ES2324433T3 - Tgf-beta novedoso similar a citocina. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBE UNA NUEVA CITOQUINA "TGF BE} UCLEOTIDO QUE CODIFICAN LA PCL13 Y FRAGMENTOS BIOLOGICAMENTE ACTIVOS, ASI COMO METODOS DE EXPRESION Y USOS DE LAS PROTEINAS, FRAGMENTOS Y MOLECULAS DE POLINUCLEOTIDO.

Description

TGF-\beta novedoso similar a citocina.

Esta invención se relaciona con una novedosa TGF-b similar a citocina y para aislar moléculas de polinucleótido que codifican esta proteína. Aplicaciones particulares de la invención pueden incluir tratamientos para cicatrización y consolidación de una fractura, ensayos de tratamientos y diagnósticos para cáncer, enfermedades autoinmunes y fibróticas.

Los macrófagos juegan un papel central en los procesos inflamatorios crónicos. La importancia de estas células deriva de la gran variedad de moléculas bioactivas que ellas producen y por consiguiente, su capacidad para ampliar la respuesta inflamatoria. Su papel central es también debido a su capacidad para la comunicación con muchas otras células. Por ejemplo, el macrófago derivado de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) es un factor de crecimiento importante para los fibroblastos y las células de músculo liso. Otro grupo de proteínas de gran significado en la relación de los macrófagos con varias células del tejido conjuntivo (por ejemplo fibroblastos, músculo liso, osteoblas-
tos endoteliales, etc.) son las citocinas de la superfamilia TGF-\beta, especialmente las proteínas TGF-\beta en sí mismas.

La superfamilia TGF-\beta consiste de factores de crecimiento y diferenciación que comparten la homología estructural (1). En los vertebrados, las familias individuales comprenden las proteínas TGF-\beta en sí mismas, los factores de crecimiento y diferenciación (GDF) (crecimiento embriónico y desarrollo), proteínas morfogenéticas óseas (BMP) (inducen formación de cartílago y hueso), las inhibinas y activinas (regulan la secreción FSH por la pituitaria), y sustancia inhibidora de Müller (MIS) (regresión de conducto de Müller durante diferenciación sexual masculina). Estas proteínas comparten características estructurales importantes. Sus residuos bioactivos en la región de terminal carboxi de 100-150 aminoácidos. Sobre esta región, los miembros de esta superfamilia comparten aproximadamente 30% de identidad de secuencia con TGF-\beta1 y tienen 7 residuos de cisteína conservados. Dentro de los subgrupos individuales de la superfamilia, las proteínas comparten 70% a 90% de identidad sobre el dominio del termina carboxi bioactivo. Todos los miembros de la superfamilia están a través de ser divididos en un grupo de residuos básicos de aminoácidos 110 a 140 del terminal carboxi de una proteína precursora. El procesamiento ocurre inmediatamente luego de una secuencia RXXR conservada.

Las tres proteínas TGF-\beta humanas comparten 80% de similitud de secuencia sobre la porción bioactiva de la molécula. El propéptido (llamado péptido asociado a latencia (\beta1-LAP)) exhibe menos de 50% de similitud entre los miembros de la familia. El \beta1-LAP se divide de la proteína madura, pero el disulfuro permanece unido a este. La separación del \beta1-LAP es necesaria para alcanzar actividad biológica (2).

Han sido estudiadas las proteínas TGF-\beta intensamente debido a su importancia biológica y potencial terapéutico. Su biología y funciones son bien conocidas y se han revisado extensamente (por ejemplo 2, 3, 4). En términos generales ellas promueven diferenciación y función diferenciada en una amplia variedad de células. Ellas son factores quimiotácticos potentes para macrófagos y fibroblastos y generalmente inhiben la proliferación celular, quizás debido a su papel en la diferenciación. En el contexto de inflamación, el TGF-\beta es un potente estimulador de colágeno de fibroblasto y síntesis de proteína de matriz, promueve angiogenia, modula expresión de moléculas de adhesión e inhibe proliferación de linfocito, la producción de algunas linfocinas y función celular NK. Esta molécula ha sido de gran interés a la industria farmacéutica principalmente, por su capacidad demostrable para promover cicatrización y consolidación de una fractura in vivo. El TGF-\beta también ha estado ampliamente implicada en la patogenia de procesos y mecanismos inflamatorios crónicos. Wahl. SM. Enseña la transformación del factor de crecimiento beta en inflamación (3). Adicionalmente, su producción ha sido utilizada como un marcador sustituto por ejemplo en enfermedades fibróticas activas tales como cirrosis y por lo tanto como potencial en el ámbito diagnóstico.

Los presentes inventores han hora aislado una molécula de polinucleótido que incluye un gen citosina novedoso, clon 13 (CL13), que codifica una proteína dimérica (pCL13) que aparece para representar el primer miembro de una nueva clase de proteína dentro de la superfamilia TGF-\beta.

Las reivindicaciones describen las modalidades específicas de la presente invención.

Se describe aquí una molécula de polinucleótido aislada que comprende una secuencia de nucleótido que codifica, o complementariamente a una secuencia que codifica, una proteína designada pCL 13 o un fragmento biológicamente activo de la misma.

La molécula de polinucleótido aislada puede comprender una secuencia de nucleótido la misma como aquella del clon CL13 descrito aquí o puede contener sustituciones de nucleótido sencillas o múltiples y/o eliminaciones y/o adiciones a éstas. Las sustituciones de nucleótido que se pretenden pueden resultar en una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras mediante sustituciones conservadoras, las combinaciones pretendidas son -G, A; V, I, L, M; D, E; N, Q; S, T; K, R, H; F, Y, W, H; y P, N\alpha-alquilaminoácidos. El término "secuencia de nucleótido" también incluye secuencias con homología suficiente para hibridar con la secuencia de nucleótido bajo medio o, más preferiblemente, condiciones de restricción altas (5) y con secuencias de nucleótido que codifican funcionalmente secuencias equivalentes. En adición, el término "secuencia de nucleótido" incluye secuencias que tienen por lo menos 70%, más preferiblemente 90%, homología para clon 13 descrita aquí o cualquier porción de las mismas de > 10 nucleótidos en longitud.

Más preferiblemente, la molécula de polinucleótido aislada una secuencia de nucleótido sustancialmente correspondiente a la secuencia de nucleótido mostrada en la Figura 1 o una porción de la misma, o una secuencia complementaria a ésta. El término "porción de la misma", en este respecto, es entendido como referenciado a las porciones de la secuencia de nucleótido que codifica fragmentos de proteína biológicamente activos y también, a porciones de la secuencia de nucleótido, preferiblemente > 10 nucleótidos en longitud, que se pueden utilizar en, o para la producción de sondas útiles para, ensayos de hibridación.

También se describen aquí los cebadores oligonucleótidos para las anteriores secuencias, secuencias anticodificantes y homólogos de dichos cebadores y secuencias anticodificantes, secuencias de ribozima complementarias, sitios de unión de anticuerpo catalítico y mutantes negativos dominantes de la molécula de polinucleótido.

Se describe aquí una proteína designada pCL13, o un fragmento biológicamente activo de la misma, en forma sustancialmente pura.

Preferiblemente, la proteína, o fragmento biológicamente activo de las mismas, comprende un polipéptido monomérico que tiene una secuencia de aminoácido que corresponde sustancialmente a la secuencia de aminoácido mostrada en la Figura 1 o un fragmento de la misma.

Fragmentos biológicamente activos de la misma como se describen aquí se refiere a polipéptidos pCL13 monoméricos (con o sin el propéptido) y otro polipéptido o porciones de péptido (sea monomérico o dimérico) de los mismos que pueden consistir de secuencias que inhiben, imitan o mejoran el efecto biológico de la proteína y mutantes de proteína negativos dominantes, que unen proteínas que incluyen receptores solubles, otras proteínas y/o glucosaminoglucanos. El propéptido pCL13 también puede representar un fragmento biológicamente activo de pCL13.

La proteína, o fragmento biológicamente activo de la misma, como se describe aquí se puede purificar a partir de fuentes naturales (por ejemplo pulmones, piel etc.) o estirpes celulares, o se pueden reproducir recombinantemente mediante cualquiera de los métodos habituales en la técnica (5).

Se describe aquí un organismo no humano transformado con la molécula de polinucleótido descrita aquí.

Los organismos que se pueden transformar de manera útil con la molécula de polinucleótido descrita aquí incluyen bacterias tales como E. coli y B. subtilis, estirpes celulares eucarióticas tales como CHO, hongos, levadura, animales no humanos y plantas.

Animales no humanos transformados, o transgénicos se pueden establecer para, por ejemplo, sobreexpresar CL13, pCL13 o un fragmento biológicamente activo de los mismos o, alternativamente, generar moléculas de ARN antisentido o ribozimas para inhibir expresión CL13 intacta.

Se describe aquí un anticuerpo o fragmento del mismo específico a pCL13 o una porción antigénica de los mismos. El anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal y se puede producir mediante cualquiera de los métodos habituales en la técnica.

También se entiende que la invención se relaciona con equipos para ensayos diagnósticos, dichos equipos comprenden un anticuerpo como se describe aquí o cebadores de nucleótido para ensayos basados en PCR.

Se describe aquí una proteína o porción antigénica de la misma, capaz de unir a un anticuerpo anti-pCL13.

El pCL13 es adecuado para procedimientos in vivo y in vitro que involucran células humanas y animales. El pCL13 es también adecuado para uso médico y veterinario. En particular, el pCL 13 puede ser adecuado para métodos de tratamiento para cualquier enfermedad o afección benéficamente tratable con TGF-\beta u otro miembro de la superfamilia TGF-\beta.

Se describe aquí un método de tratamiento para asistir cicatrización y/o consolidación de fractura y/o lesión isquémica, que comprende administrar (por ejemplo, oralmente, tópicamente, intravenosamente o subcutáneamente) a un sujeto una preparación que comprende una proteína, o fragmento biológicamente activo de la misma, como se describe aquí, opcionalmente en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable adecuado.

La proteína, o fragmento biológicamente activo de la misma, como se describe aquí, puede también ser útil para uno o más de los siguientes:

(i) Inmunosupresión y efectos antiinflamatorios para afecciones tales como enfermedades autoinmunes o transplante;

(ii) Regulación por disminución de extravasación y movilidad en procesos infectivos o inflamatorios; y

(iii) Tratamiento de tumores a través de apoyo de diferenciación y acción de antiproliferación.

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Tales usos se pueden alcanzar mediante administración de la proteína, o un fragmento biológicamente activo de las mismas, a un sujeto, o mediante terapia de gen utilizando todo o parte de la molécula de polinucleótido descrita aquí. Tal terapia de gen se puede utilizar para, por ejemplo, establecer sobreexpresión de CL13, o pCL13 o un fragmento biológicamente activo de los mismos en la célula anfitriona o, alternativamente, para generar moléculas de ARN antisentido o ribozima para inhibir expresión CL13 intacta.

Es también posible que la inhibición de la acción del pCL13 puede proporcionar tratamiento de trastornos fibróticos/fibroproliferativos tales como artritis reumatoide, aterosclerosis, fibrosis pulmonar, escleroderma, cirrosis y queloides, e inhibición de inmunosupresión de tumor asociada con afecciones tales como tumores, infecciones (especialmente viral) y enfermedades inflamatorias crónicas. Estos tratamientos se pueden alcanzar al utilizar:

fragmentos o péptidos de la proteína pCL13 que inhiben la unión del receptor;

proteínas de unión para pCL13 que incluye receptores solubles para esta molécula, los glucosaminoglucanos, y otras moléculas que pueden inhibir o desestabilizar interacción de ligando de receptor;

anticuerpos dirigidos a pCL13 o su receptor;

estrategias antisentido o ribozima en las que se altera la expresión o estabilidad del producto de gen pCL13;

mutantes negativos dominantes del gen CL13 que, cuando se expresa en una célula anfitriona, desestabilizará o afectará la actividad del pCL13. (Como la proteína pCL13 es un dímero, un segundo producto de gen que se ha modificado puede unir al pCL13 nativo para formar un heterodímero). Así, una variante pCL13 apropiadamente modificada puede esencialmente dar el pCL13 inactivo a través de mecanismos tales como degradación mejorada, circulación intracelular aberrante e inhibición de exportación de la célula e inhibición de bioactividad.

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Así, se describe aquí una proteína heterodimérica que comprende un polipéptido monomérico de pCL13 junto con un polipéptido monomérico de otra proteína de la superfamilia TGF-\beta.

EL pCL13 o fragmentos biológicamente activos del mismo se pueden formular en composiciones farmacéuticas estándar adecuadas para la administración de proteínas. Formulaciones adecuadas se pueden encontrar, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, última edición, Mack Publishing Company, Easton, PA.

Los niveles de dosificación del pCL13 o fragmentos biológicamente activos del mismo se pueden comparar con aquellos útiles para otros miembros de la superfamilia TGF-\beta. Estos niveles son bien conocidos en la técnica, y se puede ajustar la dosificación precisa de acuerdo con la afección del sujeto, el modo de administración, y el juicio del médico que atiende.

Aplicaciones de diagnóstico posibles incluyen diagnóstico de cáncer, trastornos inflamatorios y fibróticos tales como artritis reumatoide, cirrosis y alterosclerosis en los que la síntesis mejorada de este gen puede estar presente.

Para facilitar las aplicaciones anteriormente mencionadas para pCL13, será necesario producir la proteína en cantidades grandes. Sin embargo, estudios extensos con otros miembros de proteína de la superfamilia TGF-\beta, ha revelado un número de dificultades en alcanzar la expresión en cantidades comerciales. Por ejemplo, la expresión en sistemas procarióticos simples son grandemente inadecuados debido a los miembros de la superfamilia son grupos de proteínas cisteína diméricas que tienen unas características complejas de enlaces disulfuros.

La actual estrategia para la expresión de proteínas de la superfamilia TGF-\beta es por lo tanto expresar la proteína completa de una construcción de ADN adecuada transfectada en células de mamíferos. Sin embargo, esta estrategia necesita el tratamiento del sobrenadante de cultivo para separar la proteína madura bioactiva procesada (dividida) del propéptido y material no procesado (no dividido). Esto crea costos adicionales y dificultades debido a que algunos de los materiales expresados es no productivo según típicamente 30%-50% del material secretado no se dividirá apropiadamente. El procedimiento cromatográfico también genera pérdidas extra de proteína e incurre en costos y tiempo adicionales.

Los intentos previos para expresar la porción bioactiva madura de solo estas proteínas, han sido infructuosos, lo que indica que el propéptido es esencial para alcanzar expresión y secreción.

Los presentes inventores, sin embargo, han sido inesperadamente capaces de alcanzar expresión y secreción del pCL13 sin expresar el líder o propéptido, utilizando cultivos de células de mamíferos transfectadas.

Así, se describe aquí un método para producir una proteína designada pCL13 o un fragmento biológicamente activo de la misma, que comprende transformar un organismo anfitrión no humano adecuado con una molécula de polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótido que codifica pCL13 o un fragmento biológicamente activo de la misma, en donde dicha molécula de polinucleótido se expresa constitutiva e indeciblemente en dicho organismo anfitrión.

Preferiblemente, la secuencia de nucleótido que codifica el pCL13 o un fragmento biológicamente activo del mismo, no comprende secuencia que codifica el líder o propéptido de pCL13.

En lugar de las secuencias que codifican el líder nativo o propéptido, puede ser preferible incluir dentro de las secuencias de la molécula de polinucleótido que codifican un líder heterólogo (por ejemplo la secuencia líder de la hormona que estimula el folículo (FSH)) para asistir la expresión.

Organismos anfitriones no humanos adecuados transformados con la molécula de polinucleótido descrita aquí puede ser cualquiera de aquellos mencionados anteriormente. Sin embargo, organismos preferidos incluyen estirpes celulares de mamíferos, levadura (por ejemplo Pichia y Saccharomyces) y animales no humanos.

La expresión de solo la porción activa madura del pCL13 proporciona por lo tanto las siguientes ventajas:

(i) Altos niveles de expresión; y

(ii) No es necesario purificar a partir del propéptido y la proteína CL13 de longitud completa no procesada.

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Adicionalmente, debido a esto no es necesario expresar las proteína completa, es posible y es simple agregar etiquetas de epítopo de terminal amino (por ejemplo FLAG y/o HIS) que pueden asistir significativamente compuesto la purificación y visualización de proteína recombinante.

También, la capacidad para expresar la porción bioactiva madura del pCL13 en células de mamífero, indica que serán capaces de ser fácilmente expresadas en cepas de levadura, tal como la Pichia pastoris que es capaz de secretar disulfuro ligado a proteínas. La producción de proteína en la levadura es mucho más económica y fácil que la producción mediante células de mamífero.

La invención ahora se describirá adicionalmente por vía de los siguientes ejemplos no limitantes y con referencia a las figuras acompañantes.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 proporciona la secuencia de nucleótido y secuencia de aminoácido putativo del clon 13 que codifica pCL13.

La figura 2 muestra expresión CL13 en cultivos de macrófago.

Panel A. Se cargan 15 \mug de ARN total por línea. Tratamientos de macrófagos son: línea 1, sin tratamiento; línea 2, 1,000 U IFN\gamma durante la noche, línea 3, 1 \mum de ácido retinoico durante la noche; línea 4,1 \mum de ácido retinoico durante la noche seguido por 10 \mug/mL de LPS durante 3 horas; línea 5, 10 \mug/mL de LPS durante 3 horas.

Panel B. Se cargan 20 \mug de ARN total por línea. Tratamiento de macrófagos son: línea 1, 1 \mum de ácido retinoico durante 3 días seguido por 10 \mug/mL de LPS durante 3 horas; línea 2,1 \mum de ácido retinoico durante la noche seguido por 50 nM de PMA durante 3 horas; línea 3, 50 nM de PMA durante 3 horas; línea 4, macrófagos no tratados.

La figura 3 muestra un análisis northern blot de la expresión del clon 13 de macrófagos tratados con citocinas. Todos los tratamientos son de 3 horas. línea 1, macrófagos no tratados; línea 2, 50 nM de PMA; línea 3, 50 U/mL de GM-CSF; línea 4, 100 U/mL de M-CSF; línea 5, 100 U/mL de IL1-\beta; línea 6, 10 ng/mL de TGF-\beta; línea 7, 10 U/mL de PDGF-BB; línea 8, 50 U/mL de IL-2; línea 9, 100 U/mL de TNF-\alpha, línea 10, 50 U/ml de IL-6.

La figura 4 muestra un análisis northern blot de la expresión de clon 13 en U937. Se cargan 20 \mug de ARN total por línea en 1.2% de una agarosa que desnaturaliza gel de formaldehído. Línea 1, sin tratamiento; línea 2, 1 \mum de ácido retinoico durante 3 días, líneas 3, 4, 5, 6, 7, 1 \mum de ácido retinoico durante 3 días seguido por 160 nM de PMA durante 20 min, 1 h, 2 h, 3 h y 12 h respectivamente; línea 8, 160 nM de PMA durante 3 h. Se marcan las sondas con 32P. Se hibrida la transferencia a 65ºC y se somete a lavados posthibridación y autorradiografía.

La figura 5 proporciona una alineación de secuencia múltiple de los medios terminal carboxi de pCL13 y otros miembros de la superfamilia TGF-\beta.

La figura 6 proporciona la secuencia de nucleótido y secuencia de aminoácido putativo para el clon 13 en la construcción C13LB. La región de codificación para la porción bioactiva del pCL13 comienza con el nucleótido 625.

La figura 7 proporciona la secuencia de nucleótido y secuencia de aminoácido putativo para el clon 13 en construcción FFC13S. La porción bioactiva predicha del pCL13 comienza con el aminoácido 92.

La figura 8 proporciona las secuencias de nucleótido y secuencia de aminoácido putativo para el clon 13 en construcción C13SA. La región de codificación para la porción bioactiva del pCL13 comienza con el nucleótido 136.

La figura 9 muestra un Westernblot de pCL13 recombinante purificado (construcción FFC13S) visualizada con anticuerpo anti-FLAG.

La figura 10 proporciona una gráfica de los resultados obtenidos a partir de análisis de glucosaminoglucano en células CHO no transfectadas (K1) y CL13 (construcción FFC13S) transfectadas (P4N, 15 y 24) utilizando ensayo de azul de dimetil-metileno (DMB).

La figura 11 proporciona una gráfica de resultados obtenidos a partir de ensayos de producción de colágeno de células CHO no transfectadas (K1) y CL13 (construcción FFC13S) transfectadas (P4N, 15 y 24).

La figura 12 proporciona gráficas de resultados obtenidos a partir de análisis de producción de glucosaminoglucano en células 3T3 (Figura 12A) y CCD (Figura 12B) luego de adición de varias concentraciones de pCL13 (expresadas de la construcción C13SA).

La figura 13 proporciona resultados gráficos obtenidos a partir de análisis de producción de colágeno en células CCD luego de adición de varias concentraciones de pCL13 (expresadas a partir de construcción de C13SA).

La figura 14 proporciona gráficas de resultados que muestran actividad de factor de crecimiento bajo condiciones de suero limitantes de pCL13 (expresadas a partir de construcción de C13SA) contra TGF\beta en fibroblastos de prepucio en lactante humano (BFF) (Figura 14A) y células 3T3 (Figura 14B).

La figura 15 proporciona gráficas de resultados que muestran actividad de factor de crecimiento en la presencia de suero de pCL13 (expresadas a partir de construcción de C13SA) y TGF\beta en bFF y células 3T3.

La figura 16 proporciona gráficas de resultados que muestran el efecto de pCL13 (expresadas a partir de construcción de C13SA) de pCL13. El TGF\beta e IFNa2b en la proliferación de células monocíticas humanas U937 (Figura 16A) y células monolíticas humanas mono Mac 6 (Figura 16B).

La figura 17 proporciona resultados gráficos de un análisis de diferenciación pCL13 (expresados de construcción de C13SA) concentraciones on TNF-\alpha producción in human macrófagos derivados de cultivo.

La figura 18 proporciona gráficas de resultados que muestran el efecto de concentraciones pCL13 (expresadas a partir de construcción de C13SA) en la citotoxicidad de monocitos hacia células objetivo de vejiga 5637 (Figura 18A) y células objetivo de tumor de mama MDA-MB-231 (Figura 18B).

La figura 19A proporciona una micrografía de tejido subcutáneo tomado de una rata a la que se ha administrado pCL13 (expresada a partir de construcción de C13SA).

La figura 19B proporciona una micrografía de tejido subcutáneo tomada de una rata de control a la que solo se le ha administrado solución salina.

La figura 20A muestra las secuencias de nucleótido de variantes CL13 (a1, b1, b2, d2, dd2, f1, u2 y h1) y el CL13 original (denota C13).

La figura 20B muestra una comparación de una porción de a secuencia de aminoácido putativo de las variantes de CL13 a1, b1, b2, d2, dd2, f1, u2 y h1.

La figura 21 proporciona la secuencia de nucleótido y secuencia de aminoácido putativo para el clon 13 en construcción C13SA/5H (sitio de división de Trombina HIS -FLAG-PKA-péptido CL13 bioactivo maduro). Esta construcción ha sido utilizada para la expresión en la levadura Pichia pastoris. El HIS es un motivo de residuo 5 histadina para permitir la purificación por afinidad utilizando cromatografía de quelado de Níquel. El sitio de trombina permite la división enzimática del HIS del resto de las la secuencia si se requiere.

La figura 22 muestra un western blot de medio de cultivo de Pichia pastoris transformados con construcción C13SA/5H. Se visualiza la proteína pCL13 utilizando anticuerpo anti-FLAG.

Ejemplo 1 Caracterización del clon 13

Este clon hibrida en Northern blot a una especie única de mARN de 1.2kb de tamaño y se ha localizado el gen mediante hibridación fluorescente in situ para cromosoma 19p13.1 (TGF-\beta1 está en 19q13.1 y MIS está en 19p13.3). Las características del clon se representan adelante.

1

Los códigos de marco de lectura abiertos más grandes para una cisteína alta que contiene proteína con un péptido de señal. Estos llevan homología fuerte para los miembros de la superfamilia TGF-\beta (que incluyen TGF-\beta en sí mismo) cuando se analizan utilizando el programa fasta en la instalación ANGIS (clasificaciones opt 180-250). La alineación de secuencia múltiple extensa utilizando el programa CLUSTAL V en GCG ha sido emprendida con la secuencia de aminoácido traducida CL13 (pCL13) y más miembros de esta superfamilia (ver Figura 2).

La pCL13 madura es una proteína dimérica con un sitio RXXR conservado que es apropiada para ser involucrada en la división de un propéptido grande con el polipéptido codificado que disminuye de una masa monomérica predicha de aproximadamente 34 kDa a 13 kDa. El pCL13 tiene unos sitios de glucosilación potenciales en sus propéptidos, pero ninguno en la proteína madura, lo que sugiere que la glucosilación puede ser objetivación intracelular como éste está en TGF-\beta.

En esta superfamilia los residuos bioactivos en la mitad del terminal carboxi de la molécula. Existe fuerte conservación en esta región entre todos los miembros de la superfamilia, especialmente en 7 de los residuos de cisteína. Los datos de alineación completa demuestran inequívocamente que el pCL13 pertenece a la superfamilia TGF-\beta. En esta superfamilia en la identidad familiar es del orden de 70-80%. El pCL13 no exhibe identidad de este grado a cualquiera de las familias individuales y por lo tanto aparece para representar una categoría completamente nueva y separada dentro de la superfamilia TGF-\beta.

La secuencia de nucleótido completa y secuencia de aminoácido putativo para el clon 13 (CL13) se proporciona en la Figura 1.

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Ejemplo 2 Expresión de Gen CL13 y Análisis de Actividad Biológica

Se han emprendido estudios extensos de regulación de expresión de gen CL13 utilizando el inserto de clon marcado 32P y se resumen los resultados en la Tabla 1. Se ilustran también algunos ejemplos en las Figuras 2, 3 y 4. Los resultados indican que el transcripto 1.2 kb se presenta en muy bajos niveles en U937 no tratado y macrófagos derivados de cultivo. Las expresión se incrementa de forma marcada con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), pero no se regula por incremento por LPS o interferón-g (IFN-g). Se expresa fuertemente el clon 13 en macrófagos tratados con GM- CSF, M- CSF, IL2 o TNF-\alpha y para un menor grado con TGF-\beta, PDGF-BB o IL-6. También existe expresión incrementada de mARN CL13 en una estirpe celular de fibroblasto neonatal humano (CCD34Lu) en respuesta a IGF-1, PDGFbB, TGF-\beta o TNF-\alpha y en crecimiento de células endoteliales de vena umbilical humanas con ECGF. Se encuentra la no expresión de este gen en cualesquier linfocitos B o T/estirpes celulares activadas o en reposo.

Podemos deducir hipótesis razonables a cerca de la naturaleza del papel biológico de esta proteína sobre la base de su expresión y las características generales de la superfamilia. La expresión CL13 se podría inducir en macrófagos derivados de cultivo (MAC) mediante una variedad de agentes de activación que incluyen citocinas y PMA pero sin LPS. También se induce su expresión en fibroblastos mediante activación y podrían no ser inducidos en todos los linfocitos. Como se hacen crecer células endoteliales probadas en la presencia de ECGS, no es posible concluir si la expresión está ausente bajo condiciones de reposo.

Puede ser de particular significado que el TGF-\beta induce expresión de CL13 en los fibroblastos y el MAC. Es posible que algunas de las funciones atribuidas al TGF-\beta pueden ser debido a una inducción autocrina o paracrina de TGF-\beta mediante CL13.

Muchas de la proteínas en esta superfamilia TGF-\beta actúan en células mesenquimales y se anticipa que esto será verdadero para pCL13. También se piensa que el pCL13 puede mejorar la función efectora de estas células, quizás en una forma similar a TGF-\beta en sí mismo.

Los linfocitos y macrófagos están íntimamente relacionados en la función biológica. El hecho que los linfocitos no parecen capaces de expresar CL13, pero el MAC expresa esté en grandes cantidades sugiere la posibilidad que el linfocito también puede representar un objetivo para pCL13.

En resumen, las propiedades y característica de pCL13 de la expresión sugiere que esta puede tener algunas similitudes con TGF-\beta. Sin embargo, mientras esta pertenece a esta superfamilia, se puede decir con alguna certeza, sobre la base de la comparación de secuencia, tal pCL13 es uno de una nueva clase de proteínas dentro de esta superfamilia y no es una proteína TGF-\beta no descrita (por ejemplo TGF-\beta6).

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Ejemplo 3 Expresión de pCL13 Recombinante y Generación de Anticuerpo 1. Expresión procariótica de CL13

Este se ha emprendido utilizando el vector pGEX que genera una proteína de fusión glutationa-S-transferasa. Se sintetiza el material del peso molecular correcto ya que se desnaturaliza y es insoluble y por lo tanto inadecuado para la purificación. Como una consecuencia, sin trabajar adicionalmente se hace con este vector debido a las dificultades que probablemente se involucraran.

2. Expresión Eucariótica de Método General CL13

Han hecho un número de construcciones de ADN basadas en el CL13. Para algunas de estas construcciones la secuencia de ADN para el epítopo FLAG ha sido agregada. Estos códigos de epítopo para el péptido de aminoácido 8 (N- Asp- Tyr- Lys- Asp- Asp- Asp- Asp- Lys- C) cuyos códigos para un sitio de división enteroquinasa se reconocen mediante dos anticuerpo monoclonales. Una proteína que recubre este péptido marcador puede luego ser purificada por afinidad utilizando estos anticuerpos. Adicionalmente la proteína también se puede detectar utilizando Western blotting u otros ensayos basados en anticuerpos. La adición de este péptido hidrófilo pequeño de la región terminal amino de la construcción no se esperaría influenciar la bioactividad de la proteína completa. Sin embargo, si se desea, se puede utilizar la enteroquinasa para dividir selectivamente el péptido FLAG de la construcción, sin afectar el resto de la molécula.

La predicción del sitio de división de señal de cualquier proteína es solo 75-80% exacto. Por esta razón en algunas construcciones es necesario usar la secuencia líder de la hormona estimulante del folículo (FSH). Esta es conocida por funcionar en la célula eucariótica a ser utilizada para la transfección y se conoce su sitio de división preciso. Esto es importante para asegurar que el péptido FLAG permanezca adherido al propéptido y no se remueva con la división de secuencia de señal.

Se hacen las siguientes construcciones de ADN:

1. CL13: Secuencia de CL13 completa no modificada (Figura 1). (Secuencia líder CL13- Secuencia para propéptido CL13 - Secuencia para péptido CL13 bioactivo maduro).

2. C13LB: CL13 de longitud completa con FLAG (Figura 6). (Secuencia líder FSH - FLAG-propéptido CL13 - Secuencia para péptido CL13 bioactivo maduro).

3. FFC13S: CL13 bioactivo con FLAG (Figura 7) (secuencia líder FSH - secuencia FLAG - aproximadamente propéptido de 40 aminoácidos - Secuencia para péptido CL13 bioactivo maduro).

4. C13SA: CL13 bioactivo con FLAG (Figura 8) (FSH líder-secuencia FLAG secuencia - PKA - CL13 bioactivo maduro). El PKA es la secuencia de reconocimiento para la proteína cinasa A para permitir fosforilación in vitro.

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Se clonan estas construcciones en dos vectores de expresión de células de mamífero diferentes. Estos son el vector pCEP4 que es un vector de expresión semipermanente o el vector pCEP4 del cual se ha eliminado la secuencia de gen EBNA para permitirle permanentemente integración en el genoma de la célula de mamífero en la que este se transfecta. Todas las construcciones se han transfectados en células CHO y COS y estirpes celulares semipermanentes o permanentes que llevan el transfectante establecido con el uso de higromicina para matar células que llevan no transfectantes. Se ha emprendido la producción y purificación de proteínas para datar solo en los números de construcción 2, 3 y 4 (dominantemente 3 y 4), CL13 bioactivo con FLAG.

Cultivo celular

Se hacen crecer ambas células COS y CHO en medio Ham's F12 con 5% de suero de becerro fetal (FCS) y 400 ug/ml de higromicina (solo en estirpes celulares semipermanentes). En la confluencia, se remueve el medio y se reemplaza con HamF12 que no contiene suero u otros componentes. Se remueve el medio condicionado después de días y se utiliza para purificación de FLAG-CL13 recombinante. Luego se hacen pasar las células y una vez más se colocan en el medio que contiene suero.

Cuantificación

Un ensayo dotblot se ha establecido para cuantificación de FLAG recombinante que contiene proteínas -en cultivo sobrenadante o en forma purificada. Se deposita la proteína de los sobrenadantes de cultivo (10-100 ul) en nitrocelulosa utilizando un aparato dotblot. Luego se hace reaccionar la membrana con anticuerpo anti-FLAG monoclonal y luego con IgG de conejo antirratón biotinilado. Este luego se visualiza mediante quimioluminiscencia mejorada en película autorradiográfica. Se genera una curva estándar utilizando una proteína fosfatasa alcalina bacteriana (BAP) que se ha diseñado mediante ingeniería de tal manera que esta contiene 1 copia de el epítopo FLAG en su terminal amino (Mr 50-55 kDa). La sensibilidad de este ensayo es aproximadamente 20 ng de bAP.

Cuando se utiliza este ensayo para analizar la producción de FLAG-CL13 se encuentra que los cultivos producidos entre aproximadamente 25 y 400 ng de proteína recombinante por ml de sobrenadante de cultivo. La mejor expresión se observa con las construcciones 3 y 4.

Purificación

Se incuba el medio que contiene proteína recombinante con glóbulos de sefarosa en los que se ha conjugado el anticuerpo anti-FLAG. Aproximadamente se utiliza 1 ml de glóbulos por 100 ml de medio condicionado. Se incuban la sefarosa y el medio durante 18 horas a 3ºC luego se paletizan los glóbulos y se vierten en una minicolumna. Ellos luego se lavan extensamente con PBS y se libera la proteína recombinante con péptido FLAG. Este es un procedimiento muy gentil pero eficiente y asegura que no se perjudica la bioactividad de la proteína recombinante. Se remueve el péptido FLAG utilizando cromatografía de filtración de gel. Luego se pelan los glóbulos con amortiguador de glicina de pH 3.5 luego se pueden reutilizar.

La Figura 9 muestra un Western blot de proteína pCL13 purificada de construcciones C13LB y C13SA. Se hace electroforesis al material purificado utilizando SDS PAGE en un gel al 15% bajo condiciones de reducción y no reducciones antes de Western blotting y visualización utilizando anticuerpo anti-FLAG monoclonal. Las construcciones migran en pesos moleculares ligeramente más grandes que predicen, algo que parece ser una función de los aminoácidos en la secuencia FLAG y se han reportado previamente con el uso de esta etiqueta de epítopo. Sin embargo, existe el cambio esperado en el peso molecular asociado con el uso de condiciones de reducción que indican que el material está en la conformación dimérica.

El hecho de que estas proteínas diméricas se secretan en el medio también indica que ellas se doblan correctamente como proteínas agregadas y dobladas impropiamente se expresan en células eucarióticas no secretadas. Las dos construcciones (FFC13SC y C13SC) que codifican solo la proteína bioactiva, ambas parecen ser expresadas en muchos niveles más altos que la secuencia CL13 nativa que solo se ha modificado para contener un epítopo FLAG (C13LB). Esto se ejemplifica en la Figura 9 que compara la expresión de proteína relativa de las construcciones C13SA y
C13LB.

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Ejemplo 4 Efecto de pCL13 en Función de Fibroblasto

El TGF-\beta estimula función de fibroblasto diferenciada e inhibe la replicación. Con el fin de comparar la función de pCL13 con TGF-\beta, se puede examinar el efecto de pCL13 en las funciones de fibroblasto como sigue.

a. Producción de Colágeno y Glucosaminoglucano

Se pueden hacer crecer fibroblastos de pulmón neonatal (CCD34LU) para confluenciar y reemplazar el medio de crecimiento con DMEM. que contiene 0.1% de BSA. Luego se pueden estimular las células con pCL13 o TGF-\beta recombinante (10 ng/ml) como un control positivo. Luego se puede recolectar el sobrenadante de los cultivos 18 horas después y se ensayan para colágeno total y glucosaminoglucanos (GAG). Se puede medir la síntesis de colágeno utilizando un ensayo colorimétrico de placa de microtítulo desarrollado en este laboratorio que depende de la unión del colágeno total al tinte rojo sirius (18). El GAG sulfatado total se puede medir con un ensayo colorimétrico adaptado en este laboratorio para formato de placa de microtítulo y que ya ha sido utilizado para la determinación in vitro de síntesis GAG de fibroblastos (9,10). Este ensayo se basa en el cambio metacromático en el máximo de absorción para el tinte catiónico azul de dimetil-metileno consecuente en la unión de los grupos funcionales de los grupos funcionales polifónicos de GAG (9,10).

b. Replicación de Fibroblasto

Se conoce el TGF-\beta por tener un efecto variable en la proliferación de fibroblasto in vitro que depende probablemente del balance entre su capacidad para regular descendentemente el receptor PDGF y su inducción de síntesis de fibroblasto PDGF. Para determinar si el pCL13 también modifica la replicación, un ensayo de factor de crecimiento se emprenderá con CCD34Lu esencialmente como se describió previamente (11, 12, 13)). Estas células se colocan escasamente en placas en una concentración de aproximadamente 1000 células/pozo (placa de 96 pozos). La proteína pCL13 o TGF-\beta (100 ng/ml) (control positivo) se agregará sola o en combinación con un factor de crecimiento conocido presente dentro del suero de ternero fetal. Se puede determinar la actividad del factor de crecimiento mediante incorporación de 3H-timidina.

c. Actividad de colagenasa

Se debe esperar que el pCL13 inhiba la inducción de actividad de colagenasa. Para probar esto, se pueden hacer crecer fibroblastos de pulmón neonatal (CCD34LU) para confluenciar luego se reemplaza el medio de crecimiento con DMEM que contiene 0.1% de BSA. Luego se pueden estimular las células con PMA recombinante para inducir síntesis de colagenasa en la presencia o ausencia de pCL13 o TGF-\beta (50 ng/ml -control positivo). Los sobrenadantes luego se pueden ensayar para actividad de colagenasa utilizando nuestra adaptación (14) de un ensayo (15) que se basa en la degradación de 20 ug de colágeno tipo I purificado que se ha recubierto en una placa de microtítulo. Se visualiza el colágeno no digerido mediante teñido con rojo sirius y se cuantifica fotométricamente.

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Ejemplo 5 Efecto de pCL13 en Función de Macrófago

Los efectos de TGF-\beta en los macrófagos son complejos y en algunos casos aparentemente paradójicos. En términos generales se ha considerado el TGF-\beta por ser un agente quimiotáctico de macrófago potente, un regulador descendente de activación de macrófago y un promotor de diferenciación (3,4). Para probar el efecto de pCL13 en macrófagos, se utilizarán macrófagos derivados de cultivo (MAC) como la fuente celular principal libre de suero en Medio Dulbecco Modificado Iscove, utilizando métodos establecidos por nuestro laboratorio (15,16). Cuando las células de replicación no llegan a ser adhesivas. Es posible utilizar ambos MAC adhesivos y no adhesivos no dañados para estudio.

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a. Quimiotropismo

Este se puede examinar utilizando un ensayo de quimiotropismo Boyden estándar como se desarrolló previamente (17). Se utilizará TGF-\beta (1pg/ml) como el control positivo para quimiotropismo, y se comparará su respuesta con aquella de pCL13.

b. Diferenciación celular monocitoide

El PMA y ácido retinoico (RA) son inductores potentes de mARN CL13. Se conocen los PMA, RA (así como TGF-\beta) por inducir la diferenciación in vitro de las estirpes celulares monocitoides humanas primitivas U937 y HL60 así como precursores de monocito de médula ósea. Para examinar el papel del CL13 en este proceso, se pueden hacer crecer las estirpes celulares U937 y HL60 en la presencia de TGF-\beta, pCL13 (con o sin RA adicional). Se monitoreará su diferenciación mediante morfología, adherencia incrementada e inhibición de replicación (incorporación de 3H-timidina).

Se ha demostrado previamente que el crecimiento de MAC en medio libre de suero, y su diferenciación de monocitos a macrófagos in vitro se puede monitorear mediante la expresión de la superficie CD71, el receptor transferrina (13,15). Esto no es visto en la superficie de monolitos pero se encuentra en más del MAC en el día 7 del cultivo. Se harán crecer c con TGF-\beta o pCL13 o interferón gama luego se tiñen con anticuerpo CD71 tratado con fluoresceína y se examina citométricamente el flujo en el día 3 del cultivo (13). Se asociará la promoción de diferenciación con expresión temprana de este antígeno de superficie.

c. Producción de citocina

Se ha reportado TGF-\beta para inhibir producción inducida por LPS de TNF-\alpha e IL-1. Adicionalmente, como el TGF-\beta induce la expresión pCL13 en un número de situaciones, es posible que algunas de las funciones atribuidas al TGF-\beta se puedan contribuir mediante pCL13. Esto se puede examinar utilizando los bioensayos anteriores en los que el TGF-\beta y pCL13 son activos. Se estimularán los fibroblastos mediante TGF-\beta en la presencia de anticuerpo pCL13 de bloqueo y el pCL13 en la presencia de un anticuerpo TGF-\beta de bloqueo. Si las rutas autocrinas están en operación, se debe reducir e inhibir la función en cuestión mediante el anticuerpo de bloqueo. Se pueden también emprender experimentos de inhibición de oligonucleótido anticodificante.

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Ejemplo 6 Efecto de pCL13 en Células Endoteliales

Similar a TGF-\beta, el pCL13 puede modificar la expresión endotelial de moléculas de adhesión con regulación descendente posterior de adhesión de neutrófilos, monocitos o linfocitos. Adicionalmente el pCL13 puede modificar angiogenia y producción de mediador endotelial. Esta puede ser investigada al investigar el efecto de pCL13 en:

(i) Adherencia de leucocito al resto y endotelio vascular activado por citoquina;

(ii) Producción de citoquinas endoteliales tales como IL-8, MCP-1, IL-1, IL-6, y endotelina;

(iii) Síntesis prostanoide endotelial;

(iv) Actividad procoagulante endotelial; y

(v) Angiogenia (in vitro y vivo).

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Ejemplo 7 Efecto de pCL13 sobre la función de los linfocitos

Similar al TGF-\beta, puede actuar el pCL13 como un agente inmunosupresor. Este se puede investigar al determinar el efecto de pCL13 en:

(i) Proliferación celular T y B;

(ii) Síntesis de inmunoglobulina;

(iii) actividad de célula LAK y célula NK; y

(iv) Producción in vitro de citocinas (proteína y/o mARN) tal como IL-2, IFN-g, IL-4, IL-5, IL-10.

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Ejemplo 8 Efecto de pCL13 en Proliferación Celular de Tumor

El pCL13 puede como el TGF-\beta inhibir la replicación de células de tumor y promover diferenciación de tumor. Este se puede investigar al determinar el efecto de pCL13 en:

(i) Investigación de la proliferación in vitro de un rango amplio de estirpes celulares de tumor disponibles a través de el ATCC; y

(ii) Observar el cambio en fenotipo de tumor hacia una forma más diferenciada (por ejemplo cambio de fenotipo no adhesivo a adhesivo).

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Ejemplo 9 Efecto de pCL13 en Producción de Glucosaminoglucano mediante células CHO no transfectadas y transfectadas

Se investiga el efecto de pCL13 en la producción de glucosaminoglucano utilizando células CHO no transfectadas y transfectadas. La Figura 10 muestra análisis de glucosaminoglucano en las células CHO no transfectadas (KI) y CL13 transfectado (P4N, 15 y 24) utilizando ensayo de azul de dimetil-metileno (DMB) (9, 10). P4N, 15 y 24 producen cantidades incrementadas de pCL13 respectivamente. Se cultivan las células en medio DMEM/F-12 que contiene 5% de FCS durante 5 días. Luego se cargan las células en DMEM libre de FCS durante 24 horas. A un medio de cultivo celular de 100 \mul se agrega 100 \mul de tinte DMB y se lee la absorbancia en 492 nm inmediatamente. Los resultados representan la media +/-DE de pozos triplicados.

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Ejemplo 10 Efecto de pCL13 en Producción de Colágeno mediante Células CHO no Transfectadas y Transfectadas

Se investiga el efecto de pCL13 en producción de colágeno. La Figura 11 muestra el efecto de pCL13 en la producción de colágeno mediante células CHO no transfectadas (K1) y CL13 transfectadas (P4N, 15 y 24). El P4N, 15 y 24 produce cantidades incrementadas de pCL13 respectivamente. Se cultivan las células en medio DMEM/F-12 que contiene 5% de FCS durante 5 días. Luego se cargan las células en DMEM libre de FCS durante 24 horas. Se determina la cantidad de colágeno producida mediante estas células utilizando un aparato Biodot. Se coloca el sobrenadante del cultivo (50 \mul) en membrana de nitrocelulosa. Se lava la membrana en 100 \mul de PBS y se seca. Se tiñe el colágeno retenido en la membrana de nitrocelulosa con 0.1% de tinte rojo Sirius (18). Se cortan las manchas individuales y se eluyen con NaOH 0.1 N y se lee la absorbancia en 550 nm. Los resultados representan la media +/-DE de pozos triplicados.

Se conducen los Ejemplos 11 a 16 descritos aquí con la construcción C13SA o pCL13 producida a partir de la construcción C13SA. Como se describió anteriormente, la construcción C13SA varía de CL13 en la que no incluye secuencias de codifican propéptido.

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Ejemplo 11 Efectos de pCL13 en producción de proteína de matriz a. Producción de glucosaminoglucano

La Figura 12 muestra el efecto de pCL13 en producción de proteoglucano marcado 35S en fibroblastos de pulmón 3T3 (fibroblastos de ratón) y neonatal humano (CCD 34 Lu) después de 24 horas de incubación. Se cargan las células confluentes al medio de cultivo RPMI que contiene 0.1% de BSA y 50 \mug/ml de ácido ascórbico durante 24 horas. Luego se incuban las células con diferentes concentraciones de pCL13 en la presencia de 10 \mulCi/ml de sulfato [^{35}S] durante 24 horas. Al final del periodo de incubación se remueve el medio y se agregan inhibidores de proteasa. Se extraen los proteoglucanos presentes en la matriz extracelular utilizando clorhidrato de guanidina 4M que contiene inhibidores de proteasa durante una hora a 4ºC. Se determina la producción de proteoglucano total en el medio y se determina la fracción celular utilizando columnas cromatográficas Sephadex G-25 (19). Los resultados representan la media +/-DE de pozos triplicados.

En las células 3T3, después de 24 horas de periodo de incubación, el pCL13 origina un incremento dependiente de dosis en la producción de proteoglucano. Se observa un incremento del 92% en 25 ng/ml de concentraciones de pCL13 y se observa incremento del 60% en 6.7 y 2.2 ng/ml de concentración de pCL13. En comparación el TGF-\beta de 20 ng/ml de producción de proteoglucano elevada mediante 95%. En las células CCD 34Lu, el pCL13 en 50 ng/ml origina 23% de incremento en la producción de proteoglucano y 6% de incremento en 25 ng/ml de concentración de pCL13. En comparación el TGF-\beta en 10 ng/ml de producción de proteoglucano elevada por 36%.

b. Producción de colágeno

La Figura 13 muestra el efecto de pCL13 on producción de colágeno tipo 1 en fibroblastos de pulmón neonatal (CCD 34 Lu). Se cargan las células confluentes en medio de cultivo DMEM que contiene 0.1% de BSA y 50 \mug/ml de ácido ascórbico durante 24 horas. Luego se incuban las células con concentraciones de pCL13 diferentes en la presencia de 50 \mug/ml de b-aminopropionitrilo durante 24 horas. Al final del periodo de incubación se determina la cantidad de colágeno presente en el medio utilizando un ELISA. Brevemente, se incuban los sobrenadantes de los fibroblastos tratados y no tratados así como estándar de colágeno tipo 1 durante 72 horas a 4ºC en placas de microtítulo de 96 pozos (NUNC). Al final del periodo de incubación se lavan las placas, se bloquean con 4% de albúmina de suero bovino en salina amortiguada con fosfato, se incuba con anticuerpo monoclonal de colágeno tipo 1 (Sigma). Luego se relavan las placas y se agrega IgG de ratón biotinilado y se sigue por complejo de estreptavidina. Después de la adición de sustrato, se leen las placas en 490/405 nm o en un lector de placa. Los resultados representan la media +/-DE de pozos triplicados. El pCL13 en 50 ng/ml origina 140% de incremento en la producción de colágeno, 190% de incremento en 25 ng/ml y 11% en 5 ng/ml de concentración. En comparación el TGF-\beta en 10 ng/ml de producción de colágeno elevada mediante 34% después de 24 horas. La respuesta TGF-\beta relativamente pobre tiene ocurrencia porque el TGF-\beta requiere 48-78 horas para lograr efecto máximo.

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Ejemplo 12 Efecto de pCL13 en replicación de fibroblasto a. Crecimiento bajo condiciones de suero limitantes

Se determina la actividad del factor de crecimiento de pCL13 y el factor de crecimiento de transformación beta (TGF\beta) en el crecimiento de células detenidas BFF (fibroblastos de prepucio de infante humano) y 3T3 (fibroblastos de ratones). Se agregan las citoquinas a células BFF y 3T3 en 0.2% de medio suero bovino fetal (FBS) para determinar si ellos son verdaderos factores de crecimiento que pueden estimular una célula restante para progreso a través del ciclo celular y experimentar división. Se desarrolla el ensayo de factor de crecimiento como se describió previamente (11, 12). En breve, las células se colocan en placas en 1.2x10^{3} de células/pozo en 200 mL de medio de detección de crecimiento (0.2% de FBS) durante 72 h. Luego se reemplaza el medio con 0.2% de medio FBS fresco con o sin citoquinas y 0.5 mCi/pozo de [3-H] Timidina durante unas 72 h adicionales. Luego se cultivan las células con un cultivador de célula automatizado se cuenta la absorción de timidina en las células de proliferación en un analizador de centelleo de líquido. Los controles incluyen solo 0.2% de medio FBS, solo 10% de medio FBS (medio de crecimiento normal), y pCL13 diluyente (0.1% de CHAPS) en 0.2% de medio FBS.

Los resultados mostrados en la Figura 14 indican que el pCL13 parece tener verdadera actividad de factor de crecimiento en ambos BFF humanos. El TGF\beta aparece por ser inhibidor para las células BFF. Ninguno de pCL13 ni TGF\beta exhiben actividad de factor de crecimiento en 3T3 bajo las condiciones de este ensayo.

b. Crecimiento en la presencia de suero

Se determina la actividad de factor de crecimiento de pCL13 y factor de crecimiento de transformación beta (TGF\beta) o el crecimiento de células detenidas BFF (fibroblastos de prepucio de infante humano) y 3T3 (fibroblastos de ratones). Se agregan las citoquinas a BFF y células 3T3 en 2% de medio de suero bovino fetal (FBS) para determinar si ellos hacen crecer sustancias mejoradas que pueden mejorar la velocidad en la que las células se mueven a través del ciclo celular. Se desarrolla el ensayo de factor de crecimiento como se describió previamente (11, 12). En breve, las células se colocan en placa en 1.2x10^{3} de células/pozo en 200 ml de medio de detección de crecimiento (0.2% de FBS) durante 72 h. El medio luego se reemplaza con 2% de medio FBS fresco con o sin citoquinas y 0.5 mCi/pozo de [3-H] Timidina durante 72 h adicionales. Luego se cultivan las células con un cosechador celular automatizado y se cuenta la absorción de timidina en las células de proliferación en un analizador de centelleo de líquido. Los controles incluyen solo 2% de medio FBS, solo 10% de medio FBS (medio de crecimiento normal), y diluyente pCL13 (0.1% de CHAPS) en 0.2% de medio FBS.

Los resultados (Figura 15) muestran que el pCL13 tiene un efecto mejorado de crecimiento en células BFF y murino 3T3 humanas. El TGF\beta aparece por ser inhibidor para células BFF ya que tiene actividad mejoradora de crecimiento en una concentración en células 3T3.

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Ejemplo 13 Efectos de pCL13 en replicación de monocytoid estirpes celulares monocitoides humanas

Se compara el pCL13 con el factor de crecimiento de transformación beta (TGF\beta) y el interferón alfa 2b (IFNa2b), durante su efecto antiproliferativo en la estirpe celular U937 (un linfoma histiocítico similar a monocito humano) y Mono Mac 6 (una estirpe celular de leucemia monoblástica). Las células se colocan en placa en 3x10^{4} células/pozo en 20 0mL de 10% de medio FBS (suero bovino fetal) con o sin citocinas. Durante las 6 h finales de un periodo de incubación de 48 h, se pulsan los pozos con 0.5 mCi/pozo de [3-h] Timidina. Luego se cultivan las células con un cosechador celular automatizado y se cuenta la absorción de timidina en las células de proliferación en un analizador de centelleo de líquido. Los controles incluyen solo 10% de medio FBS y diluyente pCL13 en 10% de medio FBS.

Los resultados (Figura 16) indican que las dos tandas de pCL13, b447 y b448A. en concentraciones de 10 y 100 ng/ml tienen un efecto antiproliferativo pequeño en dos estirpes celulares humanas origen monocítico. Esto contrasta con los más fuertes efectos antiproliferativos de TGF\beta (2 y 20 ng/ml) e IFNa2b (10^{3} y 10^{5} U/ml) en células U937 y Mono Mac 6.

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Ejemplo 14 Efectos de pCL13 en producción de macrófago de TNF

Los datos en la Figura 17 muestran el efecto de concentración de pCL13 diferente en LPS estimulado por producción TNF-\alpha de macrófagos humanos derivados de cultivo. Se purifican los monocitos por elutitulación de capas leucocíticas y se cultiva en medio Iscove que contiene 0.1% de BSA (13, 16). En el día 5, se incuban las células con concentraciones diferentes de pCL13 en la presencia de 10 \mug/ml de LPS en medio Iscove durante 24 horas. Al final del periodo de incubación se remueve el medio y se determina la cantidad de TNF-\alpha presente utilizando un emparedado ELISA (Genzyme). Los resultados muestran que el pCL13 origina inhibición de LPS inducido por producción de TNF-\alpha. Se observa 47% de una inhibición en 20 ng/ml de pCL13 y se observa 27% de una inhibición en 7 ng/ml de pCL13. En comparación el TGF-\beta solo tiene aproximadamente 10% de reducción en 20 ng/ml.

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Ejemplo 15 Efectos de pCL13 en citotoxicidad de tumor

El efecto directo de pCL13 y TGF\beta en células objetivo de tumor (carcinoma de vejiga 5637 y adenocarcinoma de mama MDA-MB-231) y se examina el efecto de pCL13 y TGF\beta en muerte mediada por monocito de células tumorales al medir la liberación de ADN radiomarcado de células objetivo de tumor lisado. Se desarrolla el ensayo de citotoxicidad como se describió previamente (20). Se agregan células objetivo de tumor (marcadas en la fase de crecimiento exponencial con 20 \muCi de [3H] Timidina/1x10^{6} de células durante 24 h) a los monocitos (efectores) en un efector: relaciones objetivo (E: T) de 10: 1 durante 72 h. Luego se centrifugan las células y se cuentan los sobrenadantes en fluido de centelleo en un analizador de centelleo de líquido. Los controles incluyen células de tumor no tratadas, células de tumor no tratadas cocultivadas con monocitos y diluyente de citoquina solo. Se incuban en TGF\beta y pCL13 con monocitos durante 48 h.

Los resultados se muestran en la Figura 18. Ninguno del pCL13 ni TGF\beta tiene un efecto citotóxico directo en las líneas de tumor 5637 o MDAMB-231. Sin embargo el pCL13 mejora la capacidad de los monocitos para matar células 5637. El pCL13 también mejora la muerte mediada por monocito de de T24 (carcinoma de vejiga), J82 (carcinoma de vejiga), T47D (carcinoma ductal de la mama) y JCPL (carcinoma de ovario) (datos no mostrados).

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Ejemplo 16 Efectos In vivo de pCL13

Se inyectan ratas (Fisher F343) subcutáneamente en su lomo con 0.1 ml de tres concentraciones de pCL13, un control salino negativo y TGF\beta. Se separan ampliamente las inyecciones y se administra a cada con el panel completo de 5 inyecciones. Las cantidades de pCL13 inyectadas son 60 ng. 30 ng y 2 ng. La dosis de TGF\beta administrado es 10 ng. Luego se sacrifican los animales en intervalos iniciando en 3 horas y hasta 2 semanas luego de administración. Se utilizan tres animales para cada punto de tiempo, y luego de sacrificio se extirpan las áreas en las que el material se ha administrado, se fijan con formalina, se montan, luego se tiñen con hematoxilina y eosina. Luego se evalúa el material microscópicamente.

a. Cambios Macroscópicos

No existen diferencias macroscópicas entre las biopsias en ninguno de los animales, bajo cualquiera de las varias condiciones diferentes al punto de tiempo de dos semanas. En el punto de tiempo de dos semanas sin embargo, las biopsias, solo de las áreas con las dos más altas dosis de pCL13, muestran obvias diferencias macroscópicas en el área entre le músculo y la piel.- esta área parece que se expande un poco y tiene una apariencia brillante blanca, que sugiere exceso de precipitación de proteína de matriz.

b. Evaluación Microscópica

No se observan diferencias en las secciones histológicas en puntos de tiempo de tres horas. Sin embargo en el punto de tiempo del día uno (24 hora) las áreas en las que se han administrado concentraciones más altas de pCL13 demuestran un infiltrado celular mononuclear que es un poco desigual en carácter y está predominantemente presente en el tejido subcutáneo (Figura 19A). No se observan cambios similares en cualquiera del control salino negativo (Figura 19B) o TGF\beta en una dosis de de 10 ng/ml. El infiltrado parece estar máximamente presente en los días uno y dos y es marcadamente disminuido o ausente a partir del día cuatro hacia delante. Estos hallazgos sugieren que el pCL13 es quimiotáctico para macrófagos y o linfocitos.

Este estudio no se emprende en tal una forma como para ser capaz de suministrar buenos datos cuantitativos sobre la cantidad de colágeno que está presente en las áreas en donde se administran las dos sustancias. Sin embargo en conjunto con la apariencia macroscópica, parece probable que se incremente la cantidad de colágeno en las muestras que contienen las dos dosis más altas del clon 13, por lo menos en el punto de tiempo de la segunda semana.

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Ejemplo 17 Variantes de Clon 13

Se emprende redetección utilizando colección de cADN de pulmón fetal utilizando una porción de la secuencia codificante del clon 13 como una sonda. Este se emprende con el fin de determinar la existencia de las variantes del clon 13. Utilizando este método se obtienen un número de clones adicionales (a1b2, h1, b1, d2, dd2, f1 y u2) y se ilustra la secuencia de estos clones en la Figura 20A que muestra la secuencia de nucleótido y la Figura 20B que muestra una porción del marco de lectura abierto. También se comparan las secuencias con aquellas de la secuencia del clon 13 original (C13). A partir de la Figura 20B, se puede ver que la región codificante traducida de estas variantes de clon 13 exhiben solo diferencias menores. Esto ocurre en los aminoácidos 9, 48 y 202. Estos están todos en la región de propéptido y están probablemente para representar las diferencias genéticas entre los individuos cuyos ARN se utilizan para prepara la colección de cADN. Sin embargo, en el nivel de ADN, existe dominantemente variación sustancial en la región no traducida 5', pero en un grado más pequeño en la región no traducida 3'. Mientras que estas variantes pueden ser bien importantes en áreas tales como regulación transcripcional ellas son no traducidas y por lo tanto no pueden afectar la bioactividad.

Algunos de los clones aislados y expuestos en la Figura 20A (por ejemplo b2 y h1) aún aunque tienen región no traducida 5' muy larga, todavía no representan la secuencia de codificación completa. Esto puede ser comprobado como cuando se utiliza la región no trasladada 5' como una soda, en northern blots, es demostrable la hibridación a una banda de aproximadamente 7 kb. Las razones para esta variación de longitud marcada no son claras pero podrían incluir empalme alterno de un exón no traducido, el uso de sitios de partida transcripcionales alternos o aún duplicación de gen.

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Ejemplo 18 Expresión de clon utilizando un sistema eucariótico de levadura

La región bioactiva del clon 13, modificada en su terminal amino para contener un número de epítopos marcadores adicionales (construcción C13SA/5H -Figura 21) se clona en el plásmido pPIC9. Luego se utiliza este plásmido para transformar la levadura Pichia pastoris de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen Corp.). La levadura, se transforma exitosamente mediante este plásmido seleccionado sobre la base de sensibilidad al metanol. Luego se hacen crecer colonias de levadura durante dos días, en suspensión según las instrucciones de los fabricantes. Se recolecta el medio de cultivo y se somete una alícuota a SDS-PAGE seguido por western blotting. Se visualizan las bandas que contienen pCL13 utilizando el anticuerpo anti-FLAG M2 utilizando procedimientos estándar. Se lleva a cabo electroforesis bajo las condiciones de reducción y no reducción. Se puede ver que se producen grandes cantidades de la proteína que son fácilmente detectables con medio de cultivo de levadura no concentrado, que indican secreción de la proteína en una forma apropiada (Figura 22). El peso molecular se aproxima a aquel esperado en las bases de la composición de aminoácido y el doblamiento del peso molecular bajo condiciones de no reducción (Figura 22) indica que la proteína es, como se espera, un disulfuro unido a dímero. Esta es la configuración estructural correcta e indica que ha sido procesada y secretada la proteína por el organismo levadura en una forma apropiada.

La capacidad para expresar este complejo dimérico, proteína con un alto enlace disulfuro contenido en sistemas de levadura es altamente ventajoso como su dramáticamente más bajo costo de producción por cantidad de unidad de proteína y lo hace mucho más adecuado como un biofarmacéutico comparado con el material producido mediante células de mamífero.

Mientras que este trabajo ha sido emprendido con la levadura Pichia pastoris, es completamente probable que secreción similar ocurrirá con un rango de organismos de levadura traducidos con un vector de expresión de levadura apropiado. Como la región bioactiva es expresada no contiene sititos de n-glucosilación potenciales, la hiperglucosilación, que algunas veces ocurre con proteínas de mamíferos expresadas mediante cepas de levadura, no es un problema.

Referencias

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Se apreciará por las personas expertas en la técnica que numerosas variaciones y/o modificaciones se pueden hacer a la invención como se muestra en las modalidades específicas. Las presentes modalidades son, por lo tanto consideradas en todos los aspectos como ilustrativas y no restrictivas.

Claims (24)

1. Un polinucleótido aislado que se puede obtener a partir de cromosoma 19p13.1 humano, en donde dicha molécula de polinucleótido comprende una secuencia de nucleótido que codifica una proteína que pertenece a la superfamilia TGF-\beta que tiene un sitio RXXR conservado y 7 residuos de cisteína conservados, en donde dicha proteína codificada es capaz de:

(i) ser expresada por línea de fibroblasto neonatal humano CCD34Lu en niveles incrementados en respuesta a IGF- 1, PDGF BB, TGF-\beta o TNF-\alpha;

(ii) ser expresada por macrófagos en niveles incrementados en respuesta a GM- CSF, M- CSF, IL- 2 o TNF-\alpha; y

(iii) ser expresada por células endoteliales de vena umbilical humanas en niveles incrementados en respuesta a ECGF.

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2. Una molécula de polinucleótido aislada de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proteína codificada es capaz de:

(iv) exhibir actividad de factor de crecimiento en fibroblastos de prepucio de infante humano.

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3. Una molécula de polinucleótido aislada de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicha molécula de polinucleótido comprende una secuencia de nucleótido que corresponde a aquella mostrada en la Figura 1.

4. Una molécula de polinucleótido aislada de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la secuencia de nucleótido corresponde a una secuencia de nucleótido variante seleccionada de a1, b1, b2, d2, dd2, f1, h1 y u2 como se muestra en la Figura 20A.

5. Una molécula de polinucleótido aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la secuencia de nucleótido que codifica dicha proteína no comprende la secuencia que codifica el líder nativo o propéptido.

6. Una molécula de polinucleótido aislada de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicha secuencia de nucleótido que codifica la proteína incluye una secuencia que codifica un líder heterólogo.

7. Una molécula de polinucleótido aislada de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicho líder heterólogo es la folitropina (FSH) destacada.

8. Un vector que comprende una molécula de polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes ligada de forma operable a un promotor adecuado.

9. Un vector que comprende una molécula de nucleótido de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la molécula de polinucleótido es liga de forma operable en orientación opuesta a un promotor adecuado tal que la expresión procede 5' al terminal 3' para producir ARN anticodificante.

10. Un vector de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la molécula de polinucleótido incluye o se liga a una secuencia de nucleótido que codifica un dominio ribozima.

11. Una proteína codificada por una molécula de polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

12. Un organismo transformado con una molécula de polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o un vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde dicho organismo se selecciona de estirpes celulares eucarióticas, levadura y plantas.

13. Un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a la proteína de acuerdo con la reivindicación 11.

14. Una proteína o porción antigénica de la misma, que se une al anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 13.

15. Un método para producir una proteína de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende transformar un organismo anfitrión adecuado seleccionado de estirpes celulares eucarióticas, levadura y plantas con una molécula de polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicha molécula de polinucleótido es constitutiva e indeciblemente expresada en dicho organismo anfitrión.

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16. Una composición farmacéutica que comprende una proteína de acuerdo con la reivindicación 11 o una proteína o porción antigénica de la misma de acuerdo con la reivindicación 14 en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable.

17. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 11 o una proteína o porción antigénica de la misma de acuerdo con la reivindicación 14 para uso en el tratamiento de una enfermedad o afección seleccionada del grupo que consiste de cicatrización y/o consolidación de fractura, lesión isquémica, cáncer, enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias crónicas, inmunosupresión, trastornos fibróticos/fibroproliferativos tales como artritis reumatoide, arterosclerosis, fibrosis pulmonar, escleroderma, cirrosis y queloides.

18. Uso de una proteína de acuerdo con la reivindicación 11 o una proteína o porción antigénica de la misma de acuerdo con la reivindicación 14 en la fabricación de una composición para el tratamiento de una enfermedad o afección seleccionada del grupo que consiste de cicatrización y/o consolidación de fractura, lesión isquémica, cáncer, enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias crónicas, inmunosupresión, trastornos fibróticos/fibroproliferativos tales como artritis reumatoide, arterosclerosis, fibrosis pulmonar, escleroderma, cirrosis y queloides.

19. Un método para producir una proteína de acuerdo con la reivindicación 15, en donde dicha línea celular eucariótica es una línea celular de mamífero.

20. Un método in vitro para diagnosticar una enfermedad o trastorno en un sujeto, dicha enfermedad o trastorno se selecciona de cáncer y trastornos inflamatorios y fibróticos, dicho método comprende detectar la presencia de una proteína de acuerdo con la reivindicación 11.

21. El método de acuerdo con la reivindicación 20, en donde el trastorno inflamatorio o fibrótico es artritis reumatoide, cirrosis o aterosclerosis.

22. Un equipo para uso en el método de acuerdo con la reivindicación 20 o 21, en donde el equipo comprende la proteína de acuerdo con la reivindicación 11 y/o el anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 13.

23. Un equipo para uso en el método de acuerdo con la reivindicación 20 o 21, en donde el equipo comprende cebadores de nucleótido para la secuencia de nucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para ensayos basados en PCR.

24. Una proteína de acuerdo con la reivindicación 11 en donde la proteína es la proteína madura.