ES2325737T3 - Vacuna para enfermedad periodontal. - Google Patents

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ES2325737T3 ES05718305T ES05718305T ES2325737T3 ES 2325737 T3 ES2325737 T3 ES 2325737T3 ES 05718305 T ES05718305 T ES 05718305T ES 05718305 T ES05718305 T ES 05718305T ES 2325737 T3 ES2325737 T3 ES 2325737T3
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John Morgan Hardham
John David Haworth
Kendall Wayne King
Rajendra Krishnan
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Abstract

Una vacuna para tratar o prevenir la enfermedad periodontal en animales de compañía que comprende preparaciones de células completas inactivadas de P. gulae B43, P. salivosa B104 y O. denticanis BI 06 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Description

Vacuna para enfermedad periodontal.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una vacuna para tratar o prevenir la enfermedad periodontal en animales de compañía que comprende preparaciones de células completas inactivadas de P. gulae B43, P. salivosa B104 y O. denticanis B106 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Antecedentes de la técnica
La gran mayoría de datos experimentales que se refieren a enfermedades periodontales están basados en estudios de seres humanos o de bacterias aisladas de seres humanos. Se conoce relativamente poco con respecto a la enfermedad periodontal en animales no humanos, tales como animales de compañía, y en concreto, perros y gatos.
La enfermedad periodontal comprende un grupo de infecciones que implican a los tejidos de soporte del diente. Esta oscila en gravedad desde la inflamación leve y reversible de la encía (gingival) a la destrucción crónica de los tejidos periodontales (encía, ligamento periodontal, y hueso alveolar) con exfoliación eventual del diente.
Desde un punto de vista microbiológico, son de interés diversas características de esta enfermedad. La etiología bacteriana es compleja, con una variedad de organismos responsable del inicio y la progresión de la enfermedad en seres humanos. Muchos, sino todos, de estos organismos pueden estar también presentes en el individuo periodontalmente sano y pueden existir en armonía comensal con el huésped. De esta manera, los episodios de enfermedad pueden ser el resultado de un cambio en el equilibrio ecológico entre los factores bacterianos y del huésped, como resultado de, por ejemplo, la alteración en los números absolutos o relativos de algunos organismos, cambios en el potencial patogénico, o la modulación de factores del huésped concretos. El entorno local impone una variedad de restricciones únicas de la microbiota constituyente de la superficie dental supragingival y el espacio subgingival (el canal entre
la raíz del diente y la encía que se hace más profundo en una bolsa periodontal a medida que la enfermedad progresa).
Tanto los tejidos duros calcificados del diente como las células epiteliales de la encía están disponibles para la colonización. Estos tejidos están expuestos a las secreciones salivales del huésped y al fluido crevicular gingival (un exudado sérico), los cuales contienen moléculas que interactúan directamente con las bacterias y después predominan las condiciones ambientales. Además, se sabe que en seres humanos pueden coexistir colonizadores del diente y la zona subgingival que tienen éxito con muchas (en torno a 600) otras especies de bacterias que habitan estas regiones. El estudio de la patogénesis de las enfermedades periodontales en seres humanos se complica de esta manera por la complejidad ecológica del microentorno.
La clasificación de las diversas manifestaciones de la enfermedad periodontal en seres humanos está cambiando continuamente, y será suficiente mencionar que las enfermedades varían en gravedad, velocidad de progresión, y número de dientes afectados y que pueden ser susceptibles grupos diferentes de edad tras la erupción de los dientes primarios. La naturaleza de los agentes patógenos varía entre estas entidades de enfermedad, así como entre los pacientes humanos e incluso entre diferentes emplazamientos de la enfermedad en el interior de un paciente. En general, sin embargo, algunas formas de la enfermedad están asociadas con numerosas bacterias gram negativas. De este grupo, en seres humanos, la mayor parte de la evidencias apuntan a un papel patógeno de las Porphyromonas (antiguamente Bacteroides) gingivalis. La presencia de este organismo, que actúa en una infección tanto solo como combinado con otras bacterias, y posiblemente en concierto con la ausencia de especies beneficiosas y ciertas respuestas inmunológicas en el huésped, parece ser esencial para la actividad de la enfermedad.
La colonización de la cavidad oral requiere que las bacterias entren en primer lugar en la boca y a continuación se localicen en y ataquen las superficies disponibles. Los factores del huésped que actúan para evitar la colonización bacteriana incluyen las fuerzas de cizalladura mecánica del movimiento de la lengua junto con el flujo de saliva y de fluido crevicular gingival. Los colonizadores orales que tienen éxito poseen por tanto una variedad de atributos para superar los mecanismos protectores del huésped. La biopelícula de placa sésil que se acumula posteriormente sobre los tejidos duro y blando de la boca es un sistema dinámico compuesto de diversas especies microbianas. En seres humanos, P. gingivalis se encuentra usualmente entre los colonizadores posteriores o secundarios de la cavidad oral, requiriendo organismos antecedentes para crear las condiciones ambientales necesarias.
Se piensa que la entrada inicial de P. gingivalis en la cavidad oral humana se produce por transmisión desde individuos infectados. Parece que también otros vectores podrían ser operativos. Estos estudios indican que los individuos están colonizados por un genotipo único (o al menos uno predominante) sin tener en cuenta el emplazamiento de colonización o el estado clínico. Cepas de muchos orígenes clonales diferentes, por el contrario, están presentes en individuos diferentes. Esto apoya el concepto de que P. gingivalis es esencialmente un patógeno oportunista, no estando restringida la virulencia a un tipo clonal concreto.
La cavidad oral humana proporciona una variedad de superficies a las cuales se puede adherir P. gingivalis. Son los tejidos duros mineralizados del diente, junto con las superficies mucosales incluyendo las de la encía, mejilla, y lengua.
Aunque se sabe mucho acerca de la enfermedad periodontal en seres humanos, tal como se ha descrito anteriormente, se sabe muy poco acerca de la misma enfermedad en animales de compañía. Fournier, D. y col., "Porphorymonas gulae sp. nov., an Anaerobic, Gramnegative, Coccibacillus from the Gingival Sulcus of Various Animal Hosts", International Journal of a Systematic and Evolutionary Microbiology (2001), 51, 1179-1189 describen diversas cepas aisladas de diversos huéspedes animales, incluyendo una cepa, P. gulase spp. nov., designada ATCC 57100. Los autores plantean la hipótesis de que el biotipo animal de P. gingivalis representa una especie de Porphyromonas que es distinta de P. gingivalis. No existe mención de una vacuna útil en el tratamiento de la enfermedad periodontal en animales de compañía. Hirasawa y Takada, en "Porphyromonas gingivicanis sp. nov. y Porphyromonas crevioricanis sp. nov., Isolated from Beagles", International Journal of Systemic Bacteriology, pp. 637-640, (1994), describen dos especies bacterianas aisladas de fluidos creviculares gingivales de sabuesos. Se describen estas especies en las Patentes de los Estados Unidos N^{os} 5.710.039 y US 5.563.063. Los autores no sugieren en ninguna parte el uso de estas especies en una vacuna para tratar la enfermedad periodontal. La Solicitud Internacional PCT/AU98/01023, que tiene el número de publicación WO 99/29870, describe diversos polipéptidos y nucleótidos de P. gingivalis. Sin embargo no se proporcionan evidencias de vacunas eficaces en la prevención de la enfermedad periodontal en animales de compañía. Incluso, aunque existe una gran cantidad de información conocida acerca de la enfermedad humana, se ha avanzado poco con el fin de evitar o tratar la enfermedad, incluso en seres humanos.
Persiste una necesidad de una vacuna segura y eficaz para tratar y evitar la enfermedad periodontal en animales de compañía.
Genco y col. (Trends in Microbiology 6: 444-449, 1998) describen un modelo de rata para investigar la enfermedad periodontal mediada por Porphyromonas gingivicanis. Grecca y col. (J. Endodontics 27: 610, 2001) describen la evaluación radiográfica de la reparación periradicular tras el tratamiento endodóntico del diente de perro con periodontitis perirradicular inducida.
Antes de la presente invención, no existía modelo animal disponible para evaluar la eficacia de una vacuna contra una o más bacterias periopatógenas de una manera definida y cuantitativa.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona una vacuna para tratar o prevenir la enfermedad periodontal en animales de compañía que comprende preparaciones de células completas inactivadas de P. gulae B43, P. salivosa B104 y O. denticanis B106 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En una forma de realización, las bacterias de la vacuna de la presente invención se inactivaron mediante formalina. En una forma de realización adicional, la vacuna de la invención comprende además al menos uno de Virus del Moquillo Canino (VMC), Adenovirus-2 Canino (AVC-2), Parvovirus Canino (PVC), Virus de la Parainfluenza Canina (PIC), o Coronavirus Canino (CVC).
En otra forma de realización, la presente invención se refiere al uso de la vacuna de la invención en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir la enfermedad en animales de compañía en necesidad del mismo.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un kit que comprende, en al menos un envase, una composición para tratar y evitar la enfermedad periodontal en animales de compañía que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y preparaciones de células completas inactivadas de P. gulae B43, P. salivosa B104 y O. denticanis B106; en el que el kit comprende además un conjunto de instrucciones impresas que indican que el kit es útil para tratar o prevenir la enfermedad periodontal en animales de compañía.
Ninguna de las bacterias, polinucleótidos, polipéptidos, vacuna, composiciones de vacuna o kits de la presente invención comprende ninguna de las bacterias, polipéptidos o péptidos descritos en Foumier, D. y col., "Porphorymonas gulae sp. nov., an Anaerobic, Gram-negative, Coccibacillus from the Gingival Sulcus of Various Animal Hosts", International Journal of a Systematic and Evolutionary Microbiology (2001), 51, 1179-1189, incluyendo una cepa, P. gulae spp, nov., designada ATCC57100, Hirasawa y Takada, "Porphyromonas gingivicanis sp. nov. and Porphyromonas crevioricanis sp. nov., Isolated from Beagles", International Journal of Systemic Bacteriology, pp. 637-640, (1994), Patentes de los Estados Unidos N^{os} 5.710.039 o US 5.563.063, o la Solicitud Internacional PCT/AU98/01023, que tiene número de publicación WO 99/29870.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 es un árbol filogenético según el procedimiento del vecino más próximo de los representantes de la clase Bacteroidetes. El árbol filogenético se generó usando los programas informáticos CLUSTAL X versión 1.81 y NJ Plot (disponibles ambos en ftp://ftpigbmc.u-strasbg.fr/pub/ClustalX/). El árbol se enraizó a la secuencia génica del ARNr de 16S de Escherichia coli (número de acceso J01695; no se muestran los datos). Se llevó a cabo el análisis de remuestreo usando 1000 réplicas. Se presentan gráficamente los valores de remuestreo (\bullet, > 950; \blacksquare, > 850; o, > 700; \boxempty, > 500; sin designación, < 500. La barra de escala representa 0,01 sustituciones por posición de nucleótido. Las flechas indican la localización de O. denticanis B106^{T}, Números de acceso: P. gingivalis ATCC 33277, J01695; P. gulae B243, AF285874; P. cansulci VPB 4875, X76260; P. salivosa NCTC 11632, L26103; P. endodontalis ATCC 35406, AY253728; T. forsythensis ATCC 43037, AB035460; Clon oral BU45 del Bacteroides cf. forsythus, AF385565; B. merdae ATCC 43184T, X83954; B. distasonis ATCC 8503, M86695; Bacteria fecal equina 118ds10, AY212569; D. shahii cepa CCUG 43457, AJ319867; Clon de Bacteroidaceae:Rs-P82 sin cultivar, AB088919; Bacteria cadhufec 059h7 sin cultivar, AF530302; B. splanchnicus NCTC 10825, L16496; O. denticanis B106T, AY560020; Bacteroidetes sp. Clon oral FX069, AY134906; bacteria sin cultivar SHA-38, AJ249105; A. putredinis ATCC 29800, L16497; R. microfusus ATCC 29728, L16498; B. denticanium B78, AY549431; B. fragilis ATCC 25285T, X83935; B. thetaiotaomicron cepa 17.4, AY319392; B. acidofaciens cepa A37, AB021163; P. bivia ATCC 29303. L16475; P. nigrescens ATCC 25261, L16479; P. intermedia ATCC 25611, L16468; P. denticola ATCC 35308, L16467; y P. buccae ATCC 33690, L16478.
La Figura 2 es un árbol filogenético según el procedimiento del vecino más próximo para los aislados clínicos de Odoribacter denticanis. El árbol filogenético se generó como en la Fig. 1. El árbol se enraizó a la secuencia génica del ARNr de 16S de Porphyromonas gingivalis ATCC 53977 (número de acceso L16492; no se muestran los datos). La barra de escala representa 0,01 sustituciones por posición de nucleótido. Números de acceso: O. denticanis B106T, AY560020; O. denticanis B113, AY560022; O. denticanis B150, AY560027; O. denticanis B155, AY560030; O. denticanis B172, AY560033; O. denticanis B183, AY560035; Bacteroidetes sp. Clon oral FX069, AY134906; Bacteria cadhufec 059h7 sin cultivar, AF530302; B. splanchnicus NCTC10825; y clon de Bacteroidaceae:Rs-P82 sin cultivar, AB088919.
La Figura 3 es un árbol filogenético según el método del vecino más próximo para los representantes de la familia de la proteína FimA de Porphyromonas gingivalis (tipos I-V). El árbol filogenético se generó usando los programas informáticos CLUSTAL X versión 1.81 y NJ Plot. El árbol se enraizó a la proteína fimbrilina CFT073 de Escherichia coli (número de acceso NP_757241; no se muestran los datos). Se llevó a cabo el análisis de remuestreo usando 1000 réplicas. Se presentan gráficamente los valores de remuestreo (\bullet, > 950; \blacksquare, > 850; o, > 700; \boxempty, > 500; sin designación, < 500). La barra de escala representa 0,05 sustituciones por posición de aminoácido. Números de acceso de FimA: O. denticanis B106T, AY573801; P. gingivalis HG1691, Q93R80; P. gingivalis BH18/10, JN0915; P. gingivalis ATCC 33277, P13793; P. gingivalis OMZ314, BAA04624; P. gingivalis OMZ409, Q51822; P. gingivalis 6/26, Q51826; P. gingivalis ATCC 49417, Q51825; P. gingivalis W83, AAQ67087; P. gingivalis HG564, Q51827; y P. gingivalis HNA-99, Q9SOW8.
La Figura 4 está constituida por micrografías de barrido electrónico de (A) P. gulae B43 and (B) O. denticanis B106^{T}. La barra de escala representa una distancia de 1000 nm.
La Figura 5 es un gráfico que muestra los resultados de un estudio de crecimiento que identifica un medio "libre de producto animal" que soporta el crecimiento de Porphyromonas gulae B43. Se ensayaron los siguientes medios. ME-completo, ME-hemina, ME-vitamina K, ME-hemina y vitamina K, PYG-completo, PYG-hemina, PYG-vitamina K, PYG-hemina y vitamina K, y BHI.
La Figura 6 es un gráfico que muestra la pérdida promedio de hueso en ratones resultante de superinfección con las especies bacterianas indicadas. La pérdida neta de hueso representa la pérdida de hueso por encima y más allá de la observada en el grupo estimulado en simulación. La línea punteada representa la pérdida neta de hueso del grupo control positivo. Se indica el error estándar.
La Figura 7 es un gráfico que muestra el porcentaje de pérdida de hueso en ratones resultante de la superinfección con las especies bacterianas indicadas. Los ratones se estimularon en simulación o se estimularon con las bacterias indicadas. El porcentaje de pérdida de hueso está basado en la pérdida neta de hueso del grupo control positivo tomado como el 100% de pérdida de hueso.
Las Figuras 8A y B son fotografías que muestran en la Figura 8A, una SDS-PAGE, y en la Figura 8B, un análisis mediante transferencia Western usando el suero del epitopo anti-Xpress^{TM} (Invitrogen), de FimA de P. gulae B43 recombinante expresado en E. coli BL21 a partir de pBAD-HisA. Abreviaturas: Std (en kDa), estándares; Ind, inducido; Sol, fracción soluble; e Insol, fracción insoluble. Las puntas de las flechas denotan las localizaciones de rFimA.
La Figura 9 es una fotografía que muestra el análisis SDS-PAGE de oprF de P. gulae B43 recombinante expresado en células de E. coli BL21 a partir de un plásmido de expresión. La T = denota el tiempo después del cambio del cultivo desde 30ºC a 42ºC. Se proporcionan los estándares de tamaño del peso molecular en kDa. La punta de la flecha denota la localización de rPprF.
La Figura 10 es un gráfico que muestra los resultados del estudio de eficacia de una vacuna homóloga basada en la pérdida neta de hueso. El estudio de eficacia de la vacuna homóloga se basa en la pérdida neta de hueso: Se vacunaron los ratones con los siguientes antígenos de la vacuna y el adyuvante RIBI MPL +TDM (excepto el grupo C, que utilizó adyuvante de Freund completo e incompleto): A, B, y E, sólo PBS; C y D, P. gingivalis 53977 inactivada con formalina, P. gulae B43 inactivada con formalina; G, P. gulae B43 inactivada con BEI; H, P. gulae B43 inactivada con calor, P. gulae B43 inactivada con aireación. Los ratones se estimularon en simulación (grupo A), se estimularon con P. gingivalis 53977 (barras rayadas), o P. gulae B43 (barras sólidas) en carboximetilcelulosa al 1%. Se indican las medidas del error estándar.
La Figura 11 es un gráfico que muestra el estudio de eficacia de una vacuna homóloga de P. gingivalis 53977 en función del porcentaje de pérdida de hueso. Los ratones se vacunaron con los siguientes antígenos de vacuna y el adyuvante RIBI MPL+TDM (excepto el grupo C que utilizó adyuvante de Freund completo e incompleto): A y B, PBS sólo, C y D, P. gingivalis inactivado con formalina. Los ratones se estimularon con A, PBS; o B-D, P. gingivalis 53977 en carboximetilcelulosa al 1%.
La Figura 12 es un gráfico que muestra el estudio de eficacia de una vacuna homóloga de P. gulae B43 en función del porcentaje de pérdida de hueso. Los ratones se vacunaron con los siguientes antígenos de vacuna y el adyuvante RIBI MPL+TDM: A.B, PBS sólo; C, P. gulae B43 inactivada con formalina; D, P. gulae B43 inactivada con BEI; E, P. gulae B43 inactivada con calor; y F, P. gulae B43 inactivada con aireación. Los ratones se estimularon con A, PBS; o B-F, P. gulae B43 en carboximetilcelulosa al 1%.
La Figura 13 es un gráfico que muestra los resultados del estudio de eficacia de una vacuna heteróloga en función de la pérdida neta de hueso. Los ratones se vacunaron con los siguientes antígenos de la vacuna y el adyuvante RIBI MPL+TDM: A-E, PBS sólo; F-1, P. gulae B43 inactivada con formalina; J, P. salivosa B104 inactivada con formalina y O. denticanis B106 inactivada con formalina. Los ratones se estimularon con PBS (A), P. gulae B43 (B y F; barras sólidas), P gulae B69 (C, G, y J; barras rayadas, P. salivosa B104 (D y H; barras con líneas), u O. denticanis B106 (E e I; barras punteadas con lunares) en carboximetilcelulosa al 1%. Se indican las medidas del error estándar.
La Figura 14 es un gráfico que muestra los resultados para los grupos de estímulo de P. gulae B43 del estudio de eficacia de la vacuna heteróloga en función del porcentaje de pérdida de hueso. Los ratones se vacunaron con los siguientes antígenos de la vacuna y el adyuvante RIBI MPL+TDM: A-B, PBC sólo; C, P. gulae B43 inactivada con formalina. Los ratones se estimularon con A, PBS; o B-C, P. gulae B43 en carboximetilcelulosa al 1%.
La Figura 15 es un gráfico que muestra los resultados para los grupos de estímulo de P. gulae B69 del estudio de eficacia de la vacuna heteróloga en función del porcentaje de pérdida de hueso. Los ratones se vacunaron con los siguientes antígenos de la vacuna y el adyuvante RIBI MPL+TDM: A-B, PBS sólo; C, P. gulae B43 inactivada con formalina; o D, P. salivosa B104 inactivado con formalina y O. denticanis B106 inactivado con formalina. Los ratones se estimularon con A, PBS; o B-D, P. gulae B69 en carboximetilcelulosa al 1%.
La Figura 16 es un gráfico que muestra los resultados para los grupos de estímulo de P. salivosa B104 del estudio de eficacia de la vacuna heteróloga en función del porcentaje de pérdida de hueso. Los ratones se vacunaron con los siguientes antígenos de la vacuna y el adyuvante RIBI MPL+TDM: A-B, PBS sólo; o C, P. gulae B43 inactivada con formalina. Los ratones se estimularon con A, PBS; o B-C, P. salivosa B104 en carboximetilcelulosa al 1%.
La Figura 17 es un gráfico que muestra los resultados para los grupos de estímulo de O. denticanis del estudio de eficacia de la vacuna heteróloga en función del porcentaje de pérdida de hueso. El estudio de eficacia de la vacuna heteróloga, en función del porcentaje de pérdida de hueso para los grupos infectados por O. denticanis B106. Los ratones se vacunaron con los siguientes antígenos de la vacuna y el adyuvante RIBI MPL+TDM: A-B PBS sólo, o C, P. gulae B43 inactivada con formalina. Los ratones se estimularon con A, PBS; o B-C, O. denticanis B106 en carboximetilcelulosa al 1%.
La Figura 18 es un gráfico que muestra los resultados serológicos de los ratones vacunados con FimA de P. gulae B43 recombinante o solución salina utilizando un ELISA específico de FimA. Se vacunaron cada uno de dieciséis ratones con cualquiera de solución salina (A) o rFimA/QuilA/Colesterol (B). Se ensayó el suero combinado para los anticuerpos específicos de FimA mediante un ELISA específico de FimA. La dilución mínima ensayada fue de 1:100. A cualquier muestra dando como resultado un resultado negativo se le proporcionó una valoración de 50.
La Figura 19 es un gráfico que muestra los resultados serológicos de los ratones vacunados con OprF de P. gulae B43 o solución salina utilizando un ELISA específico de OprF. Se vacunaron cada uno de dieciséis ratones con cualquiera de solución salina (A) o rOprF/QuilA/Colesterol (B). Se ensayaron los sueros combinados para los anticuerpos específicos de OprF mediante un ELISA específico de OprF. La dilución mínima ensayada fue de 1:100. A cualquier muestra que dio como resultado un resultado negativo en esta dilución se le proporcionó una valoración de 50.
La Figura 20 es un gráfico que muestra una pérdida de hueso a las 0, 6, y 12 semanas después del estímulo. El grupo T01 está representado por los perros 2559424, 3592669, 3672859, 3673375, y 3691926; El grupo T02 está representado por los perros 3389600, 3628884, 3653552, 3657396, 3690164.
La Figura 21 es un gráfico que muestra las puntuaciones de reactividad del hueso para los grupos T01 (vacunado y estimulado, o Vx/Ch), T02 (simulación vacunada y estimulada, o No-Vx/Ch), y To3 (simulación vacunada y simulación estimulada, o No-Vx/No-Ch) a las 0, 3, 6, 9 y 12 semanas después del estímulo. Se indican también las significancias estadísticas de los efectos del tratamiento.
La Figura 22 es un gráfico que muestra las puntuaciones de reactividad del hueso para los grupos T01 (Vx/Ch), T02 (No.Vx/Ch), y T03 (No-Vx/No-Ch) a las 0, 3, 6, y 9 semanas después del estímulo. Se indica la significancia estadística entre los grupos T01 y T02.
Las Figuras 23A-23D son imágenes radiográficas de un perro único del grupo T01 (Vx/Ch) a las 0 (23A), 3 (23B), 6 (23C) y 9 (23D) semanas después del estímulo. Las Figuras 23E-23H son imágenes radiográficas de un perro único del grupo T02 (No Vx/Ch) a las 0 (23E), 3 (23F), 6 (23G), y 9 (23H) semanas después del estímulo.
Las Figuras 24A-24C son gráficas que muestran las reacciones sistémicas promedio para los grupos T01 (Vx/Ch) y T02 (No-Vx/Ch); las puntuaciones se basan en la evaluación graduada del nivel de actividad física de todos los perros en cada grupo respectivo.
Las Figuras 24D-24F son gráficas que muestran las reacciones locales promedio para los grupos T01 (Vx/Ch) y T02 (No-Vx/Ch); las puntuaciones se basan en la evaluación graduada de la hinchazón presente en el punto de inyección de todos los perros en cada grupo respectivo.
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Descripción detallada de la invención Aislados bacterianos
La presente invención proporciona bacterias anaerobias aisladas, identificadas por sus secuencias de ADN ARNr de 16S, que producen enfermedad periodontal y otras enfermedades y manifestaciones clínicas diversas en animales de compañía. Más específicamente, las bacterias se seleccionan entre el género Porphyromonas.
Preferiblemente, las bacterias aisladas de la presente invención incluyen P. gulae b43, P. cansulci B46, P. circumdentaria B52, P. gulae B69, P. circumdentaria B97, P. cangingivalis B98, P. salivosa b104, O. denticanis B106 y P. endodontalis B114, aunque la invención abarca otras especies o cepas. En una forma de realización preferida, se pueden identificar las bacterias aisladas de la presente invención por sus secuencias de ADN ARNr de 16S que se muestran en las SEC DE ID N^{os} 86 a 94.
Las infecciones producidas por la infección con las bacterias de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, enfermedad periodontal del animal de compañía, mal olor oral (halitosis) del animal de compañía, podredumbre del pie bovino, enfermedad cardíaca coronaria canina e infecciones sistémicas caninas. Las bacterias comprendidas dentro del género Porphyromonas se han relacionado también con diversas enfermedades humanas, entre las que se incluyen enfermedad cardíaca coronaria, parotitis, mal olor oral, gingivitis, periodontitis, apoplejía, aterosclerosis, hiperlipidemia, vaginosis bacteriana, retardo del crecimiento intrauterino (IUGR), y aumento de la incidencia de nacimientos pretérmino de niños con bajo peso al nacer.
La presente invención proporciona moléculas de polinucleótidos aislados y polipéptidos aislados de Porphyromonas spp. Más concretamente, la invención proporciona moléculas de polinucleótidos aislados que tienen la secuencia de nucleótidos de los genes fimA y oprF de Porphyromonas spp. o las variantes degeneradas de los mismos y las moléculas de polipéptidos aislados que tienen las secuencias de aminoácidos de las proteínas FimA y OprF codificadas por dichos genes, respectivamente.
La presente invención proporciona también secuencias de polinucleótidos que tienen al menos aproximadamente un 90% de homología, preferiblemente al menos aproximadamente un 95%, y más preferiblemente al menos un 99%, de secuencia de identidad respecto de cualquiera de las SEC DE ID N^{os}: 95 a 102 y 111 a 119 tal como se determinó usando cualquier algoritmo de identidad estándar conocido. Además, la presente invención proporciona secuencias de polinucleótidos que se hibridan bajo condiciones de restricción con el complemento de cualquiera de las secuencias de polinucleótidos que se muestran en las SEC DE ID N^{os}: 95 a 102 y 111 a 119.
En otra forma de realización específica, se proporciona un ácido nucleico que se puede hibridar con cualquiera de las secuencias de polinucleótidos representadas gráficamente en la SEC DE ID Nº 86 a 102 y 111 a 119, o sus complementos, bajo condiciones de restricción elevada. A modo de ejemplo y no como limitación, los procedimientos que usan dichas condiciones de elevada restricción para regiones de hibridación de más de 90 nucleótidos son como sigue. Se llevó a cabo la prehibridación de los filtros que contenían el ADN durante 8 h durante la noche a 65ºC en tampón compuesto de 6X SSC, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, PVP al 0,02%, Ficol al 0,02%, BSA al 0,02%, y 500 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Se hibridaron los filtros durante 48 h a 65ºC en mezcla de prehibridación que contenía 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y 5-20 X 10^{6} cpm de sonda marcada con ^{32}P. El lavado de los filtros se llevó a cabo a 37ºC durante 1 h en una solución que contenía 2X SSC, PVP al 0,01%, Ficoll al 0,01%, y BSA al 0,01%. Esto fue seguido por un lavado en 0,1 X SSC a 50ºC durante 45 min antes de la autoradiografía.
Otras condiciones de elevada restricción que se pueden usar dependen de la naturaleza del ácido nucleico (por ejemplo, longitud, contenido de GC, etc.) y el objetivo de la hibridación (detección, amplificación, etc.) son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, se lleva a cabo la hibridación restrictiva de un oligonucleótido de aproximadamente 15-40 bases con una secuencia complementaria en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) bajo las siguientes condiciones. Una concentración de sal de KCl 50 mM, una concentración de tampón de Tris-HCl 10 mM, una concentración de Mg^{2+} de 1,5 mM, un pH de 7-7,5 y una temperatura de templado de 55-60ºC.
En una forma de realización específica preferida, tras la hibridación, las condiciones de lavado son como sigue. Cada membrana se lava dos veces cada una durante 30 minutos cada una a 45ºC en fosfato de sodio 40 mM, pH 7,2, SDS al 5%, EDTA 1 mM, albúmina de suero bovino al 0,5%, seguido por cuatro lavados cada uno durante 30 minutos en fosfato de sodio, pH 7,2, SDS al 1%, EDTA 1 mM. Para la hibridación con elevada restricción, las membranas se someten cada una adicionalmente a cuatro lavados durante 30 minutos en fosfato de sodio 40 mM, pH 7,2, SDS al 1%, EDTA 1 mM a 55ºC, seguido por cuatro lavados cada una durante 30 minutos en fosfato de sodio, pH 7,2, SDS al 1%, EDTA 1 mM a 65ºC.
La presente invención proporciona además vacunas y formulaciones de vacuna que, cuando se administran a un animal de compañía en una cantidad terapéuticamente eficaz, son útiles en el tratamiento o la prevención (es decir, para conferir resistencia) a la enfermedad periodontal en un animal de compañía.
En una forma de realización, la presente invención proporciona una vacuna que comprende al menos una preparación de Porphyromonas spp. de células completas (bacterina) atenuadas (vida modificada) o inactivadas. En una forma de realización preferida, la presente invención proporciona una vacuna que contiene una preparación de células completas inactivadas de al menos tres Porphyromonas spp., por ejemplo, la combinación de P. gulae B43, P. salivosa B104 y O. denticanis B106. Las células bacterianas se pueden inactivar usando una variedad de agentes, tales como formalina, etilenoimina binaria (BEI) o beta propiolactona. Preferiblemente, se usa formalina como agente
inactivante.
En otra forma de realización, la vacuna comprende una fracción de subunidad de una Porphyromonas spp. capaz de inducir una respuesta inmune.
En una forma de realización preferida, la vacuna de la presente invención comprende una o más subunidades de polipéptidos o fragmentos o variantes de los mismos, una o más secuencias de polinucleótidos aislados o fragmentos o variantes de los mismos.
Las vacunas atenuadas (vida modificada) o inactivadas (bacterinas), o las subunidades de polipéptidos aislados, o los polinucleótidos aislados pueden estar presentes en combinación con otros componentes de formulación de vacunas conocidos tales como con adyuvantes, diluyentes, o vehículos compatibles.
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Definiciones y abreviaturas
El término "ORF" indica "marco de lectura abierto", es decir, la región de codificación de un gen.
El término "Porcentaje de identidad de la secuencia" en secuencias de nucleótidos y en secuencias de polipéptidos se determina comparando dos secuencias alineadas óptimamente en una ventana de comparación, en la que la alineación óptima proporciona el orden de correspondencia más elevado y puede introducir adiciones de nucleótidos o aminoácidos para la secuencia de ensayo o de referencia. El porcentaje de identidad se determina calculando el porcentaje de nucleótidos que son idénticos entre el ensayo y la secuencia de referencia en cada posición de la secuencia completa. La alineación óptima de la secuencia y el porcentaje de identidad se pueden determinar manualmente, o más preferiblemente mediante un algoritmo informático que incluye, pero no se limita a TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA, GAP, BESTFIT, y CLUSTALW (Altschul y col., 1990, J. Mol. Biol. 215(3): 403-10; Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU 85(8): 2444-8; Thompson, y col., 1994, Nucleic Acids Res. 22(22): 4673-80; Devereux y col., 1984, Nuc. Acids. Res. 12: 387-395); Higgins, y col., 1996, Methods Enzymol. 266: 383-402). Preferiblemente, se usa el Servidor NCBI Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) que se ajusta a los parámetros por defecto para investigar múltiples bases de datos para las secuencias homólogas.
El término "heterólogo", cuando se usa en el presente documento significa derivado de una especie o cepa bacteriana diferente.
El término "homología", "homólogo", y similar, cuando se usa en el presente documento significa el grado de identidad compartida entre secuencias de polinucleótidos o polipéptidos.
El término "homólogo", cuando se usa en referencia a especies bacterianas significa la misma especie o cepa bacteriana.
El término "célula huésped", cuando se usa en el presente documento significa una bacteria o célula eucariota que alberga un plásmido, virus, u otro vector.
El término "aislado" cuando se usa en el presente documento significa retirado de su entorno en el que se produce naturalmente ya sea solo o en una célula huésped heteróloga, o cromosoma o vector (por ejemplo, plásmido, fago, etc.).
Los términos "bacteria anaerobia aislada", "bacteria aislada", "cepa bacteriana aislada" y similares se refieren a una composición en la que las bacterias están sustancialmente libres de otros microorganismos, por ejemplo, en un cultivo, tal como cuando se separan de su entorno en el que se producen naturalmente.
El término "polinucleótido aislado" indica una composición en la que el nucleótido aislado comprende al menos un 50% de la composición en peso. Más preferiblemente, el polinucleótido aislado comprende aproximadamente un 95%, y lo más preferible un 99% en peso de la composición.
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El término "polipéptido aislado" indica una composición en la que el polipéptido aislado comprende al menos un 50% de la composición en peso. Más preferiblemente, el polipéptido aislado comprende aproximadamente un 95%, y lo más preferible un 99% en peso de la composición.
El término "funcionalmente equivalente" tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un polipéptido recombinante capaz de ser reconocido por un anticuerpo específico para el polipéptido natural producido por las bacterias que originan la enfermedad periodontal en animales de compañía, o un polipéptido recombinante capaz de estimular o producir una respuesta inmunológica sustancialmente similar a la de la proteína natural procedente de las bacterias endógenas. De esta manera, un anticuerpo movilizado contra un polipéptido funcionalmente equivalente reconoce también el polipéptido natural producido por las bacterias que producen la enfermedad periodontal en animales de compañía.
El término "inmunogenia" se refiere a la capacidad de una proteína o polipéptido para estimular una respuesta inmune dirigida específicamente contra las bacterias que producen la enfermedad periodontal en animales de compañía.
El término "antigenicidad" se refiere a la capacidad de una proteína o polipéptido de unirse inmunoespecíficamente mediante un anticuerpo movilizado contra la proteína o polipéptido.
El término "anticuerpo", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de inmunoglobulina capaz de unirse a un antígeno. Los anticuerpos pueden ser una mezcla policlonal o monoclonal. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas intactas derivadas de fuentes naturales o de fuentes recombinantes, o pueden ser porciones inmunoreactivas de inmunoglobulinas intactas. Los anticuerpos pueden existir en una variedad de formas que incluyen, por ejemplo, as, Fv, Fab', F(ab')_{2} así como en cadenas simples.
El término "animal de compañía", tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier animal no humano en cautividad considerado como mascota, entre estos se puede incluir a, pero no restringirse a, perros, gatos, caballos, ovejas, conejos, monos, y roedores, que incluyen, ratones, ratas, hámsteres, jerbos, y hurones.
El término "protección", "protector", y similar, tal como se usa en el presente documento con respecto a una vacuna, significa que la vacuna evita o reduce los síntomas de la enfermedad producidos por el organismo a partir del cual se deriva(n) el(los) antígeno(s) usados en la vacuna. Los términos "protección", "protector" y similares significan también que se puede usar la vacuna para "tratar" la enfermedad o uno de más síntomas de la enfermedad que existe ya en un sujeto.
El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de las bacterias, o una subunidad, (por ejemplo, polipéptidos, secuencias de polinucleótidos) y las combinaciones de los mismos suficientes para estimular una respuesta inmune en el sujeto al cual se administran. La respuesta inmune puede comprender, sin limitación, la inducción de inmunidad celular y/o humoral.
El término "prevención de la infección" significa evitar o inhibir la replicación de las bacterias que producen la enfermedad periodontal en animales de compañía, para inhibir la transmisión de las bacterias, o para evitar el establecimiento de las bacterias por sí mismas en su huésped, o para aliviar los síntomas de la enfermedad producidos por la infección. El tratamiento se considera terapéutico si existe una reducción en la carga bacteriana.
El término "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un medio vehículo que no interfiere con la efectividad de la actividad biológica del ingrediente activo y no es tóxico para el sujeto a quien se administra.
El término "agente terapéutico" se refiere a cualquier molécula, compuesto o tratamiento, preferiblemente una molécula o compuesto antibacteriano, que ayuda en el tratamiento de una infección o una enfermedad o dolencia bacteriana producida de esa manera.
El término "fragmento o variante del mismo" se refiere a las secuencias parciales de nucleótidos o aminoácidos de acuerdo con la presente invención. Preferiblemente los fragmentos o variantes de los polipéptidos que se proporcionan en la presente invención son capaces de estimular una respuesta inmune humoral y/o celular en un animal de compañía. Se abarcan los análogos mediante el término "fragmento o variante del mismo". Se abarcan mediante el término "fragmento o variante del mismo" los polinucleótidos mutantes que pueden poseer una o más mutaciones que son delecciones, inserciones o sustituciones de residuos de nucleótidos. Se abarcan mediante el término "fragmento o variante del mismo" las variantes alélicas.
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Aislamiento y caracterización de Porphyromonas spp.
Se pueden obtener las bacterias proporcionadas por la presente invención usando técnicas de muestreo, cultivo y aislamiento conocidas. Por ejemplo, se pueden obtener muestras microbianas de una población de animales de compañía, tales como de perros y gatos, que presentan enfermedad periodontal. Se puede observar la evidencia de enfermedad periodontal usando medidas conocidas tales como perros con bolsas periodontales > 3 mm y gatos con bolsas periodontales > 2 mm. Se pueden determinar los parámetros conocidos para caracterizar la enfermedad periodontal tal como los índices dentales (índice gingival e índice periodontal) y las profundidades de las bolsas periodontales para la muestra de población de animales de compañía. Se pueden obtener muestras individuales de la bolsa periodontal de un animal concreto, mantenerse bajo condiciones anaerobias y cultivarse usando diversos medios de cultivo conocidos.
Se pueden caracterizar los aislados clínicos usando técnicas conocidas tales como numerosos ensayos bioquímicos, y análisis de la secuencia de ADN ARNr de 16S para determinar su género y especie Se pueden transferir aislados individuales a placas y se pueden colocar discos antibióticos (Anaerobe Systems) sobre la superficie del agar para determinar los modelos de resistencia al antibiótico de cada aislado. Se pueden someter también las colonias purificadas a ensayos de indol y catalasa conocidos (Anaerobe Systems). Se pueden determinar los modelos de producción de lipasa y lecitinasa para aislados individuales.
Se pueden tipificar los aislados basándose en su secuencia de ADN ARNr de 16 S. Se pueden utilizar colonias individuales aisladas en pocillos como plantilla para amplificación mediante reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) de la región que usa ARNr de 16S, por ejemplo, los cebadores D0056 y D0057 (SEC DE ID Nº 1 y SEC DE ID Nº 2, Tabla 1). Se pueden purificar los productos resultantes de la PCR usando los kits preps de la PCR disponibles (Promega Corp.; Madison, WI) y aislarse el combinado. A continuación se pueden desalar los productos purificados de la PCR y someterse a análisis de la secuencia del ADN. Se pueden usar las secuencias de ADN resultantes para investigar en las bases de datos disponibles. A continuación se pueden tipificar los aislados bacterianos basándose en la correspondencia más cercana identificada por las investigaciones en las bases de datos.
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TABLA 1 Listado de identificación de secuencias de ADN. Todos los cebadores de oligonucleótidos se sintetizaron tanto por Gibco-BRL (EE.UU.) como por Lark Technologies Inc. (EE.UU.) 
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Nota. Los nucleótidos en minúscula no están presentes en la secuencia de ADN diana. Se añaden a la región 5' del cebador para ayudar en la clonación. NA, No aplicable.
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Los siguientes aislados periodontales de animales de compañía se depositaron en la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA, 20110, EEUU, el 9 de Agosto de 2001: P. gulae B43 (PTA-3618), P. cansulci B46 (PTA-3619), P. circumdentaria B52 (PTA-3620), P. gulae B69 (PTA-3621), P. circumdentaria B97 (PTA-3622), P. cangingivalis B98 (PTA-3623), P. salivosa B104 (PTA-3624), O. denticanis B106 (PTA-3625), y P. endodontalis B114 (PTA-3626). En una forma de realización preferida de la invención, una molécula de polinucleótido aislada de la presente invención tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo constituido por las SEC DE ID N^{os}: 86 a 102 y 111 a 119. Los polipéptidos preferidos de la presente invención tienen secuencias de aminoácidos seleccionadas entre el grupo constituido por las SEC DE ID N^{os}: 103 a 110 y 120 a 128.
Clonación de secuencias de nucleótidos de Porphyromonas
Existen diversos procedimientos o técnicas conocidas que se pueden usar para clonar las secuencias de nucleótidos de Porphyromonas de la presente invención. Por ejemplo, las secuencias se pueden aislar en forma de fragmentos de restricción y clonarse en vectores de clonación y/o expresión, las secuencias se pueden amplificar mediante la PCR y clonarse en vectores de clonación y/o expresión, o las secuencias se pueden clonar mediante una combinación de estos dos procedimientos.
Se pueden seguir en general las técnicas de biología molecular estándar conocidas tal como se describe en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1989); Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson y col., Recombinant DNA, Scientific American Books, Nueva York; Birren y col (eds) Genome Analysis: A Laboratory Manual Series, Vols. 1-4 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); y la metodología que se muestra en las Patentes de los Estados Unidos N^{os} 4.666.828; 4.638.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057. Se lleva a cabo generalmente la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) tal como se describe en los protocolos de la PCR: A Guide To Methods And Applications, Academic Press, San Diego, CA (1990).
En el Ejemplo se proporcionan Ejemplos de los procedimientos útiles en la clonación y el secuenciamiento de los polinucleótidos de la presente invención.
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Polipéptidos y proteínas codificados por fimA y oprF
La presente invención abarca el uso de sistemas de expresión procariotas y eucariotas, incluyendo vectores y células huéspedes, que se pueden usar para expresar formas truncadas y de longitud completa (proteína nativa) de los polipéptidos recombinantes expresados por las secuencias de nucleótidos de la presente invención.
En una forma de realización preferida de la invención, una molécula de polinucleótido aislada de la presente invención tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada entre una de las secuencias de la SEC DE ID: 95 a 102 y 111 a 119 o variantes degeneradas de las mismas; y que codifican un polipéptido correspondiente seleccionado entre las secuencias de aminoácidos de la SEC DE ID Nº: 103 a 110 y 120 a 128, respectivamente.
Se puede utilizar una variedad de sistemas de vectores de expresión en el huésped para expresar los polipéptidos de la presente invención. Dichos sistemas de expresión en el huésped representan vehículos mediante los cuales se pueden clonar las secuencias de codificación de interés y posteriormente purificarse. La presente invención proporciona además células huéspedes que pueden, cuando se transforman o transfectan con el vector apropiado o secuencia de nucleótido, expresar el producto génico del polipéptido codificado de la invención. Dichas células huéspedes, incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli, B. subtilis) transformadas con ADN de bacteriófago recombinante, vectores de expresión de ADN plásmido o ADN cósmido que contienen las secuencias de codificación; levaduras (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformadas con vectores de expresión de levaduras recombinantes que contienen el producto génico de las secuencias de codificación; sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión víricos recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen las secuencias de codificación; sistemas de células de plantas infectados con vectores de expresión víricos recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión plásmidos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen las secuencias de codificación, o sistemas de células de mamíferos (por ejemplo, COS, CHO, BHK, 293, 3T3) que albergan constructos de expresión recombinante que contienen promotores derivados del genoma de células de mamíferos (por ejemplo, promotor de la metalotioneína)
o de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío del adenovirus; el promotor 7.5K del virus de vaccinia).
En una forma de realización preferida, el sistema de expresión es un sistema bacteriano. Se pueden seleccionar ventajosamente numerosos vectores de expresión dependiendo del uso pretendido del producto que se está expresando. Por ejemplo, cuando se va a producir una gran cantidad de dicho polipéptido, para la generación de composiciones de vacuna o para la movilización de anticuerpos, por ejemplo, pueden ser deseables vectores que dirijan la expresión de niveles elevados de productos de proteínas de fusión que se purifiquen fácilmente. Preferiblemente, los vectores contienen promotores que dirigen la expresión inducible del gen. Los vectores adecuados incluyen, pero no se limitan a los vectores de expresión pET de E. coli (Studier y Moffatt, 1986, J. Mol. Biol. 189: 113; Rosenberg y col., 1987, Gene 56: 125-135; Novagen, Madison, Wisconsin), en los que la secuencia de codificación se puede fusionar en marco con una secuencia que codifica múltiples (por ejemplo, 6) restos de histidina; vectores pDAD (Guzman y col., 1995, J. Bact. 177: 4121-4130), a partir de los cuales se puede expresar una proteína heteróloga bajo el control de una proteína inducible mediante arabinosa; y los vectores pGEX (Pharmacia Biotech, EEUU), usados para expresar polipéptidos heterólogos en forma de proteínas de fusión con la glutatión S-transferasa (GST). Se pueden clonar las secuencias fimA u oprF de la presente invención en un vector de expresión \lambda y expresarse en cepas bacterianas \lambda^{-}. En un modo preferido, la cepa bacteriana es E. coli BL21 (Gibco.BRL, EEUU). Preferiblemente, los vectores que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, vectores de expresión pLEX (LaVallie y col., 1992, Bio/Technology 11: 187-193; Mieschendahl y col., 1986, Bio/Technology 4: 802-808; Invitrogen) y vectores de expresión pRIT2T (Nilsson y col., 1985, EMBO 4: 1075; Zabeau y Stanley, 1982, EMBO 1: 1217; Pharmacia Biotech). Se pueden usar otros vectores y cepas bacterianas y las personas expertas en la técnica los conocen.
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Producción de anticuerpos
Los anticuerpos pueden ser cualquiera de monoclonales, policlonales, o recombinantes. Convenientemente, se pueden preparar los anticuerpos contra el inmunógeno o porción del mismo, por ejemplo, un péptido sintético basado en la secuencia, o prepararse de manera recombinante mediante técnicas de clonación o se pueden aislar el producto génico natural y/o las porciones del mismo y usarse como inmunógeno. Se pueden usar los inmunógenos para producir anticuerpos mediante tecnología estándar de producción de anticuerpos bien conocida por las personas expertas en la técnica tal como se describe generalmente en Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988 y Borrebaeck, Antibody Engineering - A Practical Guide, W.H. Freeman y Co., 1992. Se pueden preparar también fragmentos de anticuerpos a partir de los anticuerpos e incluyen Fab, F(ab')_{2}, y Fv mediante procedimientos conocidos por las personas expertas en la técnica.
En la producción de anticuerpos, se puede llevar a cabo la selección del anticuerpo deseado mediante procedimientos estándar en inmunología conocidos en la técnica. Se siguen generalmente técnicas no específicamente descritas tales como las de Stites y col. (eds), Basic and Clinical Immunology (8ª Edición), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994) y Mishell y Shiigi (eds), Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman y Co., Nueva York (1980). En general, los ensayos ELISA y la transferencia Western son los tipos preferidos de inmunoensayos. Ambos ensayos son bien conocidos por las personas expertas en la técnica. Se pueden usar en los ensayos anticuerpos tanto policlonales como monoclonales. Se puede unir el anticuerpo a un sustrato con soporte sólido o conjugarse con un resto detectable o unirse y conjugarse como se conoce bien en la técnica (para una descripción general de la conjugación de restos fluorescentes o enzimáticos véase Johnstone & Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1982.) La unión de anticuerpos a un sustrato con soporte sólido es también bien conocida en la técnica (véanse para una descripción general, Harlow & Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Publications, Nueva York, 1988 y Borrebaeck, Antibody Engineering - A Practical Guide, W.H. Freeman y Co., 1992). Los restos detectables contemplados para uso en la presente invención pueden incluir, pero no limitarse a, marcadores fluorescentes, metálicos, enzimáticos y radioactivos tales como biotina, oro, ferritina, fosfatasa alcalina, b-galactosidasa, peroxidasa, ureasa, fluoresceína, rodamina, tritio, ^{14}C y yodación.
Cuando sea apropiado, se pueden usar otros inmunoensayos tales como radioinmunoensayos (RIA) que se conocen en la técnica. Los inmunoensayos disponibles se describen extensamente en la bibliografía de patentes y científica. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos N^{os} 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771; y 5.281.521, así como en Sambrook y col, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor, Nueva York, 1989.
Kits de detección, diagnóstico, y prevención
La presente invención proporciona además kits para la detección de Porphyromonas spp. El kit incluye reactivos para analizar una muestra para la presencia de organismos de Porphyromonas, polipéptidos, o secuencias de nucleótidos de Porphyromonas de la presente invención, en la que la presencia de la secuencia del nucleótido es indicativa de la presencia del organismo. Este procedimiento es valioso debido a que se puede diagnosticar la enfermedad antes de la existencia de síntomas y se puede evitar por tanto el comienzo de la enfermedad antes de la incidencia de daño al paciente. Se puede determinar la presencia de Porphyromonas spp. Bacterias, polipéptidos, o secuencias de nucleótidos se pueden determinar usando anticuerpos, PCR, hibridación, y otros procedimientos de detección conocidos por las personas expertas en la técnica.
En una forma de realización, el kit proporciona reactivos para la detección de anticuerpos contra Porphyromonas. En algunas formas de realización, el kit puede incluir un conjunto de instrucciones impresas o una marca que indica que el kit es útil para la detección de Porphyromonas spp. Mínimamente, el kit comprende en al menos un envase una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 30 aminoácidos contiguos de cualquiera de los polipéptidos de la SEC DE ID Nº: 103 a 110 y 120 a 128. En una forma de realización, el kit comprende además un anticuerpo secundario. En una forma de realización preferida, el anticuerpo secundario está conjugado con un resto detectable, tal como, por ejemplo, una enzima que cataliza una reacción colorimétrica o quimioluminiscente, tal como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa de rábano picante. En una forma de realización adicional, el kit comprende reactivos para llevar a cabo un ensayo colorimétrico o quimioluminiscente.
En otra forma de realización, el kit proporciona reactivos para la detección de los ácidos nucleicos de Porphyromonas. En una forma de realización, el kit proporciona reactivos para la detección mediante la PCR de los ácidos nucleicos de Porphyromonas y comprende en al menos un envase una primera molécula de ADN aislada que comprende un fragmento de al menos aproximadamente 15, 20, 25 ó 30 nucleótidos, cuyo fragmento hibrida bajo condiciones de restricción con una molécula de ADN que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de al menos 5, 10, 15, 20, 25, ó 30 aminoácidos contiguos, o la secuencia de aminoácidos completa, de cualquiera de los polipéptidos de la SEC DE ID Nº: 103-110 ó 120-128, y una segunda molécula de ADN aislada que comprende un fragmento de al menos 15, 20, 25, ó 30 nucleótidos, cuyo fragmento se hibrida bajo condiciones de restricción con una molécula de ADN complementaria de una molécula de ADN que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de al menos 5, 10, 15, 20, 25, ó 30 aminoácidos contiguos, o la secuencia de aminoácidos completa, de cualquiera de los polipéptidos de la SEC DE ID Nº: 103-110 ó 120-128, cuya primera y segunda moléculas de ADN se pueden usar para amplificar específicamente un ácido nucleico de Porphyromonas spp. que codifica un ARNr de 16S cuyo ARNr de 16S está codificado por una molécula de ADN seleccionada entre el grupo constituido por las SEC DE ID N^{os}: 1-9.
En una forma de realización adicional, la presente invención proporciona un kit que comprende en al menos un envase una molécula de ADN aislada que comprende una secuencia de nucleótidos de al menos aproximadamente 15 nucleótidos contiguos seleccionados entre cualquiera de las SEC DE ID N^{os} 86 a 94, 95 a 102, y 111 a 119 que se hibrida bajo condiciones de elevada restricción con el complemento de cualquiera de las secuencias de nucleótidos representadas gráficamente en las SEC DE ID N^{os}: 86 a 94, 95 a 102, y 111 a 119 y una segunda molécula de ADN comprendiendo en un segundo envase una molécula de ADN aislada que comprende una secuencia de nucleótidos de al menos aproximadamente 15 nucleótidos contiguos seleccionados entre cualquiera de las SEC DE ID N^{os} 86 a 94, 95 a 102, y 111 a 119 que se hibrida bajo condiciones de elevada restricción con cualquiera de las secuencias de nucleótidos representadas gráficamente en las SEC DE ID N^{os}: 86 a 94, 95 a 102, y 111 a 119, en la que el kit comprende
además un conjuntos de instrucciones que indican que el kit es útil para la detección de Porphyromonas spp.
Formulación de vacuna y procedimiento de administración
Se puede administrar la vacuna de la presente invención a un animal de compañía en una cantidad eficaz de tal manera que la vacuna trate terapéuticamente o confiera resistencia a o evite la enfermedad periodontal en el animal de compañía. La vacuna de la presente invención es útil en el control de las bacterias que producen la enfermedad periodontal. Las vacunas de la presente invención pueden, en concreto, usarse en el campo de la medicina veterinaria para tratar animales de compañía y para el mantenimiento de la salud pública frente a aquellas bacterias descritas en el presente documento que son conocidas por producir la enfermedad periodontal.
Las vacunas de la presente invención son de valor en el control de las bacterias que son perjudiciales, o que se diseminan o actúan como vectores de la enfermedad en el hombre y los animales de compañía, por ejemplo, las descritas en el presente documento. Las vacunas de la presente invención son particularmente útiles en el control de las bacterias que están presentes en los animales de compañía para cuyo objetivo se pueden administrar usando cualquier procedimiento conocido de administración, que incluye, pero no se limita, la administración oral, parenteral, intranasal, subcutánea, o tópica.
De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una composición que comprende una vacuna de la presente invención, en premezcla con un adyuvante, diluyente o vehículo compatible. En una forma de realización preferida, la formulación de vacuna de la presente invención está compuesta por una suspensión o solución acuosa que contiene al menos una bacteria de la presente invención y/o al menos una subunidad de proteína, preferiblemente tamponada a pH fisiológico, en una forma lista para la inyección. En otra forma de realización preferida, la formulación de vacuna de la presente invención está compuesta por preparaciones de células completas inactivadas de al menos tres Porphyromonas spp., por ejemplo, P. gulae B43, P. salivosa B104 y O. denticanis B106.
La presente invención proporciona además un procedimiento para tratar o prevenir una infección bacteriana, que comprende el tratamiento con una cantidad eficaz de una vacuna o formulación de vacuna de la presente invención. Debe apreciarse que la referencia al tratamiento incluye la profilaxis así como el alivio de los síntomas establecidos de una infección bacteriana.
Las vacunas y las formulaciones de vacuna de la presente invención se pueden usar para inducir una respuesta que evite los cambios patológicos característicos de la enfermedad periodontal producidos por las bacterias que producen la enfermedad periodontal. En una formulación de vacuna, se mezclan deseablemente una cantidad inmunogénica de las bacterias, la proteína purificada, el ácido nucleico, o las combinaciones de los mismos con unos adyuvantes y vehículos fisiológicos de vacunas convencionales adecuados, para uso en mamíferos.
Se puede producir una formulación de vacuna para prevenir la enfermedad periodontal en animales de compañía usando al menos una de las bacterias aisladas y purificadas, inactivadas o atenuadas, los polipéptidos purificados (tales como las proteínas naturales, las subunidades de proteínas, o los polipéptidos, y premezclar uno o más de éstos con un adyuvante, diluyente, o vehículo compatible. Preferiblemente, las secuencias de polipéptidos son subunidades de proteínas seleccionadas entre el grupo que incluye FimA (Sec DE ID N^{os}: 103 a 110) y OprF (SEC DE ID N^{os}: 120 a 128).
Los ejemplos de fragmentos de FimA y OprF que se pueden usar para los polipéptidos de diagnóstico o para las preparaciones de vacuna incluyen, pero no se limitan a ACNKDNEAEPVV, YPVLVNFESNNYTYTGDAVEK, TGPGTNNPENPITESA, NDNNNKDFVDRLGA, DLNGQINRLRREVEELSKRPVSCPECPDV, y ADPTGDTQY
NERLSERRAKAV (SEC DE ID N^{os}: 129-134). La subunidad de proteína se puede expresar de manera recombinante, tanto sola como fusionada con otra secuencia de polipéptido o proteína. La otra secuencia de polipéptido o proteína puede incluir, pero no se limita a, una etiqueta poli-His, MBP, tioredoxina, o GST, por ejemplo. También proporcionadas por la presente invención están las secuencias de polinucleótidos o los genes que codifican cualquiera de las subunidades de proteínas anteriormente mencionadas. Las secuencias de polinucleótidos de las bacterias se pueden seleccionar de fimA y oprF o uno de sus fragmentos o variantes cuyo fragmento o variante presenta al menos aproximadamente un 90%, 95%, o 99% de homología con los anteriores, o una secuencia de polinucleótido complementaria que se hibrida bajo condiciones de elevada restricción, o una combinación de ambas. Preferiblemente, se pueden usar las secuencias de polinucleótidos de la presente invención para amplificar una molécula de ADN de fimA u oprF de la presente in-
vención, o codificar un fragmento de aminoácido que se puede usar para movilizar anticuerpos contra FimA u OprF.
Para la terapia basada en ADN, se puede usar un vehículo capaz de administrar o transferir ácido nucleico heterólogo al interior de una célula huésped. El vehículo de expresión puede incluir elementos para controlar la dirección, expresión y transcripción del ácido nucleico de manera selectiva en una célula tal como se conoce en la técnica. El vehículo de expresión puede incluir un promotor para controlar la transcripción del material heterólogo y puede ser un promotor tanto constitutivo como inducible para permitir la transcripción selectiva. Se pueden incluir potenciadores que se pueden necesitar para obtener los niveles de transcripción necesarios.
Se pueden introducir vectores en células o tejidos mediante uno cualquiera de una variedad de procedimientos conocidos dentro de la técnica. Dichos procedimientos se pueden encontrar generalmente descritos en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, Nueva York (1989, 1992); Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Chang y col., Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, MI (1995); Vega y col., Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor, MI (1995); R.L. Rodriguez Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston MA (1988) e incluyen, por ejemplo, la transfección estable o transitoria, la lipofección, la electroporación y la infección con vectores víricos recombinantes.
La presente invención proporciona además combinaciones de vacunas que tienen al menos una de las bacterias inactivadas o atenuadas, las secuencias de nucleótidos, o las secuencias de polipéptidos de la presente invención, en combinación con uno o más componentes inmunogénicos adicionales. Dicha combinación de vacuna puede producir en el animal vacunado un efecto sorprendentemente mayor que el esperado debido a la adición simple de los efectos de cada componente administrado por separado. De esta manera, una combinación de vacuna puede estimular una producción sinérgica del anticuerpo en animales.
En una forma de realización preferida, la combinación de vacuna de la presente invención está compuesta por preparaciones de células completas inactivadas de al menos tres Porphyromonas spp., por ejemplo, P. gulae B43, P. salivosa B104 y O. denticanis B106, en combinación con uno o más componentes inmunógenos bacterianos o víricos adicionales. Los componentes inmunógenos adicionales adecuados para uso en combinaciones de vacunas de la presente invención incluyen, pero no se limitan a Virus del Moquillo Canino (VMC), Adenovirus-2 Canino (AVC-2), Parvovirus Canino (PVC) Virus de la Parainfluenza Canina (PIC), y Coronavirus Canino (CVC).
Las vacunas de la presente invención se pueden preparar por combinación de al menos una de las bacterias inactivadas o atenuadas, las secuencias de nucleótidos, o las secuencias de polipéptidos de la presente invención, con un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferiblemente, un adyuvante.
Las preparaciones adecuadas de las vacunas de la presente invención incluyen inyectables, tanto soluciones líquidas como suspensiones. Se pueden preparar también formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable antes de la inyección. Se puede emulsionar la preparación de vacuna. El componente inmunógeno activo, se mezcla preferiblemente con un adyuvante que sea farmacéuticamente aceptable y compatible con el componente inmunógeno activo. Los adyuvantes adecuados incluyen, pero no se limitan a: geles minerales, por ejemplo, hidróxido de aluminio; sustancias activas superficiales tales como lisolecitina; glicósidos, por ejemplo, derivados de saponina tales como Quil A o GPI-0100 (Patente de los Estados Unidos Nº 5.977.081); tensioactivos catiónicos tales como DDA, polioles plurónicos; polianiones; polímeros en bloque no iónicos, por ejemplo Pluronic F-127 (B.A.S.F., EEUU); péptidos; aceites minerales, por ejemplo, Montanide ISA-50 (Seppic, París, Francia), carbopol, Amphigen (Hydronics, Omaha, NE EEUU), Alhydrogel (Superfos Biosector, Frederikssund, Dinamarca), emulsiones de aceite, por ejemplo una emulsión de aceite mineral tal como BayolF/Arlacel A y agua, o una emulsión de aceite vegetal, agua y un emulsificante tal como lecitina; alum, colesterol, rmLT, citoquinas y combinaciones de los mismos. Se puede incorporar también el componente inmunógeno a liposomas, o conjugarse con polisacáridos y/u otros polímeros para uso en la formulación de vacuna. Las sustancias adicionales que se pueden incluir en un producto para uso en los presentes procedimientos incluyen, pero no se limitan a uno o más conservantes tales como sal de disodio o tetrasodio del ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), mertiolato, y similares.
El sujeto al cual se administra la vacuna es preferiblemente un animal de compañía, lo más preferible, un perro o gato.
Se prefiere que la vacuna de la invención, cuando se encuentra en una formulación de vacuna, esté presente en forma de dosificación unitaria. Para los objetivos de esta invención, una cantidad inmunógena, cuando se administra comprende aproximadamente 1 x 10^{4} - 1 x 10^{3} de células bactrianas inactivadas, 0,1 \mug -1 mg de proteína purificada, o 0,1 \mug - 10 mg de ácido nucleico. En una formulación de vacuna que contiene múltiples componentes, se pueden emplear con utilidad cantidades inmunógenas idénticas o menores.
Las personas expertas en la técnica pueden determinar fácilmente las dosis terapéuticamente eficaces apropiadas basándose en las cantidades inmunógenas anteriores, la dolencia que se está tratando y las características fisiológicas del animal. De acuerdo con esto, una preparación de vacuna proporciona una dosificación de una preparación estéril de una cantidad inmunógena del(de los) ingrediente(s) activo(s), en la que el ingrediente activo es al menos una bacteria, proteína, ácido nucleico, o cualquier combinación de los mismos. En presencia de agentes activos adicionales, las personas expertas en la técnica pueden ajustar fácilmente las dosificaciones unitarias.
Un régimen de dosificación deseable implica la administración de al menos una dosis de composición de vacuna deseada, en la que el contenido antigénico de cada fracción es como se ha establecido anteriormente. Se pueden también extrapolar las dosis eficaces (cantidades inmunizantes) de las vacunas de la invención a partir de las curvas de dosis-respuesta derivadas de los sistemas modelo de ensayo. El modo de administración de las vacunas de la invención puede ser cualquier ruta adecuada que libere la vacuna en el huésped. Estas incluyen, pero no se limitan a, las rutas oral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, intranasal, y mediante escarificación (raspado a través de las capas superiores de la piel, usando, por ejemplo, una aguja bifurcada). Sin embargo, la vacuna se administra preferiblemente de manera subcutánea o mediante inyección intramuscular. Se pueden emplear también otros modos de administración, cuando se desee, tales como intradérmico, intravenoso, intranasal, o intraamigdalar.
Los estudios han mostrado que, para cada una de las composiciones de vacuna anteriormente descritas, se inicia deseablemente una inmunización primaria de animales jóvenes (tras 8 semanas de edad), con dosis de refuerzo administradas a las 12 semanas y a las 16 semanas de edad. Se recomienda la revacunación anual.
La vacuna de la presente invención se administra y dosifica de acuerdo con las buenas prácticas médicas, teniendo en cuanta la dolencia clínica del sujeto individual, el lugar y el procedimiento de administración, el calendario de administración, la edad del sujeto, el sexo, el peso corporal y otros factores conocidos por los especialistas médicos.
La invención proporciona además kits para la prevención de la enfermedad periodontal en animales de compañía. En una forma de realización, el kit proporciona un envase que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que evita la enfermedad periodontal en animales de compañía. Se proporciona también en el mismo o diferente envase un vehículo farmacéuticamente aceptable que se puede usar en la composición. El kit puede incluir adicionalmente un adyuvante que se puede usar para ayudar en la creación de la respuesta de la composición de la presente invención. También, el kit puede incluir un dispensador para dispensar la composición, preferiblemente en forma de dosificación unitaria. El dispensador puede, por ejemplo, comprender una hoja de metal o plástico tal como un paquete en blíster. El kit se puede acompañar por una marca o instrucciones impresas que describan la administración de la composición para evitar la enfermedad periodontal en un animal de compañía. Se pueden preparar también composiciones que comprenden una composición de vacuna de la presente invención formulada en un vehículo farmacéuticamente aceptable, colocarse en un envase apropiado, y marcarse para el tratamiento de la dolencia periodontal indicada.
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Determinación de la eficacia de la vacuna
El mecanismo específico de protección inducido por las vacunas y composiciones de vacuna de la presente invención es la inducción de la respuesta inmune de anticuerpo y/o celular en los animales vacunados, tal como se indica mediante los ensayos animales in vivo descritos a continuación.
Las bacterias, polinucleótidos, polipéptidos, vacunas, y composiciones de vacunas de la presente invención pueden ser útiles en el tratamiento o prevención de la enfermedad periodontal en el animal de compañía, podredumbre del pie bovino, enfermedad cardíaca coronaria (perros), o infecciones sistémicas (perros). Además, las composiciones de la presente invención pueden ser también útiles en el tratamiento o prevención de algunas enfermedades en animales de compañía que corresponden a enfermedades similares en seres humanos tales como la enfermedad cardíaca coronaria (o vascular o de la arteria), parotitis, mal olor oral, gingivitis, periodontitis, apoplejía, aterosclerosis, hiperlipidemia, aumento en la incidencia de nacimientos pretérmino de niños con bajo peso al nacer, vaginosis bacteriana y retraso del crecimiento intrauterino (IUGR).
En un aspecto adicional de la presente invención, se proporcionan procedimientos para evaluar la eficacia de una vacuna frente a una o más bacterias periopatógenas en un animal. La presente invención ha demostrado que se pueden evaluar una vacuna contra una o más bacterias periopatógenas en especies animales tales como ratón o perro, concretamente perro.
De acuerdo con la presente invención, se pueden evaluar vacunas contra una variedad de bacterias periopatógenas usando los procedimientos descritos anteriormente en el presente documento, que incluyen, pero no se limitan a, Porphyromonas, Bacteriodes, Prevotella, Tannerella (Tannerella forsythensis, antiguamente Bacteroides forsythus), y Treponema, que se diseñan para tratar o prevenir una enfermedad periodontal en seres humanos o animales de compañía producida por estas bacterias. Las bacterias pueden contener bacterias inactivadas o atenuadas, polipéptidos, o polinucleótidos de cualquiera de estas especies bacterianas.
Se puede evaluar la eficacia de una vacuna introduciendo un cultivo de estímulo en un animal vacunado y en un animal no vacunado, y comparando los signos clínicos en los dos animales. El cultivo de estímulo puede estar compuesto por las mismas bacterias periopatógenas que la vacuna. Sin embargo, el cultivo de estímulo puede contener bacterias diferentes de aquellas en la vacuna para evaluar cualquier protección cruzada que puede tener la vacuna contra otras especies bacterianas.
De acuerdo con la presente invención, es deseable introducir el cultivo de estímulo en el canal de la raíz del diente de los animales de los que se ha extirpado el material de la raíz, seguido por la colocación de una restauración. El cultivo de estímulo contiene normalmente aproximadamente 1 X 10^{2} a 1 x 10^{12} unidades formadoras de colonias (UFC) por dosis de estímulo, preferiblemente 1 X 10^{5} a aproximadamente 1 X 10^{11} unidades formadoras de colonias (UFC) por dosis de estímulo; incluso más preferible, aproximadamente 5 X 10^{7} a aproximadamente 5 X 10^{10} unidades formadoras de colonias (UFC) por dosis de estímulo.
Los signos clínicos de la enfermedad que se pueden evaluar incluyen un aumento en los niveles de una o más bacterias periopatógenas en el fluido crevicular gingival, la placa, el hueso infectado, o el canal gingival, o cambios en la cantidad de hueso alveolar, concretamente en la región periapical del hueso alveolar. Se pueden cuantificar los cambios en el hueso mediante, por ejemplo, medidas radiográficas.
La presente invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos no limitantes y las figuras que los acompañan.
Ejemplo 1 Muestra de fluido crevicular en animales de compañía
Se tomaron muestras microbianas de perros y gatos examinados en clínicas veterinarias para tratamiento periodontal, o perros examinados en cualquiera de las instalaciones de Pfizer Terre Haute o Pfizer Sandwich para exámenes normales. Se incluyeron es este estudio perros con bolsas periodontales > 3 mm y gatos con bolsas periodontales > 2 mm. Se registraron los índices dentales (índice gingival e índice periodontal) y las profundidades de las bolsas periodontales. Se insertaron asépticamente puntas individuales de papel absorbente grueso (Henry Schein; Melville, NY) en la bolsa periodontal. Tras la retirada, se insertaron inmediatamente las puntas de papel en viales que contenían Medio Estéril Anaeróbicamente Pre-reducido (PRAS) y Medio Anaerobio de Trasporte Dental (ADT) (Anaerobe Systems; Morgan Hills, CA).
Se transfirieron los viales a una cámara anaerobia Bactron IV (Sheldon Manufacturing, Cornelius, OR) y se procesaron en N_{2} al 90%, H_{2} al 5%, CO_{2} al 5%. Las puntas de papel se colocaron asépticamente en 50 \mul de medio de Infusión de Cerebro Corazón PRAS (BHI) (Anaerobe Systems) y se sometieron a vortización durante 30 segundos. Se prepararon diluciones de 1.100 y 1:1000 en medio BHI. Se pulverizaron alícuotas de 100 \mul de las diluciones 1:100 y 1:1000 en placas de Agar de Brucella Sangre PRAS (BRU) (Anaerobe Systems). Se incubaron las placas a 37ºC en la cámara anaerobia durante cinco a siete días. Se contaron el número total de colonias bacterianas y el número de colonias de Bacterias Anaerobias Pigmentadas de Negro (BPAP). Las colonias BPAP individuales se transfirieron a placas BRU nuevas y se volvieron a incubar como se ha indicado anteriormente.
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Caracterización del aislado clínico
Se sometió cada aislado clínico a numerosos análisis bioquímicos y al análisis de la secuencia de ADN ARNr de 16S, usando los cebadores D0056 y D0057 (SEC DE ID Nº 1 y SEC DE ID Nº 2; Tabla 1), para determinar el género y la especie. Los aislados individuales se vetearon en placas BRU. Se colocaron discos de kanamicina, vancomicina, y colistina (Anaerobe Systems) sobre la superficie del agar para determinar los modelos de resistencia a KVC de cada aislado. Las colonias purificadas se sometieron también a los ensayos de indol y catalasa (Anaerobe Systems). Se transfirieron los aislados individuales a placas de Agar de Yema de Huevo (ELLA) (Anaerobe Systems) con el fin de determinar los modelos de producción de lipasa y lecitinasa. Se muestran estos datos en la Tabla 2.
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Se tipificaron los aislados basándose en su secuencia de ADN ARNr de 16 S. Se utilizaron colonias individuales aisladas en pocillos como plantillas para la amplificación de las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) de la región del ARNr de 16S usando los cebadores D0056 y D0057 (SEC DE ID Nº 1 y SEC DE ID Nº 2; Tabla 1) por triplicado. Se llevó a cabo la PCR en volúmenes de reacción de 50 \mul que contenían tampón de PCR 1X (Life Technologies; Rockville, MD), MgCl_{2} 1,0 mM, 1,25 \muM de cada cebador, 300 \muM de cada desoxi-NTP, y 2,5 U de Platino Pfx ADN Polimerasa (Life Technologies). Se utilizaron las siguientes condiciones de ciclación de la PCR: una etapa de desnaturalización de dos minutos a 94ºC; 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 40 segundos, templado a 60ºC durante 40 segundos, y extensión a 72ºC durante un minuto; una etapa final de extensión a 72ºC durante dos minutos; y una etapa final de enfriamiento a 4ºC. Se utilizó un termociclador GeneAmp 9700 (Perkin Elmer Applied Biosystems; Foster City, CA) para todas las amplificaciones de la PCR.
Los productos resultantes de la PCR se purificaron usando los kits preps de la PCR (Promega Corp.; Madison, WI) y se combinaron por aislado. A continuación, los productos de la PCR purificados se desalaron mediante análisis a la gota frente a 25 ml de agua estéril usando un filtro de nitrocelulosa de 0,025 \muM (Millipore Corp.; Bedford, MA). Los productos de la PCR purificados desalados se sometieron a un análisis de la secuencia del ADN usando la reacción de terminación DyeDeoxi en un secuenciador de ADN ABI automatizado (University of Texas Genetics Core Facility, Houston, TX y Lark Technologies Inc., Houston, TX). Se usaron los cebadores D0056, D0057, PFZ175-AP1, PFZ175-AP2, y PFZ175-AP3 de oligonucleótido sintéticos (SEC DE ID Nº 1-5, respectivamente; Tabla 1) para obtener la secuencia de ADN de doble cadena. Las secuencias de ADN resultantes se usaron para investigar las bases de datos de ADN públicamente disponibles usando un programa BLAST-N públicamente disponible del National Center for Biotechnology Information, EEUU.
Los aislados bacterianos se tipificaron basándose en la correspondencia más cercana identificada mediante investigaciones en las bases de datos. El aislado b106 no tiene una correspondencia precisa sugiriendo que puede representar un nuevo género/especie bacteriano. (Véase a continuación). En la Tabla 2, se localiza un listado completo de todos los aislados y sus características respectivas. Las nueve cepas superiores más frecuentemente aisladas se ejemplifican mediante los siguientes aislados: P. gulae B43 (muestra Sandwich 4 de perro), P. cansulci B46 (muestra VHUP 1B de perro), P. circumdentaria B52 (muestra VHUP 2A de gato), P. gulae B69 (muestra VHUP 3A de gato). P. circumdentaria B97 (muestra TH 1bC de perro), P cangingivalis B98 (muestra TH 1aC de perro), P. salivosa B104 (muestra TH 1bC de perro), O. denticanis B106 (muestra TH 1bE de perro), y P. endodontalis B114 (muestra TH 2bA).
En la Tabla 3 se muestra la distribución de los aislados.
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TABLA 3 Resumen del número de perros y gatos identificados por albergar las especies bacterianas indicadas 
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TABLA 3 (continuación)
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Los aislados relacionados anteriormente representan aquellas especies que se identificaron más frecuentemente y que están presentes en los porcentajes más elevados de perros o gatos.
Los siguientes aislados periodontales de animales de compañía se depositaron en la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA, 20110, EEUU, el 9 de Agosto de 2001: P. gulae B43 (PTA-3618), P. cansulci B46 (PTA-3619), P. circumdentaria B52 (PTA-3620), P. gulae B69 (PTA-3621), P. circumdentaria B97 (PTA-3622), P. cangingivalis B98 (PTA-3623), P. salivosa B104 (PTA-3624), O. denticanis B106 (PTA-3625), y P. endodontalis B114 (PTA-3626).
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Identificación de un nuevo género/especie (Odoribacter denticanis)
Durante el curso de este estudio se identificaron numerosos aislados clínicos cuyas secuencias de ARNr de 16S no tenían correspondencias muy similares en las bases de datos disponibles, indicando que las bacterias pueden representar aislados novedosos. Un grupo de estos aislados pareció representar una nueva especie. Basándose en los datos presentados hasta el momento, los inventores proponen que esta nueva especie se sitúe en un nuevo género a denominar como Odoribacter gen. nov. El tipo de cepa de Odoribacter denticanis es la cepa B106^{T} (= ATCC PTA-3625^{T}; = CNCM I-3225^{T}).
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Odoribacter denticanis B106^{T} se aisló de un perro macho adulto de raza mixta de edad desconocida con enfermedad periodontal. Se obtuvo una muestra de punta de papel del primer molar mandibular que tenía una bolsa periodontal de 4 mm de profundidad y un índice gingival de 1. Se procesó la muestra tal como se ha descrito anteriormente. Las células purificadas se sometieron a análisis bioquímico usando el kit de ensayo clínico RapID ANA II (Remel; Lenexa, KS) y el sistema de tarjeta de Identificación Anaerobia de Vitek (ANI) (BioMerieux Inc., Durham, NC). De manera breve, las células bacterianas que crecían en placas de agar Brucella sangre se volvieron a suspender hasta equivalencia en McFarland nº 3. Se añadió la suspensión a los pocillos de ensayo del RapID ANA II o a la tarjeta ANI de Vitek y se incubaron durante 4 horas a 37ºC. Tras el período de incubación se registraron los resultados de los ensayos bioquímicos.
La Tabla 4 muestra los resultados del ensayo RapID ANA II para O. denticanis B106^{T} así como para 6 bacterias relacionadas. De los 18 ensayos llevados a cabo mediante el kit RapID ANA II, sólo 2 (LGY e IND) fueron positivos para O. denticanis B106^{T}. En comparación, Porphyromonas gingivalis ATCC 33277, Prevotella intermedia ATCC 25611, Tannerella forsythensis ATCC 43037, Bacteroides thetaiotaomicron ATCC 29148, Bacteroides fragilis ATCC 25285, y Bacteroides splanchnicus ATCC 29572 dieron como resultado 5, 4, 10, 12, 9, y 8 ensayos positivos, respectivamente.
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Se determinaron los modelos de reacción bioquímica de O. denticanis B106T, P. gingivalis ATCC 53977, y Fusobacterium nucleatum subespecie nucleatum ATCC 23726 usando la Tarjeta ANI Vitek (Tabla 5). O. denticanis B106T dio como resultado sólo 2 ensayos positivos (INDOL y TTZ) mientras que P. gingivalis ATCC 53977 dio como resultado 5 ensayos positivos (INDOL, PO4, NAG, BANA, y TTZ). De los 12 ensayos que hay en común entre RapID-ANA II y la tarjeta ANI de Vitek, todos dieron resultados similares. Usando la base de datos suministrada por Vitek, el aislado de O. denticanis B106T se identificó incorrectamente como F. nucleatum con un nivel de confianza del 63% (no se muestran los datos). El error de identificación puede ser debido a una ausencia de aislados de PAB veterinarios en la base de datos de Vitek.
TABLA 5 Ensayos* bioquímicos ANI de Vitek de O. denticanis B106T y las cepas relacionadas
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El gen del ARNr de 16S de O. denticanis B106^{T} se amplificó mediante la PCR por triplicado usando los cebadores D134 (SEC DE ID Nº 169) y D57 (SEC DE ID Nº 2). Los productos de la PCR se combinaron, purificaron, desalaron, y sometieron a análisis directo de la secuencia de ADN. Las búsquedas BLAST-N (Altschul y col., 1990) de las bases de datos de nucleótidos no redundantes en el National Center for Biotechnology Information usando la secuencia del gen del ARNr de 16S de O. denticanis B106^{T} indicaron que el aislado de O. denticanis B106^{T} estaba relacionado con los miembros del género Bacteroides. La secuencia del gen del ARNr de 16S de O. denticanis B106^{T} era la más estrechamente relacionada con la secuencia del gen del ARNr de 16S del clon oral FX069 de Bacteroidetes sp (número de acceso AY134906) mostrando una identidad del 96,3% sobre 1.465 pb. Se aisló el clon oral FX069 de Bacteroidetes sp de un paciente humano con periodontitis ulcerosa necrotizante (NUP) durante un estudio para definir las especies bacterianas asociadas con NUP en pacientes VIH positivos (Paster, B.J., y col., "Phylogeny of Bacteroides, Prevotella, and Porphyromonas spp. and related bacteria", J Bacteriol. (1994), 176: 725-732).
Se llevó a cabo el análisis filogenético basado en las secuencias del gen del ARNr de 16S usando el software CLUSTAL X versión 1.81 (Thompsom, J.D., y col., "CLUSTALW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice", Nucleic Acids Res. (1994) 22: 4673-4680). Se generaron árboles filogenéticos usando el procedimiento del vecino más próximo (Saitou, N. & Nei, M. "The neighborjoining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees". Mol. Biol. Evol. (1987) 4:406-425). Se obtuvieron los valores de remuestreo usando 1000 réplicas. La Fig. 1 muestra los resultados del análisis filogenético para el aislado de O. denticanis B106^{T}. La colocación de los géneros principales (Porphyromonas, Bacteroides, Prevotella, Tannerella, etc.) está de acuerdo con los árboles filogenéticos anteriormente publicados para el grupo cytophaga-flavobacter-bacteroides (CFB) (Paster y col., 1994; Sakamoto, M., y col., "Reclassification of Bacteroides forsythus (Tanner y col. 1986) as Tannerella forsythensis corrig., gen. nov., comb.nov." Int. J Syst. Evol. Microbiol. (2002) 52: 841-849; Shah, H. N. y Collins, D. "Proposal for reclassification of Bacteroides asaccharolyticus, Bacteroides gingivalis, and Bacteroides endodontalis in a new genus, Porphyromonas". Int. J Syst. Bacteriol. (1998) 36: 128-131).
O. denticanis B106T se agrupa en un grupo externo de Bacteroides que incluye B. splanchnicus (Werner, H., y col., "A new butyric acid-producing Bacteroides species: B. splanchnicus n. sp." Zentralbl. Bakteriol. (1975) 231: 133-144), algunos aislados orales y numerosas cepas no cultivadas. Un valor de confianza del remuestreo del 71% en el punto de la rama de O. denticanis B106^{T} y B. splanchnicus indica un grado moderadamente alto de certeza de que estos dos organismos están relacionados. Sin embargo, existe una discusión histórica acerca de la ubicación de B. splanchnicus dentro del género Bacteroides (Paster y col., 1994; Shah y col., 1998). Paster y col. sugirieron que B. splanchnicus puede representar un nuevo género. Shah y col. indicaron que B. splanchnicus comparte muchas propiedades quimiotaxonómicas con los miembros del género Porphyromonas. Los datos de los inventores están de acuerdo con la hipótesis debido a que las ramificaciones del grupo B splanchnicus y O. denticanis B106^{T} están más próximas a las del género Porphyromonas que a las del género Bacteroides (Fig. 1).
Se amplificó mediante la PCR una región de aproximadamente 580 pb del gen ARNr de 16S procedente de 25 aislados clínicos caninos adicionales de O. denticanis (Tabla 1) usando los cebadores D56 y D57 descritos anteriormente. Se purificaron y se desalaron los productos de la PCR. A continuación se determinó la secuencia del ADN de los productos de la PCR. Las secuencias parciales del ARNr de los aislados de O. denticanis (SEC DE ID Nº 138-162) se encontraron conjuntamente todas en un clúster en grupos de secuencias idénticas o muy conservadas, siendo la divergencia más grande entre estos grupos de un 97% de identidad sobre la región analizada. La Fig. 2 muestra los resultados del análisis filogenético de las secuencias parciales del gen del ARNr de 16S de los aislados de O. denticanis; se escogió un aislado representativo de cada grupo de secuencias relacionadas para el análisis. Basándose en esta información, se puede concluir que todos estos aislados son cepas variables de la misma especie.
Se obtuvieron también los aislados clínicos de O. denticanis de gatos (Tabla 1). Se amplificó la misma región de aproximadamente 580 pb del gen del ARNr de 16S descrita anteriormente a partir de estos aislados mediante la PCR usando los cebadores D56 y D57. Las secuencias del ADN obtenidas de los productos de la PCR purificados (SEC DE ID Nº 163-168) se alinearon con las secuencias obtenidas de los aislados caninos. Los resultados de la alineación indican que los aislados de O. denticanis de felino son cepas variables de las misma especie encontrada en perros.
Con el fin de analizar adicionalmente las relaciones de O. denticanis B106^{T} con el género Porphyromonas, los inventores amplificaron mediante la PCR el gen fimA (por triplicado) usando los cebadores de PCR degenerados D122 (SEC DE ID Nº 84) y D123 (SEC DE ID Nº 85) (Invitrogen Corp.). Los productos de la PCR se purificaron, se desalaron, se combinaron, y se sometieron al análisis directo de la secuencia de ADN. Las búsquedas con BLAST-P (Altschul y col., 1990) de las bases de datos de polipéptidos no redundantes en el National Center for Biotechnology Information usando la secuencia de aminoácidos de FimA indicaron que la proteína FimA de O. denticanis B106^{T} estaba relacionada con la proteína FimA de los miembros del género Porphyromonas. La Fig. 3 muestra la relación filogenética de las diversas secuencias de la proteína FimA. Existe una relación muy fuerte (valor de remuestreo del 100%) entre la proteína de O. denticanis B106^{T} y algunas de las proteínas del tipo I de la fimbrilina de Porphyromonas spp.
O. denticanis B106^{T} y Porphyromonas gulae B43 se sometieron al microscopio electrónico de barrido para determinar la morfología celular. De manera breve, se centrifugaron cultivos líquidos de 36 horas en medio PYG modificado a 1800 X g. Se sustituyeron los medios con glutaraldehído de calidad EM al 3% (Polysciences, Inc., Warrington, PA) en un tampón fosfato 0,1 M (pH 7,3) y se incubaron a 4ºC durante 1 hora. A continuación se lavaron las células dos veces en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,3) y se suspendieron en tetróxido de osmio al 1% tamponado (Polysciences, Inc., Warrington, PA) durante 1 hora a temperatura ambiente Las muestras se deshidrataron en una serie de etanol en disminución con deshidratación final llevada a cabo por inmersión en hexametildisilazano durante 15 minutos seguido por secado al aire durante 1 hora. Las muestras se montaron sobre soportes de aluminio y se recubrieron con 200 \ring{A} de oro en una unidad de autorecubrimiento Polaron SEM (Polaron Intruments, Inc, Hatfield, PA). Cada muestra se examinó usando un microscopio electrónico de barrido DS-130 de ISI (ISI, Inc. Tokio, Japón). Se capturaron las imágenes usando una interfaz digital de control de haces Noran 4485 (Noran Instruments, Inc., EEUU). La Figura 4 muestra las micrografías electrónicas de barrido de P. gulae B43 y O. denticanis B106^{T}. La morfología en forma de varilla corta (longitud promedio de 1,25 \mum) de P. gulae B43 (Fig. 4A) es típica de miembros del género Porphyromonas. Por el contrario, O denticanis B106^{T} fue fusiforme con extremos cónicos y una longitud celular promedio de 5,9 \mum (Fig. 4B). La morfología de O. denticanis B106^{T} es análoga a la de Tannerella forsythensis bajo estas condiciones de crecimiento (Tanner y col., 1986). La diferencia morfológica entre P. gulae y O. denticanis apoya adicionalmente la ubicación de O. denticanis fuera del género Porphyromonas.
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Condiciones de cultivo para Porphyromonas Spp.
Debido a que los medios de crecimiento estándar para Porphyromonas sp. (medios de Infusión Cerebro Corazón (BHI) y Carbohidrato Carne Triturada (CMC) contienen producto animal, que no son adecuados para la producción de vacunas, se deseaba un medio de crecimiento que no contuviera estos ingredientes. Se ensayaron diversas composiciones de medios, con y sin la adición de hemina y vitamina K, para su capacidad de soportar el crecimiento de manera equivalente al del crecimiento de BHI o CMC. El medio PYG completo y el medio ME completo soportaron el crecimiento de P. gulae B43 (PTA-3618) hasta un nivel equivalente al de BHI (Figura 5). Se escogió el medio PYG completo como medio de crecimiento de P. gulae B43 (PTA-3618) debido a su capacidad para dar como resultado cultivos de alta densidad durante la fermentación. Este medio contiene los siguientes ingredientes: fitona al 3% (Becton Dickinson; Cockeysville, MD), extracto de levadura al 0,3% (Becton Dickinson), glucosa al 0,3% (Sigma Corp.; San Luis, MO), tioglicolato de sodio (Becton Dickinson), cloruro de sodio al 0,5% (Sigma Corp.) 5 \mug/ml de hemina (Sigma Corp.) (añadida después del autoclavado, 0,5 \mug/ml de menadiona (Sigma Corp.) (añadida después del autoclavado), y bicarbonato de sodio al 0,2% (Sigma Corp.), pH 7,0.
Se cultivó de manera rutinaria P. gulae B43 (PTA-3618) en placas de agar Brucella sangre (Anaerobe Systems) o en medio PYG completo o BHI a 37ºC en una cámara anaerobia Bactron IV (Shel Labs; Cornelius, OR) en N_{2} al 90%, CO_{2} al 5% durante tres a cinco días (placas) o 24 a 48 horas (cultivos líquidos). Para la preparación de bacterina de la célula completa, se cultivó P. gulae B43 (PTA-3618) en un Bioreactor BioFlo 3000 usando 5 litros de medio PYG completo. El medio de cultivo en el reactor se volvió anaerobio aireando con N_{2} al 95-99,5% y CO_{2} al 0,5-5% inmediatamente después del autoclavado. El medio de cultivo reducido se sembró con 0,02% de un stock de P. gulae B43 (PTA-3618) y se cultivó a 37ºC con una velocidad de agitación de 100 rpm y el pH mantenido a 7,0 mediante la adición automática de NaOH. Durante el cultivo, se aireó el reactor periódicamente con N_{2} y CO_{2}. Las células bacterianas se recogieron después de 36 a 48 horas a una DO_{600} de 2,0 a 3,5 mientras que las células experimentaban aún un crecimiento logarítmico.
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Ensayo de patogenia de aislados clínicos en ratones
Se ensayaron los nueve aislados (P. gulae B43, P. cansulci B46, P. circumdentaria B52, P. gulae B69, P. circumdentaria B97, P. cangingivalis B98, P. salivosa B104, O. denticanis B106, y P. endodontalis B114) para su patogenia en el modelo de pérdida de hueso periodontal de ratón. Se utilizaron para este estudio ratones Balb/c CyJ machos de tres semanas de edad, clasificados por edades (Jackson Laboratories; Bar Harbor, ME) con pesos estimados de 14-15 gramos. Los animales se alojaron en unidades de jaulas con barrera a presión positiva. Se proporcionaron lentejas de pienso, estándar para las especies, y agua ad libitum a lo largo del experimento. La cama utilizada fue cama O'Cobbs granular para minimizar el impacto en los tejidos gingivales. Tras la recepción, todos los animales se aclimataron durante cinco a siete días. Para reducir la flora oral competente, se administró a los animales una mezcla de sulfametoxazol y trimetoprima (10 ml de agua potable, aproximadamente 2 mg y 0,4 mg/ml, respectivamente) durante diez días seguido por un período de descanso de cinco días. Se tomaron muestras de suero por sangrado de la vena de la cola de cada ratón. Los animales se infectaron con 0,5 ml de una suspensión de aproximadamente 1 X 10^{10} ufc/ml de la cepa bacteriana apropiada en carboximetilcelulosa al 1% por sonda nasogástrica. Se colocaron gotas adicionales en la cavidad oral. Esta infección se repitió dos veces más durante un total de tres veces (lunes, miércoles, y viernes).
El Día 1 del experimento se definió como el martes después de la primera infección. Todos los animales se sacrificaron en el Día 2. Se recogió el suero después de la infección, que fueron las muestras microbianas. Se descarnaron las quijadas de cada ratón, se tiñeron, y se puntuaron microscópicamente para la pérdida de hueso horizontal. Se repitió la puntuación tres veces para reducir el error del operario. La pérdida de hueso promedio se expresó como el promedio de pérdida de hueso/fuera de sitio en mm. El análisis estadístico de los datos resultantes se llevó a cabo con Systat (versión 9), SigmaStat (versión 2), y SigmaPlot (versión 2000) disponibles de SPSS Science Inc. (Chicago, IL). La Tabla 6 muestra los resultados numéricos para los nueve aislados mayores.
TABLA 6 Resumen del ensayo de patogenia de la enfermedad periodontal en ratones
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Cada uno de estos dio como resultado pérdida de hueso estadísticamente significativa en este modelo.
La Figura 6 muestra gráficamente la pérdida de hueso neta. Se obtuvieron los niveles de hueso alveolar promedio (unión cemento esmalte - cresta del hueso alveolar) en 14 puntos del maxilar en mm, y se determinó el valor promedio para cada quijada. Para cada grupo experimental, se suman los valores promedio para cada quijada, y se deriva el promedio del grupo dividiendo por el número total de animales en ese grupo.
La Figura 7 muestra gráficamente la comparación de la pérdida de hueso neta. Se obtuvieron los niveles de hueso alveolar promedio (uniones cemento esmalte - cresta del hueso alveolar) en 14 puntos del maxilar en mm, y se determinó el valor promedio para cada quijada. Para cada grupo experimental, se suman los valores promedio para cada quijada y se deriva el promedio del grupo dividiendo por el número total de animales en este grupo. Se presentan los datos como porcentaje del grupo control positivo (P. gingivalis 53977) que se ajusta al 100%. P. gingivalis W50 es una cepa muy poco fimbrinada que tiene virulencia reducida en este modelo animal.
Estos datos indican que los siguientes aislados clínicos son capaces de producir altos niveles de pérdida de hueso en el modelo de ratón de la enfermedad periodontal: P. gulae B43 (PTA-3618), P. gulae B69 (PTA-3621), P. cangingivalis B98 (PTA-3623) y O. denticanis B106 (PTA-3625). Los siguientes aislados clínicos dieron como resultado pérdidas moderadas de hueso en el modelo periodontal de ratón: P. cansulci B46 (PTA-3619), P. salivosa B104 (PTA-3624), y P. endodontalis B114 (PTA-3626). Los siguientes aislados clínicos dieron como resultado una pérdida de hueso mínima en el modelo periodontal de ratón: P. circumdentaria B52 (PTA-3620) y P. circumdentaria B97 (PTA-3622). Aunque se observaron cantidades variables de pérdida de hueso entre los aislados clínicos, debería señalarse que en cada caso, la cantidad de pérdida de hueso observada estuvo bastante por encima de la observada en los ratones infectados en simulación. Basándose en estos datos, se puede concluir que cada uno de los nueve aislados clínicos mayores es capaz de producir la enfermedad periodontal tanto solo como en concierto con otras bacterias.
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Preparación de células bacterianas y ADN genómico
Las especies bacterianas se cultivaron anaeróbicamente en BHI o PYG completo a 37ºC durante 48 horas. Las células de un cultivo de 1-2 ml se aglomeraron mediante centrifugación, se lavaron una vez en un volumen igual de PBS anaerobio, se volvieron a centrifugar, y se volvieron a suspender en un volumen 1/10 de PBS anaerobio.
El ADN genómico se purificó a partir de cultivos de 5 ml de las especies bacterianas que se cultivaban anaeróbicamente en BHI o PYG completo a 37ºC durante 48 horas. Se utilizó el kit Wizard Genomic DNA Extraction (Promega Corp) para todas las preparaciones de ADN genómico.
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Clonación del gen fimbrial a partir de aislados clínicos
Se amplificó el gen fimA mediante la PCR a partir del ADN genómico aislado de los diez aislados clínicos mayores usando combinaciones de los siguientes cebadores de la PCR, D0067 (directo; SEC DE ID Nº 6), D0078 (directo; SEC DE ID Nº 8), D0097 (directo; SEC DE ID Nº 9), D0068 (inverso; SEC DE ID Nº 7) y D0098 (inverso; SEC DE ID Nº 10). Se llevó a cabo la PCR en volúmenes de reacción de 50 \mul que contenían tampón de PCR 1 x (Life Technologies), MgCl_{2} 1,0 M, 1,25 \muM de cada cebador, 300 M de cada desoxi-NTP, y 2,5 U de platino Pfx ADN polimerasa (Life Technologies). Se utilizaron las siguientes condiciones de ciclación de la PCR: una etapa de desnaturalización de dos minutos a 94ºC; 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 40 segundos, templado a 60ºC durante 40 segundos, y extensión a 72ºC durante 1,5 minutos, una etapa final de extensión a 72ºC durante cinco minutos; y una etapa final de enfriamiento a 4ºC. Se utilizó un termociclador GeneAmp 9700 (Perkin Elmer Applied Biosystems; Foster City, CA) para todas las amplificaciones de la PCR. Los productos amplificados se visualizaron en E-gel al 1,2% (Invitrogen; Carslbad, CA).
Los productos de la PCR se pusieron en la cola A usando 10 unidades de polimerasa Klen Taq (Ab Peptides, Inc; San Luis, MO) durante cinco minutos a 72ºC. los productos resultantes se clonaron inmediatamente en la cola T en el vector pCR2.2-TOPO (Invitrogen) usando el protocolo del fabricante y se transformaron en el Top10F' de E. coli (Novagen; Madison, WI). Se identificaron los transformantes que albergaban plásmidos recombinantes con el ADN correcto inserto mediante una combinación de la PCR de la colonia, digestión mediante enzima de restricción, y análisis de la secuencia de ADN usando reacciones de terminación DyeDeoxi sobre una secuencia de ADN automatizada con ABI (Lark Technologies Inc.). Se usaron cebadores de oligonucleótidos sintéticos para obtener la secuencia de ADN de doble cadena.
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Clonación del gen FimA de P. gulae B43 en plásmidos de expresión
Para el objetivo de expresión de la proteína a un nivel elevado, se clonó el gen fimA de P. gulae B43 (PTA-3618) en el vector de expresión pBAD/HisA (Invitrogen). Se purificó el ADN genómico de un cultivo de 5 ml de P. gulae B43 en BHI y se incubó a 37ºC durante dos días anaeróbicamente usando el kit de extracción del ADN genómico (Promega Corp.). Se amplificó por triplicado el gen fimA mediante la PCR usando los cebadores D0097 y D0098 (SEC DE ID Nº 9 y SEC DE ID Nº 10). Se llevó a cabo la PCR en volúmenes de reacción de 50 \mul que contenían tampón de PCR 1 X (Life Technologies), 50 ng de ADN genómico de P. gulae B43, MgCl_{2} 1,0 mM, 1,25 \muM de cada cebador, 30 \muM de cada desoxi-NTP, y 2,5 U de Platino Pfx ADN Polimerasa (Life Technologies, EEUU.).
Se utilizaron las siguientes condiciones de ciclación de la PCR: una etapa de desnaturalización de dos minutos a 94ºC; cinco ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 40 segundos, templado a 58ºC durante 40 segundos, y extensión a 72ºC durante 1,5 minutos, 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 40 segundos, templado a 65ºC durante 40 segundos, y extensión a 72ºC durante 1,5 minutos; una etapa final de extensión a 72ºC durante cinco minutos; y una etapa final de enfriamiento a 4ºC. Se utilizó un termociclador GeneAmp 9700 (Perkin Elmer Applied Biosystems) para todas las amplificaciones de la PCR. Los productos de la PCR se purificaron usando los kits prep de la PCR (Promega Corp.). Los productos de la PCR y PBAD/HisA se digirieron por duplicado con HindIII y HhoI durante tres horas a 37ºC. Hacia la mitad de la digestión, se añadieron cinco unidades de fosfatasa alcalina de camarón (SAP) (Amersham Pharmacia Biotech, Inc.: Piscataway, NJ) a la digestión del vector. Los ADN digeridos se purificaron usando el kit Clean-Up del ADN (Promega Corp.). Los productos purificados de la PCR digeridos con HindIII/Xhoi se ligaron en el pBAD/HisA tratado con SAP digerido con HindIIIXhoi, mediante la enzima T4 ADN ligasa (Life Technologies) en presencia de tampón ligasa de T4 ADN ligasa 1 X a 16ºC durante 18 horas. Una porción de la mezcla de ligadura resultante se transformó en células Top10F' de E. coli competentes (Novagen). Se encontró que un plásmido recombinante, pBAD:B43fimA4, contenía el gen fimA en la orientación correcta. El FimA recombinante contiene una secuencia terminal (MGGSHHHHHHGMASMTGGQMGRDLYDDDDKDRWGSELEICSQYHMGI, SEC DE ID Nº: 135), codificada por el vector, seguido por la porción madura de FimA que comienza en la asparagina-20. Se transformó este plásmido en células BL21 de E. coli competentes (Novagen) para el análisis adicional de expresión de la proteína.
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Expresión y purificación de la Proteína Fim A recombinante
Se descongeló un stock de trabajo congelado de BL21/pDAD:B43fimA4 de E. coli, se sembró a una dilución 1:5000 en caldo de Luria que contenía 100 \mug/ml de ampicilina (triptona al 1%, extracto de levadura al 0,5%, NaCl al 0,5%), y se hizo crecer en un Bioreactor BioFlo 3000 con un volumen de trabajo de 5 litros (New Brunswick Scientific; Edison, NJ) a 37ºC con una velocidad de agitación de 100 rpm hasta que A_{625} fue de 2,5-3,5. A concentración se añadió L-arabinosa al cultivo hasta una concentración final de 0,1% para inducir la expresión de FimA. Se incubó el cultivo durante tres horas más. Se detectó la expresión del FimA recombinante mediante SDS-PAGE y el análisis de transferencia Western usando un suero anti-Express (Invitrogen) (Figura 8). La proteína FimA recombinante tuvo un peso molecular predicho de 45 kDa.
Se cosecharon las células húmedas del transformante BL21 de E. coli que expresaban la FimA recombinante de la fermentación de 5 litros mediante centrifugación y se volvieron a suspender en solución salina tamponada. Las células se lisaron mecánicamente. Tras la centrifugación, se descartó el residuo. Se pasó el sobrenadante sobre una columna de afinidad de Ni^{2+}, y se eluyeron usando un gradiente de imidazol. Las fracciones que contenían la proteína recombinante se combinaron, se dializaron para eliminar el imidazol, y se esterilizaron mediante filtración usando un filtro de 0,2 \mum.
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Clonación del gen oprF a partir de aislados clínicos
Basándose en las secuencias homólogas de oprF de la cepa W50 de P. gingivalis, se diseñaron y sintetizaron el gen PG32 (número de acceso del Genbank AF175714), los cebadores de oligonucleótidos D0086 (SEC DE ID Nº 43, D0087 (SEC DE ID Nº 44), y KWK-Pg-03 (SEC DE ID Nº 45) (Life Technologies). Para la PCR, se usó el cebador D0086 (SEC DE ID Nº 43) en conjunción con cualquiera de D0087 (SEC DE ID Nº 44) o KWK-Pg-03 (SEC DE ID Nº 45) en tampón PC2 1 X (Ab Peptides), 200 \muM de cada dNTP, 7,5 U de Klen Taq1 (Ab Peptides) y 0,15 U de polimerasas termoestables de Pfu clonado (Stratagene; La Jolla, CA) en un volumen final de muestra de 50 \mul. Se llevaron a cabo las reacciones por triplicado usando cualquiera de una suspensión celular lavada o ADN genómico purificado como plantilla de P. gulae B43, P. cansulci B46, P. circumdentaria B52, P. gulae B69, P. circumdentaria B97, P. cangingivalis B98, P. salivosa B104, O. denticanis B106, y P. endodontalis B114. Se llevó a cabo la amplificación como sigue: desnaturalización (94ºC, 9 minutos); 30-40 ciclos de desnaturalización (94ºC, 30 segundos), templado (55-60ºC, 30 segundos), y polimerización (72ºC, 1,5 minutos); seguido por una extensión final a 72ºC durante siete minutos.
Para la amplificación en cadena de la polimerasa del homólogo de oprF procedente de P. cangingivalis B98 se usó el cebador KWK-Ps-04b (SEC DE ID Nº 81) en conjunción con KWK-Ps-06b (SEC DE ID Nº 83). Para la amplificación del homólogo de P. salivosa B104 se usó el cebador KWK-Ps-04b (SEC DE ID Nº 81) con KWK-Ps-05b (SEC DE ID Nº 82). Para la amplificación del gen de O. denticanis B106 se usó el cebador KWK-Ps-02 (SEC DE ID Nº 79) con KWK-Ps-03 (SEC DE ID Nº 80). Se llevaron a cabo las reacciones por triplicado usando ADN cromosómico purificado como plantilla para las cepas de P. cangingivalis B98, P. salivosa B104, y O. denticanis B106. Se llevó a cabo la amplificación como sigue: desnaturalización (94ºC, 9 minutos); 30-35 ciclos de desnaturalización (94ºC, 30 segundos), templado (61-72ºC, 30 segundos), y polimerización (72ºC, 1,5 minutos); se siguió esto por una extensión final a 72ºC durante 7 minutos.
Los productos génicos amplificados de la PCR se visualizaron por separación en un gel de agarosa al 1,0% (Sigma). Los productos de la PCR se purificaron usando un kit de Purificación de la PCR QIAquick^{TM} (Quiagen; Valancia, CA), y se combinó cada conjunto de muestras triplicadas. A continuación se secuenciaron estos fragmentos directamente en un intento de evitar la introducción de artefactos de secuencia debido a las mutaciones que se producen durante la amplificación de la PCR y las posteriores etapas de clonación. A continuación se sometieron las mezclas combinadas al análisis directo de la secuencia usando una reacción de terminación la reacción DyeDeoxi en un secuenciador de ADN automatizado con ABI (Lark Technologies). Se usaron los cebadores de oligonucleótidos sintéticos (SEC DE ID Nº 46-75) para secuencias ambas cepas de ADN de los productos amplificados.
Las secuencias de nucleótidos que representan gráficamente el homólogo de OprF procedente de P. gulae B43, P. cansulci B46, P. circumdentaria B52, P. gulae B69, P. circumdentaria B97, P. cangingivalis B98, P. salivosa B104, O. denticanis B106, P. cangingivalis B98, P. salivosa B104, O. denticanis B106, y P. endodontalis B114 se representan gráficamente en la SEC DE ID Nº 111 a 119. Se eliminó la secuencia que correspondía a los cebadores 5' y 3' usados para la amplificación de la PCR de cada gen, ya que puede no representar la secuencia real del gen en cada una de las cepas respectivas. Los ORF codificados por las SEC DE ID N^{ros} 111 a 119 se muestran en la SEC DE ID N^{ros} 120 a 128, respectivamente. Para cada uno de los ORF codificados, se excluyó la secuencia aminoterminal, incluso cuando ésta estaba codificada por el cebador 5', manteniéndose aún las características de una secuencia señal procariota (von Heijne, 1985, J. Mol. Biol, 184:99-105; Nielsen, H., Engelbrecht, J., Brunak, S., y von Heijne, G., 1997 Protein Engineering, 10:1-6). Se comparó cada ORF con los nucleótidos existentes y las bases de datos de proteínas usando los programas Basis Local Align Search Tool (BLAST) (Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W., Lipman, D.J., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410). La entrada con la cual compartió la mayor homología fue PG32 de P. gingivalis.
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Clonación del gen oprF de P. gulae B43 en plásmidos de expresión
Para el objetivo de la expresión de la proteína recombinante, se clonó el gen que codificaba OprF con la secuencia que codificaba su péptido señal. Se amplificó OprF de P. gulae B43 usando los cebadores de oligonucleótidos KWK-Pg-06 (SEC DE ID Nº 76) y KWK-Pg-03 (SEC DE ID Nº 45). Para la amplificación en cadena de la polimerasa, se prepararon por duplicado reacciones de 50 \mul que contenían ADN cromosómico como plantilla, tampón PC2 1 X, 200 \muM de cada dNTP, 50 pmol de cada cebador, 7,5 U de Klen Taq1 y 0,15 de polimerasa termoestable de Pfu clonado. Se llevó a cabo la amplificación como sigue: desnaturalización (94ºC, nueve minutos); 30 ciclos de desnaturalización (94ºC, 30 s), templado (60ºC, 30 s), y polimerización (72ºC, 1,5 min), seguido por una extensión final a 72ºC durante 7 minutos. Tras la amplificación, se purificaron las muestras (kit de Purificación de la PCR QIAquick^{TM}) y se combinaron. El producto de la PCR purificado se clonó directamente en el emplazamiento de clonación TA de pBAD-TOPO y pBAD/Thio-TOPO (Invitrogen). Los productos de los ligandos se transformaron en células DH5\alpha de Máxima Eficiencia. La secuencia aminoterminal predicha de la proteína codificada expresada de PBAD-TOPO:OprF está constituida por la secuencia MGSGSGDDDDKLALM (SEC DE ID Nº: 136) codificada por el vector, seguida inmediatamente por la secuencia que se inicia en la glutamina 13 de OprF (SEC DE ID Nº 120). Se identificó un clon que contenía el plásmido apropiado, y se aisló el plásmido purificado de un cultivo en caldo a pequeña escala usando un kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen). Este plásmido se transformó en células BL21 de E. coli (Novagen), y se identificó un clon que contenía el plásmido apropiado.
La secuencia aminoterminal predicha de la proteína de fusión codificada expresada a partir de pBAD/Thio-TOPO:oprF debería estar constituida por la proteína tioredoxina y un ligante de 14 restos de aminoácidos seguido inmediatamente por la secuencia que se inicia en la glutamina 13 de OprF (SEC DE ID Nº 120). Se identificó un clon que contenía el plásmido apropiado, y se aisló el plásmido purificado a partir de un cultivo en caldo a pequeña escala usando un kit QIAprep Spin Miniprep. Se transformó este plásmido en células BL21 de E. coli, y se identificó un clon que contenía el plásmido apropiado.
Se clonó también el gen oprF que carecía de la secuencia que codificaba el péptido señal en dos diferentes plásmidos de expresión \lambda. Estos plásmidos codifican el \lambda represor c/857 sensible a la temperatura, que inhibe la expresión de los promotores \lambda a 30ºC. A 42ºC, el represor se inactiva y se posibilita la expresión del promotor \lambda, dando como resultado una transcripción y traducción de alto nivel. Para la clonación en estos vectores, se amplificó oprF de P.gulae B43 usando los cebadores de oligonucleótidos KWK-Pgu-14 (SEC DE ID Nº 77) y KWK-Pgu-15 (SEC DE ID Nº 78). Para la amplificación en cadena de la polimerasa se prepararon por duplicado reacciones de 50 \mul que contenían células de P. gulae B43 lavadas como plantilla, tampón PC2 1 X, 200 \muM de cada dNTP, 50 pM de cada cebador, 7,5 U de Klen Taq1 y 0,15 U de polimerasas termoestables de Pfu clonado. Se llevó a cabo la amplificación como sigue. Desnaturalización (94ºC, nueve minutos); 45 ciclos de desnaturalización (94ºC, 30 s), templado (55ºC, 30 s), y polimerización (72ºC, 1,5 minutos), seguido por una extensión final a 72ºC durante siete minutos. Tras la amplificación, se combinaron las muestras y se digirieron con enzimas de restricción, generando salientes compatibles con los plásmidos que se habían linealizado también con las mismas enzimas. Tras la digestión de restricción, el fragmento de la PCR y los plásmidos se purificaron (kit de Purificación de la PCR QIAquick^{TM}; Qiagen Corp.), se ligaron, y se transformaron en células 5H5\alpha de E. coli (Novagen). La secuencia aminoterminal predicha estaba constituida por la secuencia MGTTTTTTSLHM (SEC DE ID Nº: 137) codificada por el vector, seguida inmediatamente por la secuencia que se iniciaba en la Glutamina 13 de OprF (SEC DE ID Nº 20). La proteína expresada a partir del segundo plásmido estaría constituida sólo por una Met codificada por el vector seguido por la Glutamina 13 de OprF (SEC DE ID Nº: 120). Se identificaron los clones que contenían los plásmidos apropiados, y se aislaron los plásmidos a partir de cultivos en caldo a pequeña escala usando los kits QIAprep Spin Miniprep (Qiagen Corp.). Estos plásmidos se transformaron en células BL21 de E. coli, y se identificaron los clones separados que contenían los plásmidos
apropiados.
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Expresión y purificación de la proteína OprF recombinante
Se utilizaron células BL21 de E. coli que expresaban OprF recombinante (fusionadas en su término N con la SEC DE ID Nº: 137) para los estudios de expresión. Se descongeló un stock congelado, se sembró a una dilución 1:5000 en medio YT 2 X que contenía 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina (triptona al 1,6%, extracto de levadura al 1%, 0,5 NaCl), y se hizo crecer en un Bioreactor BioFlo 3000 con un volumen de trabajo de 5 litros (New Brunswick Scientific; Edison, NJ) a 29ºC con una velocidad de agitación de 100 rpm hasta que A_{625} fue de 2,5-3,5. A continuación se cambiaron los cultivos a 42ºC para inducir la expresión de OprF. Se incubó el cultivo durante 3 horas más. Se retiraron alícuotas en diversos puntos temporales, se centrifugaron, y se volvieron a suspender en tampón de muestra reductor. Se analizaron todas la muestras en un gel NuPAGE al 10% (Invitrogen, EEUU) (Figura 9). Se cosecharon las células húmedas del transformante BL21 de E. coli que expresaban OprF recombinante a partir de la fermentación de 5 litros mediante centrifugación y se volvieron a suspender en solución salina tamponada con fosfato. Se lisaron las células mecánicamente. Tras la centrifugación, se descartó el residuo. Se pasó el sobrenadante por una columna de intercambio iónico, y se eluyó usando un gradiente de NaCl. Las fracciones que contenían la proteína recombinante se combinaron, se dializaron para eliminar el NaCl, y se esterilizaron mediante filtración usando un filtro de 0,2 \mum.
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Preparación de bacterina de células completas
Se hizo crecer un lote de 5 litros de P. gulae B43 en un fermentador tal como se ha descrito anteriormente y se dividió en porciones de 1 litro. Las células en cada fracción de 1 litro (4,4 X 10^{12} células de P. gulae B43 totales) se inactivaron mediante los siguientes tratamientos: exposición a formalina al 0,4% durante 24 horas a 23ºC, exposición a etileno-imina binaria 10 mM (BEI) a pH 8,5 durante 48 horas a 37ºC, calentando a 60ºC durante 30 minutos en dos días consecutivos, y exposición al aire durante 48 horas. Tras el tratamiento con BEI, se inactivó el BEI mediante tratamiento con tiosulfato de sodio 50 mM. Se recogieron las células mediante centrifugación. Los aglomerados celulares resultantes se volvieron a suspender en 220 ml de PBS dando como resultado una concentración final de 2 X 10^{10} células por ml. Siete ml de cada una de las células inactivadas se mezclaron con 7 ml de adyuvante MPL+TDM (Sigma Corp.) dando como resultado una concentración final de 1,0 X 10^{10} células por ml.
Se pueden preparar preparaciones de bacterina de células completas a paritr del resto de ocho aislados clínicos mayores (P. cansulci B46, P. circumdentaria B52, P. gulae B69, P. circumdentaria B97, P. cangingivalis B98, P. salivosa B104, O. denticanis B106, y P. endodontalis B114) u otras bacterias anaerobias pigmentadas de una manera idéntica.
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Eficacia en ratones de la vacuna homóloga
En estudios de eficacia de vacuna homóloga, se inmunizaron ratones con dos inyecciones de 0,2 ml cada una de las célula de P. gulae B43 inactivadas anteriormente mencionadas en adyuvante MPL+TDM con una separación de tres semanas. Se infectaron los ratones tal como se ha descrito anteriormente con P. gulae B43 dos semanas después de la inmunización de refuerzo. Cuarenta y dos días después de la inyección se sacrificaron los ratones y se procesaron tal como se ha descrito anteriormente. La Tabla 7 muestra los resultados numéricos de las medidas de la pérdida de hueso.
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TABLA 7 Resultados del estudio de eficacia de la vacuna homóloga de ratón
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TABLA 7 (continuación)
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TABLA 7 (continuación)
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Las Figuras 10, 11, y 12 muestran gráficamente estos resultados. La Figura 11 muestra el porcentaje de pérdida de hueso para el experimento control. Las vacunas que contienen P. gingivalis 53977 inactivada con formalina y cualquiera de los adyuvantes completo/incompleto de Freund o MPL+TDM redujeron la pérdida de hueso inducida por la infección con P. gingivalis 53977 en aproximadamente un 32% y un 43%, respectivamente. La Figura 12 muestra el porcentaje de pérdida de hueso para el experimento de ensayo. Las vacunas que contenían cualquiera de P. gulae B43 y MPL+TDM inactivada con formalina, calor, o aire, redujeron la pérdida de hueso inducida por la infección con P. gulae B43 en aproximadamente un 45%, un 35% y un 75%, respectivamente. Basándose en estos datos, se puede concluir que las vacunas de P. gulae B43 inactivadas con formalina, aire, y calor fueron eficaces en su capacidad para reducir la pérdida de hueso inducida en este modelo de superinfección. Extrapolando estos datos en el escenario clínico, estas tres vacunas podrían ser probablemente eficaces en la prevención profiláctica de la enfermedad periodontal y pueden probar bien ser eficaces en el tratamiento terapéutico de la enfermedad periodontal.
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Estudio de eficacia de la vacuna heteróloga en ratones
En los estudios de eficacia de la vacuna heteróloga, se inmunizaron ratones con dos inyecciones de 0,2 ml cada una de cualquiera de las células de P. gulae B43 inactivada con formalina o P. salivosa B104 y O. denticanis B106 inactivadas con formalina en adyuvante MPL+TDM con tres semanas de separación. Se infectaron los ratones tal como se ha descrito anteriormente con cualquiera de P. gulae B43, P. gulae B69, P. salivosa B104, u O. denticanis B106 dos semanas después de la inmunización de refuerzo. Cuarenta y dos días después de la infección, se sacrificaron los ratones y se procesaron tal como se ha descrito anteriormente. La Tabla 8 muestra los resultados numéricos de las medidas de la pérdida de hueso.
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Las Figuras 13, 14, 15, 16, y 17 muestran gráficamente estos resultados. La Figura 9 muestra la pérdida neta de hueso para estos experimentos. La Figura 14 muestra el porcentaje de pérdida de hueso para los grupos infectados con P. gulae B43. P. gulae B43 inactivada con formalina y adyuvante MPL+TDM redujeron la pérdida de hueso inducida por la infección con P. gulae B43 en aproximadamente un 84%. La Figura 15 muestra el porcentaje de pérdida de hueso para los grupos infectados con P. gulae B69. P. gulae B43 inactivada con formalina y las vacunas de P. salivosa B104/O. denticanis B106 inactivadas con formalina que contenían adyuvante MPL+TDM redujeron la pérdida de hueso inducida por la infección con P. gulae B69 en aproximadamente un 40% y un 49%, respectivamente. La Figura 16 muestra el porcentaje de pérdida de hueso para los grupos infectados con P. salivosa B104. P. gulae B43 inactivada con formalina y adyuvante MPL+TDM redujeron la pérdida de hueso inducida por P. salivosa B104 en aproximadamente un 65%. La Figura 17 muestra el porcentaje de pérdida de hueso para los grupos infectados con O. denticanis B106. P. gulae B43 inactivada con formalina con el adyuvante MPL+TDM fracasó en proteger de manera cruzada contra el estímulo con O. denticanis B106. Basándose en estos datos, se puede concluir que la vacuna de P. gulae B43 inactivada con formalina adyuvada con MPL+TDM fue capaz de proporcionar protección no sólo del estímulo homólogo, sino también del estímulo heterólogo con P. gulae B69. Es más. Es más, se observó protección entre dos especies de Porphyromonas ya que la vacuna de P. gulae B43 protegió contra el estímulo de P. salivosa B104. Extrapolando estos datos en el escenario clínico, una vacuna multivalente podría probablemente ser eficaz en la prevención profiláctica de la enfermedad periodontal y puede probar bien ser eficaz en el tratamiento terapéutico de la enfermedad periodontal.
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Estudio serológico de Fim A y OprF recombinantes de ratón
En los estudios de serología de la vacuna subunidad se inmunizaron ratones con dos inyecciones de 0,2 ml cada una de cualquiera de FimA de P. gulae B43 purificada, recombinantemente expresada u OprF de P. gulae B43 purificada, recombinantemente expresada en adyuvante QuilA/colesterol con tres semanas de separación. Los ratones se sangraron antes de la primera vacunación y dos semanas después de la inmunización de refuerzo. La Tabla 9 muestra los resultados numéricos mientras que las Figuras 18 y 19 muestran los resultados gráficamente.
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TABLA 9 Estudio de serología de la vacuna subunidad
70 
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Ejemplo 2
Se usaron para este estudio diez perros sabuesos con dentición adulta. Se anestesiaron los animales, y se realizó un acceso al canal de la raíz de los premolares mandibulares y los primeros molares usando un torno dental con forma de pera (Midwest Dental Products Corp; Des Plaines, IL), en una unidad dental Schein Ultima 2000 con un torno manual de alta velocidad (Henry Schein Inc.; Melville, NY). Se confirmó el acceso al canal de la raíz pasando una broca con púas veterinaria (21 mm, tamaño nº 5; Roydent Dental Products; Johnson City, TN) en el canal a una profundidad aproximada a la profundidad del canal de la raíz. La hemorragia fue menor; se consiguió la hemostasis con puntas de papel estéril (Henry Schein Inc.) colocadas en el canal. Fue importante en este momento asegurar que se eliminara cualquier contaminación inadvertida del canal durante la perforación y el vaciado del canal. Por tanto, se lavó el canal con una solución de blanqueo al 10%, Para crear una superficie apropiada para la colocación de la restauración, se talló el esmalte que rodeaba el puerto de acceso usando un gel de ácido sulfúrico al 40% (Scotchbond Etching Gel, 3M; St. Paul, MN). Con el fin de evitar cualquier influencia sobre la viabilidad del material del estímulo debido a la solución residual de blanqueo o el gel ácido, se lavó el canal de la raíz desde el interior hacia el exterior, usando una aguja endodóntica (27 ga., Dentsply Pharmaceutical; York, PA) y copiosas cantidades de solución salina estéril. La zona de acceso y el canal se secaron con puntas de papel estéril.
Se preparó el material del estímulo haciendo crecer la cepa B69 de P. gulae en caldo de Brucella sangre (Anaerobe Systems; Morgan Hill, CA), e incubando a 37ºC en un entorno anaerobio (H_{2} al 5%, CO_{2} al 5%, N_{2} al 90%). Se cosecharon las células y se volvieron a suspender en medio SSYG estéril. A continuación se introdujo una dosis del estímulo de aproximadamente 7,5 x 10^{8} unidades formadoras de colonias (UFC) en la cavidad expuesta del canal de la raíz del diente seleccionado con una aguja endodóntica. Cinco animales recibieron el material del estímulo (T01), mientras que los otros cinco recibieron un estímulo de simulación consistente en medio SSYG estéril (T02). A continuación se selló el puerto de acceso con una combinación de ionómero de vidrio y un material compuesto dental endurecido con luz restaurador (Revolution 3; 3M).
Se determinó la periopatogenia de los organismos del estímulo en función de los cambios en la densidad del hueso periodontal que rodea el diente. Se llevó a cabo esta evaluación midiendo las intensidades de píxel de las radiografías digitales tomadas usando sensores y software Schick Computed Dental Radiography (CDR®) en las semanas 0, 3, 6, 9 y 12 del estudio. Se tomaron radiografías de seis a ocho dientes en cada animal. Con el fin de obtener los valores iniciales, se tomaron radiografías inmediatamente antes del procedimiento. Tras el estímulo, se tomaron radiografías cada tres semanas a doce semanas después del estímulo. Se analizaron las radiografías mediante dos procedimientos diferentes. De manera breve, esto consistió en un observador entrenado que examinaba las radiografías, anotando las anormalidades y señalando el grado de anormalidad para cada perro en una Escala Analógica Visual. En segundo lugar, se midieron las zonas no afectadas del hueso evidentes en las radiografías tomadas a las 0, 6 y 12 semanas tras el estímulo usando una herramienta de medida del área comprendida dentro del software de la radiografía. Esto estuvo constituido por la demarcación del diámetro grosero de las lesiones visibles en la radiografía usando la herramienta de medida Straight-line comprendida en el Software CDR de Schick. A partir de la distancia resultante, se determinó el área aproximada de la lesión. Se totalizaron estas áreas para cada perro y se tabularon.
El análisis de las radiografías usando ambos procedimientos sugirió que el grupo T01 perdió más hueso periodontal que el grupo T02 (Figura 20). Se concluyó a partir de este estudio que se había desarrollado un modelo factible de estímulo. Sin embargo, debido a las dificultades en cuantificar los cambios que se produjeron en un área tridimensional (hueso periodontal) basándose en las medidas bidimensionales (radiografías), podrían conseguirse mejoras en los procedimientos de cuantificación.
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Ejemplo 3 Evaluación de la eficacia de la vacuna trivalente en el modelo de estímulo canino
Tras el desarrollo del modelo, se llevó a cabo un estudio en perros para ensayar la eficacia de la preparación de una vacuna trivalente. La bacterina trivalente contenía P. gulae (B43), P. salivosa (B104), y O. denticanis (B106), inactivadas con formalina, adyuvadas con Quil A y colesterol a 50 \mug de cada una por dosis. Cada cepa de bacterina se ensambló a una concentración aproximada de 1 x 10^{10} UFC/dosis de vacuna. Se usaron tres grupos de ocho animales con dentición adulta en este estudio. Los perros del primer grupo (T01) se vacunaron por vía intramuscular (IM) con 1 ml de vacuna trivalente. Los grupos segundo (T02) y tercero (T03) se vacunaron en simulación con 1 ml de solución salina estéril. Todos los perros recibieron tres administraciones intramusculares (IM), con un intervalo de tres semanas entre las administraciones. Tres semanas después de la administración final, los animales se anestesiaron tal como se ha descrito anteriormente, y el material del estímulo se introdujo en el canal de la raíz de los premolares y primeros molares mandibulares tras la extirpación del material de la raíz. Los perros de los grupos T01 y T02 se estimularon con 1 x 10^{10} CFU de una cepa de P. gulae heteróloga (B69) preparada tal como se describe en el Ejemplo 1. Los perros del grupo T03 se estimularon con medios estériles, en un esfuerzo para medir los efectos del
procedimiento.
Se tomaron radiografías usando un equipo radiográfico dental Helidont, el sistema de captura CDR de Schick® (radiografía digital informatizada) y las técnicas estándar a las tres, seis, nueve, y doce semanas tras el estímulo. Para este estudio, una vez que se obtuvieron las radiografías digitales, se registraron en primer lugar imágenes secuenciales de cada perro entre sí mediante ImageJ (v 1.29; NIH; Bethesda, MD) usando el complemento TurboReg® con una técnica de rotación escalada. A continuación se calibraron los conjuntos de imágenes registradas usando una escala en gris externa con un 3^{er} grado de función polinómica. A continuación se señaló la zona del hueso que rodea el diente tratado, excluyendo el diente y el aire, y se registró la densidad promedio de la zona para cada imagen. De esta manera, se derivó objetivamente un número que representaba las "blancuras" del hueso que rodeaban las raíces de los dientes y estuvo disponible para el análisis. Se denominó este número la "puntuación de reactividad del hueso" y es una representación de la densidad del hueso promedio.
En la Figura 21 se muestran los resultados de este estudio. Las puntuaciones de hueso promedio para los animales en el grupo T02 disminuyeron, o se volvieron más blancas, tras el estímulo, hasta la semana 12 después del estímulo, cuando volvieron a los niveles pre-estímulo. También disminuyeron inicialmente las puntuaciones de reactividad del hueso promedio en el grupo T01 y T03, pareciendo a continuación recuperar casi los valores normales hasta la semana 12 después del estímulo, momento en el que divergieron. Los controles procedimentales en el grupo T03 se volvieron más blancos, mientras que los animales vacunados en el grupo T01 mantuvieron un valor promedio similar al delo niveles pre-estímulo. De esta manera, los perros que recibieron la vacuna fueron capaces de recuperar la densidad del hueso más rápidamente que los perros no vacunados de cara a un estímulo endodóntico. Adicionalmente, el análisis del suero recogido en cada uno de los puntos de observación indicó que los animales que recibieron la vacuna generaron altas valoraciones de anticuerpos contra las cepas de la vacuna y tuvieron un aumento de la reactividad cruzada al anticuerpo frente a la cepa del estímulo (no se muestran los datos).
Las radiografías se volvieron más blancas tras el estímulo, en oposición a más oscuras, la dirección más intuitiva en el caso de las infecciones de hueso. El hueso reacciona a la inflamación y a la infección de una manera doble, con una pérdida de la matriz de hueso así como aumentando el hueso que la rodea para "separar con un muro" la dispersión de la infección. Las lesiones líticas-escleróticas mezcladas son típicas de aquellas que se observan con diversas infecciones óseas, pero están influenciadas por 1) la virulencia del patógeno, 2) la edad del animal, 3) la genética del animal, y 4) la cantidad de trauma asociado con la instigación de la inflamación. Los animales usados en este estudio eran jóvenes (10-14 meses de edad), y tenían trauma significativo en el diente y el hueso que lo rodeaba asociado con el procedimiento del estímulo. Estos factores, cuando se tienen en cuenta junto con lo que se sabe con respecto a cómo reacciona el hueso a la infección y a la inflamación, pueden explicar porqué hubo un aumento en la densidad del hueso que lo rodeaba.
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Ejemplo 4 Eficacia de la vacuna en el modelo de estímulo canino
Este estudio de eficacia de la vacuna fue similar en el diseño al descrito en el Ejemplo 3. Cada grupo de tratamiento contenía diez animales. Se vacunaron y estimularon los perros del grupo T01; el grupo T02 recibió una vacunación de simulación antes del estimulo, y los perros del grupo T03 se vacunaron con la simulación y se estimularon con la simulación. Cada vacuna contenía P. gulae cepa B43, P. salivosa cepa B104, y O. denticanis cepa B106, inactivadas con formalina, a una concentración de 1 x 10^{7} UFC de cada cepa por dosis. El calendario de vacunación era idéntico al que se muestra en el Ejemplo 3. El inóculo de estímulo fue P. gulae cepa B69, administrada tres semanas después de la tercera vacunación. Se tomaron radiografías de nuevo a intervalos de 3 semanas, pero sólo hasta nueve semanas después del estímulo, y se analizaron de una manera similar a la descrita en el Ejemplo 2. La Figura 22 indica los resultados del análisis de reactividad del hueso.
En este estudio, los animales reaccionaron al procedimiento de estímulo con una disminución de las puntuaciones promedio de reactividad del hueso. Esto significa que las radiografías se volvieron más oscuras, correspondiendo a una disminución en la densidad del hueso (Figura 23). Aunque las radiografías indicaron lesiones significativas en ambos grupos T01 y T02, el hueso en los animales no vacunado fue mucho menos denso globalmente que el hueso en los vacunados. A las nueve semanas, las puntuaciones promedio de reactividad del hueso de los perros no vacunados del grupo T02 fueron significativamente diferentes que las del grupo T01 vacunado (p = 0,05). Los perros en este estudio eran uniformemente más viejos que los del Ejemplo 2, y la experiencia del operario mejoró mucho. Se postula que estos factores contribuyeron a que las reacciones fueran más normales que las asociadas con las infecciones óseas, esto es, una disminución en la densidad del hueso. De esta manera, el modelo endodóntico de la periodontitis canina es una herramienta novedosa y útil para estudiar la periodontitis. No sólo esto es de valor en los estudios de vacunación/estímulo asociados con la evaluación de la vacuna, sino que podría emplearse también en estudios de terapia antimicrobiana y tópica.
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Ejemplo 5 Evaluación de la reactividad sistémica y local a la vacuna
Se emprendió una evaluación de las reacciones sistémicas y locales del tejido a l vacuna trivalente en combinación con otras vacunas administradas a perros. Se vacunaron IM dos grupos de perros, de aproximadamente 6 semanas de edad en el inicio del estudio a las 6, 9 y 12 semanas de edad. Se recogieron muestras de sangre antes de cada vacunación. Se examinaron todos los perros diariamente para las reacciones sistémicas y locales durante 1 semana después de cada vacunación. Igualmente, se determinaron las temperaturas corporales y se registraron en estos días. Se vacunó el grupo T01 con una combinación de la bacterina trivalente (preparada tal como se describe en los Ejemplos 3 y 4) a una concentración de 3 x 10^{8} UFC del antígeno total y adyuvada con Quil A y colesterol a 50 \mug de cada uno por dosis, y los siguientes componentes víricos vivos y muertos modificados: Virus del Moquillo Canino (VMC), Adenovirus-2 canino (AVC-2), Parvovirus Canino (PVC), Virus de la Parainfluenza Canina (PIC), y Coronavirus Canino (CVC). El grupo T02 recibió la bacterina trivalente a una concentración de 3 x 10^{6} UFC y la misma combinación de componentes víricos. Los resultados en la Figura 24 ilustran que la vacuna trivalente, cuando se añade a una combinación de componentes víricos normalmente administrados a cachorros, no produce reacciones sistémicas o locales adversas en los grupos de ensayo.
<110> Hardham, John M.
\hskip1cm King, Kendall W.
\hskip1cm Krishnan, Rajendra
\hskip1cm Dreir, Kimberley J.
\hskip1cm Haworth, John David
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<120> VACUNA PARA ENFERMEDAD PERIODONTAL
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<130> PC32761A
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<140>
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<141>
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<160> 169
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: D0056
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<400> 1
\hskip1cm71 
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<210> 2
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<211> 19
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: D0057
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm72 
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<210> 3
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: PFZ175-AP1
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<400> 3
\hskip1cm73 
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<210> 4
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: PFZ175-AP2
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<400> 4
\hskip1cm74 
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<210> 5
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: PFZ175-AP3
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<400> 5
\hskip1cm75 
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<210> 6
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: D0067
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<400> 6
\hskip1cm76 
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<210> 7
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: D0068
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm77 
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<210> 8
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: D0078
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<400> 8
\hskip1cm78 
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<210> 9
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: D0097
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<400> 9
\hskip1cm79 
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<210> 10
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<211> 34
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: D0098
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<400> 10
\hskip1cm80 
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<210> 11
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: PFZ185-AP1
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<400> 11
\hskip1cm81 
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<210> 12
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: PFZ185-AP2
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<400> 12
\hskip1cm82 
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<210> 13
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: PFZ185-AP3
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<400> 13
\hskip1cm83 
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<210> 14
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: PFZ185-AP4
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<400> 14
\hskip1cm84 
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<210> 15
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: PFZ186-AP1
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<400> 15
\hskip1cm85 
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<210> 16
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: PFZ186-AP2
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<400> 16
\hskip1cm86 
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<210> 17
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: PFZ186-AP3
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<400> 17
\hskip1cm87 
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<210> 18
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: PFZ186-AP4
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<400> 18
\hskip1cm88 
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<210> 19
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: PFZ186-AP5
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: PFZ187-AP1
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: PFZ187-AP2
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: PFZ187-AP3
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: PFZ187-AP4
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: PFZ187-AP9
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: PFZ209-AP2
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: PFZ209-AP3
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: PFZ211-AP1
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: PFZ211-AP2
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: D122
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: D123
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia del polinucleótido del ARNr de 16S de P. gulae B43
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia del polinucleótido del ARNr de 16 s de P. cansulci B46
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<211> 573
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia del polinucleótido del ARNr de 16S de P. circumdentaria B52
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<211> 573
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia del polinucleótido del ARnr de 16S de P. gulae B69
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia del polinucleótido del ARNr de 16S de P. circumdentaria B97
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<211> 571
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia del polipéptido de OprF de P. cangingivalis B98
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia del polipéptido de OprF de P. salivosa B104
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia del polipéptido de OprF de P. denticanis B106
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia del polipéptido de OprF de P. endodontalis B114
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial; Fragmento de la secuencia nº 1 del polipéptido de FimA de P. gulae B43
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Fragmento de la secuencia nº 2 del polipéptido de FimA de P. gulae B43
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Fragmento de la secuencia nº 3 del polipéptido de FimA de P. gulae B43
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Fragmento de la secuencia nº 1 del polipéptido OprF de P. gulae b43
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Fragmento de la secuencia nº 2 del polipéptido de OprF de P. gulae b43
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial; Fragmento de la secuencia nº 3 del polipéptido de OprF d P. gulae B43
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<223> Descripción de la Secuencia artificial: secuencia del polipéptido aminoterminal de pBAD-HisA
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<223> Descripción de la Secuencia artificial: secuencia del polipéptido aminoterminal de pBAD-TOPO
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial; Secuencia del polipéptido aminoterminal del vector 1
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<223> Descripción de la Secuencia artificial: secuencia del polinucleótido del ARNr de 16S de O. denticanis B107
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia del polinucleótido del ARNr de 16S de O. denticanis B113
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial; Secuencia del polinucleótido del ARNr de 16S de O. denticanis B126
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia del polinucleótido del ARNr de 16S de O. denticanis B129
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial; Secuencia del polinucleótido del ARNr de 16S de O. denticanis B135
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia del polipéptido del ARNr de 16S de O. denticanis B140
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia del polinucleótido del ARNr de 16S de O. denticanis B150
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia del polinucleótido del ARNr de 16S de O. denticanis B152
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia del polinucleótido del ARNr de 16S de O. denticanis B155
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia del polinucleótido del ARNr de 16S de O. denticanis B163
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia del polinucleótido del ARNr de 16S de O. denticanis B171
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia del polinucleótido del ARNr de 16S de O. denticanis B381
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<400> 163
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248
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia del polinucleótido del ARNr de 16S de O. denticanis B401
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<221> misc_feature
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<222> (20)..(20)
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<223> n es a, c, g, o t
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<222> (545)..(545)
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<223> n es a, c, g, o t
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<211> 564
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<212> ADN
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia del polinucleótido del ARNr de 16S de O. denticanis B417
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<400> 165
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia del polinucleótido del ARNr de 16S de O. denticanis B418
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<221> misc_ feature
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<222> (2)..(2)
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia del polinucleótido del ARNr de 16S de O. denticanis B421
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia del polinucleótido del ARNr de 16S de O. denticanis B422
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<400> 168
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<400> 169
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Claims (5)

1. Una vacuna para tratar o prevenir la enfermedad periodontal en animales de compañía que comprende preparaciones de células completas inactivadas de P. gulae B43, P. salivosa B104 y O. denticanis BI 06 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
2. La vacuna de la reivindicación 1, en la que las bacterias se inactivan mediante formalina.
3. La vacuna de la reivindicación 1, que comprende además al menos uno del Virus del Moquillo Canino (VMC), Adenovirus-2 Canino (AVC-2), Parvovirus canino (PVC), Virus de la parinfluenza canina (PCI), o Coronavirus Canino (CVC).
4. Uso de una vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir la enfermedad periodontal en animales de compañía necesitados del mismo.
5. Un kit que comprende, en al menos un envase, una composición para tratar y prevenir la enfermedad periodontal en animales de compañía que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y preparaciones de células completas inactivadas de P. gulae B43, P. salivosa B104 y O. denticanis B106; en el que el kit comprende además un conjunto de instrucciones impresas que indican que el kit es útil para tratar o prevenir la enfermedad periodontal en animales de compañía.
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Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8129500B2 (en) * 1997-12-10 2012-03-06 Csl Limited Porphyromonas gingivalis polypeptides and nucleotides
US7378101B2 (en) * 2001-12-21 2008-05-27 Pfizer, Inc. Vaccine for periodontal disease
US7682619B2 (en) 2006-04-06 2010-03-23 Cornell Research Foundation, Inc. Canine influenza virus
US9181592B2 (en) * 2007-03-30 2015-11-10 Case Western Reserve University Method for detecting a bacterial pathogen
WO2008137506A2 (en) * 2007-05-01 2008-11-13 Mars Incorporated Methods and kits for dog plaque disease
JP2009173558A (ja) * 2008-01-22 2009-08-06 Gen Corp:Kk 抗イヌ歯周病組成物
US8691502B2 (en) 2008-10-31 2014-04-08 Tremrx, Inc. T-cell vaccination with viral vectors via mechanical epidermal disruption
SG179037A1 (en) * 2009-09-10 2012-04-27 Merial Ltd New vaccine formulations comprising saponin-containing adjuvants
CN102639148A (zh) * 2009-12-01 2012-08-15 英特维特国际股份有限公司 灭活的家禽疫苗
WO2012151272A2 (en) * 2011-05-02 2012-11-08 Tremrx, Inc. T-cell vaccination with viral vectors via mechanical epidermal disruption
EP2586461A1 (en) 2011-10-27 2013-05-01 Christopher L. Parks Viral particles derived from an enveloped virus
JP6108553B2 (ja) * 2011-12-13 2017-04-05 学校法人麻布獣医学園 Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｕｌａｅの線毛タイプ
US9347065B2 (en) 2012-03-29 2016-05-24 International Aids Vaccine Initiative Methods to improve vector expression and genetic stability
WO2015190589A1 (ja) * 2014-06-13 2015-12-17 学校法人麻布獣医学園 イヌの僧帽弁閉鎖不全症のリスク診断
JP2018154574A (ja) * 2017-03-16 2018-10-04 合同会社チューモス 点眼ワクチン及び免疫誘導方法
MA50363A (fr) 2017-10-12 2020-08-19 Vaxcyte Inc Vaccin contre la parodontite et compositions associées et procédé d'utilisation
US12403187B2 (en) 2018-12-31 2025-09-02 Bellevacc As Bacterial vaccine
CN112533623A (zh) 2019-07-04 2021-03-19 株式会社索辛 动物用的口腔用组合物及使用了它的动物用的牙周病预防剂、传染病预防剂及口臭预防剂
US10973908B1 (en) 2020-05-14 2021-04-13 David Gordon Bermudes Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine
US12537071B1 (en) 2020-07-22 2026-01-27 David Gordon Bermudes Bacteria having boolean control pathways expressing therapeutic proteins including immunotherapeutic cytotoxins
CN116751292B (zh) * 2023-07-31 2024-05-14 河南大学 牙龈卟啉单胞菌Mfa1单克隆抗体及其应用

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59128338A (ja) * 1982-12-08 1984-07-24 Kitasato Inst:The 歯周炎予防用ワクチン及びその製法
JPH0662431B2 (ja) 1984-12-14 1994-08-17 ライオン株式会社 歯周炎予防用経口ワクチン
US5536497A (en) * 1992-12-21 1996-07-16 The Research Foundation Of State University Of New York Fimbrial polypeptides useful in the prevention of periodontitis
JPH0797395A (ja) 1993-09-28 1995-04-11 Kyowa Medex Co Ltd ポルフイロモナス・ジンジバリス線毛蛋白質の配列を含有するペプチド類及びその用途
EP0726314A4 (en) 1993-10-08 1998-04-22 Lion Corp FIMBRILLIN PROTEIN FROM -i (PORPHYROMONAS GINGIVALIS)
US5563063A (en) 1995-08-30 1996-10-08 Nihon University (Educational Foundation) Porphyromonas crevioricanis species of microorganism
US5710039A (en) 1995-08-30 1998-01-20 Nihon University (Educational Foundationn) Porphyromonas gingivicanis strain ATCC 55562
AUPQ137699A0 (en) * 1999-07-02 1999-07-22 University Of New England, The Control of acidosis
AUPQ718200A0 (en) 2000-04-28 2000-05-25 Csl Limited Porphyromonas gingivalis recombinant proteins and truncations
US7378101B2 (en) * 2001-12-21 2008-05-27 Pfizer, Inc. Vaccine for periodontal disease
US7468185B2 (en) * 2001-12-21 2008-12-23 Pfizer Inc. Vaccine for periodontal disease

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