ES2325331T3 - Polipeptidos con capacidad para atrapar farmacos y liberarlos de forma controlada. - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido que comprende entre alrededor de 1% y alrededor de 75% de unidades de monómero que tienen una o más de las fórmulas (I), (II) o (III) siguientes: ** ver fórmula** en las que: - n puede ser 1 o 2; - R 1 puede ser H o un grupo protector de tiol; - R 2 puede ser un grupo hidroxilo (OH), un grupo protector de ácido carboxílico, o un grupo -NR 5 R 6 en el que R 5 y R 6 pueden seleccionarse del grupo que consiste en H o un grupo alquilo C1-C7, lineal o ramificado; - R 3 y R 4 pueden seleccionarse del grupo que consiste en H, un grupo alquilo C 1-C 7, lineal o ramificado, o un grupo protector de amina; en donde los centros quirales marcados con un asterisco pueden tener una configuración R, S o RS.
Description
Polipéptidos con capacidad para atrapar fármacos
y liberarlos de forma controlada.
La presente invención se refiere a polímeros de
péptidos o polipéptidos nuevos entrecruzados con la capacidad de
atrapar componentes farmacéuticamente activos o materiales
farmacéuticamente activos y, a continuación, liberarlos de forma
controlada en un medio fisiológico.
En el campo de la administración de fármacos dos
de los problemas farmacológicos más importantes, y a menudo
asociados, conciernen a la dificultad de mantener la concentración
del componente activo a concentraciones terapéuticas por periodos
prolongados, y de conseguir que este componente activo alcance su
diana terapéutica. Estos problemas afectan particularmente a los
fármacos de semivida corta, tales como los péptidos o las proteínas,
donde un tratamiento eficaz requiere administración parenteral
frecuente, con todos sus efectos adversos asociados para los
pacientes.
Se han desarrollado soluciones técnicas para
disminuir estos efectos, y principalmente envuelven el atrapamiento
del fármaco o moléculas bioactivas en matrices de polímeros capaces
de liberarlos de una forma controlada y, si es posible, sólo cuando
alcanzan la diana terapéutica.
Hasta la fecha, algunas de las matrices más
ampliamente usadas para este propósito han sido composiciones de
polímeros de PLGA, éstas son copolímeros de ácido láctico y ácido
glicólico. Sin embargo, la cinética de liberación del fármaco de
muchas de estas matrices es difícil de controlar, y a menudo no es
del deseado orden cero, ya que el procedimiento de formación de las
micro esferas de la matrices origina que el fármaco se acumule en
la superficie e induzca una liberación masiva del fármaco en los
estados iniciales de liberación. Además, la degradación de las
matrices de PLGA por hidrólisis de sus grupos éster ocurre en toda
la micro esfera, no sólo en su superficie; esto hace que las micro
esferas sean porosas y, consecuentemente, el fármaco se libere a
mayor velocidad.
La Solicitud de Patente Internacional
WO-A-00/52078 describe polímeros de
aminoácidos que son capaces de ser entrecruzados en ciertas
condiciones, las matrices resultantes son capaces de atrapar
fármacos en su estructura.
La solicitud de patente internacional referida
describe polipéptidos formados de entre uno a más de siete
aminoácidos, seleccionados entre el ácido glutámico (Glu), lisina
(Lys), fenilalanina (Phe), prolina (Pro), triptófano (Trp),
tirosina (Tyr) y cisteína (Cys). Se describe que estos polipéptidos
pueden reorganizarse por sí mismos como estructuras de orden más
alto, a veces formando dominios hidrófobos que son útiles para
proteger compuestos sensibles a la proteolisis química y enzimática,
y que en ciertas condiciones son capaces de liberar estos compuestos
de forma controlada.
Una característica estructural de los
polipéptidos descritos en el documento
WO-A-00/52078 es que los polímeros
obtenidos por medio de la formación de enlaces peptídicos entre uno
o más de los aminoácidos mencionados anteriormente no contienen
modificaciones funcionales adicionales en las unidades de monómeros
de su cadena peptídica limitando así su habilidad para ser
entrecruzados y, consecuentemente, formar matrices de polímeros con
capacidad de atrapar fármacos.
La publicación Chemical Abstracts 2001:197706
incluye un resumen publicado en Abstr. Pap. - Am. Chem. Soc (2001),
221. La publicación original es un resumen de una conferencia, no
una publicación detallada, y describe que las microesferas de
proteínas pueden usarse como sistemas de liberación de fármacos.
Según el resumen las microesferas se obtienen aplicando ultrasonido
a proteínas que contienen restos de cisteína capaces de formar
enlaces disulfuro, produciendo así el entrecruzamiento que conduce a
la formación de microesferas capaces de atrapar fármacos. La
publicación referida, sin embargo, no describe los tipos de proteína
usados, o los detalles técnicos requeridos para reproducir el
estudio en el laboratorio.
De esta manera, puede verse que el estado de la
técnica en relación al uso de polipéptidos para formar matrices con
capacidad de atrapar fármacos y liberarlos de forma controlada está
lejos de estar desarrollado. De hecho, podría decirse que está
dando sus primeros pasos tentativos. Por lo tanto, hay una necesidad
de encontrar soluciones técnicas, específicas, nuevas en este campo
que sean eficaces para desarrollar nuevos sistemas de
administración de fármacos, especialmente para aquellos componentes
activos que, como se mencionó anteriormente, tienen una semivida
corta y requieren frecuentemente administración parenteral.
Es un objeto de la presente invención
desarrollar nuevos polipéptidos que puedan ser entrecruzados en un
medio acuoso y que atrapen componentes farmacéuticos o materiales
farmacéuticos suspendidos o disueltos, formando matrices de
polímeros con la capacidad de liberar componentes farmacéuticos de
forma controlada en un medio fisiológico.
Otro objeto de la invención es desarrollar un
procedimiento para preparar los polipéptidos nuevos.
Todavía otro objeto de la presente invención es
producir matrices de polímeros capaces de contener fármacos,
obtenidas cuando los polipéptidos son entrecruzados en presencia de
al menos un fármaco.
Es también un objeto de la invención desarrollar
un procedimiento para producir las matrices de polímeros mencionadas
anteriormente capaces de contener fármacos.
Es un objeto adicional de la invención
desarrollar composiciones farmacéuticas que contienen las matrices
de polímeros, obtenidas con los polipéptidos nuevos mencionados
anteriormente, y que incluyen uno o más componentes farmacéuticos
activos.
Todavía otro objeto adicional de la invención es
usar los nuevos polipéptidos para producir matrices capaces de
liberar fármacos de forma controlada.
La Figura 1 es un gráfico que muestra la
cinética de liberación de la ciprofloxacina (\mumoles de
ciprofloxacina frente al tiempo) contenida en una de las matrices
de polímeros de la presente invención. El gráfico muestra una
comparación entre la muestra sujeta a proteolisis enzimática (M1) y
un control sin enzima (B).
Las expresiones "polipéptidos", "polímero
de péptidos" y "polímeros de péptidos" usadas aquí se
refieren a estructuras de polímero formadas por unidades de
monómeros que se originan por la formación de enlaces peptídicos de
aminoácidos naturales o no naturales y/o sus derivados; estos
aminoácidos pueden estar protegidos.
Además, cuando se hace referencia a grupos
protectores o formas de proteger grupos funcionales "como se
describe por Green", se refiere al texto bien conocido sobre el
tema, o sea, Green et al. "Protective Groups in Organic
Síntesis". Tercera edición John Wiley & Sons Inc. 1999 (ISBN
0-471-16019-9).
La presente invención ha originado por vez
primera un nuevo tipo de polipéptido que puede ser entrecruzado en
condiciones suaves, y que produce matrices de polímero que pueden
atrapar fármacos y liberarlos de forma controlada en un medio
fisiológico.
Los polipéptidos de la presente invención
comprenden polímeros que tienen entre alrededor de 1% y alrededor de
75% de sus unidades de monómero de una de las fórmulas (I), (II) o
(III) siguientes:
en las
que
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
Los centros quirales marcados con un asterisco
pueden tener una configuración R, S o RS.
En la realización preferida entre alrededor del
5% al 30% de las unidades de monómeros de los polipéptidos de la
presente invención tienen una de las fórmulas (I), (II) o (III).
También en la realización preferida los
polipéptidos de la presente invención tienen un peso molecular
entre alrededor de 5.000 a 200.000, más preferiblemente entre 10.000
y 100.000.
En una realización preferida al menos alrededor
del 50% de las unidades de monómeros de los polipéptidos de la
presente invención tienen la fórmula (IV) o (V)
\vskip1.000000\baselineskip
en las
que
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- en la que R^{1} y R^{2} son como se describió anteriormente;
- -
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- en cuyo caso o R^{7} o R^{8} es H y R^{1} es como se describió anteriormente, o un resto de la fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- en cuyo caso o R^{7} o R^{8} es H y R^{1}, R^{3} y R^{4} son como se describió anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Los centros quirales marcados con un asterisco
pueden tener una configuración R, S o RS.
En la realización preferida mencionada
anteriormente los polipéptidos pueden contener otras unidades de
monómeros seleccionados de entre otros aminoácidos naturales o no
naturales y sus derivados protegidos.
\newpage
Los polipéptidos preferidos son aquellos que
tienen uno o más de los aspectos siguientes:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
Son especialmente preferidos los siguientes
grupos de polipéptidos:
Grupo A: polímeros que contienen unidades de
monómero de restos de ácido L-glutámico y ácido
L-glutámico (L-cisteína) con las
fórmulas
Grupo B: polímeros como los del grupo A pero que
contienen también unidades de monómero de restos de
L-alanina.
Grupo C: polímeros que contienen unidades de
monómero de restos de L-lisina y
N'-(4-mercaptobutiroil)-L-lisina
con las fórmulas
Grupo D: polímeros como los del grupo C pero que
contienen también unidades de monómero de restos de
L-alanina.
En otra realización especialmente preferida,
entre alrededor de 5% y el 30% de las unidades de monómero de los
polímeros de los grupos A, B, C y D contienen grupos tiol libres
(SH).
Los polipéptidos de la presente invención se
preparan por medio de reacciones de amidación, empezando por
polímeros de péptidos precursores en los que al menos alrededor del
50% de las unidades de monómero tienen la fórmula (VI) o (VII)
o sus precursores en los que tanto
el grupo de ácido carboxílico como el grupo de amina primaria libre
están protegidos por grupos protectores tales como los descritos por
Green. Esto significa
que:
- -
-
\vtcortauna
- \quad
- en la que R^{1} y R^{2} son como se definió anteriormente; o alternativamente,
- -
-
\vtcortauna
- \quad
- o con el ácido 4-mercaptobutírico o sus derivados activados.
\vskip1.000000\baselineskip
Si se desea, los grupos protectores pueden
después eliminarse completa o parcialmente de los grupos funcionales
que todavía estén protegidos.
Los polipéptidos precursores pueden prepararse
usando procedimientos convencionales de síntesis de péptidos
empezando con ácido glutámico, ácido aspártico o lisina, en sus
formas L, D o LD, estos son los aminoácidos que corresponden a las
unidades de monómero con fórmula (VI) o (VII); otros aminoácidos
naturales o no naturales pueden también usarse, preferiblemente la
alanina, en cualquiera de sus formas L, D o LD, o sus derivados
protegidos. En todos los casos, al menos alrededor del 50%, y
preferiblemente al menos alrededor del 80%, de las unidades de
monómero deben tener la fórmula (VI) o (VII).
Se conocen algunos de estos polipéptidos
precursores, tales como los polímeros del ácido poliglutámico
(poliGlu) o polilisina (poliLys) de varios pesos moleculares, y
están comercializados.
Un método adecuado para realizar las reacciones
de polimerización es el que envuelve la formación de intermediarios
activos del N-carboxianhidrido (NCA), como se
describe, por ejemplo, en Katakai et al., J. Org. Chem.
1985, 50, páginas 715-716, seguido de la
polimerización de los aminoácidos NCA activos como se describe, por
ejemplo, en Blout et al., J. Am. Chem. Soc. 1956, 78,
páginas 941-946.
Para preparar los polipéptidos precursores de
aminoácidos que contienen un grupo carboxílico adicional, ácido
glutámico y ácido aspártico, es preferible usar aquellos en los que
el grupo carboxílico adicional está protegido, por ejemplo, en su
forma de éster bencílico; la protección de los grupos carboxílicos
puede ser después completa o parcialmente eliminada después de la
polimerización.
La reacción de amidación de los polímeros
precursores que contienen grupos carboxílicos, unidades de monómero
de fórmula (VI), con la cisteína o sus derivados protegidos se
realiza usando técnicas estándares de formación de enlaces amida.
De esta manera, por ejemplo, después de eliminar completa o
parcialmente la protección de los grupos carboxílicos, los grupos
carboxílicos libres son después activados usando cualquiera de las
técnicas de síntesis de péptidos usuales, por ejemplo, por adición
de carbodiimidas solubles en agua: la reacción con cisteína puede
entonces realizarse.
En el caso de los polímeros precursores que
contienen grupos amino primarios, unidades de monómero de fórmula
(VII), la reacción de amidación envuelve la acilación de estos
grupos amino usando métodos convencionales. Por ejemplo, los grupos
amino pueden acilarse con 4-butirolactona o con
derivados activos (que pueden tener un grupo tiol protegido) del
ácido 4-mercaptobutírico. Pueden también acilarse
con derivados de cisteína activados en el grupo carboxílico, que
pueden tener un grupo amino protegido.
Una vez que se han obtenido los polipéptidos
funcionalizados pueden eliminarse los grupos protectores de
cualquier grupo tiol que estuviera protegido, usando las técnicas
de desprotección descritas por Green.
El grado de funcionalización del polímero es el
porcentaje de unidades de monómero que contienen grupos tiol
libres, y puede determinarse usando la prueba cuantitativa de
Ellman, como se describe en Ellman Arch. Biochem. Biophys.
1958, 74, páginas 443-458. El grado de
funcionalización puede variar libremente y depende de la cantidad
de unidades de monómero de fórmulas (VI) y (VII) en el polímero
precursor, y en le estequiometría de la reacción de amidación
subsiguiente con los compuestos de tiol. Como se ha descrito
anteriormente, entre alrededor de 1% y alrededor de 50% de las
unidades de monómero de los polímeros de la presente invención
contienen grupos tiol, y preferiblemente entre alrededor de 5% y el
30%.
Los polipéptidos de la presente invención pueden
ser entrecruzados en medio acuoso, a un pH igual o mayor de 6, ya
que los grupos tioles se oxidan con el oxígeno del aire y forman
enlaces disulfuro. El entrecruzamiento conduce a la formación de
matrices de polímero con la capacidad de atrapar fármacos que están
suspendidos o disueltos en el medio acuoso.
Estas matrices de polímero que contienen
fármacos pueden aislarse del medio acuoso usando técnicas
convencionales, por ejemplo, por medio de la concentración con
membranas de diálisis y la centrifugación posterior.
Un procedimiento para preparar las matrices de
polímero que contienen fármacos de la presente invención es oxidar
los polipéptidos de la presente invención en un medio acuoso
alcalino, en presencia de un fármaco, y separar el producto
obtenido.
Una de las principales ventajas de esta técnica,
comparada con los métodos convencionales que se basan en la
formación de micro esferas con polímeros de PLGA, es que el
procedimiento entero de atrapamiento de fármacos se lleva a cabo
sin necesidad de disolventes orgánicos que interaccionen con el
fármaco, y que son difíciles de eliminar después. Además, si el
fármaco está basado en proteínas el disolvente puede causar su
desnaturalización, y de esta manera que pierdan su actividad.
Cuando las matrices de polímero de la presente
invención se introducen en un medio fisiológico liberan el fármaco
de forma controlada ya que su naturaleza péptídica permite la
degradación progresiva bajo la acción de enzimas presentes en el
medio. Si se seleccionan unidades de monómero adecuadas, por
ejemplo, en relación al número de monómeros que se originan de
D-aminoácidos, la liberación del fármaco puede
modularse como se desee usando matrices con velocidades variables de
proteolisis enzimática.
En las matrices de la presente invención el
fármaco atrapado se distribuye más o menos uniformemente y, además,
se libera de forma regular ya que la degradación enzimática de la
matriz de polímero ocurre en la superficie; esto significa que la
velocidad de liberación del fármaco es constante. Estos aspectos
constituyen también ventajas significativas sobre micro esferas de
PLGA convencionales que, como se describió anteriormente, raramente
consiguen una cinética de orden cero, debido a la acumulación del
fármaco en su superficie y a su degradación irregular.
Una ventaja adicional de las matrices de
polímero de la presente invención es que, debido a su naturaleza
peptídica, son biodegradables y soportadas bien por el cuerpo
humano.
En principio, los polipéptidos de la presente
invención pueden usarse para obtener matrices de polímero con la
capacidad de liberar varios tipos de fármacos de una forma
controlada; son por lo tanto adecuadas para uso en composiciones
farmacéuticas dirigidas a cualquier tipo de tratamiento,
especialmente el tratamiento prolongado.
Debería indicarse, sin embargo, que las matrices
de polímero de la presente invención son especialmente adecuadas en
la administración de compuestos activos que, cuando se administran
en formas farmacéuticas convencionales, requieren administración
parenteral frecuente, con todos sus efectos adversos asociados para
los pacientes.
Las matrices de polímero de la presente
invención son también especialmente adecuadas para componentes o
materiales activos de gran actividad terapéutica y que presentan
problemas de administración debido a su gran capacidad de
degradación en el organismo, como es el caso de los péptidos y
proteínas.
Como propósito ilustrativo solamente, puede
mencionarse los siguientes como ejemplo de estos tipos de compuestos
activos o materiales activos: el péptido T-20, que
actualmente se usa en pacientes infectados de VIH-1
(Nature Medicine, 1998, 4, 1302-1307;
Proc. Natl. Acad. Sci., 1994, 91,
9770-9774) y que tiene que ser administrado en
dosis muy altas y muy frecuentes; los análogos de la hormona que
libera la gonadotropina (GnRH) tales como la leuprolida,
goserelina, nafarelina o triptorelina, que se usan corrientemente en
ciertos tipos de cáncer, principalmente cáncer de próstata;
interferón y otras interleucinas con aplicaciones médicas múltiples,
entre otras, como tratamientos del cáncer; hormona estimuladora del
folículo (FSH) y hormona luteinizante (LH) usadas en tratamientos de
fertilidad.
Nada de lo anterior impide que las matrices de
polímero de la presente invención sean también adecuadas para
contener otros fármacos de interés terapéutico importante tales
como, para citar dos ejemplos ampliamente usados, los fármacos
anticancerosos taxol y doxorrubicina. Hay estudios que han mostrado
que el índice terapéutico de paclitaxel (taxol) mejora cuando está
conjugado con el ácido poliglutámico (Li, Chun. Advanced Drug
Delivery Reviews. 2002, 54(5), 695-713;
Auzenne et al. Clinical Cancer Research. 2002, 8(2),
573-581.
Pueden obtenerse composiciones farmacéuticas
útiles en el tratamiento de enfermedades con las matrices de
polímero que contienen fármacos de la presente invención. Las
composiciones farmacéuticas obtenidas de esta manera pueden
diseñarse para cualquier vía de administración (oral, parenteral,
subcutánea, transdérmica, transmucosal etc) y pueden contener los
excipientes y adyuvantes usados corrientemente en la tecnología
farmacéutica.
En la realización preferida, las composiciones
farmacéuticas de la presente invención son aquellas diseñadas para
administración parenteral.
\vskip1.000000\baselineskip
Se suspenden 5 g del ácido
\gamma-benciloxiglutámico
(H-Glu(OBz)-OH, 21 mmoles) en
60 ml de tetrahidrofurano seco, que ha sido previamente eluido a
través de una columna de alúmina y destilado sobre sodio, y después
se calienta a 50ºC en condiciones anhidras. Se añade entonces
trifosgeno (98%, 3,1 g, 0,5 equivalentes, 10,4 mmoles). La mezcla
de reacción se agita durante al menos 3 horas hasta que la
suspensión inicial se convierte en una solución clara. Finalmente,
se deja enfriar y se evapora en el rotavapor hasta
15-20 ml. La solución se diluye con 45 ml de AcOEt
destilado y filtrado. Se añaden entonces 300 ml de hexano destilado
al filtrado y se enfría la mezcla en un baño de acetona y hielo
seco a -78ºC. El precipitado obtenido se filtra en una placa
filtrante, se disuelve en 30 ml de AcOEt destilado y se precipita
con 300 ml de hexano destilado.
El N-carboxianhidrido obtenido
(2,25 g, 8,5 x 10^{-3} moles) se disuelve en dioxano (30 ml,
filtrado a través de una columna de alúmina, destilado sobre sodio
y guardado con tamiz molecular). Se añade entonces Et_{2}NH (9
\mul, 85 \mumoles 99%) y se deja la mezcla sin agitar durante 5
días en aire seco. Se añade entonces una solución acuosa de HCl
(200 ml, 6,5 mM) y la mezcla se deja a temperatura ambiente durante
4 horas. El precipitado obtenido se filtra y se lava con agua
abundante hasta que se alcanza un pH neutro. Se obtiene un total de
1,3 g del polímero protegido poli(Glu(OBz) (65% de
rendimiento).
Una parte del polímero protegido obtenido (250
mg) se suspende en 1 ml de AcOH y se agita durante 2 horas en
condiciones anhidras. Después se añaden 10 ml de una mezcla de
HBr/AcOH (3:1) seguido de agitación durante 15 horas. El producto
se precipita entonces con 200 ml de Et_{2}O y se filtra usando una
placa filtrante. El poliGlu(OH) obtenido se almacena en un
desecador con KOH. Se evalúa la eliminación de bencilo por
UV-Vis a 254 nm. Rendimiento: 90 mg, 70%. El peso
molecular medio del polímero obtenido es 25 kDa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se trata el ácido poliglutámico
(poliGlu(OH)) (SIGMA, 17 kDa, 20,2 mg, 132 \mumoles de
grupos COOH) con
(1-etil-3-(3'-dimetilaminopropil)carbodiimida
HCl (NOVABIOCHEM, 26,3 mg, 0,137 \mumoles) a pH 5 (tampón MES,
ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico, 100 mM,
150 \mul). Se añade 30 minutos más tarde cisteína (SIGMA, 10
equivalentes, 208,1 mg, 1,32 mmoles), la solución se aumenta a un
volumen de 1150 \mul con tampón MES adicional y el pH se reajusta
a alrededor de 6 con NaOH 10 N (1-2 \mul). La
solución obtenida se agita a temperatura ambiente durante 20 horas.
Los puentes disulfuro se reducen con un exceso de borohidruro sódico
(NaBH_{4}, aproximadamente 15 mg). El polímero se purifica por
diálisis en presencia de HCl acuoso (1 mM, 1 l) durante 8 horas
usando membranas MWCO 1000 Da (CELLU-SEP). Se
realiza la diálisis en triplicado y el polímero se obtiene por
liofilización.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añade 4-butirotiolactona (7
\mul, 0,08 mmoles) a una solución de agua tamponada (1 ml, borato,
pH 9) de poliLys (20 mg, 0,16 mmoles NH_{2}, peso molecular 26
kDa, SIGMA) en una atmósfera de argón con agitación magnética
vigorosa. Después de 24 horas, manteniendo el pH a 9 mediante la
adición de NaOH 1 M, la solución se trata con un exceso de
NaBH_{4} (aproximadamente 15 mg). El polímero de tiol se diluye
con agua de Milli-Q (4 ml) y se purifica por
diálisis en la presencia de HCl acuoso (1 mM, 1 l) durante 8 horas
(usando membranas de MWCO de 1000 Da, CELLU-SEP).
La diálisis se lleva a cabo por triplicado. Finalmente, la solución
acuosa se liofiliza para obtener
polilys(CO(CH_{2})_{3}-SH)_{0},_{12}.
\vskip1.000000\baselineskip
Se suspende alanina
(H-Ala-OH) (4 g, 43,4 mmoles) en
tetrahidrofurano (100 ml, eluido a través de una columna de alúmina
y destilado sobre sodio) y se calienta a 50ºC en condiciones
anhidras (tubo de CaCl_{2}), antes de añadir trifosgeno (6,4 g,
21,7 mmoles, 98%). La mezcla de reacción se agita durante
3-4 horas. Después se enfria y se concentra por
evaporación en rotavapor hasta 15-20 ml. La solución
se diluye con 35 ml de AcOEt y se filtra. Se añade hexano (250 ml)
a la solución que se enfría en un baño de acetona y hielo seco a
-78ºC. El precipitado se filtra sobre una placa filtrante y se
disuelve en 30 ml de AcOEt, y después se precipita con 250 ml de
hexano. El producto obtenido es
el N-carboxianhidrido de la alanina, NCA-Ala, que se guarda en un desecador sobre P_{2}O_{5}. Rendimiento: 3,0 g. 60%.
el N-carboxianhidrido de la alanina, NCA-Ala, que se guarda en un desecador sobre P_{2}O_{5}. Rendimiento: 3,0 g. 60%.
La NCA-Ala obtenida en la etapa
anterior (50 mg, 4,35 x 10^{-4} moles) se disuelve en
1,4-dioxano (1,4 ml, filtrado a través de una
columna de alúmina, destilado sobre sodio y guardado sobre tamiz
molecular). Se añade después ácido
poli-\gamma-bencilglutámico (120
mg 1,739 x 10^{-6} moles, SIGMA, peso molecular 69 kDa,) y se
disuelve completamente con agitación magnética. La mezcla se deja a
temperatura ambiente, sin agitación y en aire seco, durante 4 días.
La gel obtenida se vierte después sobre una solución acuosa de HCl
(200 ml, 6,5 mM). El precipitado resultante se filtra y se lava con
agua abundante hasta que las aguas de lavado tienen un pH neutro.
Se obtiene 106 mg (rendimiento 70%) del copolímero bencilado
(Ala)_{178}-(Glu(OBzl))_{315}, y este se
identifica por ^{1}H-RMN, IR y análisis de
aminoácidos.
\vskip1.000000\baselineskip
El copolímero bencilado obtenido en la etapa
anterior es después parcialmente desbencilado usando la metodología
descrita en M. Bodansky y A. Bodansky The Practice of Peptide
Synthesis. Springer Verlag Ed. Berlin 1984, páginas
177-178. La eliminación de la protección del grupo
bencilo puede ser total o parcial, dependiendo de las condiciones y
la estequiometria de la reacción.
Usando el método de funcionalización con
cisteína descrito en la etapa b) del Ejemplo 1, la proporción
deseada de grupos carboxílicos pueden ser después funcionalizados
simplemente haciendo cualquier ajuste necesario a la reacción
estequiométrica.
Así, puede obtenerse como se requiera varios
grados de funcionalización del copolímero.
\vskip1.000000\baselineskip
Una suspensión en agua (0,5 ml) del polímero del
ácido poliglutámico funcionalizado con cisteína,
poliGlu(Cys)_{0,21}-OH, como se obtuvo en el Ejemplo 1 (14,27 mg, aproximadamente 19,5 kDa), se trata con un exceso de NaBH_{4} (aproximadamente 15 mg) para reducirlo y hacerlo soluble (pH 9,3). La solución reducida se acidula con HCl a pH 1-2 para destruir los residuos de hidruro y después se añade a una solución de hidrocloruro de ciprofloxacina (CFX.HCl, 3,02 mg, en tampón de bórax 0,5 ml pH 9-10). La solución resultante se diluye con tampón de bórax adicional (hasta un volumen final de 3,5 ml) y el pH se ajusta a 9,94 con NaOH 10 N (1-2 \mul). La solución resultante se agita constantemente a temperatura ambiente durante 90 horas; en este punto aparece una suspensión, producida por el entrecruzamiento del polímero debido a la oxidación.
poliGlu(Cys)_{0,21}-OH, como se obtuvo en el Ejemplo 1 (14,27 mg, aproximadamente 19,5 kDa), se trata con un exceso de NaBH_{4} (aproximadamente 15 mg) para reducirlo y hacerlo soluble (pH 9,3). La solución reducida se acidula con HCl a pH 1-2 para destruir los residuos de hidruro y después se añade a una solución de hidrocloruro de ciprofloxacina (CFX.HCl, 3,02 mg, en tampón de bórax 0,5 ml pH 9-10). La solución resultante se diluye con tampón de bórax adicional (hasta un volumen final de 3,5 ml) y el pH se ajusta a 9,94 con NaOH 10 N (1-2 \mul). La solución resultante se agita constantemente a temperatura ambiente durante 90 horas; en este punto aparece una suspensión, producida por el entrecruzamiento del polímero debido a la oxidación.
Para recuperar el polímero con el fármaco
atrapado, la solución se acidula con HCl (a pH 1,8), mientras que
se agita continuamente, y se enfría en un baño de agua/hielo. Esto
causa la precipitación de la matriz de fármaco/polímero. El
precipitado y la solución se colocan después en un dispositivo de
concentración (Ultrafree-15, Millipore®), que
contiene una membrana de 5000 Da de MWCO, y esto permite que el
polímero (con el fármaco encapsulado) sea separado del fármaco no
encapsulado que permanece en solución por medios de centrifugación.
La medida de la ciprofloxacina en el centrifugado (espectroscopía UV
a \lambda = 272 nm) revela que esta constituye el 9% del peso de
la matriz. Una forma sólida de la matriz fármaco/polímero puede
obtenerse por liofilización de la solución.
\vskip1.000000\baselineskip
Una matriz formada por el polímero
poliGlu(Cys)_{0,21}-OH y
ciprofloxacina, 7,5% de su peso siendo el fármaco (1,5 mg de la
matriz de fármaco/polímero) se suspendió en una solución tamponada
de AcONH_{4} (1,5 ml, 25 mM, pH 7) de la enzima endoproteinasa
Glu-C (300 \mug, 0,20 \mug/\mul, BOEHRINGER).
La mezcla se mantuvo en suspensión mediante agitación magnética y
se mantuvo a una temperatura constante de 37ºC. Para monitorizar
tanto la degradación del polímero como la liberación del
antibiótico, las muestras (150 \mul) se tomaron a diferentes
tiempos a lo largo de varios días. Las muestras se centrifugaron con
un dispositivo de ultrafiltración que contiene una membrana de 5
kDa de MWCO (Ultrafree-0,5, Millipore®, 3000 rpm
durante 45 minutos), de forma que la ciprofloxacina liberada debido
a la hidrólisis enzimática estaba presente en la solución
centrifugada. Para establecer el perfil de liberación de la
ciprofloxacina, los centrifugados se analizaron por espectroscopía
UV-Vis (\lambda = 272 nm). Los resultados de este
análisis se muestran en la Figura 1, el gráfico muestra \mumoles
de ciprofloxacina (CFX) frente al tiempo. Para propósitos de
comparación el gráfico representa ambos una muestra de proteólisis
enzimática (M1) y la de un segundo experimento de control sin enzima
(B).
El gráfico muestra que después de 8 días
aproximadamente el 28% del fármaco ha sido liberado debido a la
acción enzimática.
\vskip1.000000\baselineskip
Para evaluar la capacidad de atrapamiento de
materiales peptídicos se usó el mismo método que en el Ejemplo 5
para preparar una matriz que incluye el péptido
Ac-Thr-Tyr-Gln-Arg-Arg-Ser-Arg-Trp-Pro-Phe-Ser-Lys-Ala-Arg-Ser-CONH_{2}
(con un peso molecular de 1.968,5), usando
poliGlu(cys)_{0,05} de 17 kDa (funcionalizado con 5%
de cisteína).
La determinación por espectroscopia UV a 280 nm
reveló que el rendimiento del atrapamiento fue de 12% en peso.
\vskip1.000000\baselineskip
Una solución de polímero de ácido poliglutámico,
obtenido por el procedimiento descrito en el Ejemplo1 y adaptado
para obtener un polímero con mayor contenido de cisteína
(poliGlu(Cys)0,4-OH, aproximadamente
23 kDa, 6g) en NaOH 1 M (18,6 ml) se añade a la hormona de
crecimiento humano recombinante liofilizada (HGH, 1 g) con
agitación suave hasta que se obtiene una solución homogénea (pH
6-7). Se añade después DMSO (4,6 ml), el agente
oxidante, y después de una agitación suave la solución se deja a
temperatura ambiente durante 12 h. Se obtiene una gel, que se lava
con agua abundante (2 l) en un dispositivo de filtración de 0,22
\mum (Durapore, MILLIPORE®). Después de liofilizar la gel
resultante, se obtiene un polvo blanco (6,38 g) con un contenido de
HGH del 4,5% p/p, determinado por el análisis de aminoácidos.
\vskip1.000000\baselineskip
A tres grupos de cinco ratas macho
Sprage-Dawley CD (albino) se les administró hormona
de crecimiento humana según la siguiente pauta:
Los animales estaban en el intervalo de 7 - 9
semanas de edad y su peso corporal se refleja en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Seguidamente de la administración subcutánea,
muestras de sangre (ca 0,5 ml) se tomaron de cada rata en la
pre-dosis, 0,5, 2, 4 y 8 horas después de la
dosis.
Todas las muestras de sangre se recogieron en
tubos EDTA de la vena de la cola por pinchado, excepto la muestra de
sangre última, que se recogió por punción cardiaca con anestesia de
isoflurano.
Las muestras de sangre se centrifugaron y el
plasma separado se transfirió a un tubo limpio. Las células de la
sangre se despreciaron.
Después de la recolección de la muestra de
sangre última, las ratas fueron sacrificadas por dislocación
cervical y se sacaron el hígado, riñones, pulmones, bazo, corazón,
cerebro y médula espinal. Las muestras de plasma se guardaron a
aproximadamente -80ºC hasta que se realizó el análisis. Las carcasas
se despreciaron.
\vskip1.000000\baselineskip
Las concentraciones de plasma de la hormona de
crecimiento humana fueron evaluadas usando un kit de
radioinmunoensayo DPC (Los Ángeles, California, USA) en el contador
de Canberra Packard Cobra Gamma Counter, usando las instrucciones
del fabricante del kit. La curva estándar de calibración se obtuvo
con 0,3-31 ng/ml de HGH. Los coeficientes de
variación intraensayo con la curva estándar fueron del 3% o menos en
cada concentración de HGH. Los resultados de estos experimentos se
resumen en las Tablas 1 y 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Signos clínicos: no se observaron reacciones
adversas después de la dosis administrada.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
Este Ejemplo y sus resultados indican que la
presente formulación depot de HGH puede proporcionar liberación
dependiente del tiempo y la concentración de HGH después de una
única inyección subcutánea en ratas, en ausencia de signos clínicos
evidentes. A la concentración más alta de HGH (Grupo 3), las
concentraciones en plasma de HGH se elevaron desde 30 minutos a 8
horas después de una única administración subcutánea. Este ejemplo
in vivo por tanto soporta la posibilidad de usar esta realización de
la invención para obtener concentraciones de HGH en plasma
consistentes y relativamente duraderas potencialmente
terapéuticas.
Debería entenderse que los Ejemplos, aunque
indican realizaciones preferidas de la invención, se proporcionan
únicamente como ilustración. De la descripción anterior y los
Ejemplos, una persona conocedora de la técnica puede discernir las
características esenciales de esta invención, y sin salirse del
espíritu y alcance de la misma, puede hacer varios cambios y
modificaciones de la invención para adaptarla a los varios usos y
condiciones.
Claims (31)
1. Un polipéptido que comprende entre alrededor
de 1% y alrededor de 75% de unidades de monómero que tienen una o
más de las fórmulas (I), (II) o (III) siguientes:
en las
que:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
en donde los centros quirales marcados con un
asterisco pueden tener una configuración R, S o
RS.
2. Un polipéptido según la reivindicación 1, en
donde las unidades de monómero comprenden la fórmula (I).
3. Un polipéptido según la reivindicación 1, en
donde las unidades de monómero comprenden la fórmula (II).
4. Un polipéptido según la reivindicación 1, en
donde las unidades de monómero comprenden la fórmula (III).
5. Un polipéptido según la reivindicación 1, que
comprende entre alrededor del 5% y alrededor del 50% de unidades de
monómero que tienen una o más de las fórmulas (I), (II) o (III).
6. Un polipéptido según la reivindicación 1, en
donde el peso molecular del polímero es entre alrededor de 5.000 y
alrededor de 200.000.
7. Un polipéptido según la reivindicación 6, en
donde el peso molecular del polímero es entre alrededor de 10.000 y
alrededor de 100.000.
8. Un polipéptido según la reivindicación 1, en
donde al menos alrededor del 50% de las unidades de monómero tienen
una o más de las fórmulas (IV) o (V):
en las
que:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- en la que R^{1} y R^{2} son como se describió anteriormente;
- -
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- en cuyo caso o R^{7} o R^{8} es H y R^{1} es como se describió anteriormente, o un resto de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- en cuyo caso R^{7} o R^{8} es H y R^{1},R^{3} y R^{4} son como se describió anteriormente,
en donde los centros quirales
marcados con un asterisco pueden tener una configuración R,
S o
RS.
9. Un polipéptido según la reivindicación 8, en
donde las unidades de monómero comprenden la fórmula (IV).
10. Un polipéptido según la reivindicación 8, en
donde las unidades de monómero comprenden la fórmula (V).
11. El polipéptido según la reivindicación 8, en
donde el polipéptido puede contener otras unidades de monómero
seleccionadas entre otros aminoácidos naturales o no naturales y sus
derivados protegidos.
12. El polipéptido según la reivindicación 8, en
el que al menos el 80% de las unidades de monómero tienen o la
fórmula (IV) o (V).
13. El polipéptido según la reivindicación 8, en
donde entre alrededor del 5% y alrededor del 30% de las unidades de
monómero contienen grupos SR^{1}.
14. El polipéptido según la reivindicación 8, en
donde las unidades de monómero se seleccionan de entre aquellas de
fórmula (IV), aquellas de fórmula (V) o restos de
L-alanina y D-alanina.
15. El polipéptido según la reivindicación 8,
que comprende unidades de monómero de fórmula (IV) o (V) en la que
R^{1} es H.
16. El polipéptido según la reivindicación 8,
que comprende unidades de monómero de fórmula (IV) en la que R^{6}
es OH o un resto de cisteína, o aquellas de fórmula (V) en la que
R^{7} y R^{8} son H o R^{7} es H y R^{8} es un resto tanto
de cisteína como de 4-mercaptobutiroilo.
\newpage
17. El polipéptido según la reivindicación 1,
que comprende unidades de monómero de restos de ácido
L-glutámico y ácido L-glutámico
(L-cisteína) con las fórmulas
\vskip1.000000\baselineskip
18. El polipéptido según la reivindicación 17,
que comprende además unidades de monómero de restos de
L-alanina.
19. El polipéptido según la reivindicación 1,
que comprende unidades de monómero de restos de
L-lisina y
N'-(4-mercaptobutiroil)-L-lisina
con las fórmulas:
\vskip1.000000\baselineskip
20. El polipéptido según la reivindicación 19,
que comprende además unidades de monómero de restos de
L-alanina.
21. Un método para preparar los polipéptidos
descritos en la reivindicación 1, que comprende proporcionar un
polipéptido precursor en el que al menos alrededor del 50% de las
unidades de monómero tienen la fórmula (VI) o (VII):
\vskip1.000000\baselineskip
o sus precursores en los que o el
grupo de ácido carboxílico o la amina primaria libre está protegido
por grupos de protección,
y
- -
-
\vtcortauna
- \quad
- en la que R^{1} y R^{2} son como se definió anteriormente; o alternativamente,
- -
-
\vtcortauna
o con el ácido
4-mercaptobutírico o sus derivados
activados.
22. Un método para preparar una matriz de
polímero que contiene al menos un fármaco, que comprende oxidar un
polipéptido según la reivindicación 1 en un medio acuoso alcalino en
presencia de al menos un fármaco, y separar la solución
obtenida.
23. La matriz de polímero que contiene un
fármaco que se obtiene usando el método según la reivindicación
22.
24. Una matriz de polímero que comprende un
polipéptido entrecruzado de la reivindicación 1 o la reivindicación
8.
25. Una matriz de polímero que comprende un
polipéptido entrecruzado de la reivindicación 24 y al menos un
fármaco.
26. La matriz de polímero según la
reivindicación 23 o 25, en donde el fármaco es un péptido o
proteína.
27. La matriz de polímero según la
reivindicación 26, que comprende un componente de fármaco que
comprende uno o más de los siguientes: el péptido
T-20; interferón u otras interleucinas; análogos de
la hormona que libera la gonadotropina (GnRH) tales como la
leuprolida, goserelina, nafarelina o triptorelina; hormona humana
del crecimiento; hormona estimuladora del folículo (FSH), o hormona
luteinizante (LH).
28. La matriz de polímero según la
reivindicación 23 o 25, en donde el componente de fármaco comprende
el paclitaxel, la doxorrubicina o la ciprofloxacina.
29. La matriz de polímero según la
reivindicación 23 o 25, en donde el componente de fármaco es la
hormona de crecimiento humana.
30. Una composición farmacéutica que comprende
una matriz de polímero que contiene un fármaco según la
reivindicación 23 o 25, y un excipiente, diluyente o vehículo
farmacéuticamente aceptable.
31. Un polipéptido según la reivindicación 1, en
donde el polipéptido puede contener otras unidades de monómeros
seleccionadas de entre otros aminoácidos naturales o no naturales y
sus derivados protegidos.
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