ES2325393T3

ES2325393T3 - Aparato poroso de flujo a traves microfabricado para la deteccion diferenciada de reacciones de union.

Info

Publication number: ES2325393T3
Application number: ES01118897T
Authority: ES
Inventors: Kenneth L. Beattie
Original assignee: Houston Advanced Research Center HARC
Current assignee: Houston Advanced Research Center HARC
Priority date: 1993-10-28
Filing date: 1994-10-27
Publication date: 2009-09-03
Anticipated expiration: 2014-10-27
Also published as: DE69430207T2; JP3488465B2; AU700315B2; EP1157743B1; DK0725682T3; AU1043595A; ATE424927T1; PT725682E; EP0725682A1; ATE214633T1; DE69430207D1; WO1995011755A1; CA2174140A1; JPH09504864A; DK1157743T3; CA2174140C; EP0725682B1; ES2176308T3; EP1157743A1; US5843767A

Abstract

Dispositivo microfabricado para unir una especie molecular, que comprende: un elemento de soporte superior que presenta unos pocillos, adherido a un sustrato de oblea de vidrio nanoporoso que presenta superficies primera y segunda en dirección opuesta; una multiplicidad de canales que se extienden a través del sustrato desde la primera superficie hasta la segunda superficie; un primer reactivo de unión inmovilizado en un primer grupo de los canales, formando una primera región diferenciada y aislada; y un segundo reactivo de unión inmovilizado en un segundo grupo de los canales, formando una segunda región diferenciada y aislada; en el que cada región diferenciada y aislada presenta una dimensión máxima de 5 a 2000 mim, la separación entre regiones adyacentes está comprendida entre 0,1 y 10 veces dicha dimensión máxima, y el sustrato presenta un espesor comprendido entre 10 y 500 mim.

Description

Aparato poroso de flujo a través microfabricado para la detección diferenciada de reacciones de unión.

Antecedentes de la invención

Actualmente están desarrollándose diversas formas de reacciones de hibridación en red bajo el título común "secuenciación por hibridación" (SBH). Se incluyen las versiones de "formato 1" de SBH, que implican la hibridación por etapas de sondas de oligonucleótidos diferentes con redes de muestras de ADN dispuestas en cuadrícula sobre membranas, e implementaciones de "formato 2", que implican la hibridación de una única "secuencia diana" de ácido nucleico a una red de sondas de oligonucleótidos ancladas a una superficie plana o inmovilizadas dentro de una matriz de gel delgada. El término "genosensor" ha hecho referencia hasta el momento a una forma de SBH en la que los oligonucleótidos están anclados a la superficie en una red bidimensional y sirven como elementos de reconocimiento para secuencias complementarias presentes en una secuencia "diana" de ácido nucleico. El concepto de genosensor incluye además dispositivos microfabricados en los que los componentes microelectrónicos están presentes en cada sitio de prueba, permitiendo una rápida detección que puede dirigirse de la hibridación a lo largo de la red.

La presente invención se define en la reivindicación 1. Por ejemplo, proporciona un genosensor de flujo a través novedoso, en el que los elementos de reconocimiento de ácido nucleico están inmovilizados dentro de canales o poros rellenos densamente, dispuestos en pequeñas extensiones a lo largo de una oblea de un material de soporte sólido. Están disponibles técnicas de microfabricación conocidas para producir sílice porosa y vidrio con microcanales o nanocanales útiles como obleas de soporte. Los genosensores de flujo a través utilizan una variedad de procedimientos de detección convencionales, que incluyen componentes de detección electrónicos y ópticos microfabricados, una película, redes de dispositivos acoplados por carga, sistemas de cámara y tecnología de almacenamiento de fósforo.

Se obtienen las siguientes ventajas para el aparato de flujo a través novedoso en la presente memoria en comparación con diseños de superficie plana conocidos:

(1): sensibilidad de detección mejorada debido al área superficial enormemente aumentada, que aumenta la cantidad de ácido nucleico unido por área de sección transversal;

(2): minimización de una etapa de difusión limitadora de la velocidad antes de la reacción de hibridación (reduciendo el tiempo requerido para que la molécula diana promedio encuentre una sonda anclada a la superficie desde horas hasta milisegundos), acelerando la hibridación y posibilitando la discriminación de un apareamiento erróneo tanto en las reacciones directas como en las inversas;

(3): posibilitar el análisis de disoluciones diluidas de ácido nucleico debido a su capacidad para hacer fluir gradualmente la disolución a través de la oblea porosa;

(4): facilitación de rondas posteriores de hibridación que implican el suministro de sondas a sitios específicos dentro de la red de hibridación;

(5): facilitación de la recuperación de ácidos nucleicos unidos desde sitios de hibridación específicos dentro de la red, posibilitando el análisis adicional de tales moléculas recuperadas; y

(6): facilitación de la unión química de moléculas de sonda a la superficie dentro de cada región aislada debido a que se evita el rápido secado de pequeñas gotitas de disolución de sonda sobre las superficies planas expuestas a la atmósfera.

La presente invención proporciona específicamente dispositivos porosos, microfabricados con densidad alta y densidad ultra-alta novedosos para la realización y detección de reacciones de unión. En particular, la presente invención proporciona "genosensores" mejorados y procedimientos para la utilización de los mismos en la identificación o caracterización de secuencias de ácido nucleico a través de hibridación con sonda de ácido nucleico con muestras que contienen un ácido polinucleico no caracterizado, por ejemplo, ADNc, ARNm, ADN recombinante, fragmentos de reacción en cadena de la polimerasa (PRC) o similares, así como otras biomoléculas.

Durante la última década la tecnología de microfabricación ha revolucionado la industria electrónica y ha posibilitado la miniaturización y automatización de procesos de fabricación en numerosas industrias. El impacto de la tecnología de microfabricación en la investigación biomédica puede verse en la creciente presencia en el laboratorio de robótica e instrumentos analíticos controlados por microprocesadores, que es particularmente evidente en laboratorios dedicados a la secuenciación y el mapeo genómicos de alto rendimiento. El Proyecto Genoma Humano es un ejemplo excelente de una tarea cuya rentabilidad económica se beneficiaría enormemente de dispositivos de hibridación de densidad alta y de densidad ultra-alta microfabricados que pueden aplicarse ampliamente en la secuenciación y el mapeo genómicos.

La hibridación de ADN inmovilizados en membrana con sondas de ADN marcadas es un procedimiento analítico ampliamente utilizado en el mapeo genómico. Los dispositivos robóticos posibilitan actualmente la disposición en cuadrículas de 10.000-15.000 ADN diana diferentes sobre una membrana de 12 cm x 8 cm. Drmanac, R., Drmanac, S., Jarvis, J. y Labat, I. 1993. en Venter, J.C. (Ed.), Automated DNA Sequencing and Analysis Techniques, Academic Press, en prensa, y Meier-Ewert, S., Maier, E., Ahmadi, A., Curtis, J. y Lehrach, H. 1993. Science 361:375-376. La hibridación de sondas de ADN a filtros de este tipo presenta numerosas aplicaciones en el mapeo genómico, incluyendo la generación de bibliotecas ordenadas linealmente, el mapeo de segmentos genómicos clonados con respecto a cromosomas específicos o megaYAC, la conexión cruzada de secuencias clonadas en bibliotecas genómicas y de ADNc, etc. Iniciativas recientes en "secuenciación por hibridación" (SBH) presentan como objetivo redes de hibridación de densidad alta miniaturizadas. Una seria limitación para la miniaturización de redes de hibridación en membranas o en superficies planas es la cantidad de ADN presente por área unitaria de sección transversal, que (en una superficie bidimensional) es función del área superficial. Este parámetro determina el rendimiento de ADN hibridado y por tanto la sensibilidad de detección.

Actualmente están desarrollándose genosensores, o "chips de ADN" miniaturizados en diversos laboratorios para el análisis por hibridación de muestras de ADN. Los chips de ADN emplean normalmente redes de sondas de ADN ancladas a superficies planas, por ejemplo, Fodor, S.P.A., Read, J.L., Pirrung, M.C., Stryer, L., Lu, A.T. y Solas, D. 1991. Science 251:767-773, Southern, E.M., Maskos, U. y Elder, J.K. 1992. Genomics 13:1008-1017, Eggers, M.D., Hogan, M.E., Reigh, R.K., Lamture, J.B., Beattie, K.L., Hollis, M.A., Ehrlich, D.J., Kosicki, B.B., Shumaker, J.M., Varma, R.S., Burke, B.E., Murphy, A. y Rathman, D.D. 1993. Advances in DNA Sequencing Technology, SPIE Conference, Los Angeles, CA, y Beattie, K., Eggers, M., Shumaker, J., Hogan, M., Varma, R., Lamture, J., Hollis, M., Ehrlich, D. y Rathman, D. 1993. Clin. Chem. 39: 719-722, para obtener un patrón de hibridación que refleje la secuencia de nucleótidos del ADN diana. El límite de detección para la hibridación en genosensores de superficie plana, como en la hibridación sobre membrana, está limitado por la cantidad de ADN que puede unirse a un área bidimensional.

Otra limitación de estos enfoques de la técnica anterior es el hecho de que un diseño de superficie plana introduce una etapa limitadora de la velocidad en la reacción de hibridación, es decir, la difusión de moléculas diana a lo largo de distancias relativamente largas antes de encontrar las sondas complementarias sobre la superficie. Por el contrario, el aparato microfabricado según la presente invención está diseñado para superar las limitaciones inherentes en los materiales de hibridación en fase sólida actuales, eliminando la etapa limitada por difusión en hibridaciones en superficie plana y aumentando la densidad en sección transversal de ADN.

Normalmente los dispositivos de genosensor microfabricados se caracterizan por un tamaño físico compacto y la densidad de componentes ubicados en el mismo. Los dispositivos de unión microfabricados conocidos son normalmente aparatos de tipo oblea rectangulares con un área superficial de aproximadamente un cm^{2}, por ejemplo, 1 cm x 1 cm. Las regiones unidas en tales dispositivos están normalmente presentes en una densidad de 10^{2}-10^{4} regiones/cm^{2}, aunque se ha considerado la conveniencia de construir aparatos con densidades mucho mayores como un objetivo importante. Véase Eggers y Beattie, citados anteriormente, para una discusión de estrategias para la construcción de dispositivos con densidades mayores para las regiones unidas.

Es conocido que los aparatos microfabricados tal como se describen en la presente memoria son útiles para una variedad de tareas analíticas, incluyendo análisis de secuencias de ácido nucleico por hibridación (SBH), análisis de patrones de expresión génica por hibridación de ARNm celular a una red de sondas específicas para genes, análisis inmunoquímico de mezclas de proteínas, mapeo de epítopos, ensayo de interacciones receptor-ligando y obtención de perfiles de poblaciones celulares que implican la unión de moléculas de la superficie celular a receptores o ligandos específicos inmovilizados dentro de sitios de unión individuales. Aunque el análisis de ácido nucleico es una utilización principal para un microaparato de este tipo, se aplica ventajosamente en una amplia gama de reacciones de unión molecular que implican moléculas pequeñas, macromoléculas, partículas y sistemas celulares. Véanse, por ejemplo, las utilizaciones descritas en la solicitud PCT publicada WO 89/10977.

Habitualmente, el aparato microfabricado se utiliza junto con una tecnología de detección conocida adaptada particularmente para discriminar entre regiones unidas en las que ha tenido lugar una unión y aquellas en las que no se ha producido ninguna unión y para cuantificar el grado relativo de unión en diferentes regiones unidas. En la detección de secuencias de ADN y ARN se utilizan ventajosamente autorradiografía y detección óptica. La autorradiografía se realiza utilizando muestras marcadas con ^{32}P o ^{35}S. Para aplicaciones de análisis de secuencias de ADN tradicionales, los fragmentos de ácido nucleico están marcados en el extremo con ^{32}P y estos fragmentos marcados en el extremo se separan por tamaño y después se colocan adyacentes a una película de rayos x según sea necesario para exponer la película, una función de la cantidad de radiactividad adyacente a una región de película. Alternativamente pueden utilizarse procedimientos de detección con un phosphorimager.

La detección óptica de receptores marcados con fluorescente se emplea también en detección. En la secuenciación tradicional, un colorante fluorescente específico para base de ADN se une covalentemente a los cebadores de oligonucleótidos o a los didesoxinucleótidos terminadores de cadena utilizados junto con la ADN polimerasa. Se elige la longitud de onda de absorción apropiada para cada colorante y se utiliza para excitar el colorante. Si los espectros de absorción de los colorantes están próximos entre sí, puede elegirse una longitud de onda específica para excitar el conjunto completo de colorantes. Una técnica de detección óptica particularmente útil implica la utilización de bromuro de etidio, que tiñe los ácidos nucleicos dúplex. La fluorescencia de estos colorantes muestra un aumento de aproximadamente veinte veces cuando está unida a ADN o ARN dúplex, en comparación con la fluorescencia mostrada por el colorante sin unir o el colorante unido a ADN monocatenario. Este colorante se utiliza ventajosamente para detectar la presencia de ácido polinucleicos hibridados.

Un procedimiento de detección sumamente preferido es una red de dispositivo acoplado por carga o red de CCD. Con la red de CCD, un pixel individual o un grupo de píxeles dentro de la red de CCD se coloca adyacente a cada región confinada del sustrato en la que ha de realizarse la detección. La atenuación de la luz, provocada por una mayor absorción de una luz de iluminación en sitios de prueba con moléculas hibridadas, se utiliza para determinar los sitios en los que ha tenido lugar la hibridación. También pueden utilizarse cámaras de CCD a base de lentes.

Alternativamente, puede construirse un aparato de detección de tal manera que puedan medirse la detección de cambios en la conductancia de CA o la disipación de un condensador colocado contiguo a cada región confinada. De manera similar, formando una línea de transmisión entre dos electrodos contiguos a cada región confinada, pueden medirse las moléculas hibridadas mediante la pérdida de radiofrecuencia (RF). Los procedimientos preferidos para su utilización en la presente memoria se describen en, Optical and Electrical Methods and Apparatus for Molecule Detection, solicitud PCT publicada WO 93/22678, publicada el 11 de noviembre de 1993.

Igualmente se conocen procedimientos para adherir muestras de biomoléculas sustancialmente homogéneas de una estructura predeterminada a las regiones confinadas del microaparato. Un procedimiento preferido para hacer esto es adherir estas biomoléculas covalentemente a superficies tales como películas de oro o vidrio. Por ejemplo, se conocen procedimientos para adhesiones de sondas de oligonucleótidos a superficies de vidrio. Se introduce una amina primaria en un extremo terminal durante la síntesis química del mismo. Opcionalmente, una o más unidades de trietilenglicol pueden introducirse entre las mismas como unidades espaciadoras. Tras derivatizar la superficie de vidrio en la región confinada con epoxisilano, el extremo terminal de amina primaria del oligonucleótido puede unirse covalentemente a la misma.

Véase Beattie, et al., citado anteriormente, para una descripción adicional de esta tecnología para fijar las biomoléculas predeterminadas en las regiones unidas del aparato microfabricado.

Técnica relacionada

Khrapko, K.R., et al., A method for DNA sequencing by hybridization with oligonucleotide matrix, J. DNA Sequencing and Mapping, 1:375-388 (1991), Drmanac, Radoje, et al., Sequencing by hybridization: Towards an automated sequencing of one million M13 clones arrayed on membranes Electrophoresis 13: 566-573 (1992), Meier-Ewert, Sebastian, An automated approach to generating expressed sequence catalogues, Nature 361:375-376 (1993), Drmanac, R., et al., DNA Sequence Determination by Hybridization: A Strategy for Efficient Large-Scale Sequencing, Science 260: 1649-1652 (1993), Southern, E.M., et al., Analyzing and Comparing Nucleic Acid Sequences by Hybridization to Arrays of Oligonucleotides: Evaluation Using Experimental Models, Genomics 13:1008-1017 (1992), y Saiki, Randall K., et al., Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6230-6234 (1989) describen determinaciones de secuencia por hibridación, incluyendo por medio de la utilización de redes de oligonucleótidos adheridas a una matriz o sustrato. Eggers, Mitchell D., et al., Genosensors: microfabricated devices for automated DNA sequence analysis, SPIE Proceedings Series, Advances in DNA Sequence Technology, Proceedings Preprint, The International Society for Optical Engineering, 21 de enero de 1993; Beattie, Kenneth, et al., Genosensor Technology, Clinical Chemistry 39:719-722 (1993); Lamture, J.B., et al., Direct detection of nucleic acid hybridization on the surface of a charge coupled device, Nucl. Acids Res. 22: 2121-2124 (1994); y Eggers, M., et al., A microchip for quantitative detection of molecules utilizing luminescent and radioisotope reporter groups, Biotechniques 17: 516-525 (1994) describen las metodologías y estrategias generales para diseñar dispositivos microfabricados útiles en la secuenciación por hibridación (SBH) para ADN.

Sumario de la invención

La presente invención se define en la en reivindicación 1. Las características preferidas se definen en las reivindicaciones subordinadas.

Los dispositivos de la presente invención se utilizan para caracterizar o identificar de otra manera las especiales moleculares que pueden unirse de manera controlada a biomoléculas de la misma manera y utilizando los mismos regímenes de unión que los conocidos en la técnica. Aunque las utilizaciones de estos dispositivos novedosos incluyen la unión anticuerpo-antígeno y ligando-receptor, una utilización principal de la presente invención es en el campo del análisis de secuencias de ácido nucleico. Dos propiedades fundamentales del ADN son vitales para sus funciones de codificación y replicación en la célula:

(1): La disposición de "bases" [adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T)] en una secuencia específica a lo largo de la cadena de ADN define la estructura genética de un individuo. Las diferencias de secuencias de ADN explican las diferencias de características físicas entre las especies y entre diferentes individuos de una especie dada

(2): Una cadena de ADN puede aparearse específicamente con otra cadena de ADN para formar una estructura bicatenaria en la que las bases están apareadas mediante un puente de hidrógeno específico: A se aparea con T y G se aparea con C. También se produce un apareamiento específico entre ADN y otro ácido nucleico, ácido ribonucleico (ARN), en el que el uracilo (U) en el ARN muestra las mismas propiedades de apareamiento de bases que T en el ADN.

El patrón específico de apareamiento de bases (A con T o U y G con C) es vital para el funcionamiento apropiado de los ácidos nucleicos en las células y comprende también medios sumamente específicos para el análisis de secuencias de ácido nucleico fuera de la célula. Una cadena de ácido nucleico de secuencia de bases específica puede utilizarse como elemento de reconocimiento de secuencias para "examinar con sonda" la presencia de la secuencia perfectamente "complementaria" dentro de una muestra de ácido nucleico (Conner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 80:278-282 (1983)). Por tanto, si una muestra de ADN o ARN "se aparea" o "se hibrida" con una "sonda" de ácido nucleico que contiene una secuencia de bases específica, la sonda se unirá a la cadena "diana" de ácido nucleico sólo si hay una complementariedad de secuencias perfecta (o casi perfecta) entre la sonda y la diana. El acontecimiento de hibridación que indica la presencia de una secuencia de bases específica en una muestra de ácido nucleico se detecta normalmente mediante la inmovilización de la muestra de ácido nucleico o la sonda sobre una superficie, seguido por la captura de una "etiqueta" (por ejemplo, radiactividad o fluorescencia) portada por la secuencia complementaria.

La hibridación de ADN se ha empleado para examinar con sonda la identidad o diferencia de secuencia entre muestras de ADN, por ejemplo en la detección de mutaciones dentro de regiones genéticas específicas (Kidd, et al., N. Engl. J. Med., 310: 639-642 (1984); Saiki, et al., N. Engl. J. Med., 319: 537-541 (1988); Saiki, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86:6230-6234 (1989)). Aunque el análisis por sonda de ADN es un medio útil para la detección de mutaciones asociadas con enfermedades genéticas, los procedimientos actuales están limitados por la necesidad de realizar una reacción de hibridación separada para la detección de cada mutación. Muchas enfermedades genéticas humanas, por ejemplo, el cáncer (Hollstein, et al., Science, 253:49-53 (1991)) están asociadas con alguna de un gran número de mutaciones distribuidas en muchas ubicaciones dentro de los genes afectados. En estos casos ha sido necesario emplear procedimientos de secuenciación de ADN laboriosos para identificar las mutaciones asociadas con la enfermedad. El problema se agrava cuando existe la necesidad de analizar un gran número de muestras de ADN, que implican poblaciones de individuos. La detección de mutaciones inducida por la exposición a radiación o productos químicos genotóxicos es de interés en las pruebas toxicológicas y la exploración de poblaciones, pero de nuevo, actualmente se necesitan procedimientos laboriosos, costosos y que requieren mucho tiempo para tales análisis mutacionales.

Además de provocar enfermedades genéticas, las mutaciones también son responsables de polimorfismos de secuencias de ADN entre elementos individuales de una población. Los polimorfismos genéticos son cambios de secuencias de ADN en cualquier locus genético dado que se mantienen en una fracción significativa de los individuos dentro de una población. Los polimorfismos de secuencias de ADN pueden servir como marcadores útiles en el mapeo genético cuando los cambios de las secuencias de ADN detectables están ligados estrechamente a marcadores fenotípicos y se producen con una frecuencia de por lo menos el 5% de los individuos dentro de una población. Además, los polimorfismos se emplean en identificación forense y pruebas de paternidad. Los procedimientos empleados actualmente para detectar polimorfismos genéticos implican búsquedas laboriosas de "polimorfismos de la longitud de fragmentos de restricción" (RFLPS) (Lander y Bottstein, Proc, Natl. Acad, Sci., U.S.A., 83:7353-7357 (1986)), la utilización igualmente laboriosa de análisis de longitud del ADN por electroforesis en gel, combinado con un procedimiento de amplificación de ADN que utiliza cebadores de oligonucleótidos de secuencia arbitraria (Williams, et al., Nucl. Acids Res., 18: 6531-6535 (1991); Welsh y McClelland, Nucl. Acids Res., 18:7213-7218 (1991)), y el análisis por electroforesis en gel de secuencias de repetición en tándem cortas de longitud variable) en ADN genómico. Weber, James L., Genomics 7: 524-530 (1990) y Weber, James L., Am. J. Hum. Genet. 44: 388-396 (1989).

Otra clase de variación de secuencias de ADN es la que se produce entre especies de organismos, que es de importancia por varios motivos. En primer lugar, la identificación de diferencias de secuencia entre especies puede ayudar en la determinación de la base molecular de diferencias fenotípicas entre especies. En segundo lugar, un estudio de la variación de secuencias dentro de un gen específico entre numerosas especies relacionadas puede aclarar un espectro de sustituciones de aminoácidos admisibles dentro del producto proteico codificado por el gen, y esta información es valiosa para la determinación de las relaciones estructura-función y en programas de ingeniería proteica. Sin embargo, este tipo de comparación de secuencias de ADN seleccionadas como diana es extremadamente laboriosa, requiere mucho tiempo y es costosa si se lleva a cabo mediante la metodología de secuenciación de ADN actual. Adicionalmente, la variación de secuencias genéticas puede formar la base de la identificación específica de organismos, por ejemplo, microorganismos infecciosos.

El aparato de la presente invención se emplea en una variedad de tareas analíticas, incluyendo análisis de secuencias de ácido nucleico por hibridación, análisis de patrones de expresión génica por hibridación de ARNm celular a una red de sondas específicas para genes, análisis inmunoquímico de mezclas de proteínas, mapeo de epítopos, ensayo de interacciones receptor-ligando y obtención de perfiles de poblaciones celulares que implican la unión de moléculas de la superficie celular a receptores o ligandos específicos inmovilizados dentro de sitios de unión individuales. Aunque en esta descripción se enseña específicamente el análisis de ácido nucleico, la presente invención puede aplicarse igualmente a una amplia gama de reacciones de unión moleculares que implican moléculas pequeñas, macromoléculas, partículas y sistemas celulares.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 representa la utilización de una red de pocillos de muestra de sección decreciente que comprenden un elemento de soporte de refuerzo para la oblea porosa que contiene canales de 0,1 - 10 micras de diámetro que comprenden la región de unión para las biomoléculas fijadas en la misma. Tal como se describe posteriormente, la región de unión es una oblea de vidrio microporoso o nanoporoso a la que está adherida la capa polimérica superior.

La figura 2 representa el empaquetamiento de un sustrato de oblea en una cámara inferior sellada a la que puede aplicarse vacío de modo que el material aplicado en un depósito superior entra en contacto con la superficie superior del sustrato poroso y se conduce a través de los pocillos de muestra. En la figura 2 se representa específicamente la utilización de una junta tórica de Delrin que comprende el sello de la cámara inferior de oblea.

La figura 3 representa el mismo aparato de cámara inferior de oblea que contiene vacío de la figura 2 con una cámara superior presurizada adicionalmente opcional. De nuevo, tal como se representa, la cámara superior está sellada por la utilización de una junta tórica de Delrin.

La figura 4 proporciona una representación esquemática idealizada de los resultados de un ensayo de detección de mutación hprt en un dispositivo según la presente invención. La secuencia representada en el lado izquierdo de la figura corresponde a los nucleótidos 23-55 de la SEC ID nº: 2. Una de las dos secuencias en el lado derecho de la figura corresponde a los nucleótidos 3-22 de la SEC ID nº: 4 (secuencia con A en la 16ª posición desde la izquierda) y la otra a los nucleótidos 3-22 de la SEC ID nº: 5 (secuencia inferior con G sustituyendo a A en la posición 16).

Descripción detallada

La presente invención se entenderá más fácilmente mediante las siguientes formas de realización preferidas:

Ejemplo 1 Obleas de vidrio con nanocanales (NCG)

Se utilizan dos tipos de redes de vidrio con nanocanales desarrolladas en el Naval Research Laboratory como estructuras de soporte nanoporosas de alta área superficial para anclar las sondas o dianas de ADN para la hibridación. Los materiales de NCG son estructuras de vidrio especiales que contienen una red geométrica regular de canales u orificios paralelos de tan sólo 33 nm de diámetro o de hasta varios micrómetros de diámetro. Véase Tonucci, R.J., Justus, B.L., Campillo, A.J. y Ford, C.E. 1992. Science 258:783-785. Estas estructuras de vidrio con nanocanales pueden presentar densidades de relleno de más de 3x10^{10} canales por centímetro cuadrado, fabricadas en diversas configuraciones de red. Una variedad de materiales puede inmovilizarse en, o fijarse a, las superficies de vidrio dentro de los canales de la red de NCG, para dar una alta razón de área superficial con respecto a volumen.

Las redes de vidrio con nanocanales se fabrican disponiendo vidrios distintos en una configuración predeterminada, en la que por lo menos un tipo de vidrio puede habitualmente atacarse químicamente con ácido. La construcción de una red de empaquetamiento compacto hexagonal bidimensional comienza con la inserción de una varilla de vidrio cilíndrica que puede atacarse químicamente con ácido (denominada el vidrio de canal) en un tubo de vidrio inerte (denominado vidrio de matriz) cuyas dimensiones internas coinciden con las de la varilla. Entonces se retira el par a vacío para reducir la sección transversal global hasta la de un filamento fino. Entonces se apilan, vuelven a fundirse y se retiran de nuevo los filamentos. Se continúa con este proceso hasta que se consiguen diámetros de canal apropiados y el número deseado de elementos de red. Ajustando la razón del diámetro de la varilla de vidrio que puede atacarse químicamente a la de la dimensión externa del tubo de vidrio inerte, la separación de centro a centro de las varillas y sus diámetros en el producto terminado se vuelven parámetros ajustables independientemente.

Una vez completado el proceso de fabricación, el material de NCG se coloca como oblea perpendicular a la dirección de los canales con una sierra de diamante y entonces se pule para producir secciones de material de 0,1-1,0 mm. Entonces se elimina por ataque químico con una disolución ácida el vidrio con canales de la estructura de red.

Una disposición de empaquetamiento compacto hexagonal de vidrios con canales, tras ataque químico con ácido, contiene normalmente 10^{7} canales y es uniforme en toda su extensión. El diámetro de canal es normalmente de 450 nm y la separación de centro a centro es de aproximadamente 750 nm. El tipo de estructura de red descrita anteriormente es útil en el montaje de hibridación de red de NCG según la presente invención. En esta configuración, la estructura de pocillos de muestra de sección decreciente define cada grupo de canales que sirve como sitio de prueba de hibridación específico.

Un segundo tipo de estructura de red hexagonal, en la que se forman agrupaciones separadas de canales durante el proceso de fabricación, muestra una estructura de red abierta con diámetros de canal típicos de 300 nm. La estructura de vidrio global consiste en una red de subredes de 18 \mum de diámetro, sirviendo cada una para contener una diana o sonda de ADN específica, y separada normalmente 25 \mum de las redes adyacentes.

Ejemplo 2 Redes de pocillos que definen regiones de unión diferenciadas y asiladas

Se unen las redes de NCG de hibridación descritas en el ejemplo 1 en el lado superior a una capa polimérica que contiene una red de orificios que están alineados con la red de haces de nanocanales y sirven como pocillos de muestra para la colocación de una muestra sustancialmente homogénea de una biomolécula (por ejemplo, una única clase de ADN) dentro de cada sitio de hibridación. Esta red de pocillos de muestra polimérica también proporciona soporte físico a la frágil oblea de NCG.

Se fabrica la red polimérica de orificios utilizando los procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, esta capa polimérica adecuada para su utilización en la presente memoria puede obtenerse de MicroFab Technologies, Inc. Se fabrican los orificios utilizando mecanizado por láser excimer. Se prefiere este procedimiento porque se emplea la tecnología existente permitiendo una fabricación de bajo coste/gran volumen, tal como está haciéndose actualmente en la industria de la microelectrónica.

El desarrollo de la red polimérica comprende cuatro tareas: (1) selección de materiales; (2) mecanizado por ablación y desarrollo de proceso; (3) mecanizado por laminación y desarrollo de proceso; y (4) producción de redes poliméricas de densidad alta y densidad ultra-alta. Estas tareas se realizan tal como sigue:

Parte A

Selección de materiales

Los materiales útiles en la red polimérica son polímeros rellenos, resinas epoxídicas y materiales compuestos relacionados (por ejemplo, de tipo "placa de circuitos"). Dado que es un proceso convencional en la industria de la microelectrónica, la presente invención emplea de la manera más ventajosa materiales poliméricos con el adhesivo aplicado por el vendedor comercial del material, por ejemplo, una poliamida con una capa de 12 \mum de espesor de un adhesivo (de termocurado) de fase B.

Los requisitos principales para el material de red polimérica que va a utilizarse son:

1.: Alta idoneidad para mecanizado por láser excimer:

i.: alta absorción en UV (por ejemplo, >4x10^{5}/cm a 193 nm),

ii.: alta tasa de ataque por láser (por ejemplo, 0,5 \mum/pulso) y baja conicidad del orificio (reducción del diámetro del orificio con la profundidad en el material, por ejemplo, <3º);

2.: Que pueda obtenerse en espesores de hasta 1 mm;

3.: Que pueda obtenerse con adhesivo de fase B en un lado tanto que pueda someterse a ablación por láser como que sea adecuado para unirse a la oblea nanoporosa;

4.: Alta rigidez y estabilidad térmica (para mantener una alineación exacta de las características de oblea de NCG y pocillo de muestra durante la laminación);

5.: Compatibilidad con disoluciones de ADN (es decir, baja unión no específica).

Parte B

Mecanizado por ablación y procesamiento

El mecanizado por láser excimer con máscara de contacto es una técnica de procesamiento preferida debido a que es una técnica de menor coste que el mecanizado por láser excimer con máscara de proyección. Sin embargo, se emplea una máscara de proyección cuando el tamaño característico es menor que 50 \mum. Se fabrican una o más máscaras con una variedad de tamaños y formas de patrón, junto con elementos de fijación para sujetar la máscara y el material que va a someterse a ablación. Estas máscaras se emplean para determinar el material óptimo para el mecanizado por láser y las condiciones de mecanizado óptimas (es decir, tamaño de orificio de la máscara, densidad de energía, tasa de entrada, etc.). Se utilizan microscopía electrónica de barrido y microscopía óptica para inspeccionar las piezas mecanizadas por láser excimer y para cuantificar las dimensiones obtenidas, incluyendo la variación en las dimensiones.

Además de someter a ablación a los pocillos de muestra en el material polimérico, también se somete a ablación el material adhesivo. Esta segunda ablación se realiza de modo que el diámetro del orificio en el adhesivo se hace más grande que el diámetro del pocillo de muestra en el lado del adhesivo del material polimérico. Esto impide que el adhesivo se disperse en el pocillo de muestra y/o el vidrio nanoporoso durante la laminación.

Parte C

Mecanizado por laminación y procesamiento

El desarrollo del proceso de laminación inicial se lleva a cabo utilizando material polimérico no sometido a ablación (o alternativamente, utilizando portaobjetos de vidrio y/u obleas de sílice). La temperatura de curado, la presión y la fijación se optimizan durante este desarrollo de proceso. Después de esto, se emplean los parámetros de procesamiento optimizados para laminar tanto las obleas nanoporosas como las redes poliméricas. La laminación final se realiza de tal modo que la alineación de las dos capas crea pocillos funcionales.

Parte D

Producción de redes poliméricas

Se determinan los parámetros de láser excimer y los patrones de máscara óptimos y después de esto se emplean en la fabricación de elementos de fijación para sujetar el material y máscaras de contacto. Normalmente, la fabricación se realiza de modo que produce un gran número (> 100) de piezas a medida que las máscaras se desgastan con su utilización.

Ejemplo 3 Adhesión de oligonucleótidos a vidrio

Parte A

Tratamiento con epoxisilano del vidrio

Se prepara con poca antelación una disolución madre de epoxisilano con las siguientes proporciones: 4 ml de 3-glicidoxipropil-trimetoxisilano, 12 ml de xileno, 0,5 ml de N,N-diisopropiletilamina (base de Hunig). Se hace fluir esta disolución al interior de los poros de la oblea, entonces se deja la oblea en remojo durante 5 horas en la disolución a 80ºC, entonces se lava con tetrahidrofurano, se seca a 80ºC y se coloca en un desecador a vacío sobre Drierrite o se almacena en un desecador bajo argón seco.

Parte B

Adhesión de oligonucleótido

Puede adherirse oligonucleótidos derivatizados con amina a vidrio derivatizado con epoxisilano en KOH diluido (por ejemplo, 10 mM - 50 mM) a 37ºC durante varias horas.

Ejemplo 4 Suministro de fluido robótico

Un sistema de suministro de fluido robótico Microlab 2200 de Hamilton, equipado con jeringas de bajo volumen especiales y cabezales de fluido de 8 posiciones, que puede suministrar volúmenes de 10-100 nl a un escalonamiento xyz de 500 \mum y una precisión de bajo porcentaje. Utilizando este equipo se colocan muestras de biomoléculas de 40 nl (por ejemplo, ADN, oligonucleótidos y similares) en el interior de los pocillos de la oblea de NCG de alta densidad. Una subfase controlada piezoléctricamente adaptada para Microlab 2200 permite la colocación en xy con una resolución de submicras. Para las muestras de 1 nl se emplean agujas fabricadas a medida. Se hace funcionar el cabezal de fluido lineal de ocho agujas en etapas repetitivas escalonadas para generar la separación estrecha deseada por toda la oblea. El sistema presenta una gran área de fase y un rápido control del movimiento, proporcionando la capacidad para producir cientos de obleas de hibridación duplicadas.

Parte A

Chorros microfluidos de Microfab

Se conocen en la técnica (Microfab Technologies, Inc.) procedimientos para suministrar microgotitas inferiores al nanolitro de fluidos a una superficie con una precisión de submicras. Se emplea una sistema de microchorro que puede suministrar disoluciones de ADN inferiores al nanolitro a la superficie de la oblea tal como sigue: para la colocación de ADN en sitios de hibridación individuales dentro de obleas de densidad ultra-alta, con volúmenes de un nl (correspondiente a una esfera de 130 \mum o un cubo de 100 \mum) se emplea un equipo dispensador comercialmente disponible que utiliza tecnología de chorro de tinta como el procedimiento de microdispensación para el volumen de fluido a continuación. Las gotitas producidas utilizando tecnología de chorro de tinta son sumamente reproducibles y pueden controlarse de modo que puede colocarse una gotita en una ubicación específica en un momento específico según datos de imágenes almacenadas digitalmente. Los diámetros de gotita típicos para los dispositivos de chorro de tinta en modo de demanda son de 30-100 \mum, lo que se traduce en volúmenes de gotita de 14-520 pl. Las velocidades de creación de gotitas para dispositivos de chorro de tinta en modo de demanda son normalmente de 2000-5000 gotitas por segundo. Por tanto, tanto la resolución como el rendimiento de la microdispensación de chorro de tinta en modo de demanda están en los intervalos requeridos para la oblea de hibridación de densidad ultra-alta.

Parte B

Sistema de microdispensación

El sistema de microdispensación se modifica a partir de un dispositivo de tipo chorro de tinta de gota a demanda de MicroFab, denominado en lo sucesivo en la presente memoria dispositivo MicroJet, de modo que este tipo de dispositivo puede producir gotitas de 50 \mum de diámetro a una velocidad de 2000 por segundo. Los principios de funcionamiento de este tipo de dispositivo se conocen (D.B. Wallace, "A Method of Characteristics Model of a Drop-On-Demand Ink-Jet Device Using an Integral Drop Formation Method", ASME publicación 89-WA/FE-4, diciembre de 1989) y se utilizan para efectuar la modificación. Para aumentar el rendimiento, se integran ocho de estos dispositivos en una red en línea de menos de 1 pulgada (25 mm) de longitud. Los ocho dispositivos se cargan con reactivo simultáneamente, se dispensan secuencialmente y se lavan simultáneamente. Se repite este protocolo hasta que se han dispensado todos los reactivos. La mayoría del tiempo de ciclo está asociado con la carga y el lavado de los reactivos, limitando las ventajas de un complejo de capacidad de dispensación paralela. El tiempo de ciclo típico requerido es como en el siguiente orden: 1 minuto para el lavado y la carga de 8 reactivos; 30 segundos para calibrar la ubicación de descarga de cada reactivo; 15 segundos para dispensar cada reactivo en una ubicación de cada uno de los 16 genosensores, o 2 minutos para dispensar los 8 reactivos. El tiempo total para cargar y dispensar 8 reactivos en 16 sensores es por tanto de 3,5 minutos. El tiempo total para 64 reactivos en 16 sensores sería de 28 minutos. El sistema de microdispensación consistirá en los subsistemas enumerados a continuación:

A.: Cabezal dispensador MicroJet - Un montaje de 8 dispositivos MicroJet y la electrónica de accionamiento requerida. El coste y la complejidad del sistema se minimizan utilizando un único canal de electrónica de accionamiento para multiplexar los 8 dispositivos dispensadores. Los requisitos de forma de onda de accionamiento para cada dispositivo individual se descargan del controlador del sistema. La electrónica de accionamiento se construye utilizando procedimientos convencionales.

B.: Sistema de suministro de fluido - Un Biomec de Beckman se modifica para que actúe como el sistema de entrada de reactivos múltiples. Entre éste y el cabezal dispensador MicroJet hay un sistema de válvulas de solenoide, controlado por el controlador del sistema. Proporcionan un fluido de lavado a presión (agua desionizada o solución salina) y aire para purgar el reactivo del sistema y vacío para cargar el reactivo en el sistema.

C.: Sistema de colocación X-Y - Se utiliza un sistema de colocación X-Y de precisión disponible comercialmente, con controlador. Pueden obtenerse fácilmente una resolución de 0,2 \mum y una exactitud de 2 \mum. El sistema de colocación está dimensionado para alojar 16 sensores, pero el tamaño del cabezal dispensador MicroJet, la estación de purgado y la estación de calibración representan los principales factores en la determinación de lo requisitos de tamaño globales.

D.: Sistema de visión - Se utiliza un sistema de visión para calibrar la "zona de descarga" de cada dispositivo MicroJet en relación con el sistema de colocación. La calibración se produce tras cada ciclo de carga de reactivo. Además, el sistema de visión ubica cada sitio de dispensación en cada sensor cuando la bandeja de 16 sensores se carga por primera vez por medio de marcas de referencia en los sensores. Por economía, se utiliza un sistema basado en software, aunque puede emplearse ventajosamente un sistema de visión a base de hardware.

E.: Controlador del sistema - Se utiliza un PC convencional como controlador del sistema global. La captura y el procesamiento de imágenes del sistema de visión se basan también en el controlador del sistema.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5 Flujo a través líquido

Con el fin de unir dianas o sondas de ADN dentro de los poros del soporte de hibridación microfabricado, llevar a cabo las etapas de hibridación y lavado, procesar el material para su reutilización y posiblemente recuperar materiales unidos para su análisis adicional, se proporcionan medios para el flujo de líquidos a través de la oblea. Para posibilitar el flujo de líquido a través de la oblea de hibridación, se empaqueta dentro de un marco de polipropileno de 2 mm x 4 mm, que sirve como depósito superior y estructura para manipulación. Se emplea una cámara de vacío de polipropileno con una junta tórica de Delrin alrededor de su borde superior para permitir la sujeción de la oblea sobre el colector de vacío para formar un sello. El montaje de vacío se ilustra en la figura 3. Para el control del flujo de fluido a través de la oblea se proporciona un dispositivo de transmisión de husillo con control de la retroalimentación.

Ejemplo 6 Síntesis y derivatización de oligonucleótidos

Los oligonucleótidos que va a utilizarse en la presente invención se sintetizan mediante la química de la fosforamidita (Beaucage, S.L. y Caruthers, M.H. 1981. Tet. Lett. 22:1859-1862) utilizando la estrategia de síntesis segmentada que puede producir más de cien oligonucleótidos simultáneamente (Beattie, K.L., Logsdon, N.J., Anderson, R.S., Espinosa-Lara, J.M., Maldonado-Rodriguez, R. y Frost, J.D. III. 1988. Biotechnol. Appl. Biochem. 10:510-521;
Beattie, K.L. y Fowler, R.F. 1991. Nature 352:548-54926.27). Los oligonucleótidos pueden derivatizarse con la función alquilamino durante la síntesis química, o bien en el extremo 5' o bien en el extremo 3'.

\newpage

Parte A

Química de adhesión al vidrio

Los procedimientos óptimos para la adhesión de ADN a superficies de dióxido de silicio se basan en química del silicio bien establecida (Parkam, M. E. y Loudon, G. M. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun., 1: 1-6; Lund, V., Schmid, R., Rickwood, D. y Homes, E. (1988) Nucl. Acids Res. 16: 10861-10880). Esta química se utiliza para introducir un grupo ligador en el vidrio que porta un resto epóxido terminal que reacciona específicamente con un grupo amina primaria terminal en los oligonucleótidos. Este enfoque versátil (utilizando epoxisilano) es barato y proporciona una red densa de monocapas que pueden acoplarse fácilmente a oligonucleótidos modificados de manera terminal (amino o tiolderivatizados). La densidad de la adhesión de la sonda se controla a lo largo de un amplio intervalo mezclando aminoalcoholes de cadena larga con los oligonucleótidos aminoderivatizados durante la adhesión al vidrio epoxisilanizado. Esta estrategia produce esencialmente una monocapa de ADN anclado, intercalado con alcoholes de cadena más corta, dando como resultado la adhesión de oligonucleótidos de hasta tan solo 50 \ring{A} alejados en la superficie. Opcionalmente se introducen espaciadores de longitud variable en los extremos de los oligonucleótidos, mediante la incorporación de unidades de trietilenglicol-fosforilo durante la síntesis química. Estos brazos de ligador variables son útiles para determinar cuánto deben separarse de la superficie las sondas de oligonucleótidos para ser fácilmente accesibles para el apareamiento con las cadenas de ADN diana. La química del tiol, adaptada del procedimiento de Whitesides y colaboradores sobre la generación de monocapas sobre superficies de oro (Randall lee, T., Laibinis, P. E., Folkers, J. P. y Whitesides, G. M. (1991) Pure & Appl. Chem. 63: 821-828 y referencias citadas en el mismo), se utiliza para la adhesión de ADN a superficies de platino y oro. Los ditioles (por ejemplo, 1,10-decanoditiol) proporcionan un resto tiol reactivo, terminal, para la reacción con oligonucleótidos bromoacetilados. La densidad de adhesión del ADN a las superficies de platino u oro se controla en la fase de activación de la superficie, mediante la utilización de mezclas definidas de mono y ditioles.

\vskip1.000000\baselineskip

Parte B

Inmovilización en superficie de fragmentos de PCR, ADNc y ADN de vector recombinante

Los procedimientos químicos descritos anteriormente se utilizan de la manera más ventajosa para la adhesión covalente de oligonucleótidos sintéticos a superficies. Para la adhesión de cadenas de ácido nucleico de cadena más larga a superficies de vidrio epoxisilanizado se emplea la reacción relativamente lenta de los grupos epoxi de superficie con los nitrógenos del anillo y los grupos amino exocíclicos a lo largo de las cadenas de ADN largas para conseguir la inmovilización. A través de experimentación rutinaria se definen las condiciones óptimas para la inmovilización de moléculas de ácido nucleico no modificadas en unos pocos sitios por diana, de modo que la mayor parte de la secuencia inmovilizada permanece disponible para la hibridación. En el caso de la inmovilización en nanocanales recubiertos con platino u oro, los grupos hexilamina se incorporan en primer lugar en el ADN diana utilizando polimerización (PCR o cebado al azar) en presencia de 5-hexilamina-dUTP, entonces se lleva a cabo una etapa de bromoacetilación para activar el ADN para la adhesión a superficies metálicas tioladas. De nuevo se emplea experimentación rutinaria (variando la razón dTTP/5-hexilamina-dUTP y el tiempo de adhesión) para definir las condiciones que proporcionan resultados de hibridación reproducibles.

El procedimiento anterior (omitiendo la etapa de bromoacetilación) puede servir también como procedimiento alternativo para la inmovilización de ADN diana en superficies de vidrio.

\vskip1.000000\baselineskip

Parte C

Capacidad de unión a ADN

Basándose en las mediciones cuantitativas de la adhesión de oligonucleótidos marcados a superficies de vidrio planas, la adhesión final coloca las sondas separadas 50-100 \ring{A} en la superficie, lo que corresponde a hasta 10^{8} sondas en un área de 50 \mum x 50 \mum. La densidad de oligonucleótidos unidos por área de sección transversal se estima mediante marcado del extremo antes de la reacción de adhesión, cuantificando entonces la radiactividad utilizando el phosphorimager. Las cantidades conocidas de oligonucleótidos marcados secados sobre la superficie se utilizan para calibrar las mediciones de densidad de unión. A partir de datos de la unión covalente del ADN de plásmido que porta hexilamina a superficies de vidrio planas epoxisilanizadas en una base suave, se sabe que por lo menos 10^{7} moléculas de pBR322 pueden adherirse por mm^{2} de superficie de vidrio. Basándose en esta densidad dentro de los poros de la oblea nanofabricada, se consigue la inmovilización de 10^{9}-10^{10} moléculas de ADN de plásmido desnaturalizado por mm^{2} de sección transversal de oblea.

\newpage

Ejemplo 7 Condiciones de hibridación

Parte A

Preparación de las muestras

Se prepara el ADN diana (analito) mediante la reacción en cadena de la polimerasa, incorporando [^{32}P]nucleótidos en el producto durante la amplificación o utilizando gamma-^{32}P[ATP] + polinucleótido cinasa para marcar en 5' el producto de amplificación. El marcador no incorporado se elimina mediante filtración con Centricon. Preferiblemente, uno de los fragmentos de PCR está marcado con biotina en 5' para posibilitar la preparación de cadenas individuales mediante cromatografía de afinidad a estreptavidina. Se disuelve el ADN diana en tampón de hibridación (Tris-HCl 50 mM, pH 8, EDTA 2 mM, cloruro de tetrametilamonio 3,3 M) a una concentración de por lo menos 5 nM (5 fmol/\mul) y una actividad específica de por lo menos 5.000 cpm/fmol. Los fragmentos de PCR de unos pocos cientos de bases de longitud son adecuados para la hibridación con oligonucleótidos anclados a la superficie de por lo menos una longitud de octámero.

Parte B

Hibridación

Se hace fluir la muestra de ADN diana hacia el interior de las regiones porosas del chip y se incuban a 6ºC durante 5-15 minutos, entonces se lavan haciendo fluir disolución de hibridación a través del chip poroso a 18ºC durante un tiempo similar. Alternativamente, la hibridación puede llevarse a cabo en tampón que contiene KCl o NaCl 1 M o betaína 5,2 M, en lugar de cloruro de tetrametilamonio.

Parte C

Optimización de la selectividad de hibridación (discriminación frente a híbridos que contienen apareamientos erróneos)

Aunque las condiciones experimentales descritas anteriormente proporcionan generalmente una discriminación aceptable entre híbridos perfectos e híbridos que contienen apareamientos erróneos, puede ser deseable cierta optimización de condiciones para ciertos análisis. Por ejemplo, la temperatura de hibridación y de lavado puede variarse en el intervalo de 5ºC a 30ºC para la hibridación con oligonucleótidos cortos. Pueden desearse temperaturas superiores para la hibridación utilizando sondas más largas.

Ejemplo 8 Detección cuantitativa de la hibridación

Parte A

Detección por phosphorimager y película

La detección y cuantificación de las intensidades de hibridación se lleva a cabo utilizando procedimientos que están ampliamente disponibles: phosphorimager y película. El phosphorimager de Biorad presenta una resolución de muestra de aproximadamente 100 \mum y puede registrar tanto emisión beta como emisión de luz desde etiquetas quimioluminiscentes. Los kits de reactivos para la detección quimioluminiscente disponibles de Millipore y New England Nuclear, que producen luz de 477 y 428 nm, respectivamente, se utilizan ventajosamente con el instrumento de Biorad. Las etiquetas quimioluminiscentes se introducen en las muestras de ADN diana (fragmentos de PCR o ADN de vector cebado al azar) utilizando los procedimientos recomendados por el proveedor. Después de esto, se hibrida el ADN con las obleas nanoporosas que portan sondas de oligonucleótidos. También se utilizan etiquetas radiactivas (^{32}P y ^{33}P, incorporadas mediante cebado al azar y reacción PCR) en estos experimentos. Se utiliza la exposición con película para la comparación. En el caso de la hibridación de oligonucleótidos marcados con ADN diana inmovilizados en superficie, lo más preferiblemente se utilizan las etiquetas radiactivas (incorporadas utilizando polinucleótido cinasa), ya que los procedimientos de etiquetado quimioluminiscente óptimo para oligonucleótidos generalmente no están disponibles.

Parte B

Dispositivos de detección de CCD

Los dispositivos genosensores de CCD pueden tener una sensibilidad y resolución máximas y se utilizan con etiquetas quimioluminiscentes, fluorescentes y radiactivas (Lamture, J.L., Varma, R., Fowler, R., Smith, S., Hogan, M., Beattie, K.L., Eggers, M., Ehrlick, D., Hollis, M. y Kosicki, B. 1993. Nature, presentado).

Ejemplo 9 Experimento genosensor; detección de la mutación en la región del exón 7/8 de un gen hprt de hámster

El gen hprt se utiliza ampliamente como sistema modelo para estudios de mutación. El gen se ha clonado y secuenciado a partir de diversos mamíferos. Se conocen una variedad de mutaciones en este gen y se caracterizaron mediante secuenciación de ADN, en el hámster (inducida mediante productos químicos y radiación en líneas celulares de ovario de hámster chino) y a partir de seres humanos (asociados con el síndrome de Lesch Nyhan). Una fracción significativa de las mutaciones hprt se encuentran en una región corta del gen codificado por los exones 7 y 8. La secuencia de nucleótidos de los genes normales y mutantes se encuentra en las siguientes referencias: Edwards, A., Voss, H., Rice, P., Civitello, A., Stegemann, J., Schwager, C., Zinimermann, J., Erfle, H., Caskey, C..T. y Ansorge, W. (1990), Automated DNA Sequencing of the Human HPRT Locus, Genomics, 6:593-608; Gibbs, R., Nguyen, P.-N., Edwards, A., Civitello, A. y Caskey, C.T. (1990), Multiplex DNA Deletion Detection and Exon Sequencing of the Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Gene in Lesch-Nyhan Families, Genomics, 7:235-244; Yu, Y., Xu, Z, Gibbs, R. y Hsie, A. (1992), Polymerase chain reaction-based Comprehensive Procedure for the Analysis of the Mutation Spectrum at the Hypoxanthine-guanine Phosphoribosyltransferase locus in Chinese Hamster Cells, Environ. Mol. Mutagen., 19:267-273; y Xu, Z., Yu, Y., Gibbs, R., Caskey, C.T. y Hsie, A. (1993), Multiplex DNA Amplification and Solid-phase Direct Sequencing at the hprt Locus in Chinese Hamster Cells, Mutat. Res., 282: 237-248. Las secuencias de nucleótidos del ADNc de la región del exón 7/8 de hprt de hámster, y sondas adecuadas, se proporcionan en el documento WO-A-95/11755.

Se construye un dispositivo microfabricado de densidad alta o densidad ultra-alta según los ejemplos anteriores y se lleva a cabo la adhesión de las sondas de oligonucleótidos dentro de las regiones unidas de la oblea. Se incluyen las sondas normales (1-18) más las sondas específicas que corresponden a cinco mutaciones conocidas diferentes, incluyendo las mutaciones anteriores (sitios 19 y 20, respectivamente). Lo anterior utiliza dos conjuntos de cebadores de PCR (tabla I) para amplificar la región de los exones 7/8 de ADN genómico de hámster. Se incorpora un marcador radiactivo (^{32}P) en los fragmentos de PCR durante la amplificación, lo que posibilita la detección de hibridación por autorradiografía o phosphorimager. La figura 4 ilustra los resultados cuando se adhieren las sondas anteriores a un extremo a la superficie en sitios de prueba específicos dentro del chip de ADN (numerados tal como anteriormente). Los patrones de hibridación idealizados para dos de los mutantes (deleción de 10 bases en la izquierda y transición A-G en la derecha) se muestran en la parte inferior.

Claims

1. Dispositivo microfabricado para unir una especie molecular, que comprende:

un elemento de soporte superior que presenta unos pocillos, adherido a un sustrato de oblea de vidrio nanoporoso que presenta superficies primera y segunda en dirección opuesta;

una multiplicidad de canales que se extienden a través del sustrato desde la primera superficie hasta la segunda superficie;

un primer reactivo de unión inmovilizado en un primer grupo de los canales, formando una primera región diferenciada y aislada; y

un segundo reactivo de unión inmovilizado en un segundo grupo de los canales, formando una segunda región diferenciada y aislada;

en el que cada región diferenciada y aislada presenta una dimensión máxima de 5 a 2000 \mum, la separación entre regiones adyacentes está comprendida entre 0,1 y 10 veces dicha dimensión máxima, y el sustrato presenta un espesor comprendido entre 10 y 500 \mum.

2. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que los reactivos de unión resultan eficaces para llevar a cabo reacciones de unión que implican moléculas pequeñas, macromoléculas, partículas o sistemas celulares.

3. Dispositivo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que los reactivos de unión son ADN, proteínas o ligandos.

4. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los reactivos de unión son adecuados para su utilización en análisis de secuencias de ácido nucleico por hibridación, análisis de patrones de expresión génica por hibridación de ARNm celular a una red de sondas específicas para genes, análisis inmunoquímico de mezclas de proteínas, mapeo de epítopos, ensayo de interacciones receptor-ligando u obtención de perfiles de poblaciones celulares que implican la unión de moléculas de la superficie celular a receptores o ligandos específicos.

5. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los reactivos de unión son polinucleótidos.

6. Dispositivo según la reivindicación 5, en el que los polinucleótidos son oligonucleótidos o clones de ADNc.

7. Dispositivo según la reivindicación 5, en el que los polinucleótidos comprenden un conjunto de sondas de oligonucleótidos completamente degenerados.

8. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que la fijación de los polinucleótidos en los canales puede conseguirse mediante la adhesión de un derivado de amina primaria terminal del polinucleótido a un sustrato de vidrio derivatizado con epoxisilano.

9. Dispositivo según la reivindicación 8, en el que la adhesión comprende una o más unidades de trietilenglicol-fosforilo.

10. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que la fijación de los polinucleótidos en los canales puede conseguirse mediante la adhesión de un derivado de bromoacetilo terminal del polinucleótido a un sustrato de platino derivatizado con un ditioalcano.

11. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el sustrato es de SiO_{2} y los reactivos de unión están fijados al mismo por medio de un grupo amina primaria.

12. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende más de 3 x 10^{10} canales por cm^{2}.

13. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que cada una de las regiones presenta una dimensión máxima de aproximadamente 100 \mum, la separación de centro a centro entre regiones adyacentes es de aproximadamente 500 \mum, el sustrato presenta un espesor de aproximadamente 100 \mum y la densidad de dichas regiones en la oblea es de aproximadamente 400 regiones/cm^{2}.

14. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que cada una de las regiones presenta una dimensión máxima de aproximadamente 50 \mum, la separación de centro a centro entre regiones adyacentes es de aproximadamente 150 \mum, el sustrato presenta un espesor de aproximadamente 50 \mum y la densidad de dichas regiones en el sustrato es de aproximadamente 4.400 regiones/cm^{2}.

15. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el elemento de soporte es rígido y forma una sola pieza con el sustrato, o está unido al sustrato.

16. Dispositivo según la reivindicación 15, en el que los pocillos son de sección decreciente.

17. Aparato que comprende un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores y unos medios de detección que pueden determinar el grado en el que ha tenido lugar una reacción de unión, y que notifica el resultado de la misma.

18. Aparato según la reivindicación 17, en el que los medios de detección comprenden un dispositivo acoplado por carga.

19. Aparato que comprende un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 y unos medios para aplicar una diferencia de presión por el sustrato, para facilitar el flujo de líquido a través del mismo.

20. Aparato según la reivindicación 19, que comprende una cámara de vacío acoplada al mismo.

21. Aparato según la reivindicación 19, que comprende una cámara de presión acoplada al mismo.

22. Procedimiento para detectar una reacción de unión entre un reactivo de unión y una especie molecular, que comprende:

(A): poner en contacto una muestra de la que se sospecha que contiene una diana de unión con un dispositivo según lo definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16; y

(B): detectar la unión entre la especie molecular en la muestra y por lo menos un reactivo de unión en por lo menos un grupo de canales diferenciados en el sustrato, detectando de ese modo la reacción de unión.

23. Procedimiento según la reivindicación 22, que comprende inundar una superficie del sustrato con la muestra y poner la superficie opuesta del sustrato a presión negativa con respecto a la primera superficie.

24. Procedimiento según la reivindicación 22 o la reivindicación 23, en el que se utiliza un marcador detectable para detectar la reacción de unión.

25. Procedimiento según la reivindicación 24, en el que la especie molecular está marcada.

26. Procedimiento según la reivindicación 24 o la reivindicación 25, en el que el marcador es quimioluminiscente, fluorescente o radiactivo.

27. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, en el que la reacción comprende hibridación de ácido nucleico.

28. Procedimiento según la reivindicación 27, para el análisis de la expresión génica.

29. Procedimiento según la reivindicación 27, para la detección de la variación en una secuencia de ADN.

30. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 29, en el que la sonda detecta diferencias en la expresión génica entre los estados normal y mutado de una célula o tejido.

31. Procedimiento según la reivindicación 30, en el que las diferencias están provocadas por la exposición a un fármaco o compuesto químico.

32. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que los canales diferenciados presentan un diámetro comprendido entre 0,45 y 10 \mum.

33. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 y 32, en el que los canales presentan cada uno un diámetro de 0,033 \mum.

34. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, 32 y 33, en el que los reactivos de unión primero y segundo difieren entre sí.

35. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 y 32 a 34, en el que los reactivos de unión primero y segundo se unen a diferentes especies moleculares.