ES2323772T3 - Anticuerpos inhibidores de la actividad de her3. - Google Patents
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Abstract
Una composición farmacéutica que comprende como agente activo un inhibidor de la actividad de HER3 y vehículos, diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables, en donde la fijación de dicho inhibidor a HER3 reduce la transducción de señales mediada por HER3, en donde dicha reducción de la transducción de señales está causada por una regulación decreciente de HER3, que da como resultado una desaparición al menos parcial de moléculas HER3 de la superficie celular, en donde dicho inhibidor es un anticuerpo anti-HER3.
Description
Anticuerpos inhibidores de la actividad de
HER3.
La presente invención se refiere a una
composición farmacéutica que comprende como agente activo un
inhibidor de la actividad de HER3, a saber un anticuerpo
anti-HER3. Adicionalmente, se describe el uso de
esta composición para el diagnóstico, prevención o tratamiento de
enfermedades hiperproliferativas, particularmente enfermedades
tumorales.
Se sabe que las proteínas
tirosina-quinasas son enzimas que median procesos de
transducción de señales que regulan el crecimiento y la
diferenciación celular. Las proteínas
tirosina-quinasas receptoras actúan por la vía de
la fosforilación de la tirosina de sustratos estimulada por
ligandos. HER3 (denominado también ErbB3) es un miembro de la
subfamilia de receptores de factores de crecimiento epidérmico
(EGFR) de protein-tirosinaquinasas receptoras
(Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87 (1990),
4905-4909; Kraus et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 86 (1989), 9193-9197 y Kraus et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (1993),
2900-2904).
Se ha encontrado que HER3 está sobreexpresado en
varios tipos de cáncer tales como los cánceres de mama,
gastrointestinales y pancreáticos. Cuando HER3 se coexpresa con
HER2, otro miembro de la subfamilia EGFR de
protein-tirosina-quinasas
receptoras, se forma un complejo de señalización heterodímero
activo.
Un anticuerpo monoclonal contra HER3 (Rajkumar
et al., Br. J. Cancer 70 (1994), 459-456)
tenía un efecto agonista sobre el crecimiento independiente del
anclaje de líneas de células que expresan HER3. Por otra parte, se
ha informado que anticuerpos anti-HER3 descritos en
la Patente U.S. 5.968.511 (correspondiente a WO 97/35885) reducen
la formación, inducida por Heregulina de heterodímeros HER2/HER3.
Dicha actividad, sin embargo, está demostrada únicamente para un
anticuerpo que aumenta la fijación de Heregulina a HER3. Por tanto,
no está claro qué tipo de anticuerpo anti-HER3 - en
su caso - tiene potencial para ser utilizado para aplicaciones
terapéuticas.
Vadlamudi et al. (Oncogenes 18 (1999),
305-314) describen la regulación del camino de la
ciclooxigenasa (COX-2) por el receptor HER2. Se
encontró que un inhibidor específico de COX-2 puede
reprimir la acción mitógena e invasiva de las células del cáncer
colorrectal. Adicionalmente, se encontró que la incubación con un
anticuerpo monoclonal anti-HER3 conduce a una
reducción en los niveles de heterodímeros HER2/HER3, pero da como
resultado una reducción solamente parcial de la expresión de
COX-2.
WO 00/31048 describe un derivado de quinazolina
que actúa como inhibidor de tirosina-quinasas
receptoras tales como EGFR, HER2 y HER4. Sin embargo, no se
describe inhibición de HER3.
WO 00/78347 describe métodos para detener o
inhibir el crecimiento celular, que comprenden la prevención o
reducción de la formación de heterodímeros
ErbB-2/ErbB-3. Por ejemplo, el
agente puede ser una combinación de un anticuerpo del dominio
extracelular anti-HER2 y un anticuerpo
anti-HER3, v.g. el anticuerpo de HER3 H3.105.5
adquirido de NeoMarkers. Sin embargo, no está claro qué tipo de
anticuerpo anti-HER3 se requiere para obtener
efectos terapéuticos deseables.
La Patente U.S. 5.804.396 describe un método
para identificar un agente para el tratamiento de un trastorno
proliferativo, que comprende los pasos de ensayar un agente
potencial respecto a actividad en la inhibición de la transducción
de señales por un heterodímero HER2/HER3 o HER2-HER4
o HER3/HER4. No se describen inhibidores específicos de HER3.
Los autores de la presente invención han
comparado las propiedades biológicas de la Herceptina, un anticuerpo
monoclonal agonista contra HER2 con anticuerpos HER3, a saber (i)
\alpha-HER3-ECD, un anticuerpo
monoclonal murino IgG1, Upstate Biotechnology, Cat. No.
#05-471, dirigido contra el sitio de fijación de
Heregulina de HER3, (ii) anticuerpo 1B4C3 del laboratorio de los
inventores, y (iii) anticuerpo 2D102 también del laboratorio de los
autores de la presente invención, en líneas de células de cáncer de
mama invasivas MCR-7 (DKFZ, Heidelberg),
MDA-MB-468 (ATCC
HTB-132) y
MDA-MB-231 (ATCC
HTB-26) que expresan relaciones HER2:HER3
diferentes. Los inventores proporcionan evidencia de que el
pretratamiento de las líneas de células del cáncer de mama con
anticuerpo anti-HER3 antes de la estimulación con
\alpha/\beta-Heregulina
(\alpha/\beta-HRG) disminuía el contenido de
fosforilación de la tirosina de HER2/HER3 en contraste con la
herceptina. Adicionalmente, el anticuerpo anti-HER3
anulaba la heterodimerización de HER2/HER3 y reducía también la
formación de complejo de la subunidad p85 de la quinasa PI_{3} y
la proteína adaptadora SHC con HER3, dando como resultado actividad
reducida de quinasa PI_{3} y de la quinasa terminal
c-jun (JNK), respectivamente. En comparación con
herceptina, el anticuerpo anti-HER3 era capaz
también de regular en sentido decreciente la quinasa 2 extracelular
regulada por señales (ERK2) después de estimulación con
\alpha/\beta-HRG. Adicionalmente, los inventores
han demostrado una reducción significativa de la propiedad
migratoria y proliferativa de las líneas de células de cáncer de
mama después de pretratamiento con anticuerpo
anti-HER3. Los datos que poseen los inventores
demuestran claramente que un anticuerpo anti-HER3
es más potente en lo que respecta a la disminución de los procesos
de transducción de señales después de estimulación con HRG que la
herceptina. Adicionalmente, en tipos específicos de cáncer, v.g. el
melanoma, los anticuerpos anti-HER3 son eficaces
para reducir las propiedades migratorias y proliferativas, mientras
que los anticuerpos anti-HER2 no exhiben efecto
significativo alguno. Estos datos demuestran el gran potencial de
los anticuerpos anti-HER3 u otros inhibidores de
HER3 para la terapia del cáncer de mama y otras enfermedades
malignas caracterizadas por hiperseñalización a través de HER3 y sus
socios de heterodimerización.
Por tanto, la presente invención se refiere a
una composición farmacéutica que comprende como agente activo un
inhibidor de la actividad de HER3 y vehículos, diluyentes y/o
adyuvantes farmacéuticamente aceptables, en donde la fijación de
dicho inhibidor a HER3 reduce la transducción de las señales
mediadas por HER3, en donde dicha reducción de la transducción de
señales está causada por una regulación decreciente de HER3, que da
como resultado una desaparición al menos parcial de moléculas HER3
de la superficie celular, en donde dicho inhibidor es un anticuerpo
anti-HER3. El inhibidor de HER3 de la invención se
caracteriza porque la fijación del inhibidor a HER3 reduce la
transducción de las señales mediadas por HER3. De acuerdo con la
invención, la reducción de la transducción de las señales mediadas
por HER3 está causada por una regulación decreciente de HER3 que da
como resultado una desaparición al menos parcial de moléculas de
HER3 de la superficie celular. Para comparación, se hace referencia
a la reducción de la transducción de señales mediadas por HER3 que
está causada por una estabilización de HER3 en la superficie
celular en un forma sustancialmente inactiva, es decir una forma
que exhibe una transducción de señales menor comparada con la forma
no estabilizada, lo que está causado también por un anticuerpo
anti-HER3. Sin embargo, de acuerdo con la presente
invención, la reducción de la transducción de señales mediadas por
HER3 está causada como se define en la reivindicación 1.
El inhibidor de la invención puede influir en la
fijación de Heregulina a HER3, particularmente por disminución de
la fijación de Heregulina a HER3. En otras realizaciones, sin
embargo, el inhibidor puede no competir con la fijación de
Heregulina a HER3.
El inhibidor es un anticuerpo
anti-HER3. Preferiblemente, el anticuerpo está
dirigido contra el dominio extracelular de HER3.
De acuerdo con la invención, el término
"anticuerpo" abarca anticuerpos monoclonales, anticuerpos
policlonales, anticuerpos multiespecíficos (v.g. anticuerpos
biespecíficos) formados por al menos dos anticuerpos y fragmentos
de anticuerpos con tal que los mismos exhiban la actividad
deseada.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal
que puede obtenerse por el método del hibridoma como ha sido
descrito por Köhler et al. (Nature 256 (1975), 495) o por
métodos de DNA recombinante (véase v.g. la Patente U.S. 4.816.567).
Pueden aislarse también anticuerpos monoclonales a partir de
bibliotecas de anticuerpos de fago utilizando técnicas describas en
Clackson et al. (Nature 352 (1991), 624-628)
y Marks et al. (J. Mol. Biol. 222 (1991),
581-597). El anticuerpo puede ser un IgM, IgG, v.g.
IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4,
Los fragmentos de anticuerpo comprenden una
porción de un anticuerpo, generalmente la región de fijación de
antígeno o región variable del anticuerpo intacto. Ejemplos de
fragmentos de anticuerpo incluyen Fab, Fab', F(ab')_{2} y
fragmentos Fv, diacuerpos, moléculas de anticuerpo monocatenarias y
fragmentos de anticuerpos multiespecíficos.
Particularmente, el anticuerpo puede ser un
anticuerpo recombinante o un fragmento de anticuerpo, seleccionado
más particularmente de anticuerpos quiméricos o fragmentos de los
mismos (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81
(1984), 6851-6855), anticuerpos humanizados (Jones
et al., Nature 321 (1986), 522-525; Riechmann
et al., Nature 332 (1988), 323-329 y Presta,
Curr. Op. Struct. Biol. 2 (1992), 593-596),
anticuerpos Fv monocatenarios (Plücktuhn en: The Pharmacology of
Monoclonal Antibodies 113, Rosenburg y Moore, EDS, Springer Verlag,
N.Y. (1994), pp. 269-315) y diacuerpos (Hollinger
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (1993),
6444-6448).
En una realización especialmente preferida, el
anticuerpo es el anticuerpo 1B4C3 (IgG2a) producido por la línea de
células de hibridoma DSM ACC 2527, fragmentos de los mismos o
derivados recombinantes de los mismos. 1B4C3 es un anticuerpo que
conduce a internalización de HER3. Un anticuerpo
anti-HER3 adicional, 2D1D12, que se presenta
únicamente para comparación, es un anticuerpo que conduce a
estabilización de HER3. 2D1D12 es producido por la línea de células
de hibridoma DSM ACC 2517. Se prefieren adicionalmente anticuerpos,
v.g. anticuerpos quiméricos o humanizados o fragmentos de los
mismos, que tienen sustancialmente la misma actividad biológica
(v.g. como se describe en los Ejemplos) comparada con el anticuerpo
producido por la línea de células de hibridoma depositada, por
ejemplo, por fijación al mismo epítope en HER3. La línea de células
de hibridoma DSM ACC 2517 fue depositada bajo el Tratado de
Budapest para el Depósito de Microorganismos el 24 de julio de 2001
en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
(DSMZ), Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Alemania. La línea
de células de hibridoma DSM ACC 2527 que produce el anticuerpo 1B4C3
fue depositada el 7 de agosto de 2001 en DMSZ.
El anticuerpo de la invención puede acoplarse a
un grupo marcador, particularmente para aplicaciones de diagnóstico.
Ejemplos de grupos marcadores adecuados tales como grupos
radiactivos, grupos fluorescentes u otros grupos de marcación se
conocen en la técnica. Adicionalmente, en particular para
aplicaciones terapéuticas, el anticuerpo puede estar acoplado a un
grupo efector, v.g. un grupo citotóxico tal como un grupo
radiactivo, una toxina u otro grupo efector como se conoce en la
técnica.
Adicionalmente, la presente solicitud se refiere
al uso de un inhibidor de la actividad de HER3, en donde la
fijación de dicho inhibidor a HER3 reduce la transducción de señales
mediada por HER3, para la fabricación de un agente para el
diagnóstico, prevención y/o tratamiento de enfermedades
hiperproliferativas, en particular enfermedades tumorales tales
como cáncer de mama, cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas,
cáncer de próstata, glioma, melanoma, u otros cánceres que expresan
o sobreexpresan HER3, o formación de metástasis de tumores. La
enfermedad puede estar asociada con transducción de señales de HER3
incrementada y puede estar asociada con expresión concomitante de
HER2 o carecer de expresión de HER2. Particularmente, la enfermedad
está asociada con fosforilación incrementada de HER3 y/o
heterodimerización incrementada de HER2/HER3 y/o actividad
incrementada de la quinasa PI_{3} y/o actividad incrementada de
la quinasa terminal c-jun y/o actividad de AKT y/o
actividad incrementada de ERK2 y/o actividad de PYK2.
Sorprendentemente, se encontró que el inhibidor
de HER3 de la invención, a saber un anticuerpo
anti-HER3 que exhibe la actividad inhibidora de
HER3 de la invención, exhibe una eficiencia significativamente mayor
en la disminución de los procesos de transducción de señales que un
inhibidor de HER2 tal como Herceptina. En particular, en las
células del melanoma, el anticuerpo anti-HER3 era
eficaz, en tanto que herceptina no exhibía efecto significativo,
aun cuando HER2 era expresado por las células del melanoma.
Preferiblemente, el inhibidor de HER3 de la
invención exhibe al menos una de las características siguientes:
- -
- disminución de la asociación de Heregulina (p85) con HER3 transactivada, preferiblemente inhibición sustancialmente completa de la fijación de p85 con HER3,
- -
- inhibición de la fijación de GRB2 a HER2, la fijación de HER2 a HER3 y/o la asociación de GRB2 con SHC,
- -
- inhibición de la fosforilación del receptor tirosina,
- -
- inhibición de la fosforilación de AKT,
- -
- disminución de la invasividad de los tumores, particularmente en el cáncer de mama y el melanoma,
- -
- inhibición de la fosforilación de la tirosina PYK2 e
- -
- inhibición de la fosforilación de ERK2.
\vskip1.000000\baselineskip
Adicionalmente, la invención se refiere al uso
de un anticuerpo anti-HER3 que inhibe la actividad
de HER3 como se define en la reivindicación 1 para la fabricación
de un agente para diagnosticar, prevenir o tratar una enfermedad
hiperproliferativa, particularmente una enfermedad tumoral, que
comprende administrar a un individuo que se encuentra en necesidad
de ello, v.g. un humano, una cantidad eficaz de un inhibidor de la
actividad de HER3, en donde la fijación de dicho inhibidor a HER3
reduce la transducción de señales mediadas por HER3.
El inhibidor de HER3, es decir el anticuerpo
anti-HER3 puede formularse por mezcla del agente
activo con vehículos, diluyentes y/o adyuvantes fisiológicamente
aceptables, v.g. en la forma de formulaciones liofilizadas,
soluciones acuosas, dispersiones o preparaciones sólidas tales como
tabletas, grageas o cápsulas como se describe en Remington's
Pharmaceutical Sciences.
La formulación puede contener también más de un
compuesto activo, v.g. inhibidores de otras
proteína-tirosina-quinasas
receptoras tales como EGFR2, HER2, HER4 o el factor endotelial
vascular (VEGF). Alternativa o adicionalmente, la composición puede
comprender un agente citotóxico tal como doxorrubicina,
cis-platino o carboplatino, o una citoquina.
El inhibidor de la invención es adecuado también
para aplicaciones diagnósticas in vitro, v.g. a fin de
determinar la expresión y/o actividad de HER3 en las células diana.
Una aplicación de diagnóstico de este tipo puede llevarse a cabo de
acuerdo con métodos conocidos.
Dependiendo del tipo y la gravedad de la
enfermedad a tratar, pueden administrarse aproximadamente 1
\mug/kg a 15 mg/kg de anticuerpo a un paciente humano, v.g. por
una o más administraciones separadas o por infusión continua. Una
dosis diaria típica podría oscilar desde aproximadamente 1 \mug/kg
a aproximadamente 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores
arriba mencionados. Para administraciones repetidas a lo largo de
varios días o más, dependiendo de la condición a tratar, el
tratamiento se mantiene hasta que se produce una disminución deseada
de los síntomas de la enfermedad.
Adicionalmente, la presente invención se
explicará por las figuras y ejemplos que siguen:
La presente invención se ilustra por anticuerpos
anti-HER3, que se caracterizan como se expone en las
reivindicaciones. El anticuerpo anti-HER3 2D1d12 se
incorpora únicamente para comparación.
Las líneas de células del cáncer de mama
MCF-7 (DKFZ-Heidelberg),
MDA-MB-468 (ATCC
HTB-132) y
MDA-MB-231 (ATTC
HTB-26) se eligieron sobre la base de sus relaciones
HER2:HER3 diferentes y sus propiedades migratorias inherentes,
siendo MDA-MB-231 la línea de
células más invasiva. Con objeto de evaluar el papel funcional de
\alpha-HER3^{ECD} (Upstate Biotechnology, Cat.
#05-471) en comparación con trastuzumab
(Herceptina), los inventores pre-trataron las
células con \alpha-HER^{ECD} y HC,
respectivamente, antes de la estimulación con Heregulina (HRG),
realizaron experimentos de inmunoprecipitación de receptores y
sondaron con un anticuerpo anti-fosfotirosina (PY)
(Figura 1). Los datos de los inventores demuestran que el
pretratamiento con \alpha-HER3^{ECD} reducía
sustancialmente el contenido de fosforilación de la tirosina de HER3
y HER2 después de estimulación con \alpha-HRG en
MCF-7 (Figura 1A) y
MDA-MB-231 (Figura 1C), pero
aumentaba por el contrario la fosforilación de la tirosina de HER3
en MDA-MB-468 (Figura 1B). La
asociación entre HER2 y HER3 se intensificaba aún con
\alpha-HER3^{ECD}, aunque el contenido de
receptores fosforilados en tirosilo se reducía espectacularmente
(Figura 1A, B, pistas de panel medio-superior
4-8). En contraste, HC regulaba en sentido creciente
la fosforilación del tirosilo receptor y promovía la asociación de
HER3 y HER2 en presencia o ausencia de HRG en todas las líneas de
células (Figura 1A, B, C, pistas de paneles superiores 3, 7, 11 y
15). En el caso de las células
MDA-MB-486, que son insensibles a
\alpha-HRG, se utilizó como estímulo
\beta-HRG.
Los inventores se preguntaron subsiguientemente
si \alpha-HER3^{ECD} tiene algún efecto sobre
los sustratos conocidos de HER3, a saber SHC y
fosfatidil-3-OH-quinasa
(PI_{3}-K), que son proteínas efectoras
responsables de la activación de la cascada MAPK y la señalización
de lípidos, respectivamente. Para ello, los inventores
inmunoprecipitaron SHC y PI_{3}K en las condiciones experimentales
arriba descritas y evaluaron la fosforilación de la tirosina de
estos efectores. Como se muestra en la Figura 2,
\alpha-HER3^{ECD} reducía significativamente la
fosforilación de la tirosina de SHC en las líneas de células
MCF-7 y MDA-MB-486
(Figura 2A, B, compárese la pista 3 con la 16). Resulta interesante
que la asociación de SHC se atenuaba en las células
MCF-7, mientras que en
MDA-MB-486,
\alpha-HER3^{ECD} conducía a una fijación
incrementada de HER3 con SHC. Los inmunoprecipitados de la
subunidad reguladora de PI^{3}-K producían
resultados esencialmente similares. La fijación de HER3 fosforilado
en la tirosina con PI_{3}-K se anulaba en
MCF-7, en tanto que se observó un aumento en
MDA-MB-486 (Figura 1B, 2B). Sin
embargo, el pretratamiento con \alpha-HER3^{ECD}
en las células MDA-MB-486 conduce a
una fijación incrementada de SHC y PI_{3}-K a
HER3, mientras que HC exhibía de nuevo propiedades de reticulación
en todas las líneas de células. Dado que SHC se asocia con la
molécula adaptadora GRB2 después de la estimulación con HRG, se
exploró el efecto de la tirosil-fosforilación
reducida de SHC por medida de la fijación de GRB2 (Figura 2C). Para
ello se realizaron ensayos de degradación de GSC en células
MCF-7 utilizando fusiones GSC-GRB2
y el mismo diseño experimental que anteriormente. De hecho, la
tirosil-fosforilación reducida de SHC dio como
resultado una fijación notablemente reducida de GRB2 a SHC (Figura
2C panel inferior, compárense las pistas 5 y 8), y una inhibición
completa de su asociación con HER2 (Figura 2C panel central,
compárense las pistas 5 y 8). Estos datos demuestran claramente que
\alpha-HER3C^{ECD} inhibe la fijación de SHC y
PI_{3}-K a HER3 en MCF-7, pero
inversamente en MDA-MB-486, ambas
proteínas se asociaban con HER3 con indiferencia del estado de
fosforilación de HER3.
La proteína adaptadora SHC media los caminos de
señalización de MAPK aguas abajo de los receptores de factores de
crecimiento, activando ERK2 y JNK, respectivamente. Para investigar
el efecto de \alpha-HER3^{ECD} sobre ERK2 y
JNK, se realizaron ensayos de la quinasa MAPK en las mismas
condiciones experimentales en MCF-7 y
MB-468 (Figura 3). Se observó una acusada
disminución de la actividad de JNK en todas las líneas de células,
pero un efecto equivalente de HC sobre JNK era detectable únicamente
en MCF-7 (Figura 3A). La actividad de ERK2 era
reducida sólo ligera pero significativamente por
\alpha-HER3^{ECD}, mientras que HC no tenía
efecto alguno sobre la actividad de ERK2 (datos no presentados).
Dado que se ha demostrado recientemente una implicación de
PI_{3}-K en la invasión del carcinoma, se
investigaron las propiedades inhibidoras de
\alpha-HER3^{ECD} sobre la actividad de
PI_{3}-K y se realizaron ensayos de
PI_{3}-K (Figura 3). En MCF-7 y
MDA-MB-486, la actividad de
PI_{3}-K era acusadamente reducida en comparación
con las células tratadas con HRG (Figura 3A, B). En
MDA-MB-486, HC poseía un efecto aún
mayor sobre la actividad de PI_{3}-K que
\alpha-HER3^{ECD}. Estos datos sugieren que
\alpha-HER3^{ECD} regula en sentido decreciente
la actividad de JNK y PI_{3}-K, respectivamente,
en las células MCF-7 y
MDA-MB-486.
HER2 y HER3 son endocitosados y reciclados
después de la estimulación con HRG. Los inventores se interesaron
en establecer si la inhibición mediada por
\alpha-HER3^{ECD} de la
tirosil-fosforilación de HER2 se origina por una
endocitosis acelerada. Para formarse una idea, se realizó una
evaluación temporal con células MCF-7 en ausencia o
presencia de \alpha-HER3^{ECD} o HRG,
respectivamente, y se efectuó la estimulación subsiguientemente con
HRG (Figura 4). Se inmunoprecipitó luego HER3 después de
biotinilación de las proteínas de membrana. Se observó que HER3
sufre endocitosis rápidamente después del pretratamiento con
\alpha-HER3^{ECD} (Figura 4B, panel superior).
La aplicación de HRG a las células tenía el mismo efecto, con la
diferencia de que, después de 2 horas, HER3 se exportaba de nuevo a
la membrana y al cabo de 3 horas había sufrido nuevamente
endocitosis. Como control, se sondaron lisados de células enteras
(WCL) con PY (Figura 4B, panel inferior). En comparación con las
células tratadas con HRG, en las que el contenido de proteína
tirosil-fosforilada se reducía después de 3 horas,
la endocitosis acelerada de HER3 ocurría después de 1 hora de
pretratamiento con \alpha-HER3^{ECD}. Para
comparar \alpha-HER3^{ECD} con HC, se realizó el
mismo experimento con HC y HER2 inmunoprecipitada (Figura 4A, panel
superior). Sorprendentemente, HER2 no experimentaba endocitosis
después de pretratamiento con HC en ningún momento, mientras que
HRG conducía a una endocitosis rápida. Cuando se comparan receptores
endocitosados y lisados de células enteras, sondados con
anti-fosfotirosina (PY), se aprecia claramente que
el contenido de fosfotirosina decrecía con
\alpha-HER3^{ECD}, pero no con HC (Figura 4B,
panel inferior). Los datos de los autores indican que
\alpha-HER3^{ECD} regula rápidamente en sentido
decreciente HER3 por endocitosis acelerada, haciendo así la célula
insensible a la estimulación con HRG.
Con objeto de evaluar la función biológica de
\alpha-HER3^{ECD} sobre las propiedades
migratorias y proliferativas de las células de cáncer de mama, se
realizaron ensayos de incorporación de BrdU en presencia o ausencia
de \alpha-HER3^{ECD} y se efectuó una
estimulación con HRG. El pretratamiento con
\alpha-HER3^{ECD} reducía la proliferación en
28,7% \pm 6,18% y 21,1% \pm 7,62% en MCF-7 y
MDA-MB-486, respectivamente. La
inhibición observada en la proliferación se correlacionaba con los
ensayos ERK2, mientras que HC no tenía efecto alguno en estas
líneas de células (datos no presentados). Adicionalmente, a fin de
investigar el efecto de \alpha-HER3^{ECD} sobre
las propiedades migratorias de las células del cáncer de mama, se
condujeron experimentos de quimiotaxis con MCF-7 y
MDA-MB-486 en presencia o ausencia
de \alpha-HER3^{ECD}. Se observó una fuerte
disminución en la migración de 59,1% (P = 0,018) y 55,4% (P =
0,00005) en MCF-7 y
MDA-MB-486, respectivamente.
Adicionalmente, la migración podía inhibirse también en
MDA-MB-231 en un 35%, pero con menor
significación (P = 0,06). Los datos de los inventores demuestran
claramente un efecto inhibidor de
\alpha-HER3^{ECD} sobre la proliferación y
migración en MCF-7 y MDA-468.
Se generaron luego anticuerpos monoclonales
murinos contra el dominio extracelular de HER3, inmunizando ratones
Balb/C con una proteína humana recombinante de fusión de la parte
extracelular de HER3 y un marcador His C-terminal
(HER3-6xHis-CT). El inmunógeno se
obtuvo por transfección, selección con G418 y expresión estable del
constructo en células HEK293; el sobrenadante del cultivo de
células del clon con el nivel de expresión máximo se recogió y la
proteína se purificó después de precipitación con sulfato de amonio,
diálisis y cromatografía de afinidad de iones metálicos
subsiguiente (Ni-NTA). El aseguramiento de la
calidad se realizó por transferencia Western (datos no
presentados). La inmunización se realizó por inyección
intraperitoneal con 22 \mug de
HER3-6xHis-CT de acuerdo con el
protocolo del fabricante (Qiagen ImmunEasy Mouse Adjuvant). Líneas
de células de hibridoma que producían anticuerpos monoclonales se
generaron utilizando métodos estándar.
Los inventores identificaron por análisis FACS
tres anticuerpos monoclonales que reconocían específicamente HER3
nativo en la superficie celular de las células MCF-7
(datos no presentados). 1B4C2 y 1B4C3 son anticuerpos IgG2a
isotipo, en tanto que 2D1D12 es un anticuerpo IgG1 isotipo. No se
detectó reactividad cruzada alguna con los otros miembros de la
familia EGFR (datos no presentados). Los inventores se propusieron
luego determinar si los anticuerpos se fijan a estructuras
glicosiladas o a la cadena proteínica principal de HER3 y qué
consecuencias podría tener esto sobre la regulación endocítica del
receptor. Para ello se pretrataron células MCF-7
durante 16 horas en presencia o ausencia del anticuerpo
Tunicamicina que, como es sabido, previene la glicosilación ligada
a N de las proteínas de la superficie celular. Después de lisar las
células, se inmunoprecipitó HER3 con los anticuerpos monoclonales
2F12 (dirigido contra la parte intracelular de HER3),
\alpha-HER3^{ECD} (parte extracelular de HER3),
1B4C2, 1B4C3 y 2D1D12. Los datos de los inventores demuestran que
\alpha-HER3^{ECD}, 1B4C3 y 2D1D12 se fijan
todos ellos preferentemente a la cadena proteínica principal de
HER3, en tanto que 1B4C3 tiene también afinidad para las formas
glicosiladas de HER3 (Figura 6A).
Para investigar el efecto de 1B4C3 y 2D1D12
sobre los procesos endocíticos de HER3, se realizó un experimento
de evolución temporal, en el que se incubaron células
MCF-7 durante diversos periodos de tiempo con 1B4C3
o 2D1D12, respectivamente. Las proteínas de la superficie celular se
biotinilaron, se precipitaron con un anticuerpo contra el dominio
intracelular de HER3 y se sondaron contra estreptavidina. Se observó
que 1B4C3 acelera la endocitosis de HER3 análogamente a
\alpha-HER3^{ECD}, en tanto que 2D1D12
estabilizaba y por tanto acumulaba HER3 en la superficie celular
(Figura 6B).
Los inventores se preguntaron luego si 1B4C3 y
2D1D12 podrían inhibir la fosforilación de la tirosina de HER2 y
del sustrato de HER3 SHC. Dado que GRB2 se fija a HER2 estimulada
con HRG y transmite del mismo modo que SHC señales mitógenas al
camino MAPK, se inmunoprecipitó SHC y se realizó en paralelo una
degradación de GST-GRB2 en las células
MCF-7 sin tratar o pretratadas con los anticuerpos y
estimuladas subsiguientemente con HRG (Figura 6C). Este experimento
demuestra que ambos anticuerpos inhiben la fosforilación de la
tirosina de SHC y la asociación de GRB2 con SHC. Adicionalmente,
los anticuerpos inhiben la asociación de SHC con HER3 y la
heterodimerización entre HER2 y HER3. Estos datos demuestran que la
señalización aguas abajo es inhibida por 1B4C3 y 2D1D12, aunque
teniendo 2D1D12 un efecto inhibidor aún más fuerte que 1B4C3.
A continuación, los inventores se propusieron
explorar la actividad biológica de 1B4C3 y 2D1D12 en las dos líneas
de células de cáncer de mama
MDA-MB-435S (ATCC
HTB-129), ZR-75-1
(ATCC CRL-1500) y la línea de células del melanoma
Mel Gerlach (Klinikum Grosshadern, Munich). Se seleccionaron las
líneas de células debido a su tumorigenicidad en ratones lampiños y
su alto nivel de expresión de HER3. Debe indicarse que las células
del melanoma sobreexpresan HER3, dado que HER3 es crítico en el
desarrollo de los melanocitos así como de los oligodendrocitos.
Para testar la hipótesis de los inventores de que 1B4C3 y 2D1D12
anulan las señales mitógenas y por consiguiente las propiedades
proliferativas de las células del cáncer, se realizaron ensayos de
incorporación de BrdU en presencia o ausencia de los anticuerpos
(Figura 7). La proliferación se reducía acusadamente en todas las
líneas de células por 2D1D12, en tanto que 1B4C3 tenía sólo un
efecto inhibidor en Mel Gerlach. Considerados en su conjunto, los
datos de los inventores constituyen la primera evidencia de que los
anticuerpos monoclonales contra HER3 podrían considerarse
potencialmente como nuevas armas terapéuticas contra el cáncer.
Las líneas de células de hibridoma productoras
de los anticuerpos 1B4C3 y 2D1D12 se depositaron en fecha 7 de
agosto de 2001 y 24 de julio de 2001, respectivamente, en DSMZ.
MDA-MB-435S se
obtuvieron de ATCC (HTB-129) y
Mel-Juso se obtuvieron del Servicio de Líneas de
Células (CLS) (0282-HU). GST-p85
(a.a. 333-430) se obtuvo de Santa Cruz.
GST-GRB2 se purificó como se ha descrito
previamente. Phospho-AKT (P-Ser
473) era de New England Biolabs (NEB). El anticuerpo HER2 se
purificó como se describe para el sobrenadante del cultivo de
hibridoma (ATCC CRL-10463). Para los ensayos de
degradación de GST se utilizaron 1,25 \mug de proteína de cebo.
Los ensayos de incorporación de BrdU e invasión se realizaron como
se ha descrito previamente. Todos los experimentos se realizaron al
menos dos veces.
Con objeto de examinar la expresión en
superficie de los receptores de HER2 y HER3 en
MDA-MB-435S y
Mel-Juso, se determinó adicionalmente su nivel de
expresión por análisis FACS (Fig. 8A, B). Se observó la expresión
de HER2 y HE3 en estas líneas de células y se continuó analizando
minuciosamente el mecanismo molecular por el cual los anticuerpos
HER3 actúan sobre la transducción de señales mediada por Heregulina
(HRG). Para ello, se realizaron ensayos de degradación de GST en la
línea de células del carcinoma de mama humano
MDA-MB-435S y la línea de células
del melanoma Mel-Juso (Fig. 8). Las células en
reposo se pretrataron con los anticuerpos HER3 1B4C3, 2D1D12, el
anticuerpo de control anti-HER2 y con el inhibidor
de PI(3)K LY294002 y se estimularon subsiguientemente
con \beta-HRG. Después de la lisis celular, se
normalizaron los niveles de proteínas y, dado que HER3 tiene 6
sitios potenciales de fijación de p85, se realizó un ensayo de
degradación de GST con GST-p85 (a.a.
333-430) como cebo. La transferencia Western contra
fosfotirosina (PY) revela que anti-HER2 y 1B4C3
reducen por igual la asociación de p85 con HER3 transactivado,
mientras que LY294002 (control negativo) no tiene efecto inhibidor
alguno sobre la fijación de p85 en
MDA-MB-435S (Fig. 8C). En cambio,
2D1D12 anula casi completamente la fijación de p85 con HER3 en
MDA-MB-435S (Fig. 8C).
En la línea de células de melanoma humano
Mel-Juso, 1B4C3 y 2D1D12 reducen por igual la
asociación de p85 con HER3, mientras que anti-HER2
exhibe una disminución más acusada en la asociación de p85 con el
receptor (Fig. 8D). De nuevo, LY294002 no exhibía efecto inhibidor
alguno sobre la fijación de p85 (Fig. 8D). Además, se observaron
algunas bandas fosforiladas prominentes de tirosina en la
transferencia de fosfotirosina a 125 kDa y 66 kDa en
MDA-MB-435S y solamente una banda
importante a 125 kDa en Mel-Juso. Es sabido que
PI(3)K se asocia físicamente con la quinasa de
adhesión focal (FAK) y por esta razón se reexploró luego la
transferencia con anticuerpos FAK (Fig. 8C, D, paneles inferiores).
Los datos de los inventores demuestran que en ambas líneas de
células, únicamente 2D1D12 y el inhibidor de PI(3)K
LY294002 anulaban la asociación de FAK con p85. La reexploración de
la transferencia con los anticuerpos HER2 y HER3 confirmó la
cantidad reducida de HER3 capturada y su heterodimerización
reducida con HER2 (Fig. 8C, D, paneles centrales). Considerados en
su conjunto, estos datos indican que aunque los anticuerpos HER3 y
HER2 reducen los niveles de fosforilación de la tirosina de los
receptores, son capaces de modular respuestas diferentes al nivel
secundario de las proteínas efectoras asociadas con los
receptores.
Dado que GRB2 se fija sólo directamente a HER2 e
indirectamente a través de SHC a HER3, se realizó un experimento
adicional de degradación de GST con GST-GRB2 como
cebo en condiciones experimentales idénticas y en las líneas de
células tumorales humanas anteriores (Fig. 9A, B). Se observó que
1B4C3 y 2D1D12 reducían la fosforilación de la tirosina de los
receptores entre 160 y 185 kDa, en tanto que LY294002 no tenía
efecto inhibidor alguno (Fig. 9A, B, panel superior). Sin embargo,
el pretratamiento de las células con anticuerpos
anti-HER2 conduce a una fosforilación incrementada
de la tirosina de los receptores, lo que podría potenciarse
adicionalmente con \beta-HRG. La reexploración
con los anticuerpos HER2, HER3 y SHC demuestra que 1B4C3 y 2D1D12
inhiben sustancialmente la fijación de GRB2 con HER2 y su
asociación indirecta con HER3 (Fig. 9A, B, paneles centrales), así
como su asociación con SHC en ambas líneas de células (Fig. 9A, B,
paneles inferiores). Por otra parte, los anticuerpos
anti-HER2 aumentaban la fijación de GRB2 a HER2 y
SHC.
Para adquirir mayor comprensión en cuanto a la
señalización aguas abajo mediada por los anticuerpos, se analizaron
también lisados de células enteras (WCL) de los experimentos arriba
descritos (Fig. 10). Cuando se consideró el contenido de
fosfoproteína de la proteína celular total, se observó que en ambas
líneas de células, anti-HER2 activaba
constitutivamente los receptores, mientras que 1B4C3 y 2D1D12
inhibían la fosforilación de la tirosina de los receptores (Fig.
10A, panel superior). De nuevo, LY294002 no tenía efecto alguno.
Está perfectamente demostrado que HRG activa el
camino de las proteína-quinasas activadas por
mitógenos (MAPK), contribuyendo a proliferación celular,
supervivencia celular, y transcripción intensificada de diversos
genes. Para examinar el efecto de los anticuerpos HER2 y HER3 sobre
la activación de MAPK inducida por HRG, se sondaron
inmunotransferencias de extractos de células enteras
MDA-MB-435S y
Mel-Juso con anticuerpos phospho-ERK
(T202/Y204) (Fig. 10). La fosforilación de la MAPK ERK1/2 (p44/p42)
demostró que a pesar de la activación del receptor,
anti-HER2 reducía ligeramente la fosforilación de
ERK1, mientras que 1B4C3 y 2D1D12 no tenían efecto inhibidor alguno
sobre la fosforilación de ERK1 (Fig. 10A, panel central). La
reexploración ulterior de la transferencia confirmó cantidades
iguales de proteína cargada (Fig. 10A, panel inferior).
Adicionalmente, se investigó el estado de
activación de AKT, que es una diana aguas abajo de
PI(3)K y tiene un papel importante en la
supervivencia de las células. Se observó que
anti-HER2, 1B4C3 y 2D1D12 inhibían acusadamente la
fosforilación de AKT en las células del melanoma
Mel-Juso (Fig. 10B, panel superior). En las células
del cáncer de mama MDA-MB-435S,
ambos anticuerpos HER2 y HER3 reducían significativamente la
fosforilación de AKT (Fig. 10C). LY294002 servía como el control
positivo. Esta observación es de la mayor importancia, dado que las
pacientes de cáncer de mama con expresión notablemente incrementada
de AKT activada son más propensas a sufrir recaída con metástasis
distantes, dando como resultado un desenlace clínico malo
(Pérez-Tenorio G. et al., British Journal of
Cancer, 86, 540-545 (2002).
Para evaluar la función inhibidora de 1B4C3 y
2D1D12 sobre la progresión del ciclo celular y la invasión de
tumores, se realizaron ensayos de incorporación de BrdU e invasión
(Fig. 11).
Se observó una fuerte disminución en la
incorporación de BrdU estimulada por \beta-HRG en
las células MDA-MB-435S y
Mel-Juso pretratadas con 2D1D12 (Fig. 11A). Los
ensayos de invasión revelaron que los anticuerpos
anti-HER3 2D1D12 y 1B4C3 reducían sustancialmente
la invasividad de las células de cáncer de mama
MDA-MB-435S y del melanoma
Mel-Juso. Sorprendentemente, el anticuerpo HER2 4D5
exhibía sólo inhibición en
MDA-MB-435S, pero no en la línea de
células del melanoma Mel-Juso, aunque el receptor se
expresa en la superficie celular (Fig. 11B, C y Fig. 8A, B). Los
resultados obtenidos por los inventores sugieren el uso de
anticuerpos anti-HER3 para el tratamiento del
cáncer de mama y el melanoma.
Los inventores demostraron previamente que la
tirosina-quinasa intracelular PYK2 se asocia con y
es fosforilada por HER3, lo que sugiere que PYK2 funciona como un
mediador de las actividades de HER3. Coherentemente con esto, la
PYK2 dominante-negativa inhibía la invasión de
células de glioma mediada por HRG. Por esta razón, se decidió
explorar el efecto de los anticuerpos anti-HER3
sobre la fosforilación de la tirosina de PYK2 inducida por HRG. Se
pretrataron células de glioma humano SF767 en reposo con
anti-HER2, 1B4C3 y 2D1D12 y se estimularon
subsiguientemente las células con \alpha-HRG.
Después de lisis y normalización para cantidades iguales de
proteínas, se inmunoprecipitó PYK2 y se transfirió contra
fosfotirosina (PY). Se observó que mientras
anti-HER2 y 1B4C3 no tenían efecto inhibidor alguno
sobre la fosforilación de la tirosina de PYK2, 2D1D12 reducía
acusadamente la fosforilación de la tirosina de PYK2 (Fig. 12A).
Así pues, los anticuerpos anti-HER2 son eficaces
para inhibir la fosforilación de la tirosina de PYK2 inducida por
HRG.
Por exploración de inmunotransferencias de WCL
con anticuerpos fosfo-ERK se observó que el
pretratamiento de las células con anti-HER2, 1B4C3
y 2D1D12 inhibía la fosforilación de ERK2 activada por
\alpha-HRG (Fig. 12B, panel central). La
reexploración con anticuerpos ERK confirmó cantidad igual de
proteína cargada (Fig. 12B, panel inferior). De nuevo, los datos de
los inventores demuestran que los anticuerpos HER3 regulan en
sentido decreciente los sucesos de señalización mediados por HRG en
MDA-MB-435S,
Mel-Juso y SF767. Adicionalmente, el análisis de
los inventores sugiere que los anticuerpos dirigidos contra los
ectodominios de HER2 y HER3 modulan la señalización diferencial,
conduciendo a respuestas distintas de las proteínas efectoras aguas
abajo.
Claims (19)
1. Una composición farmacéutica que comprende
como agente activo un inhibidor de la actividad de HER3 y vehículos,
diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables, en donde la
fijación de dicho inhibidor a HER3 reduce la transducción de
señales mediada por HER3,
en donde dicha reducción de la transducción de
señales está causada por una regulación decreciente de HER3, que da
como resultado una desaparición al menos parcial de moléculas HER3
de la superficie celular, en donde dicho inhibidor es un anticuerpo
anti-HER3.
2. La composición de la reivindicación 1, en
donde el inhibidor no compite con la fijación de Heregulina a
HER3.
3. La composición de la reivindicación 1, en
donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un fragmento
del mismo, que causa regulación decreciente de HER3.
4. La composición de la reivindicación 1, en
donde dicho anticuerpo es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo
recombinante, que causa regulación decreciente de HER3.
5. La composición de la reivindicación 4, en
donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo recombinante, que
causa regulación decreciente de HER3, se selecciona de anticuerpos
quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos monocatenarios y
fragmentos de los mismos.
6. La composición de las reivindicaciones
1-5, en donde dicho anticuerpo está acoplado a un
grupo marcador o un grupo efector, en donde el grupo marcador es un
grupo radiactivo o un grupo fluorescente, y el grupo efector es un
grupo citotóxico.
7. La composición de las reivindicaciones
1-6, en donde el anticuerpo es 1B4C3 producido por
la línea de células de hibridoma DSM ACC 2527, fragmentos del mismo
o derivados recombinantes del mismo, que causan regulación
decreciente de HER3.
8. La composición de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-7 que comprende un agente activo
adicional, en donde el agente activo se selecciona de inhibidores
de otras tirosina-quinasas receptoras o agentes
citotóxicos.
9. La composición de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-8 para aplicaciones de
diagnóstico.
10. La composición de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-8 para aplicaciones
terapéuticas.
11. El uso de un anticuerpo
anti-HER3 que inhibe la actividad de HER3 como se
define en una cualquiera de las reivindicaciones
1-7, para la fabricación de un agente para el
diagnóstico, la prevención o el tratamiento de enfermedades
tumorales, en donde la actividad de HER3 es inhibida por reducción
de la transducción de señales causada por una regulación
decreciente de HER3, que da como resultado una desaparición al menos
parcial de moléculas HER3 en la superficie celular.
12. El uso de la reivindicación 11, en donde el
anticuerpo es 1B4C3 producido por la línea de células de hibridoma
DSM ACC 2527, fragmentos del mismo o derivados recombinantes del
mismo, que causan regulación decreciente de HER3.
13. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 11 ó 12 para el diagnóstico, la prevención o el
tratamiento de cáncer de mama, cáncer gastrointestinal, cáncer de
páncreas, cáncer de próstata, glioma, melanoma o formación de
metástasis tumorales.
14. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 11-13, en donde dicha enfermedad
está causada por la expresión o sobreexpresión de HER3 y asociada
con fosforilación incrementada de HER3 con respecto a las células
normales.
15. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 11-14, en donde dicha enfermedad
está causada por la expresión o sobreexpresión de HER3 y asociada
con heterodimerización HER2/HER3 incrementada con respecto a las
células normales.
16. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 11-15, en donde dicha enfermedad
está causada por expresión o sobreexpresión de HER3 y asociada con
una actividad incrementada de la quinasa PI3, la quinasa terminal
c-jun, AKT, ERK2 y/o PYK2 con respecto a las células
normales.
17. Un método in vitro para identificar
un nuevo agente para diagnóstico, prevención o tratamiento de una
enfermedad hiperproliferativa, particularmente una enfermedad
tumoral, que comprende ensayar si un compuesto candidato es capaz
de inhibir la actividad de HER3, en donde la fijación de dicho
inhibidor a HER3 reduce la transducción de señales mediada por
HER3,
en donde dicha reducción de la transducción de
señales está causada por una regulación decreciente de HER3, que da
como resultado una desaparición al menos parcial de moléculas HER3
de la superficie celular.
18. La línea de células de hibridoma DSM ACC
2527 y línea de células derivada de la misma que producen
anticuerpos que inhiben la actividad de HER3, en donde la actividad
de HER3 es inhibida por reducción de la transducción de señales
causada por una regulación decreciente de HER3, que da como
resultado una desaparición al menos parcial de moléculas HER3 de la
superficie celular.
19. Anticuerpo producido por una línea de
células de reivindicación 18, que inhibe la actividad de HER3, en
donde la actividad de HER3 es inhibida por reducción de la
transducción de señales causada por una regulación decreciente de
HER3, que da como resultado una desaparición al menos parcial de
moléculas HER3 de la superficie celular.
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