ES2323951T3 - Dispositivo y metodo para detectar simultaneamente diferentes anticuerpos y antigenos en muestras clinicas alimenticias y ambientales. - Google Patents
Dispositivo y metodo para detectar simultaneamente diferentes anticuerpos y antigenos en muestras clinicas alimenticias y ambientales. Download PDFInfo
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Abstract
Método para detectar de modo simultáneo diferentes anticuerpos y antígenos por medio de pruebas inmunoenzimáticas y ELISA (Ensayo Inmunoabsorbente ligado a Enzimas), caracterizado por el hecho de que la fase sólida sobre la que se forma el inmunocomplejo está constituida por cilindros pequeños (2) dispuestos sobre una varilla (1), los cilindros pequeños sobre la varilla se sensibilizan con diferentes antígenos, y se sumergen en los micropozos de una microplaca; una vez sensibilizados los cilindros pequeños de cada varilla, dicha varilla se inserta en un contenedor o envase (5a) con la muestra a ser analizada; una vez ha finalizado el periodo de incubación para la muestra en el contenedor, cada varilla se coloca sobre un soporte; se limpian los cilindros pequeños de cada varilla sobre el soporte; los cilindros pequeños de cada varilla sobre el soporte se introducen en los micropozos de una microplaca, que contienen conjugados específicos a una temperatura adecuada durante un periodo de incubación; una vez que la incubación finaliza, se elevan los cilindros pequeños sobre el soporte desde la microplaca y se limpian; los cilindros pequeños de cada varilla sobre el soporte se introducen en los micropozos de una microplaca, que contiene la subcapa cromógena a una temperatura ambiente durante un periodo de incubación; se extraen los cilindros pequeños de cada varilla sobre el soporte y se leen los resultados.
Description
Dispositivo y método para detectar
simultáneamente diferentes anticuerpos y antígenos en muestras
clínicas alimenticias y ambientales.
Esta invención hace referencia a un método para
detectar de modo simultáneo diferentes anticuerpos y antígenos.
Dicho método se basa en el uso de un dispositivo que permite la
introducción de la fase sólida de una reacción inmunoenzimática
directamente en una muestra que va a examinarse, invirtiendo de
este modo el procedimiento del primer paso en la ejecución de los
métodos inmunoenzimáticos y en aquellos de ELISA (Ensayo
Inmunoabsorbente ligado a Enzimas), que generalmente prevén que la
muestra se distribuirá entre los micropozos de las microplacas,
sobre cuya superficie se adsorbe el tipo único (fase sólida),
reagente, antígeno o anticuerpo.
En el método propuesto la fase sólida transporta
diversos reagentes adsorbidos (antígenos o anticuerpos) para varios
análisis simultáneos y se representa por las superficies de
pequeños cilindros protuberantes desde una barra o varilla, que se
introduce directamente en la muestra y más tarde, tras la
incubación, se coloca sobre una pantalla para microplacas o
microtiras, que se mueve desde los micropozos de una primera
microplaca, que contiene el conjugado, a una microplaca (microtira)
donde se distribuye la subcapa cromógena. Esta última, una vez
retirada de la pantalla que sujeta los pequeños cilindros, pasa a
través de un espectrofotómetro para una lectura: esto permite el
uso del equipo que ya se encuentra a la venta y que se emplea
habitualmente en los laboratorios para análisis y por lo tanto no
constituye un obstáculo económico para la amplia distribución del
producto innovador.
Los cilindros pequeños pueden ser sencillos y
pueden montarse en las sondas, de acuerdo con las necesidades
analíticas, o con las necesidades de la investigación, o pueden
exponerse en números de 4 u 8 o 12 para cada barra o varilla, de
acuerdo con los paneles específicos que responden a las principales
exigencias de diagnóstico (Fig. 1).
La versatilidad de la invención propuesta hace
que el método tenga varios tipos de enfoques, tanto experimentales
como rutinarios, extremadamente flexibles y adaptables, y permite la
reducción y optimización de prácticas en laboratorio en el campo
médico, veterinario, alimenticio e industrial que prevén el uso de
pruebas inmunoenzimáticas y ELISA.
Los métodos y el dispositivo empleados hasta la
fecha para la detección de anticuerpos y antígenos, que prevén el
uso de pruebas inmunoenzimáticas y ELISA, presentan algunos pasos
muy delicados que condicionan el resultado analítico y que precisan
un cuidado particular. Estos son:
- -
- Limpiar la fase sólida, constituida por micropozos de pequeña dimensión;
- -
- Secar la misma fase sólida;
- -
- Establecer los diferentes tiempos de contacto de los reagentes que se distribuyen manualmente en los micropozos, con la consecuente posibilidad de errores sistemáticos.
Además, estas pruebas están condicionadas
por:
- -
- Los tiempos procesados para las muestras que sufren en el tiempo necesario para la distribución de las diferentes muestras entre las microplacas y para la transcripción de los códigos identificadores;
- -
- El volumen de las muestras sobre las que se ejecuta el análisis, que limita la sensibilidad de la prueba, y que no puede variar porque depende del número de micropozos en las microplacas;
- -
- La necesidad para ejecutar varios análisis para una única muestra en diferentes microplacas.
Para superar estos inconvenientes, se han
propuesto varias soluciones y entre ellas se encuentran las
descritas en los siguientes documentos de patente: DE 4120139,
EP-A1-0301141,
EP-A-0087899.
En DE 4120139, los micropozos están hechos sobre
una microplaca, y se distribuyen en diversas líneas y columnas en
paralelo. Una cubierta secundaria para la microplaca crea un soporte
estructural que se une con el antígeno o anticuerpo, también
situado a lo largo de las líneas y columnas correspondientes a la
geometría de los micropozos, de modo que cubriendo la microplaca
con la cubierta de soporte penetren perfectamente en los
micropozos. Cada muestra que pretende analizarse se coloca mediante
una pipeta en cada hoyo de las microplacas individuales. La
cubierta que sujeta la estructura de soporte para el antígeno de
nuevo cubre la microplaca, y se deja que incube durante un tiempo
suficiente para permitir la formación del inmunocomplejo. Una vez
formado, el inmunocomplejo permanece clavado o pegado en la parte
distal (las gotas) del soporte. La primera limpieza de los soportes
tiene lugar en el interior de los micropozos. Toda la cubierta,
junto con las estructuras de soporte para el antígeno, se
transfiere a otra microplaca, y se deja que vuelva a incubar una
vez. Si el inmunocomplejo está presente, se enlazará con él. Se
realiza una segunda limpieza. La cubierta vuelve a transferirse a
una tercera microplaca, en la cual se ha distribuido la subcapa
cromógena. Finalmente, se coloca aparte para incubar y para
permitir que ocurra la acción cromógena.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Las muestras que van a analizarse deben
depositarse rápidamente y singularmente en la primera
microplaca.
En
EP-A1-0301141, puede determinarse
simultáneamente una variedad de anticuerpos específicos para
diferentes antígenos determinados en una única muestra clínica.
La invención consiste en:
- \bullet
- una estructura de soporte que está fabricada preferiblemente de plástico, provista de un grupo de aberturas con forma elipsoidal;
- \bullet
- una membrana porosa de nitrocelulosa inmovilizada sobre dicho soporte, sobre el cual se pulverizan los diferentes antígenos;
- \bullet
- aglutinantes (dobles capas adhesivas) para inmovilizar dicha membrana sobre el miembro de soporte;
- \bullet
- un primer contenedor, que contiene la muestra diluida de suero que va a ser analizada;
- \bullet
- un segundo contenedor que contiene las especies conjugadas;
- \bullet
- un tercer contenedor que contiene la subcapa cromógena.
El miembro sostenedor, sobre la membrana de la
cual se adsorben los diferentes antígenos, se inserta en el primer
contenedor que sujeta la muestra que pretende analizarse. Se deja
incubar durante cinco minutos, durante los cuales tiene lugar la
formación del inmunocomplejo que permanece adherido a la membrana.
A continuación, le sigue una fase de limpieza del miembro soporte
con agua destilada, para eliminar los residuos no ligados, y más
tarde el miembro soporte se inserta en un segundo contenedor en el
cual se ha distribuido la antiespecie conjugada
fosfatasa-alcalina. A continuación, le sigue una
incubación posterior, durante la cual el conjugado se une con el
inmunocomplejo (dicho agregado, un
conjugado-inmunocomplejo, siempre quedará adherido
al soporte): La tercera limpieza tiene lugar. En la fase final, la
estructura de soporte se inserta en el tercer contenedor que
contiene el sustrato cromógeno. La fosfatasa alcalina (una enzima
del conjugado) convierte la subcapa cromógena soluble en un
producto con color insoluble que es depositado en la membrana
porosa. Los productos así formados son visibles en la forma de
marcas de color en la membrana porosa. La ausencia de marcas de
color en la membrana indica la ausencia de anticuerpos específicos
en la muestra clínica.
En EP-A-0087899,
los micropozos dispuestos en un número de columnas y líneas en
paralelo se preparan en una microplaca. Una cubierta secundaria
sobre la microplaca presenta estructuras de soporte que constituyen
la fase sólida para anclar el inmunocomplejo que son movibles, a
través de una conexión por el frágil apéndice: estas estructuras
también se disponen a lo largo de líneas y columnas que
corresponden a la geometría de los micropozos, de tal modo que
cuando la microplaca se cubre con la cubierta, las estructuras de
soporte penetran perfectamente en los micropozos. La muestra que va
a analizarse se distribuye en cada hoyo. La microplaca se vuelve a
cubrir con la cubierta que sostiene las estructuras de soporte para
el antígeno y se deja incubar durante un periodo de tiempo
suficiente que permita la formación del inmunocomplejo. A
continuación se realizan las fases de la metodología ELISA.
Algunos de los métodos analizados no resuelven
el problema de la distribución de las muestras entre las
microplacas y la trascripción de los códigos de identificación, con
una notable pérdida de tiempo y con la posibilidad de error,
mientras que otros no consienten la ejecución de los análisis para
la búsqueda de antígenos en las muestras.
Otra desventaja es la representada por el hecho
de que el tiempo de incubación solamente comienza desde el momento
en el que los micropozos en las microplacas se han llenado. Para
superar estos inconvenientes y desventajas, y para optimizar el
procedimiento analítico, se presenta el presente dispositivo y
método para detección simultánea de diferentes anticuerpos y
antígenos, que, a modo de ejemplo pero sin limitarse, se emplea
para:
A) - la búsqueda simultánea de diferentes
anticuerpos en:
- \bullet
- muestras en masa de leche;
- \bullet
- muestras individuales de sangre (animal o humana) con un anticoagulante;
- \bullet
- muestras de saliva;
- \bullet
- muestras de huevo;
B) - la búsqueda simultánea de diferentes
antígenos (microorganismos de interés en el campo médico o
veterinario o sus toxinas, sustancias xenobióticas, etc.) en:
- \bullet
- muestras de patología;
- \bullet
- muestras de comida;
- \bullet
- muestras ambientales;
\global\parskip1.000000\baselineskip
C) - la búsqueda simultánea de diferentes
anticuerpos y diferentes antígenos en:
- \bullet
- muestras en masa de leche;
- \bullet
- muestras individuales de sangre (animal o humana) con un anticoagulante;
- \bullet
- muestras de saliva;
- \bullet
- muestras de huevo;
- \bullet
- muestras de patología.
El método de la presente invención se realiza a
través de las siguientes fases:
La fase sólida está constituida por las
superficies de los pequeños cilindros de material plástico que son
adecuados para uso en inmunoenzimática (poliestireno, nylon,
estireno acrilonitrilo, etc.) y se sensibiliza usando los métodos
actuales que prevén el contacto de la superficie a ser
sensibilizada con el reagente proteico (antígeno o anticuerpo) en
un tampón de carbonato/bicarbonato de pH = 9:5 e incubación durante
una noche a temperatura de refrigerador.
La diferencia sustancial entre este
procedimiento de sensibilización con respecto al método clásico
consiste en el hecho de que los contenedores empleados para
sensibilizar los cilindros pequeños se llenan con diferentes
reagentes (mientras que en el método clásico todos los micropozos
de una microplaca se sensibilizan con el mismo reagente) de tal
modo que cada cilindro pequeño de la misma sonda trae diversos
reagentes adsorbidos a la superficie. Por ejemplo, si se emplea una
microplaca con 96 micropozos pequeños para la sensibilización del
cilindro pequeño transportado por 12 barras, cada una con 8
cilindros pequeños, la microplaca se cargaría del siguiente
modo:
línea A: reagente A en los 12 micropozos
línea B: reagente B en los 12 micropozos
línea C: reagente C en los 12 micropozos
línea D: reagente D en los 12 micropozos
línea E: reagente E en los 12 micropozos
línea F: reagente F en los 12 micropozos
línea G: reagente G en los 12 micropozos
línea H: sin reagente = control negativo
De este modo, al final del procedimiento de la
sensibilización de la fase sólida, cada una de las 12 barras con 8
cilindros pequeños es útil para llevar a cabo 7 pruebas diferentes
más un control negativo de manera contemporánea, y cada barra
tendrá una secuencia idéntica.
La fase sólida preparada de este modo se
conserva en un frigorífico hasta el momento de análisis.
Se recoge la muestra (por ejemplo sangre con un
anticoagulante, o leche) en botellas o tubos de ensayo (en los
cuales se coloca una cantidad igual de líquido diluyente) en los
cuales se sumerge una varilla -en un lugar específico y
predispuesto en el interior de la tapa o cubierta que a continuación
cierra el contenedor de la muestra- llevando los cilindros pequeños
donde los antígenos se adsorben hacia la muestra en la que se
examinarán los anticuerpos (y/o para determinar la presencia de
anticuerpos dirigidos hacia antígenos): cada cilindro pequeño
contiene un antígeno diferente (o un anticuerpo monoclonal
diferente) y puede distinguirse por un color particular (Fig. 2); un
cilindro pequeño no se sensibiliza con ningún antígeno y actúa
como un control negativo (las sondas pueden montarse de tal modo
que contengan: - un antígeno más el control negativo; - hasta 7
antígenos más el control negativo, tal y como se muestra en la
ilustración; - hasta 11 antígenos más el control negativo,
invirtiendo la dirección de las microplacas y empleando varillas
con 12 cilindros pequeños).
La cubierta o tapa de los contenedores de las
muestras también se adaptan, en el exterior, con una funda
específica para la tarjeta que incorpora el código identificador de
la muestra: dicha tarjeta se coloca sobre la cubierta en el momento
en el que se coge la muestra y, en el momento del proceso de la
muestra, se coge de la cubierta y se coloca en la varilla. El
tiempo invertido en el laboratorio para transportar las muestras se
emplea como un periodo de incubación para la formación del
inmunocomplejo, en el caso de que haya anticuerpos específicos
presentes en la muestra cuando se enfrentan a los antígenos
adsorbidos en los cilindros pequeños (y/o los antígenos específicos
para los anticuerpos monoclonales adsorbidos en los cilindros
pequeños).
Si la muestra resulta positiva para uno o más
antígenos (o anticuerpos) presentes en la varilla que se ha
insertado, el inmunocomplejo que forma se adhiere a la superficie
del respectivo cilindro pequeño por el antígeno (o anticuerpo)
específico: de hecho, la reacción hace uso de la adsorción de los
antígenos (o anticuerpos) en la fase sólida, representada por los
cilindros pequeños. Esta fase que detiene al inmunocomplejo pasa
por diferentes pasos.
A la llegada al laboratorio, se abre el
contenedor o envase que mantiene la muestra, se retira la varilla
que sujeta los pequeños cilindros, y se le adapta su propia tarjeta
que contiene el código identificativo para la muestra, a
continuación se coloca junto con otras varillas de diferentes
muestras, en una funda específica con la forma de una parrilla para
microplacas (Fig. 3); en el caso de una única muestra, se colocará
sobre un soporte para microtiras.
Se realiza una limpieza profunda, bañando los
pequeños cilindros con una solución especial y se deja que el
líquido limpiador gotee hasta que se seque, colocando la extremidad
del cilindro pequeño en papel secante (es suficiente para colocarlo
en el papel). De este modo, se retira cualquier huella de materia
que se pueda adherir a la superficie de los cilindros pequeños, ya
que no se encuentra unida específicamente a ellos, mientras que los
anticuerpos (o los antígenos) trabajando en la formación del
inmunocomplejo permanecen adheridos a los antígenos específicos (o
anticuerpos) adsorbidos por la superficie con los cilindros
pequeños.
El conjugado antiespecie es dispuesto entre los
micropozos de una microplaca o microtira que no ha adsorbido ningún
tipo de reagente, e inmediatamente se cubre por la funda que sujeta
las varillas, de tal modo que los cilindros pequeños goteen en el
reagente y el color de los cilindros pequeños corresponda con la
tira de color que aparece en el lado de la microplaca o en la funda
con la microtira (Fig. 4, Fig. 5), y se podría desear usar fundas
marcadas con color (en el caso de búsqueda de antígenos en la
muestra puesta a examen, el conjugado estará constituido por una
enzima unida a un anticuerpo monoclonal o policlonal dirigido en un
epítope del antígeno que es diferente del que se une con el
anticuerpo monoclonal adsorbido en la superficie de los cilindros
pequeños).
Se deja incubar (generalmente 30 minutos a
+37ºC).
Durante el periodo de incubación el conjugado,
que es un anticuerpo unido a una proteína enzimática capaz de
catalizar la reacción cromógena en presencia de la subcapa
específica, se enlaza específicamente con el inmunocomplejo siempre
que éste se haya formado durante la fase precedente de incubación
con la varilla insertada en la muestra que pretende examinarse. Si
la muestra resulta positiva, el conjugado también quedará adherido
a la superficie de los cilindros pequeños y se transportará con
ellos en la microplaca final.
Tras la incubación, se retira la funda que
sujeta las varillas y se realiza una limpieza y secado adicional,
para eliminar los reagentes que no se adhieren específicamente a
las superficies de los cilindros pequeños, mientras que el complejo
antígeno/anticuerpo/conjugado (o el complejo
anticuerpo/antígeno/conjugado) permanece firmemente adherido.
La funda que sujeta las varillas se coloca en
otra microplaca o microtira final, donde se ha dispuesto la subcapa
cromógena.
Se deja incubar (generalmente
10-15 minutos a temperatura ambiente), para
producir la reacción catalizada de la enzima unida al conjugado que
lleva al desarrollo de una sustancia con color (reacción
cromógena), cuya cantidad es proporcional a la cantidad del
inmunocomplejo que se adhiere a los cilindros pequeños y a la
densidad óptica que se mide a través de un espectrofotómetro. La
reacción cromógena simplemente se bloquea elevando los soportes; es
decir, extrayendo los cilindros pequeños que sujetan el conjugado
adsorbido con la enzima (Fig. 6).
Se realiza una lectura de la microplaca o
microtira con el espectrofotómetro.
Se sigue el mismo procedimiento para las sondas
con 4 o 6 cilindros pequeños (Fig. 7).
Si se desea realizar el método exclusivamente en
un laboratorio, omitiendo la inserción de la varilla con los
cilindros pequeños directamente en la muestra y la recogida del
envase que va a analizarse, se puede proceder a la distribución de
las muestras en los micropozos (en los que puede colocarse
finalmente una cantidad oportuna de líquido diluyente) de una
microplaca que no ha sido sensibilizada por la acción de ningún
agente, usando una micropipeta. En este caso, como deben
distribuirse muchas réplicas de la muestra ya que hay cilindros
pequeños para las varillas que se insertarán de modo sucesivo en
los micropozos que contienen la muestra, debe observarse la misma
dirección de ubicación de varillas insertadas en la parrilla (por
ejemplo, en el caso de una varilla con 8 cilindros pequeños, se
distribuyen 12 muestran en una microplaca, cada una se replica 8
veces, en los 8 micropozos que forman una columna). Una vez que ha
finalizado la distribución de las muestras entre las microplacas,
la parrilla que contiene las varillas con los cilindros pequeños se
coloca de tal modo que gotee en las muestras que van a analizarse y
se deja que incube a la temperatura adecuada durante el tiempo
necesario. Al final del periodo de incubación, se procede a la
limpieza de los cilindros pequeños, y su inmersión en los
micropozos de la microplaca que contienen la subcapa cromógena, se
deja que incuben durante el tiempo necesario a la temperatura
adecuada, se eleva la parrilla que contiene las sondas con los
cilindros pequeños, y se procede a la lectura con un
espectrofotómetro.
El tiempo de ejecución para este tipo de prueba
en un laboratorio es aproximadamente 50 minutos en total, mientras
que el método clásico es decididamente más largo, debido a la
necesidad de transferir una cantidad proporcional de la muestra a
la microplaca, los códigos de identificación de las muestras
transcriben en el orden de su distribución en la microplaca,
permitiendo que las muestras se incuben con el antígeno adsorbido en
la fase sólida constitutiva por las paredes de los micropozos de la
microplaca, y todo se multiplicará por un número de veces igual al
número de pruebas que se realizan para la misma muestra.
Se realizan dos limpiezas, al igual que con el
método clásico.
Los periodos de incubación, tras la adición de
conjugado y tras la adición de la subcapa cromógena, son iguales a
los del método clásico.
Es necesaria una microplaca extra con respecto
al método clásico, no sensibilizada por la acción de cualquier tipo
de reagente y por lo tanto de bajo coste.
El coste de las varillas con los cilindros
pequeños en los cuales se adsorben los antígenos (o anticuerpos) es
comparable al de las microplacas sensibilizadas con antígenos o
anticuerpos.
El coste de las fundas para las varillas con los
cilindros pequeños debería considerarse únicamente un coste
inicial, como el coste del material de laboratorio (como para los
organizadores de tubos de pruebas).
\vskip1.000000\baselineskip
Las ventajas ofrecidas por la invención
propuesta se distinguen en ventajas generales -es decir, en las
mejoras a la calidad del método inmunoenzimático clásico- y en
ventajas de un tipo específico; es decir, relativas a aplicaciones
específicas en el campo de la salud.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- La optimización de los procedimientos de limpieza durante la fase sólida deriva de la posibilidad de conferir un flujo de solución limpiadora a los cilindros pequeños mucho más eficiente en la retirada de reagentes no específicos capaces de alterar la reacción;
- \bullet
- La optimización de los procedimientos de secado durante la fase sólida y como consecuencia la conformidad de los cilindros pequeños, que permite que el líquido en el que se han sumergido previamente gotee fácilmente;
- \bullet
- La reducción de errores sistemáticos derivados del contacto de cada muestra de la microplaca con los reagentes al mismo tiempo;
- \bullet
- La reducción en los tiempos de procesamiento para la muestra es posible al emplear el tiempo de transporte al laboratorio como un primer paso de periodo de incubación;
- \bullet
- La reducción en los tiempos de procesamiento, dado que la fase sólida, a la cual se ancla finalmente el conjugado, se extrae de la microplaca final, haciendo que la inoculación de la solución que bloquea la reacción enzimática cromógena sea innecesaria;
- \bullet
- Una mejora en la sensibilidad de la prueba se deriva de la posibilidad de aumentar la cantidad de la muestra para ser analizada de acuerdo con la voluntad, sin aumentar las cantidades de reagentes necesarios para llevar a cabo las pruebas: la cantidad de la muestra sometida a examen se separa, por lo tanto, de la cantidad de la reacción, y esto provoca un aumento en la sensibilidad de las pruebas, sobre todo en muestras de leche en masa, en muestras de comida, y en muestras ambientales (en el caso de muestras de comida y ambientales, debería estudiarse la posibilidad de predisponer anticuerpos monoclonales capaces de reaccionar con los antígenos bacterianos no desnaturalizados: esto haría posible el uso del método propuesto en una mayor cantidad de muestras en comparación con el empleado en el método inmunoenzimático clásico, evitando de este modo la necesidad de volver a la fase enriquecedora -la liberación del informador analítico 24 horas antes que en el método tradicional- o para eliminar las fases de pre-enriquecimiento y enriquecimiento, con la liberación del informe analítico 48 horas antes que el método clásico; sin embargo, queda por evaluar cuidadosamente la importancia que se atribuye a las reacciones positivas que no son precedidas por el crecimiento de bacterias).
\newpage
- \bullet
- La posibilidad de procesar muestras en serie, que es al mismo tiempo para todo el conjunto de pruebas llevadas a cabo (panel de respiración, panel entérico, panel de salud animal durante la retirada gradual, patógenos y toxinas en alimentos, etc.) responde de manera congruente a las necesidades de serología en diagnóstico y de control alimenticio y ambiental, que raramente prevén un único tipo de prueba por muestra, permitiendo la liberación del informe analítico completo al finalizar una única prueba.
La fase sólida, constituida por los cilindros
pequeños, puede planearse para permitir la formación de los
pequeños cilindros individuales en cualquier momento, de acuerdo
con las necesidades de diagnóstico que se dan en cada ocasión.
\vskip1.000000\baselineskip
En el caso de llevar a cabo pruebas mezcladas en
la búsqueda de diferentes antígenos en la misma muestra, junto con
la búsqueda de diferentes anticuerpos o no, debería anotarse que
mientras el mismo conjugado anti-especie puede
emplearse en la búsqueda de cualquier tipo de anticuerpo, en la
búsqueda de antígeno se emplea un conjugado específico para cada
tipo de antígeno: en la primera microplaca empleada en el
laboratorio a la llegada de la muestra, se colocó un conjugado
específico en cada línea o columna para poner de manifiesto
antígenos específicos; para hacer la distribución más sencilla, la
parte inferior de los micropozos de la microplaca pueden colorarse,
dado que esta microplaca no pasa por una lectura con
espectrofotómetro.
Otras características y ventajas de la invención
aparecerán claras a partir de la siguiente descripción de varios
métodos para construir la invención, solamente ofrecidos como
ejemplos no limitativos en las figuras 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1 representa una varilla de metal o
plástico (1), a partir de la cual sobresalen pequeños cilindros
igualmente distanciados (2) de material sólido y absorbente, como
poliestireno o nailon, por ejemplo. Los cilindros pequeños (2)
también pueden ser individuales y en ese caso se fijan por medio de
juntas (3) a las muescas (4) hechas en la varilla (1). El sistema
para fijar la junta (3) a la muesca (4) permite un montaje a
voluntad de los pequeños cilindros (2) en la varilla (1).
En la Figura 1 hay ocho cilindros pequeños (2)
colocados en la barra, pero también podrían ser cuatro o doce.
La figura 2 muestra una varilla (1), donde los
cilindros pequeños (2) han sido todos sensibilizados previamente
con un reagente diferente de proteína (anticuerpo o antígeno), que
se sumerge en el contenedor o envase (5a) para la muestra en
búsqueda de antígenos o anticuerpos.
La varilla tiene una etiqueta (6) que se separa
e inserta en la tapa del contenedor de la muestra (5b).
El tiempo de transporte del contenedor de la
muestra (5) con la varilla (1) que incluye los cilindros pequeños
(2) se emplea como tiempo de incubación para la formación del
inmunocomplejo en cada pequeño cilindro individual (2).
La Figura 3 muestra cómo, al final del periodo
de incubación, cada varilla (1) con los cilindros pequeños (2) y
con las etiquetas (6) se coloca sobre una parrilla (10) formada por
al menos tres lados horizontales paralelos (11, 12 y 13) y con al
menos dos lados verticales paralelos (14 y 15) y con un asa o mango
(16) para elevarla o transportarla.
Para alojar las varillas se dispone de doce
muescas, igualmente distanciadas en los lados horizontales (11, 12
y 13) y ocho muescas igualmente distanciadas en los lados
verticales (14 y 15).
Para indicar la dirección de carga de las
varillas sobre la parrilla (10) se coloca un botón con color (16)
sobre ella.
Las varillas (1) se colocan sobre la parrilla
(10) de acuerdo con el botón de color (16). En la Figura 4 las
varillas (1) están colocadas en las muescas presentes en los lados
horizontales paralelos (11, 12 y 13), y se muestra una microplaca
(20), que tiene noventa y seis micropozos (21) distribuidos en doce
columnas numeradas del 1 al 12 y ocho líneas indicadas desde la A a
la H. Las líneas también se distinguen por pequeños cuadros con
diferentes colores (22).
La parrilla (10) tiene una forma y un tamaño
suficiente para permitir la carga de la varilla (1) de tal modo que
haga que la posición de los cilindros pequeños (2) coincida con la
posición de los mismos micropozos (21) dispuestos sobre la
microplaca (20), tal y como se ilustra en la figura 5.
La figura 6 muestra la parrilla (10) que se
eleva de la microplaca (20) para proceder a su limpieza.
En la figura 7 se muestra una varilla (1a) con
cuatro cilindros pequeños (2) y con una etiqueta. La varilla (1a)
en la misma figura se sitúa en las doce columnas de la microplaca
(20) desde un lado al otro, doblando la capacidad de las
microplacas para llevar a cabo los análisis en el doble del número
de muestras. Como consecuencia, los pequeños cuadros con color (22)
que simétricamente se repetirán, se modifican en la microplaca.
Tal y como se muestra en la figura 8, el método
se presta a la creación de kits para el examen de muestras en el
campo de la medicina o veterinaria o en los laboratorios (médicos o
veterinarios), gracias a la simplificación de los procedimientos
para la distribución de la muestra, la limpieza en la fase sólida,
y la posibilidad de llevar a cabo simultáneamente la detección de
más anticuerpos y/o antígenos. En este caso, la lectura por medio
del espectrofotómetro puede sustituirse por una lectura visible de
los resultados de la prueba.
La figura 8 representa los pasos para llevar
cabo un análisis de una varilla sencilla (1a) con cuatro cilindros
pequeños (2).
Paso 1. Coger la muestra e introducir la varilla
en el contenedor (5) (finalmente graduado y que ya contiene la
solución diluyente).
Paso 2. Incubación a temperatura ambiente.
Paso 3. Tres conductos en tubos de test (7) que
contienen el líquido limpiador.
Paso 4. La introducción de una microtira (25a)
que ya contiene los conjugados específicos.
Paso 5. Incubación a temperatura ambiente.
Paso 6. Tres conductos en tubos de test (7) que
contienen el líquido limpiador.
Paso 7. La introducción de una microtira (25b)
que ya contiene la subcapa cromógena.
Paso 8. Incubación a temperatura ambiente.
Paso 9. La lectura visible de los
resultados.
En cada microplaca (25a) o (25b) hecha de una
única columna de micropozos, que es una microtira, los anticuerpos
o antígenos que se buscan son indicados por cuadros pequeños
específicos con color (22) -por ejemplo, antígeno A, antígeno B,
anticuerpo monoclonal, sin reagente (control negativo)- cuyo color
corresponde con el de los cilindros pequeños (2).
\vskip1.000000\baselineskip
Para cada microplaca o serie de microplacas o
microtiras, el control positivo se prepara colocando previamente
una varilla en incubación -los cilindros pequeños de esta varilla
se sumergen en micropozos que contienen los reagentes específicos
para el control positivo de la prueba (antígenos y anticuerpos)-
durante el periodo necesario y a una temperatura adecuada (el
cilindro pequeño que no se ha sensibilizado por ningún reagente se
inserta en un hoyo sin ningún reagente específico y sirve como un
posterior control negativo); las varillas en las que el
inmunocomplejo se ha formado pueden finalmente conservarse, estando
listas para su uso.
A continuación, la varilla con el control
negativo se introduce en la parrilla donde las varillas extraídas
de las muestras se cargan, y se examina al mismo tiempo que estas
varillas, y con ellas siguen los procedimientos de prueba
anteriormente descritos.
Debe señalarse que la invención no se limita en
uso a los ejemplos dados en las ilustraciones, y los expertos en la
técnica pueden modificarla y perfeccionarla, sin que suponga
variación sustancial de la Patente.
Claims (11)
1. Método para detectar de modo simultáneo
diferentes anticuerpos y antígenos por medio de pruebas
inmunoenzimáticas y ELISA (Ensayo Inmunoabsorbente ligado a
Enzimas), caracterizado por el hecho de que la fase
sólida sobre la que se forma el inmunocomplejo está constituida por
cilindros pequeños (2) dispuestos sobre una varilla (1), los
cilindros pequeños sobre la varilla se sensibilizan con diferentes
antígenos, y se sumergen en los micropozos de una microplaca; una
vez sensibilizados los cilindros pequeños de cada varilla, dicha
varilla se inserta en un contenedor o envase (5a) con la muestra a
ser analizada; una vez ha finalizado el periodo de incubación para
la muestra en el contenedor, cada varilla se coloca sobre un
soporte; se limpian los cilindros pequeños de cada varilla sobre el
soporte; los cilindros pequeños de cada varilla sobre el soporte se
introducen en los micropozos de una microplaca, que contienen
conjugados específicos a una temperatura adecuada durante un
periodo de incubación; una vez que la incubación finaliza, se
elevan los cilindros pequeños sobre el soporte desde la microplaca
y se limpian; los cilindros pequeños de cada varilla sobre el
soporte se introducen en los micropozos de una microplaca, que
contiene la subcapa cromógena a una temperatura ambiente durante un
periodo de incubación; se extraen los cilindros pequeños de cada
varilla sobre el soporte y se leen los resultados.
2. Método para detectar de modo simultáneo
diferentes anticuerpos y antígenos por medio de pruebas
inmunoenzimáticas y ELISA (Ensayo Inmunoabsorbente ligado a
Enzimas), de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que el contenedor para la
muestra a ser analizada está constituido por una microplaca que no
ha sido sensibilizada y sobre tal microplaca se coloca una
parrilla, con varillas que llevan los pequeños cilindros, durante
un periodo adecuado de incubación a la temperatura necesaria.
3. Dispositivo para detectar de modo simultáneo
diferentes anticuerpos y antígenos por medio de pruebas
inmunoenzimáticas y ELISA (Ensayo Inmunoabsorbente ligado a
Enzimas), constituido por cilindros pequeños adsorbentes (2)
sobre los cuales se forman los inmunocomplejos,
caracterizado por el hecho de que dichos cilindros pequeños
adsorbentes se bloquean a una distancia modular sobre la varilla
(1); dicha varilla lleva una etiqueta (6) para identificar la
muestra bajo examen; dicha varilla que sujeta los cilindros
pequeños se coloca sobre un soporte; dicho soporte con dicha
varilla con los cilindros pequeños se posiciona sobre una
microplaca que incluye micropozos colocados a distancias modulares,
dichos cilindros pequeños que se proyectan desde la varilla
sujetada por el soporte se colocan a la misma distancia modular que
los micropozos; dichos cilindros pequeños, cuando el soporte se
coloca sobre la microplaca, penetran en los micropozos rellenos de
los conjugados específicos y más tarde con el compuesto
cromógeno.
4. Dispositivo para detectar de modo simultáneo
diferentes anticuerpos y antígenos por medio de pruebas
inmunoenzimáticas y ELISA (Ensayo Inmunoabsorbente ligado a
Enzimas), de acuerdo con la reivindicación 3
caracterizado por el hecho de que cada soporte es una
parrilla formada al menos por dos lados horizontales paralelos y
por al menos dos lados verticales paralelos, dicha parrilla tiene
un asa o mango para transporte y elevación, las muescas se
encuentran sobre dichos lados horizontales y verticales para situar
las varillas, y sobre dicha parrilla existe un botón con color que
indica la dirección de carga.
5. Dispositivo para detectar de modo simultáneo
diferentes anticuerpos y antígenos por medio de pruebas
inmunoenzimáticas y ELISA (Ensayo Inmunoabsorbente ligado a
Enzimas), de acuerdo con la reivindicación 4
caracterizado por el hecho de que dicha parrilla recibe doce
varillas cada una con ocho cilindros pequeños, dicha parrilla se
encuentra posicionada en una microplaca con noventa y seis
micropozos posicionados en doce columnas y ocho líneas a la
distancia modular de los cilindros pequeños sujetados por la
parrilla; los cilindros pequeños penetran en dichos micropozos
presentes sobre dicha microplaca.
6. Dispositivo para detectar de modo simultáneo
diferentes anticuerpos y antígenos por medio de pruebas
inmunoenzimáticas y ELISA (Ensayo Inmunoabsorbente ligado a
Enzimas), de acuerdo con la reivindicación 4
caracterizado por el hecho de que dicha parrilla recibe ocho
varillas cada una con 12 cilindros pequeños, dicha parrilla se
encuentra posicionada en una microplaca con noventa y seis
micropozos colocados en ocho columnas y doce líneas a la distancia
modular de los cilindros pequeños sujetados por la parrilla; los
cilindros pequeños penetran en dichos micropozos presentes sobre
dicha microplaca.
7. Dispositivo para detectar de modo simultáneo
diferentes anticuerpos y antígenos por medio de pruebas
inmunoenzimáticas y ELISA (Ensayo Inmunoabsorbente ligado a
Enzimas), de acuerdo con la reivindicación 4
caracterizado por el hecho de que dicha parrilla recibe
veinticuatro varillas cada una con cuatro cilindros pequeños,
dichas varillas se sitúan simétricamente sobre dicha parrilla;
dicha parrilla se encuentra posicionada en una microplaca con
noventa y seis micropozos colocados en doce columnas y ocho líneas
a la distancia modular de los cilindros pequeños sujetados por la
parrilla; los cilindros pequeños penetran en dichos micropozos
presentes sobre dicha microplaca.
8. Dispositivo para detectar de modo simultáneo
diferentes anticuerpos y antígenos por medio de pruebas
inmunoenzimáticas y ELISA (Ensayo Inmunoabsorbente ligado a
Enzimas), de acuerdo con la reivindicación 4
caracterizado por el hecho de que dicha parrilla recibe
dieciséis varillas cada una con seis cilindros pequeños, dichas
varillas se sitúan simétricamente sobre dicha parrilla; dicha
parrilla se encuentra posicionada en una microplaca con noventa y
seis micropozos colocados en doce columnas y ocho líneas a la
distancia modular de los cilindros pequeños sujetados por la
parrilla; los cilindros pequeños penetran en dichos micropozos
presentes sobre dicha microplaca.
9. Dispositivo para detectar de modo simultáneo
diferentes anticuerpos y antígenos por medio de pruebas
inmunoenzimáticas y ELISA (Ensayo Inmunoabsorbente ligado a
Enzimas), de acuerdo con la reivindicación 3
caracterizado por el hecho de que dicha varilla lleva
cilindros pequeños, dicha microplaca es una microtira en la cual
los micropozos están presentes; dichos cilindros pequeños penetran
en dichos micropozos presentes en la microtira; dichos micropozos
se distinguen por los pequeños cuadros de color, cuyos colores
corresponden con los de los cilindros pequeños de la varilla.
10. Dispositivo para detectar de modo simultáneo
diferentes anticuerpos y antígenos por medio de pruebas
inmunoenzimáticas y ELISA (Ensayo Inmunoabsorbente ligado a
Enzimas), de acuerdo con la reivindicación 3
caracterizado por el hecho de que dicha varilla que sujeta
los cilindros pequeños tiene un lugar para posicionar la tarjeta
que contiene el código de identificación de la muestra, y desde ese
lugar puede insertarse la tarjeta en una funda específica sobre la
cubierta o tapa del contenedor para muestras y dicha cubierta o
tapa también tiene un lugar externo para la tarjeta que identifica
la muestra.
11. Dispositivo para detectar de modo simultáneo
diferentes anticuerpos y antígenos por medio de pruebas
inmunoenzimáticas y ELISA (Ensayo Inmunoabsorbente ligado a
Enzimas), de acuerdo con las reivindicaciones 3 y 9
caracterizado por el hecho de que las varillas, los
cilindros pequeños, los contenedores para las muestras y las
microtiras se construyen en su totalidad para llevar a cabo las
pruebas en el campo o en los laboratorios o quirófanos no
especialistas.
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