ES2325121T3 - Procedimiento para la deteccion de metilaciones de citosina en muestras de adn inmovilizado. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para el análisis de patrones de metilación de citosina en muestras de ADN genómico, en el que se realizan las siguientes etapas de procedimiento: a) se aísla el ADN genómico a partir de células u otros materiales acompañantes y se une de forma esencialmente irreversible a una superficie, b) se trata el ADN unido a la superficie preferiblemente con un bisulfito (=disulfito, hidrogenosulfito) de modo que la citosina se transforme en una base distinta en el comportamiento de apareamiento de bases en el dúplex de ADN, mientras que la 5-metilcitosina permanece intacta, c) se retiran los reactivos usados en la etapa b) en una etapa de lavado, d) se amplifican fragmentos seleccionados del ADN inmovilizado en una reacción con polimerasa, e) se analizan los amplificados respecto a su secuencia.
Description
Procedimiento para la detección de metilaciones
de citosina en muestras de ADN inmovilizado.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la detección de la metilación de citosina en
muestras de ADN.
Los niveles de observación bien estudiados según
los desarrollos metodológicos de los últimos años en la biología
molecular son los genes mismos, la traducción de estos genes a ARN
y las proteínas generadas a partir de los mismos. Cuándo en el
transcurso del desarrollo de un individuo se activa cuál gen y cómo
se controla la activación e inhibición de determinados genes en
determinadas células y tejidos puede correlacionarse con la
extensión y carácter de la metilación del gen o del genoma. A este
respecto, se manifiestan estados patológicos en un patrón de
metilación modificado de genes individuales o del genoma.
La 5-metilcitosina es la base
modificada covalentemente más frecuente en el ADN de células
eucarióticas. Desempeña un papel, por ejemplo, en la regulación de
la transcripción, en la imprimación genética y en la tumorigénesis.
La identificación de 5-metilcitosina como componente
de información genética es por tanto de elevado interés. Las
posiciones de 5-metilcitosina no pueden sin embargo
identificarse mediante secuenciación, ya que la
5-metilcitosina presenta el mismo comportamiento de
apareamiento de bases que la citosina. Además, en una amplificación
por PCR se pierde completamente la información epigenética que
porta la 5-metilcitosina.
Un procedimiento relativamente nuevo y por ahora
empleado con más frecuencia para el análisis en ADN de
5-metilcitosina se basa en la reacción específica
de bisulfito con citosina, que se transforma en uracilo tras
hidrólisis alcalina posterior, que se corresponde en su
comportamiento de apareamiento de bases con la timidina. La
5-metilcitosina no se modifica por el contrario en
estas condiciones. Por tanto, el ADN original se transforma de modo
que la metilcitosina, que originalmente no puede diferenciarse de
la citosina por su comportamiento de hibridación, puede detectarse
ahora mediante técnicas de biología molecular "normales" como
la única citosina restante mediante amplificación e hibridación o
secuenciación. Todas estas técnicas se basan en el apareamiento de
bases, que ahora se aprovecha totalmente. El estado de la técnica,
en lo que se refiere a la sensibilidad, se define mediante un
procedimiento que incluye el ADN a analizar en una matriz de
agarosa, reduciendo así la difusión y renaturalización del ADN (el
bisulfito reacciona sólo con ADN monocatenario) y se sustituyen
todas las etapas de precipitación y purificación por una rápida
diálisis (Olek A, Oswald J, Walter J. "A modified and improved
method for bisulphate based cytosine methylation analysis".
Nucleic Acids Res., 15 de diciembre de 1996; 24(24):
5064-6). Con este procedimiento, pueden analizarse
células individuales, lo que ilustra el potencial del
procedimiento. Sin embargo, se han analizado hasta ahora sólo
regiones individuales de hasta aproximadamente 3.000 pares de bases
de longitud, no siendo posible un análisis global en células de
miles de posibles análisis de metilación. Sin embargo, este
procedimiento no puede analizar fiablemente tampoco fragmentos muy
pequeños de cantidades de muestra bajas. Estos se pierden en la
matriz a pesar de la protección de difusión.
Puede deducirse una visión general sobre las
posibilidades conocidas adicionales de detectar
5-metilcitosina a partir de los siguientes artículos
genéricos: Rein T, DePamphilis ML, Zorbas H. "Identifying
5-methylcytosine and related modifications in DNA
genomes". Nucleic Acids Res. 15 de mayo de 1998;
26(10): 2255-64.
La técnica del bisulfito se emplea hasta ahora
con pocas excepciones (por ejemplo, Zeschnigk M, Lich C, Buiting K,
Dörfler W, Horsthemke B. "A single-tube PCR test
for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi
syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN
locus". Eur. J. Hum. Genet., marzo-abril
de 1997; 5(2): 94-8) sólo en la
investigación. Pero siempre se amplifican y secuencian
completamente trozos específicos cortos de un gen conocido mediante
un tratamiento con bisulfito (Olek A, Walter J. "The
pre-implantation ontogeny of the H19 methylation
imprint". Nat. Genet., noviembre de 1997; 17(3):
275-6) o se detectan posiciones de citosina
individuales mediante una "reacción de extensión de cebador"
(Gonzalgo ML, Jones PA. "Rapid quantitation of methylation
differences at specific sites using
methylation-sensitive single nucleotide primer
extension (Ms-SNuPE)". Nucleic Acids Res.
15 de junio de 1997; 25(12): 2529-31, patente
WO 9500669) o una etapa enzimática (Xiong Z, Laird PW. "COBRA: a
sensitive and quantitative DNA methylation assay". Nucleic
Acids Res. 15 de junio de 1997; 25(12):
2532-4). Además, se ha descrito también la detección
mediante hibridación (Olek et al., documento WO 99
28498).
La urea mejora la eficacia del tratamiento con
bisulfito antes de la secuenciación de
5-metilcitosina en ADN genómico (Paulin R, Grigg GW,
Davey MW, Piper AA. "Urea improves efficiency of
bisulphate-mediated sequencing of
5'-methylcytosine in genomic DNA". Nucleic
Acids Res. 1 de noviembre de 1998; 26(21):
5009-10).
Son otras publicaciones que se ocupan de la
aplicación de la técnica del bisulfito para la detección de la
metilación en genes individuales:
Grigg G, Clark S. "Sequencing
5-methylcytosine residues in genomic DNA".
Bioassays, junio de 1994; 16(6):
431-6, 431; Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B,
Buiting K, Horsthemke B, Dörfler W. "Imprinted segments in the
human genome: different DNA methylation patterns in the
Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined
by the genomic sequencing method". Hum. Mol. Genet, marzo
de 1997; 6(3): 387-95; Fell R, Charlton J,
Bird AP, Walter J, Reik W. "Methylation analysis on individual
chromosomes: improved protocol fort bisulphate genomic
sequencing". Nucleic Acids Res., 25 de febrero de 1994;
22(4): 695-6; Martin V, Ribieras S, Song Wang
X, Rio MC, Dante R. "Genomic sequencing indicates a correlation
between DNA hypomethylation in the 5' region of the pS2 gene and in
its expression in human breast cancer cell lines". Gene,
19 de mayo de 1995; 157(1-2):
261-4; documentos WO 97/46705, WO 95/15373 y WO
95/45560.
Es otro procedimiento conocido la denominada PCR
sensible a la metilación (Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin
BD, Baylin SB. (1996), "Methylation-specific PCR:
a novel PCR assay for methylation status of CpG islands".
Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 3 de septiembre; 93(18):
9821-6). Para este procedimiento, se usan cebadores
que hibridan sólo con una secuencia que se origina mediante el
tratamiento con bisulfito de un ADN no metilado en la posición
afectada, o también cebadores inversos que se unen sólo a un ácido
nucleico que se origina mediante el tratamiento con bisulfito de un
ADN no metilado en la posición afectada. Con estos cebadores,
pueden producirse así amplificados, cuya detección proporciona a su
vez evidencias de la presencia de una posición metilada o no
metilada en la muestra a la que se unen los cebadores.
Es también un nuevo procedimiento la detección
de la metilación de citosina mediante una PCR TaqMan, que es
conocida como Methyl-Light (documento WO 00/70090).
Con este procedimiento, es posible detectar directamente el estado
de metilación de posiciones individuales o cortas en el transcurso
de la PCR, de modo que se ahorra un análisis posterior de los
productos.
Puede deducirse una visión general del estado de
la técnica en la preparación de matrices oligoméricas a partir de
un número especial aparecido en enero de 1999 de Nature
Genetics (Nature Genetics Supplement, volumen 21, enero de
1999), de la bibliografía allí citada y de la patente de EE.UU.
5994065 sobre procedimientos para la preparación de portadores
sólidos para moléculas diana como oligonucleótidos con señal de
fondo no específica reducida.
Para el muestreo de una matriz de ADN
inmovilizado, se usan múltiples sondas marcadas fluorescentemente.
Es especialmente adecuada para marcadores de fluorescencia la
simple fijación de los colorantes Cy3 y Cy5 al extremo
5'-OH de la sonda respectiva. La detección de la
fluorescencia de las sondas hibridadas se realiza, por ejemplo,
mediante un microscopio confocal. Los colorantes Cy3 y Cy5, además
de muchos otros, son comercialmente obtenibles.
La espectrometría de masas con
desorción/ionización de la matriz asistida por láser
(MALDI-TOF) es un desarrollo muy eficaz para el
análisis de biomoléculas (Karas M, Hillenkamp F. "Laser
desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding
10,000 daltons". Anal Chem., 15 de octubre de 1988;
60(20): 2299-301). Se embebe un analito en
una matriz fotoabsorbente. Mediante un pulso láser corto, se
evapora la matriz y se traspasa la molécula de analito así no
fragmentada a la fase gaseosa. Mediante choques con moléculas de
matriz, se consigue la ionización del analito. Una tensión aplicada
acelera los iones en un tubo de vuelo exento de campo. Debido a sus
diferentes masas, se aceleran fuertemente de forma distinta los
iones. Los iones más pequeños alcanzan el detector antes que los
mayores.
La espectroscopía MALDI-TOF es
excelentemente adecuada para el análisis de péptidos y proteínas.
El análisis de ácidos nucleicos es algo más difícil (Gut, I. G. y
Beck, S. (1995), "DNA and Matrix Assisted Laser Desorption
Ionization Mass Spectrometry". Molecular Biology: Current
Innovations and Future Trends 1: 147-157). Para
los ácidos nucleicos, la sensibilidad es aproximadamente 100 veces
peor que para péptidos, y se reduce desproporcionadamente al
aumentar el tamaño del fragmento. Para los ácidos nucleicos, que
tienen una cadena principal cargada muy negativamente, el proceso
de ionización mediante la matriz es esencialmente ineficaz. En la
espectroscopia MALDI-TOF, la elección de la matriz
desempeña un papel eminentemente importante. Para la desorción de
péptidos, se han encontrado varias matrices muy eficaces que
proporcionan como resultado una cristalización muy fina. Para ADN,
hay hasta ahora de hecho varias matrices atractivas, pero no se
reducía así la diferencia de sensibilidad. La diferencia de
sensibilidad puede reducirse modificando químicamente el ADN de modo
que sea más similar a un péptido. Los ácidos nucleicos de
fosforotioato, en los que los fosfatos convencionales de la cadena
principal se sustituyen por tiofosfatos, pueden transformarse
mediante una sencilla química de alquilación en un ADN de carga
neutra (Gut, I. G. y Beck, S. (1995), "A procedure for selective
DNA alkylation and detection by mass spectrometry". Nucleic
Acids Res. 23: 1367-1373). El acoplamiento de
un "marcaje de carga" a este ADN modificado da como resultado
el aumento de la sensibilidad al mismo valor que se ha encontrado
para péptidos. Otra ventaja del "marcaje de carga" es la
estabilidad elevada del análisis frente a impurezas, que dificultan
en gran medida la detección de sustratos no modificados.
El ADN genómico se obtiene mediante
procedimientos estándar a partir de ADN de muestras de células,
tejidos u otros ensayos. Esta metodología estándar se encuentra en
referencias como Fritsch y Maniatis, "Molecular Cloning: A
Laboratory Manual", 1989.
Después de la invención de la PCR, se han dado a
conocer en los siguientes años numerosas variantes que refinan esta
técnica para la amplificación del ADN. Ha de mencionarse aquí
particularmente la multiplexación de PCR (PCR multiplexada), en la
que se utilizan más de 2 cebadores específicos y pueden producirse
por tanto en un recipiente de reacción una pluralidad de distintas
amplificaciones específicas. Es también especialmente interesante
la denominada PCR anidada, que se usa entre otras cosas para la
detección de cantidades de ADN especialmente bajas. Este tipo de
PCR está compuesto por dos amplificaciones consecutivas en las que
los cebadores de la segunda amplificación se encuentran dentro del
primer amplificado y no son idénticos a los cebadores de la primera
amplificación. De este modo, se consigue una especificidad
especial, ya que los cebadores de la segunda amplificación
funcionan entonces sólo cuando se ha producido el fragmento
pretendido en la primera amplificación. En contraposición, no se
excluye tan bien la multiplicación de posibles productos secundarios
de la primera amplificación en la segunda.
Los presentes procedimientos para análisis de la
metilación que comprenden una reacción de bisulfito tienen todos la
desventaja de que la solución de reacción no puede utilizarse
inmediatamente para una reacción en cadena de la polimerasa
posterior, ya que el alto contenido en sales de la reacción de
bisulfito la afecta negativamente. Deben llevarse a cabo por tanto
en la práctica varias etapas de purificación y/o lavado, lo que
particularmente con cantidades de muestras de ADN pequeñas conduce
a una peor reproducibilidad del protocolo, a un manejo laborioso y
a una menor sensibilidad del procedimiento. Además, el ADN debe
aislarse primero, como también para otros ensayos de biología
molecular, antes de poder utilizarse en la reacción de
bisulfito.
Es por tanto el objetivo de la presente
invención superar las desventajas del estado de la técnica.
El objetivo se consigue mediante un
procedimiento para el análisis de patrones de metilación de
citosina en muestras de ADN genómico en el que se realizan las
siguientes etapas de procedimiento:
a) Se aísla el ADN genómico a partir de células
u otros materiales acompañantes y se une de forma esencialmente
irreversible a una superficie,
b) se trata el ADN unido a la superficie
preferiblemente con un bisulfito (=disulfito, hidrogenosulfito) de
modo que la citosina se transforme en una base distinta en el
comportamiento de apareamiento de bases en el dúplex de ADN,
mientras que la 5-metilcitosina permanece
intacta,
c) se retiran los reactivos usados en la etapa
b) en una etapa de lavado,
d) se amplifican fragmentos seleccionados del
ADN inmovilizado en una reacción con polimerasa,
e) se analizan los amplificados respecto a su
secuencia.
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Es ventajoso que se realicen las siguientes
etapas adicionales:
f) se retiran los reactivos y productos de la
reacción con polimerasa en una etapa de lavado,
g) se amplifican fragmentos seleccionados
adicionales del ADN inmovilizado que son distintos de los de la
etapa d) en una reacción con polimerasa,
h) se analizan los amplificados respecto a su
secuencia.
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Es especialmente ventajoso además según la
invención que las etapas f)-g) se repitan varias
veces, en las que en cada amplificación según la etapa g) se
amplifican otros fragmentos que en las amplificaciones
precedentes.
Se prefiere según la invención que la unión del
ADN a la superficie sea covalente.
Es especialmente ventajoso a este respecto que
se aísle el ARN inmediatamente también en la etapa de
inmovilización.
Se prefiere según la invención que se realice el
aislamiento de ADN a partir de sangre completa o suero. Es
ventajoso según la invención también que se realice el aislamiento
del ADN a partir de tejidos lisados.
Se prefiere según la invención que se lleve a
cabo la tisis mediante proteinasa K.
Se prefiere particularmente según la invención
que se realice la inmovilización en los recipientes de una placa de
microvaloración con 96 recipientes o 384 recipientes,
inmovilizándose en los recipientes distintas muestras de
ADN.
ADN.
Es especialmente ventajoso según la invención
también realizar la inmovilización en los recipientes de reacción
PCR, inmovilizándose en los recipientes distintas muestras de ADN.
Se prefiere según la invención realizar la inmovilización del ADN
en un óxido metálico, preferiblemente óxido de aluminio.
Es ventajoso también el procedimiento según la
invención cuando se realiza la inmovilización en un material
hidrófobo y la unión es esencialmente irreversible sólo en las
condiciones de tamponación seleccionadas.
Se prefiere también según la invención que se
realice una etapa de amplificación con varios pares cebadores en
forma de PCR multiplexada.
Se prefiere según la invención que se combinen
todos o una gran parte de los amplificados de una muestra de ADN
inmovilizada y aplicar así un análisis adicional colectivamente.
Una gran parte son aproximadamente un 50% y más de los
amplificados. Pero puede ser también hasta un 75% y más.
Se prefiere en el procedimiento según la
invención que en este análisis adicional se trate de la hibridación
a una matriz oligonucleotídica o matriz de PNA (ácidos nucleicos
peptídicos).
Se prefiere también según la invención que el
análisis se realice durante la amplificación mediante un
procedimiento de PCR instantánea.
Es también ventajoso según la invención que el
análisis se realice después de la amplificación en el mismo
recipiente de reacción mediante la incorporación de una curva de
fusión.
Se prefiere especialmente según la invención que
el análisis se realice mediante la hibridación específica de alelo
de oligonucleótidos o PNA (ácidos nucleicos peptídicos) en las
posiciones a analizar en los amplificados.
Se prefiere además según la invención que el
análisis se realice mediante la hibridación de cebadores
oligonucleotídicos y una reacción de extensión de cebador o una
reacción de secuenciación posterior.
Es también objeto de la presente invención el
uso del procedimiento según la invención para el diagnóstico y/o el
pronóstico de eventos adversos para pacientes o individuos, en el
que estos eventos adversos pertenecen al menos a una de las
siguientes categorías: efectos indeseados de medicamentos,
enfermedades cancerosas, disfunciones, daños o enfermedades del
SNC, síntomas de agresión o alteraciones del comportamiento,
consecuencias clínicas, psicológicas y sociales de lesiones
cerebrales, alteraciones psicóticas y alteraciones de la
personalidad, demencia y/u otros síndromes asociados, enfermedad,
disfunción y lesión cardiovascular, disfunción, lesión o enfermedad
del tracto gastrointestinal, disfunción, lesión o enfermedad del
sistema respiratorio, lesión, inflamación, infección, inmunidad y/o
convalecencia, disfunción, lesión o enfermedad corporal como
desviación del proceso de desarrollo, disfunción, lesión o
enfermedad de la piel, los músculos, el tejido conectivo o la
médula, disfunción, lesión o enfermedad endocrina y metabólica,
dolores de cabeza o disfunción sexual.
Se prefiere según la invención el uso del
procedimiento según la invención para la diferenciación de tipos
celulares o tejidos o para el análisis de la diferenciación
celular.
Es además objeto de la presente invención un kit
compuesto por un reactivo para el tratamiento del ADN según la
etapa b, al menos dos oligonucleótidos cebadores para la
preparación de los amplificados, una fase sólida para la
inmovilización del ADN de muestra, así como otras soluciones
opcionales e instrucciones para la práctica de un ensayo según un
procedimiento según la invención.
La solución al problema basada en la presente
invención consiste en someter al ADN, que en el marco de su
aislamiento requerido en cualquier caso a partir de, por ejemplo,
sangre completa, suero o tejidos, se une en cualquier caso a una
fase sólida, directamente en esta fase sólida a continuación
también a una reacción con bisulfito. Después de la separación a
conseguir de la mezcla de reacción de bisulfito en este caso muy
sencilla, mediante lavado posterior con agua o un tampón adecuado,
puede utilizarse también inmediatamente el ADN inmovilizado
directamente para la amplificación. Como alternativa, puede
almacenarse en esta forma inmovilizada y usarse sólo en caso
necesario para una amplificación. Ya que el ADN inmovilizado no se
altera esencialmente en la amplificación, también es posible llevar
a cabo varias amplificaciones posteriores con el ADN inmovilizado
como molde, después de que los componentes de reacción de la
amplificación respectiva previa se hayan retirado mediante etapas
de lavado.
En conjunto, la presente invención pone a
disposición por tanto un procedimiento que representa una notable
simplificación respecto a la práctica de cualquier ensayo de
metilación que recurra al tratamiento con bisulfito. El ADN de
muestra debe unirse sólo directamente a una fase sólida, se lleva a
cabo el tratamiento con bisulfito en esta fase sólida y se lleva a
cabo a continuación usando la misma fase sólida una reacción con
polimerasa. Esto permite también llevar a cabo ensayos estables a
partir de cantidades muy bajas de ADN, como a partir de suero.
Razonablemente, la fase sólida es una superficie
modificada de un recipiente en el que se lleva a cabo entonces
también la reacción de PCR y ventajosamente un recipiente de PCR
comercial, que también puede presentarse como tiras de 8 o como
parte de una placa de microvaloración. Era por tanto el objetivo
esencial de la presente invención, entre otros, procurar
superficies que por un lado pudieran unir lo más irreversiblemente
posible el ADN, pero por otro lado también que permanecieran en las
condiciones presentes en el tratamiento con bisulfito
suficientemente estables y mantuvieran unido además el ADN.
Se han identificado dos superficies que
satisfacen este fin. Por un lado, se trata de óxido de aluminio,
por otro lado de cadenas alquilo C18 que en combinación con
cationes adecuados como iones de trietilamonio permiten una
conexión fija del ADN. Las cadenas alquilo C18 pueden aplicarse
mediante el procedimiento de silanización conocido por el experto
mediante un octadeciltrialcoxisilano. Se describen procedimientos
para la modificación de superficies con óxido de aluminio, entre
otros, en el documento US 6.291.166.
El procedimiento según la invención para el
análisis de patrones de metilación de citosina está compuesto por
las siguientes etapas parciales:
1. Se aísla el ADN genómico a partir de células
u otros materiales acompañantes y se une de forma esencialmente
irreversible a una superficie.
2. Se trata el ADN unido a la superficie
preferiblemente con un bisulfito (=disulfito, hidrogenosulfito) de
modo que la citosina se transforme en una base distinta en el
comportamiento de apareamiento de bases en el dúplex de ADN,
mientras que la 5-metilcitosina permanece
intacta.
3. Se retiran los reactivos usados en la segunda
etapa en una etapa de lavado.
4. Se amplifican fragmentos seleccionados del
ADN inmovilizado en una reacción con polimerasa y
5. Se analizan los amplificados respecto a su
secuencia.
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En una variante especialmente preferida del
procedimiento, se realizan adicionalmente las siguientes
etapas:
6. Se retiran los reactivos y productos de la
reacción con polimerasa en una etapa de lavado.
7. Se amplifican fragmentos seleccionados
adicionales que son distintos de los de la etapa d) del ADN
inmovilizado en una reacción con polimerasa.
8. Se analizan los amplificados respecto a su
secuencia.
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En una variante especialmente preferida
adicional del procedimiento, se repiten las etapas
6-8 varias veces.
En la primera etapa de procedimiento, se aísla
el ADN genómico preferido a partir de células u otros materiales
acompañantes y se une de forma esencialmente irreversible a una
superficie.
Una unión irreversible en el sentido de la
presente invención significa una unión que con los agentes puestos
a disposición habitualmente en las condiciones presentes en la
reacción no puede volver a romperse completamente. Esta unión puede
ser preferiblemente un enlace covalente, un enlace de par iónico o
también un enlace que se basa en efectos electrostáticos o
hidrófobos.
El aislamiento de ADN se realiza preferiblemente
de modo que se ponga en contacto un fluido corporal o también un
lisado de un tejido con la superficie, que a su vez se une
preferiblemente de forma irreversible al ADN. Para ello, en el caso
del material C18 es necesario un tampón especial (por ejemplo,
acetato de trietilamonio). Se retira el sobrenadante y se lava
posteriormente con tampón o agua (o ambos) para llevar a cabo la
reacción con bisulfito posterior con un material de partida lo más
puro posible.
Es una variante especialmente preferida del
procedimiento la unión covalente del ADN a la superficie. En una
variante de procedimiento especialmente preferida adicional, se
aísla también el ADN inmediatamente en la etapa de inmovilización.
El aislamiento del ADN se realiza preferiblemente a partir de
sangre completa o suero.
En una variante de procedimiento especialmente
preferida adicional, se realiza el aislamiento de ADN a partir de
tejidos lisados. La tisis se lleva a cabo de forma especialmente
preferida mediante proteinasa K.
En una variante de procedimiento especialmente
preferida adicional, se lleva a cabo la inmovilización en los
recipientes de una placa de microvaloración de 96 recipientes o 384
recipientes, inmovilizándose en los recipientes distintas muestras
de ADN.
En una variante de procedimiento especialmente
preferida, se lleva a cabo la inmovilización en recipientes de
reacción de PCR, inmovilizándose en los recipientes distintas
muestras de ADN.
De forma especialmente preferida, se realiza la
inmovilización del ADN en un óxido metálico, preferiblemente óxido
de aluminio. En una variante de procedimiento especialmente
preferida adicional, se realiza la inmovilización en un material
hidrófobo y la unión es esencialmente irreversible sólo en las
condiciones de tamponación seleccionadas.
El ADN a analizar se obtiene preferiblemente a
partir de fuentes habituales de ADN como, por ejemplo, líneas
celulares, sangre, esputo, heces, orina, líquido cerebroespinal,
tejidos embebidos en parafina, por ejemplo, tejidos de ojos,
intestino, riñones, cerebro, corazón, próstata, pulmones, mama o
hígado, portaobjetos histológicos y todas las combinaciones posibles
de los mismos.
En la segunda etapa del procedimiento, se trata
el ADN unido a la superficie preferiblemente con bisulfito
(=disulfito, hidrogenosulfito) de modo que toda la citosina no
metilada en la posición 5 de la base se altere de modo que se
origine una base distinta respecto al comportamiento de apareamiento
de bases, mientras que la citosina metilada en posición 5 permanece
intacta.
En caso de usar un reactivo de bisulfito, se
prefiere especialmente en el caso de la superficie C18 el bisulfito
de trialquilamonio para garantizar una conexión fija del ADN a la
superficie. En el caso de superficies de óxido de aluminio, se usa
preferiblemente bisulfito de sodio.
La muestra de ADN se desnaturaliza térmicamente
de forma especialmente preferida antes del tratamiento o usando un
reactivo alcalino como, por ejemplo, lejía de sosa diluida
(preferiblemente 0,1 a 0,3 M).
En caso de usar bisulfito para la reacción,
tiene lugar una adición en las bases de citosina no metiladas. Para
el procedimiento según la invención, se prefiere además añadir un
reactivo o disolvente desnaturalizante así como un captador de
radicales.
A este respecto, pueden tenerse en cuenta como
reactivos o disolventes desnaturalizantes preferiblemente los
siguientes compuestos o clases de compuestos:
polietilenglicoldialquiléteres, dioxano y derivados sustituidos,
urea o derivados, acetonitrilo, alcoholes primarios, alcoholes
secundarios, alcoholes terciarios, dietilenglicoldialquiléteres,
trietilenglicoldialquiléteres, tetraetilenglicoldialquiléteres,
pentaetilenglicoldialquiléteres, hexaetilenglicoldialquiléteres,
DMSO o THF. Sin embargo, es también posible la incorporación del
ADN a agarosa después de la desnaturalización mediante la adición a
la misma en forma disuelta y posterior enfriamiento, análogamente
al procedimiento publicado por Olek et al. La agarosa puede
retirarse térmicamente después del tratamiento con bisulfito con
tampón o agua caliente.
La hidrólisis alcalina posterior
(preferiblemente: tampón Tris a pH 10 o amoniaco) conduce entonces
a la transformación de las nucleobases de citosina no metiladas en
uracilo. Preferiblemente, se lleva a cabo a continuación la
desulfonación del ADN (10-30 min,
90-100ºC) a un valor de pH alcalino.
En la tercera etapa del procedimiento, se
retiran los reactivos anteriormente usados en una etapa de lavado.
A este respecto, es decisivo a su vez que el ADN inmovilizado
presente tratado químicamente permanezca entonces unido a la
superficie. Esto es sencillo en el caso de un enlace, por ejemplo
covalente, a la superficie. Por el contrario, es necesario a su vez
un tampón correspondiente si se realiza una unión, por ejemplo,
mediante cationes de trietilamonio a una fase C18. Esto requiere
entonces también en las etapas de lavado un tampón que fomente la
unión del ADN a la fase hidrófoba como, por ejemplo, un tampón
acetato de trietilamonio.
Se prefiere realizar varias etapas de lavado que
están compuestas de forma especialmente preferida por una etapa de
pipeteado automatizado, en la que se añade agua o tampón, y por una
etapa de pipeteado posterior en la que se retira el tampón
respectivo o el agua. Esto se consigue, por ejemplo, con una
inmovilización del ADN en una placa de microvaloración y con el uso
de un robot de pipetado comercial (por ejemplo de las compañías
Tecan o Qiagen).
En la cuarta etapa de procedimiento, se
amplifican fragmentos seleccionados del ADN inmovilizado
tratado.
Se amplifica la muestra de ADN en una reacción
en cadena de la polimerasa, preferiblemente con una ADN polimerasa
termoestable. La amplificación de varios fragmentos de ADN se hace
preferiblemente en un recipiente de reacción.
Puede llevarse a cabo también preferiblemente la
etapa de procedimiento en dos etapas parciales. Se empieza con una
preamplificación por PCR con al menos un par cebador de distinta
secuencia que hibridan inespecificamente con la muestra de ADN
pretratada y por tanto dan como resultado en la etapa de PCR más de
un amplificado. Después, se conduce una amplificación por PCR del
producto formado en la preamplificación con cebadores de distinta
secuencia que son respectivamente idénticos a o complementarios
inversos de un fragmento de la muestra de ADN pretratada [cadena
(+) o cadena (-)] e hibridan específicamente con el ADN a
amplificar.
En una variante de procedimiento especialmente
preferida, se realiza una etapa de amplificación con varios pares
cebadores como PCR multiplexada. Se prefiere especialmente también
combinar todos o una gran parte de los amplificados de una muestra
de ADN inmovilizado y aplicar así un análisis adicional
colectivamente. Se prefiere especialmente retirar la mezcla de
reacción después de la amplificación del recipiente de reacción al
que está unido el ADN inmovilizado. Por tanto, se pone a
disposición ADN inmovilizado como molde de amplificaciones
adicionales, preferiblemente a su vez con cebadores anteriormente
no usados.
En una variante de procedimiento especialmente
preferida, se repite por tanto la amplificación varias veces con
distintos cebadores, de modo que el procedimiento presenta las
siguientes etapas adicionales:
1) Se retiran los reactivos y productos de la
reacción con polimerasa en una etapa de lavado.
2) Se amplifican fragmentos seleccionados
adicionales del ADN inmovilizado que son distintos de los
amplificados anteriormente en una reacción con polimerasa,
3) Se analizan los amplificados respecto a su
secuencia.
En una variante especialmente preferida del
procedimiento, se repiten estas etapas varias veces, amplificando
en cada amplificación según la etapa 2) otros fragmentos que en las
amplificaciones precedentes.
En la última etapa de procedimiento, y también
cuando se realizan las etapas adicionales anteriores, se analizan
los amplificados respecto a su secuencia. De este modo, puede
deducirse inmediatamente el estado de metilación de las bases de
citosina seleccionadas en la muestra de ADN.
Este análisis de secuencia y las conclusiones
posteriores respecto al estado de metilación pueden realizarse
principalmente usando muchos procedimientos conocidos por el
experto que se describen también en el estado de la técnica.
De forma especialmente preferida, se realiza el
análisis de los amplificados en una matriz de oligonucleótidos o
matriz de PNA (ácidos nucleicos peptídicos).
Se prefiere además que el análisis se realice
durante la amplificación mediante un procedimiento de PCR
instantánea. Se prefiere especialmente por tanto una variante de la
invención en la que la extracción de ADN, el tratamiento con
bisulfito, la amplificación y la detección puedan realizarse
preferiblemente mediante PCR instantánea de todas las etapas en un
recipiente de reacción. Se prefiere especialmente a este respecto
también un procedimiento en el que el análisis después de la
amplificación se lleve a cabo en el mismo recipiente de reacción
mediante la incorporación de una curva de fusión y se deduzca a
partir del comportamiento de fusión la composición de bases del
fragmento y por tanto el estado de metilación.
El análisis puede realizarse también mediante la
inserción de la superficie en un espectrómetro de masas, que
determina las masas moleculares de los amplificados, de fragmentos
de los amplificados o también de sondas que hibridan
específicamente con los amplificados. Esta información puede
consultarse a su vez para la identificación de secuencias cuando la
secuencia es ya conocida en gran medida. También es posible la
introducción de los amplificados disueltos separados en un
espectrómetro de masas y llevar a cabo el análisis según
procedimientos conocidos por el experto.
Se prefiere especialmente también un
procedimiento en el que el análisis se realiza mediante hibridación
específica de alelo de oligonucleótidos o PNA (ácidos nucleicos
peptídicos) en las posiciones a analizar en los amplificados.
En una variante especialmente preferida
adicional del procedimiento, se lleva a cabo el análisis mediante
la hibridación de cebadores oligonucleotídicos y una reacción de
extensión de cebador o una reacción de secuenciación posterior.
Es también objeto de la presente invención el
uso del procedimiento anteriormente descrito para el diagnóstico
y/o el pronóstico de eventos adversos para pacientes o individuos,
en el que estos eventos adversos pertenecen al menos a una de las
siguientes categorías: efectos indeseados de medicamentos,
enfermedades cancerosas, disfunciones, daños o enfermedades del
SNC, síntomas de agresión o alteraciones del comportamiento,
consecuencias clínicas, psicológicas y sociales de lesiones
cerebrales, alteraciones psicóticas y alteraciones de la
personalidad, demencia y/u otros síndromes asociados, enfermedad,
disfunción y lesión cardiovascular, disfunción, lesión o enfermedad
del tracto gastrointestinal, disfunción, lesión o enfermedad del
sistema respiratorio, lesión, inflamación, infección, inmunidad y/o
convalecencia, disfunción, lesión o enfermedad corporal como
desviación del proceso de desarrollo, disfunción, lesión o
enfermedad de la piel, los músculos, el tejido conectivo o la
médula, disfunción, lesión o enfermedad endocrina y metabólica,
dolores de cabeza o disfunción sexual.
Se prefiere igualmente el uso de un
procedimiento para la diferenciación de tipos celulares o tejidos o
para el análisis de la diferenciación celular.
Es también objeto de la presente invención un
kit compuesto por un reactivo para el tratamiento del ADN, al menos
dos oligonucleótidos cebadores para la preparación de amplificados,
una fase sólida para la inmovilización del ADN de muestra, así como
soluciones adicionales opcionales e instrucciones para la práctica
de al menos una de las variantes de procedimiento anteriormente
descritas.
Ejemplo
Para la conexión del ADN con la superficie
recubierta con óxido de aluminio de los recipientes de reacción, se
usó ADN genómico cortado con EcoRI (Promega) y ADN de plásmido M13.
Se pipetearon respectivamente 160 ng en los correspondientes
recipientes de reacción, se rellenaron con agua a un volumen total
de 20 \mul, se mezclaron poco tiempo en un agitador y se
incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación,
se retiró la solución y se lavaron los recipientes dos veces con 50
\mul de agua cada vez. Para disminuir la actividad de los sitios
de unión restantes a la superficie del tubo, se pipetearon 10
\mul de una solución de albúmina de suero bovino al 5%, se
rellenó con 40 \mul de agua y se incubó igualmente a temperatura
ambiente durante 15 minutos. Finalmente, se lavaron los recipientes
una vez con 50 \mul de agua respectivamente.
Se desnaturalizó el ADN unido a 96ºC sin adición
de agua durante 20 minutos en un
Eppendorf-Mastercycler. Se retiraron después de ello
los recipientes lo más rápidamente posible y se mezclaron con 6
\mul de dioxano, con lo que se detuvo la desnaturalización del
ADN. Para la reacción con bisulfito, se añadieron 10 \mul de una
solución de bisulfito de sodio 0,75 M, 2 \mul de captador de
radicales (ácido
6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico,
98,6 mg en 1 ml de dioxano) y 2 \mul de agua. Se incubaron los
recipientes de reacción a 50ºC en un
Eppendorf-Mastercycler durante 5 horas.
Después de realizada la reacción con bisulfito,
se retiraron por pipeteo las soluciones y se lavaron los
recipientes con 100 \mul de agua y, preliminarmente a la
desulfonilación, con 100 \mul de una solución de
Tris-HCl 50 mM. Se realiza la desulfonilación con
50 \mul de una solución de Tris-HCl 50 mM a pH 9
durante 20 minutos a 96ºC. Después de tres lavados con 50 \mul de
agua cada uno, los recipientes de reacción están preparados para el
uso de una amplificación mediante PCR.
Se preparó la PCR a una escala de 25 \mul.
Sirvieron como cebadores para el ADN Promega 5'-TAA
GTA TGT TGA AGA AAG ATT ATT GTA G-3' y 5'TAA AAA
CTA TCC CAT AAT AAC TCC CAA C-3', así como
5'-ATT ACA AAA TCG CGC AAA-3' y
5'-AAG TCG GAG GTT AAA AAG GT-3'
(MWG) para el ADN de plásmido M13. Se dispusieron ambos cebadores
respectivos en una solución con una concentración de 12,5
pmol/\mul, y se pipetearon 2 \mul de esta solución de cebador
en el tubo correspondiente. Se añadieron a los recipientes para la
PCR 2,5 \mul de mezcla de dNTP (Fermentas, concentración de cada
dNTP 2,5 \mumol/\mul), 0,3 \mul de Hot Star Taq (Qiagen), 2,5
\mul de solución tampón de PCR 10x (Qiagen, contienen MgCl_{2}
15 mmol en tampón) y 17,7 \mul de agua (Fluka) por
preparación.
Los controles de PCR se realizaron mediante
electroforesis en gel. Para ello, se aplicaron 5 \mul de muestra
con 3 \mul de tinte de carga sobre un gel de agarosa al 1,4%
(Eurogentec., Inc.), como tampón de desarrollo sirvió 1xTBE. Se
tiñeron los fragmentos mediante bromuro de etidio, y se fotografió
el gel con UV.
<110> Epigenomics AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para la detección de
metilaciones de citosina en muestras de ADN inmovilizadas
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaagtatgtt gaagaaagat tattgtag
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaaaaactat cccataataa ctcccaac
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN de plásmido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattacaaaat cgcgcaaa
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN de plásmido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagtcggagg ttaaaaaggt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (27)
1. Procedimiento para el análisis de patrones de
metilación de citosina en muestras de ADN genómico, en el que se
realizan las siguientes etapas de procedimiento:
a) se aísla el ADN genómico a partir de células
u otros materiales acompañantes y se une de forma esencialmente
irreversible a una superficie,
b) se trata el ADN unido a la superficie
preferiblemente con un bisulfito (=disulfito, hidrogenosulfito) de
modo que la citosina se transforme en una base distinta en el
comportamiento de apareamiento de bases en el dúplex de ADN,
mientras que la 5-metilcitosina permanece
intacta,
c) se retiran los reactivos usados en la etapa
b) en una etapa de lavado,
d) se amplifican fragmentos seleccionados del
ADN inmovilizado en una reacción con polimerasa,
e) se analizan los amplificados respecto a su
secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque se realizan las siguientes etapas
adicionales:
f) se retiran los reactivos y productos de la
reacción de polimerización en una etapa de lavado,
g) se amplifican fragmentos seleccionados
adicionales del ADN inmovilizado que son distintos de los de la
etapa d) en una reacción con polimerasa,
h) se analizan los amplificados respecto a su
secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque se repiten las etapas
f)-g) varias veces, en el que en cada amplificación
según la etapa g) se amplifican otros fragmentos que en las
amplificaciones precedentes.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la unión
del ADN a la superficie es covalente.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el ADN se
aísla también inmediatamente en la etapa de inmovilización.
6. Procedimiento según la reivindicación 5,
caracterizado porque el aislamiento del ADN se realiza a
partir de sangre completa o suero.
7. Procedimiento según la reivindicación 5,
caracterizado porque el aislamiento del ADN se realiza a
partir de tejidos lisados.
8.Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque se lleva a cabo la Tisis mediante
proteinasa K.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la
inmovilización se realiza en los recipientes de una placa de
microvaloración con 96 recipientes o 384 recipientes,
inmovilizándose en los recipientes distintas muestras de ADN.
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la
inmovilización se realiza en recipientes de reacción de PCR,
inmovilizándose en los recipientes distintas muestras de ADN.
11. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la
inmovilización del ADN se realiza en un óxido metálico,
preferiblemente óxido de aluminio.
12. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la
inmovilización se realiza en un material hidrófobo y la unión es
esencialmente irreversible sólo en las condiciones de tamponación
seleccionadas.
13. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se
realiza una etapa de amplificación con varios pares cebadores como
PCR multiplexada.
14. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se
combinan todos o una gran parte de los amplificados de una muestra
de ADN inmovilizado y se aplica así un análisis adicional
colectivamente.
\newpage
15. Procedimiento según la reivindicación 13 ó
14, caracterizado porque en este análisis adicional se trata
de la hibridación a una matriz oligonucleotídica o matriz de PNA
(ácidos nucleicos peptídicos).
16. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque el análisis se
realiza durante la amplificación mediante un procedimiento de PCR
instantánea.
17. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque el análisis se
realiza después de la amplificación en el mismo recipiente de
reacción mediante la incorporación de una curva de fusión.
18. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque el análisis se
realiza mediante la hibridación específica de alelo de
oligonucleótidos o PNA (ácidos nucleicos peptídicos) en las
posiciones a analizar en los amplificados.
19. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque el análisis se
realiza mediante la hibridación de cebadores oligonucleotídicos y
una reacción de extensión de cebador o una reacción de
secuenciación posterior.
20. Uso de un procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes para el diagnóstico y/o el pronóstico
de eventos adversos para pacientes o individuos, en el que estos
eventos adversos pertenecen al menos a una de las siguientes
categorías: efectos indeseados de medicamentos, enfermedades
cancerosas, disfunciones, daños o enfermedades del SNC, síntomas de
agresión o alteraciones del comportamiento, consecuencias clínicas,
psicológicas y sociales de lesiones cerebrales, alteraciones
psicóticas y alteraciones de la personalidad, demencia y/u otros
síndromes asociados, enfermedad, disfunción y lesión
cardiovascular, disfunción, lesión o enfermedad del tracto
gastrointestinal, disfunción, lesión o enfermedad del sistema
respiratorio, lesión, inflamación, infección, inmunidad y/o
convalecencia, disfunción, lesión o enfermedad corporal como
desviación del proceso de desarrollo, disfunción, lesión o
enfermedad de la piel, los músculos, el tejido conectivo o la
médula, disfunción, lesión o enfermedad endocrina y metabólica,
dolores de cabeza o disfunción sexual.
21. Uso de un procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes para la diferenciación de tipos
celulares o tejidos o para el análisis de la diferenciación
celular.
22. Kit para la práctica de un procedimiento
según una de las reivindicaciones 1 a 19, compuesto por
- un reactivo para el tratamiento del ADN según
la reivindicación 1b, en el que mediante el reactivo la citosina se
transforma en una base distinta en el comportamiento de
apareamiento de bases en el dúplex de ADN, mientras que la
5-metilcitosina permanece intacta,
- al menos dos oligonucleótidos cebadores para
la preparación de amplificados,
- una fase sólida para la inmovilización del ADN
de muestra con una superficie que presenta un óxido metálico o
cadena alquilo C18.
23. Kit según la reivindicación 22, en el que la
superficie presenta óxido de aluminio.
24. Kit según la reivindicación 22, que presenta
un tampón acetato de trietilamonio para la unión irreversible del
ADN de muestra a la superficie que presenta cadenas alquilo
C18.
25. Kit según la reivindicación 22 ó 24, que
presenta bisulfito de trialquilamonio para el tratamiento con
bisulfito del ADN de muestra en una superficie que presenta cadenas
alquilo C18.
26. Kit según la reivindicación 22 ó 23, que
presenta bisulfito de sodio para el tratamiento con bisulfito del
ADN de muestra en una superficie que presenta óxido de
aluminio.
27. Kit según una de las reivindicaciones 22 a
26, que presenta varios pares cebadores para la práctica de una PCR
multiplexada.
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