares.

La presente invención se refiere a vehículos de liberación lenta para administrar un agente biológicamente activo. Más particularmente, la presente invención se refiere a liposomas multivesiculares que contienen IGF-I.

Las proteínas que son rápidamente eliminadas de la circulación tras inyecciones intravenosas o subcutáneas necesitan administrarse rápidamente con el fin de mantener los niveles sanguíneos terapéuticos. Una de las proteínas que necesita la administración frecuente para resultar beneficiosa terapéuticamente es el factor I de crecimiento similar a insulina (IGF-1). La proteína IGF-I circulante madura, de 7,65 kD, consiste de dominios B y A (homólogos de las cadenas B y A de la insulina). Al contrario que la insulina, los dominios B y A de las IGFs se encuentran conectados mediante un péptido C, y contienen una extensión de ocho aminoácidos en el extremo C-terminal, denominada dominio D.

La IGF-I nativa contiene tres enlaces disulfuro que implican los residuos siguientes: CysB6-CysB7, CysA6-
CysAII, y CysB18-CysA20. Bajo condiciones reductoras, estos enlaces disulfuro se rompen y pueden "desordenarse" durante el replegamiento oxidativo en soluciones desnaturalizantes, rindiendo dos isómeros disulfuro alternativos con estructuras terciarias diferentes (L.O. Narhi et al., Biochemistry 32:5214-5221, 1993).

Es conocido que IGF-I presenta múltiples actividades biológicas. Aquéllas con potencial terapéutico son su actividad en la reversión del catabolismo en estados de ayuno, enfermedad severa o lesión, en la potenciación de la cicatrización de heridas y la regeneración nerviosa, y en la reducción de la resistencia a la insulina en los diabéticos. También es conocido que IGF-I estimula generalmente el crecimiento y el mantenimiento del tejido nervioso, incrementa la incorporación de glucosa por parte de las células y estimula la función renal. La desnutrición crónica y la diabetes mal controlada en los jóvenes se asocia con niveles circulantes de IGF-I más bajos y con retraso del crecimiento.

El tratamiento óptimo con IGF-I puede requerir que el nivel de fármaco se mantenga a un nivel especificado durante un periodo de tiempo prolongado. Por ejemplo, el tratamiento óptimo de la dependencia de insulina en los diabéticos puede requerir el mantenimiento de un nivel relativamente elevado de IGF-I durante un periodo de varios días.

Para ciertos otros usos terapéuticos, por ejemplo el tratamiento de la desnutrición y la osteoporosis, resultaría beneficioso un nivel reducido de IGF-I a lo largo de un periodo de varios días.

Un enfoque que se ha utilizado para proporcionar composiciones de liberación controlada para la administración de fármaco es el encapsulamiento en liposomas. Entre los tipos principales de liposoma, los liposomas multivesiculares (Kim et al., Biochim. Biophys. Acta. 728:339-348, 1983) son únicos y diferentes de los liposomas unilamelares (Huang, Biochemistry 8:334-352, 1969; Kim et al., Biochim. Biophys. Acta. 646:1-10, 1981), de los liposomas multilamelares (Bangham et al., J. Mol. Biol. 13:238-252, 1965) y de los liposomas plurilamelares estables (patente US No. 4.522.803). En contraste con los liposomas unilamelares, los liposomas multivesiculares contienen múltiples cámaras acuosas. En contraste con los liposomas unilamelares, las cámaras acuosas múltiples de los liposomas multivesiculares son no concéntricas, con membranas distribuidas en forma de red en la totalidad de las cámaras.

En los liposomas multivesiculares, la eficiencia de encapsulamiento de algunas moléculas pequeñas, tales como el arabinósido de citosina, es relativamente reducida, y la tasa de liberación de las moléculas encapsuladas en los líquidos biológicos es más rápida que lo terapéuticamente deseable, a menos que la osmolaridad del primer componente acuoso se ajuste para controlar la tasa de liberación. La patente EP 0 280 503 B1 da a conocer el coencapsulamiento de un hidrocloruro, tal como el ácido hidroclórico, con un agente activo para controlar la tasa de liberación del agente activo. Otra investigación, dada a conocer en la patente WO 95/13796, ha demostrado que la tasa de liberación de agentes a partir de liposomas multivesiculares en el plasma humano también puede controlarse mediante la introducción de un ácido no clorhídrico en la solución acuosa en la que el agente se disuelve antes de formar el liposoma multivesicular. También es conocido (patente WO 96/08253) el control de la tasa de liberación de agentes activos mediante la introducción de otros tipos de solutos denominados "espaciadores osmóticos" en la solución acuosa en la que se disuelve el agente activo antes de formar los liposomas multivesiculares.

Además del agente biológicamente activo y los ácidos o espaciadores osmóticos destinados al control de la tasa de liberación del agente biológicamente activo a partir de los liposomas, es práctica común coencapsular con los compuestos de agente activo destinados a servir cualquiera de entre varias funciones adyuvantes. Por ejemplo, determinados compuestos biológicamente activos conservan actividad únicamente al almacenarlos a un pH particular. De esta manera, con frecuencia se encapsulan por necesidad ácidos o tampones además del agente activo, para controlar el pH del ambiente del fármaco. En otros casos se incorpora un contraión para incrementar la solubilidad de un agente biológicamente activo que presenta solubilidad reducida.

De esta manera, existe la necesidad de nuevas formulaciones de liberación lenta de carga elevada y de carga reducida de IGF-I que presenten la bioactividad del fármaco libre en un vehículo adecuado como depósito de fármaco de liberación lenta. Debido a que IGF-I es un fármaco caro, sea en una forma que ha sido purificada a partir de muestras biológicas o sea de producción recombinante, también existe una necesidad de conseguir estos objetivos manteniendo simultáneamente la eficiencia de encapsulamiento a un nivel tan elevado como resulte posible para evitar la pérdida de agentes activos caros.

La presente invención proporciona un procedimiento para obtener formulaciones de carga elevada y de carga reducida de IGF-I en liposomas multivesiculares (MVLs) en un medio de suspensión acuoso y formulaciones de MVL que contienen las mismas. Las formulaciones de carga reducida se obtienen mediante la utilización durante la fabricación de un primer componente acuoso que comprende una concentración de IGF-I disuelto de entre aproximadamente 1 mg/mL y aproximadamente 33 mg/mL, por ejemplo de entre aproximadamente 5 mg/mL y aproximadamente 20 mg/mL. El primer componente acuoso utilizado durante la preparación de las formulaciones de carga reducida además puede contener uno o más excipientes osmóticos, tales como sacarosa, y una cantidad suficiente de uno o más agentes de ajuste del pH, tales como citrato amónico dibásico, para mantener el pH dentro del intervalo de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 5.

Las formulaciones de carga elevada generalmente se obtienen mediante la utilización durante la fabricación de un primer componente acuoso que contiene una concentración de IGF-I disuelto de entre aproximadamente 40 mg/mL y aproximadamente 300 mg/mL, por ejemplo entre aproximadamente 100 mg/mL y aproximadamente 160 mg/mL. El primer componente acuoso en la formulación de carga elevada contiene además un agente de ajuste del pH, tal como ácido cítrico o citrato amónico dibásico, en cantidad suficiente para mantener el pH dentro del intervalo de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 4,8, y un excipiente osmótico, tal como sacarosa.

Las formulaciones tanto de carga elevada como de carga reducida pueden diluirse adicionalmente mediante la adición de medio de suspensión u otro portador biológicamente aceptable para obtener formulaciones de depósito de liberación lenta inyectables o implantables de cualquier dosis total terapéuticamente eficaz.

Los procedimientos para preparar MVLs son bien conocidos de la técnica y se describen en las patentes US Nos. 5.455.044, 5.576.018, 5.993.850, 5.807.572, 6.132.766 y 5.931.809. El procedimiento general para preparar liposomas multivesiculares les proporciona sus propiedades características, incluyendo las propiedades de liberación modulada de sustancias biológicamente activas encapsuladas. En el presente procedimiento, en primer lugar se prepara una emulsión de "agua en aceite" que contiene la sustancia biológicamente activa que debe encapsularse, mediante la disolución de por lo menos un lípido anfipático y por lo menos un lípido neutro en un solvente orgánico volátil para el componente lípido, añadiendo al componente lípido un primer componente acuoso inmiscible y emulsionando la mezcla. Puede añadirse un ácido clorhídrico o no clorhídrico a cualquiera de entre el primer componente acuoso y el componente lípido o a ambos, para controlar la liberación del agente activo a partir de los MVLs. En este procedimiento general, la sustancia biológicamente activa que debe encapsularse puede contenerse en el primer componente acuoso o en el componente lípido, o en ambos.

A continuación, se mezcla la emulsión de agua en aceite completa con el segundo componente acuoso, y se agita mecánicamente, tal como anteriormente, para formar esférulas de solvente suspendidas en el segundo componente acuoso. Las esférulas de solvente contienen múltiples gotitas acuosas con la sustancia que debe encapsularse disuelta en las mismas. En la etapa final, el solvente orgánico volátil se elimina de las esférulas, por ejemplo mediante evaporación. Tras eliminar por completo el solvente, se forman liposomas multivesiculares. Entre los gases representativos satisfactorios para la utilización en la evaporación del solvente se incluyen nitrógeno, helio, argón, oxígeno, hidrógeno y dióxido de carbono. Alternativamente, el solvente orgánico puede eliminarse mediante burbujeo, evaporación rotatoria o membranas selectivas de solvente. Las partículas de liposomas multivesicular seguidamente se suspenden en un medio acuoso para su almacenamiento y utilización.

En la presente invención, el presente procedimiento general se modifica en determinados casos clave, para obtener las formulaciones de MVL de carga elevada y de carga reducida de IGF-I. En particular, la composición del primer componente acuoso se modula para controlar la carga de IGF-I en el producto final. Además, IGF-I se disuelve en el primer componente acuoso, más que disolverse en el componente lípido, y, de mayor importancia, se ajusta la osmolaridad del componente acuoso en el que se disuelve el agente activo para su encapsulamiento, con el fin de controlar la carga del agente biológicamente activo, en el mismo.

Se ha descubierto una relación inversa entre la osmolaridad y la carga de fármaco, incrementándose la carga de IGF-I a medida que la osmolaridad del componente acuoso utilizado durante la preparación de las MVLs se reduce, y viceversa. De esta manera, el parámetro clave que se manipula durante la preparación de las MVLs con carga elevada o con carga reducida de IGF-I es la osmolaridad de la primera solución acuosa que contiene fármaco utilizada durante el proceso de fabricación. En la presente invención, la osmolaridad de la solución acuosa se ajusta mediante la disolución de un excipiente osmótico, tal como sacarosa o glicilglicina, en la misma, con una concentración más alta de excipiente osmótico conduciendo a una carga más reducida del agente activo, y viceversa. Al utilizar sacarosa como excipiente osmótico, para las formulaciones de carga reducida, la concentración de sacarosa en el primer componente acuoso durante la preparación es de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 7 por ciento en peso por volumen (% p/v), mientras que para las formulaciones de carga elevada, la concentración de sacarosa se encuentra comprendida en el intervalo de entre cero y aproximadamente 2,5 por ciento en peso por volumen.

Los solicitantes también han descubierto un segundo parámetro que debe tomarse en consideración al determinar la composición del primer componente acuoso durante la preparación de las formulaciones de IGF-I de la presente invención. La concentración de IGF-I en solución en el primer componente acuoso durante la preparación es directamente proporcional a la cantidad de IGF-I que puede cargarse en cualquier formulación dada. Sin embargo, la solubilidad de IGF-I en solución acuosa cae drásticamente a un pH de aproximadamente 5. La figura 1 muestra la solubilidad de una concentración aproximada de 120 mg/mL de IGF-I en citrato amónico 20 mM en 5 por ciento en peso por volumen de sacarosa en el intervalo de pH de 4,5 a 5,5. Algunos estudios adicionales han demostrado que puede solubilizarse hasta aproximadamente 300 mg/mL de IGF-I a un pH inferior a 5. De esta manera, para obtener y mantener suficiente IGF-I en solución en la primera solución acuosa, también se añade un tampón o ácido a la misma durante la preparación para garantizar una concentración suficientemente elevada de IGF-I disuelto en el primer componente acuoso para obtener un producto MVL final que contenga la carga deseada de fármaco. Para las formulaciones de carga reducida, el pH del primer componente acuoso generalmente se ajusta a un valor comprendido en el intervalo de entre 1 y aproximadamente 5, mientras que para las formulaciones de carga elevada el intervalo de pH se encuentra comprendido entre 2 y 4,8.

Debido a que todos los solutos en la primera solución acuosa, incluyendo el tampón, u otro agente de ajuste del pH, contribuyen a su osmolaridad, debe equilibrarse la cantidad del excipiente osmótico y del agente de ajuste del pH para mantener la solubilidad del fármaco en el producto final, permitiendo simultáneamente la carga de la concentración deseada del fármaco. Tal como apreciará el experto en la materia, una parte de los excipientes osmóticos, incluyendo el tampón, pasará a través de las membranas permeables de las vesículas, de manera que la osmolaridad del componente acuoso en el producto final no será generalmente igual a la osmolaridad del primer componente acuoso utilizado en el momento de la fabricación.

En una realización de la invención se obtienen formulaciones de MVL de carga reducida IGF-I mediante la utilización de un primer componente acuoso que contiene entre aproximadamente 9 mg/mL y aproximadamente 16 mg/mL de IGF-I, 3 a 7% p/v de sacarosa como excipiente osmótico y citrato amónico dibásico 20 mM, pH 4,5 a 5,5, como tampón para mantener el pH del componente acuoso dentro del intervalo necesario para garantizar que IGF-I permanecerá en solución, aunque sin riesgo de desnaturalizar la proteína. La osmolaridad correspondiente del primer componente acuoso se encuentra comprendida dentro del intervalo de entre aproximadamente 130 y aproximadamente 290 mOsm. En otra realización, en el intervalo de pH de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 5, en el caso de que la concentración de IGF-I se encuentre comprendida en el intervalo de entre aproximadamente 1 mg/mL y aproximadamente 33 mg/mL, el primer componente acuoso contiene suficiente de un excipiente osmótico para llevar su osmolaridad a un valor comprendido dentro del intervalo de entre aproximadamente 160 mOsm y aproximadamente 320 mOsm. En todos los casos el extremo inferior del intervalo de osmolaridad correspondiente al extremo superior del intervalo de concentración de fármaco.

Las formulaciones de MVL de carga elevada de IGF-I se obtienen mediante la utilización de un primer componente acuoso durante la preparación, que comprende entre aproximadamente 40 y aproximadamente 300 mg/mL, por ejemplo, entre aproximadamente 20 y aproximadamente 80 mg/mL de IGF-I, una cantidad suficiente de un agente de ajuste del pH para mantener el pH dentro del intervalo de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 4,8, y cantidad suficiente de un excipiente osmótico para llevar la osmolaridad a un nivel comprendido en el intervalo de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 150 mOsm, correspondiendo el extremo inferior del intervalo de osmolaridad al extremo superior del intervalo de concentraciones de fármaco. En una realización, el excipiente osmótico es entre cero y aproximadamente 2,5 en peso por volumen de sacarosa y se utiliza ácido cítrico 25 mM como el agente de ajuste del pH.

Para mantener una eficiencia de encapsulamiento (o rendimiento en porcentaje) elevada durante la formulación de los MVLs y garantizar que la liberación del agente activo durante la utilización se produce a una tasa terapéuticamente eficaz lenta, el componente lípido contiene uno o más lípidos anfipáticos que presentan entre aproximadamente 13 y aproximadamente 28, por ejemplo entre aproximadamente 18 y 22 carbonos en la cadena de carbonos del mismo.

En otra realización, se proporciona una formulación de liposomas multivesiculares de carga elevada que contiene entre aproximadamente 50 mg/mL y aproximadamente 80 mg/mL de IGF-I. La formulación comprende una suspensión acuosa de un liposoma multivesicular que comprende IGF-I en un componente acuoso, un lípido anfipático que contiene entre aproximadamente 18 y 22 carbonos en la cadena de carbonos; y un lípido neutro que no presenta un grupo de cabeza hidrofílico. La formulación puede contener menos de 2 por ciento de IGF-I en la suspensión acuosa en una base de peso por volumen.

También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden un liposoma multivesicular preparado mediante el procedimiento de la presente invención, en el que el medio de suspensión que además comprende un portador fisiológicamente aceptable y la cantidad total del IGF-I en la composición es una dosis terapéuticamente eficaz.

Se ha descubierto que la modulación de la carga de IGF-I en los liposomas multivesiculares (MVLs), particularmente para conseguir una carga elevada de fármaco, puede conseguirse sin sacrificar la eficiencia de encapsulamiento elevada en el procedimiento de preparación ni la liberación controlada deseable de fármaco a partir del producto final durante la utilización. La carga de fármaco en los MVLs se modula mediante el control de la osmolaridad del primer componente acuoso utilizado durante la preparación de los MVLs. La osmolaridad es la suma de las concentraciones molares de los solutos presentes en una solución acuosa. Si el soluto se encuentra presente en una forma disociada, ionizada o agregada, la osmolaridad se define como la suma de las concentraciones molares de las formas disociadas, ionizadas o agregadas. Los solutos que contribuyen a la osmolaridad de una solución acuosa incluyen IGF-I y excipientes osmóticos que deben encapsularse durante la preparación de los MVLs. La contribución de la osmolaridad de una solución realizada por cualquier soluto en la solución es aproximadamente equivalente a la concentración en peso del soluto en la solución (por ejemplo mg/mL) dividido por su peso molecular. De esta manera, a modo de principio general, para una concentración en peso dada, cuanto mayor sea el peso molecular de un soluto, menor es la osmolaridad del mismo, y menor es la contribución de ese soluto a la osmolaridad total de la solución. También resulta posible reducir la osmolaridad del primer componente acuoso mediante la reducción de la concentración del agente activo. Este procedimiento conduce a una menor carga de IGF-I si la concentración de otros solutos en el primer componente acuoso permanece constante.

La carga de fármaco es la concentración de fármaco por unidad de volumen encapsulado de liposomas. Se ha descubierto una correlación inversa entre la osmolaridad de la primera solución acuosa utilizada en la preparación de los MVLs, y la cantidad de IGF-I que puede cargarse en las vesículas. Por lo tanto, los solutos diferentes de IGF-I presentes en la primera solución acuosa utilizada durante la preparación de los liposomas tienden a reducir la cantidad de IGF-I que puede cargarse en los liposomas. Para incluir este resultado, en la presente invención deben equilibrarse los efectos beneficiosos de los excipientes osmóticos adyuvantes, tales como el tampón utilizado para mantener la solubilidad del IGF-I durante la preparación y en los MVLs de producto, frente al efecto adverso que se produce tras la carga del fármaco atribuible a los excipientes osmóticos. Este problema resulta particularmente agudo al preparar las formulaciones de carga elevada.

En los Ejemplos de la presente invención, el efecto inverso de la osmolaridad sobre la carga de fármaco (es decir, el encapsulamiento de fármaco por unidad de volumen encapsulado) y el procedimiento para modular la carga de fármaco mediante el ajuste de la osmolaridad de la solución acuosa que contiene fármaco antes del encapsulamiento se ha ilustrado en formulaciones de MVL tanto de carga elevada como reducida de IGF-1. Los resultados de estos estudios demuestran que pueden producirse formulaciones de MVL que presentan un amplio intervalo de cargas de IGF-I.

Durante la preparación de liposomas multivesiculares que presentan una carga controlada de IGF-I, se ajusta la osmolaridad de la primera solución acuosa para obtener un nivel terapéuticamente eficaz de carga de fármaco para el uso destinado, de la manera siguiente. Se mezcla un componente lípido que contiene por lo menos un lípido anfipático y un lípido neutro disuelto en uno o más solventes orgánicos, con un primer componente acuoso inmiscible. El primer componente acuoso contiene el IGF-I, un excipiente osmótico opcional, y una cantidad de ajuste de pH de un ácido o tampón. En una realización, en las formulaciones de carga elevada, el tampón puede ser ácido cítrico, generalmente ácido cítrico 25 mM, mientras que en las formulaciones de carga reducida, el tampón puede ser citrato amónico dibásico, generalmente citrato amónico dibásico 20 mM, ajustado a pH aproximadamente 5 con ácido cítrico. La carga del agente activo en la formulación final depende de la concentración de fármaco disuelto, así como de la osmolaridad global de dicho primer componente acuoso, que es la suma de la osmolaridad contribuida por cada uno de los solutos disueltos en el primer componente acuoso, incluyendo el IGF-I, el excipiente osmótico y el agente de ajuste del pH.

Tras ajustar la osmolaridad del primer componente acuoso para conseguir la carga deseada del agente activo en el producto final, se forma una emulsión de agua en aceite mediante la mezcla de los dos componentes inmiscibles. A continuación, se mezcla la emulsión de agua en aceite en un segundo componente acuoso inmiscible para formar esférulas de solvente. El solvente orgánico finalmente se elimina de las esférulas de solvente, por ejemplo mediante evaporación, causando que se agreguen en MVLs. En la etapa final del procedimiento, las MVLs se suspenden en un medio acuoso, tal como solución salina normal. La cantidad total de agente activo en la formulación en una base de peso por volumen de formulación puede ajustarse a cualquier nivel deseado incrementando o reduciendo el volumen del medio en el que se suspenden las MVLs.

Existen por lo menos tres tipos de liposoma. La expresión "liposomas multivesiculares (MVL)" tal como se utiliza en toda la especificación y reivindicaciones se refiere a vesículas artificiales microscópicas que comprenden membranas de lípidos que circundan múltiples cámaras acuosas no concéntricas con membranas distribuidas en forma de red en la totalidad de la cámaras (ver Kim et al., Biochem. Biophys. Acta 728:339-348, 1983).

La expresión "esférula de solvente" tal como se utiliza en toda la especificación y reivindicaciones se refiere a una gotita esferoide microscópica de solvente orgánico, dentro de la que se encuentran múltiples gotitas más pequeñas de solución acuosa. Las esférulas de solvente se suspenden y se sumergen totalmente en una segunda solución acuosa.

La expresión "lípido neutro" se refiere a un aceite o grasa sin capacidad de formar membranas por sí misma y que carece de un grupo "de cabeza" hidrofílico.

La expresión "lípido anfipático" se refiere a una molécula que presenta un grupo "de cabeza" hidrofílico y un grupo "de cola" hidrofóbico y que presenta capacidad de formar membranas.

La expresión "lípido zwiteriónico" se refiere a un lípido anfipático con una carga neta de cero a pH 7,4.

La expresión "lípido aniónico" se refiere a un lípido anfipático con una carga neta negativa a pH 7,4.

La expresión "lípido catiónico" se refiere a un lípido anfipático con una carga neta positiva a pH 7,4.

Para preparar liposomas multivesiculares resulta necesario incluir en el componente lípido por lo menos un lípido anfipático y un lípido neutro. Los lípidos anfipáticos pueden ser lípidos zwiteriónicos, aniónicos o catiónicos. Son ejemplos de lípidos anfipáticos zwiteriónicos: fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas, esfingomielinas, etc. Son ejemplos de lípidos anfipáticos aniónicos: fosfatidilgliceroles, fosfatidilserinas, fosfatidilinositoles, ácidos fosfatídicos, etc. Son ejemplos de lípidos anfipáticos catiónicos: diacil-trimetilamoniopropano y etilfosfatidilcolina. Ejemplos de lípidos neutros incluyen diglicéridos, tales como dioleina, dipalmitoleína y diglicéridos caprilina-caprina mixtos; triglicéridos, tales como trioleina, tripalmitoleina, trilinoleina, tricaprilina y trilaurina; aceites vegetales, tales como aceite de soja; escualeno; tocoferol; y combinaciones de los mismos. Además, puede utilizarse colesterol o esteroles vegetales en la preparación de liposomas multivesiculares.

Tal como se utiliza en la presente invención, la expresión "biológicamente activo", al utilizarla para describir IGF-I o cualquier otro agente presente en las cámaras del liposoma multivesicular, incluye agentes que presentan actividad biológica focalizada en el tratamiento de un estado de enfermedad particular, sea en la forma liberada a partir de las vesículas MVL, o en una forma que se active tras la liberación a partir de la cámara de una vesícula, tal como un profármaco que se convierte, tras interaccionar con una enzima, en un grupo activo con actividad terapéutica.

La expresión "excipiente osmótico" se refiere a cualquier molécula de soluto biológicamente compatible, en una solución acuosa, que no es el agente biológicamente activo. Tanto los electrolitos como los no electrolitos funcionan como excipientes osmóticos. Para determinar si una molécula particular funcionará como excipiente osmótico o para determinar la concentración de excipiente osmótico encapsulado dentro de un liposoma multivesicular, debe considerarse si, bajo las condiciones internas del liposoma multivesicular (por ejemplo el pH), la molécula se encuentra total o parcialmente ionizada y si dichos iones permean a través de la membrana lipídica (The Biomolecular Lipid Bilayer Membrane, Mahendra K. Jain, van Nostrand Reinhold Co., 1972, 470 páginas). El experto en la materia apreciará que, para la utilización en la presente invención, el excipiente osmótico debe seleccionarse para evitar los agentes que resultarían tóxicos o perjudiciales de otro modo para un sujeto sometido a terapia mediante la utilización de los MVLs de la presente invención. Los expertos en la materia podrán evaluar fácilmente la conveniencia de un excipiente osmótico dado para la utilización en la presente invención sin recurrir a experimentación indebida.

Determinados excipientes osmóticos presentan actividad biológica inherente, y muchos facilitan la actividad biológica del agente biológicamente activo. Por ejemplo, pueden coencapsularse iones de calcio como contraiones para incrementar la vida de almacenamiento o para facilitar la bioactividad de un fármaco, pero no resultan suficientes para conseguir la utilidad terapéutica u otra utilidad de la formulación de MVL. Además, también pueden encontrarse presentes diversos estabilizadores. Determinados agentes comúnmente clasificados como excipientes de hecho pueden presentar actividad biológica directa de muy leve a bastante significativa. Por ejemplo, el excipiente común manitol también puede actuar biológicamente como diurético. Incluso el agua puede actuar biológicamente curando la deshidratación, aunque, en el caso de que estos compuestos se utilicen como excipientes osmóticos, son relativamente intercambiables con otros que llevan a cabo la misma función adyuvante.

Entre los excipientes osmóticos útiles se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, glucosa, sacarosa, trehalosa, succinato, ciclodextrina, arginina, galactosa, manosa, maltosa, manitol, glicina, lisina, citrato, sorbitol, dextrano y combinaciones adecuadas de los mismos, y pueden utilizarse para formar liposomas multivesiculares y para modular la carga de fármaco del agente encapsulado de liposomas multivesiculares. La Tabla 1 a continuación compara la osmolaridad de soluciones de sacarosa y glicilglicina a diferentes concentraciones.

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TABLA 1

1

Entre los agentes modificadores del pH útiles se incluyen, aunque sin limitarse a los ácidos orgánicos, tales como los ácidos cítrico, tartárico, maleico, glucónico, glucurónico y succínico, y ácido fosfórico.

Tal como se utiliza en la presente invención la expresión "cantidad o nivel terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de un agente biológicamente activo necesaria para inducir un efecto farmacológico deseado. La cantidad puede variar mucho según la efectividad de un agente activo particular, la edad, el peso y la respuesta del huésped individual, así como de la naturaleza y severidad de los síntomas del huésped. Por consiguiente, no existe ningún límite superior o inferior a la cantidad del agente activo. El experto en la materia podrá determinar fácilmente la cantidad terapéuticamente eficaz que debe utilizarse en la presente invención.

Tal como se utiliza en la presente invención, la expresión "carga de fármaco" se refiere, en un sentido cuantitativo general, a la cantidad del agente biológicamente activo cargado en el producto suspensión de MVL en comparación con formulaciones similares. Por lo tanto, es una medida de la cantidad de agente activo disponible en una unidad de volumen de formulación de MVL que debe administrarse en el paciente durante la utilización. Más particularmente, la expresión "carga de fármaco" se refiere a la proporción de fármaco por unidad de volumen de suspensión de liposomas y el porcentaje de volumen encapsulado en los liposomas mismos. Es aproximadamente igual a la concentración del agente activo en la suspensión de MVL dividido por el lipocrito de la suspensión, para el fármaco libre de porcentaje reducido.

100

Tal como se utiliza en la presente invención, la expresión "porcentaje de encapsulamiento de fármaco, o de otro compuesto" se refiere a la proporción entre la cantidad de compuesto que debe encapsularse en la suspensión final del procedimiento de preparación de liposomas y la cantidad total de compuesto que debe encapsularse utilizada en la primera solución acuosa del procedimiento, multiplicada por 100.

101

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "lipocrito", que se define análogamente al hematocrito, se refiere a la proporción entre el volumen ocupado por los liposomas y el volumen de suspensión total, multiplicado por 100.

102

Tal como se utiliza en la presente invención, la expresión "porcentaje de fármaco libre" se refiere a la proporción entre la cantidad de fármaco exterior a los liposomas en la suspensión final de liposomas y la cantidad total de fármaco en la suspensión final (el producto final), multiplicado por 100.

103

Los procedimientos para determinar estos parámetros se ilustran en el Ejemplo 7 de la presente solicitud.

En general, el límite inferior de osmolaridad para el primer componente acuoso puede ser próximo a cero, que es el caso del agente biológicamente activo encapsulado sin ningún excipiente osmótico. Esto resulta especialmente cierto si el agente activo es una proteína de elevado peso molecular u otra macromolécula. Por otra parte, la osmolaridad del primer componente acuoso puede ser de hasta aproximadamente 1.000 mOsm, o superior, sin efecto tóxico debido a que muchos de los excipientes pueden salir del liposoma durante el procedimiento de preparación. Sin embargo, generalmente la osmolaridad del primer componente acuoso se encuentra comprendida dentro del intervalo de entre aproximadamente 5 mOsm y aproximadamente 320 mOsm.

La osmolaridad del componente acuoso encapsulado en el producto liposómico final es generalmente isotónica respecto a la del medio de suspensión, el ambiente acuoso fisiológicamente relevante en el que se almacenan los MVLs (tal como solución salina al 0,9% en peso) o en el que se introducen (tanto in vitro como in vivo). Sin embargo, la osmolaridad del componente acuoso en el producto de MVL final también puede ser hipertónica con respecto al ambiente acuoso fisiológicamente relevante, para proporcionar una reducción óptima de la tasa de liberación del agente biológicamente activo de los liposomas. Por lo tanto, se encuentra contemplado dentro del alcance de la presente invención que el componente acuoso en el producto MVL pueda ser hipotónico, isotónico o hipertónico con respecto al medio de almacenamiento o al ambiente acuoso en el que debe liberarse el agente biológicamente activo.

Debido a que la osmolaridad de la solución salina normal es similar a la del plasma humano y otros ambientes in vivo, tal como el líquido cerebroespinal, el líquido sinovial y los espacios subcutáneos e intramusculares, la solución salina puede utilizarse como modelo predictivo de la liberación de fármaco de MVL en dichos ambientes. Debido a que el uso preferente de los MVLs de la invención es para la inyección o implante in vivo en tejidos o cavidades corporales (por ejemplo como depósitos de fármaco), habitualmente se almacenan en un medio tal como solución salina normal, solución salina tamponada con fosfato u otro medio osmóticamente similar.

Con el fin de garantizar la liberación sostenida durante la utilización y la eficiencia de encapsulamiento durante la preparación, el componente lípido puede comprender uno o más lípidos anfipáticos que presentan entre aproximadamente 13 y aproximadamente 28 carbonos, por ejemplo entre aproximadamente 18 y 22 carbonos. Esta regla general se mantiene tanto si la cadena de carbonos del lípido anfipático es saturada como si contiene uno o más dobles enlaces. Sin embargo, generalmente durante la selección de los lípidos que deben utilizarse al formular un liposoma multivesicular debe tenerse en cuenta que resulta posible utilizar un solvente orgánico con un punto de ebullición más bajo al utilizar un lípido con un número dado de carbonos en la cadena de carbonos, si el lípido contiene por lo menos un doble enlace en la cadena de carbonos. Los efectos beneficiosos sobre la eficiencia de encapsulamiento y la liberación sostenida del agente biológicamente activo que debe obtenerse mediante la utilización de dichos lípidos anfipáticos de cadena larga durante la preparación de los MVLs se dan a conocer en la patente US copendiente No. 5.997.899, titulada "Method for Producing Liposomes With Increased Percent of Compound Encapsulated".

A continuación se proporciona una lista representativa de los lípidos anfipáticos de cadena larga útiles en la práctica de la presente invención. Esta lista es ilustrativa y no pretende en modo alguno limitar el alcance de la invención. También se encuentran incluidas las abreviaturas utilizadas para referirse a los fosfolípidos en la presente solicitud y en la literatura científica.

DEPC o DC22:1PC = 1,2-dierucoil-sn-glicero-3-fosfocolina

DOPC o DC18:1P = 1,2dioleil-sn-glicero-3-fosfocolina

DLPC o DC12:0PC = 1,2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfocolina

DMPC o DC14:0PC = 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina

DPPC o DC16:0PC = 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina

DSPC o DC18:0PC = 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina

DAPC o DC10:0PC = 1,2-diaraquidoil-sn-glicero-3-fosfocolina

DBPC o DC22:0PC = 1,2-dibehenoil-sn-glicero-3-fosfocolina

DC16:1PC = 1,2-dipalmitoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina

DC20-1PC = 1,2-dieicosenoil-sn-glicero-3-fosfocolina

DC22:1PC = 1,2-dierucoil-sn-glicero-3-fosfocolina

DPPG = 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol

DOPG = 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol

Los lípidos anfipáticos preferentes para la utilización en la preparación de liposomas multivesiculares de la presente invención son DOPC y DEPC, lípidos de origen natural.

Las formulaciones de carga elevada de IGF-I obtenidas mediante el procedimiento de la presente invención resultan particularmente útiles en la industria farmacéutica para reducir la cantidad de formulación de liposoma que debe administrarse en un sujeto (por ejemplo intramuscular o subcutáneamente) para conseguir una concentración terapéutica deseada de fármaco en el flujo sanguíneo. También resultan útiles para reducir el número de ocasiones en las que debe administrarse IGF-I para alcanzar un nivel terapéutico sostenido de fármaco en el paciente. El límite útil superior sobre la cantidad de fármaco encapsulada en un volumen dado de suspensión de liposoma también puede estar dictada por el lipocrito de la suspensión. Tal como apreciará un experto en la materia, puede resultar difícil inyectar una suspensión que contiene liposomas si el lipocrito de la suspensión es excesivamente elevado. Para la administración sistémica, el intervalo de dosis de IGF-I en los liposomas multivesiculares apropiada para la utilización in vivo en el ser humano de la presente invención incluye el intervalo de entre aproximadamente 0,01 mg/kg y aproximadamente 100 mg/kg de masa corporal magra, o más, dependiendo de la indicación terapéutica. Por ejemplo, en el tratamiento de la diabetes o ALS, se selecciona el extremo superior del intervalo de dosis. Sin embargo, para la inyección o administración local, se seleccionaría el extremo inferior del intervalo de dosis sistémica.

Pueden diluirse adicionalmente las formulaciones tanto de carga elevada como de carga reducida para obtener una formulación de depósito de liberación lenta inyectable de cualquier dosis total terapéuticamente efectiva mediante la adición de medio de suspensión o cualquier portador fisiológicamente aceptable. Entre los portadores adecuados comunes se incluyen las soluciones acuosas o no acuosas, la suspensiones y las emulsiones. Son ejemplos de soluciones no acuosas: propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Entre los portadores acuosos se incluyen agua, soluciones alcohólicas-acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo solución salina y medios tamponados. Entre los vehículos parenterales se incluyen solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y solución de Ringer lactato. Entre los vehículos intravenosos se incluyen reabastecedores de líquidos y de nutrientes, reabastecedores de electrolitos (tales como aquellos basados en dextrosa de Ringer) y similares. También pueden encontrarse presentes conservantes y otros aditivos, tales como antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes (ver Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, A. Oslo, editor, Mack, Easton, PA, 1980).

Las composiciones de IGF-I en MVL conservan sustancialmente bioactividad completa y pueden administrarse mediante cualquier vía deseada; por ejemplo intratumoral, intraarticular (en articulaciones), intraocular, intramuscular, intratecal, intraperitoneal, subcutánea, intravenosa, intralinfática, oral y submucosal. Los liposomas multivesiculares pueden modificarse utilizando procedimientos bien conocidos de la técnica mediante la unión a los mismos, directa o indirectamente, por ejemplo por medio de una molécula o péptido de excipiente, ligandos específicos de diana, tales como anticuerpos y otros ligandos proteínas específicos de receptor, con el fin de proporcionar especificidad de diana orgánica o celular (Malone et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86:6077, 1989; Gregoriadis, Immunology Today 11(3):89, 1990).

Se llevó a cabo una serie de experimentos para mostrar que el efecto de la osmolaridad sobre la carga de fármaco es inverso e independiente de otros parámetros utilizados durante el proceso de fabricación, incluyendo el tipo de mezclador utilizado durante la formación de las emulsiones. Se obtuvieron formulaciones de carga elevada utilizando primeros componentes acuosos que contenían concentraciones de IGF-I comprendidas entre 20 y 80 mg/mL de IGF-I y con ácido cítrico 25 mM o sin ácido. Además, se prepararon formulaciones de IGF-I comparando los efectos sobre la carga de fármaco utilizando un azúcar (sacarosa) o un no azúcar (glicilglicina) como excipiente osmótico. La comparación de los resultados de estos ensayos en las Tablas 2 a 6 demostró que la relación inversa entre la osmolaridad y la carga de fármaco no depende del carácter químico de ninguno de los componentes que forman el primer componente acuoso, y que depende únicamente de un parámetro: la osmolaridad total del primer componente acuoso utilizado durante la preparación de los MVLs. En varias formulaciones, se cambió el lípido anfipático de cadena larga utilizado para proporcionar propiedades de liberación lenta de las formulaciones de DEPC a DOPC sin cambios significativos de la tendencia a la modulación de la carga de fármaco mediante la alteración de la osmolaridad. Además, se prepararon las formulaciones de MVL en diferentes tamaños de lote con diferentes tipos de mezclador para ilustrar que el procedimiento de la presente invención es independiente de dichas variables utilizadas durante el proceso.

A continuación se proporciona una descripción a título de ejemplo únicamente, haciendo referencia a los dibujos adjuntos de realizaciones de la presente invención.

En los dibujos:

la figura 1 es un gráfico que muestra la solubilidad de IGF-I (mg/mL) como función del pH a 4ºC (\blacksquare) y a temperatura ambiente (\medbullet). También se indica la solubilidad de IGF-I correspondiente a la formulación en masa diana (\ding{115}).

La figura 2 es un gráfico que muestra el porcentaje de IGF-I retenido en MVLs de carga elevada incubados in vitro en plasma a 37ºC durante 7 días (tasa de liberación). Se utilizaron diversas concentraciones de IGF-I y un excipiente osmótico en el primer componente acuoso utilizado durante la preparación para controlar la carga de fármaco. \lozenge = 80 mg/mL de IGF-I en ácido cítrico 25 mM, y sacarosa al 2,5% p/v (113,5 mOsm); \nabla = 80 mg/mL de IGF-I en ácido cítrico 25 mM, glicilglicina al 1% p/v (113,5 mOsm); + = 50 mg/mL de IGF-I en ácido cítrico 25 mM, sacarosa al 1% p/v (63,5 mOsm). Las barras de error representan desviaciones estándar.

La figura 3 es un gráfico que muestra la concentración de IGF-I en suero (ng/mL) durante 8 días en ratas macho tras una inyección subcutánea de 10 mg de MVLs realizada con 80 mg/mL de IGF-I, ácido cítrico 25 mM y sacarosa al 2,5% p/v (113,5 mOsm) en el primer componente acuoso. Los datos representan la media de tres ratas.

La figura 4 es un gráfico que muestra la bioactividad en unidades internacionales (IU) de IGF-I extraído de 10 lotes de formulaciones de MVL de carga reducida que contenían IGF-I a una concentración de aproximadamente 5 mg/mL de formulación preparadas según el procedimiento de la invención. La bioactividad se mide utilizando un ensayo mitogénico de cultivo celular con un control de rhIGF-I estándar que presentaba una actividad de -1,3 x 10^{3} unidades internacionales (IU)/mL.

La figura 5 es un gráfico que muestra el perfil de liberación in vitro en plasma humano durante 7 días de IGF-I encapsulado en forma de formulación de carga reducida (5 mg/mL) en MVL. La ordenada muestra el porcentaje de IGF-I retenido en la fracción de partículas, y las abscisas muestran los días de incubación en plasma a 37ºC.

La figura 6 es un gráfico que muestra la liberación in vivo en suero obtenido tras la inyección subcutánea en ratas ofIGF-I encapsulado en forma de formulación de carga reducida de MVL. El gráfico también muestra el nivel sérico resultante de una dosis igual de IGF-I libre. La ordenada muestra la concentración de IGF-I en suero (ng/mL) y las abscisas muestran los días posteriores a la inyección, -\medbullet- = IGF-I en MVL, dosis de 20 mg/kg; -\ding{115}- = IGF-I libre, dosis de 20 mg/kg.

Ejemplo 1 Preparación de formulaciones de liposomas multivesiculares que contienen una carga elevada de IGF-I A. Preparación a escala de 0,5 mL de MVLs

En todos los procedimientos de preparación de MVLs ilustrados en la presente invención, en la primera etapa se prepara una emulsión de "agua en aceite" mediante la mezcla de un componente lípido con un primer componente acuoso. El componente lípido contiene 0,5 a 4 mL de DOPC o DEPC 13,20 mM, colesterol 19,88 mM, DPPG 2,79 mM y trioleína 2,44 mM (Avant Polar Lipids Inc., Alabaster, AL) en cloroformo (Spectrum Chemical Manufacturing Corp., Gardena, CA) como solvente.

En la presente realización, se preparó un componente lípido que contenía DEPC y no DOPC. El primer componente acuoso contenía 50 mg/mL de IGF-I y 0,25, 0,5, 1,0, 2,5 ó 5,0% p/v de sacarosa como excipiente osmótico. Se formó una emulsión del lípido y primer componente acuoso mediante la mezcla de 0,5 mL del primer componente acuoso con 0,5 mL del primer componente acuoso con 0,5 mL del componente lípido utilizando un agitador vórtex Baxter a velocidad máxima (dial 10) durante 6 minutos. A la primera emulsión resultante, se añadieron 2,5 mL de una solución que contenía glucosa al 4% en peso y lisina 40 mM (Spectrum Chemicals), respectivamente. La mezcla resultante se emulsionó para formar una segunda emulsión con el vórtex Baxter a velocidad máxima durante 4 segundos. La segunda emulsión resultante, una doble emulsión de "agua en aceite en agua", se transfirió para la agitación suave a un matraz Erlenmeyer de 250 mL que contenía 10 mL de una solución de glucosa al 4 por ciento en peso y lisina 40 mM. Para evaporar el solvente orgánico (cloroformo) de las partículas, se pasó gas nitrógeno sobre la segunda emulsión a 37ºC durante 20 minutos bajo agitación suave. Los liposomas multivesiculares resultantes se lavaron dos veces con 50 mL de solución salina normal mediante centrifugación a 600 x g en una centrífuga de laboratorio, y después se resuspendieron en 0,5 a 4 mL de solución salina normal. Se llevó a cabo el resto de etapas descritas en el Ejemplo 1 para obtener MVLs que contenían IGF-I suspendidas en solución salina normal. Se muestran en la Tabla 2 a continuación la osmolaridad estimada (mOsm), el rendimiento en porcentaje y la carga de fármaco de estas formulaciones.

TABLA 2

2

Al caracterizar el IGF-I encapsulado tal como se describe en el Ejemplo 3 de la presente invención, se descubrió que la proteína se encontraba parcialmente desnaturalizada. El estudio adicional demuestra que la utilización de ácido cítrico proporciona condiciones químicas más favorables para la bioactividad del IGF-I encapsulado.

B. Preparación de MVLs a escala de 4 mL

Se preparó un componente lípido que contenía DOPC y no DEPC tal como en el Ejemplo 1. El primer componente acuoso contenía 20 mg/mL de IGF-I (Chiron Corp., Emeryville, CA) en ácido hidroclórico 100 mM y 2,5 ó 5,0% de sacarosa como excipiente osmótico, o 50 mg/mL de IGF-I en ácido hidroclórico 100 mM y 0 ó 2,5% p/v de sacarosa como excipiente osmótico. Los procedimientos del Ejemplo 1 se siguieron para obtener los MVLs que contenían IGF-I, excepto que se mezclaron 4 mL del primer componente acuoso con 4 mL del componente lípido utilizando un autohomogeneizador K de TK a una velocidad de 9.000 rpm durante 8 minutos para obtener la primera emulsión. A la primer emulsión se añadió 1 mL de una solución que contenía glucosa al 4% en peso y lisina 40 mM (Spectrum Chemicals), respectivamente. La mezcla resultante se emulsionó para formar una segunda emulsión con el autohomogeneizador K de TK a una velocidad de 4.000 rpm durante 1 minuto. Se muestran en la Tabla 3, a continuación, la osmolaridad estimada (mOsm), el rendimiento en porcentaje y la carga de fármaco de estas formulaciones utilizando un agitador vórtex y DEPC, un líquido que presenta una cadena de 22 carbonos.

TABLA 3

3

La Tabla 3 muestra que los resultados obtenidos con el procedimiento del mezclador TK son similares a los obtenidos al utilizar un mezclador vórtex para preparar las emulsiones. Tras obtener y caracterizar la proteína encapsulada tal como se describe en el Ejemplo 3 de la presente invención, se encontró una cantidad incrementada de oligómeros de IGF-I en comparación con las formulaciones de la Tabla 4, en la que se incluyó ácido cítrico 25 mM en el primer componente acuoso.

C. Preparación de IGF-I encapsulado a escala de 3 mL

Se preparó tal como en el Ejemplo 1 un componente lípido que contenía DEPC y no DOPC. El primer componente acuoso contenía 30 mg/mL de IGF-I en ácido cítrico 25 mM y 0 ó 2,5% p/v de sacarosa como excipiente osmótico, o 50 mg/mL de IGF-I en ácido cítrico 25 mM, y 2,5, 1,0, 0,5 ó 0% p/v de sacarosa, o 50 mg/mL de IGF-I sin ácido cítrico, y 0 ó 0,5% p/v de sacarosa. Se siguieron los procedimientos del Ejemplo 1 para obtener los MVLs que contenían IGF-I, excepto en que se mezclaron 3 mL del primer componente acuoso con 3 mL del componente lípido utilizando un mezclador ES de Omni a una velocidad de 10.000 rpm durante 12 minutos para obtener la primera emulsión. A la primera emulsión se añadieron 20 mL de una solución que contenía glucosa al 4% en peso y lisina 40 mM (Spectrum Chemicals), respectivamente. La mezcla resultante se emulsionó para formar una segunda emulsión con el mezclador ES de Omni a una velocidad de 4.500 rpm durante 2 minutos. A continuación se muestran en la Tabla 4 la osmolaridad estimada (mOsm), el rendimiento en porcentaje y la carga de fármaco de estas formulaciones.

TABLA 4

4

Los resultados en la Tabla 4 muestran una modulación similar de la carga de fármaco mediante osmolaridad para cualquiera de las concentraciones de fármaco sometidas a ensayo.

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Ejemplo 2 Efecto de la sustitución de la glicilglicina como excipiente osmótico

Se preparó tal como en el Ejemplo 1 un componente lípido que contenía DEPC y no DOPC. El primer componente acuoso contenía 10 mg/mL de IGF-I en ácido cítrico 25 mM, y 0, 1,0 ó 2,0% p/v de glicilglicina como excipiente osmótico. Se llevó a cabo el resto de las etapas descritas en el Ejemplo 1 para obtener MVLs que contenían IGF-I suspendido en solución salina normal. Se muestran en la Tabla 5, a continuación, la osmolaridad estimada (mOsm), el rendimiento en porcentaje y la carga de fármaco de estas formulaciones.

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TABLA 5

5

Se muestra una modulación osmótica similar de la carga de fármaco para formulaciones con un espaciador osmótico no azúcar, la glicilglicina, en lugar de la sacarosa. De esta manera, los datos en la Tabla 5 demuestran que el efecto de la osmolaridad sobre la carga de fármaco es independiente de la estructura química del excipiente osmótico utilizado.

Comparación de diferentes excipientes osmóticos a igual fuerza osmótica

Se prepararon MVLs en el procedimiento del Ejemplo 1A que contenían IGF-I encapsulado con sacarosa al 2,5% p/v o glicilglicina al 1,0% p/v como excipientes osmóticos con una fuerza osmótica aproximadamente igual. Para la comparación se introdujo sacarosa al 2,5% p/v o glicilglicina al 1,0% p/v como el excipiente osmótico en el primer componente acuoso que contenía 80 mg/mL de IGF-I y ácido cítrico 25 mM.

Se siguieron los procedimientos del Ejemplo 1A para obtener los MVLs que contenían IGF-I, excepto en que se mezclaron 3 mL del primer componente acuoso con 3 mL del componente lípido utilizando un mezclador ES de Omni a una velocidad de 10.000 rpm durante 12 minutos para obtener la primera emulsión. A la primera emulsión se añadieron 20 mL de una solución que contenía glucosa al 4% en peso y lisina 40 mM (Spectrum Chemicals), respectivamente. La mezcla resultante se emulsionó para formar una segunda emulsión con el mezclador ES de Omni a una velocidad de 4.500 rpm durante 2 minutos.

Para determinar si el efecto sobre la carga de fármaco era atribuible únicamente a la osmolaridad del primer componente acuoso, se preparó una tercera formulación tal como se ha descrito anteriormente, excepto en que las concentraciones del excipiente osmótico y el IGF-I se reducían proporcionalmente (de 80 mg/mL de IGF-I y sacarosa al 2,5% a 50 mg/mL de IGF-I y sacarosa al 1,0%). En estas formulaciones, el segundo componente acuoso sustituyó la glicina al 1,5% y la lisina 40 mM por glucosa al 4% y lisina 40 mM utilizados en el Ejemplo 1. La Tabla 6 más abajo compara la osmolaridad estimada, el rendimiento en % y la carga de fármaco en la suspensión final de liposomas para estas tres formulaciones.

Se muestran en la Tabla 6, a continuación, una comparación de la osmolaridad estimada (mOsm), el rendimiento en porcentaje y la carga de fármaco de estas formulaciones.

TABLA 6

6

Los datos en la Tabla 6 demuestran que, para una concentración dada de fármaco, la osmolaridad del excipiente osmótico es la variable efectiva resultado debido a que dos espaciadores osmóticos diferentes a fuerza osmótica aproximadamente igual aunque a concentración en peso desigual producen un efecto comparable sobre la carga de fármaco. Por otra parte, la concentración de fármaco en el primer componente acuoso también puede afectar a la carga de fármaco.

Los datos en las Tablas 2 a 6 muestran que la carga de fármaco en una formulación de MLV de carga elevada de IGF-I puede modularse mediante la variación de la osmolaridad de la primera solución acuosa utilizada en la preparación de los liposomas multivesiculares, resultando una menor osmolaridad en una carga de fármaco incrementada.

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Ejemplo 3 Determinación del porcentaje de encapsulamiento (o rendimiento en porcentaje), lipocrito, porcentaje de fármaco libre, distribución de tamaños de partícula y carga de fármaco en formulaciones de carga elevada de IGF-I

Las Tablas 2 a 4 muestran la osmolaridad estimada (mOsm), rendimiento en % y carga de fármaco (mg/mL) para las formulaciones liposómicas de carga elevada indicadas en los Ejemplos 1 y 2, anteriormente. El porcentaje de encapsulamiento (o rendimiento en porcentaje) de fármaco se calculó como proporción porcentual entre la cantidad de fármaco en la suspensión liposómica final y la cantidad total de fármaco utilizada en la primera solución acuosa. De esta manera, se calculó el rendimiento en porcentaje de fármaco como la proporción entre la concentración de fármaco en la suspensión final multiplicado por el volumen de la suspensión final, y la concentración de fármaco en la primera solución acuosa multiplicada por el volumen de la primera solución acuosa. Se calculó el lipocrito, en analogía al hematocrito, como la proporción porcentual entre el volumen del pellet y el volumen de suspensión (ver condiciones posteriormente para obtener el volumen del pellet).

Se calculó el porcentaje de fármaco libre como la proporción en porcentaje entre la cantidad de fármaco en el sobrenadante y la cantidad de fármaco en la suspensión final. También puede calcularse el porcentaje de fármaco libre como la proporción porcentual entre la concentración de fármaco en el sobrenadante y en la suspensión, multiplicado por (1-lipocrito). La carga de fármaco, que mide la cantidad de fármaco encapsulado en cada unidad del volumen encapsulado, es aproximadamente igual y puede estimarse (suponiendo un porcentaje reducido de fármaco libre) como la proporción entre la concentración de fármaco de la suspensión final de liposomas y el lipocrito. Estas variables se determinaron tal como se describe más particularmente después.

Para calcular el lipocrito, se introdujeron aproximadamente 50 \mul de la suspensión de liposomas multivesiculares en un tubo capilar y se selló el extremo del tubo asegurando que la suspensión no contuviese burbujas de aire. Se centrifugó la suspensión en una centrífuga a 600xg durante 10 minutos para obtener un capa de pellet y una capa sobrenadante. El lipocrito se calculó como la proporción porcentual entre la longitud del tubo ocupada por el pellet y aquélla ocupada por la suspensión.

Para la utilización en la determinación de la cantidad de fármaco libre en una formulación, se obtuvo sobrenadante mediante centrifugado de aproximadamente 0,2 mL de suspensión durante 3 minutos a 600xg en un tubo Eppendorf de centrífuga. A continuación, se midió la absorbancia a 280 nm en un espectrofotómetro (Hitachi U-2000). Para la centrifugación, se extrajeron 25 a 50 \mul del sobrenadante y se introdujeron con pipeta en un tubo de vidrio que contenía 1 mL de alcohol isopropílico v/v:ácido cítrico 2 N en proporción 3:1 (Sigma Chemical), seguido de la agitación vigorosa, obteniendo una solución transparente. Se midió la absorbancia a 275 nm en un espectrofotómetro (Hitachi U-2000). Utilizando un estándar de absorbancia estándar establecido basándose en soluciones de fármaco de concentración conocida en la misma solución de disolución, se calcularon las concentraciones de fármaco en la suspensión y en el sobrenadante. El intervalo de fármaco libre en las formulaciones de carga elevada fue en general <2% (p/v).

Se determinaron la distribución de los tamaños de partícula y el diámetro medio de las partículas mediante el procedimiento de difracción de luz láser utilizando un analizador de tamaños de partícula LA-500 o LA-910 de Horiba Inc. (Irvine, CA). El diámetro medio de partícula ponderado según el volumen para todas las formulaciones estudiadas generalmente se encontraba comprendido dentro del intervalo de entre aproximadamente 6 y 18 \mum.

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Ejemplo 4 Liberación in vitro e in vivo de formulaciones de IGF-I de elevada carga de fármaco y elevado rendimiento en porcentaje

Se confirmó la integridad físicoquímica del IGF-I de carga elevada encapsulado mediante el ensayo de SDS-PAGE utilizando gel Novex NuPage, así como mediante ensayo de RP-HPLC utilizando una columna simétrica C18. Se extrajo la proteína encapsulada utilizando IPA:ácido cítrico 2 N en proporción 75:25. Se confirmó la bioactividad del IGF-I encapsulado mediante un bioensayo mitogénico utilizando células MG-63 y tinción MTT según el procedimiento de W. Lopaczynski et al., Regulatory Peptides 48:207-216, 1993. Se obtuvo la línea celular de osteosarcoma humano MG-63 de la American Type Culture Collection (ATCC No. CRL 1427) y se determinó la respuesta mitogénica dependiente de la dosis de células MG-63 quiescentes frente al IGF-I añadido.

Se confirmó la bioactividad del IGF-I extraído como aproximadamente equivalente a la de un estándar no encapsulado.

Experimento in vitro : brevemente, se preparó un experimento de liberación in vitro y se llevó a cabo de la manera siguiente: se diluyó 20 veces en plasma humano que contenía NaN_{3} al 0,01% una suspensión de MVL que contenía aproximadamente 50 mg/mL de IGF-I; se utilizó una muestra de 0,5 mL en un tubo Eppendorf de tapa enroscable para cada punto del tiempo y las muestras se incubaron bajo condiciones dinámicas/rotación a 37ºC. Se obtuvieron muestras en diversos tiempos y se lavaron con 0,9 mL de solución salina normal. A continuación se obtuvieron pellets de partículas mediante centrifugación en una micrófuga a 14 K rpm, aproximadamente 16.000 g, durante 4 minutos y se almacenaron a -20ºC hasta el ensayo de RP-HPLC utilizando una columna simétrica C18. La figura 2 muestra los datos de liberación en plasma in vitro obtenidos para las tres formulaciones de IGF-I representativas indicadas en la Tabla 5. Estos datos indican que se consigue una liberación sostenida de IGF-I en las tres formulaciones sometidas a ensayo durante un periodo de varios días para las formulaciones de carga de fármaco elevada y elevado rendimiento de IGF-I.

Experimento in vitro : se inyectaron subcutáneamente en ratas macho las tres formulaciones de MVL mostradas en la Tabla 6, para obtener información sobre las características de la liberación in vivo. Cada rata recibió una dosis de 10 mg de IGF-I, y cada una de las formulaciones sometida a ensayo se inyectó en 3 ratas. Se recogieron muestras de sangre (0,2 mL) de la vena de la cola de las ratas y se dejó que coagulasen en el tiempo cero y a los 1, 3, 5 y 7 días de la inyección. A continuación, se obtuvo suero mediante centrifugación y se almacenó a -70ºC antes del ensayo para la concentración de IGF-I utilizando un kit ELISA de IGF-I DSL-10-5600 (Diagnostic Systems Laboratories Inc., Webster, TX).

La figura 3 muestra el curso temporal de la concentración media en suero de IGF-I de tres ratas que recibieron los 10 mg de IGF-I de la formulación A en la Tabla 6. Estos datos indican que puede conseguirse un nivel sostenido en suero de IGF-I durante un periodo de muchos días utilizando las formulaciones de IGF-I de elevada carga de fármaco y elevado rendimiento en porcentaje de la presente invención.

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Ejemplo 5 Preparación de MVLs que contienen carga reducida de IGF-I

Se prepararon MVLs que contenían una carga reducida de IGF-I mediante modificación del procedimiento del Ejemplo 1A de la manera siguiente: el componente acuoso era una solución acuosa que contenía una concentración de IGF-I comprendida en el intervalo de entre 9 y 16 mg/mL en sacarosa al 7% (p/v), citrato amónico 20 mM (pH 5). Se emulsionó una alícuota de 3,5 mL del componente acuoso a temperatura ambiente (23-28ºC) durante 9 minutos a 9.000 rpm con un volumen igual de un componente lípido que contenía dioleoil fosfatidilcolina 13 mM, dipalmitoil fosfatidilglicerol 2,8 mM, colesterol 19,9 mM y tripalmitoleína 2,4 mM disueltos en colesterol saturado en agua. Tras la mezcla, se añadieron 28 mL de glucosa al 4% en lisina 20 mM a la emulsión de agua en aceite con la paleta de mezcla a 1 cm sobre la interfaz acuosa orgánica y el contenido se mezcló durante 1 minuto a 6.000 rpm. La segunda emulsión resultante se añadió a un matraz con placas deflectoras de 1 litro que contenía 42 mL de glucosa al 4% en lisina 20 mM. La mezcla en el matraz se burbujeó con 50 pies cúbicos por hora de nitrógeno estándar a 37ºC durante 15 minutos para eliminar el cloroformo. A continuación, se recolectaron los liposomas multivesiculares mediante la adición de 4 veces el volumen posterior al burbujeo de citrato amónico dibásico 122 mM (pH 5) y centrifugando durante 10 minutos a 627 g. Tras el lavado, el pellet se resuspendió en un volumen igual de citrato amónico dibásico 122 mM, a un lipocrito de entre aproximadamente 40-50%. Se calculó la eficiencia de encapsulamiento de IGF-I en los MVL como superior a 60%. El intervalo de osmolaridades que corresponde a una concentración de entre 9 y 16 mg/mL de IGF-I en sacarosa al 7% en citrato amónico dibásico 20 mM era de entre aproximadamente 30 mOsm y aproximadamente 290 mOsm.

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Ejemplo 6 Caracterización de las formulaciones que contienen una carga reducida de IGF-I

Tamaño de partícula. Se determinó el tamaño de las partículas de MVL mediante la utilización de un detector de tamaño de partícula de dispersión de luz láser Horiba modelo LA-500 (Horiba Instruments, Inc., Irvine, CA). Se recogieron datos sin tratar utilizando el software Horiba LA-500 (Horiba Instruments, Inc., Irvine, CA). La estimación del tamaño de partícula se realizó mediante la adición de 10 a 15 \mul de suspensión de MVL a 10 mL de NaCl al 0,9% y midiendo la distribución de tamaños ponderada según el volumen. La mediana de tamaño de partículas se encontraba comprendida entre 12 y 18 micrómetros.

Lipocrito. Se midió el lipocrito mediante la adición de 65 \mul de suspensión de MVL a tubos de microhematocrito y centrifugando los tubos de microhematocrito (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) durante 10 minutos a 630 g. Tras la centrifugación, se midieron las longitudes del sobrenadante y del pellet. El lipocrito se calculó como la proporción en porcentaje entre la longitud del tubo ocupada por el pellet y aquélla ocupada por la suspensión.

Microscopía. Se observaron gráficamente suspensiones de liposomas bajo un microscopio Olympus (BH-2). Las suspensiones se diluyeron 3 veces con solución de cloruro sódico al 0,9% antes de la observación. Los liposomas eran esencialmente esféricos y multivesiculares.

pH del componente acuoso encapsulado. Se estimó el pH del componente acuoso encapsulado dentro de los MVLs en la formulación final mediante lavado del pellet de MVL obtenido mediante centrifugación con solución salina y después resuspendiendo el pellet con agua de grado HPLC (Mallinckrodt-Baker, París, KY). A continuación, la muestra se congeló a -70ºC para fracturar las vesículas, liberando de esta manera el componente acuoso encapsulado de las MVL. Se midió el pH del componente acuoso liberado en agua de PHLC y se corrigió para la dilución con el agua de HPLC, obteniendo el pH estimado del componente acuoso encapsulado.

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Ejemplo 7 Preparación a escala de 125 mL de IGF-I encapsulado

Se preparó un componente lípido estándar que contenía DEPC y no DOPC tal como para las demás formulaciones de fármaco. El primer componente acuoso contenía 15 mg/mL de IGF-I disueltos en una solución de sacarosa al 5%/citrato amónico 20 mM o en una solución de sacarosa al 8%/citrato amónico 20 mM. Se mezclaron 125 mL de la primera solución acuosa con 125 mL del componente lípido utilizando un sistema de recipiente de alta cizalla doble mezcla para obtener la primera emulsión. Este sistema de mezcla es un modelo del proceso a escala de producción, y se utiliza para el escalado de las formulaciones de fármaco encapsulado. Se mezclaron los componentes acuoso y orgánico a una velocidad de 8.000 rpm durante 30 minutos en el primer recipiente de emulsión. A continuación, se bombeó la primera emulsión a un caudal de 167 mL/minuto en un flujo fluido consistente de hidróxido amónico 0,04 N en solución de glicina al 1,5% que fluía a 2.400 mL/minuto y se mezcló utilizando un mezclador estático en línea para obtener la segunda emulsión. El caudal total a través del mezclador estático era 2.567 mL/minuto. A este caudal, se agotó la primera emulsión en 90 segundos. La segunda emulsión, tras la entrada en un recipiente receptor se mezcló con la solución de lisina y después se burbujeó inmediatamente con nitrógeno para despojar el solvente orgánico. Se muestran en la Tabla 7, más abajo, la osmolaridad estimada (mOsm), el rendimiento en porcentaje, la carga de fármaco y el % de fármaco libre para estas formulaciones.

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(Tabla pasa a página siguiente)

7

Los resultados en la Tabla 7, más arriba, muestran un incremento similar de la carga de fármaco al reducirse la concentración de sacarosa al igual que las demás formulaciones de fármaco sometidas a ensayo.

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Ejemplo 8 Caracterización de IGF-I en las formulaciones de carga reducida de MVL

Se extrajo el IGF-I de las partículas antes de caracterizar la proteína encapsulada. El procedimiento de extracción utilizado es una modificación de un procedimiento utilizado para la extracción de IGF-I de las proteínas plasmáticas de unión de la misma, y es el siguiente: se centrifugó una muestra de 100 \mul de una suspensión de ensayo durante 10 minutos a 627 g. Los sobrenadantes se aspiraron de las fracciones de partículas y se salvaron para el análisis. A continuación, se extrajo cada fracción de partículas utilizando una solución de 87% de isopropanol y 13% de ácido hidroclórico 2 N. Las muestras extraídas se incubaron en un baño de hielo durante 45 minutos, después se neutralizaron con una solución de concentración 1 M de Tris/ácido hidroclórico a pH 9.

Se midió la concentración de proteínas a 275 nm en un espectrofotómetro Hitachi modelo U-2000 (Hitachi Scientific Instruments, Berkshire, UK). Se calculó la concentración de proteínas utilizando el coeficiente de extinción de 0,62 para una solución de proteínas que contenía 1 mg/mL de IGF-I. Se determinó la concentración de IGF-I libre a partir de la absorbancia de una dilución de solución madre de IGF-I en ácido acético 100 mM.

También se caracterizó el IGF-I encapsulado mediante RP-HPLC tras extracción, y se comparó con el IGF-I libre. Se llevó a cabo el RP-HPLC en un sistema de cromatografía líquida Hewlett-Packard modelo 1090 (Hewlett-Packard GmbH, Waldborn, Alemania). La columna utilizada era una C_{18} Waters Symmetry de 150 x 3,9 nm D.I. (Millipore, Milford, MA). Se recogieron los datos sin tratar utilizando software Hewlett-Packard 3D Chemstation (Hewlett-Packard GmbH, Waldbom, Alemania). Se detectó IGF-I tanto a 214 nm como a 275 nm.

Se separó el IGF-I a un caudal de 0,8 mL/minuto utilizando un gradiente lineal de solvente partiendo de 22 por ciento en volumen de solvente B y cambiando hasta 40 por ciento en volumen de B a lo largo de 11 minutos. El solvente A era acetonitrilo al 10%/ácido trifluoroacético al 0,2% y el tampón B era acetonitrilo al 90%/ácido trifluoroacético al 0,2% (TFA). Tras la separación se realizó una elución isocrática de 4 minutos con 100% de solvente B, seguido de una equilibración de 9 minutos bajo las condiciones iniciales. La separación se llevó a cabo a 45ºC.

Se llevaron a cabo análisis de SDS-PAGE del IGF-I separado de los MVL de IGF-I siguiendo las instrucciones del fabricante utilizando geles Novex Tris al 18%/glicina y el sistema tamponador Novex Tris/glicina. El análisis del gel SDS-PAGE de los MVL encapsulantes de IGF-I indicó la ausencia de oligomerización y mostró que se mantenía la integridad de las proteínas encapsuladas.

Se confirmó la bioactividad del IGF-I encapsulado mediante un bioensayo mitogénico utilizando células MG-63, una línea celular de osteosarcoma humano, tinción de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) según el procedimiento de W. Lopaczynski et al., Regulatory Peptides 48:207-216, 1993. Se obtuvo la línea celular MG-63 de la American Type Culture Collection (ATCC No. CRL 1427) y se determinó la respuesta mitogénica dependiente de dosis de células MG-63 quiescentes frente al IGF-I añadido. La figura 4 muestra la bioactividad de una formulación MVL de carga reducida de IGF-I que contenía 5 mg de IGF-I por mL de formulación según cálculos contra un estándar de IGF-I humano recombinante (Chiron Corporation) con bioactividad de 1,3 x 10^{3} unidades internacionales (IU)/mL. Las recuperaciones en el ensayo mitogénico se encontraban comprendidas entre 90-110% del IGF-I de control.

Estudios in vitro . Para estimar la tasa de liberación en plasma de la carga reducida de IGF-I de los liposomas multivesiculares de carga reducida in vitro, se incubó plasma humano de banco de sangre (pulsado con azida sódica al 0,01%) con suspensiones de MVL que contenían una dilución de cinco veces de los MVLs 5 mg/mL en comparación con una dilución de 20 veces en el estudio de la formulación de carga elevada. Se pipetearon alícuotas de 500 \mul en tubos de 1,5 mL de tapa enroscable, representando cada tubo un punto del tiempo y se incubaron a 37ºC bajo condiciones suavemente dinámicas. Todos los estudios de liberación in vitro se realizaron por duplicado. En los puntos del tiempo de 1, 3, 5 y 7 días después del inicio de la incubación, se añadieron 0,9 mL de cloruro sódico al 0,9% a uno de los tubos. El tubo se centrifugó durante 3 minutos a 14.269 g en una microcentrífuga y se separaron sobrenadante y pellet. El pellet se extrajo con 1 mL de isopropanol acidificado y 0,2 mL de Tris tal como se ha descrito anteriormente en la sección de procedimiento de extracción. Los pellets extraídos se analizaron para el contenido de IGF-I mediante RP-HPLC. Para la determinación de la bioactividad de IGF-I liberado de las partículas de MVL, la suspensión se incubó en solución salina a 37ºC y se midió la bioactividad de IGF-I en las fracciones tanto de sobrenadante como de pellet tal como se ha descrito anteriormente. Un gráfico del perfil de liberación in vitro (figura 5) muestra que, pasados 7 días, 75% a 80% del IGF-I encapsulado se libera de una manera sostenida de orden cero.

Estudios in vivo . Se comparó el comportamiento farmacocinético de una formulación de carga reducida de MVL que contenía IGF-I con la de IGF-I no encapsulado tras inyecciones subcutáneas (parte inferior del lomo) en ratas. Se inyectaron en cada rata dosis de 20 mg/kg de IGF-I libre o de una formulación de MVL o de IGF-I preparada a partir de una solución madre de 5 mg/mL de IGF-I, con 3 ratas por grupo. Se recogieron los sueros en diversos tiempos hasta 8 días después de la inyección y se sometieron a ensayo para IGF-I utilizando un kit ELISA de IGF-I (DSL-10-5600) (Diagnostic Systems Laboratories (DSL), Webster, Texas) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se calcularon los parámetros farmacocinéticos utilizando el programa WinNonlin (Scientific Consulting Inc.) y un modelo sin compartimientos. Un gráfico que muestra los resultados de este estudio (figura 6) indica que la formulación de MVL de carga reducida libera un nivel terapéutico de IGF-I durante un periodo de 5 a 7 días, mientras que el IGF-I libre se elimina tras aproximadamente 1 día.

Claims

1. Liposoma multivesicular que contiene factor I de crecimiento similar a insulina (IGF-I) y que presenta múltiples cámaras no concéntricas con membranas distribuidas en forma de red continua en la totalidad de las cámaras, obtenible mediante un procedimiento que comprende las etapas de:

(a): formar una emulsión de agua en aceite a partir de dos componentes inmiscibles, siendo los dos componentes inmiscibles: (1) un componente lípido que comprende por lo menos un solvente orgánico, por lo menos un lípido anfipático y un lípido neutro sin un grupo de cabeza hidrofílico, y (2) un primer componente acuoso que comprende IGF-I en un intervalo de concentraciones de carga reducida de entre 1 mg/mL y 33 mg/mL, o un intervalo de concentraciones de carga elevada de entre 40 mg/mL y 300 mg/mL;

: en la que el componente acuoso presenta una osmolaridad comprendida en el intervalo de entre 160 mOsm y 320 mOsm, o de entre 5 mOsm y 150 mOsm; y un pH comprendido en el intervalo de entre 1 y 5, o de entre 2 y 4,8, para intervalos de concentración de carga reducida o elevada, respectivamente;

(b): dispersar la emulsión de agua en aceite que contiene el IGF en un segundo componente acuoso para formar esférulas de solvente; y después

(c): eliminar el solvente orgánico de las esférulas de solvente para formar los liposomas multivesiculares suspendidos en el segundo componente acuoso.

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2. Procedimiento para producir una composición que contiene un liposoma multivesicular que presenta múltiples cámaras no concéntricas con membranas distribuidas en forma de red continua en la totalidad de las cámaras y que presenta factor I de crecimiento similar a insulina (IGF-I) encapsulado en las mismas, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

(a): formar una emulsión de agua en aceite a partir de dos componentes inmiscibles, siendo los dos componentes inmiscibles: (1) un componente lípido que comprende por lo menos un solvente orgánico, por lo menos un lípido anfipático y un lípido neutro sin un grupo de cabeza hidrofílico, y (2) un primer componente acuoso que comprende IGF-I en un intervalo de concentraciones de carga reducida de entre 1 mg/mL y 33 mg/mL o un intervalo de concentraciones de carga elevada de entre 40 mg/mL y 300 mg/mL; y que presenta una osmolaridad comprendida en el intervalo de entre 160 mOsm y 320 mOsm, o de entre 5 mOsm y 150 mOsm; y un pH comprendido en el intervalo de entre 1 y 5, o de entre 2 y 4,8; para intervalos de concentración de carga reducida o elevada, respectivamente;

(b): dispersar la emulsión de agua en aceite que contiene el agente biológicamente activo en un segundo componente acuoso para formar esférulas de solvente; y después,

(c): eliminar el solvente orgánico de las esférulas de solvente para formar los liposomas multivesiculares suspendidos en el segundo componente acuoso;

en el que la osmolaridad del primer componente acuoso se selecciona para modular la carga del IGF-I en la composición, o es inversamente proporcional a la concentración del IGF-I en el liposoma.

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3. Realización según la reivindicación 1 ó 2, en la que el primer componente acuoso además comprende un excipiente osmótico.

4. Realización según la reivindicación 3, en la que el excipiente osmótico es sacarosa.

5. Realización según la reivindicación 3, en la que el excipiente osmótico es glicilglicina.

6. Realización según la reivindicación 1 ó 2, en la que el primer componente acuoso comprende además un agente de ajuste del pH.

7. Realización según la reivindicación 6, en la que el agente de ajuste del pH es ácido cítrico.

8. Realización según la reivindicación 6, en la que el agente de ajuste del pH es citrato amónico dibásico.

9. Realización según la reivindicación 1 ó 2, en la que el componente lípido comprende por lo menos un lípido anfipático que presenta entre 13 y 28 carbonos en la cadena de carbonos del mismo.

10. Realización según la reivindicación 1 ó 2, en la que el componente lípido comprende por lo menos un lípido anfipático que presenta entre 18 y 22 carbonos en la cadena de carbonos del mismo.

11. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que el excipiente osmótico se selecciona de entre el grupo que consiste de glicilglicina, glucosa, sacarosa, trehalosa, succinato, ciclodextrina, arginina, galactosa, manosa, maltosa, manitol, glicina, lisina, citrato, sorbitol, dextrano, cloruro sódico y combinaciones de los mismos.

12. Realización según la reivindicación 1 ó 2, en la que el lípido neutro se selecciona de entre el grupo que consiste de trioleína, tricaprilina, escualeno y combinaciones de los mismos.

13. Realización según la reivindicación 1 ó 2, en la que el solvente orgánico se selecciona de entre el grupo que consiste de éteres, hidrocarburos, hidrocarburos halogenados, éteres halogenados, ésteres, CO_{2}, NH_{3}, freones y combinaciones de los mismos.

14. Composición que comprende:

(a): un liposoma multivesicular que presenta múltiples cámaras no concéntricas con membranas distribuidas en forma de red continua en la totalidad de las cámaras, comprendiendo dicho liposoma:

: un componente acuoso que comprende IGF-I;

: un lípido anfipático que contiene entre 18 y 22 carbonos en la cadena de carbonos; y

: un lípido neutro sin un grupo de cabeza hidrofílico; y

(b): un medio acuoso en el que se suspende el liposoma,

en la que la carga de fármaco de IGF-I se encuentra comprendida en el intervalo de entre 76,8 mg/mL y 267,5 mg/mL.

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15. Composición según la reivindicación 14, que comprende además un excipiente osmótico y un agente de ajuste del pH.

16. Composición según la reivindicación 15, en la que el excipiente osmótico se selecciona de entre el grupo que consiste de sacarosa y glicilglicina, y el agente de ajuste del pH se selecciona de entre el grupo que consiste de ácido cítrico y citrato amónico dibásico.

17. Composición según la reivindicación 16, en la que la carga de fármaco de IGF-I se encuentra comprendida entre 82,5 mg/mL y 175,7 mg/mL.

18. Realización según las reivindicaciones 1 ó 14, en la que el lípido anfipático es 1,2-dierucoil-sn-fosfocolina.

19. Realización según las reivindicaciones 1 ó 14, en la que el lípido anfipático es 1,2-dioleoil-sn-fosfocolina.

20. Composición farmacéutica que comprende la composición según la reivindicaciones 14 a 19, en la que el medio de suspensión comprende además un portador fisiológicamente aceptable y la cantidad total del IGF-I en la composición es una dosis terapéuticamente efectiva.