ES2326076T3 - Procedimiento de proteccion de un grupo tiol en un anticuerpo. - Google Patents
Procedimiento de proteccion de un grupo tiol en un anticuerpo. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2326076T3 ES2326076T3 ES03780938T ES03780938T ES2326076T3 ES 2326076 T3 ES2326076 T3 ES 2326076T3 ES 03780938 T ES03780938 T ES 03780938T ES 03780938 T ES03780938 T ES 03780938T ES 2326076 T3 ES2326076 T3 ES 2326076T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- antibody
- baselineskip
- activity
- molecule
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
- C07K1/061—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups
- C07K1/066—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups for omega-amido functions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/006—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length of peptides containing derivatised side chain amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
- C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Un método para protección de un grupo tiol en un anticuerpo que tiene un radical de cisteína libre, que comprende la adición de un compuesto que tiene un enlace disulfuro en la molécula y no ejerce sustancialmente influencia sobre la actividad del anticuerpo, donde el compuesto que tiene un enlace disulfuro en la molécula y no ejerce sustancialmente influencia sobre la actividad del anticuerpo es cistina, homocistina, ácido lipoico, glutation oxidado o disulfuro de glutation.
Description
Procedimiento de protección de un grupo tiol en
un anticuerpo.
La presente invención se refiere a un método
para la formación de manera efectiva y eficaz un anticuerpo por
protección de un grupo tiol en un anticuerpo que tiene un radical de
cisteína libre.
Se sabe que cuando están presentes radicales de
cisteína libres en una proteína, se forma un enlace disulfuro entre
moléculas a través de los grupos tiol de los radicales de cisteína
libres causando la polimerización de las proteínas. Además, se sabe
también que el grupo tiol del radical de cisteína libre es apto para
generar reacción de intercambio con el enlace disulfuro formado en
una molécula o entre moléculas, y los radicales cisteína libres son
aptos para sufrir cierta modificación.
Dado que tal polimerización, modificación o
intercambio interfiere con la formación de una estructura de orden
superior preferible de una proteína o genera un cambio en el punto
activo de la proteína, puede ser causa de reducción de actividad de
la proteína.
La reacción del radical de cisteína libre antes
descrita tiene lugar frecuentemente en el tiempo de la purificación
o conservación de una proteína. Para evitar tal reacción, se ha
llevado a cabo convencionalmente un método en que el pH de una
solución de proteína se mantiene en condición ácida. o se le añade
un antioxidante tal como cisteína,
2-mercaptoetanol. ditiotreitol, ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido ascórbico o similares
(Seikagaku Jiten (Biochemical Dictionary), 3ª edición, editado por
Tokyo Kagaku Dojin, página 182b).
Sin embargo, para mantener el pH de una solución
de proteína en la condición ácida, los disolventes y agentes tampón
que se pueden utilizar en la purificación de la proteína son
limitados, de manera que se considera que tal limitación da por
resultado una reducción de la eficacia de la purificación. Además,
la adición de un antioxidante a un disolvente o agente tampón en el
tiempo de la purificación o conservación tiene también el problema
de no poder obtenerse suficiente efecto del control de reacción, no
poder evitarse la polimerización después de la separación del
antioxidante, o similar.
Según esto, se puede considerar el desarrollo de
un método en que el grupo tiol de un radical de cisteína quede
protegido por su modificación con un cierto compuesto. Entre los
ejemplos de reactivo para modificar el grupo tiol de un radical de
cisteína de una proteína se incluyen 1) agentes oxidantes tales
como 5',5-ditiobis(ácido
2-nitrobenzoico) (DTNB), sulfuro de
2,2'(4,4')-dipiridilo, ácido tetratiónico,
2,6-diclorofenolindofenol (DCIP) y glutation
oxidado, 2) agentes que forman mercáptido tal como ácido
p-mercuribenzoico (PMB) y ácido
p-mercuribenzosulfónico (PMBS), y 3) agentes
alquilantes tales como ácido yodoacético, yodoacetamida y
N-etilmaleimida (NEM) (Seikagaku. Jiten
(Biochemical Dictionary), 3ª edición, editado por Tokyo Kagaku
Dojin, p. 182b). Sin embargo, dado que estos se utilizan con el
propósito de modificar un grupo tiol de una enzima SH o similar que
requiere un grupo tiol como factor esencial para su actividad,
cuando se utiliza tal reactivo con la intención de proteger un
grupo tiol libre que no está implicado en la actividad de una
proteína, el resultado es por el contrario la obstrucción de la
formación de estructura de orden superior de la proteína, lo que
ejerce frecuentemente una influencia sobre la actividad de la
proteína. Por otra parte, incluso en el caso que no ejerza
influencia en la actividad de una proteína, a veces aparece el
problema, cuando la proteína se usa como medicamento, de tener que
eliminar a fondo el reactivo remanente. Según esto, cuando se
utiliza tal reactivo con el propósito de proteger el grupo tiol
libre en una proteína, se prefiere utilizar los que pueden emplearse
como aditivos farmacéuticos.
Además, cuando se produce una proteína para
aplicarla a un medicamento, se prefiere utilizar un medio de cultivo
libre de suero, sin utilizar suero. Sin embargo, cuando no se
utiliza suero en el cultivo de células animales, esto
frecuentemente da lugar al caso de que no puede aportarse el
suplemento de componentes necesario para mantener suficientemente
las funciones de la célula de manera que no puede asegurarse una
proteína suficientemente útil, y también da lugar a que la proteína
producida cambie delicadamente físicamente, bioquímicamente o
biológicamente de la proteína de interés, dando lugar a problemas
como, por ejemplo, la formación de un polímero y similares.
Seikagaku Jiten (Biochemical Dictionary),
3ª edición, editado por Tokyo Kagaku Dojin, p. 182b.
Patente europea EP-A- 0 943 690
se refiere a un método industrial de producción de activina A humana
que comprende el re-plegado de una activina A
humana modificada producida por un microorganismo en activina A
humana de la forma natural que tiene actividad biológica.
La Patente internacional WO 90/13310 se refiere
al tratamiento de factor de crecimiento de fibroblastos básico
(bFGF) con disulfuros orgánicos, preferiblemente disulfuro de
glutation o con compuestos inorgánicos de función similar que da
por resultado una composición de bFGF de estabilidad potenciada y
resistencia a multimerización.
La Patente estadounidense US 6.342.585 se
refiere a un método para formar un disulfuro mixto de proteínas
recombinantes por solubilización con un agente desnaturalizante en
la presencia de un componente disulfuro y adición entonces de un
componente disulfuro y un agente desnaturalizante a una
concentración suficiente para formar un disulfuro mixto.
Los objetos de la presente invención son los de
establecer un método para formar eficiente y eficazmente una
proteína por protección de un grupo tiol en una proteína que tiene
un radical de cisteína libre, y proporcionar un medicamento que
contiene la proteína. Según la invención, la proteína mencionada a
lo largo de la solicitud es un anticuerpo.
Según esto, los autores de la presente invención
han completado la presente invención llevando a cabo estudios sobre
los agentes para protección del radical de cisteína libre y estudios
sobre las condiciones de reacción, y por resolución de tales
problemas a través de un análisis en profundidad de los productos de
reacción.
Según esto, la presente invención es tal como se
define en las reivindicaciones 1-14.
La Figura 1 es un gráfico que muestra el efecto
de inhibición de la polimerización de un F(ab')_{2} de
anticuerpo GAH por cultivo libre de suero y la influencia del
pH.
La Figura 2 es un gráfico que muestra el efecto
de inhibición de la polimerización de un F(ab')_{2} de
anticuerpo GAH por cultivo libre de suero y la influencia de la
temperatura de reacción.
La Figura 3 es un gráfico que muestra el efecto
de inhibición de la polimerización de un (F(ab')_{2} de
anticuerpo GAH por cultivo libre de suero y la influencia de la
concentración de cisteína.
La Figura 4 es un gráfico que muestra un
cromatograma de intercambio de catión antes de la activación de un
anticuerpo GH completo.
La Figura 5 es un gráfico que muestra un
cromatograma de intercambio de catión después de la activación de
un anticuerpo GAH completo purificado.
La Figura 6 es un gráfico que muestra un
cromatograma de intercambio de catión después del tratamiento de
inhibición de la polimerización de un anticuerpo GAH completo
purificado.
La Figura 7 es un gráfico que muestra un
cromatograma de intercambio de catión de un anticuerpo GAH completo
purificado desalificado y concentrado después de tratamiento de
inhibición de polimerización de un anticuerpo GAH completo
purificado.
La Figura 8 es un gráfico que muestra el
cromatograma de intercambio de catión F(ab')_{2} de
anticuerpo GAH purificado.
La presente invención se describe a continuación
con detalle.
En la presente invención, los compuestos que
tienen un enlace disulfuro en la molécula y que no ejercen
substancialmente influencia en la actividad de la proteína son
cistina, homocistina, ácido lipoico, glutation oxidado y disulfuro
de glutation, prefiriéndose la cistina. Puede servir de ejemplo
también un método en el que los compuestos que tienen grupos tiol
en las moléculas y no ejercen substancialmente ninguna influencia
sobre la actividad de la proteína se añaden simultánea o
separadamente.
En la presente invención, entre los ejemplos del
compuesto que tiene un grupo tiol en la molécula y no ejerce
substancialmente ninguna influencia sobre la actividad de la
proteína se incluyen cisteína, homocisteína, glutation y ácido
dihidrolipoico, y es particularmente preferida la cisteína.
En la presente invención, la expresión "el
compuesto que no ejerce substancialmente influencia sobre la
actividad de la proteína" significa que no incrementa ni reduce
la actividad de la proteína. Como la proteína es un anticuerpo,
puede ser un ejemplo un caso en el cual la reactividad de la
reacción antígeno-anticuerpo no se incrementa.
La proteína de la presente invención se
caracteriza porque tiene un radical de cisteína libre en su
estructura molecular. El término "libre", tal como aquí se
emplea significa un estado en que el radical de cisteína que tiene
un electrón desparejado, es inestable y es alto en reactividad.
Además, es más preferible que el grupo tiol del radical de cisteína
sea alto en reactividad.
Con respecto al grupo tiol de la presente
invención, puede servir de ejemplo el caso en que esté implicado
directa o indirectamente en la actividad de la proteína, siendo más
preferido el caso con implicación directa. Ejemplos de la actividad
de la proteína tal como aquí se emplea incluyen la reactividad en
una reacción antígeno-anticuerpo y la reactividad
en una reacción de enzima. Entre los ejemplos de implicación
directa se incluye el caso en que la actividad de la proteína se
reduce cuando el grupo tiol es modificado con, por ejemplo, un
reactivo modificador. Por otra parte, un ejemplo de implicación
directa es el caso en que la actividad de la proteína se reduce
debido a la interrupción de la formación de la estructura de orden
más alto por modificación del grupo tiol.
Como protección en la presente invención, un
ejemplo puede ser la inhibición de la polimerización, modificación
o intercambio que ejerce una influencia substancial sobre la
actividad de la proteína. Más específicamente, entre los ejemplos
se incluye la inhibición de la formación de un polímero debido a la
formación de un enlace disulfuro entre proteínas vía grupos tiol,
inhibición de la modificación de un radical de cisteína libre, e
inhibición de la reacción de intercambio con un enlace disulfuro
formado en una molécula o entre moléculas por los grupos tiol de
los radicales de cisteína libres. La inhibición de formación de un
polímero debido a la formación de un enlace disulfuro entre
proteínas vía grupos tiol es más preferido. En este caso, tiene
lugar una reacción de intercambio tiol-disulfuro de
la reacción dada a continuación a través de la reacción de un
compuesto que tiene un enlace disulfuro, tal como cistina, con el
grupo tiol de una proteína que tiene un radical libre cisteína.
(I)Pr-SH +
R-S-S-R \hskip0,3cm
\rightarrow \hskip0,3cm
Pr-S-S-R +
R-SH
(Pr representa una proteína y R
representa un radical distinto a los grupos
funcionales).
Según esto, dado que el
Pr-S-S-R formado por
la reacción está establemente presente incluso después de la
eliminación de
R-S-S-R, se inhibe
la reacción vía Pr-SH, tal como polimerización de
proteínas.
Además, en tal método, el compuesto que tiene un
enlace disulfuro en la molécula y no ejerce substancialmente
influencia sobre la actividad de la proteína puede añadirse en
cualquier estadio de tiempo de la producción de proteína. Por
ejemplo, cuando esto se lleva a cabo utilizando un anticuerpo GAH
mostrado en los siguientes Ejemplos, los ejemplos incluyen los
métodos en que se añade cistina a los productos finales purificados
de F(ab')_{2} (Ejemplos 1 a 3) o inmediatamente después de
la activación del anticuerpo completo (Ejemplos 4 a 6).
En los métodos de la presente invención se
utiliza un disolvente. Aunque el disolvente no está particularmente
limitado, se prefiere un líquido capaz de dar lugar a intercambio
del grupo tiol de un radical de cisteína en una proteína con
disulfuro de cistina. Específicamente, es adecuado un agente tampón
de débilmente ácido a alcalino, preferiblemente un agente tampón de
neutro a ligeramente alcalino.
La concentración del compuesto de adición que
tiene un enlace disulfuro en la molécula y no ejerce
substancialmente influencia sobre la actividad de la proteína no
está particularmente limitada, pero en el caso de cistina, por
ejemplo, se prefiere una concentración de cistina capaz de dar lugar
a intercambio del grupo tiol de radical de cisteína de una proteína
con disulfuro de cistina. Específicamente, es adecuada una
concentración de 0,01 a 100 mM, preferiblemente de 0,1 a 10 mM.
Aunque la concentración de proteína no está
particularmente limitada, se prefiere una concentración capaz de
dar lugar a intercambio del grupo tiol de un radical de cisteína de
una proteína con disulfuro de un compuesto que tiene un enlace
disulfuro en la molécula y no ejerce substancialmente influencia
sobre la actividad de la proteína. Específicamente, es adecuada una
concentración de 0,01 a 1.000 mg/ml, preferiblemente de 0,1 a 100
mg/ml.
Aunque la temperatura de reacción no está
particularmente limitada, se prefiere, por ejemplo, una temperatura
capaz de dar lugar a intercambio del grupo tiol de un radical de
cisteína de una proteína con disulfuro de cistina como compuesto
que tiene enlace disulfuro en la molécula y no ejerce
substancialmente ninguna influencia sobre la actividad de la
proteína. Específicamente, es adecuada una temperatura de -20 a
60ºC, preferiblemente de 0ºC a 50ºC.
Además, incluso cuando un compuesto que tiene un
grupo tiol, tal como cisteína, está presente junto con una proteína
en tal método, tiene lugar la reacción de (I) por la adición de
cistina en exceso. Por ejemplo, como se describe en WO 03/048357,
respecto a una proteína producida utilizando un medio libre de
suero, se da el caso en que no puede asegurarse una proteína con
suficiente actividad debido a suministro insuficiente de
componentes necesarios para mantener funciones de la célula que
produce proteína. En ese caso, se puede llevar a cabo un
tratamiento de la proteína con cisteína o similar, pero, como se
muestra en los siguientes Ejemplos, la inhibición de la
polimerización de anticuerpo GAH se puede llevar a cabo también
inmediatamente después de la activación del anticuerpo completo por
cisteína (Ejemplo 4).
Entre los ejemplos de polimerización de la
presente invención se incluyen un cambio en la estructura de una
proteína a orden más alto, un cambio en la actividad de la proteína,
y formación de un dímero, un trímero y similar, que tiene lugar
cuando la proteína forma un enlace disulfuro intermolecular vía
grupos tiol. Se prefiere un cambio en la actividad de proteína y
formación de dímero y trímero, y más preferida es la formación de
un dímero y un
trímero.
trímero.
Entre los ejemplos de la modificación en la
presente invención se incluye un cambio en la estructura de una
proteína a orden más alto, un cambio en la actividad de la proteína
y similar, que tiene lugar cuando un compuesto capaz de ejercer una
influencia substancial sobre la actividad se une al grupo tiol de
una proteína que tiene un radical de cisteína libre.
Preferiblemente, puede servir de ejemplo un cambio en la actividad
de proteína.
Entre los ejemplos de intercambio de la presente
invención se incluyen un cambio en la estructura de una proteína a
un orden más alto, un cambio en la actividad de la proteína y
similares, que tiene lugar cuando el grupo tiol de una proteína que
tiene un radical cisteína libre forma un enlace
tiol-disulfuro en una molécula o entre moléculas de
la proteína. Preferiblemente, el ejemplo es un cambio en la
actividad de la proteína.
La proteína recombinante de la presente
invención es un anticuerpo.
Entre los ejemplos del anticuerpo de la presente
invención se incluyen anticuerpos completos (anticuerpo completo,
en toda su longitud), fragmentos de anticuerpo (fragmentos de
anticuerpo tales como F(ab'), F(ab')_{2} y scFv
(anticuerpo de una sola cadena)) y derivados de anticuerpo, y el
más preferido es anticuerpo F(ab')_{2}.
Un ejemplo de anticuerpo monoclonal de la
presente invención es un anticuerpo que comprende las secuencias de
aminoácidos representadas por SEQ ID Nos.: 1, 2 y 3 en la Lista de
Secuencias en su región hipervariable de cadena pesada, y las
secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID Nos.: 4, 5 y 6 en
la Lista de Secuencias en su región hipervariable de cadena ligera.
Generalmente estas secuencias de aminoácidos están contenidas,
respectivamente, en tres regiones hipervariables de cada cadena de
la cadena pesada y cadena ligera, en el orden de SEQ ID Nos.: 1, 2
y 3 y SEQ ID Nos.: 4, 5 y 6 comenzando desde el lado de terminal N.
La región hipervariable determina la especificidad de la
inmunoglobulina como anticuerpo y la afinidad de unión de un
determinante antigénico con el anticuerpo, y se llama también
región determinante de la complementariedad. Según esto, las
regiones distintas a esta región hipervariable pueden derivar de
otro anticuerpo. Es decir, en los anticuerpos monoclonales que
pueden emplearse en la presente invención, se incluyen aquellos en
que la modificación parcial de aminoácidos, tal como sustitución,
inserción, supresión o adición, se realiza dentro de un intervalo en
el que no se deteriora la actividad de unión (reactividad) con
antígenos.
Ejemplos más específicos incluyen un anticuerpo
que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la
sentencia de aminoácidos representada por SEQ ID No.:7 en la Lista
de Secuencias y una región variable de cadena ligera que comprende
la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID No.: 8 en la
Lista de Secuencias, es decir el anticuerpo GAH. El anticuerpo GAH
es un anticuerpo monoclonal humano que se une específicamente a
cánceres analizados selectivamente basándose en la reactividad con
cáncer gástrico y cáncer del intestino grueso (EP526700 o
EP520499), y este anticuerpo se puede obtener por preparación de
hibridomas derivados de linfocitos derivados de paciente de cáncer
con células de mieloma de ratón, y seleccionando un hibridoma que
tiene las secuencias de aminoácido especificadas antes descritas, o
puede prepararse también por técnicas de ingeniería genética
(EP520499).
Cuando se compara con la posición de cisteína en
secuencias de aminoácidos humanas conocidas convencionalmente, el
anticuerpo GAH se caracteriza por la cisteína en posición 32 en SEQ
ID No.:7 de la Lista de Secuencias. Es decir, se considera que es
una cisteína libre que no está implicada en la formación de enlace
disulfuro en la molécula. Dado que el radical de cisteína
corresponde a la posición 4ª en la secuencia mostrada en SEQ ID
No.:1 de la Lista de Secuencias y está situada en una región
hipervariable de cadena pesada, se considera que está implicada en
la unión con su antígeno.
Entre los ejemplos de medio libre de suero en
la presente invención se incluyen aquellos medios que no contienen
sueros tales como suero bovino (fetal) en los componentes del medio.
Entre los ejemplos se incluyen el medio libre de suero CD CHO
(fabricado por Invitrogen) y ExCell 325-PF
(fabricado por JRH) descritos en los ejemplos siguientes, y
similares.
La presente invención proporciona un medicamento
que comprende, como ingrediente activo un anticuerpo obtenido por
el método de la presente invención, por ejemplo, una composición
farmacéutica que comprende la substancia antes descrita y un
vehículo farmacéuticamente aceptable, y proporciona una preparación
terapéutica que tiene diversas formas de dosificación. El término
"farmacéuticamente aceptable" significa que no tienen lugar
efectos secundarios indeseables, tales como náuseas, vértigo y
mareo, acompañando a la administración, respuesta inmune frente a
una preparación farmacéutica durante el tiempo de su administración
frecuente. Además, un anticuerpo preparado por unión de una
sustancia, tal como una toxina, a la proteína de la presente
invención se puede utilizar también como medicamento. Entre los
ejemplos se incluyen aquellos en los que se une un anticuerpo a
liposoma, en que se encapsula un agente tal como un agente
antitumor, por ejemplo doxorubicina (EP526700, EP520499 y
EP1174126). El liposoma que contiene sustancia
anti-neoplásica unida a anticuerpo puede obtenerse
como preparaciones farmacéuticas por los métodos convencionales
conocidos tales como método de deshidratación (WO88/06441), un
método en el que se utiliza como soluciones por adición de un agente
estabilizante
(JP-A-64-9931), un
método de liofilización
(JP-A-64-9931) y se
puede administrar a pacientes por un método tal como administración
intravascular o administración tópica. La dosis se puede seleccionar
opcionalmente en respuesta a las clases de sustancia
anti-neoplásica como el ingrediente activo, y cuando
se administra liposoma encapsulada con doxorubicina, por ejemplo,
se puede utilizar a una dosis de 50 mg/kg o menos, preferiblemente
10 mg/kg o menos, más preferiblemente 5 mg/kg o menos, en términos
de la cantidad de ingrediente activo.
La presente invención se describe con detalle a
continuación sobre la base de Ejemplos, pero la presente invención
no queda limitada a los siguientes Ejemplos sin sobrepasar su
esencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1 de
producción
Se preparó un medio de cultivo por disolución de
4 mmoles de glutamina (fabricada por SIGMA) y 10 mg de insulina
(fabricada por SIGMA) en 1 litro de cada uno de los medios libres de
suero: CD CHO (fabricado por Invitrogen) y ExCell
325-PF (fabricado por JRH) y se llevo a cabo
filtración aséptica de la solución utilizando un filtro de 0,22
\mum en la parte de encima de un frasco (fabricado por Corning
Coaster). El medio de células así preparado se cargó asépticamente
en un matraz giratorio de 1 litro de capacidad (fabricado por
Belco) que ha sido esterilizado por anticipado utilizando un
autoclave (fabricado por Sakura Seiki), y el matraz se dispuso
sobre un dispositivo de control de cultivos (fabricado por Biott)
para ajustar la temperatura a 37ºC, y la concentración de oxígeno
disuelto a 3,0 mg/l, el pH a 7,4 y la velocidad de agitación a 60
rpm.
Un anticuerpo recombinante que produce célula
CHO 1-6R (véanse Ejemplos de EP520499) cultivada por
anticipado utilizando un frasco giratorio (fabricado por Falcon)
se trató con tripsina para desprender las células, se descartó el
sobrenadante después de la centrifugación y las células se lavaron
dos veces con el correspondiente medio libre de suero. Después de
esto, se suspendieron las células en el correspondiente medio libre
de suero y se inocularon asépticamente en un matraz giratorio de 1
litro de capacidad para que comenzase el cultivo. Después de la
inoculación, se realizó la toma de muestras y se midió la densidad
de células viables y la relación de supervivencia utilizando un
hemocitómetro para encontrar que había, respectivamente, CD CHO:
1,09x10^{5} células/ml y 82,3%, ExCell 325-PF:
0,87x10^{5} células/ml y 84,1%.
El cultivo se completó al cabo de 353 horas de
la inoculación, y se recuperó el medio de cultivo. El medio de
cultivo se centrifugó (3.000 rpm, 20 minutos) y luego se filtró
utilizando un filtro de 0,22 \mum encima de un frasco para
obtener aproximadamente 800 ml de un volumen sin purificar.
\vskip1.000000\baselineskip
Se dividió en dos aproximadamente 800 ml de cada
uno de los volúmenes sin purificar obtenidos en (1) y se sometió a
purificación por cromatografía en columna utilizando columna XK16
(diámetro interno 16 mm, fabricada por Amersham Bioscience) rellena
con 14,3 ml de resina Prosep-A (fabricada por
Millipore). Se introdujeron como alimentación el volumen sin
purificar y un agente tampón en la columna a una velocidad de flujo
de 14,3 ml/minuto, se llevaron a cabo aplicación y lavado por un
modo de flujo descendente, y la elución y regeneración por un modo
de flujo ascendente. La composición del agente tampón para lavado,
elución y regeneración era de tampón acetato 40 mM que contenía
NaCl 40 mM teniendo los valores respectivos de pH de 6,0, 4,0
y
2,7.
2,7.
De los volúmenes sin purificar de CD CHO y
ExCell 325-PF, se obtuvieron, respectivamente, 47,2
y 50,8 ml de soluciones que contenían anticuerpo completo (pH 4,0).
Cuando se midieron las cantidades del anticuerpo en esta solución
por fotometría de absorción ultravioleta, eran de 57 mg y 48 mg,
respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
En relación con el método de tratamiento de
activación, se puede utilizar WO 03/048357 como referencia.
Utilizando Centricon 30 (fabricado por Amicon),
se concentraron 20 mg de cada una de las soluciones del anticuerpo
completo obtenido en (2) utilizando medio CD CHO y medio EXCELL
325-PF a aproximadamente 1,7 ml. Se añadieron los
reactivos a 250 \mul (que corresponden a 3 mg) de este líquido
para obtener una composición de agente tampón
Tris-HCl 30 mM (pH 9) que contenía cloruro de sodio
1,6M, L-cisteína 2 mM y ácido ascórbico 12 mM en
las concentraciones finales, y la composición se ajustó a
aproximadamente 10 ml. Este líquido se dejó reposar a la
temperatura ambiente durante 16 horas y luego se ajustó a pH 4 por
adición de ácido trifluoroacético. El líquido se concentró
utilizando Centricon 30, y la composición líquida se reemplazó por
ácido acético al
0,05%.
0,05%.
\vskip1.000000\baselineskip
La muestra tratada por activación obtenida en
(3) se ajustó a pH 4,0 y se digirió entonces con pepsina. Es decir,
se añadió pepsina (fabricada por SIGMA) a lo anterior a una
concentración de 1,2 mg/g de GAH, seguido de filtración aséptica
utilizando filtro Mylex (fabricado por Milipore, 0,22 \mum) y se
agitó suavemente entonces durante 17 horas bajo calentamiento a
37ºC.
Después de la digestión con pepsina, se purificó
un (Fab')_{2} de anticuerpo GAH utilizando cromatografía de
columna de intercambio catiónico. Es decir, se rellenó la columna
XK16 se rellenó con 15,3 ml de una resina de intercambio catiónico
SP-Sepharose FF (fabricada por Amersham Bioscience),
y se le aplicó el líquido que contenía anticuerpo después de la
digestión de pepsina. Después, se llevó a cabo un lavado utilizando
tampón acetato 40 mM (pH 4,0) que contenía NaCl 20 mM, y el pico
del anticuerpo se fraccionó mientras se incrementaba la
concentración de sal. La velocidad de flujo era 1,58 ml/min. Los
volúmenes de las muestras de CD CHO y ExCell 325-PF
eran 10,5 ml y 11,6 ml, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se intentó la inhibición de la polimerización en
el F(ab')_{2} de anticuerpo GAH después del tratamiento de
la activación obtenida de acuerdo con el Ejemplo 1 de producción
utilizando medio ExCell 325-PF.
Se añadió una solución de cistina a una solución
de (F(ab')_{2} de anticuerpo GAH preparada a una
concentración de aproximadamente 5 mg/ml, a una concentración final
de 1 mM. En este caso, la solución de cistina se utilizó
disolviendo cistina en ácido clorhídrico 0,5 N a una concentración
de 40 mM.
Esta solución se dividió en dos, se añadió 1/4
de volumen de tampón fosfato de sodio 1 M (pH 7,5) a uno de ellos
(pH final 7,5), no se añadió nada al otro (pH final 4,7) y se
utilizaron como solución tratada de pH 7,5 con adición de cistina y
solución tratada de pH 4,7 con adición de cistina,
respectivamente.
Estas soluciones a las que se había añadido
cistina y una solución a la que no se había añadido cistina se
dejaron reposar a 37ºC durante 3 horas, y después se separó la
cistina utilizando una membrana de ultrafiltración de corte de peso
molecular nominal de 30 K, y el disolvente se reemplazó por tampón
acetato 20 mM (pH 4,7). Utilizando este estadio como inicial, se
llevó a cabo análisis de cromatografía HPLC de filtración de gel. A
continuación, se mezcló cada una de estas soluciones con ¼ de
volumen de tampón fosfato de sodio (pH 7,5) (pH final 7.5), seguido
de reposo a 37ºC durante 45 minutos, y se llevó a cabo análisis de
cromatografía HPLC de filtración de
gel.
gel.
\vskip1.000000\baselineskip
- Detector:
- Fotómetro de absorción ultravioleta (longitud de onda de medida: 215 nm).
- Columna:
- TSKgel G3000SW_{XL} (aproximadamente 8 mm de diámetro interno x aproximadamente 4 cm de longitud) fabricada por Tosoh.
- Pre-columna:
- TSKgel guardacolumna SWXL (aproximadamente 6 mm de diámetro interior x aproximadamente 4 cm de longitud) fabricada por Tosoh.
- Temp. de columna:
- temperatura constante de alrededor de 25ºC.
- Fase móvil:
- tampón fosfato de sodio 50 mM (pH 7,0)/sulfato de sodio 300 mM.
- Velocidad flujo:
- 0,3 ml/minuto.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados se muestran en la Figura 1. Al
principio, el contenido de monómero era 86 a 87% en cada una de las
soluciones: solución sin añadir cistina, solución tratada de pH 4,7
con cistina añadida y solución tratada de pH 7,5 con cistina
añadida. Cuando estos tres tipos de soluciones se ajustaron a pH 7,5
y se dejaron reposar a 37ºC durante 45 minutos, el contenido de
monómero de la solución sin añadir cistina se redujo a 73%,
mientras que el de la solución tratada de pH 4,7 con cistina añadida
era del 78% mostrando una ligera inhibición de polimerización.
Además, de que el de la solución tratada de pH 7,5 con cistina
añadida era del 87%, se inhibía completamente la
polimerización.
polimerización.
\newpage
De estos resultados se deduce que el pH de la
reacción en el tiempo de la adición de cistina era bueno en el
intervalo neutro como en el ácido.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se intentó la inhibición de la polimerización
sobre el (F(ab')_{2} de anticuerpo GAH después del
tratamiento de activación de acuerdo con el Ejemplo de Producción 1
utilizando medio ExCell 325-PF.
Se añadió una solución de cistina a una solución
de F(ab')_{2} de anticuerpo GAH preparada a una
concentración de aproximadamente 5 mg/ml, a una concentración final
1mM. En este caso, se utilizó la solución de cistina preparada por
disolución de cistina en ácido clorhídrico 0,5N a una concentración
de 40 mM.
Esta solución se mezcló con 1/4 de volumen de
tampón fosfato de sodio 1M (pH 7.5) (pH final 7.5) se dividió en
dos partes, y una de las partes se dejó reposar a 37ºC durante 3
horas y la otra a 4ºC durante un día entero y una noche. Se
utilizaron como solución tratada, de 37ºC, con cistina añadida y
solución tratada, de 4ºC, con cistina añadida, respectivamente.
Se separó la cistina de estos dos tipos de
soluciones y una solución sin cistina añadida utilizando una
membrana de ultrafiltración de corte de peso molecular nominal de
30 K, y el disolvente se reemplazó por tampón acetato 20 mM (pH
4,7). Utilizando este estadio como inicial, se llevó a cabo análisis
de HPLC de filtración de gel. A continuación, se mezclaron cada
uno de estos tres tipos de soluciones con ¼ de volumen de tampón
fosfato de sodio 1M (pH 7,5) (pH final 7,5), seguido de reposo a
37ºC durante 45 minutos, y después se llevó a cabo el análisis por
HPLC de filtración de gel.
\vskip1.000000\baselineskip
Las mismas que en el Ejemplo 1.
Los resultados se muestran en la Figura 2.
Inicialmente, el contenido de monómero era de 86 a 87% en cada una
de las soluciones: solución sin cistina añadida, solución tratada
de 37ºC con cistina añadida y solución tratada de 4ºC con cistina
añadida. Cuando estas soluciones se ajustaron a pH 7,5 y se dejaron
reposar a 37ºC durante 45 minutos, el contenido de monómero de la
solución sin cistina añadida se redujo a 73%, mientras que el de
la solución tratada de 37º con cistina añadida era 87% y el de la
solución tratada de 4ºC con cistina añadida era 86%, inhibiéndose
la polimerización completamente en ambos casos.
De estos resultados se deduce que la temperatura
de reacción en el momento de la adición de cistina era o bien 37ºC
o 4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se intentó la inhibición de polimerización sobre
F(ab')_{2} de anticuerpo GAH después de tratamiento de
activación obtenida de acuerdo con el Ejemplo de Producción
empleando medio ExCell 325-PF.
Se añadió una solución de cistina a una solución
de F(ab')_{2} de anticuerpo GAH preparada a una
concentración de aproximadamente 5 mg/ml, a una concentración final
de 1 mM ó 0,54 mM. En este caso, la solución de cistina se utilizó
por disolución de cistina en ácido clorhídrico 0,5N a una
concentración de 40 mM o 20 mM..
Cada una de estas soluciones se mezclaron con ¼
de volumen de tampón fosfato de sodio 1M (pH 7,5) (pH final 7,5), y
se utilizaron como tratamiento 1 mM y tratamiento 0,5 mM,
respectivamente.
Estos dos tipos de soluciones y una solución sin
cistina añadida se dejaron reposar a 4ºC durante un día y una noche
completos, y se separó entonces la cistina utilizando una membrana
de ultrafiltración de corte de peso molecular nominal de 30 K, y el
disolvente se reemplazó por tampón acetato 20 mM (pH 4,7).
Utilizando este estadio como inicial, se llevó a cabo análisis por
HPLC de filtración de gel. A continuación, se mezcló cada una de
estas soluciones con ¼ de volumen de tampón fosfato de sodio 1 M (pH
7,5) (pH final 7,5), se dejó reposar a 37ºC durante 45 minutos, y
se llevó a cabo entonces análisis de HPLC de filtración de gel.
\vskip1.000000\baselineskip
Las mismas que en el Ejemplo 1.
Los resultados se muestran en la Figura 3.
Inicialmente, el contenido de monómero era 86 a 87% en cada una de
las soluciones: la solución sin cistina añadida y la solución 1 mM
con cistina añadida, mientras que la solución de cistina añadida
0,5 mM tenía un valor ligeramente inferior a 84%. Cuando estas
soluciones se ajustaron a pH 7,5 y se dejaron reposar a 37ºC
durante 45 minutos, se redujo el contenido de monómero de la
solución sin cistina añadida a 73%, mientras el de la solución con
cistina añadida 1 mM era 86% y el de la solución de cistina añadida
0,5 mM era 84%, no mostrando ninguna cambio del inicial.
De estos resultados se deduce que el efecto
inhibidor de polimerización era ligeramente más alto por adición
de cistina a concentración 1 mM que a la concentración de 0,5
mM.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de producción
2
Se preparó un medio de cultivo celular por
disolución de un medio libre de suero ExCell 325-PF
(JRH) en 30 litros en total de agua mili-Q, se
disolvieron 4 mM de glutamina (fabricada por SIGMA), 1,6 g/l de
bicarbonato de sodio (fabricado por Invitrogen) y 10 mg/l de
insulina (fabricada por SIGMA) en lo anterior y llevando a cabo
filtración aséptica de la solución utilizando un filtro
Milli-pack 40 de 0,22 \mum (fabricado por
Millipore). En un fermentador de 50 litros de capacidad (fabricado
por Biott) que había sido esterilizado previamente utilizando un
autoclave (fabricado por Sakura Seiki), se cargaron asépticamente 4
litros del medio celular así preparado y la vasija se conectó a un
dispositivo de control del cultivo (fabricado por Biott).
Se cultivó por anticipado un anticuerpo
recombinante GAH que producía célula CHO 1-6R
(véanse Ejemplos de WO 03/048357) en un matraz rotatorio de 7
litros de capacidad (volumen de trabajo: 6 litros) (fabricado por
Belco) utilizando un medio libre de suero ExCell
324-PF. y el volumen total del medio de cultivo se
inoculó asépticamente a un fermentador de 50 litros de capacidad.
Después, se llevó a cabo el cultivo suplementando la vasija con 5
litros del medio libre de suero ExCell 325-PF al
cabo de 1 día, 15 litros al cabo de 2 días y 1 litro al cabo de 4
días.
El cultivo se completó al cabo de 307 horas de
la inoculación y se recuperó el medio de cultivo. Se separaron las
células del medio de cultivo con Prostack (fabricado por Millipore)
y después se filtró utilizando un Millipack 40 de 0,22 \mum para
obtener aproximadamente 26 litros de un volumen sin purificar.
\vskip1.000000\baselineskip
Una porción de 17 litros de volúmenes sin
purificar obtenidos en (1) se dividió en 12 porciones y se sometió
a purificación por cromatografía en columna utilizando columna XK16
(diámetro interior 16 mm, fabricada por Amersham Bioscience)
rellena con 14,3 ml de resina Prosep-A (fabricada
por Millipore) obteniéndose así aproximadamente 1,7 g de anticuerpo
completo GAH.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se diluyó una porción de 640 ml de la solución
de anticuerpo completo obtenido en el Ejemplo 2 de Producción con
solución 40 mM de ácido acético-acetato de sodio (pH
4,0) que contenía cloruro de sodio 40 mM a una concentración de
anticuerpo de 1 mg/ml. Los reactivos se añadieron a esta solución de
anticuerpo para obtener una composición de tampón
Tris-HCl 30 mM (pH 9,0) que contenía cloruro de
sodio 1,0 M, L-cisteína 2 mM y ácido ascórbico 12
mM como concentraciones finales. Este líquido se ajustó a PH 7,5 con
solución acuosa de hidróxido de sodio 5N, y se agitó suavemente
entonces a temperatura ambiente durante 3 horas para completar la
reacción de activación. Se sacó como muestra una pequeña porción
del mismo, y se añadió un reactivo a la solución de anticuerpo
remanente a una concentración final de cistina de 4 mM. Después se
ajustó a pH 7,5 con solución acuosa de hidróxido de sodio 5N, y se
agitó entonces suavemente a temperatura ambiente durante 2 horas
para llevar a cabo un tratamiento de inhibición de la
polimerización. Se ajustó luego el pH de lo anterior a 4,0 con ácido
clorhídrico 6 N, y se llevó a cabo desalificación y concentración
utilizando una membrana de ultrafiltración de corte de peso
molecular de 30 kDa (Hydrosalt, fabricada por Sartorius) hasta que
la conductividad eléctrica se hizo de 0,6 S/m. La muestra tomada
después de la reacción de activación se sometió a desalificación y
concentración utilizando una membrana de ultrafiltración de corte
de peso molecular nominal 30 kDa (Saltocon, fabricada por Sartorius)
sin llevar a cabo tratamiento de inhibición de polimerización.
\newpage
Ejemplo
5
Utilizando la solución de anticuerpo completo
GAH obtenida en el Ejemplo 4, se llevó a cabo la cromatografía de
líquidos de intercambio catiónico para comparar cromatogramas antes
y después del tratamiento de inhibición de polimerización.
\vskip1.000000\baselineskip
- Detector:
- Fotómetro de absorción ultravioleta (longitud de onda de medida: 280 nm).
- Columna:
- TSKgel CM-5PW (7,5 de diámetro interior x 7,5 cm de longitud) fabricada por Tosoh.
- Temperatura columna:
- Temperatura constante de alrededor de 30ºC.
- Fase móvil A.
- Tampón de fosfato de sodio 50 mM (pH 7,0).
- Fase móvil B
- Tampón fosfato de sodio 50 mM (pH 7,0)/cloruro de sodio 0,5M.
- Alimentación de fases móviles:
- Control del gradiente de densidad (véase la siguiente Tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- Velocidad de flujo:
- 1,0 ml/min.
Los cromatogramas obtenidos de las muestras
tomadas antes de la reacción de activación, después de completada
la reacción de activación, después del tratamiento de inhibición de
la polimerización y después de desalificación y concentración, se
compararon para el anticuerpo completo GAH purificado, con los
resultados mostrados en la Figura 4 a Figura 7.
El cromatograma de antes de la activación es del
tipo inactivo debido a la presencia de un gran número de especies
moleculares originadas desde la heterogeneidad como se muestra en la
Figura 4, pero se vuelve un cromatograma de GAH tipo activo cuando
se lleva a cabo la reacción de activación como muestra la Figura 5.
Después de esto, no pueden encontrarse diferencias del cromatograma
tras la reacción de activación en el cromatograma después de
llevado a cabo el tratamiento de la presente invención como muestra
la Figura 6. Además, no se pueden encontrar cambios cuando se lleva
a cabo el tratamiento de desalificación y concentración como se
muestra en la Figura 7.
De estos resultados, se puede ver, por
comparación de cromatogramas, que el tratamiento de la presente
invención no ejerce influencia sobre la actividad de anticuerpo
GAH.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Utilizando la solución de anticuerpo GAH
completo obtenido en el Ejemplo 4, se llevó a cabo un análisis por
HPLC de filtración de gel para comparar cantidades de un monómero
del anticuerpo antes y después del tratamiento de inhibición de la
polimerización. Las condiciones de operación son las mismas que las
del Ejemplo 1.
Los resultados obtenidos de las muestras sacadas
antes de la reacción de activación, después de completada la
reacción de activación, después del tratamiento de inhibición de
polimerización y después de desalificación y concentración, se
muestran en la Tabla 2, cuando el tratamiento de la presente
invención se aplicaba o no aplicaba al anticuerpo GAH completo
purificado.
\newpage
\global\parskip0.970000\baselineskip
El anticuerpo GAH completo purificado al que no
se aplicó el tratamiento de la presente invención forma polímero en
gran cantidad en la etapa de desalificación y concentración. Por
otra parte, en el caso de anticuerpo GAH completo purificado al que
se aplica el tratamiento de la presente invención, el contenido de
monómero aumenta tras tratamiento de activación aunque sea
ligeramente, y no se forma polímero en la etapa de desalificación y
concentración.
Basándose en este resultado, se ha encontrado
que el tratamiento de la presente invención incrementa el contenido
de monómero e inhibe la formación de polímero al mismo tiempo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Se tomó una porción de 150 ml de una muestra
desde la solución obtenida en el Ejemplo 4 y se digirió con pepsina.
Es decir, se añadió pepsina (fabricada por SIGMA) a la misma a una
concentración de 1,2 mg/g de GAH, seguido de filtración aséptica
utilizando un filtro en la parte de encima de un frasco (Corning
Coaster, 0,22 \mum) y se agitó suavemente entonces durante 19
horas bajo calentamiento a 37ºC.
Después de la digestión con pepsina, se purificó
F(ab')_{2} de anticuerpo GAH utilizando cromatografía de
columna de intercambio catiónico. Es decir, la columna XK16 se
rellenó con 15,3 ml de resina de intercambio catiónico
SP-Sepharose HP (fabricada por Amersham Bioscience)
y se le aplicó el líquido que contenía anticuerpo después de la
digestión con pepsina. Después se llevó a cabo un lavado utilizando
tampón acetato 40 mM (pH 4,0) que contenía NaCl 20 mM, y se
fraccionó el pico del anticuerpo mientras se incrementaba
gradualmente la concentración de sal. La velocidad de flujo era
4,17 ml/minuto.
Después de esto, se ajustó la mezcla a pH 7,0
llevando a cabo intercambio del agente tampón a agente tampón
fosfato 5 mM (pH 4,0) utilizando Saltocon de corte de peso molecular
nominal de 30 kDa y entonces se purificó un F(ab')_{2} de
anticuerpo GAH por cromatografía en columna de intercambio de anión.
Es decir, se rellenó la columna XK16 con 31 ml de resina de
intercambio de anión Q.Sepharose FF (fabricada por Amersham
Bioscience), se le aplico la solución que contenía anticuerpo
después intercambio de agente tampón y se fraccionó el pico del
anticuerpo. Se ajustó luego la mezcla a pH 4,0 y la concentración de
anticuerpo a aproximadamente 5 mg/ml utilizando Saltocon de corte
de peso molecular de 30 kDa para obtener así un F(ab')_{2}
de anticuerpo GAH purificado.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Se llevó a cabo cromatografía de líquidos de
intercambio de catión por aplicación del F(ab')_{2} de
anticuerpo GAH obtenido en el Ejemplo 7 a TSKgel
CM-5PW (7,5 mm de diámetro interior, 7.5 cm en
longitud; fabricado por Tosoh). Las condiciones de operación son
las mismas que las mostradas en el Ejemplo 4.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Los resultados se muestran en la Figura 8.
Se ha confirmado por este resultado que el
anticuerpo así obtenido es del tipo activo, y el tratamiento de la
presente invención no ejerce influencia sobre la actividad de
anticuerpo a través del proceso de purificación.
Además, el F(ab')_{2} de anticuerpo GAH
obtenido en el Ejemplo 7 se sometió a la medida de cantidades de
monómero utilizando un método de HPLC de filtración de gel.
Las condiciones de operación son las mismas que
se muestran en el Ejemplo 1.
Como resultado, el contenido de monómero era
93,8%, lo que revelaba que se había obtenido el anticuerpo que
satisfacía suficientemente la especificación de purificación.
Además, se confirmó que el tratamiento de la presente invención
inhibía la formación de polímero a través del proceso de
purificación completo, y se encontró que se lograba un mejoramiento
nítido del rendimiento de purificación.
En la presente invención, es posible establecer
un método para formar efectiva y eficazmente un anticuerpo por
protección del grupo tiol en un anticuerpo que tiene un radical de
cisteína libre, y proporcionar un medicamento que comprende el
anticuerpo.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Mitsubishi Pharma
Corporation
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> El método de protección de
grupos tiol en proteínas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 03044WO0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 2002-370822
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-12-20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> S
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Inventor: Kenji, Sasaki; Yasuhiko,
Katsumura
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 114
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
Claims (14)
1. Un método para protección de un grupo
tiol en un anticuerpo que tiene un radical de cisteína libre, que
comprende la adición de un compuesto que tiene un enlace disulfuro
en la molécula y no ejerce sustancialmente influencia sobre la
actividad del anticuerpo, donde el compuesto que tiene un enlace
disulfuro en la molécula y no ejerce sustancialmente influencia
sobre la actividad del anticuerpo es cistina, homocistina, ácido
lipoico, glutation oxidado o disulfuro de glutation.
2. El método según la reivindicación 1 que
es para inhibir una reacción de polimerización de anticuerpos vía
grupos tiol.
3. El método según la reivindicación 1 que
es para inhibir la modificación de un anticuerpo.
4. El método según la reivindicación 1 que
es para inhibir una reacción de intercambio de un grupo tiol en un
anticuerpo con un enlace disulfuro formado en la molécula o entre
las moléculas del anticuerpo.
5. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, donde el compuesto que tiene un enlace
disulfuro en la molécula y no ejerce sustancialmente ninguna
influencia sobre la actividad del anticuerpo es cistina.
6. El método para proteger un grupo tiol en
un anticuerpo que tiene un radical de cisteína libre según la
reivindicación 1, que comprende la adición del compuesto que tiene
enlace disulfuro en la molécula y no ejerce sustancialmente
influencia sobre la actividad del anticuerpo simultánea o
separadamente desde un compuesto que tiene un grupo tiol en la
molécula y no ejerce sustancialmente influencia sobre la actividad
del anticuerpo, donde el compuesto que tiene un grupo tiol en la
molécula y no ejerce sustancialmente influencia en la actividad del
anticuerpo es cisteína, homocisteína, glutation o ácido
dihidrolipoico.
7. El método según la reivindicación 6,
donde el compuesto que tiene grupo tiol en la molécula y no ejerce
sustancialmente influencia sobre la actividad del anticuerpo es
cisteína.
8. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, donde el anticuerpo es un anticuerpo
F(ab')_{2}.
9. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, donde el anticuerpo es un anticuerpo
monoclonal.
10. El método según la reivindicación 9,
donde el anticuerpo monoclonal tiene un grupo tiol en su región
variable.
11. El método según la reivindicación 9 o
10, donde el anticuerpo monoclonal tiene un radical de cisteína en
su región variable.
12. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 11, donde el anticuerpo monoclonal comprende
las secuencias de aminoácidos representadas en SEQ ID Nos: 1, 2 y 3
en la Lista de Secuencias en su región hipervariable de cadena
pesada, y las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID
Nos: 4. 5 y 6 en la Lista de Secuencias en su región hipervariable
de cadena ligera.
13. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 12, donde el anticuerpo monoclonal comprende
una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de
aminoácidos representada por SEQ ID No. 7 en la Lista de Secuencias
y una reacción variable de cadena ligera que contiene la secuencia
de aminoácidos representada por SEQ ID No: 8 en la Lista de
Secuencias.
14. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, donde el anticuerpo se produce utilizando
una célula cultivada en un medio libre de suero.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002370822 | 2002-12-20 | ||
| JP2002-370822 | 2002-12-20 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2326076T3 true ES2326076T3 (es) | 2009-09-30 |
Family
ID=32677181
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES03780938T Expired - Lifetime ES2326076T3 (es) | 2002-12-20 | 2003-12-19 | Procedimiento de proteccion de un grupo tiol en un anticuerpo. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20060257393A1 (es) |
| EP (1) | EP1574521B1 (es) |
| JP (1) | JPWO2004056872A1 (es) |
| AT (1) | ATE431835T1 (es) |
| AU (1) | AU2003289455A1 (es) |
| CA (1) | CA2511228A1 (es) |
| DE (1) | DE60327715D1 (es) |
| ES (1) | ES2326076T3 (es) |
| WO (1) | WO2004056872A1 (es) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AR103173A1 (es) | 2014-12-22 | 2017-04-19 | Novarits Ag | Productos farmacéuticos y composiciones líquidas estables de anticuerpos il-17 |
| AR103172A1 (es) | 2014-12-22 | 2017-04-19 | Novartis Ag | Reducción selectiva de residuos de cisteina en anticuerpos il-17 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4734362A (en) * | 1986-02-03 | 1988-03-29 | Cambridge Bioscience Corporation | Process for purifying recombinant proteins, and products thereof |
| DE3851685D1 (de) * | 1987-10-13 | 1994-11-03 | Thomae Gmbh Dr K | Verfahren zur Herstellung von Proteinen. |
| US5130418A (en) * | 1989-05-02 | 1992-07-14 | California Biotechnology Inc. | Method to stabilize basic fibroblast growth factor |
| CA2094378A1 (en) * | 1990-10-25 | 1992-04-26 | Paul B. Fisher | Development of dna probes and immunological reagents of human tumor associated antigens |
| US5284830A (en) * | 1991-02-13 | 1994-02-08 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Thyroid-derived chondrocyte-stimulating factor |
| JP3220180B2 (ja) * | 1991-05-23 | 2001-10-22 | 三菱化学株式会社 | 薬剤含有タンパク質結合リポソーム |
| JP3236667B2 (ja) * | 1991-06-28 | 2001-12-10 | 三菱化学株式会社 | ヒト型モノクローナル抗体およびそれをコードする遺伝子、ハイブリドーマ並びに抗腫瘍剤 |
| CA2072249C (en) * | 1991-06-28 | 2003-06-17 | Saiko Hosokawa | Human monoclonal antibody specifically binding to surface antigen of cancer cell membrane |
| CA2137561C (en) * | 1992-07-06 | 2001-10-23 | Thomas R. Sykes | Photoactivation of proteins for conjugation purposes |
| DE69636739T2 (de) * | 1995-12-21 | 2007-10-18 | Ajinomoto Co., Inc. | Verfahren zur rückfaltung von menschlichem activin a |
| TR199802584T2 (xx) * | 1996-06-11 | 1999-03-22 | Boehringer Mannheim Gmbh | Denat�re proteinin aktive edilmesi i�in y�ntem. |
| US20030120042A1 (en) * | 2000-03-30 | 2003-06-26 | Takao Yamada | Process for producing recombinant protein |
| JP4249028B2 (ja) * | 2001-12-04 | 2009-04-02 | 田辺三菱製薬株式会社 | 蛋白質の活性化方法 |
-
2003
- 2003-12-19 JP JP2004562060A patent/JPWO2004056872A1/ja not_active Withdrawn
- 2003-12-19 AU AU2003289455A patent/AU2003289455A1/en not_active Abandoned
- 2003-12-19 CA CA002511228A patent/CA2511228A1/en not_active Abandoned
- 2003-12-19 EP EP03780938A patent/EP1574521B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-12-19 ES ES03780938T patent/ES2326076T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-12-19 DE DE60327715T patent/DE60327715D1/de not_active Expired - Fee Related
- 2003-12-19 WO PCT/JP2003/016362 patent/WO2004056872A1/ja not_active Ceased
- 2003-12-19 US US10/539,756 patent/US20060257393A1/en not_active Abandoned
- 2003-12-19 AT AT03780938T patent/ATE431835T1/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE431835T1 (de) | 2009-06-15 |
| EP1574521A1 (en) | 2005-09-14 |
| CA2511228A1 (en) | 2004-07-08 |
| DE60327715D1 (de) | 2009-07-02 |
| US20060257393A1 (en) | 2006-11-16 |
| EP1574521A4 (en) | 2006-04-12 |
| AU2003289455A1 (en) | 2004-07-14 |
| WO2004056872A1 (ja) | 2004-07-08 |
| JPWO2004056872A1 (ja) | 2006-04-20 |
| EP1574521B1 (en) | 2009-05-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102741325B1 (ko) | IgG 결합 펩타이드에 의한 부위 특이적 RI 표지 항체 | |
| KR102843708B1 (ko) | 이중특이적 항체 작제물을 포함하는 약제학적 조성물 | |
| ES2141467T5 (es) | Anticuerpos anti-cd30 que evitan la escision proteolitica y liberacion del antigeno cd30 fijado a la membrana. | |
| CN106604741B (zh) | 酶法制备同质的抗体-药物缀合物 | |
| ES2562912T3 (es) | Procedimiento de estabilización de un anticuerpo, y preparación de anticuerpo de tipo disolución estabilizada | |
| BR112021001194A2 (pt) | métodos para produzir um conjugado anticorpo-fármaco e para produzir uma composição farmacêutica | |
| ES2855169T3 (es) | Conjugados de polipéptido-anticuerpo derivados de aprotinina | |
| JP6865209B2 (ja) | キャップ付加および非キャップ付加抗体システイン、および抗体−薬物コンジュゲーションにおけるそれらの使用 | |
| ES2759061T3 (es) | Inmunoglobulina híbrida que contiene unión no peptidílica | |
| BR112021012555A2 (pt) | Anticorpos monoclonais contra a região de cadeia beta do trbv9 humano | |
| BR112020020739A2 (pt) | conjugados anticorpo-fármaco e seus usos para o tratamento de câncer | |
| JP2021508694A (ja) | 抗ｓｅｚ６抗体薬物コンジュゲート及び使用方法 | |
| EP2149582A1 (en) | Osteopontin functional epitopes, monoclonal antibodies against the epitopes and uses thereof | |
| ES2326076T3 (es) | Procedimiento de proteccion de un grupo tiol en un anticuerpo. | |
| ES2943474T3 (es) | Anticuerpo que comprende una extensión carboxiterminal de una cadena ligera que contiene glutamina, conjugados del mismo, y métodos y usos | |
| CN117159703A (zh) | 含抗lag-3抗体的药物组合物及其用途 | |
| CA2637012A1 (en) | Sequence of stro-1 antibody variable region | |
| EP4643871A1 (en) | A composition comprising aflibercept and a variant thereof and related methods and uses | |
| JP2023552664A (ja) | 抗ｆｓｈｒ抗体及びその抗体－薬物複合体の製造並びに使用 | |
| CN114805570A (zh) | 一种抗人ace2单克隆抗体及其应用 | |
| AU2017238246B2 (en) | Conjugates of tacrolimus, their compositions, and their uses | |
| RU2744978C2 (ru) | Способы конъюгации агента с тиольным компонентом в белке, который содержит по меньшей мере одну трисульфидную связь | |
| WO2024041587A1 (zh) | 抗体偶联药物的药物组合物 | |
| IL295958A (en) | Protease-processed molecules | |
| JPWO2003048357A1 (ja) | 蛋白質の活性化方法 |