KR20170052647A - 재조합 숙주에서 스테비올 글리코시드의 생성 - Google Patents

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KR20170052647A
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미하엘 달가르트 미켈슨
옌스 호튼-라르센
베로니크 도친
제인 다노우 디에캐르
시몬 칼센
니나 니콜린 라스무센
에스벤 홀캐르 한센
헬레나 룬드 로버트슨
아이벤 노르트마르크 앤더슨
아담 매튜 타코스
스위 창 림 할윌
프란세스카 암브리
마누엘 퀴로스 아센시오
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에볼바 에스아
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Abstract

본 발명은 스테비올 글리코시드 및 스테비올 글리코시드 전구체를 생성하기 위한 재조합 미생물 및 방법에 관한 것이다.

Description

재조합 숙주에서 스테비올 글리코시드의 생성 {PRODUCTION OF STEVIOL GLYCOSIDES IN RECOMBINANT HOSTS}
본 발명은 재조합 숙주에서 스테비올 글리코시드 및 스테비올 글리코시드 전구체의 재조합 생성 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 재조합 숙주에서 스테비올-13-O-글루코시드 (13-SMG), 스테비올-1,2-바이오사이드, 스테비올-1,3-바이오사이드, 스테비올-19-O-글루코시드 (19-SMG), 스테비오사이드, 1,3-스테비오사이드, 루부소사이드, 레바우디오사이드 A (RebA), 레바우디오사이드 B (RebB), 레바우디오사이드 C (RebC), 레바우디오사이드 D (RebD), 레바우디오사이드 E (RebE), 레바우디오사이드 F (RebF), 레바우디오사이드 M (RebM), 레바우디오사이드 Q (RebQ), 레바우디오사이드 I (RebI), 둘코사이드 A 또는 이들의 이성질체를 포함하는 스테비올 글리코시드의 생성 방법에 관한 것이다.
감미료는 식품, 음료, 또는 과자 산업에서 가장 흔히 이용되는 성분들로 잘 알려져 있다. 감미료는 생산 동안 최종 식품에 통합될 수 있거나 단독 용도로 적절하게 희석시켰을 때, 식탁 감미료 또는 베이킹에서 설탕을 대체하는 가정용 대체물로 이용할 수 있다. 감미료는 예를 들어 수크로스, 고과당 옥수수 시럽, 당밀, 메이플 시럽, 및 꿀과 같은 천연 감미료, 및 아스파르탐, 사카린 및 수크랄로스와 같은 인공 감미료를 포함한다. 스테비아(Stevia) 추출물은 다년생 관목, 스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana)로부터 분리되고 추출될 수 있는 천연 감미료이다. 스테비아 추출물의 상업적 생산을 위한 스테비아는 남미 및 아시에에서 흔히 자란다. 다양한 수준으로 정제된 스테비아 추출물은 식품 및 블렌드에서 고감도 감미료로 또는 단독으로 식탁 감미료로 상업적으로 이용된다.
디테르펜 스테비올 및 다양한 스테비올 글리코시드를 포함하는, 여러 스테비올 글리코시드에 대한 화학 구조는 도 1에 도시되어 있다. 스테비아 식물의 추출물들은 단맛에 기여하는 스테비올 글리코시드를 일반적으로 포함하지만, 각 스테비올 글리코시드의 양은 특히 다양한 생산 배치 (batches)에 따라 종종 변화한다.
스테비아 식물로부터의 스테비올 글리코시드의 회수 및 정제가 노동 집약적이고 비효율적인 것으로 밝혀지면서, RebD 및 RebM과 같은 고수율의 요망되는 스테비올 글리코시드를 축적할 수 있는 재조합 생산 시스템이 여전히 요구되고 있다. 또한, 상업적 용도를 위한 재조합 숙주에서 스테비올 글리코시드의 개선된 생산에 대한 요구가 여전히 존재한다.
발명의 개요
상기 배경에 대하여 본 발명은 종래 기술에 비해 특정 이점 및 진보를 제공한다.
본원에 개시된 본 발명은 특정 이점 또는 기능으로 한정되는 것은 아니나, 본 발명은
(a) ent-카우렌 옥시다제 (KO) 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자;
(b) 사이토크롬 P450 리덕타제 (CPR) 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자; 및/또는
(c) ent-카우레노산 하이드록실라제 (KAH) 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자 중 하나 이상을 포함하는 재조합 숙주를 제공하며;
여기에서 유전자 중 적어도 하나는 재조합 유전자이며;
재조합 숙주는 스테비올 글리코시드 전구체를 생성할 수 있다.
본 발명은 또한,
(a) 게라닐게라닐 디포스페이트 신타제 (GGPPS) 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자;
(b) ent-코팔릴 디포스페이트 신타제 (CDPS) 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자;
(c) ent-카우렌 신타제 (KS) 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자;
(d) ent-카우렌 옥시다제 (KO) 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자;
(e) 사이토크롬 P450 리덕타제 (CPR) 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자; 및
(f) ent-카우레노산 하이드록실라제 (KAH) 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 숙주를 제공하며;
여기에서 유전자 중 적어도 하나는 재조합 유전자이고;
재조합 숙주는 스테비올을 생성할 수 있다.
본원에 기재된 재조합 숙주의 한 양태에서,
(a) KO 폴리펩티드는 SEQ ID NO:72 또는 SEQ ID NO:75에 제시된 아미노산 서열과 적어도 60%의 동일성; SEQ ID NO:54에 제시된 아미노산 서열과 적어도 65%의 동일성; SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, 또는 SEQ ID NO:79에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%의 동일성; SEQ ID NO:77에 제시된 아미노산 서열과 적어도 40%의 동일성; 또는 SEQ ID NO:78에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%의 동일성을 갖는 KO 폴리펩티드를 포함하고/거나;
(b) CPR 폴리펩티드는 SEQ ID NO:69, SEQ ID NO 74, SEQ ID NO:76 또는 SEQ ID NO:87에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%의 동일성; SEQ ID NO:73에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성; SEQ ID NO:22에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%의 동일성; SEQ ID NO:28에 제시된 아미노산 서열과 적어도 65%의 동일성; 또는 SEQ ID NO:98에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%의 동일성을 갖는 CPR 폴리펩티드를 포함하고/거나;
(c) KAH 폴리펩티드는 SEQ ID NO:82에 제시된 아미노산 서열과 적어도 40%의 동일성; SEQ ID NO:91에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%의 동일성; 또는 SEQ ID NO:68에 제시된 아미노산 서열과 적어도 60%의 동일성을 갖는 KAH 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명은
(a) SEQ ID NO:75에 제시된 아미노산 서열과 적어도 60%의 동일성을 갖는 KO 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자;
(b) SEQ ID NO:82에 제시된 아미노산 서열과 적어도 40%의 동일성을 갖는 KAH 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자; 및/또는
(c) SEQ ID NO:98에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%의 동일성을 갖는 CPR 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자중 하나 이상을 포함하는 재조합 숙주를 추가로 제공하며;
여기에서 유전자 중 적어도 하나가 재조합 유전자이며;
재조합 숙주는 스테비올 글리코시드 전구체를 생성할 수 있다.
본 발명은
(a) SEQ ID NO:70에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 KO 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자;
(b) SEQ ID NO:82에 제시된 아미노산 서열과 적어도 40%의 동일성을 갖는 KAH 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자; 및/또는
(c) SEQ ID NO:98에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%의 동일성을 갖는 CPR 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자 중 적어도 하나 이상을 포함하는 재조합 숙주를 추가로 제공하고;
여기에서 유전자 중 적어도 하나가 재조합 유전자이며;
재조합 숙주는 스테비올 글리코시드 전구체를 생성할 수 있다.
본원에 기재된 재조합 숙주의 한 양태에서, 숙주는 SEQ ID NO:54에 제시된 아미노산 서열과 적어도 65%의 동일성을 갖는 KO 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 재조합 숙주의 또 다른 양태에서, 재조합 숙주는 SEQ ID NO:68에 제시된 아미노산 서열과 적어도 60%의 동일성을 갖는 KAH 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 재조합 숙주의 또 다른 양태에서, 재조합 숙주는 SEQ ID NO:79에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 KO 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 재조합 숙주의 한 양태에서, 숙주는
(a) 게라닐게라닐 디포스페이트 신타제 (GGPPS) 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자;
(b) ent-코팔릴 디포스페이트 신타제 (CDPS) 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자; 및/또는
(c) ent-카우렌 신타제 (KS) 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자 중 하나 이상을 추가로 포함하며;
여기에서 유전자 중 적어도 하나가 재조합 유전자이며;
재조합 숙주는 스테비올 글리코시드 전구체를 생성할 수 있다.
본원에 기재된 재조합 숙주의 일부 양태에서,
(a) GGPPS 폴리펩티드는 SEQ ID NO:49에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하고/거나;
(b) CDPS 폴리펩티드는 SEQ ID NO:37에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하고/거나;
(c) KS 폴리펩티드는 SEQ ID NO:6에 제시된 아미노산 서열과 적어도 40%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
본원에 기재된 재조합 숙주의 한 양태에서, 재조합 숙주는 세포질 그물 막 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 재조합 숙주의 또 다른 양태에서, 세포질 그물 막 폴리펩티드는 SEQ ID NO:114에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%의 동일성을 갖는 유전 피질 ER 단백질 2 (ICE2) 폴리펩티드를 포함한다.
본원에 기재된 재조합 숙주의 한 양태에서, KO 폴리펩티드는 융합 작제물이다.
또 다른 양태에서, 융합 작제물은 SEQ ID NO:118 또는 SEQ ID NO:120에 제시된 아미노산 서열과 적어도 60%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
또 다른 양태에서, 융합 작제물은 SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:110, 또는 SEQ ID NO:112에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%의 동일성을 갖는다.
본원에 기재된 재조합 숙주의 한 양태에서, 숙주는
(a) UGT85C 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자;
(b) UGT76G 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자;
(c) UGT74G1 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자;
(d) UGT91D2 기능성 호몰로그 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자; 및/또는
(e) EUGT11 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자 중 하나 이상을 추가로 포함하며;
여기에서 유전자 중 적어도 하나가 재조합 유전자이며;
숙주는 스테비올 글리코시드를 생성할 수 있다.
본원에 기재된 재조합 숙주의 일부 양태에서,
(a) UGT85C2 폴리펩티드는 SEQ ID NO:30에 제시된 아미노산 서열과 적어도 55%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하고/거나;
(b) UGT76G1 폴리펩티드는 SEQ ID NO:83에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하고/거나;
(c) UGT74G1 폴리펩티드는 SEQ ID NO:29에 제시된 아미노산 서열과 적어도 55%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하고/거나;
(d) UGT91D2 기능성 호몰로그 폴리펩티드는 SEQ ID NO:84에 제시된 아미노산 서열과 90% 또는 그 초과의 동일성을 갖는 UGT91D2 폴리펩티드 또는 SEQ ID NO:88에 제시된 아미노산 서열과 90% 또는 그 초과의 동일성을 갖는 UGT91D2e-b 폴리펩티드를 포함하고/거나;
(e) EUGT11 폴리펩티드는 SEQ ID NO:86에 제시된 아미노산 서열과 적어도 65%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 재조합 숙주는 식물 세포, 포유동물 세포, 곤충 세포, 진균류 세포 또는 박테리아 세포를 포함한다.
한 양태에서, 박테리아 세포는 에스체리치아 박테리아 세포, 예를 들어, 에스체리치아 콜라이 세포; 락토바실러스 박테리아 세포, 락토코커스 박테리아 세포, 코르네박테리움 박테리아 세포, 아세토박터 박테리아 세포, 아시네토박터 박테리아 세포, 또는 슈도모나스 박테리아 세포를 포함한다.
한 양태에서, 진균류 세포는 효모 세포를 포함한다.
한 양태에서, 효모 세포는 사카로마아세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 아쉬비아 고시피이(Ashbya gossypii), 사이베를린드네라 자디니이(Cyberlindnera jadinii), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 칸디다 보이디니이(Candida boidinii), 아르술라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans), 잔토필로마이세스 덴드로르호우스(Xanthophyllomyces dendrorhous), 또는 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 종으로부터의 세포이다.
한 양태에서, 일부 양태에서, 효모 세포는 사카로마이세테(Saccharomycete)이다.
한 양태에서, 효모 세포는 사카로마이세스 세레비시애 종으로부터의 세포이다.
본 발명은
(a) 본원에 기재된 임의의 유전자가 발현되는 조건하에 배양 배지에서 본원에 기재된 재조합 숙주를 성장시키는 단계로서,
스테비올 글리코시드 또는 스테비올 글리코시드 전구체가 상기 숙주에 의해 합성되는 단계; 및/또는
(b) 선택적으로 스테비올 글리코시드 또는 스테비올 글리코시드 전구체를 정량화시키는 단계; 및/또는
(c) 선택적으로, 스테비올 글리코시드 또는 스테비올 글리코시드 전구체를 분리하는 단계를 포함하여, 스테비올 글리코시드 또는 스테비올 글리코시드 전구체를 생성하는 방법을 추가로 제공한다.
일부 양태에서, 스테비올 글리코시드는 스테비올-13-O-글루코시드 (13-SMG), 스테비올-1,2-바이오사이드, 스테비올-1,3-바이오사이드, 스테비올-19-O-글루코시드 (19-SMG), 스테비오사이드, 1,3-스테비오사이드, 루부소사이드, 레바우디오사이드 A (RebA), 레바우디오사이드 B (RebB), 레바우디오사이드 C (RebC), 레바우디오사이드 D (RebD), 레바우디오사이드 E (RebE), 레바우디오사이드 F (RebF), 레바우디오사이드 M (RebM), 레바우디오사이드 Q (RebQ), 레바우디오사이드 I (RebI), 둘코사이드 A, 디-글리코실화된 스테비올, 트리-글리코실화된 스테비올, 테트라-글리코실화된 스테비올, 펜타-글리코실화된 스테비올, 헥사-글리코실화된 스테비올, 헵타-글리코실화된 스테비올, 또는 이들의 이성질체를 포함한다..
일부 양태에서, 본원에 기재된 방법 또는 재조합 숙주에 의해 생성된 스테비올 글리코시드 또는 스테비올 글리코시드 전구체는 상기 조건 하에서 배양될 때 검출 가능한 농도로 축적된다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 방법 또는 재조합 숙주에 의해 생성된 스테비올 글리코시드 또는 스테비올 글리코시드 전구체는 검출불가능한 농도의 스테비아 식물-유래된 오염물질을 갖는다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 방법 또는 재조합 숙주에 의해 생성된 스테비올 글리코시드 또는 스테비올 글리코시드 전구체는 야생형 스테비아 식물의 스테비올 글리코시드 조성물과 비교하여 RebD 또는 RebM이 풍부한 스테비올 글리코시드 조성을 갖는다.
본 발명의 이러한 및 그 밖의 특징 및 이점은 첨부된 청구범위와 함께 취해진 하기 상세한 설명으로부터 더욱 잘 이해될 것이다. 청구범위는 청구범위의 기술에 의해 규정되며 본 설명에서 제시된 특징 및 이점의 특정 논의에 의해 규정되지 않음이 주지된다.
본 발명의 구체예의 하기 상세한 설명은 하기 도면과 함께 숙지할 경우 가장 잘 이해될 것이며, 여기에서 동일한 구조물이 동일한 참조 번호로 표시된다:
도 1은 게라닐게라닐 디포스페이트 신타제 (GGPPS), ent-코팔릴 디포스페이트 신타제 (CDPS), ent-카우렌 신타제 (KS), ent-카우렌 옥시다제 (KO), 및 ent-카우레노산 하이드록실라제 (KAH) 폴리펩티드를 사용하여 게라닐게라닐 디포스페이트로부터 효모 중에서 스테비올을 생성하는 조작된 생합성 경로의 개략도를 보여준다.
도 2는 여러 스테비올 글리코시드 화합물에 적합한 유리딘 5'-디포스포(UDP) 글리코실 트랜스퍼라제 (UGT) 효소 및 화학 구조에 의해 촉매화된 대표적인 스테비올 글리코시드 글리코실화 반응을 보여준다.
도 3은 SEQ ID NO:59에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩되는 S. 레바우디아나 KO1 (SrKO1), SEQ ID NO:55에 제시된 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO, 또는 SEQ ID NO:56에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO를 개별적으로 발현하는 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애에서의 레바우디오사이드 B (RebB) 생성을 보여준다. RebB 생성은 개별 배양물의 μM/OD600으로서 액체 크로마토그래피-질량 분광법 (LC-MS) 분석에 의해 측정되었다. 실시예 3 참조.
도 4은 배양 샘플의 LC-MS에 의해 측정되는 바와 같이 SEQ ID NO:59에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 SrKO1, SEQ ID NO:55에 제시된 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO, 또는 SEQ ID NO:56에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO를 개별적으로 발현하는 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주에서의 ent-카우레노산의 생성을 보여준다. Ent-카우레노산 수준은 ent-카우레노산에 상응하는 LC-MS 피크의 곡선하 면적 (AUC)으로서 계산되었다. 실시예 3 참조.
도 5는 SEQ ID NO:55-60 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO를 발현하거나 SrKAHe1을 과다발현하지 않는 대조군 균주와 비교하여, SEQ ID NO:55-60 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO 및 SrKAHe1 (SEQ ID NO:18에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩됨)을 공동-발현하는 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주에서 또는 S. 레바우디아나 KAHe1 (SrKAHe1; SEQ ID NO:18에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩됨)을 과다발현하는 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주에서 총 (세포외 플러스 세포내) 스테비올 글리코시드의 생성을 보여준다. 총 스테비올 글리코시드의 생성량은 표준 곡선과 비교하여 정량화하였다. y-축으로 플롯팅된 값 (μM)은 3개의 생물학적 반복값의 평균이다. 실시예 4 참조.
도 6은 SrKAHe1(SEQ ID NO:18에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩됨)을 과다발현하고 SEQ ID NO:56에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO 또는 SEQ ID NO:65에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO 중 어느 하나를 추가로 발현하는 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주에서 레바우디오사이드 A (RebA), 레바우디오사이드 D (RebD), 및 레바우디오사이드 M (RebM)의 생성을 보여준다. RebA + RebD + RebM의 생성은 μM로 측정하였다. 실시예 4 참조.
도 7은 SEQ ID NO:55-60 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO 및 (SEQ ID NO:18에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된) SrKAHe1을 공동발현하는 스테비올 글리코시드-생성 균주에서 또는 (SEQ ID NO:18에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된) SrKAHe1을 과다발현하는 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주에서 글리코실화된 ent-카우레노산의 생성을 보여준다. 값은 3개의 생물학적 반복값의 평균으로서 글리코실화된 ent-카우레노산에 상응하는 LC-MS 피크의 AUC로서 계산하였다. 실시예 4 참조.
도 8은 SEQ ID NO:55-60에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO 및 (SEQ ID NO:18에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된) SrKAHe1을 공동발현하는 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주에서 또는 (SEQ ID NO:18에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된) SrKAHe1을 과다발현하는 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주에서 글리코실화된 ent-카우레놀의 생성을 보여준다. y-축에 플롯팅된 값은 글리코실화된 ent-카우레놀에 상응하는 LC-MS 피크의 AUC로서 계산하였다. 실시예 4 참조.
도 9는 (SEQ ID NO:61에 제시된 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된) CPR1 또는 (SEQ ID NO:23에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된) CPR7을 발현하는 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주에서 레바우디오사이드 M (RebM) 생산을 보여준다. y-축에 플롯팅된 값은 μM로 측정되었다. 실시예 5 참조.
도 10은 (SEQ ID NO:18에 제시된 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된) SrKAHe1을 과다발현하고, SEQ ID NO:62에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 CPR4497을 추가로 발현하는 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주에서 레바우디오사이드 M (RebM) 생성을 보여준다. y-축에 플롯팅된 값은 RebM의 μM 농도로 나타낸다. 실시예 5 참조.
도 11a는 스테비올-13-O-글루코시드 (13-SMG) 표준의 LC-MS 크로마토그램을 보여준다. 도 11b는 SEQ ID NO:80에 제시된 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:82에 제시된 아미노산 서열)에 의해 엔코딩되는 KAH를 발현하는 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주에 의한 13-SMG의 생성을 보여준다. 실시예 7 참조.
도 12는 KO 및 CPR을 공동-발현하는 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주에서 스테비올-13-O-글루코시드 (13-SMG) 및 레바우디오사이드 B (RebB) 생성을 보여준다. KO는 (SEQ ID NO:59에 제시된 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된) SrKO1, SEQ ID NO:63에 제시된 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO, 또는 SEQ ID NO:64에 제시된 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO로부터 선택되었다. 사이토크롬 P450 리덕타제 (CPR) 폴리펩티드는 SEQ ID NO:66에 제시된 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 CPR 또는 SEQ ID NO:67에 제시된 코돈-최적화 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 CPR로부터 선택되었다. y-축 상에 표시된 값은 지시된 스테비올 글리코시드의 μM 농도이다. 실시예 6 참조.
도 13은 (SEQ ID NO:18에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된) SrKAHe1, SEQ ID NO:80에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KAH, 또는 SEQ ID NO:81에 제시된 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KAH를 발현하는 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주에서 루부소사이드 및 스테비올-13-O-글루코시드 (13-SMG)의 생성을 보여준다. y-축에 표시된 값은 플레이트 판독기를 사용하여 측정된 OD600에 표준화되고 8개의 생물학적 반복값을 평균화시킨, 13-SMG 및 루부소사이드의 μM 농도이다. 오차 막대는 ± 각 표준 편차이다. 실시예 7 참조.
도 14는 (SEQ ID NO:18에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된) SrKAHe1을 단독으로 또는 (SEQ ID NO:61에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된) CPR1 또는 (SEQ ID NO:97에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된) CPR12와 조합하여 발현하는 S. 세레비시애 균주로부터 제조된 마이크로좀 단백질과 인큐베이션시 사이토크롬 c에 대한 사이토크롬 P450 리덕타제 (CPR) 폴리펩티드 활성을 보여준다. 결과는 2개의 생물학적 반복값의 평균으로서 U/mg로 표시된다. 실시예 9 참조.
도 15a는 (SEQ ID NO:18에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된) SrKAHe1을 단독으로 또는 (SEQ ID NO:61에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된) CPR1 또는 (SEQ ID NO:97에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된) CPR12와 조합하여 발현하는 S. 세레비시애 균주로부터 제조된 마이크로좀 단백질과 ent-카우레노산의 30분 인큐베이션시 스테비올 축적을 보여준다. 결과는 3개의 생물학적 반복값의 평균으로서 AUC로 표시된다. 대조군 반응은 상기 기술된 마이크로좀 단백질을 포함하나, 스테비올 축적 측정 전에 30분 동안 인큐베이션하지 않았다. 도 15b는 (SEQ ID NO:18에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된) SrKAHe1을 단독으로 또는 (SEQ ID NO:61에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된) CPR1 또는 (SEQ ID NO:97에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된) CPR12와 조합하여 발현하는 S. 세레비시애 균주로부터 제조된 마이크로좀 단백질과 ent-카우레노산의 30분 인큐베이션 후 ent-카우레노산의 수준을 보여준다. 결과는 3개의 생물학적 반복값의 평균으로서 μM로 표시된다. 대조군 반응은 상기 기술된 마이크로좀 단백질을 포함하나, ent-카우레노산 수준의 측정 전에 30분 동안 인큐베이션하지 않았다. 실시예 9 참조.
도 16은 SrKO1 (SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:79), SEQ ID NO:65에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO 또는 SEQ ID NO:65에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO 또는 SrKO1 중 어느 하나와 CYP102A1의 NADPH-의존적 P450 옥시도리덕타제 도메인 ("BMR 도메인"으로서 본원에서 언급됨) 사이의 융합 작제물을 발현하는 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주에 의해 축적된 스테비올-13-O-글루코시드 (13-SMG), 1,2-바이오사이드, 레바우디오사이드 B (RebB), ent-카우레노산, 및 ent-카우렌 수준을 보여준다. 도 16a는 SrKO1 (SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:79), SrKO1 및 BMR의 융합 작제물 (SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100), SrKO1 및 BMR W1046A의 융합 작제물 (SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102), 절두된 SrKO1 및 BMR 의 융합 작제물(SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104), 절두된 SrKO1 및 BMR W1046A의 융합 작제물 (SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:106), 또는 대조군 플라스미드를 발현하는 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주에 대하여 LC-MS에 의해 측정된 13-SMG, 1,2-바이오사이드, 및 RebB의 수준을 보여준다. 도 16b는 SrKO1 (SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:79), SrKO1 및 BMR의 융합 작제물 (SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100), SrKO1 및 BMR W1046A의 융합 작제물 (SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102), 절두된 SrKO1 및 BMR의 융합 작제물 (SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104), 절두된 SrKO1 및 BMR W1046A의 융합 작제물 (SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:106), 또는 대조군 플라스미드를 발현하는 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주에 대하여 LC-UV에 의해 측정된 ent-카우레노산 및 ent-카우렌의 수준을 보여준다. 도 16c는 SEQ ID NO:65에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO, SEQ ID NO:65에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO 및 BMR의 융합 작제물 (SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:108), SEQ ID NO:65에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO 및 BMR W1046A의 융합 작제물 (SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110), SEQ ID NO:65에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 절두된 KO 및 BMR W1046A의 융합 작제물 (SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:112), 또는 플라스미드 대조군을 발현하는 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주에 있어서 LC-MS에 의해 측정된 13-SMG, 1,2-바이오사이드, 및 RebB의 수준을 보여준다. 도 16d는 SEQ ID NO:65에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO, SEQ ID NO:65에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO 및 BMR의 융합 작제물 (SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:108), SEQ ID NO:65에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO 및 BMR W1046A의 융합 작제물 (SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110), SEQ ID NO:65에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 절두된 KO 및 BMR W1046A의 융합 작제물 (SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:112), 또는 플라스미드 대조군을 발현하는 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주에 의해 축적된 ent-카우레노산 또는 ent-카우렌의 수준을 보여준다. 실시예 10 참조.
본 발명을 상세히 기재하기에 앞서, 다수의 용어가 정의될 것이다. 본원에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 달리 명백하게 기술하지 않는 한 복수 대상물을 포함한다. 예를 들어 "핵산"에 대한 언급은 하나 이상의 핵산을 의미한다.
"바람직하게는", "보통", 및 "전형적으로"와 같은 용어는 청구된 발명의 범위를 제한한다거나 특정 특성이 청구된 발명의 구조나 기능에 결정적이거나, 필수적이거나, 심지어 중요함을 의미하기 위해 본원에서 이용된 것이 아님에 유의한다. 오히려, 이러한 용어들은 단지 본 발명의 특정 구체예에 이용될 수 있거나 이용될 수 없는 대안적이거나 추가적인 특성을 강조하기 위한 것이다.
본 발명을 기재하고 정의할 목적으로, 용어 "실질적으로"는 임의의 정량적 비교, 값, 측정, 또는 다른 표현에서 비롯될 수 있는 고유의 불확실성 정도를 나타내기 위해 본원에 이용된 것임에 유의한다. 용어 "실질적으로"는 또한 정량적인 표현이 관심 주제의 기본적인 기능에서의 변화를 발생시키지 않으며 언급 기준으로부터 변화될 수 있는 정도를 나타내기 위해 본원에서 이용된다.
당업자에게 널리 공지된 방법을 이용하여 본 발명에 따른 유전자 발현 작제물 및 재조합 세포를 작제할 수 있다. 이러한 방법은 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법, 생체내 재조합 기법, 및 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기법을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Green & Sambrook, 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, New York; Ausubel et al., 1989, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York, and PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., 1990, Academic Press, San Diego, CA)]에 기재된 기법을 참조하라.
본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드", 및 "핵산"은 DNA, RNA, 이의 유도체, 또는 이의 조합물을 포함하는 핵산을 나타내기 위해 상호교환적으로 이용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "미생물", "미생물 숙주", "미생물 숙주 세포", "재조합 숙주" 및 "재조합 숙주 세포"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "재조합 숙주"는 숙주 유전체가 적어도 하나의 DNA 서열에 의해 보강된 숙주를 나타내는 것으로 의도된다. 그러한 DNA 서열은 자연적으로 존재하지 않는 유전자, RNA로 일반적으로 전사되지 않거나 단백질로 번역("발현")되지 않는 DNA 서열, 및 숙주에 도입하고자 하는 그 밖의 유전자 또는 DNA 서열을 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다. 본원에 기재된 재조합 숙주의 유전체는 전형적으로 하나 이상의 재조합 유전자의 안정적인 도입을 통하여 보강됨이 이해될 것이다. 일반적으로, 도입된 DNA는 그 DNA의 수용체인 숙주에 원래 존재하는 것은 아니지만, 주어진 숙주로부터 DNA 세그먼트를 단리시키고, 후속하여 동일한 숙주 안에 그 DNA의 하나 이상의 추가적인 복사체를 도입시켜, 예컨대 유전자 생성물의 생성을 향상시키거나 유전자의 발현 패턴을 변경시키는 것은 본 발명의 범위 내에 있다. 일부 예에서, 도입된 DNA는, 예를 들어, 상동 재조합 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 내인성 유전자 또는 DNA 서열을 변형시키거나 심지어 대체할 것이다. 적합한 재조합 숙주는 미생물을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "재조합 유전자"는, 동일하거나 유사한 유전자 또는 DNA 서열이 이미 그러한 숙주에 존재할 수 있는 것과 무관하게, 수용체 숙주에 도입되는 유전자 또는 DNA 서열을 의미한다. 이러한 문맥에서 "도입된" 또는 "보강된"은 사람의 손에 의해 도입되거나 보강되는 것을 의미함이 당 분야에 공지되어 있다. 따라서, 재조합 유전자는 또 다른 종으로부터의 DNA 서열일 수 있거나, 동일한 종으로부터 기원하거나 동일한 종에 존재하는 DNA 서열일 수 있으나, 이는 재조합 방법에 의해 숙주에 혼입되어 재조합 숙주를 형성한다. 숙주에 도입되는 재조합 유전자는 형질전환되는 숙주에 일반적으로 존재하고, DNA의 하나 이상의 추가적인 복사체를 제공하기 위해 도입되어 그 DNA의 유전자 생성물의 과다발현 또는 변형된 발현을 허용하는 DNA 서열과 동일할 수 있음이 이해될 것이다. 상기 양태에서, 상기 재조합 유전자는 cDNA에 의해 엔코딩된다. 기타 구체예에서, 재조합 유전자는 S. 세레비시애에서 발현을 위해 합성 및/또는 코돈-최적화된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "조작된 생합성 경로"는 본원에 기재된 바와 같이 재조합 숙주에서 발생하는 생합성 경로를 나타낸다. 일부 양태에서, 생합성 경로의 하나 이상의 단계는 비변형된 숙주에서 자연적으로 발생하지 않는다. 일부 구체예에서, 이종성 버전의 유전자가 내인성 버전의 유전자를 포함하는 숙주 내로 도입된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "내인성" 유전자는 특정 유기체, 조직 또는 세포에서 기원하고 생성되거나 합성되는 유전자를 지칭한다. 일부 구체예에서, 내인성 유전자는 효모 유전자이다. 일부 구체예에서, 이러한 유전자는 S. 세레비시애 균주 S288C를 포함하나 이에 제한되지 않는 S. 세레비시애에 대해 내인성이다. 일부 구체예에서, 내인성 효모 유전자가 과다발현된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "과다발현"은 야생형 유기체에서 유전자 발현 수준보다 높은 수준의 유기체에서의 유전자 발현을 지칭하는데 사용된다. 예를 들어, 문헌 [Prelich, 2012, Genetics 190:841-54] 참조. 일부 구체예에서, 내인성 효모 유전자가 결실된다. 예를 들어, 문헌 [Giaever & Nislow, 2014, Genetics 197(2):451-65] 참조. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "결실", "결실된", "녹아웃" 및 "녹아웃된"은 S. 세레비시애를 포함하나 이에 제한되지 않는 유기체에서 더 이상 발현되지 않도록 조작된 내인성 유전자를 지칭하는데 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "이종 서열" 및 "이종 코딩 서열"은 재조합 숙주 이외의 종으로부터 유래된 서열을 기술하는데 사용된다. 일부 구체예에서, 재조합 숙주는 S. 세레비시애 세포이고, 이종 서열은 S. 세레비시애 이외의 유기체로부터 유래된다. 예를 들어, 이종 코딩 서열은 이종 서열을 발현하는 재조합 숙주와 상이한 원핵 미생물, 진핵 미생물, 식물, 동물, 곤충 또는 진균류로부터 비롯될 수 있다. 일부 구체예에서, 코딩 서열은 숙주에 대해 천연인 서열이다.
"선택가능한 마커"는 숙주 세포 영양요구성(auxotrophy)을 보충하거나, 항생제 내성을 제공하거나, 색상 변화를 야기하는 임의의 유전자들 중 하나일 수 있다. 유전자 치환 벡터의 선형화된 DNA 단편은 이어서 당 업계에 널리 공지된 방법을 이용하여 세포에 도입된다 (하기 참조). 선형 단편의 유전체로의 통합 및 유전자의 분열은 선택 마커에 따라 결정될 수 있고, 예를 들어, PCR 또는 Southern blot 분석법으로 입증될 수 있다. 선별에서 이들 사용에 뒤이어, 선택가능한 마커는 숙주 세포의 유전체로부터 예를 들어, Cre-LoxP 시스템에 의해 제거될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Gossen et al., 2002, Ann. Rev. Genetics 36:153-173] 및 미국 2006/0014264 참조). 다르게는, 유전자 치환 벡터는 임의의 내인성 유전자 프로모터 서열이 결여되고 아무것도 엔코딩하지 않은, 분해되는 유전자의 일부, 또는 유전자의 코딩 서열의 비활성 단편을 포함하게 하는 방법으로 작제될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "변이체" 및 "돌연변이체"는 특정 단백질의 야생형 서열과 비교하여, 하나 이상의 아미노산이 변형된 단백질 서열을 기술하는데 이용된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "비활성 단편"은 유전자의 전장 코딩 서열로부터 생성된 단백질의 약 10% 미만 (예를 들어, 약 9% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만, 약 6% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 약 1% 미만, 또는 0%)의 활성을 갖는 단백질을 엔코딩하는 유전자의 단편이다. 유전자의 이러한 부분은 알려지지 않은 프로모터 서열이 상기 유전자 서열에 작동 가능하게 연결되나, 종결 코돈 및 전사 종결 서열은 상기 유전자 서열의 상기 부분에 작동 가능하게 연결되는 방식으로 백터에 삽입된다. 이 벡터는 이후 상기 유전자 서열의 상기 부분에서 선형화되고, 세포내로 형질전환된다. 단일 동종 재조합에 의해, 상기 선형화된 벡터는 이후 비활성화되면서 유전자의 내인성 상응체(counterpart)에 통합된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "스테비올 글리코시드"는 레바우디오사이드 A (RebA) (CAS # 58543-16-1), 레바우디오사이드 B (RebB) (CAS # 58543-17-2), 레바우디오사이드 C (RebC) (CAS # 63550-99-2), 레바우디오사이드 D (RebD) (CAS # 63279-13-0), 레바우디오사이드 E (RebE) (CAS # 63279-14-1), 레바우디오사이드 F (RebF) (CAS # 438045-89-7), 레바우디오사이드 M (RebM) (CAS # 1220616-44-3), 루부소사이드(Rubusoside) (CAS # 63849-39-4), 둘코사이드 A(Dulcoside A) (CAS # 64432-06-0), 레바우디오사이드 I (RebI) (MassBank Record: FU000332), 레바우디오사이드 Q (RebQ), 1,2-스테비오사이드 (CAS # 57817-89-7), 1,3-스테비오사이드 (RebG), 1,2-바이오사이드 (MassBank Record: FU000299), 1,3-바이오사이드, 스테비올-13-O-글루코시드 (13-SMG), 스테비올-19-O-글루코시드 (19-SMG), 트리-글루코실화된 스테비올 글리코시드, 테트라-글리코실화된 스테비올 글리코시드, 펜타-글루코실화된 스테비올 글리코시드, 헥사-글루코실화된 스테비올 글리코시드, 헵타-글루코실화된 스테비올 글리코시드, 및 이들의 이성질체를 나타낸다. 도 2 참조; 또한 문헌 [스테비올 글리코시드s Chemical and Technical Assessment 69th JECFA, 2007, prepared by Harriet Wallin, Food Agric. Org.] 참조.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "스테비올 글리코시드 전구체" 및 "스테비올 글리코시드 전구체 화합물"은 스테비올 글리코시드 생합성 경로의 중간체 화합물을 지칭하기 위해 사용된다. 스테비올 글리코시드 전구체는 비제한적으로, 게라닐게라닐 디포스페이트 (GGPP), ent-코팔릴-디포스페이트, ent-카우렌, ent-카우레놀, ent-카우레날, ent-카우레노산, 및 스테비올을 포함한다. 도 1 참조. 일부 구체예에서, 스테비올 글리코시드 전구체는 스테비올 글리코시드 화합물 자체이다. 예를 들어, 19-SMG, 루부소사이드, 스테비오사이드, 및 RebE는 RebM의 스테비올 글리코시드 전구체이다. 도 2 참조. 스테비올 글리코시드 및/또는 스테비올 글리코시드 전구체는 생체내에서 (즉, 재조합 숙주에서), 시험관내에서 (즉, 효소적으로), 또는 전세포 생물전환에 의해 생성될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 “생성하다” 및 “축적하다”는 생체내에서, 시험관내에서 또는 전세포 생물전환에 의해 스테비올 글리코시드 및 스테비올 글리코시드 전구체의 합성을 기술하기 위해 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "디-글리코실화된 스테비올"은 2개의 당 모이어티 예컨대, 글루코스 또는 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)를 포함하는 스테비올 분자을 지칭하는데 사용될 수 있다. 디-글리코실화된 스테비올 분자의 비제한적 예는 스테비올-1,3-바이오사이드, 스테비올-1,2-바이오사이드, 루부소사이드, 2개의 글루코스 모이어티를 포함하는 스테비올 분자, 1개의 글루코스 모이어티 및 1개의 GlcNAc 모이어티를 포함하는 스테비올 분자, 및 이들의 이성질체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 “트리-글리코실화된 스테비올”은 3개의 당 모이어티 예컨대, 글루코스 또는 GlcNAc를 포함하는 스테비올 분자를 지칭하는데 사용될 수 있다. 트리-글리코실화된 스테비올 분자의 비제한적 예는 RebB, RebG, 스테비오사이드, 2개의 글루코스 모이어티 및 1개의 GlcNAc 모이어티를 포함하는 스테비올 분자, 및 이들의 이성질체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 “테트라-글리코실화된 스테비올”은 4개의 당 모이어티 예컨대, 글루코스 또는 GlcNAc를 포함하는 스테비올 분자를 지칭하는데 사용될 수 있다. 테트라-글리코실화된 스테비올 분자의 비제한적인 예는 RebA, RebE, RebQ, 4개의 글루코스 모이어티를 포함하는 스테비올 분자, 3개의 글루코스 모이어티 및 1개의 GlcNAc 모이어티를 포함하는 스테비올 분자, 및 이들의 이성질체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "펜타-글리코실화된 스테비올"은 5개의 당 모이어티, 예컨대, 글루코스 또는 GlcNAc를 포함하는 스테비올 분자를 지칭하는데 사용될 수 있다. 펜타-글리코실화된 스테비올 분자의 비제한적 예는 RebD, 5개의 글루코스 모이어티를 포함하는 스테비올 분자, 4개의 글루코스 모이어티 및 1개의 GlcNAc 모이어티를 포함하는 스테비올 분자, 및 이들의 이성질체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 “헥사-글리코실화된 스테비올”은 6개의 당 모이어티 예컨대, 글루코스 또는 GlcNAc를 포함하는 스테비올 분자를 지칭하는데 사용될 수 있다. 헥사-글리코실화된 스테비올 분자의 비제한적 예는 RebM, 6개의 글루코스 모이어티를 포함하는 스테비올 분자, 5개의 글루코스 모이어티 및 1개의 GlcNAc 모이어티를 포함하는 스테비올 분자, 및 이들의 이성질체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 “헵타-글리코실화된 스테비올”은 7개의 당 모이어티 예컨대, 글루코스 또는 GlcNAc를 포함하는 스테비올 분자를 지칭하는데 사용될 수 있다. 헵타-글리코실화된 스테비올 분자의 비제한적 예는 7개의 글루코스 모이어티를 포함하는 스테비올 분자 및 이들의 이성질체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 “글리코실화된 ent-카우레노산”은 당 모이어티 예컨대, 글루코스 또는 GlcNAc를 포함하는 ent-카우레노산 분자를 지칭하는데 사용될 수 있다. 글리코실화된 ent-카우레노산 분자의 비제한적 예는 2개의 글루코스 모이어티 및 1개의 GlcNAc 모이어티를 포함하는 ent-카우레노산 분자, 3개의 글루코스 모이어티를 포함하는 ent-카우레노산 분자, 1개의 글루코스 모이어티 및 1개의 GlcNAc 모이어티를 포함하는 ent-카우레노산 분자, 2개의 글루코스 모이어티를 포함하는 ent-카우레노산 분자, 및 이들의 이성질체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 “글리코실화된 ent-카우레놀”은 당 모이어티 예컨대, 글루코스 또는 GlcNAc를 포함하는 ent-카우레놀 분자를 지칭하는데 사용될 수 있다. 글리코실화된 ent-카우레놀 분자의 비제한적 예는 3개의 글루코스 모이어티를 포함하는 ent-카우레놀 분자, 1개의 글루코스 모이어티 및 1개의 GlcNAc 모이어티를 포함하는 ent-카우레놀 분자, 2개의 글루코스 모이어티를 포함하는 ent-카우레놀 분자, 및 이들의 이성질체를 포함한다.
재조합 스테비올 글리코시드-생성 사카로마아세스 세레비시애 (S. 세레비시애) 균주는 WO 2011/153378, WO 2013/022989, WO 2014/122227, 및 WO 2014/122328에 기술되어 있다. 시험관내에서 전체 세포 바이오-전환에 의해 재조합 숙주에서 스테비올 글리코시드를 생성하는 방법이 또한, WO 2011/153378, WO 2013/022989, WO 2014/122227, 및 WO 2014/122328에 기술되어 있다.
일부 구체예에서, 스테비올 글리코시드 및/또는 스테비올 글리코시드 전구체는 재조합 숙주에서 스테비올 글리코시드 생합성 경로와 관련된 하나 이상의 효소의 발현을 통해 생체내에서 생성된다. 예를 들어, GGPPS 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자, CDPS 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자, KS 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자, KO를 엔코딩하는 유전자, KAH 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자, CPR 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자, 및 UGT 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자 중 하나 이상을 발현하는 스테비올-생성 재조합 숙주는 생체내에서 스테비올 글리코시드 및/또는 스테비올 글리코시드 전구체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 도 1 및 2 참조. 숙련자는 이들 유전자 중 하나 이상이 숙주에 내인성일 수 있으며, 단 이들 유전자 중 적어도 하나 (및 일부 구체예에서, 모두)는 재조합 숙주 내로 도입된 재조합 유전자여야 함을 인지할 것이다.
또 다른 예에서, GGPPS 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자, CDPS 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자, KS 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자, KO 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자, KAH 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자, 및 CPR 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자를 발현하는 재조합 숙주는 스테비올을 생체내에서 생성할 수 있다. 예를 들어, 도 1 참조. 숙련자는 이들 유전자 중 하나 이상이 숙주에 내인성일 수 있으며, 단 이들 유전자 중 적어도 하나 (및 일부 구체예에서, 모두)는 재조합 숙주 내로 도입된 재조합 유전자여야 함을 인지할 것이다.
또 다른 예에서, GGPPS 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자, CDPS 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자, KS 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자, KO 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자, KAH 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자, CPR 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자, 및 UGT 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자 중 하나 이상을 발현하는 스테비올-생성 재조합 숙주는 생체내에서 스테비올 글리코시드를 생성할 수 있다. 예를 들어, 도 1 및 2 참조. 숙련자는, 이들 유전자 중 하나 이상은 숙주에 내인성일 수 있으며, 단 이들 유전자 중 적어도 하나 (및 일부 구체예에서, 모두)가 재조합 숙주 내로 도입된 재조합 유전자여야 함을 인지할 것이다.
KS 폴리펩티드의 비제한적 예는 SEQ ID NO:1-4 및 SEQ ID NO:6에 제시되어 있다. KO 폴리펩티드의 비제한적 예는 SEQ ID NO:7-10, 54, 70-72, 75, 및 77-79에 제시되어 있다. KAH 폴리펩티드의 비제한적 예는 SEQ ID NO:13-17, 68, 82, 및 91에 제시되어 있다. CPR 폴리펩티드의 비제한적 예는 SEQ ID NO:20-22, 28, 69, 73, 74, 76, 87, 및 98에 제시되어 있다. CDPS 폴리펩티드의 비제한적 예는 SEQ ID NO:33-39에 제시되어 있다. CDPS-KS 폴리펩티드의 비제한적 예는 SEQ ID NO:40-42에 제시되어 있다. GGPPS 폴리펩티드의 비제한적 예는 SEQ ID NO:43-50에 제시되어 있다.
일부 구체예에서, 재조합 숙주는 UGT85C2 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산(SEQ ID NO:32), UGT76G1 폴리펩티드(SEQ ID NO:83)를 엔코딩하는 핵산, UGT74G1 폴리펩티드(SEQ ID NO:29)를 엔코딩하는 핵산, UGT91D2 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 및/또는 EUGT11 폴리펩티드(SEQ ID NO:86)를 엔코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 양태에서, UGT91D2 폴리펩티드는 UGT91D2e 폴리펩티드 (SEQ ID NO:84) 또는 UGT91D2e-b 폴리펩티드 (SEQ ID NO:88)일 수 있다. 숙련자는, 이들 유전자의 발현이 특정 스테비올 글리코시드를 생성하는데 필요할 수 있으나 이들 유전자 중 하나 이상은 숙주에 대해 내인성일 수 있으며, 단 이들 유전자 중 적어도 하나 (및 일부 구체예에서, 전부)는 재조합 숙주 내부로 도입된 재조합 유전자여야 함을 인지할 것이다. 특정 구체예에서, 스테비올-생성 재조합 미생물은 UGT85C2, UGT76G1 또는 UGT91D2 폴리펩티드를 엔코딩하는 외인성 핵산을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 스테비올-생성 재조합 미생물은 UGT85C2, UGT76G1, UGT74G1 또는 UGT91D2 폴리펩티드를 엔코딩하는 외인성 핵산을 포함한다. 추가의 또 다른 특정 구체예에서, 스테비올-생성 재조합 미생물은 UGT85C2, UGT76G1, UGT74G1, 및 EUGT11 폴리펩티드를 엔코딩하는 외인성 핵산을 포함한다. 추가의 또 다른 특정 구체예에서, 스테비올-생성 재조합 미생물은 UGT85C2, UGT76G1, UGT74G1, UGT91D2 (그 중에서도 91D2e, 91D2m, 91D2e-b 및 이의 기능성 호몰로그를 포함) 및 EUGT11 폴리펩티드를 엔코딩하는 외인성 핵산을 포함한다.
특정 구체예에서, 스테비올 글리코시드는 RebA, RebB, RebD 및/또는 RebM이다. RebA는 UGT85C2, UGT76G1, UGT74G1 또는 UGT91D2를 발현하는 스테비올-생성 재조합 미생물에서 합성될 수 있다. RebB는 UGT85C2, UGT76G1, 또는 UGT91D2를 발현하는 스테비올-생성 재조합 미생물에서 합성될 수 있다. RebD는 UGT85C2, UGT76G1, UGT74G1 또는 UGT91D2 및/또는 EUGT11을 발현하는 스테비올-생성 재조합 미생물에서 합성될 수 있다. RebM은 UGT85C2, UGT76G1, UGT74G1 또는 UGT91D2 및/또는 EUGT11를 발현하는 스테비올-생성 재조합 미생물에서 합성될 수 있다 (도 2 참조).
일부 구체예에서, 스테비올 글리코시드 및/또는 스테비올 글리코시드 전구체는 시험관내에서 스테비올 글리코시드 경로에 관련된 하나 이상의 효소와의 스테비올 글리코시드 전구체의 접촉을 통해 생성된다. 예를 들어, 스테비올과 UGT 폴리펩티드의 접촉은 시험관내에서 스테비올 글리코시드의 생성을 유발할 수 있다. 일부 구체예에서, 스테비올 글리코시드 전구체는 시험관내에서 스테비올 글리코시드 경로에 관련된 하나 이상의 효소와의 업스트림 스테비올 글리코시드 전구체의 접촉을 통해 생성된다. 예를 들어, ent-카우레노산과 KAH 효소의 접촉은 시험관내에서 스테비올의 생성을 유발할 수 있다.
일부 구체예에서, 스테비올 글리코시드 또는 스테비올 글리코시드 전구체는 전체 세포 생물전환에 의해 생성된다. 전체 세포 생물전환이 발생하기 위해서, 스테비올 글리코시드 경로에 관여하는 하나 이상의 효소를 발현하는 숙주 세포는 세포에서 스테비올 글리코시드 전구체를 흡수하고 변형시키고; 생체내에서의 변형 후, 스테비올 글리코시드는 세포에 남아 있게 되고/거나 배양 배지로 분비된다. 예를 들어, UGT 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자를 발현하는 숙주 세포는 세포에서 스테비올 및 글리코실레이트 스테비올을 흡수할 수 있으며; 생체내에서 글리코실화 후, 스테비올 글리코시드는 배양 배지 내로 분비될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포는 변형될 기질을 흡수하거나 변형된 생성물을 분비하기 위해 투과가능하다.
일부 구체예에서, 스테비올, 하나 이상의 스테비올 글리코시드 전구체, 및/또는 하나 이상의 스테비올 글리코시드는 2개 이상의 숙주의 공동-배양에 의해 생성된다. 일부 구체예에서, 스테비올 글리코시드 경로에 관련된 하나 이상의 효소를 각각 발현하는 하나 이상의 숙주는 스테비올, 하나 이상의 스테비올 글리코시드 전구체, 및/또는 하나 이상의 스테비올 글리코시드를 생성한다. 예를 들어, GGPPS, CDPS, KO, KS, KAH, 및/또는 CPR를 포함하는 숙주 및 하나 이상의 UGT를 포함하는 숙주는 하나 이상의 스테비올 글리코시드를 생성한다.
일부 구체예에서, 생체내, 시험관내 또는 전체 세포 생물전환에 의해 생성된 스테비올 글리코시드 또는 스테비올 글리코시드 전구체 조성물은 특히 스테비아 식물로부터의 스테비아 추출물보다 적은 오염물질을 포함한다. 오염물질은 이취(off-flavors)의 원인이 되는 식물-유래 화합물을 포함한다. 잠재적인 오염물질로는 색소, 지질, 단백질, 석탄산(phenolics), 사카라이드, 스파툴에놀(spathulenol) 및 기타 세스키테르펜, 라단 디테르펜(labdane diterpenes), 모노테르펜(monoterpenes), 데칸산, 8,11,14-에이코사트리엔산, 2-메틸옥타데칸, 펜타코산, 옥타코산, 테트라코산, 옥타데카놀, 스티그마스테롤, β-시토스테롤, α-아미린, β-아미린, 루페올, β-아미린 아세테이트, 펜타사이클릭 트리테르펜, 센타우레딘, 퀘르시틴, 에피-알파-카디놀, 카로필렌 및 유도체들, 베타-피넨, 베타-시토스테롤, 및 깁베렐린(gibberellin)을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "검출가능한 양", "검출가능한 농도", "측정가능한 양" 및 "측정가능한 농도"는 AUC, μM/OD600, mg/L, μM, 또는 mM으로 측정된 스테비올 글리코시드의 수준을 나타낸다. 스테비올 글리코시드 생성 (즉, 전체 상청액 및/또는 세포내 스테비올 글리코시드 수준)은 예를 들어, 액체 크로마토그래피-질량 분광분석 (LC-MS), 박막 크로마토그래피 (TLC), 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC), 자외선-가시 분광법/분광광도법 (UV-Vis), 질량 분광분석법 (MS) 및 핵 자기 공명 분광법 (NMR)에 제한되지 않는 당업자가 일반적으로 이용가능한 기법에 의해 검출되고/거나 분석될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "검출불가능한 농도"는 너무 낮아서 기법 예컨대, TLC, HPLC, UV-Vis, MS, 또는 NMR에 의해 측정되고/거나 분석될 수 없는 화합물의 수준을 지칭한다. 일부 구체예에서, "검출불가능한 농도"의 화합물은 스테비올 글리코시드 또는 스테비올 글리코시드 전구체 조성물에 존재하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "또는" 및 "및/또는"은 또 다른 구성요소와 함께 또는 서로에 배타적으로 여러 구성요소를 기재하기 위해 이용된다. 예를 들어, "x, y, 및/또는 z"는 "x" 단독, "y" 단독, "z" 단독, "x, y, 및 z," "(x 및 y) 또는 z", "x 또는 (y 및 z)" 또는 "x 또는 y 또는 z"를 나타낼 수 있다. 일부 구체예에서, "및/또는"은 재조합 세포가 포함하는 외인성 핵산을 나타내는데 이용되며, 이 때 재조합 세포는 그룹에서 선택된 하나 이상의 외인성 핵산을 포함한다. 일부 구체예에서, "및/또는"은 스테비올 글리코시드 및/또는 스테비올 글리코시드 전구체의 생성을 나타내는데 이용된다. 일부 구체예에서, "및/또는"은 스테비올 글리코시드의 생성을 나타내는데 이용되며, 이 때 하나 이상의 스테비올 글리코시드가 생성된다. 일부 구체예에서, "및/또는"은 스테비올 글리코시드의 생성을 나타내는데 이용되며, 이 때 하나 이상의 스테비올 글리코시드가 재조합 미생물을 배양하는 단계, 재조합 미생물에서 하나 이상의 스테비올 글리코시드를 합성하는 단계, 및/또는 하나 이상의 스테비올 글리코시드를 분리시키는 단계 중 하나 이상을 통해 생성된다.
일부 구체예에서, KO 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, 또는 SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, 또는 SEQ ID NO:65에 제시된다. 일부 양태에서, KO 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산은 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59 또는 SEQ ID NO:60에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%의 동일성, SEQ ID NO:56 또는 SEQ ID NO:58에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%의 동일성, SEQ ID NO:63에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%의 동일성, 또는 SEQ ID NO:64 또는 SEQ ID NO:65에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 75%의 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, KO 효소의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, 또는 SEQ ID NO:79에 제시된다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 KO 폴리펩티드를 엔코딩하는 하나 이상의 핵산의 하나 이상의 복사체를 포함한다.
일부 구체예에서, RebB-생성 S. 세레비시애 균주에서 SEQ ID NO:55 또는 SEQ ID NO:56에 제시된 KO 유전자의 발현은 RebB-생성 S. 세레비시애 균주에서의 SrKO1 (SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:79)의 발현과 비교하여 RebB의 더 높은 생성을 유도한다. 실시예 3 참조.
일부 구체예에서, 기능성 KO와 RebB를 생성할 수 있는 S. 세레비시애 균주에서 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, 또는 SEQ ID NO:57에 제시된 KO 유전자의 발현은 ent-카우레노산의 생성을 유도한다. 실시예 3 참조.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 “ent-카우레노산 하이드록실라제” 및 “스테비올 신타제”는 상호교환적으로 사용될 수 있으며, "KAH"로 약칭될 수 있다. 일부 구체예에서, KAH 효소를 엔코딩하는 핵산의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:90, 또는 SEQ ID NO:96에 제시된다. 일부 양태에서, KAH-폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산은 SEQ ID NO:80에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 75%의 동일성; 또는 SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:90 또는 SEQ ID NO:96에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, KAH 효소의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:82, 또는 SEQ ID NO:91에 제시된다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 KAH 효소를 엔코딩하는 하나 이상의 핵산의 하나 이상의 복사체를 포함한다.
일부 구체예에서, SrKAHe1 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:68)의 하나 이상의 복사체는 S. 세레비시애 균주에서 발현된다. 예를 들어, 일부 구체예에서, SrKAHe1 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:68)의 2개의 복사체는 S. 세레비시애 균주에서 발현된다.
일부 구체예에서, KAH 효소를 엔코딩하는 핵산의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:80에 제시된다. SEQ ID NO:80의 핵산은 SEQ ID NO:82에 제시된 아미노산 서열을 갖는 KAH를 엔코딩한다. S. 세레비시애에서 발현에 대해 코돈-최적화된 SEQ ID NO:80의 버젼이 SEQ ID NO:81에 제시되어 있다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 KAH 효소를 엔코딩하는 하나 이상의 핵산의 하나 이상의 복사체를 포함한다. 실시예 7 참조.
일부 구체예에서, SrKAHe1 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:68) 및 SEQ ID NO:80에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KAH 또는 SEQ ID NO:81에 제시된 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KAH 중 어느 하나가 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주에서 공동-발현된다. 일부 구체예에서, 스테비올 글리코시드-생성 균주에서 SrKAHe1 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:68) 및 SEQ ID NO:80에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KAH 또는 SEQ ID NO:81에 제시된 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KAH 중 어느 하나의 공동-발현은 대조군 스테비올 글리코시드-생성 균주 또는 SrKAHe1을 과다발현하는 스테비올 글리코시드 생성 균주와 비교하여 스테비올 글리코시드의 더 높은 생성을 유도한다. 실시예 7 및 표 6 참조. 일부 양태에서, SrKAHe1 과다발현은 85.5 μM 13-SMG의 생성을 유도하며, SEQ ID NO:80에 제시된 뉴클레오티드에 의해 엔코딩된 SrKAHe1 및 KAH의 발현은 153.8 μM 13-SMG의 생성을 유도하며, SEQ ID NO:81에 제시된 뉴클레오티드에 의해 엔코딩된 KAH 및 SrKAHe1의 발현은 130.5 μM의 13-SMG의 생성을 유도한다.
일부 구체예에서, KO 유전자는 SrKAHe1 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:68)을 추가로 과다발현하는 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주에서 발현된다. 일부 구체예에서, SrKAHe1을 과다발현하는 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주에서 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, 또는 SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:65의 KO 유전자의 발현은 SrKAHe1 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:68)을 과다발현하는 스테비올 글리코시드-생성 균주 또는 대조군 스테비올-글리코시드 생성 균주와 비교하여 스테비올 글리코시드의 더 높은 발현을 유도한다. 실시예 4 참조.
일부 구체예에서, SrKAHe1 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:68)을 과다발현하는 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주에서 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:60의 KO 유전자의 발현은 대조군 S. 세레비시애 균주와 비교하여 더 높은 수준의 글리코실화된 ent-카우레노산을 발생시킨다. 실시예 4 참조.
일부 구체예에서, SrKAHe1 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:68)를 과다발현하는 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주에서 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, 또는 SEQ ID NO:60의 KO 유전자의 발현은 SrKAHe1 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:68)를 과다발현하는 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주 또는 대조군 S. 세레비시애 균주와 비교하여 글리코실화된 ent-카우레놀 중간체 화합물의 향상된 대사 전환을 유도한다. 실시예 4 참조.
일부 구체예에서, KAH는 프루너스 KAH, 예컨대, 프루너스 아비움 (Prunus avium), 프루너스 뭄(Prunus mume), 또는 프루너스 페르시카 KAH (Prunus persica KAH)이다. 일부 구체예에서, KAH는 CYP72A219 또는 CYP71A219-유사 패밀리의 KAH이다. 일부 구체예에서, KAH 효소를 엔코딩하는 핵산의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:90 또는 SEQ ID NO:96에 제시된다. SEQ ID NO:90 및 SEQ ID NO:96의 핵산은 SEQ ID NO:91에 제시된 아미노산 서열을 갖는 프루너스 아비움으로부터의 KAH를 엔코딩한다. 일부 구체예에서, KAH 폴리펩티드는 SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, 또는 SEQ ID NO:95에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 일부 구체예에서, KAH 폴리펩티드는 SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, 또는 SEQ ID NO:95에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 KAH 폴리펩티드이다. 일부 구체예에서, 재조합 숙주에서 SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, 또는 SEQ ID NO:95에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자의 발현은 스테비올 글리코시드 또는 스테비올 글리코시드 전구체, 예컨대, 13-SMG 및/또는 루부소사이드의 생성을 유도한다. 실시예 8 참조.
일부 구체예에서, CPR 효소를 엔코딩하는 핵산의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, 또는 SEQ ID NO:97에 제시된다. 일부 양태에서, CPR 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산은 SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:61, 또는 SEQ ID NO:62에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 75%의 동일성, 또는 SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:51, 또는 SEQ ID NO:97에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, CPR 효소의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, 또는 SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:87, 또는 SEQ ID NO:98에 제시된다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 CPR 효소를 엔코딩하는 하나 이상의 핵산의 하나 이상의 복사체를 포함한다.
비제한적 예에서, SrKAHe1은 유전자 NCP1 (YHR042W)에 의해 엔코딩된 S. 세레비시애 CPR에 의해 활성화된다. SrKAHe1에 의해 엔코딩된 KAH의 향상된 활성화는 유전자 ATR2 (SEQ ID NO:51)에 의해 엔코딩된 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) CPR 또는 유전자 CPR7 (SEQ ID NO:23) 또는 CPR8 (SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28)에 의해 엔코딩된 S. 레바우디아나 CPR이 재조합 세포에서 공동-발현되는 경우 관찰된다. A. 탈리아나 폴리펩티드 ATR1 및 ATR2의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO:25 및 SEQ ID NO:26에 제시된다. S. 레바우디아나 폴리펩티드 CPR7 및 CPR8은 각각 SEQ ID NO:27 및 SEQ ID NO:28에 제시된다.
일부 구체예에서, S. 레바우디아나 CPR8 (SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28) 및 A. 탈리아나 ATR2 (SEQ ID NO:51)를 공동-발현하는 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주에서 CPR7 또는 CPR1 (SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:76)의 발현은 S. 레바우디아나 CRP8 (SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28) 및 A. 탈리아나 ATR2 (SEQ ID NO:51)를 발현하는 대조군 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주와 비교하여 더 높은 수준의 RebM을 발생시킨다. 일부 구체예에서, SrKAHe1 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:68)를 과다발현하는 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주에서 SEQ ID NO:62에 제시된 CPR의 발현은 SrKAHe1을 과다발현하거나 SEQ ID NO:62에 제시된 핵산을 발현하지 않는 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주와 비교하여 더 높은 수준의 RebM을 발생시킨다. 실시예 5 참조.
일부 구체예에서, RebB-생성 균주에서 SEQ ID NO:66 또는 SEQ ID NO:77의 CPR 유전자 및 SrKO1 (SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:79)의 공동-발현은 SEQ ID NO:66 또는 SEQ ID NO:77의 CPR 유전자 및 SEQ ID NO:63 또는 SEQ ID NO:64의 KO 유전자의 공동-발현보다 13-SMG 및 RebB의 더 높은 생성을 유도한다. 실시예 6 참조.
일부 구체예에서, CPR1 (SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:76) 또는 CPR12 (SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98)은 사이토크롬 c를 활성화시킨다. 일부 구체예에서, SrKAHe1 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:68)의 존재하에 CPR1 (SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:76) 또는 CPR12 (SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98)은 사이토크롬 c를 활성화시킨다. 일부 구체예에서, CPR1 (SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:76) 또는 CPR12 (SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98)는 ent-카우레노산의 스테비올으로의 전환을 조절한다. 일부 구체예에서, SrKAHe1 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:68)과 조합된 CPR1 (SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:76) 또는 CPR12 (SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98)은 ent-카우레노산을 스테비올로 전환시킨다. 일부 구체예에서, SrKAHe1 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:68)과 조합된 CPR1 (SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:76) 또는 CPR12 (SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98)를 발현하는 S. 세레비시애 균주로부터 제조된 마이크로좀 단백질과 ent-카우레노산의 인큐베이션시 스테비올 생성이 검출된다. 일부 구체예에서, 재조합 숙주에서 CPR1 (SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:76) 또는 CPR12 (SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98)의 발현은 스테비올 글리코시드 또는 스테비올 글리코시드 전구체의 생성을 유도한다. 실시예 9 참조.
일부 구체예에서, 스테비올 글리코시드-생성 균주는 "BMR"로서 본원에서 언급된 CYP102A1의 NADPH-의존성 P450 옥시도리덕타제 도메인 및 KO를 포함하는 융합 작제물을 발현한다. BMR 폴리펩티드를 엔코딩하는 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:117에 제시되며; BMR 아미노산 서열은 SEQ ID NO:118에 제시된다. 일부 구체예에서, BMR은 돌연변이체 BMR이며, 비제한적으로 BMR W1046A 돌연변이체 (SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120)를 포함한다. BMR 돌연변이체가 NADH에 대해 특이적일 수 있다. 일부 구체예는, KO-BMR 융합 작제물은 링커 (SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:122)를 포함한다. 일부 구체예에서, 융합 작제물의 KO는 SEQ ID NO:65 (SEQ ID NO:75에 제시된 아미노산 서열에 상응)에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO 또는 SrKO1 (SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:79)이다. 일부 구체예에서, 융합 작제물의 KO는 절두된 KO이다. 예시적인 KO-BMR 융합 작제물은 SEQ ID NO:99-112에 제시된다. 실시예 10 참조.
일부 구체예에서, 스테비올 글리코시드-생성 균주에서 SrKO1-BMR 융합 작제물 (SEQ ID NO:99-106)의 발현은 스테비올 글리코시드-생성 균주에서 SrKO1 (SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:79)의 발현과 비교하여, ent-카우레노산, 13-SMG, 및 RebB 수준의 증가를 유도한다. 일부 구체예에서, 스테비올 글리코시드-생성 균주에서 융합 작제물 (SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:108)의 발현은 스테비올 글리코시드-생성 균주에서 SEQ ID NO:65에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO의 발현과 비교하여, ent-카우렌의 ent-카우레노산으로의 더 큰 전환 및 ent-카우레노산의 13-SMG으로의 더 큰 전환을 유도한다. 일부 구체예에서, SEQ ID NO:65에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO 및 W1046A 돌연변이체 BMR (SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110)을 포함하는 융합 작제물의 발현은 증가된 ent-카우레노산 수준을 유도한다. 도 16 (b 및 d) 및 실시예 10 참조.
일부 구체예에서, 스테비올 글리코시드-생성 균주는 피질 ER 단백질 2 (ICE2; SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:114)의 유전을 포함한다. ICE2는 또한 YIL090W로서 지칭된다. 일부 양태에서, ICE2는 과다발현된다. ICE2는 CPR1 (SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:76) 및/또는 CPR12 (SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98)를 포함하는 균주에서 발현될 수 있다. 일부 구체예에서, 스테비올 글리코시드-생성 균주는 ICE2의 2개 복사체를 포함한다. 일부 구체예에서, ICE2의 발현은 ent-카우렌 대사를 증가시키며 (ent-카우렌, ent-카우레놀, ent-카우레날, 및 ent-카우레놀 글리코시드의 감소된 축적을 유도함), 대조군 균주와 비교하여 스테비올 글리코시드의 증가된 축적을 유도한다. 표 10 및 실시예 11 참조.
일부 구체예에서, 발효에 의해 배양된 스테비올 글리코시드-생성 균주에서 SEQ ID NO:56에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO의 발현은 대조군 스테비올 글리코시드-생성 균주와 비교하여, ent-카우렌 화합물의 더 낮은 축적을 유도한다. 일부 양태에서, 대조군 균주와 비교하여 더 높은 수준의 ent-카우레노산 및 스테비올 글리코시드가 발생한다. 일부 구체예에서, 발효에 의해 배양된 스테비올 글리코시드-생성 균주에서 SEQ ID NO:80에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KAH, SEQ ID NO:56에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO, 및 SEQ ID NO:65에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO의 발현은 대조군 균주와 비교할 경우, ent-카우렌, ent-카우레놀, ent-카우레날, ent-카우레놀 글리코시드, ent-카우레노산, 및 ent-카우레노산 글리코시드의 감소된 축적 및 스테비올 글리코시드의 증가된 생성을 유도한다. 일부 구체예에서, 발효에 의해 배양된 CPR12 (SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98), SEQ ID NO:80에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KAH, 및 SEQ ID NO:56에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO의 발현은 대조군 균주와 비교하여, 감소된 ent-카우렌, ent-카우레놀, ent-카우레날, ent-카우레놀 글리코시드, ent-카우레노산, 및 ent-카우레노산 글리코시드 축적 및 더 높은 수준의 스테비올 글리코시드를 발생시킨다. 표 12 및 실시예 12 참조.
기능성 호몰로그
상기 기재된 폴리펩티드의 기능성 호몰로그는 또한 재조합 숙주에서 스테비올 글리코시드 생산에 이용하기에 적합하다. 기능성 호몰로그는 기준 폴리펩티드에 대한 서열 유사성을 지니고, 기준 폴리펩티드의 생화학적 또는 생리학적 기능(들) 중 하나 이상을 보유하는 폴리펩티드이다. 기능성 호몰로그 및 기준 폴리펩티드는 자연 발생 폴리펩티드일 수 있고, 서열 유사성은 수렴성 (convergent) 또는 분기성 (divergnt) 진화 사건 때문일 수 있다. 이와 같이, 기능성 호몰로그는 때로 문헌에서 호몰로그, 또는 오르톨로그(ortholog), 또는 파라로그 (paralog)로 명명된다. 자연 발생 기능성 호몰로그의 변이체, 예컨대 야생형 코딩 서열의 돌연변이체에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드는 그 자체가 기능성 호몰로그일 수 있다. 기능성 호몰로그는 또한 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 부위-지정된 돌연변이유발을 통해, 또는 상이한 자연-발생 폴리펩티드에 대한 코딩 서열로부터의 도메인을 조합시켜 ("도메인 교환 (swapping)") 생성될 수 있다. 본원에 기재된 기능성 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자를 변형시키는 기법은 공지되어 있고, 특히, 지향된 진화 기법, 부위-지정된 돌연변이유발 기법 및 무작위 돌연변이유발 기법을 포함하며, 이는 폴리펩티드의 특이적 활성을 증가시키거나, 기질 특이성을 변경시키거나, 발현 수준을 변경시키거나, 세포 내(subcellular) 위치를 변경시키거나, 폴리펩티드-폴리펩티드 상호작용을 요망되는 방식으로 변형시키는데 유용할 수 있다. 그러한 변형된 폴리펩티드는 기능성 호몰로그로 간주된다. 용어 "기능성 호몰로그"는 때로 기능적으로 상동인 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산에 적용된다.
기능성 호몰로그는 뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열 정렬의 분석에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 데이터베이스에 쿼리 (query)를 실행함으로써 스테비올 글리코시드 생합성 폴리펩티드들의 호몰로그를 확인할 수 있다. 서열 분석은 KO, KAH 또는 CPR 아미노산 서열을 기준 서열로 이용하는 비중복성 (nonredundant) 데이터베이스의 BLAST, 상호(Reciprocal) BLAST, 또는 PSI-BLAST 분석을 포함할 수 있다. 아미노산 서열은, 일부 경우에, 뉴클레오티드 서열로부터 유추된다. 데이터베이스에서 40% 초과의 서열 동일성을 갖는 이러한 폴리펩티드는 스테비올 글리코시드 생합성 폴리펩티드로서의 적합성을 추가로 평가하기 위한 후보물질이다. 아미노산 서열 유사성은 보존적 아미노산 치환, 예를 들어 하나의 소수성 잔기를 또 다른 소수성 잔기로 치환하거나 하나의 극성 잔기를 또 다른 극성 잔기로 치환하는 것을 허용한다. 요망되는 경우, 추가로 평가되어야 하는 후보의 수를 좁히기 위해 그러한 후보의 수동 검사를 수행할 수 있다. 수동 검사는 스테비올 글리코시드 생합성 폴리펩티드에 존재하는 도메인, 예컨대 보존된 기능성 도메인을 갖는 것으로 보이는 후보를 선택함에 의해 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 및 폴리펩티드는 BLAST 분석을 이용하기보다는 발현 수준을 기반으로 하는 전사체 데이터로부터 확인된다.
보존된 영역은 반복되는 서열이거나, 일부 이차 구조 (예를 들어, 나선형 및 베타 시트)를 형성하거나, 양 또는 음으로 하전된 도메인을 확립하거나, 단백질 모티프 또는 도메인을 나타내는 스테비올 글리코시드 생합성 폴리펩티드의 일차 아미노산 서열 내의 영역의 위치를 찾아냄에 의해 확인될 수 있다. 예컨대, 월드와이드웹 상에서 다양한 단백질 모티프 및 도메인에 대한 컨센서스 서열을 기재하고 있는 Pfam 웹사이트 sanger.ac.uk/Software/Pfam/ 및 pfam.janelia.org/를 참조하라. Pfam 데이터베이스에 포함된 정보는 문헌[Sonnhammer et al., Nucl. Acids Res., 26:320-322 (1998); Sonnhammer et al., Proteins, 28:405-420 (1997); and Bateman et al., Nucl. Acids Res., 27:260-262 (1999)]에 기재되어 있다. 보존된 영역은 밀접하게 관련된 종으로부터의 동일하거나 관련된 폴리펩티드의 서열을 정렬함으로써 또한 결정될 수 있다. 밀접하게 관련된 종은 바람직하게는 동일한 패밀리로부터의 종이다. 일부 구체예들에서, 이러한 호몰로그를 확인하기 위해 두 상이한 종으로부터의 서열을 정렬하는 것이 적합하다.
전형적으로, 적어도 약 40%의 아미노산 서열 동일성을 나타내는 폴리펩티드가 보존된 영역을 확인하는데 유용하다. 관련 폴리펩티드의 보존된 영역은 적어도 45%의 아미노산 서열 동일성 (예컨대, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%의 아미노산 서열 동일성)을 나타낸다. 일부 구체예에서, 보존된 영역은 적어도 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 나타낸다.
예를 들어, 재조합 숙주에서 스테비올을 생성하기에 적합한 폴리펩티드는 KO, KAH, 및 CPR의 기능성 호몰로그를 포함한다.
예를 들어, KO, KAH, 및 CPR의 기질 특이성을 변경시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 부위-지정된/논리적 돌연변이유발 접근법, 무작위 유도되는 진화 접근법 및 무작위 돌연변이유발/포화 기법이 효소의 활성 부위 부근에서 수행되는 조합법을 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 문헌[Osmani et al., 2009, Phytochemistry 70: 325-347]을 참조.
후보 서열은 전형적으로 기준 서열 길이의 80% 내지 200%인 길이, 예컨대, 기준 서열 길이의 82, 85, 87, 89, 90, 93, 95, 97, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200%인 길이를 갖는다. 기능성 호몰로그 폴리펩티드는 전형적으로 기준 서열 길이의 95% 내지 105%인 길이, 예컨대, 기준 서열 길이의 90, 93, 95, 97, 99, 100, 105, 110, 115, 또는 120%인 길이, 또는 그 사이의 임의의 범위의 길이를 갖는다. 기준 핵산 또는 폴리펩티드에 대한 임의의 후보 핵산 또는 폴리펩티드의 % 동일성은 다음과 같이 결정될 수 있다. 기준 서열 (예컨대, 본원에 기재된 핵산 서열 또는 아미노산 서열)은 컴퓨터 프로그램 ClustalW (버전 1.83, 디폴트 파라미터)를 이용하여 하나 이상의 후보 서열에 정렬되는데, 이는 이들의 전장에 걸쳐 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 정렬이 수행될 수 있게 한다 (글로벌 정렬). 문헌[Chenna et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31(13):3497-500].
ClustalW는 기준 서열과 하나 이상의 후보 서열 간의 최상의 매칭을 계산하고, 동일성, 유사성 및 차이가 측정될 수 있도록 이들을 정렬시킨다. 하나 이상의 잔기의 갭이 기준 서열, 후보 서열 또는 둘 모두에 삽입되어 서열 정렬을 최대화시킬 수 있다. 핵산 서열의 신속한 쌍(pairwise) 정렬을 위해, 다음의 디폴트 파라미터가 이용된다: 워드 크기: 2; 윈도 크기: 4; 득점 방법: % 에이지; 상부 대각선의 수: 4; 및 갭 페널티: 5. 핵산 서열의 다수 정렬을 위해, 다음의 파라미터가 이용된다: 갭 개방 페널티: 10.0; 갭 연장 페널티: 5.0; 및 중량 변화: 있음. 단백질 서열의 신속한 쌍 정렬을 위해, 다음의 파라미터가 이용된다: 워드 크기: 1; 윈도 크기: 5; 득점 방법: % 에이지; 상부 대각선의 수: 5; 갭 페널티: 3. 단백질 서열의 다수 정렬을 위해, 다음의 파라미터가 이용된다: 중량 매트릭스: 블로섬(blosum); 갭 개방 페널티: 10.0; 갭 연장 페널티: 0.05; 친수성 갭: 켜짐(on); 친수성 잔기: Gly, Pro, Ser, Asn, Asp, Gln, Glu, Arg, 및 Lys; 잔기-특이적 갭 페널티: 켜짐. ClustalW 결과는 서열 간의 관계를 반영하는 서열 정렬이다. ClustalW는, 예를 들어, 월드와이드웹 상의 Baylor College of Medicine Search Launcher 사이트 (searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html) 및 월드와이드웹 상의 European Bioinformatics Institute 사이트 (ebi.ac.uk/clustalw)에서 실행될 수 있다.
기준 서열에 대한 후보 핵산 또는 아미노산 서열의 % 동일성을 측정하기 위해, 서열을 ClustalW를 이용하여 정렬시키고, 정렬에서 동일한 매칭의 수를 기준 서열의 길이로 나누고, 그 결과에 100을 곱한다. % 동일성 값은 가장 근접한 소수점 첫째 자리까지 반올림할 수 있음에 유의한다. 예를 들어, 78.11, 78.12, 78.13, 및 78.14는 78.1로 반내림되는 반면, 78.15, 78.16, 78.17, 78.18, 및 78.19는 78.2로 반올림된다.
기능성 KO, KAH, 또는 CPR 단백질은 효소에 의해 수행된 효소 활성에 관여하지 않는 추가적인 아미노산을 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 일부 구체예에서, KO, KAH, 또는 CPR 단백질은 융합 단백질이다. 용어 "키메라", "융합 폴리펩티드", "융합 단백질", "융합 효소", "융합 작제물", "키메라 단백질", "키메라 폴리펩티드", "키메라 작제물" 및 "키메라 효소"는 다양한 단백질을 코딩하는 2개 이상의 유전자의 접합을 통해 조작된 단백질을 지칭하는 것으로 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 일부 구체예에서, KO, KAH, 또는 CPR 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 서열은 엔코딩된 폴리펩티드의 후속 조작, 분비 또는 국소화를 용이하도록 (예를 들어, 정제 또는 검출을 용이하도록) 설계된 "tag"를 엔코딩하는 tag 서열을 포함할 수 있다. Tag 서열은 엔코딩된 tag가 폴리펩티드의 카르복실 또는 아미노 말단 중 어느 하나에 위치하도록 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 서열에 삽입될 수 있다. 엔코딩된 tag의 비제한적 예는 녹색 형광 단백질 (GFP), 인간 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA), 글루타티온 S 트랜스퍼라제 (GST), 폴리히스티딘-tag (HIS tag), 및 Flag™ tag (Kodak, New Haven, CT)를 포함한다. tag의 기타 예는 엽록체 운송 펩티드, 미토콘드리아 운송 펩티드, 녹말체 펩티드, 신호 펩티드 또는 분비 tag를 포함한다.
일부 구체예에서, 융합 단백질은 도메인 교환에 의해 변형된 단백질이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "도메인 교환"은 제 1 단백질의 도메인을 제 2 단백질의 도메인로 대체하는 과정을 기술하는데 사용된다. 일부 구체예에서, 제 1 단백질의 도메인 및 제 2 단백질의 도메인은 기능적으로 동일하거나 기능적으로 유사하다. 일부 구체예에서, 제 2 단백질의 도메인의 구조 및/또는 서열은 제 1 단백질의 도메인의 구조 및/또는 서열과 상이하다. 일부 구체예에서, KO 폴리펩티드는 도메인 교환에 의해 변형된다. 실시예 10 참조.
스테비올 및 스테비올 글리코시드 생합성 핵산
본원에 기재된 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 유전자는 폴리펩티드 발현에 적합한 하나 이상의 조절 영역에 센스 배향으로 작동적으로 연결된, 상기 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함한다. 많은 미생물이 폴리시스트론 mRNA로부터 다수의 유전자 생성물을 발현할 수 있으므로, 요망되는 경우 다수의 폴리펩티드가 상기 미생물에 대한 단일한 조절 영역의 제어 하에 발현될 수 있다. 코딩 서열 및 조절 영역은, 조절 영역과 코딩 서열이 상기 서열의 전사 또는 번역을 조절하는데 유효하도록 정위될 때 작동적으로 연결된 것으로 간주된다. 전형적으로, 코딩 서열의 번역 리딩 프레임의 번역 개시 부위는 모노시스트론 유전자에 대한 조절 영역의 1 내지 약 50개 뉴클레오티드 다운스트림 사이에 위치한다.
많은 경우에, 본원에 기재된 폴리펩티드에 대한 코딩 서열은 재조합 숙주 이외의 종에서 확인되며, 즉, 이종 핵산이다. 따라서, 재조합 숙주가 미생물인 경우, 코딩 서열은 그 밖의 원핵 또는 진핵 미생물, 식물 또는 동물로부터 유래될 수 있다. 그러나, 일부 경우에 코딩 서열은 상기 숙주에 대한 천연 서열이며 해당 유기체에 재도입된다. 천연 서열은 종종 외인성 핵산에 연결된 비-자연 서열, 예를 들어 재조합 핵산 작제물에서 천연 서열의 측면에 있는 비-천연 조절 서열의 존재에 의해 자연 발생 서열과 구별될 수 있다. 또한, 안정하게 형질전환된 외인성 핵산은 전형적으로 천연 서열이 발견되는 위치가 아닌 다른 위치에 통합된다. "조절 영역"은 전사 또는 번역 개시 및 속도, 및 전사 또는 번역 생성물의 안정성 및/또는 운동성에 영향을 주는 뉴클레오티드 서열을 지닌 핵산을 의미한다. 조절 영역은, 비제한적으로, 프로모터 서열, 인핸서 서열, 반응 요소, 단백질 인지 부위, 유도성 요소, 단백질 결합 서열, 5' 및 3' 비번역된 영역 (UTR), 전사 출발 부위, 종결 서열, 폴리아데닐화 서열, 인트론, 및 이의 조합을 포함한다. 조절 영역은 전형적으로 적어도 코어(기저) 프로모터를 포함한다. 조절 영역은 또한 적어도 하나의 제어 요소, 예를 들어 인핸서 서열, 업스트림 요소 또는 업스트림 활성화 영역 (UAR)을 포함할 수 있다. 조절 영역은, 조절 영역이 서열의 전사 또는 번역을 조절하는데 유효하도록 조절 영역과 코딩 서열을 정위시킴으로써 코딩 서열에 작동적으로 연결된다. 예를 들어, 코딩 서열 및 프로모터 서열을 작동적으로 연결시키기 위해, 코딩 서열의 번역 리딩 프레임의 번역 개시 부위는 전형적으로 프로모터의 1 내지 약 50개 뉴클레오티드 다운스트림에 정위된다. 그러나, 조절 영역은 번역 개시 부위의 약 5,000개 만큼 많은 뉴클레오티드 업스트림, 또는 전사 출발 부위의 약 2,000개 뉴클레오티드 업스트림에 정위될 수 있다.
포함될 조절 영역의 선택은 비제한적으로 특정 배양 단계 동안의 효율, 선택성, 유도성, 요망되는 발현 수준, 및 우선적인 발현을 포함하는 여러 인자에 의해 좌우된다. 코딩 서열에 대한 조절 영역을 적절하게 선택하고 정위함에 의해 코딩 서열의 발현을 조절하는 것은 당업자에게는 관례적인 것이다. 하나를 초과하는 조절 영역, 예컨대 인트론, 인핸서, 업스트림 활성화 영역, 전사 종결인자, 및 유도성 요소가 존재할 수 있음이 이해될 것이다.
하나 이상의 유전자는 스테비올 및/또는 스테비올 글리코시드 생성의 별개의 양태에 유용한 "모듈"로 재조합 핵산 작제물에 조합될 수 있다. 모듈, 특히 폴리시스트론 모듈에서 복수의 유전자를 조합시키는 것은 다양한 종에서의 모듈의 이용을 용이하게 한다. 예를 들어, 스테비올 생합성 유전자 클러스터, 또는 UGT 유전자 클러스터는 폴리시스트론 모듈에서 조합될 수 있어서, 적합한 조절 영역의 삽입 후, 상기 모듈은 광범하게 다양한 종에 도입될 수 있다. 또 다른 예로서, UGT 유전자 클러스터는 각각의 UGT 코딩 서열이 별도의 조절 영역에 작동적으로 연결되어 UGT 모듈을 형성하도록 조합될 수 있다. 그러한 모듈은 모노시스트론 발현이 필수적이거나 바람직한 종들에서 이용될 수 있다. 재조합 작제물은 스테비올 또는 스테비올 글리코시드 생성에 유용한 유전자 외에, 전형적으로 복제 기점, 및 적절한 종에서 작제물의 유지를 위한 하나 이상의 선택가능한 마커를 또한 함유한다.
유전자 코드의 축퇴로 인해, 다수의 핵산은 특정한 폴리펩티드를 엔코딩할 수 있으며; 즉, 다수의 아미노산의 경우, 아미노산에 대한 코돈으로서 작용하는 하나 초과의 뉴클레오티드 트리플렛(triplet)이 존재함이 이해될 것이다. 따라서, 주어진 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 코돈은 특정 숙주에서 최적의 발현이 얻어지도록, 그 숙주 (예를 들어, 미생물)에 적절한 코돈 바이어스 표를 이용하여 변형될 수 있다. 분리된 핵산으로서, 이러한 변형된 서열은 정제된 분자로서 존재할 수 있고 재조합 핵산 작제물에 대한 모듈을 구성하는데 사용하기 위해 벡터 또는 바이러스에 혼입될 수 있다.
일부 경우에 대사 중간체를 스테비올 또는 스테비올 글리코시드 생합성 쪽으로 전용시키기 위해 내인성 폴리펩티드의 하나 이상의 기능을 억제하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 스테비올 또는 스테비올 글리코시드 생성을 추가로 증가시키기 위해, 예컨대 스쿠알렌 에폭시다제를 하향조절함으로써, 효모 균주에서 스테롤의 합성을 하향조절하는 것이 바람직할 수 있다. 또 다른 예로서, 특정한 내인성 유전자 생성물, 예를 들어 본원에 논의된 대로 이차 대사산물로부터 글루코스 모이어티를 제거하는 글리코하이드롤라제 또는 포스파타제의 분해 기능을 억제하는 것이 바람직할 수 있다. 그러한 경우에, 폴리펩티드 또는 유전자 생성물을 과다발현하는 핵산은 균주내로 형질전환되는 재조합 작제물에 포함될 수 있다. 대안적으로, 돌연변이유발을 이용하여, 기능을 증가하거나 향상시키는 것이 요망되는 유전자의 변이체를 생성할 수 있다.
숙주 미생물
포유동물, 곤충, 식물 및 조류(algal) 세포를 포함하는 재조합 숙주는 스테비올 글리코시드를 생성하기 위한 폴리펩티드를 발현하는데 사용될 수 있다. 많은 원핵생물 및 진핵생물이 또한, 본원에 기재된 재조합 미생물, 예를 들어 그람-음성 박테리아, 효모 및 진균류 구성에 사용하기에 적합하다. 스테비올 글리코시드 생성 균주로 사용하도록 선택된 종 및 균주는 우선 생성 유전자가 이 균주에 내인성인지, 어느 유전자가 존재하지 않는지를 판단하기 위하여 분석된다. 균주에 내인성 상응체가 존재하지 않는 유전자가 유리하게는 하나 이상의 재조합 작제물에 통합되고, 이는 이어서 손실 기능(들)을 공급하기 위하여 균주내로 형질전환된다.
전형적으로, 재조합 미생물은 원하는 기간 동안 한정된 온도 (들)에서 발효기에서 성장한다. 본 발명에 의해 제공된 작제되고 유전적으로 조작된 미생물은 특히, 케모스태트, 배치, 유가 배양, 반연속성 발효 예컨대, 주입 및 배출, 연속 관류 발효, 및 연속 관류 세포 배양을 포함하는 통상적인 발효 공정을 이용하여 배양될 수 있다. 상기 방법에 이용되는 특정 미생물에 따라, 이소펜테닐 생합성 유전자 및 테르펜 신타제 및 사이클라제 유전자와 같은 그 밖의 재조합 유전자가 또한 존재하고 발현될 수 있다. 기질 및 중간체, 예컨대, 이소펜테닐 디포스페이트, 디메틸알릴 디포스페이트, GGPP, ent-카우렌 및 ent-카우레노산의 수준은 공개된 방법에 따라 분석용 배양 배지로부터 샘플을 추출함에 의해 결정될 수 있다.
본 방법에서 사용되는 탄소원은 재조합 숙주 세포에 의해 대사되어 스테비올 글리코시드의 성장 및/또는 생성을 촉진할 수 있는 임의의 분자를 포함한다. 적합한 탄소원의 예는 비제한적으로, 수크로스 (예를 들어, 당밀에서 발견된 것과 같음), 프룩토스, 자일로스, 에탄올, 글리세롤, 글루코스, 셀룰로스, 전분, 셀로비오스 또는 기타 글루코스-포함 폴리머를 포함한다. 숙주로서 효모를 사용하는 구체예에서, 예를 들어, 탄소원 예컨대, 수크로스, 프룩토스, 자일로스, 에탄올, 글리세롤 및 글루코스가 적합하다. 탄소원은 배양 기간에 걸쳐 숙주 유기체에 제공될 수 있거나, 대안적으로, 유기체는 임의의 에너지 공급원 예를 들어, 단백질의 존재하에 소정 기간 동안 성장할 수 있으며, 이어서 단지 유가 배양기 동안 탄소원이 제공된다.
재조합 미생물을 요망되는 기간 동안 배양액에서 성장시킨 후, 이어서 스테비올 및/또는 하나 이상의 스테비올 글리코시드를 당 분야에 공지된 다양한 기법을 이용하여 배양액으로부터 회수할 수 있다. 일부 구체예에서, 투과제는 공급원료가 숙주로 들어가서 생성물을 방출시키는 것을 보조하기 위해 첨가될 수 있다. 예를 들어, 배양된 미생물의 미정제 용해물을 원심분리시켜 상청액을 수득할 수 있다. 그 후 생성된 상청액을 크로마토그래피 칼럼, 예컨대 C-18 칼럼에 적용시키고, 물로 세척하여 친수성 화합물을 제거한 다음, 메탄올과 같은 용매를 이용하여 관심 화합물(들)을 용리시킬 수 있다. 이어서 화합물(들)은 분취용 HPLC에 의해 추가로 정제될 수 있다. 또한 WO 2009/140394호 참조.
본원에서 논의된 다양한 유전자 및 모듈은 단일 숙주보다는 2개 이상의 재조합 숙주에 존재할 수 있음을 이해할 것이다. 복수의 재조합 숙주가 사용되는 경우, 이들은 혼합 배양에서 성장되어 스테비올 및/또는 스테비올 글리코시드를 축적할 수 있다.
대안적으로, 2개 이상의 숙주 각각은 별도의 배양 배지에서 성장시킬 수 있고, 제 1 배양 배지의 생성물, 예를 들어, 스테비올이 제 2 배양 배지에 도입되어 후속 중간체 또는 최종 생성물 예를 들어, RebA로 전환될 수 있다. 이어서 제 2 또는 최종 숙주에 의해 생성된 생성물이 회수된다. 또한, 일부 구체예에서, 재조합 숙주가 배양 배지 이외의 영양원을 사용하고 발효기 이외의 시스템을 이용하여 성장하는 것으로 또한, 이해될 것이다.
예시적인 원핵생물 및 진핵생물 종은 하기에 더욱 상세하게 기재된다. 그러나, 그 밖의 종들이 적합할 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, 적합한 종은 아가리쿠스(Agaricus), 아스퍼길루스(Aspergillus), 바실루스(Bacillus), 칸디다(Candida), 코리네박테리움(Corynebacterium), 에레모테시움(Eremothecium), 에스체리치아(Escherichia), 푸사리움/깁베렐라(Fusarium / Gibberella), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 래티포루스(Laetiporus), 렌티누스(Lentinus), 파피아(Phaffia), 파네로새테(Phanerochaete), 피치아(Pichia), 피스코미트렐라(Physcomitrella), 로도토룰라(Rhodoturula), 사카로마이세스(Saccharomyces), 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 스파셀로마(Sphaceloma), 잔토필로마이세스(Xanthophyllomyces), 및 야로위아(Yarrowia)와 같은 속에 속할 수 있다. 이러한 속으로부터 선택된 예시적은 종은 렌티누스 티그리누스 (Lentinus tigrinus), 래티포루스 술푸레우스 (Laetiporus sulphureus), 파네로새테 크리소스포리움 (Phanerochaete chrysosporium), 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris), 사이베를린데네라 자디니이(Cyberlindnera jadinii), 피스코미트렐라 파텐스 (Physcomitrella patens), 로도토룰라 글루티니스 (Rhodoturula glutinis), 로도토룰라 무실라기노사 (Rhodoturula mucilaginosa), 파피아 로도자이마 (Phaffia rhodozyma), 잔토필로마이세스 덴드로르호우스(Xanthophyllomyces dendrorhous), 푸사리움 푸지쿠로이/깁베렐라 푸지쿠로이(Fusarium fujikuroi / Gibberella fujikuroi), 칸디다 유틸리스 (Candida utilis), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)를 포함한다.
일부 구체예에서, 미생물은 원핵생물 예컨대, 에스체리치아 박테리아 세포, 예를 들어, 에스체리치아 콜라이 세포; 락토바실러스 박테리아 세포, 락토코커스 박테리아 세포, 코르네박테리움 박테리아 세포, 아세토박터 박테리아 세포, 아시네토박터 박테리아 세포, 또는 슈도모나스 박테리아 세포일 수 있다.
일부 구체예에서, 미생물은 아스코미세테 (Ascomycete), 예를 들어 깁베렐라 푸지쿠로이, 클루이베로마이세스 락티스, 쉬조사카로마이세스 폼베, 아스퍼길루스 나이저, 야로위아 리폴리티카, 아쉬비아 고시피이, 또는 S. 세레비시애일 수 있다.
일부 구체예에서, 미생물은 조류 세포 예를 들어, 블라케슬래 트리스포라(Blakeslea trispora), 두날리엘라 살리나(Dunaliella salina), 해마토코커스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis), 콜레라 종, 운다리아 핀나티피다(Undaria pinnatifida), 사르가숨(Sargassum), 라미나리아 자포니카(Laminaria japonica), 세네데스무스 알메리엔시스(Scenedesmus almeriensis) 종일 수 있다.
일부 구체예에서, 미생물은 시아노박테리아 세포 예를 들어, 블라케슬래 트리스포라(Blakeslea trispora), 두날리엘라 살리나(Dunaliella salina), 해마토코커스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis), 콜레라 종, 운다리아 핀나티피다(Undaria pinnatifida), 사르가숨(Sargassum), 라미나리아 자포니카(Laminaria japonica), 세네데스무스 알메리엔시스(Scenedesmus almeriensis) 종일 수 있다.
사카로마이세스 종
사카로마이세스는 합성 생물학에서 광범위하게 이용되는 새시 (chassis) 유기체이고, 재조합 미생물 플랫폼으로 이용될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이체의 라이브러리, 플라스미드, 대사의 상세한 컴퓨터 모델 및 S. 세레비시애에 대해 이용가능한 기타 정보가 존재하여, 생성물 수율을 향상시키기 위한 다양한 모듈의 합리적인 설계가 가능하다. 재조합 미생물을 만드는 방법은 공지되어 있다.
아스퍼질러스 종
아스퍼질러스 종, 예컨대 A. 오리재(A. oryzae), A. 나이거(A. niger) 및 A. 소재(A. sojae)는 식품 생산에 광범하게 이용되는 미생물이고, 또한 이를 재조합 미생물 플랫폼으로서 이용할 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 A. 니둘란스(A. nidulans), A. 푸미가투스(A. fumigatus), A. 오리재, A. 클라바투스(A. clavatus), A. 플라부스(A. flavus), A. 나이거, 및 A. 테레우스(A. terreus)의 유전체에 이용가능하여, 유동을 향상시키고 생성물 수율을 증가시키기 위해 내인성 경로의 합리적인 설계 및 변경을 가능케 한다. 아스퍼질러스 뿐만 아니라 트랜스크립토믹 (transcriptomic) 연구와 프로테오믹스 (proteomics) 연구를 위한 대사 모델이 개발되어 왔다. A. 나이거는 많은 식품 성분들, 예를 들어 시트르산 및 글루콘산의 산업적 생산을 위해 배양되며, 이에 따라 A. 나이거와 같은 종은 스테비올 글리코시드의 생산에 일반적으로 적합하다.
E. 콜라이
합성 생물학에서 광범위하게 이용되는 또 다른 플랫폼 유기체인 E. 콜라이는 재조합 미생물 플랫폼으로서 또한 이용될 수 있다. 사카로마이세스와 유사하게, 돌연변이체의 라이브러리, 플라스미드, 대사의 상세한 컴퓨터 모델 및 E. 콜라이에 대해 이용가능한 그 밖의 정보가 존재하여, 생성물 수율을 향상시키기 위한 다양한 모듈의 합리적인 설계가 가능하다. 사카로마이세스에 대해 상기 기재된 것과 유사한 방법을 이용하여 재조합 E. 콜라이 미생물을 제조할 수 있다.
아가리쿠스, 깁베렐라 , 및 파네로채테 종
아가리쿠스, 깁베렐라, 및 파네로채테 종은 이들이 배양액에서 다량의 이소프레노이드를 생산하는 것으로 공지되어 있기 때문에 유용할 수 있다. 따라서, 다량의 스테비올 글리코시드를 생산하기 위한 테르펜 전구체가 이미 내인성 유전자에 의해 생산된다. 따라서, 스테비올 글리코시드 생합성 폴리펩티드에 대한 재조합 유전자를 포함하는 모듈은 메발로네이트 또는 MEP 경로 유전자를 도입할 필요없이 이러한 속으로부터의 종에 도입될 수 있다.
아르술라 아데니니보란스 ( 블라스토보트리스 아데니니보란스 ( Blastobotrys adeninivorans ))
아르술라 아데니니보란스는 특이한 생화학적 특징을 갖는 이형태 효모이다 (이것은 42℃의 온도까지 빵 효모와 같은 출아 효모로서 성장하고, 이러한 임계값을 넘어서는 실모양으로 성장한다). 이것은 광범위한 기질 상에서 성장할 수 있고 니트레이트를 흡수할 수 있다. 이것은 천연 플라스틱을 생산할 수 있는 균주의 생성 또는 환경 샘플에서 에스트로겐에 대한 바이오센서의 개발에 성공적으로 적용되어 왔다.
야로위아 리폴리티카
야로위아 리폴리티카는 이형태 효모 (아르술라 아데니니보란스 참조)이며 헤미아스코마이세테 과에 속한다. 야로위아 리폴리티카의 전체 유전체는 공지되어 있다. 야로위아 종은 호기성이며 비병원성인 것으로 간주된다. 야로위아는 소수성 기질 (예를 들어, 알칸, 지방산, 오일)을 효율적으로 사용하며 당에서 성장할 수 있다. 이는 산업 응용에 대한 높은 가능성을 가지고 있으며 유성 미생물이다. 야로위아 리폴립티카는 건조 세포 중량의 약 40%까지 지질 함량을 축적할 수 있으며 지질 축적 및 재흡수를 위한 모델 유기체이다. 예를 들어, 문헌 [Nicaud, 2012, Yeast 29(10):409-18; Beopoulos et al., 2009, Biohimie 91(6):692-6; Bankar et al., 2009, Appl Microbiol Biotechnol84(5):847-65.] 참조.
로도토룰라 종
로도토룰라는 단일세포의 유색 효모이다. 유성의 붉은 효모인 로도토룰라 글루티니스는 조 글리세롤로부터 지질과 카로테노이드를 생성하는 것으로 밝혀졌다 (Saenge et al., 2011, Process Biochemistry 46 (1): 210-8). 로도토룰라 토룰로이드 균주는 향상된 바이오매스 및 지질 생산성을 위한 효율적인 유가 발효 시스템인 것으로 밝혀졌다 (Li et al., 2007, Enzyme and Microbial Technology 41: 312-7).
로도스포리디움 토룰로이드 ( Rhodosporidium toruloides )
로도스포리디움 토룰로이드는 유성 효모이며 지질-생성 경로를 공학처리하는데 유용하다 (예를 들어, 문헌 [Zhu et al., 2013, Nature Commun. 3:1112; Ageitos et al., 2011, Applied Microbiology and Biotechnology 90(4):1219-27] 참조).
칸디다 보이디니이
칸디다 보이디니이는 메탄올자화(methylotrophic) 효모이다 (이것은 메탄올 상에서 성장할 수 있다). 한세눌라 폴리모르파 및 피치아 파스토리스와 같은 다른 메탄올자화 종과 같이, 이것은 이종성 단백질 생산에 탁월한 플랫폼을 제공한다. 멀티그램 범위의 분비된 외래 단백질의 수율이 보고되었다. 컴퓨터활용 방법, IPRO는 칸디다 보이디니이 자일로스 리덕타제의 보조인자 특이성을 NADPH로부터 NADH로 실험적으로 교환시키는 돌연변이를 최근에 예측하였다. 예를 들어, 문헌 [Mattanovich et al., 2012, Methods Mol Biol. 824:329-58; Khoury et al., 2009, 단백질 Sci. 18(10):2125-38] 참조.
한세눌라 폴리모르파 ( 피치아 안구스타 ( Pichia angusta ))
한세눌라 폴리모르파는 메탄올자화 효모이다 (칸디다 보이디니이 참조). 이것은 더욱이 광범위한 범위의 다른 기질에서도 성장할 수 있다; 이것은 내열성이며 니트레이트를 흡수할 수 있다 (또한 클루이베로마이세스 락티스 참조). 이것은 B형 간염 백신, 인슐린 및 C형 간염의 치료를 위한 인터페론 알파-2a의 생산, 더 나아가 기술적 효소 범위에 활용되고 있다. 예를 들어, 문헌 [Xu et al., 2014, Virol Sin. 29(6):403-9] 참조.
클루이베로마이세스 락티스
클루이베로마이세스 락티스는 케피어 (kefir)의 생산에 일반적으로 활용되는 효모이다. 이것은 여러 당, 가장 중요하게는 밀크와 유장에 존재하는 락토스 상에서 성장할 수 있다. 이것은 특히 치즈 생산을 위한 키모신 (대개 소의 위에 존재하는 효소)의 생산에 성공적으로 활용되었다. 생산은 40,000L 규모의 발효기에서 일어난다. 예를 들어, 문헌 [van Ooyen et al., 2006, FEMS Yeast Res. 6(3):381-92] 참조.
피치아 파스토리스
피치아 파스토리스는 메탄올자화 효모이다 (칸디다 보이디니이 및 한세눌라 폴리모르파 참조). 이것은 외래 단백질의 생산을 위한 효율적인 플랫폼을 제공한다. 플랫폼 요소는 키트로 이용가능하며, 단백질 생산을 위해 전세계적으로 학계에서 이용된다. 균주는 복잡한 인간 N-글리칸 (효모 글리칸은 인간에서 발견되는 것과 유사하지만 동일하지는 않다)을 생산할 수 있도록 공학처리되었다. 예를 들어, 문헌 [Piirainen et al., 2014, N Biotechnol. 31(6):532-7] 참조.
피스코미트렐라 종
피스코미트렐라 이끼는 현탁 배양액에서 성장할 때 효모 또는 다른 진균 배양과 유사한 특징을 갖는다. 이러한 속은 다른 유형의 세포에서는 생산하기 어려운 식물 이차 대사산물의 생산에 이용될 수 있다.
스테비올 글리코시드 조성물
스테비올 글리코시드는 다양한 식품 시스템에서 반드시 동등한 성능을 발휘할 필요는 없다. 따라서, 선택된 스테비올 글리코시드 조성물로 합성을 유도하는 능력을 보유하는 것이 바람직하다. 본원에 기재된 재조합 숙주는 특이적 스테비올 글리코시드 (예를 들어, RebD 또는 RebM)가 선택적으로 풍부하고, 일관된 맛 프로파일을 보유하는 조성물을 생성할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 “풍부”는 스테비아 식물로부터의 스테비올 글리코시드 조성물 (추출물)과 비교하여 특정 스테비올 글리코시드의 증가된 비율을 갖는 스테비올 글리코시드 조성물을 설명할 때 사용된다. 따라서, 본원에 기재된 재조합 숙주는 주어진 식품에 요구되는 단맛 프로파일에 부합되도록 맞춰지고 배치 마다 일관된 각 스테비올 글리코시드의 비율을 갖는 조성물의 생성을 용이하게 할 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 숙주는 스테비아 추출물에서 볼 수 있는 원치 않는 식물 부산물을 생성하지 않거나 감소?? 양을 생성한다. 따라서, 본원에 기재된 재조합 숙주에 의해 생성된 스테비올 글리코시드 조성물은 스테비아 식물로부터 유래된 조성물과는 구별된다.
축적된 개별 스테비올 글리코시드 (예컨대, RebA, RebB, RebD 또는 RebM)의 양은 약 1 내지 약 7,000 mg/L, 예를 들어, 약 1 내지 약 10 mg/L, 약 3 내지 약 10 mg/L, 약 5 내지 약 20 mg/L, 약 10 내지 약 50 mg/L, 약 10 내지 약 100 mg/L, 약 25 내지 약 500 mg/L, 약 100 내지 약 1,500 mg/L, 또는 약 200 내지 약 1,000 mg/L, 적어도 약 1,000 mg/L, 적어도 약 1,200 mg/L, 적어도 약 1,400 mg/L, 적어도 약 1,600 mg/L, 적어도 약 1,800mg/L, 적어도 약 2,800 mg/L 또는 적어도 약 7,000 mg/L일 수 있다. 일부 양태에서, 개별 스테비올 글리코시드의 양은 7,000 mg/L를 초과할 수 있다. 축적된 스테비올 글리코시드 (예를 들어, RebA, RebB, RebD 또는 RebM)의 조합물의 양은 약 1 mg/L 내지 약 7,000 mg/L, 예를 들어, 약 200 내지 약 1,500, 적어도 약 2,000 mg/L, 적어도 약 3,000 mg/L, 적어도 약 4,000 mg/L, 적어도 약 5,000 mg/L, 적어도 약 6,000 mg/L 또는 적어도 약 7,000 mg/L일 수 있다. 일부 양태에서, 스테비올 글리코시드의 조합물의 양은 7,000 mg/L를 초과할 수 있다. 일반적으로, 배양시간이 길면 더 많은 양의 생성물을 얻을 수 있다. 따라서, 재조합 미생물은 1일 내지 7일, 1일 내지 5일, 3일 내지 5일, 약 3일, 약 4일, 또는 약 5일 동안 배양될 수 있다.
본원에 기재된 다양한 유전자와 모듈은 단일 미생물보다는 2가지 이상의 재조합 미생물에 존재할 수 있음을 인지할 것이다. 복수의 재조합 미생물이 이용될 때, 이들은 스테비올 및/또는 스테비올 글리코시드를 생성하기 위하여 혼합된 배양액에서 성장할 수 있다. 예를 들어, 제 1 미생물은 스테비올 글리코시드 전구체를 생성하기 위한 하나 이상의 생합성 유전자를 포함할 수 있는 반면, 제 2 미생물은 스테비올 글리코시드 생합성 유전자를 포함한다. 이어서 제 2 또는 최종 미생물에 의해 생성된 생성물이 회수된다. 일부 구체예에서, 재조합 미생물은 배양 배지 이외의 영양원을 사용하고 발효기 이외의 시스템을 이용하여 성장하는 것으로 또한 이해될 것이다.
대안으로, 2개 이상의 미생물 각각이 별도의 배양 배지에서 성장될 수 있고, 제 1 배양 배지의 생성물, 예를 들어 스테비올을 제 2 배양 배지로 도입하여, 후속 중간체로 전환시키거나 RebA와 같은 최종 생성물로 전환시킬 수 있다. 이어서, 제 2 또는 최종 미생물에 의해 생성된 생성물을 회수한다. 일부 구체예에서, 재조합 미생물은 배양 배지 이외의 영양원을 사용하고, 발효기 이외의 시스템을 이용하여 성장하는 것으로 또한, 이해될 것이다.
본원에 기재된 방법에 의해 수득한 스테비올 글리코시드 및 조성물은 식품, 건강기능식품 및 감미료 조성물을 제조하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, WO 2011/153378, WO 2013/022989, WO 2014/122227, 및 WO 2014/122328 참조.
예를 들어, 실질적으로 순수한 스테비올 또는 스테비올 글리코시드, 예를 들어 RebM 또는 RebD는 식품, 예를 들어 아이스크림, 탄산음료, 과일 쥬스, 요거트, 구운 제품, 츄잉검, 경질 및 연질 캔디, 및 소스에 포함될 수 있다. 실질적으로 순수한 스테비올 또는 스테비올 글리코시드는 비-식품, 예를 들어 약제품, 의학 제품, 건강기능식품 및 영양제에 또한 포함될 수 있다. 실질적으로 순수한 스테비올 또는 스테비올 글리코시드는 또한 농업 산업 및 애완동물 산업 둘 모두를 위한 동물 사료 제품에 포함될 수 있다. 대안으로, 스테비올 및/또는 스테비올 글리코시드의 혼합물은 재조합 미생물을 별도로 배양하고, 특이적 스테비올 또는 스테비올 글리코시드를 각각 생성하고, 각 미생물로부터 실질적으로 순수한 형태로 스테비올 또는 스테비올 글리코시드를 회수하고, 그 뒤 원하는 비율의 각 화합물을 포함하는 혼합물을 수득하기 위하여 이러한 화합물을 조합시켜 만들 수 있다. 본원에 기재된 재조합 미생물은 현재 스테비아 제품과 비교하여 좀더 정확하고 일관된 혼합물의 수득을 허용한다.
또 다른 대안에서, 실질적으로 순수한 스테비올 또는 스테비올 글리코시드는 다른 감미료, 예를 들어, 사카린, 덱스트로스, 수크로스, 푸룩토스, 에리트리톨, 아스파르탐, 수크랄로스, 모나틴, 또는 아세술팜 포타슘과 함께 식품에 혼입될 수 있다. 기타 감미료에 대한 스테비올 또는 스테비올 글리코시드의 중량비는 최종 식품에서 만족할 만한 맛에 도달하기 위해 필요에 따라 변화될 수 있다. 예를 들어, 미국 2007/0128311 참조. 일부 구체예에서, 스테비올 또는 스테비올 글리코시드에 향미 조절제로서 향미료 (예를 들어, 시트루스)가 제공될 수 있다.
본원에 기재된 재조합 미생물에 의해 생성된 조성물은 식품에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 재조합 미생물에 의해 생성된 스테비올 글리코시드 조성물은 스테비올 글리코시드 및 식품의 유형에 따라, 건중량을 기준으로 약 20 mg 스테비올 글리코시드/식품 kg 내지 약 1800 mg 스테비올 글리코시드/식품 kg 범위의 양으로 식품에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 재조합 미생물에 의해 생성된 스테비올 글리코시드 조성물은, 식품이 건중량을 기준으로 최대 500 mg 스테비올 글리코시드/식품 kg을 갖도록 디저트, 차가운 과자류 (예를 들어, 아이스크림), 유제품 (예를 들어, 요거트), 또은 음료 (예를 들어, 탄산 음료)에 혼입될 수 있다. 재조합 미생물에 의해 생성된 스테비올 글리코시드 조성물은, 식품이 건중량을 기준으로 최대 300 mg 스테비올 글리코시드/식품 kg을 갖도록 구운 제품 (예를 들어, 비스킷)에 혼입될 수 있다. 재조합 미생물에 의해 생성된 스테비올 글리코시드 조성물은, 식품이 건중량을 기준으로 최대 1000 mg 스테비올 글리코시드/식품 kg을 갖도록 소스 (예를 들어, 초콜릿 시럽) 또는 식물 제품 (예를 들어, 피클)에 혼입될 수 있다. 재조합 미생물에 의해 생성된 스테비올 글리코시드 조성물은, 식품이 건중량을 기준으로 최대 160 mg 스테비올 글리코시드/식품 kg을 갖도록 빵에 혼입될 수 있다. 재조합 미생물, 식물 또는 식물 세포에 의해 생성된 스테비올 글리코시드 조성물은, 식품이 건중량을 기준으로 최대 1600 mg 스테비올 글리코시드/식품 kg을 갖도록 경질 또는 연질 사탕에 혼입될 수 있다. 재조합 미생물, 식물, 또는 식물 세포에 의해 생성된 스테비올 글리코시드 조성물은, 식품이 건중량을 기준으로 최대 1000 mg 스테비올 글리코시드/식품 kg을 갖도록 가공된 과일 제품 (예를 들어, 과일 쥬스, 과일 필링, 잼 및 젤리)에 혼입될 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에서 생성된 스테비올 글리코시드 조성물은 약제 조성물의 성분이다. 예를 들어, 문헌 [스테비올 글리코시드s Chemical and Technical Assessment 69th JECFA, 2007, prepared by Harriet Wallin, Food Agric. Org.; EFSA Panel on Food Additives and Nutrient Sources added to Food (ANS), “Scientific Opinion on the safety of steviol glycosides for the proposed uses as a food additive,” 2010, EFSA Journal 8(4):1537; U.S. Food and Drug Administration GRAS Notice 323; U.S Food and Drug Administration GRAS Notice Notice 329]; WO 2011/037959; WO 2010/146463; WO 2011/046423; 및 WO 2011/056834 참조.
예를 들어, 이러한 스테비올 글리코시드 조성물은 90-99 중량%의 RebA 및 검출불가능한 스테비아 식물-유래된 오염물질을 가질 수 있으며, 건중량을 기준으로 25-1600 mg/kg, 예를 들어, 100-500 mg/kg, 25-100 mg/kg, 250-1000 mg/kg, 50-500 mg/kg 또는 500-1000 mg/kg이 되도록 식품에 혼입될 수 있다.
이러한 스테비올 글리코시드 조성물은 3 중량% 초과의 RebB를 갖는 RebB-풍부 조성물일 수 있고, 식품 중 RebB의 양이 건중량을 기준으로 25-1600 mg/kg, 예를 들어, 100-500 mg/kg, 25-100 mg/kg, 250-1000 mg/kg, 50-500 mg/kg 또는 500-1000 mg/kg이 되도록 식품에 혼입될 수 있다. 전형적으로, RebB-풍부 조성물은 스테비아 식물-유래된 검출불가능한 양의 오염물질을 갖는다.
이러한 스테비올 글리코시드 조성물은 3 중량% 초과의 RebD를 갖는 RebD-풍부 조성물일 수 있고, 제품 중의 RebD의 양이 건중량을 기준으로 25-1600 mg/kg, 예를 들어, 100-500 mg/kg, 25-100 mg/kg, 250-1000 mg/kg, 50-500 mg/kg 또는 500-1000 mg/kg이 되도록 식품에 혼입될 수 있다. 전형적으로, RebD-풍부 조성물은 스테비아 식물-유래된 검출불가능한 양의 오염물질을 갖는다.
이러한 스테비올 글리코시드 조성물은 3 중량% 초과의 RebE를 갖는 RebE -풍부 조성물일 수 있고, 제품 중의 RebE의 양이 건중량을 기준으로 25-1600 mg/kg, 예를 들어, 100-500 mg/kg, 25-100 mg/kg, 250-1000 mg/kg, 50-500 mg/kg 또는 500-1000 mg/kg이 되도록 식품에 혼입될 수 있다. 전형적으로, RebE-풍부 조성물은 스테비아 식물-유래된 검출불가능한 양의 오염물질을 갖는다.
이러한 스테비올 글리코시드 조성물은 3 중량% 초과의 RebM을 갖는 RebM-풍부 조성물일 수 있으며, 제품 중의 RebM의 양이 건중량을 기준으로 25-1600 mg/kg, 예를 들어, 100-500 mg/kg, 25-100 mg/kg, 250-1000 mg/kg, 50-500 mg/kg 또는 500-1000 mg/kg이 되도록 식품에 혼입될 수 있다. 전형적으로, RebM-풍부 조성물은 스테비아 식물-유래된 검출불가능한 양의 오염물질을 갖는다.
일부 구체예에서, 실질적으로 순수한 스테비올 또는 스테비올 글리코시드는 탁상용 감미료 또는 "컵-포-컵(cup-for-cup)" 제품에 혼입된다. 이러한 제품은 전형적으로 하나 이상의 증량제, 예를 들어, 당업자에게 공지되어 있는 말토덱스트린을 이용하여 적절한 단맛 수준으로 희석될 수 있다. RebA, RebB, RebD, RebE, 또는 RebM이 풍부한 스테비올 글리코시드 조성물은 식탁용으로 건중량을 기준으로 10,000 내지 30,000 mg 스테비올 글리코시드/제품 kg으로 한 봉지로 포장될 수 있다. 일부 구체예에서, 스테비올 글리코시드는 시험관내, 생체내에서 또는 전세포 생물전환에 의해 생성된다.
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 기술될 것이며, 이는 청구범위에 기술된 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
실시예
이어지는 실시예는 본 발명의 특수한 구체예 및 이의 다양한 사용의 예시이다. 이들은 단지 설명을 목적으로 개시되며, 본 발명을 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.
실시예 1. LC-MS 분석 절차
3가지의 LC-MS 절차를 본원에 사용하였다. 실시예 2-6에 대해 이용된 첫 번째 방법에서, LC-MS 분석은 가열된 전기분무 이온 (HESI) 공급원이 있는 TSQ Quantum Access (ThermoFisher Scientific) 삼중 사중극(triple quadropole) 질량 분광기에 연결된 Waters Acquity UPLC® BEH 쉴드 RP18 칼럼 (2.1 x 50 mm, 1.7 μm 입자, 130 Å 포어 크기)이 구비된 UltiMate 3000 UPLC 시스템 (Dionex)을 이용하여 수행되었다. 용리는 0.0분에서 4.0분까지 25%에서 47% B로 구배를 증가시키고, 4.0분에서 5.0분까지 47%에서 100% B로 증가시키고, 5.0분에서 6.5분까지 100% B로 유지시킴에 의해 용리제 B (0.1% 포름산과 MeCN) 및 용리제 A (0.1% 포름산과 물)의 이동상을 이용하여 수행되었다. 유량은 0.4 mL/min이고, 칼럼 온도는 35℃였다. 스테비올 글리코시드는 SIM (단일 이온 모니터링)을 이용하여 다음 m/z-트레이스로 검출되었다.
표 1A: 스테비올 글리코시드에 대한 LC-MS 분석 정보
Figure pct00001
실시 예 7, 8 및 10에 있어서 사용된 두 번째 방법에서, Waters ACQUITY ESI (전기분사 이온화)-TQD 삼중 사중극 질량 분광기에 결합된 Waters ACQUITY UPLC (Waters Corporation, Milford, MA)에서 LC-MS 분석을 수행하였다. 화합물 분리는 2개 이동 상의 구배를 사용하여 ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 사전-칼럼 (130 Å, 1.7 μm, 2.1 mm X 5 mm)이 장착된 Waters ACQUITY UPLC® BEH C18 칼럼 (2.1 x 50 mm, 1.7 μm 입자, 130 Å 포어 크기)에서 달성하였다: A (0.1% 포름산과 물) 및 B (0.1% 포름산과 아세토니트릴)는 B를 20%로부터 0.3 내지 2.0분에서 50%로 2.01분에서 최대 100%까지 증가시키며, 0.6분 동안 100%에 고정시키며, 0.6분 동안 다시 균형을 이루게 하였다. 유량은 0.6 mL/min이며, 칼럼 온도는 55℃였다. MS 획득은 SIM 모드 (단일 이온 모니터링)를 이용하여 음이온-모드에서 이루어졌다. 스테비올 글리코시드 정량화는 실제 표준과 비교하여 수행되었다.
표 1B: 스테비올 글리코시드에 대한 MS 정보 분석.
Figure pct00002
실시예 9에 대해 사용된 세 번째 방법에서, LC-MS 분석은 ESI가 장착되고 음성 모드에서 작동되는 Waters 단일 사중극 질량 분광기 (SQD)에 결합된 Waters Acquity UPLC® BEH C18 칼럼 (2.1 x 50 mm, 1.7 μm 입자, 130 Å)을 사용하여 Waters ACQUITY UPLC (Waters Corporation, Milford, MA)에서 수행하였다. 화합물 분리는 2개 이동 상의 구배에 의해 달성되었다: A (0.1% 포름산과 물) 및 B (0.1% 포름산과 아세토니트릴)로서, 0.3 내지 2.5분에서 60%로부터 100% B로 증가시키고, 0.1분 동안 100% B를 유지하고, 0.2분 동안 다시 균형을 이루게 한다. 유량은 0.6 mL/min이며, 칼럼 온도는 55℃로 설정되었다. 스테비올 또는 ent-카우레노산을 SIM (단일 이온 모니터링)을 이용하여 모니터링하고 실제 표준과 비교함으로써 정량화하였다.
표 1C: 스테비올 및 ent - 카우레노산에 대한 MS 분석 정보.
Figure pct00003
실시예 2. 스테비올 글리코시드-생성 및 RebB -생성 효모 균주의 작제
스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주는 WO 2011/153378, WO 2013/022989, WO 2014/122227, 및 WO 2014/122328에 기술된 바와 같이 작제하였다. 예를 들어, 사이네초콕커스 종 GGPPS (SEQ ID NO:49) 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 유전자, 절두된 제아 메이스(Zea mays) CDPS (SEQ ID NO:37) 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 유전자, A. 탈리아나 KS (SEQ ID NO:6) 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 유전자, S. 레바우디아나 KO (SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:79) 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 유전자, A. 탈리아나 ATR2 (SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:87) 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 유전자, O. 사티바 (O. sativa) EUGT11 (SEQ ID NO:86) 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 유전자, SrKAHe1 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:68) 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 유전자, S. 레바우디아나 CPR8 (SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28) 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 유전자, S. 레바우디아나 UGT85C2 (SEQ ID NO:30) 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 유전자, S. 레바우디아나 UGT74G1 (SEQ ID NO:29) 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 유전자, S. 레바우디아나 UGT76G1 (SEQ ID NO:2) 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 유전자, 및 S. 레바우디아나 UGT91D2 변이체인 UGT91D2e-b (SEQ ID NO:88), 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 유전자를 포함하는 효모 균주가 스테비올 글리코시드를 축적하였다.
UGT91D2 (PCT/US2012/050021로부터의 SEQ ID NO:5)의 UGT91D2e-b 변이체는 211번 위치에서 류신 대신 메티오닌으로의 치환 및 286번 위치에서 발린 대신 알라닌으로의 치환을 포함한다. 추가적인 변이체는 PCT/US2012/050021의 표 14 및 실시예 11에 기술된 변이체 (T144S, M152L, L213F, S364P, 및 G384C 변이체 제외)를 포함할 수 있다. GeneArt는 아미노산 변형 L211M 및 V286A를 갖는 S. 레바우디아나 UGT91D2e-b를 엔코딩하는 서열을 코돈-최적화시키고 (아미노산 서열에 있어서 SEQ ID NO:88; 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:89로 제시됨), 천연 효모 TDH3 프로모터로부터 발현시키고 천연 효모 CYC1 종결인자가 뒤따른다.
세포를 채취 전에 진탕시키면서 (딥 웰에서 400rpm 및 15mL Falcon 성장 튜브에서 200 rpm) 5일 동안 30℃에서 완전 합성 (SC) 배지에서 성장시켰다. LC-MS를 이용하여 총 글리코시드 수준의 검출을 위한 DMSO의 존재하에 배양 샘플 (세포 제거 없이)을 가열하였다. 균주는 총량 2500 mg/L 초과의 RebD, 총량 2500 mg/L 초과의 RebM, 및 총량 700 mg/L 초과의 RebA를 축적하였다. WO 2014/122227 참조.
RebB를 축적하기 위해 별도의 S. 세레비시애 균주를 작제하였다. 이러한 균주는 스테비올 글리코시드를 축적하는, 사이네초콕커스 종 GGPPS (SEQ ID NO:49) 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 유전자, 절두된 Z. 메이스 CDPS (SEQ ID NO:37) 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 유전자, A. 탈리아나 KS (SEQ ID NO:6) 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 유전자, S. 레바우디아나 KO (SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:79) 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 유전자, A. 탈리아나 ATR2 (SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:87) 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 유전자, O. 사티바 EUGT11 (SEQ ID NO:86) 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 유전자, SrKAHe1 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:68) 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 유전자, S. 레바우디아나 CPR8 (SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28) 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 유전자, S. 레바우디아나 UGT85C2 (SEQ ID NO:30) 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 유전자, S. 레바우디아나 UGT76G1 (SEQ ID NO:2) 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 유전자, 및 S. 레바우디아나 UGT91D2 변이체인 UGT91D2e-b (SEQ ID NO:88) 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 유전자를 포함하였다.
실시예 3. KO 유전자를 발현하는 효모 균주에서 스테비올 글리코시드 생산
증가된 수준의 ent-카우레노산이 스테비올 글리코시드 생성을 향상시키는지의 여부를 측정하기 위해, 다양한 종으로부터의 KO 유전자의 활성을 분석하였다. 추정 KO 유전자를 NCBI Basic Local Alignment Sequence Search Tool (BLAST)을 사용하여 확인하였다. KO 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자를 클로닝하고, KO 유전자가 결여되도록 변형된 실시예 2에 기술된 RebB-생성 S. 세레비시애 균주에서 발현시켰다. 따라서, RebB는 기능성 KO의 발현시에만 축적되었다.
SEQ ID NO:54 (SEQ ID NO:55에 제시된 뉴클레오티드 서열) 및 SEQ ID NO:75 (SEQ ID NO:56에 제시된 뉴클레오티드 서열)에 제시된 아미노산 서열에 의해 확인된 2개의 KO 폴리펩티드는 RebB-생성 균주에서 SrKO1 (SEQ ID NO:59에 제시된 뉴클레오티드 서열, SEQ ID NO:79에 제시된 아미노산 서열)보다 RebB를 더 높은 수준으로 축적하는 것으로 밝혀졌다. RebB 수준 (μM/OD600)은 도 3에 도시된다.
S. 세레비시애 스테비올 글리코시드-생성 균주에서 KO 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자 (SEQ ID NO:55 또는 SEQ ID NO:56)의 발현은 또한, ent-카우레노산의 축적을 유도하였다 (도 4). 코돈-최적화된 KO 폴리펩티드 (SEQ ID NO:57)를 엔코딩하는 유전자 및 SEQ ID NO:70에 제시된 KO 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자의 발현은 ent-카우레노산의 축적을 또한 유도하였다. 그러나, SrKO1 (SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:79)의 발현은 측정가능한 수준의 ent-카우레노산을 유도하지 않았다. 따라서, SEQ ID NO:55-57에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO 폴리펩티드는 SEQ ID NO:59에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 SrKO1 폴리펩티드와 비교하여, S. 세레비시애에서 ent-카우렌, ent-카우레놀, 및/또는 ent-카우레날을 ent-카우레노산으로 더욱 효율적으로 전환시켰다.
실시예 4. KO 유전자를 발현하고 SrKAHe1을 추가로 과다발현하는 효모 균주에서 스테비올 글리코시드 생성
클로닝된 KO 유전자를 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주에서 개별적으로 발현시켰다. SrKO1 (SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:79)을 발현하는 실시예 2에 기술된 S. 세레비시애 균주는 과다발현 SrKAHe1 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:68)을 포함하도록 변형시켰다. 평가된 KO 유전자의 코딩 서열은 물론 이들의 상응하는 아미노산 서열이 표 2에 제시된다. SEQ ID NO:55, 57, 58, 59, 및 60에 제시된 서열은 S. 세레비시애에서의 발현에 코돈-최적화되었다.
표 2: SrKAHe1을 추가로 과다발현하는 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비 시애 균주에서 발현된 KO 유전자.
Figure pct00004
표 2의 KO 효소를 엔코딩하는 임의의 이종성 핵산을 공동-발현하고, SrKAHe1 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:68)을 추가로 과다발현하는 S. 세레비시애 균주는 도 5에 도시된 바와 같이, 단지 SrKAHe1을 과다발현하는 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주 또는 대조군 S. 세레비시애 균주 (표 2의 KO를 발현하지 않음)보다 더 높은 수준으로 스테비올 글리코시드를 축적하였다. SEQ ID NO:65로서 본원에서 확인된 SEQ ID NO:56의 코돈-최적화된 버전을 발현하고, SrKAHe1을 과다발현하는 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주는 SEQ ID NO:56에 제시된 핵산 및 SrKAHe1을 공동-발현하는 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주보다 더 높은 수준으로 스테비올 글리코시드 (RebA, RebD, 및 RebM)을 축적하였다 (도 6).
추가적으로, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, 또는 SEQ ID NO:60에 제시된 핵산을 공동-발현하고 SrKAHe1을 추가로 과다발현하는 S. 세레비시애 균주는 표 2의 KO를 발현하지 않는 대조군 S. 세레비시애 균주보다 더 높은 수준으로 글리코실화된 ent-카우레노산을 축적하였다 (도 7).
또한, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, 또는 SEQ ID NO:60에 제시된 핵산을 공동-발현하고 SrKAHe1을 추가로 과다발현하는 S. 세레비시애 균주는 중간체 화합물 ent-카우레놀의 향상된 대사 전환을 입증하였으며, 이는 이어서 도 8에 도시된 바와 같이, 표 2의 KO를 발현하지 않는 대조군 S. 세레비시애 균주 또는 단지 SrKAHe1을 과다발현하는 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주와 비교하여, 글리코실화된 ent-카우레놀의 감소된 축적을 유도하였다. 대조군 S. 세레비시애 균주 및 단지 SrKAHe1을 과다발현하는 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주 각각은 SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, 또는 SEQ ID NO:60에 제시된 핵산을 발현하고 SrKAHe1을 추가로 과다발현하는 S. 세레비시애 균주가 축적하는 것보다 더 높은 수준으로 글리코실화된 ent-카우레놀을 축적하였다.
실시예 5. CPR 유전자를 발현하는 효모 균주에서 스테비올 글리코시드 생성
클로닝된 CPR 유전자는 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주에서 개별적으로 발현되었다. S. 레바우디아나 CPR8 (SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28) 및 A. 탈리아나 ATR2 (SEQ ID NO:51)를 발현하는 실시예 2에 기술된 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주를 표 3의 CPR을 엔코딩하는 핵산을 공동-발현하도록 변형시켰다. 평가된 CPR 유전자의 코딩 서열은 물론 이들의 상응하는 아미노산 서열이 표 3에 제시된다.
표 3: CPR8 및 ATR2와 조합되어 평가된 CPR 유전자.
Figure pct00005
도 9에 도시된 바와 같이, S. 레바우디아나 CPR8 (SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28) 및 A. 탈리아나 ATR2 (SEQ ID NO:51)를 이미 발현하는 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주에서 CPR1 (SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:76) 또는 CPR7 (SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:69)의 발현은 CPR1 또는 CPR7을 발현하지 않는 대조군 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주에 의해 축적된 것보다 더 높은 수준의 RebM을 발생시켰다. 또한, SEQ ID NO:62에 제시된 핵산을 발현하고 SrKAHe1 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:68)을 과다발현하는 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주는 단지 SrKAHe1을 과다발현하는 대조군 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주에 의해 축적된 것보다 더 높은 수준으로 RebM을 축적하였다 (도 10).
실시예 6. KO 및 CPR 유전자를 공동-발현하는 효모 균주에서 스테비올 글리코시드 생성
스테비올 글리코시드 생성을 표 4의 KO 유전자 및 표 5의 CPR을 공동-발현하도록 변형된 실시예 2에 기술된 RebB-생성 S. 세레비시애 균주에서 평가하였다.
표 4: CPR 유전자와 조합되어 평가된 KO 유전자.
Figure pct00006
표 5: KO 유전자와 조합되어 평가된 CPR 유전자.
Figure pct00007
도 12에 도시된 바와 같이, RebB-생성 균주에서 표 5의 CPR 유전자 중 어느 하나 및 SrKO1 (SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:79)의 공동-발현은 표 5의 사이토크롬 P450 유전자 중 어느 하나 및 SEQ ID NO:63 또는 SEQ ID NO:64에 제시된 핵산의 공동-발현보다 13-SMG 및 RebB의 더 높은 생성을 유도하였다.
실시예 7. KAH 유전자를 발현하는 효모 균주에서 스테비올 글리코시드 생성
후보물질 KAH 효소를 클로닝하고 13-SMG를 축적하도록 조작된 S. 세레비시애 균주에서 발현시켰다. 13-SMG-생성 S. 세레비시애 균주는 별도의 발현 카세트에 염색체로 통합된, 사이네초콕커스 종 GGPPS7 폴리펩티드 (SEQ ID NO:49)를 엔코딩하는 재조합 유전자, 절두된 Z. 메이스 CDPS 폴리펩티드 (SEQ ID NO:37)를 엔코딩하는 재조합 유전자, A. 탈리아나 KS 폴리펩티드 (SEQ ID NO:6)를 엔코딩하는 재조합 유전자, SrKO1 (SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:79), CPR8 (SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28), SEQ ID NO:56에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO (SEQ ID NO:75에 제시된 아미노산 서열), 및 UGT85C2 (SEQ ID NO:30)를 포함하였다 (도 11b). 균주는 SrKAHe1 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:68)이 결여되어 있다; 따라서, 13-SMG는 단지 기능성 KAH로의 S. 세레비시애 균주의 형질전환시에 축적되었다 (도 11b).
형질전환체를 4일 동안 SC-URA 배지에서 성장시키고, 10분 동안 80℃에서 DMSO를 사용하여 1:1로 추출하였다. 추출물을 LC-MS에 의해 분석하였다 (실시예 1의 방법 2). SEQ ID NO:80에 제시된 핵산으로 형질전환된 S. 세레비시애는 13-SMG를 축적하였다 (도 11b). 따라서, SEQ ID NO:82에 제시된, SEQ ID NO:80에 의해 엔코딩된 단백질은 KAH이다.
SEQ ID NO:80에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KAH는 효모에서의 발현을 위해 코돈-최적화되었으며 (SEQ ID NO:81) 상기 기술된 13-SMG-생성 S. 세레비시애 균주에서 발현되었다. SrKAHe1 (SEQ ID NO:18) 또는 SEQ ID NO:80에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KAH의 발현과 유사하게, SEQ ID NO:81에 제시된 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열의 발현은 13-SMG 플러스 루부소사이드의 생성을 유도하였다 (도 13).
SEQ ID NO:80에 제시된 뉴클레오티드 서열 및 SEQ ID NO:81에 제시된 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KAH는 또한, 실시예 2에 기술된 바와 같이, SrKAHe1을 발현하는 스테비올 글리코시드-생성 균주에서 개별적으로 발현되었다. 13-SMG의 생성은 SrKAHe1 (SEQ ID NO:18), SEQ ID NO:80에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KAH, 또는 SEQ ID NO:81에 제시된 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KAH의 과다발현시, SEQ ID NO:80에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KAH, SEQ ID NO:81에 제시된 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KAH를 발현하지 않거나, SrKAHe1을 과다발현하는 대조군 균주와 비교하여 증가되었다. 표 6 참조. SEQ ID NO:80에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KAH 또는 SEQ ID NO:81에 제시된 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KAH 중 어느 하나의 발현은 대조군 균주 또는 SrKAHe1(SEQ ID NO:18)을 과다발현하는 S. 세레비시애 균주 중 어느 하나보다 더 높은 스테비올 글리코시드 생성 (13-SMG + 1,2-바이오사이드 + 루부소사이드 + RebB + RebA + RebD + RebM)을 유도하였다. 표 6 참조.
표 6: KAH 유전자를 발현하는 효모에 의해 축적된 스테비올 글리코시드의 정량화.
Figure pct00008
실시예 8. CYP72A219 패밀리의 KAH 유전자를 발현하는 효모 균주에서 스테비 올 글리코시드 생성
S. 세레비시애에서의 발현을 위해 코돈-최적화되고 SEQ ID NO:91의 폴리펩티드를 엔코딩하는 SEQ ID NO:90의 핵산을 클로닝하고, 13-SMG를 축적하도록 조작된 실시예 7에 기술된 S. 세레비시애 균주에서 발현시켰다. 13-SMG-생성 S. 세레비시애 균주는 별도의 발현 카세트에 염색체로 통합된 사이네초콕커스 종 GGPPS7 폴리펩티드 (SEQ ID NO:49)를 엔코딩하는 재조합 유전자, 절두된 Z. 메이스 CDPS 폴리펩티드 (SEQ ID NO:37)를 엔코딩하는 재조합 유전자, A. 탈리아나 KS 폴리펩티드 (SEQ ID NO:6)를 엔코딩하는 재조합 유전자, SrKO1 (SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:79), CPR8 (SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28), SEQ ID NO:56에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO (SEQ ID NO:75에 제시된 아미노산 서열), 및 UGT85C2 (SEQ ID NO:30)를 포함하였다.
형질전환체를 4일 동안 SC-URA 배지에서 성장시키고, 10분 동안 80℃에서 DMSO를 사용하여 1:1 추출하였다. 추출물을 LC-MS에 의해 분석하였다 (실시예 1의 방법 2). SEQ ID NO:90에 제시된 핵산으로 형질전환된 S. 세레비시애는 13-SMG는 물론 루부소사이드를 축적하였다 (표 7). 따라서, SEQ ID NO:91에 제시된, SEQ ID NO:90의 핵산 서열에 의해 엔코딩된 단백질은 KAH이다.
표 7: SEQ ID NO:90에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KAH를 발현하는 효모에 의해 축적된 스테비올 글리코시드의 정량화 ( SEQ ID NO:91에 제시된 아미노산 서열).
Figure pct00009
실시예 9. CPR1 및 CPR12 활성의 측정
CPR1 및 CPR12의 활성을 시험관내 마이크로좀 검정을 이용하여 측정하였다. 문헌 [Pompon et al., "Yeast expression of animal and plant P450s in optimized redox environments," Methods Enzymol. 272:51-64 (1996)]에 교시된 방법의 변형된 버전에 의해 마이크로좀을 제조하였다. S. 세레비시애 세포를 4℃에서 10분 동안 침전시켰다. 펠렛을 10 mL TEK 완충제 (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 100 mM KCl)로 세척하였다. 세포를 4℃에서 10분 동안 다시 침전시키고, 펠렛을 1-3 mL의 TES2 완충제 (50 mM Tri-HCl (pH 7.5) 1 mM EDTA, 600 mM 소르비톨)에 재현탁시켰다. 유리 비드 (425-600 미크론)를 샘플에 첨가하고, 세포를 4℃에서 5분 동안 진탕 및 볼텍싱에 의해 강하게 파괴시켰다. 상청액을 수집하고, 비드를 TES2 완충제로 수차례 세척하였다. 세척물을 상청액과 합치고, 샘플을 4℃에서 15분 동안 원심분리하여 파괴되지 않은 세포 및 유리 비드를 제거하였다. 이어서, 샘플을 4℃에서 1시간 동안 초원심분리하였다. 펠렛을 TES 완충제 (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 600 mM 소르비톨, 1% (w/V) BSA, 5 mM DTT)로 2회, 및 TEG 완충제 (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 30% (V/V) 글리세롤)로 1회 세척하였다. 샘플을 1-3 mL TEG에 재현탁시키고, 펠렛을 균질화시켰다.
야생형 대조군 마이크로좀 단백질을 이종성 KAH 또는 CPR을 포함하지 않은 야생형 S. 세레비시애 세포로부터 상기 기술된 바와 같이 제조하였다. 마이크로좀 단백질을 또한, 염색체 수준에서 통합된 유전자 작제물로부터 i) SrKAHe1 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:68), ii) SrKAHe1 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:68)과 CPR1 (SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:76), 또는 iii) SrKAHe1 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:68)과 CPR12 (SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98)을 발현하는 S. 세레비시애 세포로부터 제조하였다. 스테비올 글리코시드-생성 균주로부터의 마이크로좀 단백질을 실시예 2에 기술된 유전자를 발현하고 S. 레바우디아나로부터의 코돈-최적화된 CPR1(아미노산 서열 SEQ ID NO:76에 상응하는 SEQ ID NO:61)은 물론 SEQ ID NO:75에 의해 엔코딩된 KO를 추가적으로 포함하는 S. 세레비시애 세포로부터 제조하였다.
CPR1 및 CPR12 활성은 시험관내에서 NADPH의 존재하에 사이토크롬 C를 환원시키는 CPR1 또는 CPR12의 능력을 측정하기 위해 사이토크롬 C 리덕타제 검정 키트 (Sigma-Aldrich; CY0100-1KT)를 사용하여 먼저 측정하였다. 사이토크롬 C의 환원은 550 nm에서 흡광도 증가를 유도하고, 이는 분광광도법적으로 정량화시킬 수 있다. 작업액은 20 mL 검정 완충제에 9 mg 사이토크롬 C를 첨가함으로써 제조하고, 사용때까지 용액을 25℃에서 저장하였다. NADPH를 H2O에서 0.85 mg/mL의 농도로 희석하였다. 최종 반응 용적은 1.1 mL였다 (950 μL 작업액 (0.43 mg 사이토크롬 C), 28 μL 효소 희석 완충제, 100 μL NADPH 용액 (0.085 mg NADPH), 20 μL 사이토크롬 C 옥시다제 억제제, 2 μL 마이크로좀 단백질). 블랭크 샘플은 마이크로좀 단백질을 포함하지 않았으며, 950 μL 작업액 (0.43 mg 사이토크롬 C), 30 μL 효소 희석 완충제, 100 μL NADPH 용액 (0.085 mg NADPH), 및 20 μL 사이토크롬 C 옥시다제 억제제로 제조하였다. 분광광도계를 NADPH를 제외하고는 반응에 첨가된 모든 구성요소로 블랭킹시켰다. NADPH의 첨가에 의해 효소 반응을 개시하고, 피펫팅에 의해 샘플을 완전히 혼합시키고, 판독 사이에 10초 간격을 두고 70초 동안 550nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 마이크로좀 제조물에 대해서 2회의 독립적인 비율 측정을 수행하였으며, 비율은 특정 활성의 계산을 위해 평균화하였다. 반응이 완료된 후, 결과는 표준 BCA 검정법 (Thermo Scientific)을 이용하여 측정된 단백질 농도로 표준화시켰다.
단위/mL를 하기 식을 이용하여 계산하였으며, 여기에서 ΔA550/min는 흡광도 판독 기간 동안 550nm에서의 흡광도 변화를 나타내며, 1.1은 반응 용적 (mL)을 나타내며, 21.1은 환원된 사이토크롬 C에 대한 흡광 계수를 나타낸다:
단위/mL = (ΔA550/min x 희석 배수 x 1.1) / (21.1 x 효소 용적)
각 샘플의 단위/mL 값은 이의 각 마이크로좀 단백질 농도에 의해 나누어 CPR 활성 (단위/mg)을 계산하였다. 도 14는 i) SrKAHe1 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:68), ii) SrKAHe1 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:68)과 CPR1 (SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:76), 및 iii) SrKAHe1 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:68)과 CPR12 (SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98) 마이크로좀 샘플의 활성 측정을 보여준다.
야생형 대조군으로부터의 마이크로좀 제조물은 단지 최소의 CPR 활성을 보여주었으며, 낮은 활성의 천연 NCP1 (YHR042W)을 반영한다. 마찬가지로, KAHe1을 과다발현하는 효모 균주로부터의 마이크로좀 제조물은 CPR 활성 증가를 입증하지 못하였다. 이에 반해, SrKAHe1 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:68) 및 CPR1 (SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:76) 또는 SrKAHe1 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:68) 및 CPR12 (SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98)를 발현하는 균주로부터의 마이크로좀 제조물은 음성 대조군과 비교하여 각각 7- 및 14-배 더 높은 활성의 높은 CPR 활성을 입증하였다 (도 14).
별도의 실험에서, 상기 제조된 바와 같이 마이크로좀에서 ent-카우레노산의 소모 및 스테비올의 형성을 측정하였다. 50 mM 인산염 완충제 (pH 7.5) 중의 33 μM ent-카우레노산, 10 mM NADPH, 및 10 μL의 마이크로좀 단백질을 100 μL의 총 반응 용적에서 30℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 모든 반응 구성요소의 첨가 직후 대조군 반응물을 추출하였으며, 이는 인큐베이션 전에 얼음 상에서 혼합하고 분취하였다. 스테비올 및 ent-카우레노산 수준을 실시예 1에 기술된 두 번째 LC-MS 절차를 이용하여 정량화하였다. 스테비올 정량화에 있어서, 마이크로좀 반응물을 DMSO (1:1)를 사용하여 80℃에서 10분 동안 추출하고, 원심분리 후 LC-MS 분석을 위해 제공하였다. ent-카우레노산 정량화에 있어서, 마이크로좀 반응물을 80℃에서 10분 동안 아세토니트릴 1:4 (20% 마이크로좀 반응물 및 80% 아세토니트릴)로 추출하고, 원심분리 후, LC-MS 분석을 위해 제공하였다. ent-카우레노산 측정에 있어서 수득된 AUC 값을 표준 곡선을 사용하여 농도로 전환시켰다.
도 15a에 나타낸 바와 같이, SrKAHe1 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:68) 및 CPR1 (SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:76) 또는 CPR12 (SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98)중 어느 하나를 발현하는 S. 세레비시애 균주로부터 제조된 마이크로좀 단백질은 30분 동안의 인큐베이션 기간 동안 ent-카우레노산을 스테비올로 전환시켰다. 스테비올-글리코시드-생성 균주 대조군 (30분의 인큐베이션 기간 없이 즉시 추출 됨)에 대한 도 15a에 도시된 스테비올 수준은 마이크로좀 제조 전에 균주에 의해 축적되고 마이크로좀과 공동-정제된 스테비올에 상응한다. 도 15b에 나타낸 바와 같이, SrKAHe1 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:68)을 단독으로 또는 CPR1 (SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:76) 또는 CPR12 (SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98)과 조합하여 발현시킨 S. 세레비시애 균주로부터 제조된 마이크로좀 단백질과 인큐베이션시 ent-카우레노산 수준이 감소하였다. 30분 동안 인큐베이션된 스테비올 글리코시드-생성 균주 마이크로좀 샘플에 대한 도 15b에서 도시된 증가된 ent-카우레노산 수준은 마이크로좀 제조 전 균주에 의해 축적된 ent-카우레노산 및 마이크로좀과 공동-정제된 ent-카우렌으로부터 축적된 ent-카우레노산에 상응한다. 도 15b에 도시된 ent-카우레노산의 수준은 사용된 희석 배율에 대해 수정되었다.
실시예 10. KO 및 P450 리덕타제 도메인 간의 융합 작제물을 포함하는 S. 세 레비시애 균주에서 스테비올 글리코시드 생성
CYP102A1 (P450BM3으로도 지칭됨; SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:116)은 바실러스 메가타륨 (Bacillus megatarium)으로부터의 촉매적으로 자급자족적인 가용성 효소이다. 예를 들어, 문헌 [Whitehouse et al., 2012, Chem Soc Rev. 41(3):1218-60] 참조. 2개의 도메인은 CYP102A1 폴리펩티드 사슬에 존재한다: P450 heme 도메인 (BMP) 및 NADPH-의존적 P450 옥시도리덕타제 도메인 (BMR). CYP102A1은 NADPH의 환원력을 거의 100% 사용하여 모노옥시겐화된 생성물을 생성한다. 예를 들어, 문헌 [Yuan et al., 2009, Biochemistry 48 (38) : 9140-6] 참조.
CYP102A1의 BMR 도메인 ("BMR"; SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:118에 제시된 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열)을 문헌 [Dodhia et al., 2006, J Biol Inorg Chem. 11(7):903-16]에 기술된 바와 같이 링커 (SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:122)를 사용하여 SEQ ID NO:65에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO (SEQ ID NO:75에 제시된 아미노산 서열) 또는 SrKO1 (SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:79)에 융합시켰다. CYP102A1의 BMR 도메인의 야생형 버젼은 물론, NADPH로부터 NADH로의 CYP102A1의 보조인자 특이성을 교체하는 것으로 밝혀진 BMR 도메인의 W1046A 돌연변이체 (SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120)를 사용하였다. 문헌 [Girvan et al., 2011, Arch Biochem Biophys. 507(1):75-85] 참조. SEQ ID NO:65에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의핸 엔코딩된 KO 및 SrKO1 (SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:79)은 또한 CYP102A1의 BMR 도메인과의 융합 전에 절두되었다; 이러한 절두는 생물정보학에 의해 예측되어 KO 유전자의 막 앵커의 손실을 유도하고 KO-BMR 융합 작제물의 시토졸 버젼을 유도하였다. 분석된 KO-BMR 융합 작제물은 표 8에 나타내었다.
표 8: KO- BMR 융합 작제물 및 서열
Figure pct00010
KO-BMR 융합 작제물을 클로닝하고, 임의의 추가의 KO 유전자를 함유하지 않도록 변형된 실시예 2에 기재된 RebB-생성 균주에서 형질전환시켰다. 따라서, 13-SMG, 1,2-바이오사이드, 및 RebB를 포함하는 스테비올 글리코시드는 기능성 KO의 발현시에만 단지 축적되었다. 각 형질전환 플레이트로부터의 3 조각 (1 μL 루프의 세포)을 200 μl 나노퓨어 H2O에 재현탁시켰다. 이어서, 70 μL를 96 딥 웰 플레이트 중의 1 mL SC-URA로 옮기고 400rpm에서 5일 동안 30℃에서 인큐베이션하였다. 생물학적 트리플리케이트를 LC-MS (실시예 1의 방법 2)에 의해 분석하여 13-SMG, 1,2-바이오사이드, 및 RebB 수준을 측정하고, 단일 샘플을 LC-UV에 의해 분석하여 ent-카우렌 및 ent-카우레노산 수준을 측정하였다.
LC-MS의 경우, 50 μL 샘플을 50 μL 100% DMSO와 혼합하고 10분 동안 80℃로 가열하였다. 후속하여, 샘플을 4000 RCF에서 10분 동안 회전 침전시키고, 생성된 상청액 85 μL를 LC-MS 플레이트로 옮겼다. LC-MS 결과는 Wallac, 2104 EnVision (Perkin Elmer) 플레이트 판독기로 측정한 개별 배양액의 OD600으로 표준화하였다.
LC-UV는 가변 파장 검출기 (VWD), 온도조절 칼럼 구획 (thermostatted column compartment :TCC), 오토샘플러, 오토샘플러 냉각 장치 및 바이너리 펌프가 포함된 Agilent 1290 장비로 SB-C18 고속 분해능 고화질 (RRHD) 2.1 mm x 300 mm, 1.8 μm 분석 칼럼 (일련의 150 mm 칼럼 2 개, 칼럼 온도 65℃)을 사용하여 수행하였다. 스테비올 글리코시드 및 스테비올 글리코시드 전구체를 역상 C18 칼럼에 의해 분리한 후 210 mm에서 UV 흡광도로 검출하였다. 각 분석물의 피크 면적을 RebA 표준과 비교하고 상이한 몰 흡수율을 갖는 화학종에 대한 보정 계수를 적용하여 스테비올 글리코시드의 정량화를 수행하였다. 각 분석물의 피크 면적을 카우레노산 표준과 비교하고 상이한 몰 흡수율을 갖는 화학종에 대한 보정 계수를 적용하여 스테비올 글리코시드 전구체 (예컨대, 카우레노산, 카우레날, 카우레놀, ent-카우렌, 및 게라닐게라니올)의 정량화를 수행하였다. LC-UV의 경우, 0.5 mL 배양액을 회전 침전시키고, 상청액을 제거하고 펠렛의 습식 중량을 계산하였다. LC-UV 결과는 펠렛 습윤 중량으로 표준화하였다.
도 16b 및 16d에 도시된 바와 같이, 빈 플라스미드로 형질전환된 S. 세레비시애 균주는 ent-카우렌을 축적하였다. SrKO1 (SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:79)를 포함하는 플라스미드 또는 SEQ ID NO:65에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 KO 유전자를 포함하는 플라스미드로의 형질전환은 13-SMG, 1,2-바이오사이드, 및 RebB의 축적을 유도하였다 (도 16a 및 16c).
전장 SrKO1-BMR 융합 작제물 (야생형 또는 W1046A 돌연변이체 BMR; SEQ ID NO:99-102)의 발현은 SrKO1 (SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:79)의 발현과 비교하여, ent-카우레노산, 13-SMG, 및 RebB의 증가를 유도하였다. 도 16a 및 16b 참조. 절두된 SrKO1-BMR 융합 작제물 (야생형 또는 W1046A 돌연변이체 BMR; SEQ ID NO:103-106)의 발현은 SrKO1 (SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:79)의 발현과 비교하여, ent-카우레노산의 증가를 유도하였다 (도 16b). 절두된 SrKO1-BMR 융합 작제물이 또한 스테비올 글리코시드 생성을 증가시켰지만, 글리코실화 활성은 절두된 SrKO1-BMR 융합 작제물보다 전장 SrKO1-BMR 융합 작제물에 대해 더 높았다 (도 16a).
SEQ ID NO:65에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO 및 야생형 BMR (SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:108)을 포함하는 융합 작제물의 발현은 SEQ ID NO:65에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO와 비교하여, ent-카우레노산의 13-SMG로의 더 큰 전환을 유도하였다 (도 16c). SEQ ID NO:65에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO 및 W1046A 돌연변이체 BMR (SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110)을 포함하는 융합 작제물의 발현은 SEQ ID NO:65에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO와 비교하여, 감소된 ent-카우레노산 수준 그러나, 유사한 글리코실화 활성을 유도하였다 (도 16c).
실시예 11. ICE2를 포함하는 S. 세레비시애 균주에서 스테비올 글리코시드 경로의 평가
ICE2는 ER 아연 항상성 및 사이토크롬 P450 안정성 및/또는 활성과 같은 메카니즘에 관여하는 소포질 그물 (ER) 막 단백질이다. 예를 들어, 문헌 [Estrada de Martin et al., 2005, J Cell Sci. 118(Pt 1):65-77 and Emmerstorfer et al., 2015, Biotechnol J. 10(4):623-35] 참조. ICE2 (SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:114)를 클로닝하고, 사이네초콕커스 종 GGPPS 폴리펩티드 (SEQ ID NO:49)를 엔코딩하는 재조합 유전자, 절두된 Z. 메이스 CDPS 폴리펩티드 (SEQ ID NO:37)를 엔코딩하는 재조합 유전자, A. 탈리아나 KS 폴리펩티드 (SEQ ID NO:6)를 엔코딩하는 재조합 유전자, 재조합 S. 레바우디아나 KO 폴리펩티드 (SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:79)를 엔코딩하는 재조합 유전자, A. 탈리아나 ATR2 폴리펩티드 (SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:87)를 엔코딩하는 재조합 유전자, SrKAHe1 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:68) 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 유전자, S. 레바우디아나 CPR8 폴리펩티드 (SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28) 를 엔코딩하는 재조합 유전자, SEQ ID NO:81에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 재조합 KAH (SEQ ID NO:82에 제시된 아미노산 서열에 상응), SEQ ID NO:56에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 재조합 KO 유전자 (SEQ ID NO:75에 제시된 아미노산 서열에 상응), SEQ ID NO:65에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 재조합 KO 유전자 (SEQ ID NO:75에 제시된 아미노산 서열에 상응), UGT76G1 (SEQ ID NO:83) 폴리펩티드를 엔코딩된 재조합 유전자, S. 레바우디아나 UGT85C2 폴리펩티드 (SEQ ID NO:30)를 엔코딩하는 재조합 유전자, S. 레바우디아나 UGT74G1 폴리펩티드 (SEQ ID NO:29)를 엔코딩하는 재조합 유전자, EUGT11 (SEQ ID NO:86) 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 유전자, UGT91D2e (SEQ ID NO:84) 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 유전자, 및 CPR1 (SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:76) 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 유전자를 포함하는 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주에서 과다발현시켰다. 과다발현은 USER 클로닝 시스템을 사용하여 통합에 의해 수행하였다; 예를 들어, 문헌 [Nour-Eldin et al., 2010, Methods Mol Biol. 643:185-200] 참조. 표 9는 상기 기술된 균주에서 발현된 추가적인 재조합 유전자 (ICE2 및/또는 CPR12)를 보여준다. 대조군 균주는 ICE2 (SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:114) 또는 CPR12 (SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98) 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 유전자를 포함하지 않았다.
표 9: ICE2 스테비올 글리코시드-생성 균주.
Figure pct00011
유가(Fed-batch) 발효를 글루코스, 암모늄 설페이트, 트레이스 금속, 비타민, 염 및 완충제를 포함하는 최소 배지에서 대략 16시간의 성장 기 이어서 글루코스-포함하는 규정된 공급 배지를 이용한 대략 110시간의 공급 기를 이용하여 30℃에서의 2L 발효기에서 호기성하에 수행하였다. 6.0 부근의 pH 및 글루코스-제한 조건을 유지하였다. 전체 배양 샘플 (세포 제거 없이)을 실시예 10의 LC-UV 방법에 의해 분석하여 스테비올 글리코시드 및 스테비올 경로 중간체의 수준을 측정하였다.
하기 값은 스테비올 글리코시드 및 스테비올 글리코시드 전구체의 측정된 수준을 기반으로 하여 계산하였다. "총 플럭스(Total-Flux)"는 측정된 RebA, RebB, RebD, RebE, RebM, 13-SMG, 루부소사이드, 스테비올-1,2-바이오사이드, 디-글리코실화된 스테비올, 트리-글리코실화된 스테비올, 테트라-글리코실화된 스테비올, 펜타-글리코실화된 스테비올, 헥사-글리코실화된 스테비올, 헵타-글리코실화된 스테비올, 코팔롤, ent-카우레노산, 글리코실화된 ent-카우레노산, 글리코실화된 ent-카우레놀, ent-카우레날, 게라닐게라니올, ent-카우레날, 및 ent-카우렌 수준의 합 (g/L RebD 당량)으로서 계산하였다. "프리(pre)-스테비올 글리코시드/플럭스"를 (("총 플럭스" - (게라닐게라니올 + 코팔롤 + ent-카우렌 + 글리코실화된 ent-카우레놀 + ent-카우레놀 + ent-카우레날 + ent-카우레노산 + 글리코실화된 ent-카우레노산)/ "총 플럭스")로서 계산하였다. "KAH 단계/플럭스"를 ((ent-카우레노산 + 글리코실화된 ent-카우레노산) /“총 플럭스”)로서 계산하였다. "KO 단계/플럭스"는 ((ent-카우렌 + 글리코실화된 ent-카우레놀 + ent-카우레놀 + ent-카우레날) / “총 플럭스”)로서 계산하였다.
프리-스테비올 글리코시드/플럭스, KO 단계/플럭스, 및 KAH 단계/플럭스 값을 하기 표 10에 나타내었다. 감소된 양의 ent-카우렌, ent-카우레놀, ent-카우레날, 글리코실화된 ent-카우레놀 및 증가된 양의 ent-카우레노산 및 글리코실화된 ent-카우레노산을 대조군 스테비올 글리코시드-생성 균주와 비교하여 ICE2 포함 균주에서 관찰하였다. 이러한 효과는 CPR1 및/또는 CPR12의 존재하에 더욱 강하였다 (표 10). ICE2 (ICE2 균주 B)의 2개의 복사체의 과다발현은 대조군 균주, ICE2 균주 A, 또는 ICE2 균주 C와 비교하여, 감소된 ent-카우렌, ent-카우레놀, ent-카우레날, 및 ent-카우레놀 글리코시드 수준 및 증가된 스테비올 글리코시드 수준을 발생시켰다 (표 10). 스테비올 글리코시드 수준은 ICE2의 2개 복사체를 포함하는 대부분의 스테비올 글리코시드-생성 균주에서 증가되었다. 따라서, ICE2는 사이토크롬 P450 기능을 향상시키는 것으로 밝혀졌다.
표 10: ICE2를 포함하는 스테비올 글리코시드-생성 균주에 대한 프리 -스테비올 글리코시드/플럭스, KO 단계/플럭스, 및 KAH 단계/플럭스 값
Figure pct00012
실시예 12. CPR1 및 CPR12를 포함하는 S. 세레비시애 균주의 발효에 의한 스테비올 글리코시드 생성
균주에 유전체로 통합된, 사이네초콕커스 종 GGPPS 폴리펩티드 (SEQ ID NO:49)를 엔코딩하는 재조합 유전자, 절두된 Z. 메이스 CDPS 폴리펩티드 (SEQ ID NO:37)를 엔코딩하는 재조합 유전자, A. 탈리아나 KS 폴리펩티드 (SEQ ID NO:6)를 엔코딩하는 재조합 유전자, 재조합 S. 레바우디아나 KO 폴리펩티드 (SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:79)를 엔코딩하는 재조합 유전자, A. 탈리아나 ATR2 폴리펩티드 (SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:87)를 엔코딩하는 재조합 유전자, SrKAHe1 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:68) 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 유전자, S. 레바우디아나 CPR8 폴리펩티드 (SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:28)를 엔코딩하는 재조합 유전자, CPR1 (SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:76) 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 유전자, SrKAHe1 (SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:68) 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 유전자, SEQ ID NO:56에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 재조합 KO 유전자 (SEQ ID NO:75에 제시된 아미노산 서열에 상응), UGT76G1 (SEQ ID NO:83) 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 유전자, S. 레바우디아나 UGT85C2 (SEQ ID NO:30) 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 유전자, S. 레바우디아나 UGT74G1 (SEQ ID NO:29) 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 유전자, UGT91D2e-b 폴리펩티드 (SEQ ID NO:88)를 엔코딩하는 재조합 유전자, 및 EUGT11 (SEQ ID NO:86) 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 유전자는 물론, 표 11에 나타낸 재조합 유전자를 포함하는 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주를 발효에 의해 배양하였다. 스테비올 글리코시드 및 스테비올 글리코시드 전구체의 수준은 실시예 11에 기술된 바와 같이 LC-UV에 의해 측정하였다. 프리-KO/플럭스, 프리-KAH/플럭스, 프리-스테비올 글리코시드/플럭스 값을 실시예 11에 기술된 바와 같이 계산하였다.
표 11: 실시예 12에서 스테비올 글리코시드-생성 S. 세레비시애 균주에서 또한 발현된 재조합 유전자.
Figure pct00013
프리-스테비올 글리코시드/플럭스, KO 단계/플럭스, 및 KAH 단계/플럭스 값을 하기 표 12에 나타내었다. SEQ ID NO:56에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO를 포함하는 균주 (균주 A)에서, ent-카우렌, ent-카우레놀, ent-카우르날, 및 ent-카우레놀 글리코시드의 더 낮은 축적이 발생하였다. 대조군 균주와 비교하여 더 높은 수준의 ent-카우레노산 및 스테비올 글리코시드가 또한, 측정되었다. SEQ ID NO:80에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KAH, SEQ ID NO:56에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO (SEQ ID NO:75에 제시된 아미노산 서열에 상응), 및 SEQ ID NO:65에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO를 포함하는 균주 (균주 B)에서, 대조군 균주와 비교하여, ent-카우렌, ent-카우레놀, ent-카우레날, ent-카우레놀 글리코시드 및 ent-카우레노산 축적은 감소하였으며, 스테비올 글리코시드의 축적은 증가하였다. CPR12 (SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98), SEQ ID NO:80에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KAH, 및 SEQ ID NO:56에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 KO를 포함하는 균주 (균주 C)에서, 대조군과 비교하여, ent-카우레놀, ent-카우레날, ent-카우레놀 글리코시드, 및 ent-카우레노산 축적이 감소하였으며, 스테비올 글리코시드의 축적은 증가하였다. 표 12 참조. 따라서, CPR12는 KAH 및/또는 KO 활성을 향상시키는 리덕타제 단백질인 것으로 밝혀졌다.
표 12. 실시예 12의 스테비올 글리코시드-생성 균주에 있어서 프리 -스테비올 글리코시드/플럭스, KO 단계/플럭스, 및 KAH 단계/플럭스 값
Figure pct00014
상세하게 기재된 본 발명 및 이의 특수한 구체예를 참조하여, 변형 및 변경이 첨부된 청구범위에 정의된 본 발명의 범위를 벗어나지 않으며 가능함이 자명할 것이다. 보다 특히, 비록 본 발명의 일부 양태가 본원에서 특히 바람직한 것으로 확인되나, 본 발명은 본 발명의 이러한 특정 양태로 반드시 제한되지 않는 것으로 고려된다.
표 13. 본원에 기재된 서열
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SEQUENCE LISTING <110> EVOLVA SA <120> PRODUCTION OF STEVIOL GLYCOSIDES IN RECOMBINANT HOSTS <130> 14-830-WO <150> US 62/048,178 <151> 2014-09-09 <150> US 62/103,547 <151> 2015-01-14 <150> US 61/117,396 <151> 2015-02-17 <150> US 62/148,585 <151> 2015-04-16 <160> 122 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 784 <212> PRT <213> Stevia rebaudiana <400> 1 Met Asn Leu Ser Leu Cys Ile Ala Ser Pro Leu Leu Thr Lys Ser Asn 1 5 10 15 Arg Pro Ala Ala Leu Ser Ala Ile His Thr Ala Ser Thr Ser His Gly 20 25 30 Gly Gln Thr Asn Pro Thr Asn Leu Ile Ile Asp Thr Thr Lys Glu Arg 35 40 45 Ile Gln Lys Gln Phe Lys Asn Val Glu Ile Ser Val Ser Ser Tyr Asp 50 55 60 Thr Ala Trp Val Ala Met Val Pro Ser Pro Asn Ser Pro Lys Ser Pro 65 70 75 80 Cys Phe Pro Glu Cys Leu Asn Trp Leu Ile Asn Asn Gln Leu Asn Asp 85 90 95 Gly Ser Trp Gly Leu Val Asn His Thr His Asn His Asn His Pro Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Ser Leu Ser Ser Thr Leu Ala Cys Ile Val Ala Leu Lys 115 120 125 Arg Trp Asn Val Gly Glu Asp Gln Ile Asn Lys Gly Leu 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ataaccatga 360 ccatcaatct cttaagaagg atgtgttatc atctacactg gctagtatcc tcgcgttaaa 420 gaagtgggga attggtgaaa gacaaataaa caagggtctc cagtttattg agctgaattc 480 tgcattagtc actgatgaaa ccatacagaa accaacaggg tttgatatta tatttcctgg 540 gatgattaaa tatgctagag atttgaatct gacgattcca ttgggctcag aagtggtgga 600 tgacatgata cgaaaaagag atctggatct taaatgtgat agtgaaaagt tttcaaaggg 660 aagagaagca tatctggcct atgttttaga ggggacaaga aacctaaaag attgggattt 720 gatagtcaaa tatcaaagga aaaatgggtc actgtttgat tctccagcca caacagcagc 780 tgcttttact cagtttggga atgatggttg tctccgttat ctctgttctc tccttcagaa 840 attcgaggct gcagttcctt cagtttatcc atttgatcaa tatgcacgcc ttagtataat 900 tgtcactctt gaaagcttag gaattgatag agatttcaaa accgaaatca aaagcatatt 960 ggatgaaacc tatagatatt ggcttcgtgg ggatgaagaa atatgtttgg acttggccac 1020 ttgtgctttg gctttccgat tattgcttgc tcatggctat gatgtgtctt acgatccgct 1080 aaaaccattt gcagaagaat ctggtttctc tgatactttg gaaggatatg ttaagaatac 1140 gttttctgtg ttagaattat ttaaggctgc tcaaagttat ccacatgaat cagctttgaa 1200 gaagcagtgt tgttggacta aacaatatct ggagatggaa ttgtccagct gggttaagac 1260 ctctgttcga gataaatacc tcaagaaaga ggtcgaggat gctcttgctt ttccctccta 1320 tgcaagccta gaaagatcag atcacaggag aaaaatactc aatggttctg ctgtggaaaa 1380 caccagagtt acaaaaacct catatcgttt gcacaatatt tgcacctctg atatcctgaa 1440 gttagctgtg gatgacttca atttctgcca gtccatacac cgtgaagaaa tggaacgtct 1500 tgataggtgg attgtggaga atagattgca ggaactgaaa tttgccagac agaagctggc 1560 ttactgttat ttctctgggg ctgcaacttt attttctcca gaactatctg atgctcgtat 1620 atcgtgggcc aaaggtggag tacttacaac ggttgtagac gacttctttg atgttggagg 1680 gtccaaagaa gaactggaaa acctcataca cttggtcgaa aagtgggatt tgaacggtgt 1740 tcctgagtac agctcagaac atgttgagat catattctca gttctaaggg acaccattct 1800 cgaaacagga gacaaagcat tcacctatca aggacgcaat gtgacacacc acattgtgaa 1860 aatttggttg gatctgctca agtctatgtt gagagaagcc gagtggtcca gtgacaagtc 1920 aacaccaagc ttggaggatt acatggaaaa tgcgtacata tcatttgcat taggaccaat 1980 tgtcctccca gctacctatc tgatcggacc tccacttcca gagaagacag tcgatagcca 2040 ccaatataat cagctctaca agctcgtgag cactatgggt cgtcttctaa atgacataca 2100 aggttttaag agagaaagcg cggaagggaa gctgaatgcg gtttcattgc acatgaaaca 2160 cgagagagac aatcgcagca aagaagtgat catagaatcg atgaaaggtt tagcagagag 2220 aaagagggaa gaattgcata agctagtttt ggaggagaaa ggaagtgtgg ttccaaggga 2280 atgcaaagaa gcgttcttga aaatgagcaa agtgttgaac ttattttaca ggaaggacga 2340 tggattcaca tcaaatgatc tgatgagtct tgttaaatca gtgatctacg agcctgttag 2400 cttacagaaa gaatctttaa cttgatccaa gttgatctgg caggtaaact cagtaaatga 2460 aaataagact ttggtcttct tctttgttgc ttcagaacaa gaagag 2506 <210> 6 <211> 785 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 6 Met Ser Ile Asn Leu Arg Ser Ser Gly Cys Ser Ser Pro Ile Ser Ala 1 5 10 15 Thr Leu Glu Arg Gly Leu Asp Ser Glu Val Gln Thr Arg Ala Asn Asn 20 25 30 Val Ser Phe Glu Gln Thr Lys Glu Lys Ile Arg Lys Met Leu Glu Lys 35 40 45 Val Glu Leu Ser Val Ser Ala Tyr Asp Thr Ser Trp Val Ala Met Val 50 55 60 Pro Ser Pro Ser Ser Gln Asn Ala Pro Leu Phe Pro Gln Cys Val Lys 65 70 75 80 Trp Leu Leu Asp 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<213> Thalassiosira pseudonana <400> 46 Met Ala Arg Phe Tyr Phe Leu Asn Ala Leu Leu Met Val Ile Ser Leu 1 5 10 15 Gln Ser Thr Thr Ala Phe Thr Pro Ala Lys Leu Ala Tyr Pro Thr Thr 20 25 30 Thr Thr Ala Leu Asn Val Ala Ser Ala Glu Thr Ser Phe Ser Leu Asp 35 40 45 Glu Tyr Leu Ala Ser Lys Ile Gly Pro Ile Glu Ser Ala Leu Glu Ala 50 55 60 Ser Val Lys Ser Arg Ile Pro Gln Thr Asp Lys Ile Cys Glu Ser Met 65 70 75 80 Ala Tyr Ser Leu Met Ala Gly Gly Lys Arg Ile Arg Pro Val Leu Cys 85 90 95 Ile Ala Ala Cys Glu Met Phe Gly Gly Ser Gln Asp Val Ala Met Pro 100 105 110 Thr Ala Val Ala Leu Glu Met Ile His Thr Met Ser Leu Ile His Asp 115 120 125 Asp Leu Pro Ser Met Asp Asn Asp Asp Leu Arg Arg Gly Lys Pro Thr 130 135 140 Asn His Val Val Phe Gly Glu Asp Val Ala Ile Leu Ala Gly Asp Ser 145 150 155 160 Leu Leu Ser Thr Ser Phe Glu His Val Ala Arg Glu Thr Lys Gly Val 165 170 175 Ser Ala Glu Lys Ile Val Asp Val Ile Ala Arg Leu Gly Lys Ser Val 180 185 190 Gly Ala Glu Gly Leu Ala Gly Gly Gln Val Met Asp Leu Glu 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cttctgaagt cgatgaaaag gacttccttg aaatcgcaag aggcttagtc 900 gatagtaagc agtcattcct ttgggtcgtg cgtccaggtt tcgtgaaagg ctcaacatgg 960 gtcgaaccac ttccagatgg ttttctaggc gaaagaggta gaatagtcaa atgggttcct 1020 caacaggaag ttttagctca tggcgctatt ggggcattct ggactcattc cggatggaat 1080 tcaactttag aatcagtatg cgaaggggta cctatgatct tttcagattt tggtcttgat 1140 caaccactga acgcaagata catgtctgat gttttgaaag tgggtgtata tctagaaaat 1200 ggctgggaaa ggggtgaaat agctaatgca ataagacgtg ttatggttga tgaagagggg 1260 gagtatatca gacaaaacgc aagagtgctg aagcaaaagg ccgacgtttc tctaatgaag 1320 ggaggctctt catacgaatc cttagaatct cttgtttcct acatttcatc actgtaa 1377 <210> 54 <211> 512 <212> PRT <213> Lactuca sativa <400> 54 Met Asp Gly Val Ile Asp Met Gln Thr Ile Pro Leu Arg Thr Ala Ile 1 5 10 15 Ala Ile Gly Gly Thr Ala Val Ala Leu Val Val Ala Leu Tyr Phe Trp 20 25 30 Phe Leu Arg Ser Tyr Ala Ser Pro Ser His His Ser Asn His Leu Pro 35 40 45 Pro Val Pro Glu Val Pro Gly Val Pro Val Leu Gly Asn Leu Leu Gln 50 55 60 Leu Lys Glu Lys Lys Pro 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ctccgatata tggaaacttc taagtgaagg tgcctatctt 1980 tatgtctgtg gcgatgcaaa gggcatggcc aaggatgtcc atagaactct gcatacaatt 2040 gttcaggaac aagggagtct ggattcttcc aaggctgaat tgtacgtcaa aaacttacag 2100 atgtctggaa gatacttaag agatgtttgg taa 2133 <210> 62 <211> 2106 <212> DNA <213> Siraitia grosvenorii <400> 62 atgaaggtca gtccattcga attcatgtcc gctattatca agggtagaat ggacccatct 60 aactcctcat ttgaatctac tggtgaagtt gcctccgtta tctttgaaaa cagagaattg 120 gttgccatct tgaccacttc tattgctgtt atgattggtt gcttcgttgt cttgatgtgg 180 agaagagctg gttctagaaa ggttaagaat gtcgaattgc caaagccatt gattgtccat 240 gaaccagaac ctgaagttga agatggtaag aagaaggttt ccatcttctt cggtactcaa 300 actggtactg ctgaaggttt tgctaaggct ttggctgatg aagctaaagc tagatacgaa 360 aaggctacct tcagagttgt tgatttggat gattatgctg ccgatgatga ccaatacgaa 420 gaaaaattga agaacgaatc cttcgccgtt ttcttgttgg ctacttatgg tgatggtgaa 480 cctactgata atgctgctag attttacaag tggttcgccg aaggtaaaga aagaggtgaa 540 tggttgcaaa acttgcacta tgctgttttt ggtttgggta acagacaata cgaacacttc 600 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cactaccaga aggagttgaa 1260 gtccgcttac caacactgct cattcaccat gacaaggaac tgtggggtga tgatgcaaac 1320 cagttcaatc cagagaggtt ttcggaagga gtttccaaag caacaaagaa ccgactctca 1380 ttcttcccct tcggagccgg tccacgcatt tgcattggac agaacttttc tatgatggaa 1440 gcaaagttgg ccttagcatt gatcttgcaa cacttcacct ttgagctttc tccatctcat 1500 gcacatgctc cttcccatcg tataaccctt caaccacagt atggtgttcg tatcatttta 1560 catcgacgtt ag 1572 <210> 81 <211> 1572 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon-optimized KAH <400> 81 atggaagtca ctgtcgcctc ttctgtcgct ttatccttag tcttcatttc cattgtcgtc 60 agatgggctt ggtccgttgt caactgggtt tggttcaaac caaagaagtt ggaaagattc 120 ttgagagagc aaggtttgaa gggtaattct tatagattct tgtacggtga catgaaggaa 180 aattctattt tgttgaagca agccagatcc aaaccaatga acttgtctac ctctcatgat 240 attgctccac aagttactcc attcgtcgat caaactgtta aagcctacgg taagaactct 300 ttcaattggg ttggtccaat tcctagagtt aacatcatga acccagaaga tttgaaggat 360 gtcttgacca agaacgttga cttcgttaag ccaatttcca acccattgat taaattgttg 420 gctactggta ttgccattta cgaaggtgaa aagtggacta agcatagaag aatcatcaac 480 cctaccttcc actctgaaag attgaagaga atgttaccat ctttccatca atcctgtaat 540 gaaatggtta aggaatggga atccttggtt tctaaagaag gttcttcttg cgaattggat 600 gtttggccat tcttggaaaa tatgtctgct gatgtcattt ccagaaccgc tttcggtacc 660 tcctacaaga agggtcaaaa gattttcgaa ttgttgagag agcaagttat ttacgttacc 720 aagggtttcc aatccttcta catcccaggt tggagattct tgccaactaa aatgaacaag 780 cgtatgaacg agatcaacga agaaattaaa ggtttgatca gaggtattat tatcgacaga 840 gaacaaatta ttaaagctgg tgaagaaacc aacgatgatt tgttgggtgc tttgatggag 900 tccaacttga aggatattag agaacatggt aagaacaaca agaatgttgg tatgtctatt 960 gaagatgtta ttcaagaatg taagttattc tacttcgctg gtcaagagac cacttctgtt 1020 ttgttagcct ggactatggt cttgttaggt caaaaccaaa attggcaaga tagagctaga 1080 caagaagttt tgcaagtctt cggttcttcc aagccagact ttgatggttt ggcccacttg 1140 aaggttgtta ctatgatttt gttagaagtt ttgagattgt acccaccagt cattgagtta 1200 atcagaacca ttcataaaaa gactcaattg ggtaaattat ctttgccaga aggtgttgaa 1260 gtcagattac caaccttgtt gattcaccac gataaggaat tatggggtga cgacgctaat 1320 caatttaatc cagaaagatt ttccgaaggt gtttccaagg ctaccaaaaa ccgtttgtcc 1380 ttcttcccat ttggtgctgg tccacgtatt tgtatcggtc aaaacttttc catgatggaa 1440 gccaagttgg ctttggcttt aatcttgcaa cacttcactt tcgaattgtc tccatcccat 1500 gcccacgctc cttctcatag aatcacttta caaccacaat acggtgtcag aatcatctta 1560 cacagaagat aa 1572 <210> 82 <211> 523 <212> PRT <213> Rubus suavissimus <400> 82 Met Glu Val Thr Val Ala Ser Ser Val Ala Leu Ser Leu Val Phe Ile 1 5 10 15 Ser Ile Val Val Arg Trp Ala Trp Ser Val Val Asn Trp Val Trp Phe 20 25 30 Lys Pro Lys Lys Leu Glu Arg Phe Leu Arg Glu Gln Gly Leu Lys Gly 35 40 45 Asn Ser Tyr Arg Phe Leu Tyr Gly Asp Met Lys Glu Asn Ser Ile Leu 50 55 60 Leu Lys Gln Ala Arg Ser Lys Pro Met Asn Leu Ser Thr Ser His Asp 65 70 75 80 Ile Ala Pro Gln Val Thr Pro Phe Val Asp Gln Thr Val Lys Ala Tyr 85 90 95 Gly Lys Asn Ser Phe Asn Trp Val Gly Pro Ile Pro Arg Val Asn Ile 100 105 110 Met Asn Pro Glu Asp Leu Lys Asp Val Leu Thr Lys Asn Val Asp Phe 115 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agaactgtta actccaacgg taagaactct 300 tttgtttgga tgggtccaat tccaagagtc catattatga accctgaaga tttgaaggac 360 gctttcaaca gacatgatga tttccataag accgtcaaga acccaattat gaagtctcca 420 ccaccaggta tagttggtat tgaaggtgaa caatgggcca aacatagaaa gattattaac 480 ccagccttcc acttggaaaa gttgaaaggt atggttccaa tcttctacca atcctgctct 540 gaaatgatta acaagtggga atccttggtt tccaaagaat cttcctgtga attggatgtc 600 tggccatatt tggaaaactt cacctccgat gttatttcca gagctgcttt tggttcttct 660 tacgaagaag gtagaaagat cttccaatta ttgagagaag aagccaaggt ttactccgtt 720 gctttgagat ctgtttacat tccaggttgg agattcttgc caactaagca aaacaaaaag 780 accaaagaaa tccacaacga aatcaagggt ttgttgaagg gtatcatcaa caagagagaa 840 gaagctatga aggctggtga agctacaaaa gatgatttgt tgggtatctt gatggaatcc 900 aacttcagag aaatccaaga acacggtaac aacaagaatg ccggtatgtc tattgaagat 960 gttatcggtg aatgcaagtt gttctacttt gctggtcaag aaactacctc cgttttgttg 1020 gtttggacca tgattttgtt gtcccaaaat caagattggc aagctagagc tagagaagaa 1080 gtcttgaaag ttttcggttc taacatccca acctacgaag 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catcctacca agaaggtgac catcttggtg taatcccaag aaactacgaa 2160 ggtatagtca atagggtaac ggcaagattt gggctggatg caagccaaca gataagacta 2220 gaagcagaag aagaaaaatt ggcgcacctt ccactagcga agacagtatc cgttgaagaa 2280 ttattgcaat acgtggaatt gcaggatccc gtcactagaa cgcaattgag agctatggca 2340 gcaaagactg tttgtccacc tcacaaggtt gaacttgaag ctctacttga aaaacaagca 2400 tacaaagagc aagtgctagc aaagagacta accatgttag aattgctgga aaaatacccg 2460 gcatgcgaaa tggaattctc cgaatttatc gcgttgttgc caagtattcg tcccaggtat 2520 tactcaattt catcttcacc aagggttgac gagaaacagg catctattac cgtatctgtg 2580 gtctctggag aagcttggag tggttacgga gaatacaagg gtattgcttc caattatctt 2640 gcagaactgc aggaagggga tacaattacc tgctttattt ctactcctca atcagaattt 2700 actcttccga aggatccaga aactccgtta attatggtag gtccgggaac aggagtcgcc 2760 cctttcagag gctttgtgca agcaaggaag caactaaaag aacagggaca aagtctgggt 2820 gaggcacatc tatatttcgg ttgcagatct ccgcatgagg attacttata ccaagaagaa 2880 cttgaaaacg cccaatcaga aggtattatc accttgcata ctgcattcag tagaatgcca 2940 aaccagccga 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cgtggattat ttcctcattg ttaacctccg gaggtgtgat taccgcatcg 600 ctgtactatt tgtatcggat ttatgtcacc cccatatggc cgttatccat ccaaacggcg 660 tccttattag gacttgtttt gtctatggta tgtggactgg ggttgtatgg tattgtgagt 720 caaaaaggat ccgtcataga gagctcttta ttttttgcgt atattgttcg ttgtatttat 780 gaaatttccc ccaaattagc tactaccgcg actgatgaaa ttttaaattt gttcaaagac 840 gtctggcaga aacatcaaag aaatctgccc acagctgaca atcttttgtg ctactttcat 900 aatgtcatat tgaaaaatgc agaggtgtta tgggggtcct ttattcctag aggaagaaag 960 aaaaccggtg attttcatga taaactcatt agcattctat cattcgaaaa agtatccttg 1020 atatctaaac cattttggaa atttttcaag aatttcacct ttagtgttcc gctatccatt 1080 aatgaatttt gtcaagttac aattaagatg gcaagcgaat cagtttcccc agctatagta 1140 atcaatttat gctttagagt tctgatgttt tactcggcaa cgaggattat tccagcatta 1200 caaagaaaaa atgacaaaca gttgcgcaag agtcgcagga tcatgaaggg attgtattgg 1260 tacagtcctt gcatattaat tgctatgtat actcacctga ttttacaata ttcaggtgag 1320 ctaaagaaag acctgtgcat atggggttgc agtgaaaagt ggtttggcgt agatcaacca 1380 gaaattatag tagattcatg gggattttgg aactggtgca acattttctg tactattttg 1440 gtatacgcta cagaattaat aggttctggt agttga 1476 <210> 114 <211> 491 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 114 Met Thr Ser Leu Ser Lys Ser Phe Met Gln Ser Gly Arg Ile Cys Ala 1 5 10 15 Ala Cys Phe Tyr Leu Leu Phe Thr Leu Leu Ser Ile Pro Ile Ser Phe 20 25 30 Lys Val Gly Gly Leu Glu Cys Gly Leu Ser Phe Thr Val Thr Leu Phe 35 40 45 Thr Leu Tyr Phe Ile Thr Thr Thr Leu Asn Val Leu Ala Arg Arg His 50 55 60 Gly Gly Arg Leu Tyr Ile Phe Phe Thr Ser Cys Leu Tyr Tyr Ser Gln 65 70 75 80 His Phe Ile Ile Ala Ser Leu Leu Tyr Leu Phe Leu Ser Gly Phe Ser 85 90 95 Asn Asp Glu Leu Gly Asn Val Leu Lys Asn Lys Tyr Asn Glu Ser Glu 100 105 110 Ser Phe Leu Glu Ala Leu Lys Asn Ser Leu Asn Ser Asn Gln Ile Asn 115 120 125 Tyr Val Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Arg Phe Val Val Gln Pro Trp Gln 130 135 140 Phe Val Leu Thr Lys Ser Thr Pro Phe Phe Thr Leu Ser Glu Gly Phe 145 150 155 160 Phe Thr Ile Leu Ala Ile Gln Ala Val Gly Glu Thr Asn Arg Trp Leu 165 170 175 Ser Asn 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ttattacaag tatggtccgt gcactggatg aagcaatgaa 2100 caagctgcag cgagcaaatc cagacgaccc agcttatgat gaaaacaagc gccagtttca 2160 agaagatatc aaggtgatga acgacctagt agataaaatt attgcagatc gcaaagcaag 2220 cggtgaacaa agcgatgatt tattaacgca tatgctaaac ggaaaagatc cagaaacggg 2280 tgagccgctt gatgacgaga acattcgcta tcaaattatt acattcttaa ttgcgggaca 2340 cgaaacaaca agtggtcttt tatcatttgc gctgtatttc ttagtgaaaa atccacatgt 2400 attacaaaaa gcagcagaag aagcagcacg agttctagta gatcctgttc caagctacaa 2460 acaagtcaaa cagcttaaat atgtcggcat ggtcttaaac gaagcgctgc gcttatggcc 2520 aactgctcct gcgttttccc tatatgcaaa agaagatacg gtgcttggag gagaatatcc 2580 tttagaaaaa ggcgacgaac taatggttct gattcctcag cttcaccgtg ataaaacaat 2640 ttggggagac gatgtggaag agttccgtcc agagcgtttt gaaaatccaa gtgcgattcc 2700 gcagcatgcg tttaaaccgt ttggaaacgg tcagcgtgcg tgtatcggtc agcagttcgc 2760 tcttcatgaa gcaacgctgg tacttggtat gatgctaaaa cactttgact ttgaagatca 2820 tacaaactac gagctggata ttaaagaaac tttaacgtta aaacctgaag gctttgtggt 2880 aaaagcaaaa tcgaaaaaaa 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His Glu Asp Tyr 930 935 940 Leu Tyr Gln Glu Glu Leu Glu Asn Ala Gln Ser Glu Gly Ile Ile Thr 945 950 955 960 Leu His Thr Ala Phe Ser Arg Met Pro Asn Gln Pro Lys Thr Tyr Val 965 970 975 Gln His Val Met Glu Gln Asp Gly Lys Lys Leu Ile Glu Leu Leu Asp 980 985 990 Gln Gly Ala His Phe Tyr Ile Cys Gly Asp Gly Ser Gln Met Ala Pro 995 1000 1005 Ala Val Glu Ala Thr Leu Met Lys Ser Tyr Ala Asp Val His Gln 1010 1015 1020 Val Ser Glu Ala Asp Ala Arg Leu Trp Leu Gln Gln Leu Glu Glu 1025 1030 1035 Lys Gly Arg Tyr Ala Lys Asp Val Trp Ala Gly 1040 1045 <210> 117 <211> 1767 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon-optimized BMR <400> 117 ccaagtccta gtaccgaaca atctgcaaaa aaagttagaa aaaaagcaga aaatgcacac 60 aatactccat tgctagttct ttatggttct aatatgggaa cagcggaagg aacggccagg 120 gatctagctg acatagctat gtccaaggga tttgccccgc aagtagcaac cctggattcc 180 catgcaggta acttgccaag agaaggtgct gttctaatag ttaccgctag ctacaatggg 240 caccctccag ataatgcgaa gcagttcgtc gattggttag atcaagcatc agcagatgaa 300 gttaagggtg ttagatactc tgtttttgga tgtggagata agaattgggc caccacatat 360 cagaaggttc cggctttcat cgatgaaatg cttgctgcaa aaggggctga aaatatagca 420 gatcgtggtg aggccgacgc aagcgacgat tttgagggta cctatgagga gtggagagag 480 cacatgtggt ctgatgttgc cgcgtatttt aatctagaca tagaaaattc tgaagacaat 540 aaaagtgcct tacttcttca attcgtcgat agtgctgcgg acatgccctt agcaaagatg 600 catggagcct tttcaacgaa cgtagtagcc agtaaggaac ttcaacaacc aggtagtgcc 660 agaagtacac gtcacttgga aattgaatta ccaaaagagg catcctacca agaaggtgac 720 catcttggtg taatcccaag aaactacgaa ggtatagtca atagggtaac ggcaagattt 780 gggctggatg caagccaaca gataagacta gaagcagaag aagaaaaatt ggcgcacctt 840 ccactagcga agacagtatc cgttgaagaa ttattgcaat acgtggaatt gcaggatccc 900 gtcactagaa cgcaattgag agctatggca gcaaagactg tttgtccacc tcacaaggtt 960 gaacttgaag ctctacttga aaaacaagca tacaaagagc aagtgctagc aaagagacta 1020 accatgttag aattgctgga aaaatacccg gcatgcgaaa tggaattctc cgaatttatc 1080 gcgttgttgc caagtattcg tcccaggtat tactcaattt catcttcacc aagggttgac 1140 gagaaacagg catctattac cgtatctgtg gtctctggag aagcttggag tggttacgga 1200 gaatacaagg gtattgcttc caattatctt gcagaactgc aggaagggga tacaattacc 1260 tgctttattt ctactcctca atcagaattt actcttccga aggatccaga aactccgtta 1320 attatggtag gtccgggaac aggagtcgcc cctttcagag gctttgtgca agcaaggaag 1380 caactaaaag aacagggaca aagtctgggt gaggcacatc tatatttcgg ttgcagatct 1440 ccgcatgagg attacttata ccaagaagaa cttgaaaacg cccaatcaga aggtattatc 1500 accttgcata ctgcattcag tagaatgcca aaccagccga aaacttacgt acagcatgtt 1560 atggagcaag atggtaagaa gttaattgag cttttggata agggcgccca cttctacatt 1620 tgcggcgacg gatcccaaat ggcgcctgcc gttgaagcca ccttgatgaa atcatatgca 1680 gatgttcatc aagtttcaga agcggacgcc cgtctttggt tacaacaact agaggagaaa 1740 ggaaggtatg caaaagatgt ttggtaa 1767 <210> 118 <211> 588 <212> PRT <213> Bacillus megaterium <400> 118 Pro Ser Pro Ser Thr Glu Gln Ser Ala Lys Lys Val Arg Lys Lys Ala 1 5 10 15 Glu Asn Ala His Asn Thr Pro Leu Leu Val Leu Tyr Gly Ser Asn Met 20 25 30 Gly Thr Ala Glu Gly Thr Ala Arg Asp Leu Ala Asp Ile Ala Met Ser 35 40 45 Lys Gly Phe Ala Pro Gln Val Ala Thr Leu Asp Ser His Ala Gly Asn 50 55 60 Leu Pro Arg Glu Gly Ala Val Leu Ile Val Thr Ala Ser Tyr Asn Gly 65 70 75 80 His Pro Pro Asp Asn Ala Lys Gln Phe Val Asp Trp Leu Asp Gln Ala 85 90 95 Ser Ala Asp Glu Val Lys Gly Val Arg Tyr Ser Val Phe Gly Cys Gly 100 105 110 Asp Lys Asn Trp Ala Thr Thr Tyr Gln Lys Val Pro Ala Phe Ile Asp 115 120 125 Glu Met Leu Ala Ala Lys Gly Ala Glu Asn Ile Ala Asp Arg Gly Glu 130 135 140 Ala Asp Ala Ser Asp Asp Phe Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Trp Arg Glu 145 150 155 160 His Met Trp Ser Asp Val Ala Ala Tyr Phe Asn Leu Asp Ile Glu Asn 165 170 175 Ser Glu Asp Asn Lys Ser Ala Leu Leu Leu Gln Phe Val Asp Ser Ala 180 185 190 Ala Asp Met Pro Leu Ala Lys Met His Gly Ala Phe Ser Thr Asn Val 195 200 205 Val Ala Ser Lys Glu Leu Gln Gln Pro Gly Ser Ala Arg Ser Thr Arg 210 215 220 His Leu Glu Ile Glu Leu Pro Lys Glu Ala Ser Tyr Gln Glu Gly Asp 225 230 235 240 His Leu Gly Val Ile Pro Arg Asn Tyr Glu Gly Ile Val Asn Arg Val 245 250 255 Thr Ala Arg Phe Gly Leu Asp Ala Ser Gln Gln Ile Arg Leu Glu Ala 260 265 270 Glu Glu Glu Lys Leu Ala His Leu Pro Leu Ala Lys Thr Val Ser Val 275 280 285 Glu Glu Leu Leu Gln Tyr Val Glu Leu Gln Asp Pro Val Thr Arg Thr 290 295 300 Gln Leu Arg Ala Met Ala Ala Lys Thr Val Cys Pro Pro His Lys Val 305 310 315 320 Glu Leu Glu Ala Leu Leu Glu Lys Gln Ala Tyr Lys Glu Gln Val Leu 325 330 335 Ala Lys Arg Leu Thr Met Leu Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Ala Cys 340 345 350 Glu Met Glu Phe Ser Glu Phe Ile Ala Leu Leu Pro Ser Ile Arg Pro 355 360 365 Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser Ser Ser Pro Arg Val Asp Glu Lys Gln Ala 370 375 380 Ser Ile Thr Val Ser Val Val Ser Gly Glu Ala Trp Ser Gly Tyr Gly 385 390 395 400 Glu Tyr Lys Gly Ile Ala Ser Asn Tyr Leu Ala Glu Leu Gln Glu Gly 405 410 415 Asp Thr Ile Thr Cys Phe Ile Ser Thr Pro Gln Ser Glu Phe Thr Leu 420 425 430 Pro Lys Asp Pro Glu Thr Pro Leu Ile Met Val Gly Pro Gly Thr Gly 435 440 445 Val Ala Pro Phe Arg Gly Phe Val Gln Ala Arg Lys Gln Leu Lys Glu 450 455 460 Gln Gly Gln Ser Leu Gly Glu Ala His Leu Tyr Phe Gly Cys Arg Ser 465 470 475 480 Pro His Glu Asp Tyr Leu Tyr Gln Glu Glu Leu Glu Asn Ala Gln Ser 485 490 495 Glu Gly Ile Ile Thr Leu His Thr Ala Phe Ser Arg Met Pro Asn Gln 500 505 510 Pro Lys Thr Tyr Val Gln His Val Met Glu Gln Asp Gly Lys Lys Leu 515 520 525 Ile Glu Leu Leu Asp Lys Gly Ala His Phe Tyr Ile Cys Gly Asp Gly 530 535 540 Ser Gln Met Ala Pro Ala Val Glu Ala Thr Leu Met Lys Ser Tyr Ala 545 550 555 560 Asp Val His Gln Val Ser Glu Ala Asp Ala Arg Leu Trp Leu Gln Gln 565 570 575 Leu Glu Glu Lys Gly Arg Tyr Ala Lys Asp Val Trp 580 585 <210> 119 <211> 1767 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon-optimized BMR W1046A <400> 119 ccaagtccta gtaccgaaca atctgcaaaa aaagttagaa aaaaagcaga aaatgcacac 60 aatactccat tgctagttct ttatggttct aatatgggaa cagcggaagg aacggccagg 120 gatctagctg acatagctat gtccaaggga tttgccccgc aagtagcaac cctggattcc 180 catgcaggta acttgccaag agaaggtgct gttctaatag ttaccgctag ctacaatggg 240 caccctccag ataatgcgaa gcagttcgtc gattggttag atcaagcatc agcagatgaa 300 gttaagggtg ttagatactc tgtttttgga tgtggagata agaattgggc caccacatat 360 cagaaggttc cggctttcat cgatgaaatg cttgctgcaa aaggggctga aaatatagca 420 gatcgtggtg aggccgacgc aagcgacgat tttgagggta cctatgagga gtggagagag 480 cacatgtggt ctgatgttgc cgcgtatttt aatctagaca tagaaaattc tgaagacaat 540 aaaagtgcct tacttcttca attcgtcgat agtgctgcgg acatgccctt agcaaagatg 600 catggagcct tttcaacgaa cgtagtagcc agtaaggaac ttcaacaacc aggtagtgcc 660 agaagtacac gtcacttgga aattgaatta ccaaaagagg catcctacca agaaggtgac 720 catcttggtg taatcccaag aaactacgaa ggtatagtca atagggtaac ggcaagattt 780 gggctggatg caagccaaca gataagacta gaagcagaag aagaaaaatt ggcgcacctt 840 ccactagcga agacagtatc cgttgaagaa ttattgcaat acgtggaatt gcaggatccc 900 gtcactagaa cgcaattgag agctatggca gcaaagactg tttgtccacc tcacaaggtt 960 gaacttgaag ctctacttga aaaacaagca tacaaagagc aagtgctagc aaagagacta 1020 accatgttag aattgctgga aaaatacccg gcatgcgaaa tggaattctc cgaatttatc 1080 gcgttgttgc caagtattcg tcccaggtat tactcaattt catcttcacc aagggttgac 1140 gagaaacagg catctattac cgtatctgtg gtctctggag aagcttggag tggttacgga 1200 gaatacaagg gtattgcttc caattatctt gcagaactgc aggaagggga tacaattacc 1260 tgctttattt ctactcctca atcagaattt actcttccga aggatccaga aactccgtta 1320 attatggtag gtccgggaac aggagtcgcc cctttcagag gctttgtgca agcaaggaag 1380 caactaaaag aacagggaca aagtctgggt gaggcacatc tatatttcgg ttgcagatct 1440 ccgcatgagg attacttata ccaagaagaa cttgaaaacg cccaatcaga aggtattatc 1500 accttgcata ctgcattcag tagaatgcca aaccagccga aaacttacgt acagcatgtt 1560 atggagcaag atggtaagaa gttaattgag cttttggata agggcgccca cttctacatt 1620 tgcggcgacg gatcccaaat ggcgcctgcc gttgaagcca ccttgatgaa atcatatgca 1680 gatgttcatc aagtttcaga agcggacgcc cgtctttggt tacaacaact agaggagaaa 1740 ggaaggtatg caaaagatgt tgcttaa 1767 <210> 120 <211> 588 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BMR W1046A <400> 120 Pro Ser Pro Ser Thr Glu Gln Ser Ala Lys Lys Val Arg Lys Lys Ala 1 5 10 15 Glu Asn Ala His Asn Thr Pro Leu Leu Val Leu Tyr Gly Ser Asn Met 20 25 30 Gly Thr Ala Glu Gly Thr Ala Arg Asp Leu Ala Asp Ile Ala Met Ser 35 40 45 Lys Gly Phe Ala Pro Gln Val Ala Thr Leu Asp Ser His Ala Gly Asn 50 55 60 Leu Pro Arg Glu Gly Ala Val Leu Ile Val Thr Ala Ser Tyr Asn Gly 65 70 75 80 His Pro Pro Asp Asn Ala Lys Gln Phe Val Asp Trp Leu Asp Gln Ala 85 90 95 Ser Ala Asp Glu Val Lys Gly Val Arg Tyr Ser Val Phe Gly Cys Gly 100 105 110 Asp Lys Asn Trp Ala Thr Thr Tyr Gln Lys Val Pro Ala Phe Ile Asp 115 120 125 Glu Met Leu Ala Ala Lys Gly Ala Glu Asn Ile Ala Asp Arg Gly Glu 130 135 140 Ala Asp Ala Ser Asp Asp Phe Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Trp Arg Glu 145 150 155 160 His Met Trp Ser Asp Val Ala Ala Tyr Phe Asn Leu Asp Ile Glu Asn 165 170 175 Ser Glu Asp Asn Lys Ser Ala Leu Leu Leu Gln Phe Val Asp Ser Ala 180 185 190 Ala Asp Met Pro Leu Ala Lys Met His Gly Ala Phe Ser Thr Asn Val 195 200 205 Val Ala Ser Lys Glu Leu Gln Gln Pro Gly Ser Ala Arg Ser Thr Arg 210 215 220 His Leu Glu Ile Glu Leu Pro Lys Glu Ala Ser Tyr Gln Glu Gly Asp 225 230 235 240 His Leu Gly Val Ile Pro Arg Asn Tyr Glu Gly Ile Val Asn Arg Val 245 250 255 Thr Ala Arg Phe Gly Leu Asp Ala Ser Gln Gln Ile Arg Leu Glu Ala 260 265 270 Glu Glu Glu Lys Leu Ala His Leu Pro Leu Ala Lys Thr Val Ser Val 275 280 285 Glu Glu Leu Leu Gln Tyr Val Glu Leu Gln Asp Pro Val Thr Arg Thr 290 295 300 Gln Leu Arg Ala Met Ala Ala Lys Thr Val Cys Pro Pro His Lys Val 305 310 315 320 Glu Leu Glu Ala Leu Leu Glu Lys Gln Ala Tyr Lys Glu Gln Val Leu 325 330 335 Ala Lys Arg Leu Thr Met Leu Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Ala Cys 340 345 350 Glu Met Glu Phe Ser Glu Phe Ile Ala Leu Leu Pro Ser Ile Arg Pro 355 360 365 Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser Ser Ser Pro Arg Val Asp Glu Lys Gln Ala 370 375 380 Ser Ile Thr Val Ser Val Val Ser Gly Glu Ala Trp Ser Gly Tyr Gly 385 390 395 400 Glu Tyr Lys Gly Ile Ala Ser Asn Tyr Leu Ala Glu Leu Gln Glu Gly 405 410 415 Asp Thr Ile Thr Cys Phe Ile Ser Thr Pro Gln Ser Glu Phe Thr Leu 420 425 430 Pro Lys Asp Pro Glu Thr Pro Leu Ile Met Val Gly Pro Gly Thr Gly 435 440 445 Val Ala Pro Phe Arg Gly Phe Val Gln Ala Arg Lys Gln Leu Lys Glu 450 455 460 Gln Gly Gln Ser Leu Gly Glu Ala His Leu Tyr Phe Gly Cys Arg Ser 465 470 475 480 Pro His Glu Asp Tyr Leu Tyr Gln Glu Glu Leu Glu Asn Ala Gln Ser 485 490 495 Glu Gly Ile Ile Thr Leu His Thr Ala Phe Ser Arg Met Pro Asn Gln 500 505 510 Pro Lys Thr Tyr Val Gln His Val Met Glu Gln Asp Gly Lys Lys Leu 515 520 525 Ile Glu Leu Leu Asp Lys Gly Ala His Phe Tyr Ile Cys Gly Asp Gly 530 535 540 Ser Gln Met Ala Pro Ala Val Glu Ala Thr Leu Met Lys Ser Tyr Ala 545 550 555 560 Asp Val His Gln Val Ser Glu Ala Asp Ala Arg Leu Trp Leu Gln Gln 565 570 575 Leu Glu Glu Lys Gly Arg Tyr Ala Lys Asp Val Ala 580 585 <210> 121 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 121 ccatcaaga 9 <210> 122 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 122 Pro Ser Arg 1

Claims (28)

  1. (a) ent-카우렌 옥시다제 (KO) 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자;
    (b) 사이토크롬 P450 리덕타제 (CPR) 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자; 및/또는
    (c) ent-카우레노산 하이드록실라제 (KAH) 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자 중 하나 이상을 포함하는 재조합 숙주로서,
    여기에서 유전자 중 적어도 하나가 재조합 유전자이며;
    재조합 숙주는 스테비올 글리코시드 전구체를 생성할 수 있는 재조합 숙주.
  2. (a) 게라닐게라닐 디포스페이트 신타제 (GGPPS) 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자;
    (b) ent-코팔릴 디포스페이트 신타제 (CDPS) 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자;
    (c) ent-카우렌 신타제 (KS) 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자;
    (d) ent-카우렌 옥시다제 (KO) 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자;
    (e) 사이토크롬 P450 리덕타제 (CPR) 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자; 및
    (f) ent-카우레노산 하이드록실라제 (KAH) 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 숙주로서,
    여기에서 유전자 중 적어도 하나가 재조합 유전자이며;
    재조합 숙주는 스테비올을 생성할 수 있는 재조합 숙주.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    (a) KO 폴리펩티드가 SEQ ID NO:72 또는 SEQ ID NO:75에 제시된 아미노산 서열과 적어도 60%의 동일성; SEQ ID NO:54에 제시된 아미노산 서열과 적어도 65%의 동일성; SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, 또는 SEQ ID NO:79에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%의 동일성; SEQ ID NO:77에 제시된 아미노산 서열과 적어도 40%의 동일성; 또는 SEQ ID NO:78에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%의 동일성을 갖는 KO 폴리펩티드를 포함하고/거나;
    (b) CPR 폴리펩티드는 SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:76 또는 SEQ ID NO:87에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%의 동일성; SEQ ID NO:73에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성; SEQ ID NO:22에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%의 동일성; SEQ ID NO:28에 제시된 아미노산 서열과 적어도 65%의 동일성; 또는 SEQ ID NO:98에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%의 동일성을 갖는 CPR 폴리펩티드를 포함하고/거나;
    (c) KAH 폴리펩티드는 SEQ ID NO:82에 제시된 아미노산 서열과 적어도 40%의 동일성; SEQ ID NO:91에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%의 동일성; 또는 SEQ ID NO:68에 제시된 아미노산 서열과 적어도 60%의 동일성을 갖는 KAH 폴리펩티드를 포함하는 재조합 숙주.
  4. (a) SEQ ID NO:75에 제시된 아미노산 서열과 적어도 60%의 동일성을 갖는 KO 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자;
    (b) SEQ ID NO:82에 제시된 아미노산 서열과 적어도 40%의 동일성을 갖는 KAH 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자; 및/또는
    (c) SEQ ID NO:98에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%의 동일성을 갖는 CPR 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자중 하나 이상을 포함하는 재조합 숙주로서;
    여기에서 유전자 중 적어도 하나가 재조합 유전자이며;
    재조합 숙주는 스테비올 글리코시드 전구체를 생성할 수 있는 재조합 숙주.
  5. (a) SEQ ID NO:70에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 KO 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자;
    (b) SEQ ID NO:82에 제시된 아미노산 서열과 적어도 40%의 동일성을 갖는 KAH 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자; 및/또는
    (c) SEQ ID NO:98에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%의 동일성을 갖는 CPR 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자중 하나 이상을 포함하는 재조합 숙주로서;
    여기에서 유전자 중 적어도 하나가 재조합 유전자이며;
    재조합 숙주는 스테비올 글리코시드 전구체를 생성할 수 있는 재조합 숙주.
  6. 제 4항 또는 제 5항에 있어서, 숙주가 SEQ ID NO:54에 제시된 아미노산 서열과 적어도 65%의 동일성을 갖는 KO 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 재조합 숙주.
  7. 제 4항 내지 제 6항 중의 어느 한 항에 있어서, 숙주가 SEQ ID NO:68에 제시된 아미노산 서열과 적어도 60%의 동일성을 갖는 KAH 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 재조합 숙주.
  8. 제 4항 내지 제 7항 중의 어느 한 항에 있어서, 숙주가 SEQ ID NO:79에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 KO 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 재조합 숙주.
  9. 제 1항 또는 제 3항 내지 제 8항 중의 어느 한 항에 있어서, 숙주가
    (a) 게라닐게라닐 디포스페이트 신타제 (GGPPS) 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자;
    (b) ent-코팔릴 디포스페이트 신타제 (CDPS) 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자; 및/또는
    (c) ent-카우렌 신타제 (KS) 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자 중 하나 이상을 추가로 포함하며;
    여기에서 유전자 중 적어도 하나가 재조합 유전자이며;
    재조합 숙주는 스테비올 글리코시드 전구체를 생성할 수 있는 재조합 숙주.
  10. 제 9항에 있어서,
    (a) GGPPS 폴리펩티드가 SEQ ID NO:49에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하고/거나;
    (b) CDPS 폴리펩티드는 SEQ ID NO:37에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하고/거나;
    (c) KS 폴리펩티드는 SEQ ID NO:6에 제시된 아미노산 서열과 적어도 40%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 재조합 숙주.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중의 어느 한 항에 있어서, 숙주가 세포질 그물 (endoplasmic reticulum) 막 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 재조합 숙주.
  12. 제 11항에 있어서, 세포질 그물 막 폴리펩티드가 SEQ ID NO:114에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%의 동일성을 갖는 유전 피질 ER 단백질 2 (ICE2: Inheritance of cortical ER protein 2) 폴리펩티드를 포함하는 재조합 숙주.
  13. 제 1항 내지 제 10항 중의 어느 한 항에 있어서, KO 폴리펩티드가 융합 작제물인 재조합 숙주.
  14. 제 13항에 있어서, 융합 작제물이 SEQ ID NO:118 또는 SEQ ID NO:120에 제시된 아미노산 서열과 적어도 60%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 재조합 숙주.
  15. 제 13항 또는 제 14항에 있어서, 융합 작제물이 SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:110, 또는 SEQ ID NO:112에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%의 동일성을 갖는 재조합 숙주.
  16. 제 1항 내지 제 15항 중의 어느 한 항에 있어서, 숙주가
    (a) UGT85C 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자;
    (b) UGT76G 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자;
    (c) UGT74G1 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자;
    (d) UGT91D2 기능성 호몰로그 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자; 및/또는
    (e) EUGT11 폴리펩티드를 엔코딩하는 유전자 중 하나 이상을 추가로 포함하며;
    여기에서 유전자 중 적어도 하나가 재조합 유전자이며;
    숙주는 스테비올 글리코시드를 생성할 수 있는 재조합 숙주.
  17. 제 16항에 있어서,
    (a) UGT85C2 폴리펩티드가 SEQ ID NO:30에 제시된 아미노산 서열과 적어도 55%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하고/거나;
    (b) UGT76G1 폴리펩티드는 SEQ ID NO:83에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하고/거나;
    (c) UGT74G1 폴리펩티드는 SEQ ID NO:29에 제시된 아미노산 서열과 적어도 55%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하고/거나;
    (d) UGT91D2 기능성 호몰로그 폴리펩티드는 SEQ ID NO:84에 제시된 아미노산 서열과 90% 또는 그 초과의 동일성을 갖는 UGT91D2 폴리펩티드 또는 SEQ ID NO:88에 제시된 아미노산 서열과 90% 또는 그 초과의 동일성을 갖는 UGT91D2e-b 폴리펩티드를 포함하고/거나;
    (e) EUGT11 폴리펩티드는 SEQ ID NO:86에 제시된 아미노산 서열과 적어도 65%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 재조합 숙주.
  18. 제 1항 내지 제 17항 중의 어느 한 항에 있어서, 재조합 숙주가 식물 세포, 포유동물 세포, 곤충 세포, 진균류 세포 또는 박테리아 세포를 포함하는 재조합 숙주.
  19. 제 18항에 있어서, 박테리아 세포가 에스체리치아(Escherichia) 박테리아 세포, 락토바실러스(Lactobacillus) 박테리아 세포, 락토코커스(Lactococcus) 박테리아 세포, 코르네박테리움(Cornebacterium) 박테리아 세포, 아세토박터(Acetobacter) 박테리아 세포, 아시네토박터(Acinetobacter) 박테리아 세포, 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 박테리아 세포를 포함하는 재조합 숙주.
  20. 제 18항에 있어서, 진균류 세포가 효모 세포를 포함하는 재조합 숙주.
  21. 제 20항에 있어서, 효모 세포가 사카로마아세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 아쉬비아 고시피이(Ashbya gossypii), 사이베를린드네라 자디니이(Cyberlindnera jadinii), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 칸디다 보이디니이(Candida boidinii), 아르술라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans), 잔토필로마이세스 덴드로르호우스(Xanthophyllomyces dendrorhous), 또는 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 종으로부터의 세포인 재조합 숙주.
  22. 제 21항에 있어서, 효모 세포가 사카로마이세테(Saccharomycete)인 재조합 숙주.
  23. 제 22항에 있어서, 효모 세포가 사카로마이세스 세레비시애 종으로부터의 세포인 재조합 숙주.
  24. 스테비올 글리코시드 또는 스테비올 글리코시드 전구체를 생성하는 방법으로서,
    (a) 제 1항 내지 제 23항 중의 어느 한 항에 기재된 임의의 유전자가 발현되는 조건하에 배양 배지에서 제 1항 내지 제 23항 중의 어느 한 항의 재조합 숙주를 성장시키는 단계로서,
    스테비올 글리코시드 또는 스테비올 글리코시드 전구체가 상기 숙주에 의해 합성되는 단계; 및/또는
    (b) 선택적으로, 스테비올 글리코시드 또는 스테비올 글리코시드 전구체를 정량화하는 단계; 및/또는
    (c) 선택적으로, 스테비올 글리코시드 또는 스테비올 글리코시드 전구체를 분리하는 단계를 포함하는 방법.
  25. 제 24항에 있어서, 스테비올 글리코시드가 스테비올-13-O-글루코시드 (13-SMG), 스테비올-1,2-바이오사이드, 스테비올-1,3-바이오사이드, 스테비올-19-O-글루코시드 (19-SMG), 스테비오사이드, 1,3-스테비오사이드, 루부소사이드, 레바우디오사이드 A (RebA), 레바우디오사이드 B (RebB), 레바우디오사이드 C (RebC), 레바우디오사이드 D (RebD), 레바우디오사이드 E (RebE), 레바우디오사이드 F (RebF), 레바우디오사이드 M (RebM), 레바우디오사이드 Q (RebQ), 레바우디오사이드 I (RebI), 둘코사이드 A, 디-글리코실화된 스테비올, 트리-글리코실화된 스테비올, 테트라-글리코실화된 스테비올, 펜타-글리코실화된 스테비올, 헥사-글리코실화된 스테비올, 헵타-글리코실화된 스테비올, 또는 이들의 이성질체를 포함하는 방법.
  26. 제 1항 내지 제 23항 중의 어느 한 항의 재조합 숙주 또는 제 24항 또는 제 25항의 방법에 의해 생성된 스테비올 글리코시드 또는 스테비올 글리코시드 전구체로서, 상기 조건 하에서 배양될 때 검출 가능한 농도로 축적되는 스테비올 글리코시드 또는 스테비올 글리코시드 전구체.
  27. 제 1항 내지 제 23항 중의 어느 한 항의 숙주 또는 제 24항 또는 제 25항의 방법에 의해 생성된 스테비올 글리코시드 조성물로서, 검출불가능한 농도의 스테비아 식물-유래된 오염물질을 갖는 스테비올 글리코시드 조성물.
  28. 제 1항 내지 제 23항 중의 어느 한 항의 숙주 또는 제 24항 또는 제 25항의 방법에 의해 생성된 스테비올 글리코시드 조성물로서, 조성물이 야생형 스테비아 식물의 스테비올 글리코시드 조성물과 비교하여 RebD 또는 RebM이 풍부한 스테비올 글리코시드 조성을 갖는 스테비올 글리코시드 조성물.
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