ES2323175T3

ES2323175T3 - Mevalonato-quinasas resistentes a la retroalimentacion.

Info

Publication number: ES2323175T3
Application number: ES04736497T
Authority: ES
Inventors: Renyunan Bai; Markus Humbelin; Martin Lehmann; Rual Lopez-Ulibarri; Markus Wyss
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2003-06-12
Filing date: 2004-06-10
Publication date: 2009-07-08
Anticipated expiration: 2024-06-10
Also published as: DE602004020218D1; WO2004111214A1; CN1806042B; ATE426662T1; JP4643569B2; EP1631664B1; JP2007523612A; US7422884B2; KR101190897B1; KR20060022692A; EP1631664A1; CN1806042A; US20070141685A1

Abstract

Una mevalonato-quinasa modificada que exhibe una sensibilidad a la inhibición de retroalimentación que es reducida en comparación con la mevalonato-quinasa no modificada correspondiente en donde (i) la secuencia de aminoácidos de la mevalonato-quinasa modificada contiene al menos una mutación cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de la mevalonato-quinasa no modificada correspondiente y (ii) la al menos una mutación se encuentra en una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo constituido por las posiciones de los aminoácidos correspondientes a las posiciones 17, 47, 93, 94, 204, y 266 de la secuencia de amino-ácidos de la mevalonato-quinasa de Paracoccus zeaxanthinifaciens que se muestra en SEQ ID NO:1, en donde la al menos una mutación es I17T, G47D, K93E, V94I, R204H o C266S.

Description

Mevalonato-quinasas resistentes a la retroalimentación.

La presente invención proporciona mevalonato-quinasas que son menos sensibles a la inhibición de retroalimentación. Las enzimas modificadas y polinucleótidos que codifican las mismas pueden utilizarse para la producción de compuestos isoprenoides, para el tratamiento de trastornos que se caracterizan por actividad reducida de las mevalonato-quinasas, y para propósitos de diagnóstico.

La mevalonato-quinasa (MK) es una enzima esencial en el camino del mevalonato que conduce a la producción de numerosos isoprenoides celulares. El isopentenil-difosfato (IPP), el producto del camino de mevalonato, y el compuesto isómero, dimetilalil-difosfato (DMAPP), son los bloques de construcción fundamentales de los isoprenoides en todos los organismos. Los isoprenoides incluyen más de 23.000 moléculas existentes naturalmente de metabolismo tanto primario como secundario. La diversidad química de esta clase de productos naturales refleja la gran diversidad de sus papeles fisiológicos en todos los sistemas vivos. Los isoprenoides incluyen, v.g., hopano-triterpenos, ubiquinonas y menaquinonas en bacterias, carotenoides, plastoquinonas, mono-, sesqui-, di-, y tri-terpenos, y las cadenas laterales prenílicas de las clorofilas en las plantas, y el hemo A, quinonas, dolicoles, esteroles/esteroides y retinoides en los mamíferos. Adicionalmente, los isoprenoides están involucrados en los tRNAs de isopentenilo, en la prenilación de las proteínas y en la modificación del colesterol de, v.g., la clase erizo de las proteínas de señalización celulares.

La enzima MK ha sido caracterizada tanto a nivel bioquímico como al nivel molecular en una diversidad de organismos (Houten et al., Biochim. Biophys. Acta 1529, 19-32, 2000). Actualmente, se conocen las secuencias de DNA y aminoácidos de muchas mevalonato-quinasas (v.g., los números de acceso Swiss-Prot/IDs P07277/ki-me_levadura; Q9R008/kime_ratón; P17256/kime_rata; Q03426/kime_humano; P46086/kime_arath; Q09780/kime_schpo;
Q9V187/kime_pyrab; O59291/kime_pyrho; Q8U0F3/kime_pyrfu; Q50559/kime_metth; O27995/kime_arcfu;
Q58487/kime_metja; Q9Y946/kime_aerpe), y cada mes pueden añadirse nuevas entradas a la lista de secuencias de mevalonato-quinasa conocidas. A las secuencias anteriores que se han obtenido por proyectos de secuenciación del genoma les ha sido asignada una supuesta función de mevalonato-quinasa basándose en la similitud de secuencia con mevalonato-quinasas conocidas. Sin embargo, para los expertos en la técnica, es inmediato demostrar que estas secuencias codifican de hecho proteínas con actividad de mevalonato-quinasa.

En términos de regulación, se considera en líneas generales que la HMG-CoA-reductasa es la enzima determinante de la velocidad en el camino del mevalonato (v.g., Goldstein y Brown, Nature 343, 425-430, 1990; Weinberger, Trends Endocrinol. Metab. 7, 1-6, 1996; Hampton et al., Trends Biochem. Sci. 21, 140-145, 1996; Houten et al., J. Biol. Chem. 278, 5736-5743, 2003). En línea con este criterio, se ha demostrado que la suplementación del medio de cultivo con mevalonato estimula la producción de carotenoides tanto en Phaffia rhodozyma (Calo et al., Biotechnol. Lett. 17, 575-578, 1995) como en Haematococcus pluvialis (Kobayashi et al., J. Ferment. Bioeng. 71, 335-339, 1991). Sin embargo, pruebas crecientes obtenidas en los últimos años indican que la mevalonato-quinasa está sometida a inhibición de retroalimentación por, v.g., los productos de aguas abajo geranildifosfato, farnesildifosfato y geranilgeranildifosfato. Esta inhibición de retroalimentación puede contribuir también a la regulación y limitación de la velocidad del camino del mevalonato y, por tanto, de la biosíntesis de los isoprenoides en general.

En los humanos, se demostró la importancia de la mevalonato-quinasa por la identificación de su deficiencia como la causa bioquímica y molecular de los trastornos humanos heredados aciduria mevalónica e hiperinmunoglobulinemia D y el síndrome de fiebre periódica (Houten et al., 2000; Nwokoro et al., Mol. Genet. Metab. 74, 105-119, 2001). La patofisiología de estos trastornos no se conoce todavía, pero eventualmente dará idea acerca del papel in vivo de la biosíntesis de la mevalonato-quinasa y los isoprenoides con respecto a la respuesta de fase aguda y la fiebre. La deficiencia en mevalonato-quinasa parece estar implicada también, v.g., en el síndrome de Zellweger y en la condrodisplasia rizomélica punctata, un trastorno de biogénesis peroxisómica en el cual un subconjunto de enzimas peroxisómicas, con inclusión de mevalonato-quinasas, no es transportado a los peroxisomas (Kelley y Herman, Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2, 299-341, 2001). Finalmente, se ha propuesto que la mevalonato-quinasa juega un papel en la proliferación celular, la regulación del ciclo celular y/o la transformación celular (véase Graef et al., Virology 208, 696-703, 1995; Hinson et al., J. Biol. Chem. 272, 26756-26760, 1997).

Todas las mevalonato-quinasas investigadas hasta ahora son inhibidas en cuanto a la retroalimentación por productos del camino situados aguas abajo. Hasta ahora no se ha descrito mevalonato-quinasa alguna que sea resistente a la inhibición de retroalimentación por, v.g., farnesil-pirofosfato o geranilgeranil-pirofosfato. Las enzimas mevalonato-quinasa resistentes a la retroalimentación pueden tener potencial industrial, v.g., (1) en la producción biotecnológica de todo tipo de compuestos isoprenoides (v.g. carotenoides, coenzima Q10, vitamina D, esteroles, etc.), (2) como enzimas de diagnóstico para, v.g., medida enzimática de las concentraciones de mevalonato en fluidos biológicos, o (3) como enzimas terapéuticas para disminución de las concentraciones de mevalonato en pacientes con aciduria mevalónica. Las MKs resistentes a la retroalimentación son particularmente adecuadas para la producción biotecnológica de isoprenoides, dado que pueden permitir un flujo mayor por el camino del mevalonato y, de este modo, mayor productividad de isoprenoides.

Como se utiliza en esta memoria, el término "mevalonato-quinasa" significará cualquier enzima que sea capaz de catalizar la fosforilación del mevalonato (ácido mevalónico) a 5-fosfomevalonato (ácido 5-fosfomevalónico), o de análogos de mevalonato (como, v.g., han sido descritos por Wilde y Eggerer, Eur. J. Biochem. 221, 463-473, 1994) a los compuestos fosforilados correspondientes. Para permitir la fosforilación del mevalonato (o análogos de mevalonato), la enzima requiere adicionalmente un donante de fosfato adecuado. Como donantes de fosfato para mevalonato-quinasa, son imaginables diferentes compuestos. El donante de fosfato más preferido es ATP (adenosina 5'-trifosfato). Otros donantes de fosfato preferidos son TTP, ITP, GTP, UTP, o CTP (véase Gibson et al., Enzime 41, 47-55, 1989). Una "mevalonato-quinasa" puede ser homóloga a una o más de las enzimas cuyas secuencias de aminoácidos se muestran en SEQ ID NOs:1 a 14. "Homóloga" se refiere a una mevalonato-quinasa que es idéntica al menos aproximadamente en un 60%, de modo preferible idéntica al menos aproximadamente en un 70%, de modo más preferible idéntica al menos aproximadamente en un 80%, de modo aún más preferible idéntica al menos aproximadamente en un 90%, y de modo muy preferible idéntica al menos aproximadamente en un 95% a una o más de las secuencias de aminoácidos que se muestran en SEQ ID NOs:1 a 14 y 30.

El término "% de identidad", como se conoce en la técnica, significa el grado de interrelación entre secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, según sea el caso, tal como se determina por la coincidencia entre cadenas de tales secuencias. La "identidad" puede determinarse fácilmente por métodos conocidos, v.g. con el programa GAP (Paquete GCG Wisconsin, versión 10.2, Accelrys, Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752, EE.UU.) utilizando los parámetros siguientes: penalidad por creación de laguna 8, penalidad por extensión de laguna 2 (parámetros por defecto).

"Enzima de tipo salvaje" o "mevalonato-quinasa de tipo salvaje" significará cualquier mevalonato-quinasa homóloga a una cualquiera de SEQ ID NOs:1-14 y 30 que se utiliza como punto de partida para el diseño de mutantes (más) resistentes a la retroalimentación de acuerdo con la presente invención. Inherentemente, esta definición implica que una "enzima de tipo salvaje" o "mevalonato-quinasa de tipo salvaje" de este tipo es sensible a la inhibición para concentraciones fisiológica o industrialmente relevantes de un producto del camino del mevalonato situado aguas abajo, v.g. FPP o GGPP. "Tipo salvaje" en el contexto de la presente invención no limitará el alcance de la invención exclusivamente a mevalonato-quinasas/secuencias de mevalonato-quinasas derivables sólo de la naturaleza. Debe indicarse explícitamente aquí que también variantes de mevalonato-quinasas sintéticas (con tal que las mismas sean homólogas a una cualquiera de SEQ ID NOs:1-14 y 30) se designan como "tipo salvaje", si las mismas pueden hacerse (más) resistentes a la retroalimentación por cualquiera de las doctrinas de la presente invención. Los términos "mevalonato-quinasa tipo salvaje" y "mevalonato-quinasa no modificada" se utilizan en esta memoria de modo intercambiable.

Un "mutante", "enzima mutante" o "mevalonato-quinasa mutante" significará cualquier variante derivable de una enzima/mevalonato-quinasa dada de tipo salvaje (de acuerdo con la definición anterior) con arreglo a la doctrina de la presente invención y que es (más) resistente a la retroalimentación que la enzima de tipo salvaje respectiva. Para el objeto de la presente invención, no es relevante de qué modo se obtengan el o los mutantes; tales mutantes pueden obtenerse, v.g., por mutagénesis orientada, mutagénesis de saturación, mutagénesis aleatoria/evolución dirigida, mutagénesis por productos químicos o mutagénesis UV de células/organismos enteros, etc. Estos mutantes pueden prepararse también, v.g. por diseño de genes sintéticos, y/o por traducción in vitro (exenta de células) (véase, v.g., Jermutus et al., Curr. Opin. Biotechnol. 9, 534-548, 1998; Betton, Curr. Prot. Pept. Sci. 4, 73-80, 2003; Martin et al., Biotechniques 31, 948-, 2001). Para testar la resistencia a la retroalimentación, pueden generarse mutantes por métodos conocidos por los expertos en la técnica (v.g. por mutagénesis orientada o por diseño de genes sintéticos).

En el contexto de esta Solicitud de Patente, "isoprenoide" incluirá cualesquiera y la totalidad de uno o más metabolitos y una o más macromoléculas preniladas derivables de mevalonato por caminos naturales o no naturales (es decir, caminos que no existen en la naturaleza, pero que se producen por vía biotecnológica), preferiblemente caminos bioquímicos. Los isoprenoides incluyen, pero sin carácter limitante, hopano-triterpenos, ubiquinonas y menaquinonas en bacterias, carotenoides, plastoquinonas, mono-, sesqui-, di- y tri-terpenos, y las cadenas laterales prenílicas de las clorofilas en las plantas, y el hemo A, quinonas, coenzima Q10, dolicoles, esteroles/esteroides, vitamina D, retinoides, y análogos.

Es en general un objeto de la presente invención proporcionar una nueva mevalonato-quinasa que ha sido modificada de tal manera que sus propiedades catalíticas son más favorables (es decir, menos sensibles a la inhibición de la retroalimentación) que las de la mevalonato-quinasa no modificada.

La invención se refiere a una mevalonato-quinasa modificada que exhibe una sensibilidad a la inhibición de retroalimentación que es reducida en comparación con la mevalonato-quinasa no modificada correspondiente en donde

(i) la secuencia de aminoácidos de la mevalonato-quinasa modificada contiene al menos una mutación cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de la mevalonato-quinasa no modificada correspondiente y

(ii) la al menos una mutación se encuentra en una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo constituido por las posiciones de los aminoácidos correspondientes a las posiciones 17, 47, 93, 94, 132, 167, 169, 204, y 266 de la secuencia de aminoácidos de la mevalonato-quinasa de Paracoccus zeaxanthinifaciens que se muestra en SEQ ID NO:1.

Como se utiliza en esta memoria, el término "inhibición de la retroalimentación" denota la inhibición de la actividad enzimática de la mevalonato-quinasa por un metabolito situado aguas abajo del mevalonato en la biosíntesis de los isoprenoides. Los metabolitos situados aguas abajo del mevalonato en la biosíntesis de los isoprenoides incluyen, pero sin carácter limitante, 5-fosfomevalonato, isopentenil-difosfato (IPP), 3,3-dimetilalil-difosfato (DMAPP), geranil-difosfato (GPP), farnesil-difosfato (FPP), geranilgeranil-difosfato (GGPP), farnesol, dolicol-fosfato, y fitil-pirofosfato (Dorsey y Porter, J. Biol. Chem. 243, 4667-4670, 1968; Flint, Biochem. J. 120, 145-150, 1970; Gray y Kekwick, Biochim. Biophys. Acta 279, 290-296, 1972; Hinson et al., J. Lipid Res. 38, 2216-2223, 1997). Se cree que la inhibición de retroalimentación de la mevalonato-quinasa está basada en la regulación alostérica de la mevalonato-quinasa por fijación a la enzima del metabolito aguas abajo de mevalonato en la biosíntesis de los isoprenoides.

Preferiblemente, la inhibición de retroalimentación es inhibición de retroalimentación por farnesil-difosfato (FPP) o geranilgeranil-difosfato (GGPP).

De acuerdo con la presente invención, la mevalonato-quinasa modificada exhibe sensibilidad reducida a la inhibición de retroalimentación en comparación con la mevalonato-quinasa no modificada correspondiente. Preferiblemente, la sensibilidad a la inhibición de retroalimentación de la mevalonato-quinasa modificada de la invención está reducida al menos en un 5% en comparación con la mevalonato-quinasa no modificada correspondiente (para medida y cuantificación de la resistencia a la retroalimentación, véase más adelante).

"Resistencia a la retroalimentación" significará cualquier aumento de resistencia a la "inhibición de la retroalimentación" (como se define arriba). La resistencia a la retroalimentación puede analizarse de diferentes maneras conocidas por los expertos en la técnica. Un enfoque apropiado se describirá aquí brevemente: se mide la actividad de mevalonato-quinasa en un ensayo de actividad similar al descrito en el Ejemplo 2 para concentraciones no saturantes de ATP (o de otro donante de fosfato) y mevalonato (o análogo de mevalonato), es decir, para concentraciones de ATP (o donante de fosfato) y mevalonato (o análogo de mevalonato) alrededor de las cuales la velocidad de reacción es sensible a los cambios de estas concentraciones de sustrato, v.g., a concentraciones próximas a los valores K_{m} respectivos de la enzima objeto de investigación para estos sustratos. Las actividades tanto de mevalonato-quinasa de tipo salvaje como de una variante/mutante de esta enzima se miden en condiciones idénticas por lo demás, tanto en ausencia como en presencia de una concentración relevante de un inhibidor de la retroalimentación, a saber, a una concentración de inhibidor de la retroalimentación que proporciona una inhibición significativa de la mevalonato-quinasa de tipo salvaje. Si la extensión de la inhibición (es decir, el % de inhibición) por el inhibidor de la retroalimentación es menor para el mutante que para la enzima de tipo salvaje, entonces el mutante es "resistente a la retroalimentación" en el contexto de la presente solicitud de patente. Una vez que se ha identificado una variante/mutante "resistente a la retroalimentación", puede aplicarse el mismo procedimiento que se ha descrito arriba para identificar mutantes adicionalmente mejorados, es decir, mutantes que son aún más resistentes en retroalimentación. La resistencia a la retroalimentación (%) se calcula como sigue: si a y b son las actividades de mevalonato-quinasa medidas de la enzima de tipo salvaje en ausencia y presencia, respectivamente, del inhibidor de la retroalimentación (v.g. FPP), y si c y d son las actividades de mevalonato-quinasa medidas de la enzima mutante en ausencia y presencia, respectivamente, del mismo inhibidor de la retroalimentación, entonces el % de resistencia a la retroalimentación es

% \ resistencia = 100 \cdot ((d/c)-(b/a))/(1-(b/a))

Preferiblemente, la resistencia a la retroalimentación se refiere a las condiciones experimentales descritas en el Ejemplo 2 de esta solicitud. Aproximadamente 3-30 mU/ml (correspondientes a aprox. 1-10 \mug/ml de mevalonato-quinasa de Paracoccus zeaxanthinifaciens), con preferencia aproximadamente 10-20 mU/ml de actividad de mevalonato-quinasa, y opcionalmente 46 \muM de FPP estaban presentes en la mezcla de ensayo, y la reacción se efectuó a 30ºC.

La mevalonato-quinasa modificada de la invención exhibe una resistencia a la retroalimentación de al menos 5%, con preferencia al menos aproximadamente 10%, de modo más preferible al menos aproximadamente 25%, de modo aún más preferible al menos aproximadamente 40%, de modo todavía más preferible al menos aproximadamente 60%, y de modo muy preferible al menos aproximadamente 70% cuando se compara con la mevalonato-quinasa no modificada correspondiente.

La secuencia de aminoácidos de la mevalonato-quinasa modificada de la invención contiene al menos una mutación cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de la mevalonato-quinasa no modificada correspondiente. La mutación puede ser una adición, deleción y/o sustitución. Preferiblemente, la mutación es una sustitución de aminoácidos en donde un aminoácido dado presente en la secuencia de aminoácidos de la mevalonato-quinasa no modificada está reemplazado por un aminoácido diferente en la secuencia de aminoácidos de la mevalonato-quinasa modificada de la invención. La secuencia de aminoácidos de la mevalonato-quinasa modificada puede contener al menos una sustitución de aminoácido cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de la mevalonato-quinasa no modificada correspondiente. En realizaciones adicionales, la mevalonato-quinasa modificada contiene al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco sustituciones cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de la mevalonato-quinasa no modificada correspondiente. En otras realizaciones de la invención, la mevalonato-quinasa modificada contiene uno a diez, uno a siete, uno a cinco, uno a cuatro, dos a diez, dos a siete, dos a cinco, dos a cuatro, tres a diez, tres a siete, tres a cinco o tres a cuatro sustituciones de aminoácidos cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de la mevalonato-quinasa no modificada correspondiente.

La(s) una o más mutaciones pueden encontrarse en una o más posiciones de aminoácidos seleccionada(s) del grupo constituido por las posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones 17, 47, 93, 94, 132, 167, 169, 204, y 266 de la secuencia de aminoácidos de la mevalonato-quinasa de Paracoccus zeaxanthinifaciens que se muestra en SEQ ID NO:1.

Preferiblemente, la al menos una mutación se encuentra en una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo constituido por las posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones 17, 47, 93, 94, 132, 167, y 266 de la secuencia de aminoácidos de la mevalonato-quinasa de Paracoccus zeaxanthinifaciens que se muestra en SEQ ID NO:1. En otra realización preferida, la al menos una mutación se encuentra en una o más posiciones de aminoácido seleccionadas del grupo constituido por las posiciones de los aminoácidos correspondientes a las posiciones 17, 47, 93, 94, 132, 167, y 169 de la secuencia de aminoácidos de la mevalonato-quinasa de Paracoccus zeaxanthinifaciens que se muestra en SEQ ID NO:1.

Si la mevalonato-quinasa modificada contiene únicamente una sola sustitución de aminoácido cuando se compara con la mevalonato-quinasa no modificada correspondiente, se prefiere que la sustitución única del aminoácido se encuentre en una posición seleccionada del grupo constituido por las posiciones correspondientes a las posiciones de los aminoácidos 17, 47, 93, 94, 204 y 266 de SEQ ID NO:1. Más preferiblemente, la sustitución es I17T, G47D, K93E, V94I, R204H o C266S.

En una realización particularmente preferida, la mutación es una sustitución que afecta a la posición del aminoácido correspondiente a la posición del aminoácido 17 de la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:1. El aminoácido presente en la mevalonato-quinasa no modificada es preferiblemente isoleucina. El aminoácido en la secuencia de la mevalonato-quinasa no modificada puede cambiarse por treonina o alanina. Muy preferiblemente, la sustitución en la posición del aminoácido correspondiente a la posición 17 de la secuencia que se muestra en SEQ ID NO:1 consiste en el reemplazamiento de isoleucina con treonina.

Si la mevalonato-quinasa modificada contiene al menos dos mutaciones cuando se compara con la mevalonato-quinasa no modificada correspondiente, una de las mutaciones puede encontrarse en la posición del aminoácido correspondiente a la posición 375 de SEQ ID NO:1. Si la mevalonato-quinasa modificada contiene dos sustituciones de aminoácidos cuando se compara con la mevalonato-quinasa no modificada correspondiente, se prefiere que las sustituciones de aminoácidos se encuentren en las posiciones correspondientes a combinaciones de las posiciones 132/375, 167/169, 17/47 o 17/93 de SEQ ID NO:1. Son muy preferidas las combinaciones P132A/P375R, R167W/K169Q, I17T/G47D o I17T/K93E.

Si la mevalonato-quinasa modificada contiene 3 sustituciones de aminoácidos cuando se compara con la mevalonato-quinasa no modificada correspondiente, se prefiere que las sustituciones de aminoácidos se encuentren en posiciones correspondientes a combinaciones de las posiciones 17/167/169, 17/132/375, 93/132/375, o 17/47/93 de SEQ ID NO:1. Son muy preferidas las combinaciones I17T/R167W/K169Q, I17T/P132A/P375R; K93E/P132A/P375R,
I17T/R167W/K169H, I17T/R167T/K169M, I17T/R167T/K169Y, I17T/R167F/K169Q, I17T/R167I/K169N,
I17T/R167H/K169Y, I17T/G47D/K93E o I17T/G47D/K93Q.

Si la mevalonato-quinasa modificada contiene 4 sustituyentes de aminoácidos cuando se compara con la mevalonato-quinasa no modificada correspondiente, se prefiere que las sustituciones de aminoácidos se encuentren en posiciones correspondientes a combinaciones de las posiciones 17/47/93/132 de SEQ ID NO:1. Son muy preferidas las combinaciones I17T/G47D/K93E/P132A o I17T/G47D/K93E/P132S.

Son muy preferidas las combinaciones de mutaciones descritas en la Tabla 1, 2, 3 ó 4 (véase más adelante). Las posiciones de aminoácidos identificadas en estos ejemplos pueden transferirse a mevalonato-quinasas de diferente origen.

La mevalonato-quinasa modificada de la invención puede obtenerse por introducción de una mutación en la mevalonato-quinasa no modificada correspondiente. Una mevalonato-quinasa no modificada puede ser cualquier mevalonato-quinasa que exhiba sensibilidad a la inhibición de la retroalimentación. Mevalonato-quinasas no modificadas incluyen, pero sin carácter limitante, mevalonato-quinasas que se derivan de la naturaleza. Mevalonato-quinasas no modificadas incluyen adicionalmente mevalonato-quinasas que son homólogas a una cualquiera de las secuencias de aminoácidos que se representan en SEQ ID NOs:1 a 14 y 30.

Mevalonato-quinasas no modificadas preferidas incluyen aquéllas que tienen una secuencia seleccionada del grupo constituido por las secuencias de aminoácidos que se muestran en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 y SEQ ID NO:30.

La mevalonato-quinasa no modificada puede ser de origen eucariota o procariota, preferiblemente de origen fúngico o bacteriano, más preferiblemente de origen Aspergillus o Saccharomyces o Paracoccus o Phaffia y muy preferiblemente Aspergillus niger o Saccharomyces cerevisiae o Paracoccus zeaxanthinifaciens o Phaffia rhodozyma. En una realización, la mevalonato-quinasa no modificada es de origen procariota, preferiblemente de origen bacteriano, más preferiblemente de origen Paracoccus y muy preferiblemente Paracoccus zeaxanthinifaciens.

Preferiblemente, la inhibición de retroalimentación de la mevalonato-quinasa no modificada por FPP es al menos 10%, más preferiblemente al menos 20%, todavía más preferiblemente al menos 30%, aún más preferiblemente al menos 40%, y muy preferiblemente al menos 50%, como se determina en un ensayo descrito en el Ejemplo 2 (FPP 0 ó 46 \muM).

La mevalonato-quinasa modificada de la invención puede comprender aminoácidos extraños, preferiblemente en su término N o C. "Aminoácidos extraños" significa aminoácidos que no están presentes en una mevalonato-quinasa nativa (existente en la naturaleza), preferiblemente un tramo de al menos aproximadamente 3, al menos aproximadamente 5 o al menos aproximadamente 7 aminoácidos contiguos que no están presentes en una mevalonato-quinasa nativa. Tramos preferidos de aminoácidos extraños incluyen, pero sin carácter limitante, "marcadores" que facilitan la purificación de la mevalonato-quinasa modificada producida recombinantemente. Ejemplos de tales marcadores incluyen, pero sin carácter limitante, un marcador "His_{6}", un marcador FLAG, un marcador myc, y análogos.

En otra realización, la mevalonato-quinasa modificada puede contener una o más, v.g., dos, deleciones cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de la mevalonato-quinasa no modificada correspondiente. Preferiblemente, las deleciones afectan a los aminoácidos N- o C-terminales de la mevalonato-quinasa no modificada correspondiente, y no reducen significativamente las propiedades funcionales, v.g., la actividad específica, de la enzima.

La mevalonato-quinasa modificada de la invención es usualmente una mevalonato-quinasa no existente naturalmente. Preferiblemente, la actividad específica de la mevalonato-quinasa modificada es al menos 10%, más preferiblemente al menos 20%, todavía más preferiblemente al menos 35%, aún más preferiblemente al menos 50%, muy preferiblemente al menos 75% de la actividad específica de la mevalonato-quinasa no modificada correspondiente.

La mevalonato-quinasa modificada de la invención puede ser un polipéptido aislado. Como se utiliza en esta memoria, la expresión "polipéptido aislado" hace referencia a un polipéptido que está sustancialmente exento de otros polipéptidos. Un polipéptido aislado tiene preferiblemente una pureza mayor que 80%, preferiblemente mayor que 90%, más preferiblemente mayor que 95%, y muy preferiblemente mayor que 99%. La pureza puede determinarse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, v.g., por SDS-PAGE y tinción subsiguiente de las proteínas. Las bandas de proteínas pueden cuantificarse luego por densitometría. Métodos adicionales para determinación de la pureza están perfectamente dentro del nivel de experiencia ordinario.

La invención se refiere adicionalmente a un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una mevalonato-quinasa modificada de acuerdo con la invención. "Polinucleótido", tal como se utiliza en esta memoria, hace referencia a un polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido que puede ser DNA o RNA sin modificar o RNA o DNA modificado. Los polinucleótidos incluyen, pero sin carácter limitante, DNA mono- y bicatenario, DNA que es una mezcla de regiones mono- y bicatenarias, RNA mono- y bicatenario, y RNA que es una mezcla de regiones mono- y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden DNA y RNA que pueden ser monocatenarias o, más típicamente, bicatenarias o una mezcla de regiones mono- y bicatenarias. El término "polinucleótido" incluye DNA o RNA que comprende una o más bases poco comunes, v.g., inosina, o una o más bases modificadas, v.g. bases tritiladas.

El polinucleótido de la invención puede obtenerse fácilmente por modificación de una secuencia de polinucleótidos que codifica una mevalonato-quinasa no modificada. Ejemplos de tales secuencias de polinucleótidos que codifican mevalonato-quinasas no modificadas se muestran en SEQ ID NOs:16 a 29 y 31. Métodos para introducción de mutaciones, v.g., adiciones, deleciones y/o sustituciones en la secuencia de nucleótidos que codifica la mevalonato-quinasa no modificada incluyen, pero sin carácter limitante, mutagénesis orientada y métodos basados en PCR.

Los principios del método de la región en cadena de la polimerasa (PCR) se reseñan, v.g., por White et al., Trends Genet. 5, 185-189, 1989, describiéndose métodos mejorados, v.g., en Innis et al. [PCR Protocols: A guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. (1990)].

Las secuencias de DNA de la presente invención pueden construirse partiendo de secuencias de DNA genómico o cDNA que codifican mevalonato-quinasas conocidas por los expertos en la técnica [para información de secuencias véanse, v.g., las bases de datos de las secuencias relevantes, por ejemplo GenBank (Intelligenetics, California, EE.UU.), el Instituto de Bioinformática Europeo (Hinston Hall, Cambridge, GB), NBRF (Georgetown University, Medical Centre, Washington DC, EE.UU.) y Vecbase (University of Wisconsin, Biotechnology Centre, Madison, Wisconsin, de EE.UU.) o la información de secuencias descrita en las figuras y el listado de secuencias] por métodos de mutagénesis in vitro [véase v.g. Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York]. Una estrategia muy utilizada para dicha "mutagénesis orientada", como se reseñó originalmente por Hutchison y Edgell (J. Virol. 8, 181-189, 1971), implica la reasociación de un oligonucleótido sintético que lleva la sustitución de oligonucleótidos deseada a una región diana de una secuencia de DNA monocatenario en la que debe introducirse la mutación (para revisión véase Smith, Annu. Rev. Genet. 19, 423-462, 1985; y para métodos mejorados véanse las referencias 2-6 en Stanssen et al., Nucl. Acids Res. 17, 4441-4454, 1989). Otra posibilidad de mutación de una secuencia de DNA dada que se prefiere también para la práctica de la presente invención es la mutagénesis utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). DNA como material de partida puede aislarse por métodos conocidos en la técnica y descritos, v.g., en Sambrook et al. (Molecular Cloning) de las cepas/organismos respectivos. Sin embargo, debe entenderse que el DNA que codifica una mevalonato-quinasa para construcción/mutación de acuerdo con la presente invención puede prepararse también sobre la base de una secuencia de DNA conocida, v.g. por construcción de un gen sintético por métodos conocidos en la técnica (como se describen, v.g., en EP 747 483 y por Lehmann et al., Prot. Eng. 13, 49-57, 2000).

Ejemplos no limitantes de polinucleótidos que codifican mevalonato-quinasas modificadas de acuerdo con la invención se muestran en SEQ ID NO:32 y 33.

El polinucleótido de la invención puede ser un polinucleótido aislado. El término "polinucleótido aislado" denota un polinucleótido que está sustancialmente exento de otras secuencias de ácido nucleico tales como, pero sin carácter limitante, otro DNA y RNA cromosómico y extracromosómico. Métodos convencionales de purificación de ácido nucleico conocidos por los técnicos expertos pueden ser utilizados para obtener polinucleótidos aislados. El término abarca también polinucleótidos recombinantes y polinucleótidos sintetizados químicamente.

En otra realización adicional, la invención se refiere a un vector o plásmido que comprende un polinucleótido de acuerdo con la invención. El vector o plásmido comprende preferiblemente al menos un gen marcador. El vector o plásmido puede comprender además elementos reguladores enlazados operativamente al polinucleótido de la invención. El término "enlazado operativamente" como se utiliza en esta memoria hace referencia a la asociación de secuencias de ácido nucleico en un solo fragmento de ácido nucleico de tal modo que la función de una se ve afectada por la otra. Por ejemplo, un promotor está enlazado operativamente con una secuencia codificante cuando el mismo es capaz de afectar a la expresión de dicha secuencia codificante, es decir, la secuencia codificante se encuentra bajo el control transcripcional del promotor. Secuencias codificantes pueden enlazarse operativamente a secuencias reguladoras en orientación sentido o antisentido. El término "expresión" denota la transcripción de una secuencia de DNA en mRNA y/o la traducción de mRNA en una secuencia de aminoácidos. El término "sobreexpresión" significa la producción de un producto génico en un almidón modificado (v.g. modificado por transformación o transfección) que excede de los niveles de producción en el organismo no modificado correspondiente.

Una vez que se han obtenido secuencias de DNA completas de la presente invención, las mismas pueden integrarse en vectores por métodos conocidos en la técnica y descritos, v.g. en Sambrook et al (véase anteriormente) para
(sobre-)expresar el polipéptido codificado en sistemas hospedadores apropiados. Sin embargo, un experto en la técnica sabe que también las secuencias de DNA propiamente dichas pueden utilizarse para transformar los sistemas hospedadores adecuados de la invención a fin de conseguir (sobre-)expresión del polipéptido codificado. Sistemas hospedadores apropiados son por ejemplo hongos, como Aspergilli, v.g. Aspergillus niger o Aspergillus oryzae, o como Trichoderma, v.g. Trichoderma reesei, o levaduras como Saccharomyces, v.g. Saccharomyces cerevisiae, o Pichia, como Pichia pastoris, o Hansenula polymorpha, v.g., H. polymorpha (DSM5215). Un experto en la técnica sabe que tales microorganismos están disponibles de autoridades depositarias, v.g., la American Type Culture Collection (ATCC), el Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) o el Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) o cualquier otra autoridad depositaria como las enumeradas en la publicación "Industrial Property" (vol. 1, páginas 29-40, 1991) o en la Revista Oficial de la Oficina Europea de Patentes (vol. 4, páginas 155-156, 2003). Bacterias que pueden utilizarse son, v.g. Paracoccus, como v.g. Paracoccus zeaxanthinifaciens, E. coli, Bacilli como, e.g., Bacillus subtilis o Streptomyces, e.g. Streptomyces lividans (véase e.g. Anné y van Mellaert en FEMS Microbiol. Lett. 114, 121-128, 1993. E. coli que podrían utilizarse son, e.g., las cepas de E. coli K12, v.g. M15 (descrita como DZ 291 por Villarejo et al. en J. Bacteriol. 120, 466-474, 1974), HB 101 (ATCC No. 33694) o E. coli SG13009 (Gottesman et al., J. Bacteriol. 148, 265-273, 1981).

Vectores que pueden utilizarse para expresión en hongos son conocidos en la técnica y se describen v.g. en EP 420 358, o por Cullen et al. (Bio/Technology 5, 369-376, 1987), Ward (en Molecular Industrial Mycology, Systems and Applications for Filamentous Fungi, Marcel Dekker, Nueva York, 1991), Upshall et al. (Bio/Technology 5, 1301-1304, 1987), Gwynne et al. (Bio/Technology 5, 71-79, 1987), o Punt et al. (J. Biotechnol. 17, 19-34, 1991), y para levaduras por Sreekrishna et al. (J. Basic Microbiol. 28, 265-278, 1988; Biochemistry 28, 4117-4125, 1989), Hitzemann et al. (Nature 293, 717-722, 1981) o en EP 183 070, EP 183 071, EP 248 227 y EP 263 311. Vectores adecuados que pueden utilizarse para expresión en E. coli se mencionan, v.g., por Sambrook et al [véase arriba] o por Fiers et al. en Proc. 8th Int. Biotechnol. Symp. [Soc. Franc. de Microbiol., París (Durand et al., compiladores), pp. 680-697, 1988], Bujard et al. (en Meth. Enzymol., compiladores Wu y Grossmann, Academic Press, Inc., Vol. 155, 416-433, 1987), o Stüber et al. (en Immunological Methods, compiladores Lefkovits y Pernis, Academic Press, Inc., Vol. IV, 121-152, 1990). Vectores que podrían utilizarse para expresión en Bacilli se conocen en la técnica y se describen, v.g., en EP 207 459 o EP 405 370, por Yansura y Henner en Proc. Natl. Acad. Sci. de EE.UU. 81, 439-443 (1984), o por Henner, Le Grice y Nagarajan en Meth. Enzymol. 185, 199-228, 1990. Vectores que pueden utilizarse para expresión en H. Polymorpha se conocen en la técnica y se describen, v.g., en Gellissen et al., Biotechnology 9, 291-295, 1991.

Cualquiera de tales vectores llevan ya elementos reguladores, v.g. promotores, o las secuencias de DNA de la presente invención pueden modificarse por ingeniería genética para contener tales elementos. Otros promotores adecuados que pueden utilizarse se conocen en la técnica y son, v.g., para Trichoderma reesei el promotor cbh1- (Haarki et al., Biotechnology 7, 596-600, 1989) o el promotor pki1 (Schindler et al., Gene 130, 271-275, 1993), para Aspergillus oryzae el promotor amy [Christensen et al., Abstr. 19th Lunteren Lectures on Molecular Genetics F23 (1987); Christensen et al., Biotechnology 6, 1419-1422, 1988; Tada et al., Mol. Gen. Genet. 229, 301-306, 1991], para Aspergillus niger el promotor glaA (Cullen et al., Bio/Technology 5, 369-376, 1987; Gwynne et al., Bio/Technology 5, 713-719, 1987; Ward en Molecular Industrial Mycology, Systems and Applications for Filamentous Fungi, Marcel Dekker, Nueva York, 83-106, 1991), alcA (Gwynne et al., Bio/Technology 5, 718-719, 1987), suc1- (Boddy et al., Curr. Genet. 24, 60-66, 1993), aphA (MacRae et al., Gene 71, 339-348, 1988; MacRae et al., Gene 132, 193-198, 1993), tpiA (McKnight et al., Cell 46, 143-147, 1986; Upshall et al., Bio/Technology 5, 1301-1304, 1987), gpdA (Punt et al., Gene 69, 49-57, 1988; Punt et al., J. Biotechnol. 17, 19-37, 1991) and pkiA (de Graaff et al., Curr. Genet. 22, 21-27, 1992). Elementos promotores adecuados que podrían utilizarse para expresión en levadura se conocen en la técnica y son, v.g., el promotor pho5 (Vogel et al., Mol. Cell. Biol. 9, 2050-2057, 1989; Rudolf y Hinnen, Proc. Natl. Acad. Sci. de EE.UU. 84, 1340-1344, 1987) o el promotor gap para expresión en Saccharomyces cerevisiae, y p.ej. el promotor aox1 para Pichia pastoris (Koutz et al., Yeast 5, 167-177, 1989; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28, 265-278, 1988), o el promotor FMD (Hollenberg et al., EPA No. 0299108) o el promotor MOX (Ledeboer et al., Nucleic Acids Res. 13, 3063-3082, 1985) para H. polymorpha.

Promotores y vectores adecuados para expresión bacteriana incluyen, v.g., un promotor sintético descrito por Giacomini et al (Gene 144, 17-24, 1994). Enseñanzas apropiadas para expresión de las mevalonato-quinasas (mutantes) en bacterias reivindicadas, sea por plásmidos apropiados o por integración de secuencias de DNA que codifican mevalonato-quinasa en el DNA cromosómico, pueden encontrarse en muchos lugares, v.g., la patente de EE.UU. No. 6322995.

La invención se refiere adicionalmente a una célula hospedadora que comprende el vector o plásmido de la invención. Células hospedadoras adecuadas pueden ser células eucariotas o procariotas. Ejemplos de células hospedadoras adecuadas incluyen, pero sin carácter limitante, células bacterianas, tales como células de estreptococos, estafilococos, enterococos, E. coli, Streptomyces, cianobacterias, Bacillus subtilis, y Streptococcus pneumoniae; células fúngicas, tales como células de una levadura Kluyveromyces, Saccharomyces, un basidiomiceto, Candida albicans y Aspergillus; células de insecto tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales tales como CHO, COS, HeLa, 3T3, BHK, 293, CV-1; y células de plantas, tales como células de una gimnosperma o angiosperma.

De acuerdo con ello, vectores que comprenden un polinucleótido de la presente invención, preferiblemente para la expresión de dichos polinucleótidos en hospedadores bacterianos, fúngicos, de levadura o de plantas, y tales hospedadores bacterianos, fúngicos, de levadura o de plantas transformados son también un objeto de la presente invención.

La invención se refiere adicionalmente a un método para producir un compuesto isoprenoide que comprende:

(a) cultivar la célula hospedadora de la invención en un medio adecuado en condiciones que permiten la expresión de la mevalonato-quinasa modificada en la célula hospedadora; y

(b) separar opcionalmente el compuesto isoprenoide del medio.

Dicho método puede utilizarse para la producción biotecnológica de cualquier tipo de compuesto isoprenoide o compuesto derivado de isoprenoides: v.g., carotenoides tales como, pero sin carácter limitante, fitoeno, licopeno, \alpha-, \beta- y \gamma-caroteno, luteína, zeaxantina, \beta-cripto-xantina, adonixantina, equinenona, cantaxantina, astaxantina y derivados de los mismos (Misawa & Shimada, J. Biotechnol. 59, 169-181, 1998; Miura et al., Appl. Environ. Microbiol. 64, 1226-1229, 1998; Hirschberg, Curr. Opin. Biotechnol. 10, 186-191, 1999; Margalith, Appl. Microbiol. Biotechnol. 51, 431-438, 1999; Schmidt-Dannert, Curr. Opin. Biotechnol. 11, 255-261, 2000; Sandmann, Arch. Biochem. Biophys. 385, 4-12, 2001; Lee & SchmidtDannert, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 1-11, 2002); quinonas tales como, pero sin carácter limitante, ubiquinona (= coenzima Q), menaquinona, plastoquinonas y antraquinonas, preferiblemente coenzima Q6, coenzima Q7, coenzima Q8, coenzima Q9, coenzima Q10 o coenzima Q11, muy preferiblemente coenzima Q10 (Clarke, Protoplasma 213, 134-147, 2000; Han et al., Plant Cell Tissue Organ Culture 67, 201-220, 2001; Kawamukai, J. Biosci. Bioeng. 94, 511-517, 2002); cauchos y derivados de caucho, preferiblemente caucho natural (= cis-1,4-poliisopreno; Mooibroek & Cornish Appl. Microbiol. Biotechnol. 53, 355-365, 2000); esteroles y derivados de esteroles tales como, pero sin carácter limitante, ergosterol, colesterol, hidrocortisona (Ménard Szczebara et al., Nature Biotechnol. 21, 143-149, 2003), vitamina D, 25-hidroxi-vitamina D3, fitosteroles dietéticos (Ling & Jones, Life Sci. 57, 195-206, 1995) y agentes tensioactivos naturales (Holmberg, Curr. Opin. Colloid. Interface Sci. 6, 148-159, 2001); y un gran número de otros isoprenoides tales como, pero sin carácter limitante, monoterpenos, diterpenos, sesquiterpenos y triterpenos, v.g., taxol (Jennewein & Croteau, Appl. Microbiol. Biotechnol. 57, 13-19, 2001) and gibberelinas (Bruckner & Blechschmidt, Crit. Rev. Biotechnol. 11, 163-192, 1991).

Células hospedadoras adecuadas son todos los tipos de organismos que son susceptibles de modificación genética tales como, pero sin carácter limitante, células de bacterias, levaduras, hongos, algas, plantas o animales. Métodos de ingeniería genética y metabólica son conocidos por los expertos en la técnica (v.g., Verpoorte et al., Biotechnol. Lett. 21, 467-479, 1999; Verpoorte et al., Transgenic Res. 9, 323-343, 2000; Barkovich & Liao, Metab. Eng. 3, 27-39, 2001). Análogamente, métodos de purifica-ción (potencialmente) adecuados para isoprenoides y compuestos derivados de isoprenoides y/o moléculas son bien conocidos en el área de la biosíntesis y producción de química fina.

Se entiende que un método para producción biotecnológica de un isoprenoide o compuesto y/o molécula derivado(a) de isoprenoide de acuerdo con la presente invención no se limita a procesos de fermentación de células enteras como se ha descrito arriba, sino que pueden utilizarse también, v.g. células hospedadoras permeabilizadas, extractos brutos de células, extractos de células clarificados de residuos celulares mediante, v.g., centrifugación o filtración, o incluso caminos de reacción reconstituidos con enzimas aisladas. Asimismo, combinaciones de tales procesos están dentro del alcance de la presente invención. En el caso de la biosíntesis exenta de células (por ejemplo con caminos de reacción reconstituidos), es irrelevante si las enzimas aisladas se han preparado por y aislado de una célula hospedadora, por transcripción/traducción in vitro, o por otros medios adicionales.

La invención se refiere además a un método para producir una mevalonato-quinasa modificada de la invención que comprende:

(a) cultivar una célula hospedadora de la invención en condiciones que permiten la expresión de la mevalonato-quinasa modificada de la invención; y

(b) recuperar la mevalonato-quinasa modificada de las células o del medio.

Las mevalonato-quinasas modificadas de la invención pueden prepararse a partir de células hospedadoras modificadas por ingeniería genética que comprenden sistemas de expresión.

Para la producción recombinante de los polipéptidos de la invención, las células hospedadoras pueden modificarse por ingeniería genética para incorporar polinucleótidos o vectores o plásmidos de la invención. La introducción de un polinucleótido o vector en la célula hospedadora puede efectuarse por métodos descritos en muchos manuales estándar de laboratorio [v.g., Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986), y Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)] tales como transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, microinyección, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, introducción balística e infección.

Una gran diversidad de sistemas de expresión pueden utilizarse para producir las mevalonato-quinasas modificadas de la invención. Tales vectores incluyen, entre otros, los arriba descritos. Generalmente, puede utilizarse para expresión a este respecto cualquier sistema o vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos y/o para expresar un polipéptido en un hospedador.

En los sistemas de expresión recombinantes en eucariotas, para secreción de una proteína traducida en el lumen del retículo endoplasmático, en el espacio periplásmico o en el ambiente extracelular, pueden incorporarse señales de secreción apropiadas en el polipéptido expresado. Estas señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas.

Los polipéptidos de la invención pueden recuperarse y purificarse de cultivos de células recombinantes por métodos bien conocidos que incluyen precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio de aniones o cationes, cromatografía con fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, y cromatografía con hidroxiapatito. En una realización, se emplea para la purificación cromatografía líquida de alta resolución. Técnicas bien conocidas para replegado de proteínas pueden emplearse a fin de regenerar la conformación activa cuando el polipéptido se ha desnaturalizado durante el aislamiento y/o la purificación. Métodos de purificación de proteínas se describen en, v.g., Deutscher, Protein Purification, Academic Press, Nueva York, 1990; y Scopes, Protein Purification, Springer Verlag, Heidelberg, 1994.

Las mevalonato-quinasas de la presente invención pueden expresarse también en plantas de acuerdo con métodos como se describen, v.g., por Pen et al., en Bio/Technology 11, 811-814, 1994 o en EP 449 375, preferiblemente en semillas como se describe, v.g., en EP 449 376. Algunos ejemplos adecuados de promotores y terminadores incluyen los genes de nopalina-sintasa (nos), octopina-sintasa (ocs) y el virus del mosaico de la coliflor (CaMV). Un tipo de promotor de plantas eficiente que puede utilizarse es un promotor de plantas de alto nivel. Tales promotores, en enlace operativo con las secuencias genéticas de la presente invención deberían ser capaces de promover la expresión del producto génico presente. Promotores de plantas de alto nivel que pueden utilizarse en esta invención incluyen el promotor de la subunidad pequeña (ss) de la ribulosa-1,5-bisfosfato-carboxilasa, por ejemplo de soja (Berry-Lowe et al., J. Mol. Appl. Genet. 1, 483-498, 1982) y el promotor de la proteína de fijación de clorofila a/b. Se sabe que estos dos promotores son inducidos por la luz en células vegetales (véase, por ejemplo, Genetic Engineering of Plants, an Agricultural Perspective, A. Cashmore, Plenum Press, NY (1983), páginas 29-38; Coruzzi et al., J. Biol. Chem. 258, 1399-1402, 1983; y Dunsmuir et al., J. Mol. Appl. Genet. 2, 285-300, 1983).

En los casos en que se desea la producción comercial de las presentes proteínas, pueden aplicarse una diversidad de metodologías de cultivo. Por ejemplo, la producción en gran escala de un producto génico específico, sobreexpresado a partir de un hospedador microbiano recombinante, puede producirse por metodologías tanto de lotes como de cultivo continuo. Los métodos de cultivo de lotes y "fed-batch" son comunes y bien conocidos en la técnica, pudiendo encontrarse ejemplos de Thomas D. Brock en Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Mass., o Deshpande, Appl. Biochem. Biotechnol. 36, 227-234, 1992. Métodos de modulación de nutrientes y factores de crecimiento para procesos de cultivo continuos, así como técnicas para maximizar la tasa de formación de producto son bien conocidos en la técnica de la microbiología industrial y una diversidad de métodos han sido detallados por Brock, citado arriba.

Los medios de fermentación deben contener sustratos de carbono adecuados. Sustratos adecuados pueden incluir, pero sin carácter limitante, monosacáridos tales como glucosa y fructosa, oligosacáridos tales como lactosa o sacarosa, polisacáridos tales como almidón o celulosa o mezclas de los mismos y mezclas impurificadas procedentes de alimentaciones renovables. Se contempla que la fuente de carbono utilizada en la presente invención puede abarcar una gran diversidad de sustratos que contienen carbono y estará limitada únicamente por la elección del organismo.

La invención se refiere adicionalmente a un método para la preparación de una mevalonato-quinasa que tiene sensibilidad reducida a la inhibición de la retroalimentación, que comprende los pasos siguientes:

(a) proporcionar un polinucleótido que codifica una primera mevalonato-quinasa que exhibe sensibilidad a la inhibición de la retroalimentación;

\newpage

(b) introducir una o más mutaciones en la secuencia de polinucleótidos de tal modo que la secuencia polinucleotídica mutada codifica una segunda mevalonato-quinasa que contiene al menos una mutación de aminoácido cuando se compara con la primera mevalonato-quinasa, en donde la al menos una mutación de aminoácido se encuentra en una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo constituido por las posiciones de aminoácido correspondientes a las posiciones 17, 47, 93, 94, 132, 167, 169, 204, y 266 de la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:1;

(c) opcionalmente, insertar el polinucleótido mutado en un vector o plásmido;

(d) introducir el polinucleótido o el vector o plásmido en una célula hospedadora adecuada; y

(e) cultivar la célula hospedadora en condiciones que permitan la expresión de la mevalonato-quinasa modificada.

Las realizaciones preferidas de este método corresponden a las realizaciones preferidas de la mevalonato-quinasa modificada, los polinucleótidos que la codifican, los vectores y plásmidos, las células hospedadoras, y los métodos descritos en esta memoria. Las mevalonato-quinasas primera y segunda corresponden a la mevalonato-quinasa no modificada y modificada, respectivamente (véase arriba).

Otro aspecto de la invención es el uso de una mevalonato-quinasa modificada de la invención o un polinucleótido de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno asociado con actividad reducida de mevalonato-quinasa. Tales trastornos incluyen, pero sin carácter limitante, aciduria mevalónica, hiperinmunoglobulinemia D y síndrome de fiebre periódica. Se prefiere que una mevalonato-quinasa modificada de la invención se administre como una enzima terapéutica. El modo de administración incluye administración oral, parenteral, intraperitoneal y/o subcutánea. Las mevalonato-quinasas modificadas de la invención y sales de las mismas pueden formularse como composiciones farmacéuticas (v.g. gránulos, cristales de enzima, tabletas, píldoras, cápsulas, inyecciones, soluciones, y análogas) que comprenden al menos una enzima de este tipo sola o en mezcla con vehículos, excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse de acuerdo con un método convencional. Niveles de dosis específicos para cualquier paciente particular se emplearán dependiendo de una diversidad de factores que incluyen la actividad de los compuestos específicos empleados, la edad, el peso corporal, el estado general de salud, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la ruta de administración, la tasa de excreción, la combinación de fármacos, y la gravedad de la enfermedad particular que se somete a la
terapia.

Los polinucleótidos de la invención pueden utilizarse en un protocolo de terapia génica.

Otro aspecto adicional de la invención es el uso de una mevalonato-quinasa modificada de la invención o un polinucleótido de la invención para determinar la concentración de mevalonato en fluidos biológicos. Ejemplos no limitantes de fluidos biológicos son sangre, suero, plasma, fluido cerebroespinal, orina, lágrimas, sudor, así como cualesquiera otros fluidos intracelulares, intercelulares y/o extracelulares.

Es un objeto de la presente invención proporcionar un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una mevalonato-quinasa modificada como se ha descrito arriba, un vector, preferiblemente un vector de expresión, que comprende un polinucleótido de este tipo, una célula hospedadora que ha sido transformada por un polinucleótido o vector de este tipo, un proceso para la preparación de una mevalonato-quinasa de la presente invención en donde la célula hospedadora como se describe anteriormente se cultiva en condiciones adecuadas de cultivo y la mevalonato-quinasa se aísla de dicha célula hospedadora o del medio de cultivo por métodos conocidos en la técnica, y un proceso para la reproducción biotecnológica de isoprenoide(s) basado en una célula hospedadora que ha sido transformada por un polinucleótido o vector de este tipo, y/o que puede haber integrado de manera estable dicho polinucleótido en su o sus cromosomas.

Es también un objeto de la presente invención proporcionar (i) una secuencia de DNA que codifica una mevalonato-quinasa que lleva al menos una de las mutaciones específicas de la presente invención y que se hibrida en condiciones estándar con cualquiera de las secuencias de DNA de las mevalonato-quinasas modificadas específicas de la presente invención, o (ii) una secuencia de DNA que codifica una mevalonato-quinasa que lleva al menos una de las mutaciones específicas de la presente invención pero que, debido a la degeneración del código genético, no se hibrida sino que codifica un polipéptido que tiene exactamente la misma secuencia de aminoácidos que una secuencia de DNA que se hibrida en condiciones estándar con cualquiera de las secuencias de DNA de las mevalonato-quinasas modificadas específicas de la presente invención, o (iii) una secuencia de DNA que es un fragmento de secuencias de DNA de este tipo que mantiene las propiedades de actividad del polipéptido del que la misma es un fragmento.

"Condiciones estándar" para hibridación significan en este contexto las condiciones que son utilizadas generalmente por un experto en la técnica para detectar señales específicas de hibridación y que se describen, v.g. por Sambrook et al., "Molecular Cloning", 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, Nueva York, o preferiblemente la denominada hibridación severa y condiciones de lavado no severas o más preferiblemente la denominada hibridación severa y condiciones de lavado severas con las que está familiarizado un experto en la técnica y que se describen, v.g. en Sambrook et al. (véase arriba). Un ejemplo específico de condiciones de hibridación severa es la incubación nocturna (v.g., 15 horas) a 42ºC en una solución que comprende: 50% de formamida, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano, y 20 \mug/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado y cizallado, seguido por lavado del soporte de hibridación en 0,1 x SSC a aproximadamente 65ºC.

Adicionalmente es un objeto de la presente invención proporcionar una secuencia de DNA que puede obtenerse por el denominado método de reacción en cadena de la polimerasa ("PCR") por iniciadores PCR diseñados sobre la base de las secuencias de DNA descritas específicamente de la presente invención. Debe entenderse que las secuencias de DNA así obtenidas codifican mevalonato-quinasas que tienen al menos la misma mutación que aquéllas a partir de las cuales se han diseñado y exhiben propiedades de actividad comparables.

Las diversas realizaciones de la invención descritas en esta memoria pueden combinarse cruzadamente.

Figura 1: Alineación múltiple de secuencias calculada con el programa ClustalW de secuencias de mevalonato-quinasa de ratón, rata, hombre, levadura, Arabidopsis thaliana (ARATH), Schizosaccharomyces pombe (SCHPO), Pyrococcus abyssi (PYRAB), Pyrococcus horikoshii (PYRHO), Pyrococcus furiosus (PYRFU), Methanobacterium thermoautotrophicum (METTH), Archaeoglobus fulgidus (ARCFU), Methanococcus jannaschii (METJA), Aeropyrum pernix (AERPE), y Paracoccus zeaxanthinifaciens (PARACOCCUS). La numeración se realiza conforme a la secuencia de aminoácidos de la mevalonato-quinasa de Paracoccus zeaxanthinifaciens.

Figura 2: Introducción de la mutación de mevalonato-quinasa K93E en el operón mevalonato de un plásmido basado en pBBR-K. Véase el texto para detalles.

Los ejemplos no limitantes siguientes ilustran la invención.

Ejemplo 1 Alineación múltiple de secuencias

Una alineación múltiple de secuencias de aminoácidos de diferentes mevalonato-quinasas (véase Fig. 1) puede calcularse, v.g., con el programa "PILEUP" (GCG Wisconsin Package, versión 10.2, Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752, EE.UU.) utilizando los parámetros siguientes: penalidad por creación de laguna 12, penalidad por extensión de laguna 4, y matriz blosum62.cmp (parámetros por defecto); o con el programa ClustalW (Version 1.7, EMBL, Heidelberg, Alemania) utilizando la matriz de intercambio BLOSUM. Tales alineaciones de secuencias son realizadas habitualmente por los expertos en la técnica (v.g. Cho et al., J. Biol. Chem. 276, 12573-12578, 2001).

Las mevalonato-quinasas homólogas en el contexto de la presente invención pueden exhibir similitud de secuencias con cualquiera de las mevalonato-quinasas representadas en Fig. 1. La Figura 1 proporciona un ejemplo de una alineación múltiple de secuencias para las secuencias de aminoácidos de mevalonato-quinasas de ratón, rata, hombre, Arabidopsis thaliana (ARATH), Schizosaccharomyces pombe (SCHPO), levadura (YEAST), Pyrococcus abyssi (PYRAB), Pyrococcus horikoshii (PYRHO), Pyrococcus furiosus (PYRFU), Methanobacterium thermoautotrophicum (METTH), Archaeoglobus fulgidus (ARCFU), Methanococcus jannaschii (METJA), Aeropyrum pernix (AERPE), y Paracoccus zeaxanthinifaciens (PARACOCCUS), utilizándose también la última secuencia como la referencia para numeración de aminoácidos a la cual se refieren las posiciones de las otras secuencias, v.g. las mencionadas anteriormente. Adicionalmente, la mevalonato-quinasa modificada de rata con la mutación E6V no significa otra cosa que la mevalonato-quinasa de la rata, en la cual, en la posición 6 de acuerdo con la asignación que se ha definido arriba (que es de hecho la posición 4 de la secuencia de aminoácidos de la mevalonato-quinasa de rata), la Glu existente naturalmente ("E" se refiere al código de aminoácidos estándar de una sola letra de la IUPAC) ha sido reemplazada por Val ("V"). Todos los mutantes/variantes de la presente invención se designan de este modo.

Ejemplo 2 Medida de la actividad de mevalonato-quinasa y de la inhibición por los inhibidores de la retroalimentación

Ensayos enzimáticos para medición de la actividad de mevalonato-quinasa han sido descritos, v.g., por Popják (Meth. Enzymol. 15, 393-, 1969), Gibson et al. (Enzyme 41, 47-55, 1989), Hinson et al. (J. Lipid Res. 38, 2216-2223, 1997), Schulte et al. (Anal. Biochem. 269, 245-254, 1999), o Cho et al. (J. Biol. Chem. 276, 12573-12578, 2001). Para preparación de mevalonato como sustrato, 130 mg de DL-mevalonato-lactona (FLUKA Chemie AG, Buchs, Suiza) se disolvieron en 5,5 ml de KOH 0,2 M y se incubaron durante 15 min a 50ºC. La solución se ajustó luego a pH 7,0 por adición de HCl 0,1 M a la temperatura ambiente (TA). Excepto que se indique otra cosa (véase el Ejemplo 3), la mezcla de ensayo está constituida por K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4} 100 mM (pH 7,0), ATP 1 mM, MgCl_{2} 2 mM, mevalonato 1 mM, fosfoenolpiruvato (PEP) 0,5 mM, NADH 0,32 mM, 20 U/ml de piruvato-quinasa y 27 U/ml de lactato-deshidrogenasa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.). Los FPP, GGPP, IPP, DNAPP y GPP testados como inhibidores en las mezclas de ensayo (a concentraciones de 0-100 \muM) se adquirieron todos ellos de Sigma. Después de la adición de mevalonato-quinasa purificada (marcada con His_{6}), la reacción enzimática reflejada por el consumo de NADH se siguió por medida fotométrica a 340 nm. Una unidad (1 U) de actividad de mevalonato-quinasa cataliza la fosforilación de 1 \mumol de mevalonato por minuto.

Ejemplo 3 Testado de la calidad del ensayo enzimático

Un ensayo óptimo debería satisfacer cierto número de requisitos, tales como linealidad con la concentración de enzima y linealidad con el tiempo. Adicionalmente, en el contexto de la presente invención, el ensayo debería permitir cuantificar la inhibición de mevalonato-quinasa por los inhibidores de la retroalimentación. En los experimentos de este ejemplo, se utilizaron las condiciones de ensayo siguientes: KH_{2}PO_{4} 100 mM, pH 7,0, ATP 0,125-4 mM, MgCl_{2} 1,125-5 mM (siempre 1 mM en exceso de ATP!), mevalonato 0,25-3 mM, FPP 0 o 46 \muM, NADH 0,16 mM, PEP 0,5 mM, 20 U/ml de piruvato-quinasa, 27 U/ml de lactato-deshidrogenasa, 30ºC. Se utilizaron cantidades diferentes de mevalonato-quinasa de Paracoccus zeaxanthinifaciens purificada marcada con His_{6}.

Los experimentos de este ejemplo muestran que el ensayo de actividad de mevalonato-quinasa, de hecho, es lineal con el tiempo y la concentración de enzima (mevalonato-quinasa), y que en las condiciones dadas para Paracoccus zeaxanthinifaciens, concentraciones de MgATP y mevalonato de 1 mM cada una pueden ser óptimas para permitir la medida fiable de la inhibición de retroalimentación por FPP.

Ejemplo 4 Mutagénesis de mevalonato-quinasa de Paracoccus zeaxanthinifaciens para obtener mutantes resistentes a la retroalimentación

El cDNA de mevalonato-quinasa de Paracoccus zeaxanthinifaciens R114 se amplifica por PCR utilizando un iniciador que codifica un sitio de restricción EcoRI junto con una secuencia de 6 x His así como una parte de la secuencia del extremo 5' de la mevalonato-quinasa sin el codón inicial ATG, y un iniciador que contiene la secuencia del extremo 3' de la mevalonato-quinasa con inclusión del codón de parada y un sitio de restricción BamHI. Después de purificación por electroforesis en gel de agarosa, el producto PCR se digiere con EcoRI y BamHI y se liga a pQE-80L (Qiagen, Hilden, Alemania), que se digiere con las mismas enzimas. pQE-80L contiene un promotor T5 regulado por un elemento operador lac, que puede estar inhibido en cis por el represor lac codificado también por pQE-80L. El plásmido se transforma luego en DH5\alpha de E. coli de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del suministrador. Después de la adición de IPTG 100 \muM a una DO_{600} nm de 0,6 durante la fase de crecimiento exponencial de E. coli, se induce la mevalonato-quinasa marcada con His_{6} a 30ºC durante 4 horas por agitación mediante sacudidas a 250 rpm. La purificación de la mevalonato-quinasa marcada con His_{6} y de enzimas mutantes de mevalonato-quinasa marcadas con His_{6} se realiza por cromatografía Ni-NTA utilizando el sistema y los reactivos QIAexpress de Qiagen.

La mutagénesis de la mevalonato-quinasa marcada con His_{6} se realiza por la denominada "PCR en dos pasos" utilizando DNA-polimerasa Turbo-Pfu de Stratagene (La Jolla, CA, EE.UU.). La primera PCR se realiza con un iniciador que contiene los codones mutados (iniciador M) y el iniciador pQE-5' correspondiente a una parte de la secuencia del extremo 5' de los sitios múltiples de clonación (MCS) de pQE-80L. El molde es pQE-80L-His-Mvk. El producto PCR se purifica por electroforesis en gel de agarosa y se utiliza como iniciador para la segunda reacción PCR que contiene también el iniciador pQE-3' que abarca una parte de la secuencia del extremo 3' de los MCS y pQE-80L-His-Mvk de tipo salvaje como molde. El producto PCR se purifica por electroforesis en gel de agarosa y se digiere con EcoRI y BamHI, con las cuales el His-Mvk se subclona en pQE-80L. Finalmente, el fragmento digerido se purifica por electroforesis en agarosa y se liga a pQE-80L linealizado por las mismas enzimas de restricción.

Ejemplo 5 Resistencia a la retroalimentación de mutantes de mevalonato-quinasa de Paracoccus zeaxanthinifaciens

Se preparó mevalonato como se describe en el Ejemplo 2. La mezcla de ensayo está constituida por: K_{2}HPO_{4}/
KH_{2}PO_{4} 100 mM (pH 7,0), ATP 1 mM, mevalonato 1 mM, MgCl_{2} 2 mM, fosfoenolpiruvato (PEP) 0,5 mM, NADH 0,32 mM, 20 U/ml de piruvato-quinasa y 27 U/ml de lactato-deshidrogenasa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.). FPP, GGPP, IPP, DMAPP, y GPP, testados como inhibidores en las mezclas de ensayo, se adquirieron todos de Sigma. Se utilizaron FPP 92 \muM o GGPP 17,6 \muM para los ensayos de inhibición realizados con los mutantes de mevalonato-quinasa. Para la comparación de la inhibición por FPP, GGPP, IPP, DMAPP y GPP, se añadieron 138 \muM de estos compuestos intermedios (Ejemplo 9). Después de la adición de mevalonato-quinasa purificada (marcada con His_{6}), la reacción enzimática reflejada por el consumo de NADH fue seguida por medida fotométrica a 340 nm.

La resistencia a la retroalimentación (%) se calcula como sigue: si a y b son las actividades medidas de mevalonato-quinasa de la enzima de tipo salvaje en ausencia y presencia, respectivamente, del inhibidor de la retroalimentación (en este caso, FPP), y si c y d son las actividades medidas de mevalonato-quinasa de la enzima mutante en ausencia y presencia, respectivamente, del mismo inhibidor de la retroalimentación, entonces el % de la resistencia a la retroalimentación es:

% resistencia = 100((d/c)-(b/a))/(1-(b/a))

TABLA 1 Impacto de la mutagénesis de la mevalonato-quinasa de Paracoccus zeaxanthinifaciens sobre la actividad específica y la resistencia a la retroalimentación de la enzima

1

WT representa la mevalonato-quinasa con SEQ ID NO:15 (con marcador His_{6}).

Resulta sorprendente que estas mutaciones afecten a la inhibición de retroalimentación de la mevalonato-quinasa. Con anterioridad, se ha propuesto que un tramo hidrófobo conservado del residuo 133 al residuo 156 de la mevalonato-quinasa humana es un buen candidato para la fijación de isoprenoides (Riou et al., Gene 148, 293-297, 1994; Houten et al., Biochim. Biophys. Acta 1529, 19-32, 2000). Sin embargo, ninguna de las mutaciones anteriores está localizada en el tramo correspondiente de la mevalonato-quinasa de Paracoccus zeaxanthinifaciens (residuos 137-160).

Se ha propuesto que un número considerable de mutaciones disminuyen o incluso destruyen la actividad de mevalonato-quinasa y, así, causan las enfermedades humanas aciduria mevalónica e hiperinmunoglobulinemia D así como el síndrome de fiebre periódica (e.g., Kl3X, H20P, H20N, L39P, W62X, S135L, A148T, Y149X, S150L, P165L, P167L, G202R, T209A, R215Q, T243I, L264F, L265P, I268T, S272F, R277C, N301T, G309S, V310M, G326R, A334T, V377I, y R388X; todas ellas en mevalonato-quinasa humana; Houten et al., Eur. J. Hum. Genet. 9, 253-259, 2001; Cuisset et al., Eur. J. Hum. Genet. 9, 260-266, 2001). De éstas, solamente dos (a saber, P165L y R215Q) se presentan en residuos correspondientes en posición dentro de la alineación de secuencia de aminoácidos con los residuos de mevalonato-quinasa de Paracoccus zeaxanthinifaciens que se ha demostrado afectan a la resistencia a la retroalimentación (a saber, los residuos 169 y 204, respectivamente). Sin embargo, no se demostró que las mutaciones descritas previamente en la mevalonato-quinasa humana tengan efecto alguno sobre la resistencia a la retroalimentación, sino que se ha sugerido más bien que afectan negativamente a la actividad (específica) de la enzima.

Ejemplo 6 Mutagénesis saturada de la mevalonato-quinasa de Paracoccus zeaxanthinifaciens en los residuos/posiciones de aminoácidos identificados previamente que afectan a la resistencia de la enzima a la inhibición de la retroalimentación

La mutagénesis saturada se realizó del mismo modo que se ha descrito arriba para la mutagénesis, excepto que el iniciador de la mutagénesis se sintetizó de una manera tal que los codones sujetos a mutagénesis saturada estaban constituidos por una secuencia aleatorizada.

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TABLA 2 Mutagénesis saturada de los residuos 167 y 169 en el mutante I17T de mevalonato-quinasa de Paracoccus zeaxanthinifaciens, y efecto sobre la actividad específica y la resistencia a la retroalimentación de la enzima

3

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WT representa la mevalonato-quinasa con SEQ ID NO:15 (con marcador His_{6}).

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TABLA 3 Mutagénesis saturada del residuo 93 en el mutante I17T, G47D de la mevalonato-quinasa de Paracoccus zeaxanthinifaciens

5

TABLA 4 Mutagénesis saturada del residuo 132 en el mutante I17T, G47D, K93E de la mevalonato-quinasa de Paracoccus zeaxanthinifaciens

6

Ejemplo 7 Producción mejorada del compuesto isoprenoide coenzima Q10 utilizando una mevalonato-quinasa resistente a la inhibición de la retroalimentación

Para testar el efecto in vivo de mutaciones que afectan a la inhibición de retroalimentación de la mevalonato-quinasa, se introdujo el mutante K93E de mevalonato-quinasa de Paracoccus zeaxanthinifaciens en un operón funcional de mevalonato clonado en un vector de amplia gama de hospedadores capaz de replicación en Paracoccus zeaxanthinifaciens. La producción del compuesto isoprenoide coenzima Q10 se comparó directamente en dos cepas recombinantes de P. zeaxanthinifaciens que difieren únicamente por la presencia o ausencia de la mutación K93E.

Construcciones de plásmidos

Las construcciones de plásmidos se representan diagramáticamente en la Figura 2. Los detalles de la clonación fueron como sigue. Se cultivaron cepas de E. coli a 37ºC en medio LB (Becton Dickinson, Sparks, MD, EE.UU.). Para el mantenimiento de los plásmidos en cepas recombinantes de E. coli, se añadieron al medio de cultivo ampicilina (100 \mug/ml) y/o kanamicina (25-50 \mug/ml, dependiendo del experimento). Se añadió agar (concentración final 1,5%) para medios sólidos. Los cultivos líquidos se dejaron crecer en una máquina de sacudidas rotativa a 200 rpm.

El plásmido pBBR-K-mev-op-wt (Figura 2) contiene el operón mevalonato, con inclusión de su región promotora, procedente de la cepa ATCC 21588 de P. zeaxanthinifaciens, insertado entre los sitios SacI y NsiI del plásmido pBBR1MCS-2 (Kovach et al., Gene 166, 175-176, 1995). El operón mevalonato clonado corresponde a la secuencia de los nucleótidos 2469 a 9001 de la secuencia que tiene el número de acceso AJ431696 en GenBank/EMBL. Entre el sitio SacI y la secuencia del operón mevalonato se encuentra una secuencia enlazadora corta, que se deriva del plásmido pCR® 2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y corresponde a la secuencia desde el sitio SacI al sitio de inserción del fragmento PCR. Debe indicarse que la secuencia con el número de acceso AJ431696 es de la cepa R114 de P. zeaxanthinifaciens (ATCC PTA-3335), no de la cepa ATCC 21588 de P. zeaxanthinifaciens. La única diferencia entre las secuencias del operón mevalonato de las cepas de P. zeaxanthinifaciens ATCC 21588 y R114 es una mutación en el gen mvk de la cepa R114. Esta mutación da como resultado un cambio del aminoácido 265 en la mevalonato-quinasa de alanina a valina (A265V). Dado que el operón mevalonato en pBBR-K-mev-op-wt es de ATCC 21588, el mismo no contiene la mutación, por tanto el codón 265 en mvk es GCC (y no GTC como en el número de acceso AJ431696).

Se construyó también un plásmido análogo a pBBR-K-mev-op-wt pero con el gen mvk de la cepa R114 y se designó pBBR-K-mev-op-R114. La introducción de un gen ddsA de la cepa ATCC 21588 de P. zeaxanthinifaciens bajo el control de la región promotora crtE entre los sitios Ecl136II y SpeI de pBBR-K-mev-op-R114 dio como resultado pBBR-K-mev-op-R114-PcrtE-ddsA_{wt} (Figura 2).

El paso final consistió en crear un plásmido idéntico a pBBR-K-mev-op-R114-PcrtE-ddsA_{wt}, pero que contenía la mutación K93E en el gen mvk. Se construyó el plásmido pBlu2SP-mvk-mvd (Figura 2) por subclonación del fragmento XmaI-SpeI de 3166 pb en el vector pBluescriptII KS+ (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.) cortado con XmaI-SpeI. El plásmido pBlu2SP-mvk-mvd tiene los sitios de endonucleasas de restricción únicos convenientes XmaI y AscI para la introducción del gen mutado mvk en el extremo 3' del operón mevalonato. El plásmido pQE-80L-mvk-K93E se cortó con XmaI y AscI, y el fragmento de 1 kb que llevaba la mayor parte de mvk, con inclusión de la mutación K93E, se ligó con la cadena principal de pBlu2SP-mvk-mvd cortada con XmaI-AscI, dando como resultado pBlu2KSp-mvk-K93E-mvd. Para reconstituir el operón mevalonato de longitud total con la mutación K93E en mvk, se cortó pBlu2KSp-mvk-K93E-mvd con XmaI y SpeI y el fragmento de 3166 pb se ligó con el fragmento XmaI - SpeI de 8,18 kb de pBBR-K-mev-op-R114-PcrtE-ddsA_{wt}, dando como resultado pBBR-K-mev-op-(mvk-K93E)-PcrtE-ddsA_{wt}. El codón 265 del gen mvk en este plásmido es GTC, dado que el gen mvk en pQE-80L-mvk-K93E se deriva de la cepa R114 de P. zeaxanthinifaciens (ATCC PTA-3335).

En resumen, los plásmidos pBBR-K-mev-op-R114-PcrtE-ddsA_{wt} y pBBR-K-mev-op-(mvk-K93E)-PcrtE-ddsA_{wt} son idénticos excepto en lo que se refiere a la presencia de la mutación K93E en el último plásmido.

Construcción de cepas recombinantes de P. zeaxanthinifaciens

Se cultivaron cepas de P. zeaxanthinifaciens a 28ºC. Las composiciones de los medios utilizados para P. zeaxanthinifaciens se describen a continuación. Todos los cultivos líquidos de P. zeaxanthinifaciens que crecieron en frascos se sometieron a agitación mediante sacudidas en una máquina de sacudidas rotativa a 200 rpm a no ser que se especifique otra cosa. Se añadió agar (concentración final 2%) para medio sólido. Cuando los medios se esterilizaron por tratamiento en autoclave, se añadió la glucosa (como una solución stock concentrada) después de esterilización para alcanzar la concentración final deseada. El medio F contiene (por litro de agua destilada): triptona, 10 g; extracto de levadura, 10 g; NaCl, 30 g; D-glucosa.H_{2}O, 10 g; MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 5 g. El pH se ajusta a 7,0 antes de la esterilización por filtración o tratamiento en autoclave. El medio 362F/2 contiene (por litro de agua destilada): D-glucosa\cdotH_{2}O, 33 g; extracto de levadura, 10 g; triptona, 10 g; NaCl, 5 g; MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 2,5 g. El pH del medio se ajusta a 7,4 antes de esterilización por filtración o tratamiento en autoclave. Después de la esterilización, se añaden 2,5 ml de cada uno de solución de microelementos, solución de NKP y solución CaFe. Las tres últimas soluciones se esterilizan por filtración. La solución de microelementos contiene (por litro de agua destilada): (NH_{4})_{2}Fe(SO_{4})_{2}.6H_{2}O, 80 g; ZnSO_{4}.7H_{2}O 6 g; MnSO_{4}.H_{2}O, 2 g; NiSO_{4}.6H_{2}O, 0,2 g; EDTA, 6 g. La solución de NKP contiene (por litro de agua destilada): K_{2}HPO_{4}, 250 g; (NH_{4})_{2}PO_{4}, 300 g. La solución CaFe contiene (por litro de agua destilada): CaCl_{2}.2H_{2}O, 75 g; FeCl_{3}.6H_{2}O, 5 g; HCl concentrado, 3,75 ml.

La preparación de células electrocompetentes de la cepa R114 de P. zeaxanthinifaciens y la electroporación se realizaron como sigue: se inocularon 100 ml de medio F con 1,5 ml de un cultivo en fase estacionaria de la cepa R114 de P. zeaxanthinifaciens y se dejaron crecer a 28ºC y 20 rpm hasta que se alcanzó una densidad óptica a 660 nm de aproximadamente 0,5. Las células se cosecharon por centrifugación durante 15 minutos a 4ºC, 7000 x g y se lavaron dos veces en 100 ml de tampón HEPES enfriado en hielo, pH 7. El sedimento final se resuspendió en 0,1 ml de tampón HEPES enfriado en hielo, pH 7 y las células se utilizaron inmediatamente para electroporación o se añadió glicerol a una concentración final de 15% y las células se guardaron en partes alícuotas de 50 \mul a -80ºC. Se añadieron 1 a 5 \mul de DNA plasmídico en solución exenta de sales y se llevaron a cabo las electroporaciones a 18 kV/cm y 129 Ohms en cubetas de 1 mm enfriadas en hielo. Las duraciones de pulsación estaban comprendidas típicamente entre 4 y 5 milisegundos. Se añadió 1 ml de medio F y se incubaron las células durante una hora a 28ºC. Las diluciones se extendieron en placas de agar F que contenían 25-50 \mug/ml de kanamicina y se incubaron a 28ºC. Se confirmó que los transformantes supuestos contenían el plásmido deseado por análisis PCR.

Condiciones de cultivo para evaluación de la producción de la coenzima Q10

La producción de coenzima Q10 se testó en cultivos "fed-batch" de las cepas de P. zeaxanthinifaciens R114/pBBR-K-mev-opR114-PcrtE-ddsA_{wt} y R114/pBBR-K-mev-op-(mvk-K93E)-PcrtE-ddsA_{wt}. Todos los cultivos se iniciaron a partir de suspensiones de células congeladas (guardadas como stock en glicerol al 25% a -80ºC). Los precultivos de las fermentaciones fed-batch se prepararon en frascos de sacudidas duplicados de dos litros con placas de desviación, que contenían 200 ml de medio 362F/2 cada uno. Se utilizaron 2 mililitros de suspensión de células descongeladas como inóculo para cada frasco. El pH inicial de los precultivos era 7,2. Los precultivos se incubaron a 28ºC con agitación mediante sacudidas a 250 rpm durante 28 horas, después de cuyo tiempo la densidad óptica a 660 nm (OD_{660}) estaba comprendida entre 14 y 22 unidades de absorbancia, dependiendo de la cepa utilizada. Los cultivos principales se dejaron crecer en biorreactores Biostat ED (B. Braun Biotech International, Melsungen, Alemania) que contenían medio que tenía la composición siguiente (por litro de agua destilada): D-glucosa.H_{2}O, 25 g; extracto de levadura (Tastone 900), 17 g; NaCl, 4,0 g; MgSO_{4}.7H_{2}O, 6,25 g; (NH_{4})_{2}Fe(SO_{4})_{2}.6H_{2}O, 0,5 g; ZnSO_{4}.7H_{2}O, 0,038 g; MnSO_{4}.H_{2}O, 0,013 g; NiSO_{4}.6H_{2}O, 0,001 g; CaCl_{2}.2H_{2}O, 0,47 g; FeCl_{3}.6H_{2}O, 0,062 g; niacina, 0,01 g; NH_{4}Cl, 0,5 g; antiespumante, 0,1 ml; solución KP, 3,5 ml. La composición de la solución KP es (por litro de agua destilada): K_{2}HPO_{4}, 250 g; NaH_{2}PO_{4}\cdot2H_{2}O, 200 g; (NH_{4})_{2}HPO_{4}, 100 g. Se añadió kanamicina (50 mg/l de concentración final) al medio para las cepas portadoras de plásmido. La solución de alimentación utilizada en todos los procesos tenía la composición siguiente (por litro de agua destilada): D-glucosa\cdotH_{2}O, 550 g; solución KP, 18,25 ml. El volumen inicial en el biorreactor (después de la inoculación) era 8,0 l. Los precultivos se diluyeron en caso necesario con agua estéril de tal modo que la adición de 400 ml al biorreactor alcanzara un valor DO_{660} de 0,5. Las condiciones de fermentación se controlaron automáticamente como sigue: 28ºC, pH 7,2 (pH controlado con adición de NH_{4}OH al 28%), y el oxígeno disuelto se controló a un mínimo de valor relativo 40% (en cascada con agitación), agitación mínima de 300 rpm y una tasa de aireación de 1 v.v.m. (con relación al volumen final). Los cultivos transcurrieron en estas condiciones sin adición de solución de alimentación durante aproximadamente 20 horas (fase de lotes). Después de este tiempo, una disminución en la velocidad de agitación, la cesación del consumo de base, un aumento brusco del pH y una disminución en la producción de CO_{2} eran indicación de que la glucosa inicial se había agotado y se inicio la alimentación. Un perfil estándar de alimentación se definió como sigue (desde el momento de inició de la alimentación): aumento brusco desde 50 g/h a 80 g/h en 17 horas, continuación a 80 g/h durante 7 horas y luego disminución brusca a 55 g/h en 11 horas, y continuación a 55 g/h durante el resto de la fermentación (tiempo total de fermentación = 70 horas). Los volúmenes finales de los cultivos principales eran aproximadamente 10 litros.

Métodos analíticos

Reactivos. Acetonitrilo, dimetilsulfóxido (DMSO), tetrahidrofurano (THF), terc-butil-metiléter (TBME), e hidroxitolueno butilado (BHT) eran purísimos, para análisis o de grado HPLC, y se obtuvieron de Fluka (Suiza). La coenzima Q10 se adquirió de Fluka. El metanol (Lichrosolv) se adquirió de Merck, Darmstadt, Alemania. Los estándares de carotenoides se obtuvieron del Chemistry Research Department, Roche Vitamins Ltd., Suiza.

Preparación y extracción de la muestra. Se transfirieron 400 microlitros de caldo completo a un tubo de centrífuga desechable de polipropileno de 15 ml. Se añadieron 4 mililitros de solución de extracción estabilizada (0,5 g/l de BHT en 1:1 (v/v) DMSO/THF) y las muestras se mezclaron durante 20 minutos en un agitador de sacudidas de laboratorio (IKA, Alemania) para mejorar la extracción. Finalmente, se centrifugaron las muestras y los sobrenadantes se transfirieron a viales de vidrio ámbar para análisis por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

HPLC. Se desarrolló un método HPLC de fase inversa para la determinación simultánea de ubiquinonas y sus hidroquinonas correspondientes. El método es capaz de separar claramente los carotenoides zeaxantina, fitoeno, \beta-criptoxantina, \beta-caroteno y licopeno de la coenzima Q10. La cromatografía se realizó utilizando un sistema HPLC Agilent 1100, equipado con un automuestreador controlado en temperatura y un detector de red de diodos. Los parámetros del método eran como sigue:

7

TABLA 5 Tiempos de retención en la HPLC y longitudes de onda utilizadas

8

Cálculos, selectividad, linealidad, límite de detección y reproducibilidad. Los cálculos se basaron en las áreas de los picos. La selectividad del método se comprobó por inyección de soluciones estándar de los compuestos de referencia relevantes. Los compuestos diana (coenzima Q10 y ubiquinol 10) se separaron completamente y no acusaron interferencia alguna. Se preparó y se analizó una serie diluciones de la coenzima Q10 en solución de extracción (véase arriba). Se encontró un intervalo lineal desde 5 mg/l a 50 mg/l. El coeficiente de correlación era 0,9999. Se determinó que el límite de detección para la coenzima Q10 por este método HPLC era 4 mg/l. Se comprobó la reproducibilidad del método con inclusión del procedimiento de extracción. Se compararon 10 preparaciones individuales de muestra. Se determinó que la desviación estándar relativa era 4%.

Resultados de producción de la coenzima Q10

En las condiciones de cultivo fed-batch arriba descritas, la concentración final de coenzima Q10 producida por la cepa de P. zeaxanthinifaciens R114/pBBR-K-mev-op-(mvk-K93E)-PcrtE-ddsA_{wt} era 34% mayor que la observada para la cepa R114/pBBR-K-mev-opR114-PcrtE-ddsA_{wt}. Esta diferencia no era atribuible simplemente a diferencias en el crecimiento de las dos cepas, dado que la cepa R114/pBBR-K-mev-op-(mvk-K93E)-PcrtE-ddsA_{wt} exhibía también una producción 12% mayor de la coenzima específica Q10 (unidades de coenzima Q10/masa de células secas en gramos/hora) comparada con la cepa R114/pBBR-K-mev-opR114-PcrtE-ddsA_{wt}. Adicionalmente, la cepa R114/pBBR-K-mev-op-(mvk-K93E)-PcrtE-ddsA_{wt} exhibía también un 31% de disminución en la acumulación de mevalonato en el caldo comparada con la cepa R114/pBBR-K-mev-opR114-PcrtE-ddsA_{wt}. Esta comparación indicaba que la mutación K93E en el plásmido pBBR-K-mev-op-(mvk-K93E)-PcrtE-ddsA_{wt} es directamente responsable de la producción incrementada de coenzima Q10.

Ejemplo 8 Efecto de la mutación I17T sobre la solubilidad de la mevalonato-quinasa de Paracoccus zeaxan-thinifaciens

Para la mevalonato-quinasa humana, se demostró que los mutantes E19A, E19Q y H20A eran completamente insolubles después de inducción con IPTG de transformantes de E. coli (Potter y Miziorko, J. Biol. Chem. 272, 25449-25454, 1997). La mevalonato-quinasa de Paracoccus zeaxanthinifaciens R114 marcada con His_{6} (SEQ ID No: 15) exhibía también una tendencia acusada a agregarse/preci-pitar, en particular en soluciones tampón con concentración iónica bastante alta (v.g., NaH_{2}PO_{4} 50 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM). Sorprendentemente, el mutante I17T de mevalonato-quinasa de Paracoccus zeaxanthinifaciens M114 marcado con His_{6} era completamente soluble y estable en las mismas condiciones, por lo que esta enzima mutante es mucho más adecuada para aplicaciones que requieran mevalonato-quinasa soluble.

Ejemplo 9 Inhibición de la retroalimentación de mevalonato-quinasa con productos diferentes aguas abajo del camino

Se informó previamente que diferentes mevalonato-quinasas son sensibles a la inhibición de retroalimentación por los productos siguientes aguas abajo del camino de mevalonato: IPP, DMAPP, GPP, FPP, GGPP, fitil-PP, farnesol, y dolicol-fosfato. A 138 \muM de GGPP, FPP, GPP, IPP, o DMAPP, la actividad de la mevalonato-quinasa de Paracoccus zeaxanthinifaciens marcada con His_{6} era inhibida en un 98%, 80,1%, 18,6%, 16,3% y 14,7%, respectivamente. La resistencia del mutante I17T/G47D/K93E/P132S de mevalonato-quinasa de Paracoccus zeaxanthinifaciens a la inhibición de retroalimentación por FPP (92 \muM) o GGPP (17,6 \muM) era 83% y 92%, respectivamente.

Ejemplo 10 Identificación de residuos correspondientes en mevalonato-quinasas que son homólogas a mevalonato-quinasa de Paracoccus zeaxanthinifaciens

Con el programa de alineamiento de secuencias GAP (GCG Wisconsin Package, versión 10.2, Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752, EE.UU.; penalidad por creación de laguna 8; penalidad por extensión de laguna 2), se identificaron los residuos siguientes correspondientes a posiciones específicas de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la mevalonato-quinasa de Paracoccus zeaxanthinifaciens (SEQ ID No: 1):

9

\vskip1.000000\baselineskip

Numeración de aminoácidos de acuerdo con las secuencias respectivas SEQ ID NOs: 1-15 y 30.

(-) No se ha identificado ningún residuo homólogo.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplos de secuencias de aminoácidos de mevalonato-quinasas no modificadas incluyen, pero sin carácter limitante, las secuencias de aminoácidos siguientes SEQ ID NOs: 1-15 y 30). Las secuencias de nucleótidos que codifican las mevalonato-quinasas no modificadas (SEQ ID NOs: 1-14 y 30) se muestran en SEQ ID NOs: 16-29 y 31, respectivamente.

SEQ ID No: 1: Secuencia de aminoácidos de la mevalonato-quinasa de Paracoccus zeaxanthinifaciens.

SEQ ID NO:2: Secuencia de aminoácidos de mevalonato-quinasa humana (nº de acceso a Swiss-Prot Q03426).

SEQ ID NO:3: Secuencia de aminoácidos de mevalonato-quinasa de ratón (nº de acceso a Swiss-Prot Q9R008).

SEQ ID NO:4: Secuencia de aminoácidos de mevalonato-quinasa de rata (nº de acceso a Swiss-Prot P17256).

SEQ ID NO:5: Secuencia de aminoácidos de mevalonato-quinasa de Arabidopsis thaliana (nº de acceso a Swiss-Prot P46086).

SEQ ID NO:6: Secuencia de aminoácidos de mevalonato-quinasa de levadura (nº de acceso a Swiss-Prot P07277).

SEQ ID NO:7: Secuencia de aminoácidos de mevalonato-quinasa de Schizosaccharomyces pombe (nº de acceso a Swiss-Prot Q09780).

SEQ ID NO:8: Secuencia de aminoácidos de mevalonato-quinasa de Pyrococcus abyssi (nº de acceso a Swiss-Prot Q9V187).

SEQ ID NO:9: Secuencia de aminoácidos de mevalonato-quinasa de Pyrococcus horikoshii (nº de acceso a Swiss-Prot O59291).

SEQ ID NO:10: Secuencia de aminoácidos de mevalonato-quinasa de Pyrococcus furiosus (nº de acceso a Swiss-Prot Q8U0F3).

SEQ ID NO:11: Secuencia de aminoácidos de mevalonato-quinasa de Methanobacterium thermoautotrophicum (nº de acceso a Swiss-Prot Q50559).

SEQ ID NO:12: Secuencia de aminoácidos de mevalonato-quinasa de Archaeoglobus fulgidus (nº de acceso a SwissProt O27995).

SEQ ID NO:13: Secuencia de aminoácidos de mevalonato-quinasa de Methanococcus jannaschii (nº de acceso a Swiss-Prot Q58487).

SEQ ID NO:14: Secuencia de aminoácidos de mevalonato-quinasa de Aeropyrum pernix (nº de acceso a Swiss-Prot Q9Y946).

SEQ ID NO:15: Secuencia de aminoácidos de mevalonato-quinasa de Paracoccus zeaxanthinifaciens marcada con His_{6}.

SEQ ID NO:16: Secuencia de DNA de mevalonato-quinasa de Paracoccus zeaxanthinifaciens.

SEQ ID NO:17: Secuencia de DNA de mevalonato-quinasa humana (nº de acceso a Genbank M88468).

SEQ ID NO:18: Secuencia de DNA de mevalonato-quinasa de ratón (nº de acceso a Genbank AF137598).

SEQ ID NO:19: Secuencia de DNA de mevalonato-quinasa de rata (nº de acceso a Genbank M29472).

SEQ ID NO:20: Secuencia de DNA de mevalonato-quinasa de Arabidopsis thaliana (nº de acceso a Genbank X77793).

SEQ ID NO:21: Secuencia de DNA de mevalonato-quinasa de levadura (nº de acceso a Genbank X06114).

SEQ ID NO:22: Secuencia de DNA de mevalonato-quinasa de Schizosaccharomyces pombe (nº de acceso a Genbank AB000541).

SEQ ID NO:23: Secuencia de DNA de mevalonato-quinasa de Pyrococcus abyssi (nº de acceso a Genbank
AJ248284).

\newpage

SEQ ID NO:24: Secuencia de DNA de mevalonato-quinasa de Pyrococcus horikoshii (nº de acceso a Genbank AB009515; dirección inversa).

SEQ ID NO:25: Secuencia de DNA de mevalonato-quinasa de Pyrococcus furiosus (nº de acceso a Genbank AE010263; dirección inversa).

SEQ ID NO:26: Secuencia de DNA de mevalonato-quinasa de Methanobacterium thermoautotrophicum (nº de acceso a Genbank U47134).

SEQ ID NO:27: Secuencia de DNA de mevalonato-quinasa de Archaeoglobus fulgidus (nº de acceso a Genbank AE000946; dirección inversa).

SEQ ID NO:28: Secuencia de DNA de mevalonato-quinasa de Methanococcus jannaschii (nº de acceso a Genbank U67551).

SEQ ID NO:29: Secuencia de DNA de mevalonato-quinasa de Aeropyrum pernix (nº de acceso a Genbank
AP000064).

SEQ ID NO:30: Secuencia de aminoácidos de mevalonato-quinasa de Phaffia rhodozyma ATCC96594.

SEQ ID No: 31: Secuencia de genes (DNA) de mevalonato-quinasa de Phaffia rhodozyma ATCC96594. El gen de mevalonato-quinasa está constituido por cuatro intrones y cinco exones.

\vskip1.000000\baselineskip

Exón 1:: 1021-1124

Intrón 1:: 1125-1630

Exón 2:: 1631-1956

Intrón 2:: 1957-2051

Exón 3:: 2052-2366

Intrón 3:: 2367-2446

Exón 4:: 2447-2651

Intrón 4:: 2652-2732

Exón 5:: 2733-3188

Sitio poliA:: 3284

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SEQ ID NO:32: Secuencia de DNA del mutante I17T de mevalonato-quinasa de Paracoccus zeaxanthinifaciens marcado con His_{6}.

SEQ ID NO:33: Secuencia de DNA del mutante I17T/G47D/K93E/P132S de mevalonato-quinasa de Paracoccus zeaxanthinifaciens marcado con His_{6}.

<110> DSM IP Assets B.V.

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\vskip0.400000\baselineskip

<120> Mevalonato-quinasas resistentes a la retroalimentación

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<130> Caso 21788

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> EP 03012294.9

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2003-06-12

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 33

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn versión 3.2

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

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<211> 378

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<212> PRT

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<213> Paracoccus zeaxanthinifaciens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

10

\hskip1cm

11

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<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 396

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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\hskip1cm

12

\hskip1cm

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

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<211> 395

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> ratón

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

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\hskip1cm

14

\hskip1cm

16

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211> 395

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> rata

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

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\hskip1cm

17

\hskip1cm

18

\hskip1cm

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

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<211> 378

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<212> PRT

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<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

20

\hskip1cm

21

\hskip1cm

22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

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<211> 443

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharomyces cerevisiae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

23

\hskip1cm

24

\hskip1cm

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 404

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Schizosaccharomyces pombe

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

26

\hskip1cm

27

\hskip1cm

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 335

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Pyrococcus abyssi

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

29

\hskip1cm

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 335

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Pyrococcus horikoshii

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\hskip1cm

31

\hskip1cm

32

\hskip1cm

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 334

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Pyrococcus furiosus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

34

\hskip1cm

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 303

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Methanobacterium thermoautotrophicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

36

\hskip1cm

37

\hskip1cm

38

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 284

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Archaeoglobus fulgidus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

39

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 312

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Methanococcus jannaschii

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

41

\hskip1cm

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Aeropyrym pernix

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

43

\hskip1cm

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 387

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> His6-Paracoccus zeaxanthinifaciens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

45

\hskip1cm

46

\hskip1cm

47

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1137

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Paracoccus zeaxanthinifaciens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1191

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1188

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> ratón

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\hskip1cm

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1188

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> rata

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

52

\hskip1cm

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1137

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

54

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1332

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharomyces cerevisiae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1215

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Schizosaccharomyces pombe

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1008

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pyrococcus abyssi

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1008

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pyrococcus horikoshii

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\hskip1cm

60

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1005

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Pyrococcus furiosus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\hskip1cm

62

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 912

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Methanobacterium thermoautotrophicum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

64

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 855

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Archaeoglobus fulgidus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\hskip1cm

65

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 939

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Methanococcus jannaschii

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\hskip1cm

67

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 975

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Aeropyrum pernix

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 432

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Phaffia rhodozyma ATCC 96594

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

69

\hskip1cm

70

\hskip1cm

71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4135

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Phaffia rhodozyma ATCC96594

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

72

\hskip1cm

73

\hskip1cm

74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1164

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Paracoccus zeaxanthinifaciens I17T

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1164

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Paracoccus zeaxanthinifaciens I17T, G47D, K93E, P132S

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

77

Claims

1. Una mevalonato-quinasa modificada que exhibe una sensibilidad a la inhibición de retroalimentación que es reducida en comparación con la mevalonato-quinasa no modificada correspondiente en donde

(i): la secuencia de aminoácidos de la mevalonato-quinasa modificada contiene al menos una mutación cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de la mevalonato-quinasa no modificada correspondiente y

(ii): la al menos una mutación se encuentra en una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo constituido por las posiciones de los aminoácidos correspondientes a las posiciones 17, 47, 93, 94, 204, y 266 de la secuencia de amino-ácidos de la mevalonato-quinasa de Paracoccus zeaxanthinifaciens que se muestra en SEQ ID NO:1, en donde la al menos una mutación es I17T, G47D, K93E, V94I, R204H o C266S.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Una mevalonato-quinasa modificada de acuerdo con la reivindicación 1, que contiene al menos dos mutaciones, en donde las al menos dos mutaciones son P132A/P375R, R167W/K169Q, I17T/G47D o I17T/K93E.

3. Un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una mevalonato-quinasa modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.

4. Un vector o plásmido que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 3.

5. Una célula hospedadora aislada transformada genéticamente que comprende como transgén un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 3 o un vector o plásmido de acuerdo con la reivindicación 4.

6. Un método para producir un compuesto isoprenoide que comprende:

a) cultivar la célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 5 en un medio adecuado; y

b) opcionalmente, separar el compuesto isoprenoide del medio.

7. Un método para producir una mevalonato-quinasa modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, que comprende:

a): cultivar una población de células hospedadoras de acuerdo con la reivindicación 5 en un medio adecuado; y

b): opcionalmente, recuperar la mevalonato-quinasa modificada de las células o del medio.

\vskip1.000000\baselineskip

8. El uso de una mevalonato-quinasa modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 o un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 3 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la aciduria mevalónica, la hiperinmunoglobulinemia D y el síndrome de fiebre periódica.

9. El uso de una mevalonato-quinasa modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 o un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 3 para determinar la concentración de mevalonato en fluidos biológicos.

10. El uso de una mevalonato-quinasa modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 o un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 3 para aumentar la producción de un compuesto isoprenoide.