ES2323586T3 - Procedimiento de preparacion de hormona del crecimiento y antagonista de la misma que tiene niveles inferiores de impurezas de isoformas. - Google Patents
Procedimiento de preparacion de hormona del crecimiento y antagonista de la misma que tiene niveles inferiores de impurezas de isoformas. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2323586T3 ES2323586T3 ES03799266T ES03799266T ES2323586T3 ES 2323586 T3 ES2323586 T3 ES 2323586T3 ES 03799266 T ES03799266 T ES 03799266T ES 03799266 T ES03799266 T ES 03799266T ES 2323586 T3 ES2323586 T3 ES 2323586T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- buffer
- tris
- cysteine
- impurity
- chelating agent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 76
- 239000012535 impurity Substances 0.000 title claims abstract description 60
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 title claims abstract description 51
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 title claims abstract description 51
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 title claims description 11
- 230000012010 growth Effects 0.000 title description 15
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 title description 6
- 239000005556 hormone Substances 0.000 title description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 5
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 claims abstract description 43
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 16
- 229940122853 Growth hormone antagonist Drugs 0.000 claims abstract description 15
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 45
- -1 mercapto compound Chemical class 0.000 claims description 45
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 37
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 36
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 26
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical group OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 claims description 14
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 10
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 9
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 9
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 8
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 7
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 7
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 7
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 6
- VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N dithioerythritol Chemical compound SC[C@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N 0.000 claims description 6
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 claims description 5
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical class OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 5
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 claims description 5
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims description 5
- PXQLVRUNWNTZOS-UHFFFAOYSA-N sulfanyl Chemical class [SH] PXQLVRUNWNTZOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 3-[bis(2-carboxyethyl)phosphanyl]propanoic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 claims description 4
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N D-cystine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CSSC[C@@H](N)C(O)=O LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 3
- 108700030081 B 2036 Proteins 0.000 description 94
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 42
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 42
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 42
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 40
- 108700037519 pegvisomant Proteins 0.000 description 24
- 229960002995 pegvisomant Drugs 0.000 description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 19
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 18
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 18
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 18
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 13
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 11
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 11
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 10
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 239000003667 hormone antagonist Substances 0.000 description 5
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 4
- 102100020948 Growth hormone receptor Human genes 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 108020001775 protein parts Proteins 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 2
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101710099093 Growth hormone receptor Proteins 0.000 description 2
- 229940124013 Growth hormone receptor antagonist Drugs 0.000 description 2
- 229940123502 Hormone receptor antagonist Drugs 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 2
- 239000008240 homogeneous mixture Substances 0.000 description 2
- 239000003689 hormone receptor blocking agent Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 229940037001 sodium edetate Drugs 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- LJRDOKAZOAKLDU-UDXJMMFXSA-N (2s,3s,4r,5r,6r)-5-amino-2-(aminomethyl)-6-[(2r,3s,4r,5s)-5-[(1r,2r,3s,5r,6s)-3,5-diamino-2-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-hydroxycyclohexyl]oxy-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl]oxyoxane-3,4-diol;sulfuric ac Chemical compound OS(O)(=O)=O.N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)N)O[C@@H]1CO LJRDOKAZOAKLDU-UDXJMMFXSA-N 0.000 description 1
- VILCJCGEZXAXTO-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-tetramine Chemical compound NCCNCCNCCN VILCJCGEZXAXTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000599 Acromegaly Diseases 0.000 description 1
- PQUCIEFHOVEZAU-UHFFFAOYSA-N Diammonium sulfite Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S([O-])=O PQUCIEFHOVEZAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QZKRHPLGUJDVAR-UHFFFAOYSA-K EDTA trisodium salt Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O QZKRHPLGUJDVAR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- UBQYURCVBFRUQT-UHFFFAOYSA-N N-benzoyl-Ferrioxamine B Chemical compound CC(=O)N(O)CCCCCNC(=O)CCC(=O)N(O)CCCCCNC(=O)CCC(=O)N(O)CCCCCN UBQYURCVBFRUQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220587327 NEDD8-activating enzyme E1 catalytic subunit_H21N_mutation Human genes 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004285 Potassium sulphite Substances 0.000 description 1
- 102100024819 Prolactin Human genes 0.000 description 1
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010068542 Somatotropin Receptors Proteins 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- RXDLGFMMQFNVLI-UHFFFAOYSA-N [Na].[Na].[Ca] Chemical compound [Na].[Na].[Ca] RXDLGFMMQFNVLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GIEAQDPIWWODTH-UHFFFAOYSA-N [Na].[Na].[Na].[Ca] Chemical compound [Na].[Na].[Na].[Ca] GIEAQDPIWWODTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- GBAOBIBJACZTNA-UHFFFAOYSA-L calcium sulfite Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])=O GBAOBIBJACZTNA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000004295 calcium sulphite Substances 0.000 description 1
- 235000010261 calcium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical group 0.000 description 1
- 229960000958 deferoxamine Drugs 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 108010005905 delta-hGHR Proteins 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 description 1
- 229940009662 edetate Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229960001639 penicillamine Drugs 0.000 description 1
- 229940067082 pentetate Drugs 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- BHZRJJOHZFYXTO-UHFFFAOYSA-L potassium sulfite Chemical compound [K+].[K+].[O-]S([O-])=O BHZRJJOHZFYXTO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019252 potassium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 229940099077 somavert Drugs 0.000 description 1
- ACTRVOBWPAIOHC-XIXRPRMCSA-N succimer Chemical compound OC(=O)[C@@H](S)[C@@H](S)C(O)=O ACTRVOBWPAIOHC-XIXRPRMCSA-N 0.000 description 1
- 229960005346 succimer Drugs 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-L sulfite Chemical compound [O-]S([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 229960001124 trientine Drugs 0.000 description 1
- 229960005066 trisodium edetate Drugs 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/10—Drugs for disorders of the endocrine system of the posterior pituitary hormones, e.g. oxytocin, ADH
- A61P5/12—Drugs for disorders of the endocrine system of the posterior pituitary hormones, e.g. oxytocin, ADH for decreasing, blocking or antagonising the activity of the posterior pituitary hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Un procedimiento para disminuir la cantidad de una impureza de isoforma de trisulfuro producida en la producción recombinante del polipéptido B-2036 antagonista de la hormona del crecimiento de SEC. ID. NO. 1 en células huésped modificadas genéticamente que contienen compuesto(s) celular(es), comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) poner en contacto un agente quelante con una pasta de células o un lisado de pasta de células que comprende (1) dicha impureza, (2) dicho polipéptido antagonista de la hormona del crecimiento, (3) dicho(s) compuesto(s) celular (es) para disminuir la cantidad de dicha impureza, en el que la proporción de los moles de dicho agente quelante con respecto a los moles de dicho polipéptido antagonista de la hormona del crecimiento es desde 20 hasta 1.000 y la temperatura se mantiene desde 0ºC hasta 35ºC.
Description
Procedimiento de preparación de hormona del
crecimiento y antagonista de la misma que tiene niveles inferiores
de impurezas de isoformas.
La presente invención se refiere en general a
procedimientos recombinantes para preparar un polipéptido deseado.
Este/Estos procedimiento(s) proporciona(n) un producto
polipeptídico que contiene niveles reducidos de impurezas de
isoforma del mismo. En particular, la presente invención se refiere
a un procedimiento recombinante para preparar un antagonista de la
hormona del crecimiento, tal como pegvisomant, y su producto
intermedio proteico, que tiene también impurezas de isoforma
reducidas del mismo. Más específicamente, las impurezas de isoforma
que se disminuyen mediante el procedimiento de la presente invención
son las impurezas de isoforma de trisulfuro del producto intermedio
B-2036 antagonista de la hormona del
crecimiento.
Pegvisomant (Somavert®; Pharmacia Corp.) es un
antagonista del receptor de la hormona del crecimiento humana. Es
un análogo de la hormona del crecimiento humana ("hGH") que se
ha alterado estructuralmente. La secuencia de aminoácidos del
componente/producto intermedio proteico (B-2036) de
pegvisomant difiere de la secuencia de aminoácidos de hGH en nueve
posiciones. Las sustituciones específicas de aminoácido son tal como
sigue: H18D, H21N, G120K, R167N, K168A, D171S, K172R, E174S e
I179T. Tal como se reconoce bien en la técnica, la primera letra
(es decir, H18D) representa el aminoácido en la secuencia de
hGH en la posición numerada (es decir, la 18ª posición de aminoácido
tal como se indica mediante H18D) que se sustituye por el
aminoácido designado mediante la segunda letra (es decir,
H18D). Por tanto, H18D designa una substitución del
aminoácido his por el aminoácido asp en la 18ª
posición de aminoácido de la secuencia de aminoácidos de hGH de tipo
natural.
La figura 1A muestra esquemáticamente la
estructura de la secuencia de aminoácidos del componente/producto
intermedio proteico (B-2036) de pegvisomant (PEG
B-2036) indicando los asteriscos los posibles sitios
de unión al polímero polietilenglicol (unidad "PEG").
Adicionalmente, el listado de secuencias de aminoácidos del
componente/producto intermedio proteico (B-2036 -
sin unión a unidad de PEG) de pegvisomant se identifica en el
presente documento como SEC. ID. NO. 1. Para la comparación, el
listado de secuencias de aminoácidos de la hormona del crecimiento
humana se identifica en el presente documento como SEC. ID. NO. 2.
Ambos listados de secuencias se proporcionan junto con el presente
documento. Véase también Jorgensen et al., "Quantifying
biosynthetic human growth hormone in Escherichia coli with
electrophoresis under hydrophobic conditions", J. Chromatography
A 817:205-214 (1998) para la secuencia de hGH.
Estructuralmente, pegvisomant es una proteína
(que contiene 191 residuos de aminoácido) a la que están unidas de
manera covalente, predominantemente de 4 a 6 unidades de PEG. El
peso molecular del componente/producto intermedio proteico
(B-2036) de pegvisomant es de 21.998 Daltons. El
peso molecular de cada unidad de PEG de pegvisomant es de
aproximadamente 5000 Daltons. De ese modo, los pesos moleculares
predominantes de pegvisomant son aproximadamente de 42.000 (4
unidades de PEG/molécula), 47.000 (5 unidades de PEG/molécula) y
52.000
(6 unidades de PEG/molécula) Daltons.
(6 unidades de PEG/molécula) Daltons.
Con referencia al agonista, y sin restringirse a
la teoría, se cree que la hGH endógena activa sus receptores cuando
una única molécula de hGH se une a dos de sus moléculas de receptor
adyacentes (e idénticas), induciendo homodimerización de receptor
mediada por hormona. Véanse las patentes estadounidenses números
5.849.535 y 6.057.292. La actividad de hGH depende de su capacidad
para unirse a dos de sus receptores adyacentes (e idénticos) a
través de dos sitios de unión separados (sitio 1 y sitio 2) en la
misma molécula de hGH. Estos sitios de unión de hGH, designados
como sitio 1 y sitio 2, están numerados con 1 y 2 para reflejar el
orden de su unión a dos receptores de hGH adyacentes (e idénticos)
que median en la homodimerización dependiente de hGH.
Además, sin querer quedar adherido a la teoría,
se cree que pegvisomant se une de manera selectiva a receptores de
la hormona del crecimiento humana ("receptores de GH") sobre
superficies celulares, en las que bloquea la unión de de la hormona
del crecimiento humana endógena, interfiriendo de ese modo con la
transducción de señales de la hormona del crecimiento humana. Las
modificaciones estructurales en la parte proteica (también
denominada "componente" o "producto intermedio") de
pegvisomant (en relación con la hGH) permiten que pegvisomant
bloquee de manera competitiva la interacción entre una molécula de
hGH y un receptor de hGH. Pegvisomant se une al receptor de GH,
bloqueando por tanto la unión a GH puesto que el receptor está
ocupado. Las modificaciones estructurales evitan la dimerización
del receptor, como resultado no se produce transducción de señales.
Bloqueando así la interacción estrecha requerida entre una molécula
de hGH y un receptor de hGH, pegvisomant bloquea la
homodimerización mediada por hGH de los receptores de hGH,
proporcionando a pegvisomant su actividad antagonista.
Este antagonista se usa para tratar afecciones,
incluyendo, pero sin limitarse a, acromegalia en pacientes que no
responden adecuadamente a cirugía, radioterapia y/u otros
tratamientos médicos convencionales, o que no pueden tolerar de
otro modo estos tratamientos. Además, las modificaciones
estructurales en la parte proteica (B-2036) de
pegvisomant hacen que muestre una afinidad de unión por el receptor
de prolactina que es inferior a la de hGH, minimizando de ese modo
los efectos secundarios no deseados relacionados con la lactancia
asociados con el uso de pegvisomant.
La parte de producto intermedio proteico
(B-2036) de pegvisomant se sintetiza mediante una
cepa de bacterias Escherichia coli que se ha modificado
genéticamente mediante la adición de un plásmido que porta un gen
para el antagonista del receptor de la hormona del crecimiento
(B-2036). B-2036 se recupera
entonces de las células microbianas y se purifica. El
B-2036 purificado se pegila entonces para producir
pegvisomant (PEG B-2036). Las patentes
estadounidenses 5.849.535 y 6.057.292 describen procedimientos de
preparación de B-2036 y procedimientos para
conjugar una o más unidades de PEG con B-2036,
aunque sin detalles en cuanto a cómo disminuir, reducir, eliminar,
invertir y/o evitar la formación de niveles inaceptablemente
elevados de trisulfuro e impurezas de isoforma
des-Phe del mismo.
Uno de los problemas que se encuentran usando
procedimientos de preparación recombinantes convencionales para
preparar B-2036 es la formación de sus impurezas de
isoforma, tales como sus isoformas des-Phe y del
trisulfuro. La impureza de isoforma des-Phe es una
en la que la molécula B-2036 carece de su
fenilalanina amino-terminal. Véase la figura 1A que
representa el residuo de fenilalanina amino-terminal
objeto (es decir, indicado con la letra "F") adyacente al
extremo -NH_{2} de B-2036. La impureza de isoforma
de trisulfuro es una en la que la molécula de
B-2036 contiene un átomo de azufre adicional que
forma un "puente de trisulfuro" dentro de la molécula. Véase el
recuadro en la figura 1B. También, véase Andersson et al.,
"Isolation and characterization of a trisulfide variant of
recombinant human growth hormone formed during expression in
Escherichia coli", Int. J. Peptide Protein Res.
47:311-321 (1996) y A. Jesperson et al.,
"Characterisation of a trisulphide derivative of biosynthetic
human growth hormone produced in Escherichia coli", Eur.
J. Biochem. 219:365-373 (1994). Sin querer
restringirse a la teoría, se cree que estas impurezas de isoforma se
generan normalmente durante el crecimiento celular (por ejemplo,
fermentación) y la expresión (síntesis y secreción) de
B-2036 en células huésped modificadas
genéticamente, y/o durante la extracción y purificación de la
proteína B-2036.
Con respecto a ciertas impurezas, la solicitud
internacional WO 94/24157 (publicada el 27 de octubre de 1994) da a
conocer un derivado hidrófobo de hGH que comprende un átomo de
azufre adicional en comparación con la hGH nativa. Véase el
documento WO 94/24157 en la página 3, líneas 3-10.
El átomo de azufre adicional del derivado hidrófobo de hGH forma un
"puente de trisulfuro" proporcionando una variante de
trisulfuro de hGH. Véase el documento WO 94/24157 en la página 7,
líneas 11-16. La referencia del documento WO
94/24157 indica además que esta variante de trisulfuro de hGH puede
convertirse de nuevo en su forma de hGH nativa tratando la variante
de trisulfuro de hGH con un compuesto de mercapto tal como cisteína,
glutatión, 2-mercaptoetanol o ditiotreitol. Véase
el documento WO 94/24157 en las páginas 4 y 5.
La solicitud internacional WO 96/02570
(publicada el 1 de febrero de 1996) describe otro procedimiento para
convertir la variante de trisulfuro de hGH de nuevo en su forma
nativa usando sulfito de sodio, sulfito de potasio, sulfito de
amonio o bien un sulfito de metal alcalinotérreo tal como sulfito de
magnesio o sulfito de calcio. Véase el documento WO 94/24157 en la
página 4, líneas 17-21.
La solicitud internacional WO 00/02900
(publicada el 20 de enero de 2000) titulada "Method for the
production of recombinant peptides with a low amount of
trisulfides" trata de "un procedimiento para la reducción de
la cantidad de trisulfuros en la producción de péptidos
recombinantes, por ejemplo, tanto proteínas como péptidos más
pequeños. La invención se basa en el hallazgo novedoso e inesperado
de que la cantidad de trisulfuros en la producción de péptidos
recombinantes podría reducirse mediante la adición de una sal de
metal, preferiblemente en exceso, ya durante o tras la fermentación
y no, tal como se sugirió anteriormente, mediante la conversión de
los trisulfuros formados de hormona del crecimiento en la forma
nativa". Véase el documento WO 00/02900 en la página 2, líneas
21-27. La referencia del documento WO 00/02900
indica además "[l]a proteína puede ser cualquier proteína
recombinante pero preferiblemente es hormona del crecimiento
recombinante que puede ser tanto humana como animal tal como
hormona del crecimiento humana (hGH), hormona del crecimiento bovina
(bGH) y hormona del crecimiento porcina (pGH)". (Énfasis
añadido). Véase el documento WO 00/02900 en la página 3, líneas
4-6.
La solicitud internacional número WO 02/057478
(publicada el 25 de julio de 2002) titulada "Methods and
Composition For Extracting Proteins From Cells" se refiere a un
procedimiento de liberación de una proteína a partir de una célula
huésped poniendo en contacto la célula huésped con un agente
reductor y un detergente. La referencia indica que el fin del
agente reductor es "facilitar[] la recuperación de proteínas en
sus conformaciones nativas". Véase el documento WO 02/057478 en
la página 2, líneas 16-18. Además, el documento WO
02/057478 describe que el "uno o más agentes reductores son
agentes... que reducen enlaces disulfuro y/o mantienen residuos de
sulfhidrilo en s[u] forma reducida. Puede usarse cualquier
agente o agentes reductores de este tipo. En una realización
preferida, el uno o más agentes reductores usados se seleccionan del
grupo constituido por, ditiotrietol (DTT); ditioeritritol (DTE);
cisteína (Cys) y
tris-2-carboxietilfosfina
(TCEP)". (Énfasis añadido). Véase el documento WO 02/057478 desde
la página 3, línea 24 hasta la página 4, línea 4. Jespersen et
al., Eur. J. Biochem. 219, 365-373, 1994 dan a
conocer la formación de una isoforma de trisulfuro en la hormona del
crecimiento humana (hGH) recombinante y el uso de un compuesto de
mercapto, cisteína, para reducir los niveles de isoforma de
trisulfuro. El documento US 2001/005750 da a conocer la formación de
una isoforma de trisulfuro en la hormona del crecimiento humana
recombinante y una purificación usando cromatografía de interacción
hidrófoba (Hic).
\newpage
Sin embargo, las referencias indicadas
anteriormente no mencionan la prevención, inversión, reducción o
eliminación de la formación de impurezas de isoforma asociada a un
antagonista de la hormona del crecimiento tal como pegvisomant o su
parte proteica, B-2036. Por consiguiente, existe una
necesidad de procedimientos mejorados de preparación de
B-2036 que disminuyan, atenúen, eviten, minimicen,
inviertan y/o eliminen la formación de sus impurezas de isoforma de
trisulfuro.
La figura 1A representa la secuencia de
aminoácidos de B-2036 que corresponde a la SEC. ID.
NO. 1. Los asteriscos (*) en la figura 1A indican nueve (9) sitios
potenciales para la unión covalente de unidades de PEG a cada
molécula de B-2036. Obsérvese que aunque se
identifican nueve (9) posibles sitios, no tienen que estar
covalentemente unidos los 9 sitios a unidades de PEG.
Preferiblemente, hay 4-6 unidades de PEG por
molécula de B-2036.
La figura 1B representa la estructura de la
impureza de isoforma de trisulfuro de B-2036
(designada "trisulfuro (+32 amu")) en comparación con su forma
deseable (designada "GHA nativa").
En vista de la necesidad anterior de
proporcionar un procedimiento mejorado para preparar un antagonista
de la hormona del crecimiento recombinante, y/o un antagonista de
la hormona del crecimiento humana recombinante, con niveles
disminuidos de impurezas de isoforma no deseadas del mismo, la
presente invención se refiere a un procedimiento mejorado para
producir el polipéptido B-2036 antagonista de la
hormona del crecimiento recombinante con niveles disminuidos de
impurezas de isoforma de trisulfuro.
Con respecto al polipéptido
B-2036 antagonista de la hormona del crecimiento
recombinante, su impureza de isoforma de trisulfuro se disminuye
mediante el contacto suficiente entre la impureza de isoforma de
trisulfuro y (1) un agente quelante, o (2) un compuesto de mercapto
tras el contacto con un agente quelante pero en ausencia del agente
quelante, respectivamente.
Las expresiones "antagonista de la hormona del
crecimiento" y "antagonista del receptor de la hormona del
crecimiento" incluyen (pero no se limitan a) polipéptidos que
inhiben o antagonizan de otro modo la unión de la hormona del
crecimiento a su receptor de hormona del crecimiento para bloquear
el/los efecto(s) biológico(s) de la hormona del
crecimiento. En este caso, el "antagonista de la hormona del
crecimiento" o el "antagonista del receptor de la hormona del
crecimiento" es B-2036.
El término "y" puede significar "y" o
"o" según sea apropiado o necesario para referirse a un
procedimiento para proporcionar la disminución deseada en el nivel
de la impureza de trisulfuro.
El término "o" puede significar "y" o
"o" según sea apropiado o necesario para referirse a un
procedimiento para proporcionar la disminución deseada en el nivel
de la impureza de trisulfuro.
Tal como se usa en el presente documento, a
menos que se indique lo contrario, el término "disminuir" (o
variaciones evidentes del mismo) significa eliminar, minimizar,
reducir, evitar y/o atenuar la cantidad de la impureza de isoforma
de trisulfuro.
A menos que se indique lo contrario, la
expresión "célula huésped" (o variaciones evidentes de la
misma) se refiere a cualquier célula huésped en la que puede
formarse B-2036 recombinante. Por consiguiente, la
célula huésped puede ser una célula huésped de mamífero, una célula
huésped vegetal o una célula huésped microbiana tal como E.
coli o incluso células de levadura. Es importante indicar que la
célula huésped puede ser una que es suficiente para hacer crecer el
componente proteico B-2036 recombinante deseado en
la misma. Como tal, no hay ninguna limitación en cuanto a qué puede
ser la célula huésped, excepto que sea una que pueda producir de
manera recombinante el componente proteico
B-2036.
Además, tal como se usa en el presente
documento, a menos que se indique lo contrario, la expresión
"hacer crecer" (o variaciones evidentes del mismo, por
ejemplo, crecimiento) incluye, pero no se limita a, fermentar y
cultivar, o hacer de otro modo que la(s) célula(s)
huésped prolifere(n) suficientemente como para producir
cantidades deseadas del componente proteico B-2036
recombinante.
Además, la presente invención se describe con
respecto a B-2036 recombinante y PEG
B-2036 recombinante.
Pegvisomant (PEG B-2036) es la
forma pegilada de la proteína recombinante (B-2036)
producida en células huésped recombinantes (por ejemplo, células
huésped de E. coli modificadas genéticamente, recombinantes).
La proteína B-2036 se produce durante el
crecimiento celular (por ejemplo, mediante fermentación) y la
expresión (síntesis y secreción). Tras su producción,
B-2036 se aísla (por ejemplo, mediante
homogeneización) seguido de purificación (por ejemplo, mediante
extracción, centrifugación, cromatografía de intercambio aniónico y
de fase inversa, e intercambio de tampón). Sin embargo, tal como se
observa durante la producción recombinante de la proteína
B-2036, se forman impurezas de isoforma de
trisulfuro no deseadas de B-2036.
Tal como se indica, la figura 1A ilustra la
secuencia de aminoácidos de B-2036, indicando las
abreviaturas de 1 letra convencionales qué aminoácido está presente
en cada posición nombrada con letra. Para referencia, véase la
tabla 1 a continuación que indica la correspondencia entre la letra
y su aminoácido asociado.
\vskip1.000000\baselineskip
Adicionalmente, la secuencia de aminoácidos de
B-2036 se proporciona en el presente documento como
SEC. ID. NO. 1 y la secuencia de aminoácidos de hGH se proporciona
en el presente documento como SEC. ID. NO. 2.
Figura 1B ilustra la estructura de la secuencia
de aminoácidos de la impureza de isoforma de trisulfuro de
B-2036. En particular, la impureza de isoforma de
trisulfuro contiene un átomo de azufre adicional en el puente entre
las cisteínas en las posiciones 182 y 189 del componente proteico
B-2036.
Sin querer quedar adherido a la teoría, se cree
que el contacto entre compuesto(s) de mercapto seleccionados
y la impureza de isoforma de trisulfuro del antagonista de la
hormona del crecimiento recombinante B-2036 da como
resultado la conversión del puente de trisulfuro
cisteína-S-S-S-cisteína
de nuevo en su forma nativa
cisteína-S-S-cisteína.
Adicionalmente, sin querer restringirse tampoco a la teoría, es
posible que la presencia del/de los compuesto(s) de mercapto
evite la formación adicional del propio puente de trisulfuro.
Normalmente, el/los compuesto(s) de
mercapto se añade(n) a la(s) célula(s) huésped
que sintetizan el componente proteico B-2036
recombinante deseado durante o tras (o durante y tras) el
crecimiento de la(s) célula(s) huésped. Además, tras
haberse realizado las etapas de hacer crecer y de poner en contacto,
se prefiere purificar la proteína B-2036. Después,
se pegila preferiblemente la proteína purificada para proporcionar
PEG B-2036 (pegvisomant). Para procedimientos de
pegilación véase la patente estadounidense número 5.849.535.
Puede usarse cualquier compuesto de mercapto en
conexión con el procedimiento tal como se describe que, cuando se
pone en contacto (preferiblemente, con un mezclado adecuado) con el
componente proteico B-2036 junto con su impureza de
isoforma de trisulfuro, es uno que es suficiente para disminuir el
nivel de la impureza de isoforma de trisulfuro, preferiblemente sin
degradar (o degradar sustancialmente) el rendimiento de
B-2036. Los compuestos de mercapto preferidos
adecuados para su uso con el procedimiento tal como se describe
incluyen, pero no se limitan a, sulfitos, glutatión,
beta-mercaptoetanol, ditiotreitol,
mercaptoetilamina, ditioeritritol, clorhidrato de
tris-(2-carboxietil)-fosfina,
cisteína y cisteína en combinación con cistina.
Otros compuestos de mercapto adecuados para su
uso con el procedimiento tal como se describe se indican en las
siguientes referencias: (1) J. Houk y G.M. Whitesides,
"Structure-Reactivity Relations for
Tiol-Disulfide Interchange", J. M. Chem. Soc.,
109:6825-6836 (1987); (2) Sigmund, M., The Chemistry
& Biochemistry of the Sulfhydro Group in Amino Acids, Peptides
and Proteins, 1ª Ed. Pergamon, Nueva York (1973). En particular,
véase la tabla II de Houk et al. identificada en el punto (1)
anterior para un listado de compuestos de mercapto a modo de
ejemplo adecuados para su uso con la presente invención.
De los compuestos de mercapto adecuados,
cisteína o cisteína en combinación con cistina (cisteína
dimerizada), es lo más preferido. La cantidad de cisteína o
combinación de cisteína y cistina (cisteína dimerizada, si está
presente) que es adecuada para su uso con el procedimiento tal como
se describe debe ser cualquier cantidad que sea suficiente para
disminuir la impureza de isoforma de trisulfuro en al menos
aproximadamente el 10% de su concentración de equilibrio más
elevada (o su concentración de equilibrio promedio más elevada,
haciéndose el promedio de múltiples lotes) formada.
Preferiblemente, la disminución en la cantidad de la impureza de
isoforma de trisulfuro es al menos aproximadamente el 20%, 30%, 40%
o el 50%, respectivamente, de su concentración de equilibrio más
elevada (o su concentración de equilibrio promedio más elevada)
formada. La concentración combinada inicial de cisteína y cualquier
cistina adecuada para su uso con la presente invención es
preferiblemente al menos aproximadamente 0,1 mM, desde
aproximadamente 0,1 mM hasta aproximadamente 10 mM, o desde
aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 5 mM,
respectivamente.
Se prefiere proporcionar el compuesto de
mercapto en un tampón. Preferiblemente, el tampón es uno que es
adecuado para su uso con el procedimiento tal como se describe, es
decir, no evita la formación del componente proteico
B-2036 ni lo degrada una vez se ha formado. Los
tampones adecuados para su uso en conexión con la presente
invención incluyen, pero no se limitan a, Tris, fosfato, HEPES,
ácido cítrico, trietilamina e histidina. El tampón preferido es
Tris. La concentración de tampón inicial preferida es desde
aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 200 mM, más
preferiblemente desde aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 100
mM, incluso más preferiblemente desde aproximadamente 8 mM, hasta
aproximadamente 70 mM, y lo más preferiblemente desde
aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 50 mM. Pueden usarse
otros tampones adecuados. Preferiblemente, estos tampones son
suficiente para mantener el pH del medio de crecimiento en cualquier
punto del intervalo desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente
9, desde aproximadamente 7,5 hasta aproximadamente 8,5, o desde
aproximadamente 7,5 hasta aproximadamente 8,0, respectivamente.
Particularmente, cuando se usan concentraciones más elevadas de
compuesto de mercapto, pueden tolerarse niveles de pH más elevados,
por ejemplo, tan elevados como aproximadamente 9,5. Por tanto, por
ejemplo, si se usa un gran exceso de cisteína con respecto a
B-2036, entonces el pH del tampón puede ser tan
elevado como aproximadamente 9,5.
Tal como se indicó anteriormente, se prefiere
proporcionar el compuesto de mercapto en un tampón. Además, la
cantidad del compuesto de mercapto en el tampón debe ser tal que la
proporción molar de los moles de compuesto de mercapto con respecto
a los moles de proteína B-2036 es desde
aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 1.000. Esto es así
especialmente cuando el compuesto de mercapto que se usa es una
combinación de cisteína y, opcionalmente, cisteína en combinación
con cistina. Como alternativa, la proporción molar de los moles de
compuesto de mercapto con respecto a los moles de proteína
B-2036 puede ser desde aproximadamente 1 hasta
aproximadamente 1.000, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente
500, o desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10,
respectivamente.
Normalmente, tras haberse completado el contacto
suficiente (para disminuir el nivel de la impureza de isoforma de
trisulfuro) entre el compuesto de mercapto y el componente proteico
B-2036 (dentro de o a partir de la(s)
célula(s) huésped), el componente proteico
B-2036 en el tampón tiene una concentración desde
aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 30 mg/ml, desde
aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 20 mg/ml, o desde
aproximadamente 1 mg/ml hasta aproximadamente 10 mg/ml,
respectivamente.
Además, el intervalo de temperatura del medio de
crecimiento junto con el tampón, el/los compuesto(s) de
mercapto y su otro contenido incluyendo, pero sin limitarse a,
B-2036, debe mantenerse a una temperatura
preferiblemente desde aproximadamente 0ºC hasta aproximadamente
25ºC después de haberse añadido el compuesto de mercapto a
la(s) célula(s) huésped o lisado de la(s)
misma(s) que contiene el componente proteico
B-2036. También, preferiblemente, la temperatura de
la(s) célula(s) huésped y/o lisado de la(s)
misma(s) que contiene el componente B-2036 se
mantiene desde aproximadamente 1ºC hasta aproximadamente 15ºC,
desde aproximadamente 2ºC hasta aproximadamente 10ºC, o desde
aproximadamente 2ºC hasta aproximadamente 8ºC, respectivamente. Es
importante observar que la desnaturalización de la proteína
B-2036 se produce a aproximadamente +40ºC. Como tal,
es deseable mantener la temperatura del homogeneizado (es decir,
que contiene células huésped, medio de crecimiento, tampón,
compuestos de mercapto y B-2036, etc.) a una
temperatura por debajo de la temperatura de desnaturalización de la
proteína de B-2036.
Adicionalmente, el tiempo de contacto entre el
componente B-2036 y el compuesto de mercapto debe
ser durante un tiempo suficiente como para disminuir el nivel de la
impureza de isoforma de trisulfuro. Tiempos de contacto adecuados a
modo de ejemplo para disminuir el nivel de la impureza de isoforma
de trisulfuro deben ser durante al menos aproximadamente 30
minutos, desde aproximadamente 1 hora hasta aproximadamente 24
horas, o desde aproximadamente 1 hora hasta aproximadamente 4
horas, respectivamente.
Normalmente, tras el contacto suficiente entre
el/los compuesto(s) de mercapto y el componente
B-2036, el tampón que contiene los mismos tiene un
volumen desde aproximadamente 1 litro hasta aproximadamente 5.000
litros, desde aproximadamente 10 litros hasta aproximadamente 500
litros, o desde 100 litros hasta aproximadamente 300 litros,
respectivamente. Otros volúmenes a modo de ejemplo adecuados pueden
estar en cualquier punto desde 160 litros hasta aproximadamente 500
litros.
Otros parámetros que pueden ser de interés
durante el contacto entre el/los compuesto(s) de mercapto y
el componente B-2036 incluyen cosas tales como la
tasa de mezclado. La tasa de mezclado debe ser aquélla que es
suficiente para formar una mezcla homogénea (de la(s)
célula(s) huésped, lisado de la(s) misma(s),
tampón, compuesto(s) de mercapto, el componente
B-2036 y cualquier otro componente en un medio de
crecimiento) mientras que se minimiza la cantidad de espumación que
puede formarse. Los expertos habituales pueden determinar fácilmente
cuál debe ser una tasa de mezclado suficiente. Obviamente, la tasa
de mezclado debe ser tal que la temperatura se mantenga en los
intervalos indicados anteriormente y se minimice cualquier
degradación del componente proteico B-2036.
Sin querer quedar adherido a la teoría, se cree
que el contacto entre el/los agente(s) quelante(s)
seleccionado(s) y (1) la impureza de isoforma de trisulfuro,
(2) el antagonista de la hormona del crecimiento recombinante
B-2036, (3) componente(s) celular(es)
de célula huésped (para la producción recombinante del antagonista),
y (4) todas las combinaciones de (1) - (3) da como resultado la
conversión del puente de trisulfuro
cisteína-S-S-S-cisteína
de nuevo en su forma nativa
cisteína-S-S-cisteína
o la disminución de los niveles de la impureza. Adicionalmente,
también sin querer restringirse a la teoría, es posible que la
presencia del/de los agente(s) quelante(s) evite la
formación adicional del propio puente de trisulfuro.
El/los agente(s) quelante(s) se
añade(n) a la(s) célula(s) huésped que
sintetizan el componente proteico B-2036
recombinante deseado durante o tras (o durante y tras) el
crecimiento de la(s) célula(s) huésped, es decir, a
una pasta de células o un lisado celular. Además, tras haberse
realizado las etapas de hacer crecer y de poner en contacto, se
prefiere purificar la proteína B-2036. Después, se
pegila preferiblemente la proteína purificada para proporcionar PEG
B-2036 (pegvisomant). Para procedimientos de
pegilación véase la patente estadounidense número 5.849.535.
Según la presente invención, la etapa de
purificación (es decir la etapa (b) según la reivindicación 2) puede
comprender además la etapa de: (b') poner en contacto dicha
impureza con un compuesto de mercapto en ausencia de un agente
quelante. Dicho compuesto de mercapto se selecciona preferiblemente
del grupo constituido por sulfitos, glutatión,
beta-mercaptoetanol, ditiotreitol,
mercaptoetilamina, ditioeritritol, clorhidrato de
tris(2-carboxietil)fosfina, cisteína y
cisteína en combinación con cistina. Lo más preferiblemente, dicho
compuesto de mercapto es cisteína o una combinación de cisteína y
cistina. Dicho compuesto de mercapto se proporciona preferiblemente
en un segundo tampón. En este procedimiento, la concentración de
cisteína y cistina combinadas tiene preferiblemente una
concentración inicial desde aproximadamente 1 mM hasta
aproximadamente 5 mM. Además, dicho segundo tampón se selecciona
preferiblemente del grupo constituido por Tris, fosfato, HEPES,
ácido cítrico, trietilamina e histidina. Más preferiblemente, dicho
segundo tampón es Tris. Lo más preferiblemente, dicho tampón Tris
tiene una concentración inicial de Tris desde aproximadamente 1 mM
hasta aproximadamente 200 mM.
Puede usarse cualquier agente quelante en
conexión con la presente invención que, cuando se pone en contacto
(preferiblemente con el mezclado adecuado) con el componente
proteico B-2036 junto con su impureza de isoforma
de trisulfuro, es uno que es suficiente para disminuir el nivel de
la impureza de isoforma de trisulfuro, preferiblemente sin degradar
(o degradar sustancialmente) el rendimiento de
B-2036. Los agentes quelantes preferidos adecuados
para su uso con la presente invención incluyen, pero no se limitan
a, EDTA, EGTA y DTPA. Agentes quelantes adicionales a modo de
ejemplo incluyen, pero no se limitan a, deferoxamina, ditiocarbo
sódico, edetato cálcico disódico, edetato disódico, edetato sódico,
edetato trisódico, penicilamina, pentetato cálcico trisódico, Ácido
pentético, succímero y trientina. Obsérvese que edetato sódico es la
forma de sal de EDTA.
\newpage
Otros agentes quelantes adecuados para su uso
con la presente invención se indican en las siguientes referencias:
(1) The Merck Index, 12ª edición, S. Budavari (Editor), Merck &
Co., Inc., Therapeutic Category and Biological Activity Index, p.
THER-19 (en "CHELATING AGENT"), Whitehouse
Station, NJ (1996) y todas y cada una de las ediciones posteriores
hasta la fecha del mismo; (2) Remington's Pharmaceutical Sciences,
16ª Ed., Arthur Osol (Editor), Mack Publishing Co., Easton,
Pensilvania (1980) y todas y cada una de las ediciones posteriores
hasta la fecha del mismo; (3) The United States Pharmacopeia, 21ª
Revisión (16ª edición), United States Pharmacopeial Convention,
Inc., Rockville, Maryland (1985) y todas y cada una de las ediciones
posteriores hasta la fecha del mismo; (4) SIGMA, Biochemicals and
Reagents for Life Science Research Catalogue, St. Louis, Misuri
(2002-2003); y (5) Aldrich, Handbook of Fine
Chemicals and Laboratory Equipment, Milwaukee, Wisconsin, ediciones
(2000-2001) y (2002-2003) del
mismo.
De los agentes quelantes adecuados, EDTA es el
más preferido. La cantidad de agente quelante que es adecuada para
su uso con la presente invención debe ser aquella cantidad que es
suficiente para disminuir la impureza de isoforma de trisulfuro en
al menos aproximadamente el 10% de su concentración de equilibrio
más elevada (o su concentración de equilibro promedio más elevada,
haciéndose el promedio de múltiples lotes) formada.
Preferiblemente, la disminución en la cantidad de la impureza de
isoforma de trisulfuro es al menos aproximadamente el 20%, 30%, 40%
o el 50%, respectivamente, de su concentración de equilibrio más
elevada (o su concentración de equilibrio promedio más elevada)
formada. La concentración inicial de EDTA adecuada para su uso con
la presente invención es preferiblemente al menos aproximadamente
0,01 mM, desde aproximadamente 0,01 mM hasta aproximadamente 100
mM, desde aproximadamente 0,1 mM hasta aproximadamente 20 mM, desde
aproximadamente 2 mM hasta aproximadamente 10 mM o desde
aproximadamente 2 hasta aproximadamente 5 mM, respectivamente.
Se prefiere proporcionar el agente quelante en
un tampón. Preferiblemente, el tampón es uno que es adecuado para
su uso con la presente invención, es decir, no evita la formación
del componente proteico B-2036 ni lo degrada una
vez se ha formado. Los tampones adecuados para su uso en conexión
con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, Tris,
fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina e histidina. El tampón
preferido es Tris. La concentración inicial de tampón preferida es
desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 200 mM, más
preferiblemente desde aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 100
mM, incluso más preferiblemente desde aproximadamente 8 mM hasta
aproximadamente 70 mM, y lo más preferiblemente desde
aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 50 mM. Pueden usarse
otros tampones adecuados. Preferiblemente, estos tampones son
suficiente para mantener el pH tras la etapa de poner en contacto
(etapa (a) de la reivindicación 1) en el intervalo desde
aproximadamente 6 hasta aproximadamente 9, desde aproximadamente 6,5
hasta aproximadamente 7,5, o desde aproximadamente 7,2 hasta
aproximadamente 7,5, respectivamente.
Tal como se indicó anteriormente, se prefiere
proporcionar el agente quelante en un tampón. Además, la cantidad
del agente quelante en el tampón debe ser tal que la proporción de
los moles de agente quelante con respecto a los moles de proteína
B-2036 es desde 20 hasta 1.000.
Normalmente, tras haberse completado el contacto
suficiente (para disminuir el nivel de la impureza de isoforma de
trisulfuro) entre el agente quelante y el componente proteico
B-2036 (dentro de o a partir de la(s)
célula(s) huésped), el componente proteico
B-2036 en el tampón tiene una concentración desde
aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 20 mg/ml, desde
aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, o desde
aproximadamente 1 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml,
respectivamente.
Además, se mantiene una temperatura desde 0ºC
hasta 35ºC cuando el agente quelante se pone en contacto con la
pasta de células o el lisado celular que contiene el componente
proteico B-2036. También, preferiblemente, la
temperatura de la pasta de células y/o lisado celular de las mismas
que contiene el componente B-2036 se mantiene desde
aproximadamente 1ºC hasta aproximadamente 15ºC, desde
aproximadamente 2ºC hasta aproximadamente 10ºC, o, lo más
preferiblemente, desde aproximadamente 2ºC hasta aproximadamente
15ºC, respectivamente. Obsérvese que, preferiblemente, con la
adición del agente quelante (por ejemplo, EDTA), cuya temperatura es
de aproximadamente 4ºC, la temperatura del homogeneizado que
contiene el B-2036 aumenta hasta aproximadamente
30ºC con la homogenización. Es importante observar que la
desnaturalización de la proteína B-2036 se produce
aproximadamente a +40ºC. Como tal, es deseable mantener la
temperatura del homogeneizado (es decir, que contiene células
huésped, medio de crecimiento, tampón, agentes quelantes y
B-2036, etc.) a una temperatura por debajo de la
temperatura de desnaturalización de la proteína de
B-2036.
Adicionalmente, el tiempo de contacto entre el
componente B-2036 y el agente quelante debe ser
durante un tiempo suficiente para disminuir el nivel de la impureza
de isoforma de trisulfuro. Tiempos de contacto adecuados a modo de
ejemplo para disminuir el nivel de la impureza de isoforma de
trisulfuro deben ser durante al menos aproximadamente 30 minutos,
desde aproximadamente 1 hora hasta aproximadamente 48 horas, o desde
aproximadamente 5 horas hasta aproximadamente 15 horas,
respectivamente.
Normalmente, tras el contacto suficiente entre
el/los agente(s) quelante(s) y el componente
B-2036, el tampón que contiene los mismos tiene un
volumen desde aproximadamente 1 litro hasta aproximadamente 5.000
litros, desde aproximadamente 10 litros hasta aproximadamente 500
litros, o desde 100 litros hasta aproximadamente 300 litros,
respectivamente. Otros volúmenes a modo de ejemplo adecuados pueden
estar en cualquier punto desde 160 litros hasta aproximadamente 500
litros.
\newpage
Otros parámetros que pueden ser de interés
durante el contacto entre el/los agente(s)
quelante(s) y el componente B-2036 incluyen
cosas tales como la tasa de mezclado. La tasa de mezclado debe ser
aquélla que es suficiente para formar una mezcla homogénea (de
la(s) célula(s) huésped, lisado de la(s)
misma(s), tampón, agente(s) quelante(s), el
componente B-2036 y cualquier otro componente en el
medio de crecimiento) mientras que se minimiza la cantidad de
espumación que puede formarse. Los expertos habituales pueden
determinar fácilmente cuál debe ser una tasa de mezclado
suficiente. Obviamente, la tasa de mezclado debe ser tal que la
temperatura se mantenga en los intervalos indicados anteriormente y
se minimice cualquier degradación del componente proteico
B-2036.
- 1.
- Un procedimiento para disminuir la cantidad de una impureza de isoforma de trisulfuro producida en la producción recombinante del polipéptido B-2036 antagonista de la hormona del crecimiento de SEC. ID. NO. 1 en células huésped modificadas genéticamente que contienen compuesto(s) celular(es), comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) poner en contacto un agente quelante con una pasta de células o un lisado de pasta de células que comprende (1) dicha impureza, (2) dicho polipéptido antagonista de la hormona del crecimiento, (3) dicho(s) compuesto(s) celular(es) y (4) combinaciones de los mismos para disminuir la cantidad de dicha impureza, en el que la proporción de los moles de dicho agente quelante con respecto a los moles de dicho polipéptido antagonista de la hormona del crecimiento es desde 20 hasta 1.000 y la temperatura se mantiene desde 0ºC hasta 35ºC.
- 2.
- El procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además la etapa de: (b) purificar dicho polipéptido para proporcionar un polipéptido purificado.
- 3.
- El procedimiento según la reivindicación 2, que comprende además la etapa de: (c) pegilar dicho polipéptido purificado.
- 4.
- El procedimiento según la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que dicho agente quelante se selecciona del grupo constituido por EDTA, EGTA y DTPA.
- 5.
- El procedimiento según la reivindicación 4, en el que dicho agente quelante es EDTA.
- 6.
- El procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho agente quelante se proporciona en un tampón.
- 7.
- El procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicho EDTA tiene una concentración inicial desde aproximadamente 2 mM hasta aproximadamente 10 mM.
- 8.
- El procedimiento según la reivindicación 6, en el que dicho tampón se selecciona del grupo constituido por Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina e histidina.
- 9.
- El procedimiento según la reivindicación 8, en el que dicho tampón es Tris.
- 10.
- El procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicho tampón Tris tiene una concentración inicial de Tris desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 200 mM.
- 11.
- El procedimiento según una de las reivindicaciones 6 a 10, en el que tras dicha etapa (a) de poner en contacto, dicho tampón tiene un pH desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 9.
- 12.
- El procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicha temperatura es desde aproximadamente 2ºC hasta aproximadamente 15ºC.
- 13.
- El procedimiento según la reivindicación 2, en el que la etapa (b) de purificación comprende además la etapa de: (b') poner en contacto dicha impureza con un compuesto de mercapto en ausencia de un agente quelante.
- 14.
- El procedimiento según la reivindicación 13, en el que dicho compuesto de mercapto se selecciona del grupo constituido por sulfitos, glutatión, beta-mercaptoetanol, ditiotreitol, mercaptoetilamina, ditioeritritol, clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina, cisteína y cisteína en combinación con cistina.
- 15.
- El procedimiento según la reivindicación 14, en el que dicho compuesto de mercapto es cisteína o una combinación de cisteína y cistina.
- 16.
- El procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 15, en el que dicho compuesto de mercapto se proporciona en un segundo tampón.
- 17.
- El procedimiento según la reivindicación 15, en el que la concentración de cisteína y cistina combinadas tiene una concentración inicial desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 5 mM.
- 18.
- El procedimiento según la reivindicación 16, en el que dicho segundo tampón se selecciona del grupo constituido por Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina e histidina.
- 19.
- El procedimiento según la reivindicación 18, en el que dicho segundo tampón es Tris.
- 20.
- El procedimiento según la reivindicación 19, en el que dicho tampón Tris tiene una concentración inicial de Tris desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 200 mM.
Lo que sigue se presenta a modo de ejemplo y no
debe interpretarse como una limitación del alcance de la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se logró la reducción del nivel de
B-2036-trisulfuro usando el
concentrado 1 (véase el diagrama de flujo 1 a continuación) en el
procedimiento de purificación de B-2036. Se llevó a
cabo la fermentación de E. coli recombinante que expresaba
B-2036 tal como se describe por Cunningham et
al. en la patente estadounidense número 5.849.535. Se llevaron
a cabo las etapas de extracción y purificación iniciales (todas las
etapas realizadas antes de obtener el concentrado 1 en el diagrama
de flujo 1 a continuación, por ejemplo, todas, resuspensión y
homogenización, extracción de dos fases, cromatografía de fase
inversa y cromatografía de intercambio aniónico) tal como se
describe en el diagrama de flujo 1 adjunto. Tras la primera etapa de
ultrafiltración/diafiltración, el producto estaba presente en
tampón HEPES 25 mM, pH 7,0 (\sim150 l) a una concentración de
proteína de 3,7 g/l. Se enfrió la temperatura de la disolución del
producto hasta 2 a 8ºC y se trató con una adición de 1/10 del
volumen (\sim15 l) de tampón Tris 200 mM, cisteína 20 mM, pH 8,0
recién preparado que se había enfriado hasta 2 a 8ºC. Se mantuvo la
disolución de B-2036/cisteína a 2 a 8ºC y se mezcló
durante 174 minutos. Entonces se concentró la mezcla hasta 131 l
usando membranas de ultrafiltración Biomax 5 de Millipore y se
sometió a diafiltración frente a un volumen 6X de HEPES 25 mM, pH
7,0. Entonces se llevó el producto resultante a través del resto
del procedimiento de purificación de B-2036 tal como
se describe en el diagrama de flujo 1 a continuación.
Antes de la incubación con cisteína, se midió
que el nivel de B-2036/trisulfuro era del 3,7 por
ciento del área. Inmediatamente tras la incubación con cisteína, su
nivel descendió hasta el 2,0 por ciento del área (disminución de
aproximadamente el 46%).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Con respecto al diagrama de flujo 1, se
añadieron 165 kg de pasta de células de pasta de células de GHA
congelada a \sim1013 litros de Tris 150 mM, EDTA 5 mM, pH 7,2.
Cuando la pasta de células había acabado de descongelarse
(determinado mediante lecturas de A_{550} estables) se hizo pasar
la mezcla a través de un homogeneizador Niro a 950 +/- 50 Bar a un
caudal nominal de 250 l/hora. Se recogió el homogeneizado en un
tanque en el que se mantuvo la temperatura entre 24ºC y 33ºC. Se
añadieron sulfato de amonio y PEG-4600 a la mezcla
de lisado formando una concentración del 10% (p/p) de ambos
compuestos. Se mezcló la mezcla de dos fases resultante durante
60-120 minutos y entonces se resolvieron estas fases
haciendo pasar la disolución a través de una centrífuga de
líquido/líquido que descarga los sólidos. La fase superior contenía
el producto deseado y se recogió y filtró a través de un tren de
filtración constituido por un filtro de "deslipidación", filtro
de "profundidad" y un filtro de 0,2 \mum. Se recogió el
filtrado en tres recipientes separados y se analizaron muestras de
cada uno para detectar
B-2036-trisulfuro. Los niveles
oscilaban entre el 3,1 y el 3,8 por ciento del área. Entonces se
procesó el material resultante para obtener producto intermedio a
granel usando el procedimiento resumido en el diagrama de flujo del
ejemplo nº 1.
Por comparación, las muestras de lotes
procesados mediante el procedimiento indicado anteriormente (pero
sin el componente EDTA (agente quelante) en el tampón de lisis y
sin tratamiento con cisteína del concentrado 1) proporcionaron un
nivel de trisulfuro (n=10) que oscilaba entre el 3,2 y el 6,4 por
ciento del área con una media de 5,1 al final de todo el
procedimiento del diagrama de flujo 1 anterior. Cuando se incluyó
EDTA en el tampón de lisis, y se realizó la etapa de incubación con
cisteína del concentrado 1, el nivel de trisulfuro al final de todo
el procedimiento del diagrama de flujo 1 fue del 1,5% por ciento del
área.
<110> Lyle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para la preparación de
hormona del crecimiento humana y antagonista de la misma que tiene
niveles inferiores de impurezas de isoforma
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 161765.00520
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> Documento US 60/406.553
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
28-08-2002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 191
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 191
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (20)
1. Un procedimiento para disminuir la cantidad
de una impureza de isoforma de trisulfuro producida en la producción
recombinante del polipéptido B-2036 antagonista de
la hormona del crecimiento de SEC. ID. NO. 1 en células huésped
modificadas genéticamente que contienen compuesto(s)
celular(es), comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(a) poner en contacto un agente quelante con una pasta de células o
un lisado de pasta de células que comprende (1) dicha impureza, (2)
dicho polipéptido antagonista de la hormona del crecimiento, (3)
dicho(s) compuesto(s) celular(es) para
disminuir la cantidad de dicha impureza, en el que la proporción de
los moles de dicho agente quelante con respecto a los moles de
dicho polipéptido antagonista de la hormona del crecimiento es
desde 20 hasta 1.000 y la temperatura se mantiene desde 0ºC hasta
35ºC.
2. El procedimiento según la reivindicación 1,
que comprende además la etapa de: (b) purificar dicho polipéptido
para proporcionar un polipéptido purificado.
3. El procedimiento según la reivindicación 2,
que comprende además la etapa de: (c) pegilar dicho polipéptido
purificado.
4. El procedimiento según la reivindicación 1, 2
ó 3, en el que dicho agente quelante se selecciona del grupo
constituido por EDTA, EGTA y DTPA.
5. El procedimiento según la reivindicación 4,
en el que dicho agente quelante es EDTA.
6. El procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho agente quelante se
proporciona en un tampón.
7. El procedimiento según la reivindicación 5,
en el que dicho EDTA tiene una concentración inicial desde
aproximadamente 2 mM hasta aproximadamente 10 mM.
8. El procedimiento según la reivindicación 6,
en el que dicho tampón se selecciona del grupo constituido por
Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina e histidina.
9. El procedimiento según la reivindicación 8,
en el que dicho tampón es Tris.
10. El procedimiento según la reivindicación 9,
en el que dicho tampón Tris tiene una concentración inicial de Tris
desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 200 mM.
11. El procedimiento según una de las
reivindicaciones 6 a 10, en el que tras dicha etapa (a) de poner en
contacto, dicho tampón tiene un pH desde aproximadamente 6 hasta
aproximadamente 9.
12. El procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que dicha temperatura es desde
aproximadamente 2ºC hasta aproximadamente 15ºC.
13. El procedimiento según la reivindicación 2,
en el que la etapa (b) de purificación comprende además la etapa
de: (b') poner en contacto dicha impureza con un compuesto de
mercapto en ausencia de un agente quelante.
14. El procedimiento según la reivindicación 13,
en el que dicho compuesto de mercapto se selecciona del grupo
constituido por sulfitos, glutatión,
beta-mercaptoetanol, ditiotreitol,
mercaptoetilamina, ditioeritritol, clorhidrato de
tris(2-carboxietil)fosfina, cisteína y
cisteína en combinación con cistina.
15. El procedimiento según la reivindicación 14,
en el que dicho compuesto de mercapto es cisteína o una combinación
de cisteína y cistina.
16. El procedimiento según una de las
reivindicaciones 13 a 15, en el que dicho compuesto de mercapto se
proporciona en un segundo tampón.
17. El procedimiento según la reivindicación 15,
en el que la concentración de cisteína y cistina combinadas tiene
una concentración inicial desde aproximadamente 1 mM hasta
aproximadamente 5 mM.
18. El procedimiento según la reivindicación 16,
en el que dicho segundo tampón se selecciona del grupo constituido
por Tris, fosfato, HEPES, ácido cítrico, trietilamina e
histidina.
19. El procedimiento según la reivindicación 18,
en el que dicho segundo tampón es Tris.
20. El procedimiento según la reivindicación 19,
en el que dicho tampón Tris tiene una concentración inicial de Tris
desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 200 mM.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US40655302P | 2002-08-28 | 2002-08-28 | |
| US406553P | 2002-08-28 | ||
| US646798 | 2003-08-25 | ||
| US10/646,798 US20040048315A1 (en) | 2002-08-28 | 2003-08-25 | Method for the preparation of growth hormone and antagonist thereof having lower levels of isoform impurities thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2323586T3 true ES2323586T3 (es) | 2009-07-21 |
Family
ID=31997673
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES03799266T Expired - Lifetime ES2323586T3 (es) | 2002-08-28 | 2003-08-26 | Procedimiento de preparacion de hormona del crecimiento y antagonista de la misma que tiene niveles inferiores de impurezas de isoformas. |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20040048315A1 (es) |
| EP (1) | EP1546185B1 (es) |
| JP (1) | JP4312154B2 (es) |
| KR (1) | KR101176588B1 (es) |
| AT (1) | ATE428721T1 (es) |
| AU (1) | AU2003260045B2 (es) |
| BR (1) | BRPI0313829B1 (es) |
| CA (1) | CA2497146C (es) |
| CY (1) | CY1109167T1 (es) |
| DE (1) | DE60327228D1 (es) |
| DK (1) | DK1546185T3 (es) |
| ES (1) | ES2323586T3 (es) |
| IL (1) | IL167121A (es) |
| MX (1) | MXPA05002359A (es) |
| PL (1) | PL211502B1 (es) |
| PT (1) | PT1546185E (es) |
| RU (1) | RU2337920C2 (es) |
| SI (1) | SI1546185T1 (es) |
| TW (2) | TWI289603B (es) |
| WO (1) | WO2004031213A1 (es) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040048315A1 (en) | 2002-08-28 | 2004-03-11 | Pharmacia Corporation | Method for the preparation of growth hormone and antagonist thereof having lower levels of isoform impurities thereof |
| ATE463503T1 (de) * | 2004-12-29 | 2010-04-15 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Verfahren zur verhinderung der bildung von trisulfidderivaten von polypeptiden |
| EP2483289B2 (en) | 2009-10-02 | 2025-03-26 | Biogen MA Inc. | Methods of preventing and removing trisulfide bonds |
| WO2011073235A1 (en) * | 2009-12-18 | 2011-06-23 | Csl Ltd. | Method of purifying polypeptides |
| WO2012158551A1 (en) | 2011-05-13 | 2012-11-22 | Biogen Idec Ma Inc. | Methods of preventing and removing trisulfide bonds |
| JP6116565B2 (ja) * | 2011-08-25 | 2017-04-19 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | 陽イオンおよび陰イオン交換クロマトグラフィー法 |
| SG11201700365TA (en) | 2014-07-24 | 2017-02-27 | Genentech Inc | Methods of conjugating an agent to a thiol moiety in a protein that contains at least one trisulfide bond |
| IL314040A (en) * | 2016-05-10 | 2024-09-01 | Genentech Inc | Methods of decreasing trisulfide bonds during recombinant production of polypeptides |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5153265A (en) | 1988-01-20 | 1992-10-06 | Cetus Corporation | Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1 |
| US5969109A (en) | 1990-02-28 | 1999-10-19 | Bona; Constantin | Chimeric antibodies comprising antigen binding sites and B and T cell epitopes |
| DK44593D0 (da) * | 1993-04-20 | 1993-04-20 | Novo Nordisk As | Fremgangsmaade til fremstilling af et polypeptid |
| ZA955789B (en) * | 1994-07-15 | 1996-03-11 | Novo Nordisk As | A method of converting a hydrophobic derivative of a polypeptide into the native form |
| DK0851925T3 (da) * | 1995-09-21 | 2005-11-28 | Genentech Inc | Humane Væksthormonvarianter |
| SE9802454D0 (sv) * | 1998-07-08 | 1998-07-08 | Pharmacia & Upjohn Ab | Production of peptides |
| AR026743A1 (es) * | 1999-12-09 | 2003-02-26 | Pharmacia Ab | Produccion de peptidos |
| US7229789B1 (en) | 2001-01-19 | 2007-06-12 | N.V. Organon | Methods and compositions for extracting proteins from cells |
| US20040048315A1 (en) | 2002-08-28 | 2004-03-11 | Pharmacia Corporation | Method for the preparation of growth hormone and antagonist thereof having lower levels of isoform impurities thereof |
| US7470779B2 (en) * | 2002-09-20 | 2008-12-30 | Pfizer Inc. | Process for decreasing aggregate levels of pegylated protein |
-
2003
- 2003-08-25 US US10/646,798 patent/US20040048315A1/en not_active Abandoned
- 2003-08-26 JP JP2004541486A patent/JP4312154B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2003-08-26 AU AU2003260045A patent/AU2003260045B2/en not_active Expired
- 2003-08-26 RU RU2005109388/13A patent/RU2337920C2/ru active
- 2003-08-26 PL PL374917A patent/PL211502B1/pl unknown
- 2003-08-26 CA CA2497146A patent/CA2497146C/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-08-26 EP EP03799266A patent/EP1546185B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-08-26 AT AT03799266T patent/ATE428721T1/de active
- 2003-08-26 PT PT03799266T patent/PT1546185E/pt unknown
- 2003-08-26 WO PCT/US2003/026498 patent/WO2004031213A1/en not_active Ceased
- 2003-08-26 DK DK03799266T patent/DK1546185T3/da active
- 2003-08-26 SI SI200331584T patent/SI1546185T1/sl unknown
- 2003-08-26 KR KR1020057003458A patent/KR101176588B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2003-08-26 BR BRPI0313829-1A patent/BRPI0313829B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2003-08-26 DE DE60327228T patent/DE60327228D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-08-26 ES ES03799266T patent/ES2323586T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-08-26 MX MXPA05002359A patent/MXPA05002359A/es active IP Right Grant
- 2003-08-28 TW TW092123686A patent/TWI289603B/zh not_active IP Right Cessation
- 2003-08-28 TW TW095130368A patent/TW200700553A/zh unknown
-
2005
- 2005-02-27 IL IL167121A patent/IL167121A/en unknown
-
2009
- 2009-03-17 US US12/405,857 patent/US8148331B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2009-06-24 CY CY20091100660T patent/CY1109167T1/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW200407428A (en) | 2004-05-16 |
| TW200700553A (en) | 2007-01-01 |
| SI1546185T1 (sl) | 2009-08-31 |
| EP1546185A1 (en) | 2005-06-29 |
| RU2337920C2 (ru) | 2008-11-10 |
| US8148331B2 (en) | 2012-04-03 |
| CA2497146C (en) | 2012-05-22 |
| JP2006517091A (ja) | 2006-07-20 |
| KR20050059163A (ko) | 2005-06-17 |
| PL211502B1 (pl) | 2012-05-31 |
| PL374917A1 (en) | 2005-11-14 |
| RU2005109388A (ru) | 2005-10-27 |
| US20100021966A1 (en) | 2010-01-28 |
| CY1109167T1 (el) | 2014-07-02 |
| CA2497146A1 (en) | 2004-04-15 |
| IL167121A (en) | 2010-11-30 |
| US20040048315A1 (en) | 2004-03-11 |
| JP4312154B2 (ja) | 2009-08-12 |
| HK1077074A1 (en) | 2006-02-03 |
| PT1546185E (pt) | 2009-07-14 |
| WO2004031213A1 (en) | 2004-04-15 |
| AU2003260045A1 (en) | 2004-04-23 |
| EP1546185B1 (en) | 2009-04-15 |
| ATE428721T1 (de) | 2009-05-15 |
| BRPI0313829B1 (pt) | 2021-10-26 |
| BR0313829A (pt) | 2005-07-26 |
| DE60327228D1 (de) | 2009-05-28 |
| AU2003260045B2 (en) | 2010-01-07 |
| DK1546185T3 (da) | 2009-06-22 |
| TWI289603B (en) | 2007-11-11 |
| KR101176588B1 (ko) | 2012-08-23 |
| MXPA05002359A (es) | 2005-07-15 |
| EP1546185A4 (en) | 2006-09-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8148331B2 (en) | Method for the preparation of growth hormone and antagonist thereof having lower levels of isoform impurities thereof | |
| ES2288151T3 (es) | Nuevos peptidos. | |
| ES2334127T3 (es) | Produccion de il-21 en huespedes procariotas. | |
| US7470779B2 (en) | Process for decreasing aggregate levels of pegylated protein | |
| ES2542202T3 (es) | Compuestos de hormonas de crecimiento estables | |
| AU777974B2 (en) | Methods for protein purification using aqueous two-phase extraction | |
| CN102131825A (zh) | 具有延长的循环半衰期的n-糖基化的人生长激素 | |
| CA2663416A1 (en) | High pressure treatment of proteins for reduced immunogenicity | |
| WO2016102580A1 (en) | Alpha-1-antitrypsin (a1at) fusion proteins and uses thereof | |
| ES2337041T3 (es) | Procedimiento para disminuir los niveles de agregacion de proteina pegilada. | |
| ES2208416T3 (es) | Plegado de proteinas de membrana utilizando dos detergentes diferentes. | |
| WO2006084888A2 (en) | C-terminally pegylated growth hormones | |
| Graber et al. | Purification, characterisation and crystallisation of selenomethionyl recombinant human interleukin‐5 from Escherichia coli | |
| HK1077074B (en) | Method for the preparation of growth hormone and antagonist thereof having lower levels of isoform impurities thereof | |
| US5663305A (en) | Somatotropin analogs | |
| ZA200501841B (en) | Method for the preparation of growth hormone and antagonist thereof having lower levels of isoform impurities thereof |