ES2326811T3 - Conversion mejorada de adn con bisulfito. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para el diagnóstico y/o pronóstico de enfermedades cancerosas, interacciones farmacológicas indeseadas, enfermedad cardiovascular o inflamación en un paciente o individuo, caracterizado porque se realizan las siguientes etapas: a) Se extrae el ADN de muestras de tejido o de fluidos corporales, b) El ADN se convierte con bisulfito, c) El ADN convertido se purifica mediante ultrafiltración.
Description
Conversión mejorada de ADN con bisulfito.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la detección de mutilaciones de citosina en el
ADN. La 5-metilcitosina es la base covalentemente
modificada más frecuente en el ADN de las células eucarióticas. Por
ejemplo, desempeña un papel en la regulación de la transcripción,
en la impresión genética y en la tumorigénesis (para una revisión:
Millar y col.: Five not four: History and significance of the fifth
base. En: S. Beck y A. Olek, eds.: The Epigenome.
Wiley-VCH Verlag Weinheim 2003, S. 3 20). Por
tanto, la identificación de 5-metilcitosina como
componente de la información genética es de un interés
considerable. No obstante, las posiciones de
5-metilcitosina no se pueden identificar mediante
secuenciación porque la 5-metilcitosina tiene el
mismo comportamiento de pares de bases que la citosina. Además, en
el caso de una amplificación por PCR, la información epigenética,
portada por las 5-metilcitosinas, se pierde
completamente.
Los procedimientos habituales para el análisis
de la metilación operan esencialmente de acuerdo con dos principios
diferentes. O se utilizan encimas de restricción específicas de
metilación o se realiza una conversión química selectiva de
citosinas no metiladas en uracilo (tratamiento con bisulfito). A
continuación, el ADN enzimática o químicamente
pre-tratado se amplifica y se puede analizar de
diferentes modos (para revisión: Fraga y Esteller: DNA Methylation:
A Profile of Methods and Applications. Biotechniques
33:632-649, Sept. 2002) WO 02/072880 pp. 1 ff).
Dado que el uso de enzimas específicas de
metilación está restringido a ciertas secuencias que contienen
sitios de restricción reconocidos por dichas enzimas, para la
mayoría de las aplicaciones se realiza un tratamiento con bisulfito
(para revisión: documento US 10/311.611). De acuerdo con la
invención, una "reacción con bisulfito", "tratamiento con
bisulfito" o "procedimiento con bisulfito" deberá querer
decir una reacción para la conversión de bases de citosina en un
ácido nucleico en bases de uracilo en presencia de iones bisulfito
según la cual las bases de 5-metilcitosina no se
convierten significativamente. La reacción con bisulfito contiene
una etapa de desaminación y una etapa de desulfonación que se
pueden realizar por separado o simultáneamente (en el documento EP
1394172A1 se describen otros detalles y se muestra un esquema de
reacción). Hay varios documentos que abordan aspectos específicos de
la reacción con bisulfito, incluidos Hayatsu y col., Biochemistry 9
(1970) 2858 28659; Slae y Shapiro, J.Org. Chem. 43 (1978)
4197-4200; Paulin y col., Nucl. Acid Res. 26 (1998)
50095010; Raizis y col., Anal Biochem. 226 (1995),
161-1666; Wang y col. Nucleic Acids Res. 8 (1980)
4777-4790. Estos documentos se resumen en el
documento EP 1394172A1.
Normalmente, el tratamiento con bisulfito se
realiza del siguiente modo: El ADN genómico se aísla, fragmenta
mecánica o enzimáticamente, desnaturaliza con NaOH, convierte varias
horas mediante una solución concentrada de bisulfito y, por último,
desulfona y desala (p. ej.: Frommer y col.: A genomic sequencing
protocol that yields a positive display of
5-methylcytosine residues in individual DNA strands.
Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Mar 1;
89(5):1827-31).
En los últimos tiempos se han desarrollado
varias mejoras técnicas de los procedimientos con bisulfito. El
procedimiento con perlas de agarosa incorpora el ADN que se va a
investigar en una matriz de agarosa, a través de la cual se
previene la difusión y renaturalización del ADN (el bisulfito sólo
reacciona con ADN monocatenario) y todas las etapas de precipitación
y purificación se sustituyen con diálisis rápida (Olek A. y col. A
modified and improved method for bisulphite based cytosine
methylation analysis, Nucl. Acid Res. 1996, 24,
5064-5066). En la solicitud de patente WO 01/98528
(= DB 100 29 915; = solicitud de EE.UU. 10/311.661) se describe una
conversión con bisulfito en la que la muestra de ADN se incuba con
una solución de bisulfito de un intervalo de concentraciones entre
0,1 mol/l a 6 mol/l en presencia de un reactivo de
desnaturalización y/o un disolvente y al menos un secuestrante. En
dicha solicitud de patente se describen varios reactivos
desnaturalizantes y secuestrantes adecuados. En la solicitud de
patente WO 03/038121 (=DE 101 54 317; =10/416,624) se desvela un
procedimiento en el que el ADN a analizar está unido a una
superficie sólida durante el tratamiento con bisulfito. En
consecuencia se facilitan las etapas de purificación y lavado. Más
mejoras se describen en las solicitudes de patente EP1394173A1 y
EP1394172A1.
No obstante, un problema básico del tratamiento
con bisulfito consiste en el hecho de que son necesarios tiempos de
reacción largos con el fin de garantizar una conversión completa y
de excluir resultados falsos positivos. Sin embargo,
simultáneamente, esto conduce a una degradación del ADN debido a los
tiempos de reacción prolongados. De hecho, temperaturas de reacción
más elevadas conducen a una tasa de conversión superior, y también
a una degradación más intensa del ADN. Recientemente se han
investigado sistemáticamente las interacciones entre temperatura,
tiempo de reacción, tasas de conversión y degradación De este modo
se ha podido mostrar que los índices de conversión más elevados se
alcanzaron a temperaturas de 55ºC (con tiempos de reacción entre 4 y
18 horas) y a 95ºC (con un tiempo de reacción de una hora). No
obstante, un problema serio es la degradación del ADN durante este
procedimiento. A una temperatura de reacción de 55ºC, el
84-96% del ADN se descompone. A 95ºC la degradación
es, de hecho, incluso mayor (Grunau y col. Bisulfite genomic
sequencing: systematic investigation of critical experimental
parameters. Nucleic Acids Res. 2001 Jul 1;
29(13):E65-5). Por tanto, la mayoría de los
autores usan temperaturas de reacción de aproximadamente 50ºC
(véase Froromer y col., loc. cit. 1992, p. 1827; Olek y col., loc.
cit. 1996, p. 5065; Raizis y col.: A bisulfite method of
5-methylcytosine mapping that minimizes template
degradation. Anal Biochem. 1995 Mar 20;
226(1):161-6, 162).
Además del elevado índice de degradación del ADN
existe otro problema en los procedimientos convencionales con
bisulfito, que consiste en el hecho de que todavía no se ha
descrito un potente procedimiento de purificación para ADN
convertido. Muchos autores usan precipitaciones (véase Grunau y
col., loc. cit.). También se ha descrito una purificación mediante
superficies de unión a ADN (véase: Kawakami y col.: Hypermethylated
APC DNA in plasma and prognosis of patients with esophageal
adenocarcinoma. Journal of the National Cancer Institute, Vol. 92,
No. 22, 2000, pp. 1805-11). No obstante, el
rendimiento de estas purificaciones es limitado.
Debido a las elevadas pérdidas del tratamiento
con bisulfito convencional, el uso de estos procedimientos supone
un problema en las investigaciones en las que la cantidad de ADN a
analizar es limitada. No obstante, un campo del análisis de la
metilación particularmente interesante reside en el diagnóstico de
las enfermedades cancerosas u otros trastornos asociados con una
variación en el estado de la metilación por medio del análisis del
ADN de los fluidos corporales, por ejemplo de sangre u orina. Sin
embargo, en los fluidos corporales el ADN sólo está presente a
concentraciones bajas, por lo que la aplicabilidad del análisis de
la metilación está limitada por el bajo rendimiento del tratamiento
convencional con bisulfito.
En consecuencia, sobre la base de la particular
importancia del análisis de la metilación de la citosina y según
las desventajas descritas de la metodología convencional, existe una
gran necesidad de mejores procedimientos de la conversión con
bisulfito.
En la actualidad se ha descubierto que la
adición de ciertos disolventes desnaturalizantes incrementa el
índice de conversión de la reacción con bisulfito de un modo
inesperado y sorprendente. De forma simultánea se reduce el tiempo
de reacción necesario y, en consecuencia, el índice de degradación.
Aunque el uso de disolventes desnaturalizantes ya se conoce en la
técnica actual, el experto en la técnica no esperaba que los
disolventes seleccionados en esta invención causaran un efecto tan
fuerte. Además de un índice de conversión claramente mejorado y de
la reducción del índice de degradación, el uso de dicho disolvente
conduce a otra ventaja importante. Normalmente, el tratamiento con
bisulfito se realiza en presencia de concentraciones elevadas de
bisulfito (Fraga and Esteller recomiendan una concentración final
de 5 mol/l; véase anteriormente, pág. 642, segundo párrafo). No
obstante, una concentración tan elevada de sales produce una
degradación alta y conduce a problemas en las posteriores
purificación y amplificación. Otra ventaja del uso de compuestos de
n-alquilenglicol como agente desnaturalizante de
acuerdo con la presente invención en comparación con los
disolventes desnaturalizantes ya conocidos es su mayor solubilidad
en agua. Como consecuencia, los compuestos de reacción, incluidos
los secuestrantes, son aplicables en un intervalo de concentración
más amplio. A través de la combinación de nuevos disolventes con
condiciones de reacción optimizadas y nuevos procedimientos de
purificación se puede mejorar más la eficacia de la conversión. Se
hace posible un análisis sensible de la metilación del ADN en
tejidos o fluidos corporales. El documento WO 03/064700 proporciona
un procedimiento para la identificación sistemática de posiciones de
dinucleótidos CpG metilados de forma diferencial dentro de las
secuencias de ADN genómico.
El documento DE 100 50 942 desvela un
procedimiento para la detección de metilaciones de citosina en el
ADN genómico.
\vskip1.000000\baselineskip
Es sujeto de la presente invención un
procedimiento para el diagnóstico y/o pronóstico de enfermedades
cancerosas, interacciones farmacológicas indeseadas, enfermedad
cardiovascular o inflamación en un paciente o individuo, que se
caracteriza porque se realizan las siguientes etapas:
a) Se extrae el ADN de muestras de tejido o de
fluidos corporales,
b) El ADN se convierte con bisulfito, y
c) El ADN convertido se purifica mediante
ultrafiltración.
Una forma de realización es un procedimiento
para una conversión de ADN con bisulfito, en el que el ADN se hace
reaccionar con un reactivo bisulfito y dicha reacción se lleva a
cabo en presencia de un compuesto del grupo de dioxano, uno de sus
derivados y un éter cíclico alifático similar.
\newpage
Otra forma de realización de la presente
invención es un procedimiento para una conversión de ADN con
bisulfito, en el que el ADN se hace reaccionar con un reactivo
bisulfito, que se caracteriza porque dicha reacción se lleva a cabo
en presencia de un compuesto de la fórmula siguiente:
n =
1-35000
m = 1-3
R_{1} = H, Me, Et, Pr, Bu
R_{2} = H, Me, Et, Pr, Bu
Por tanto, se prefieren los compuestos de
n-alquilenglicol, particularmente sus dialquiléteres
y especialmente éter dimetílico de dietilenglicol (DME).
Para ambas formas de realización, el ADN a
investigar puede proceder de diferentes fuentes en función del
objetivo diagnóstico o científico. Para investigaciones
diagnósticas, las muestras de tejido se usan, preferentemente, como
material inicial, pero también se pueden usar fluidos corporales,
particularmente suero o plasma. También es posible usar ADN de
esputo, heces, orina o líquido cefalorraquídeo. Preferentemente, el
ADN se aísla de muestras biológicas. El ADN se extrae de acuerdo
con procedimientos estándar, de sangre, por ejemplo con el uso del
kit de extracción de ADN Qiagen UltraSens. El experto en la técnica
conoce otros procedimientos para purificar ADN.
Posteriormente, el ADN aislado se puede
fragmentar mediante, por ejemplo, reacción con enzimas de
restricción. El experto en la técnica conoce las condiciones de la
reacción y las enzimas empleadas y se obtienen de, por ejemplo, los
protocolos suministrados por los fabricantes.
La conversión con bisulfito puede producirse de
acuerdo con los protocolos conocidos indicados en lo que antecede.
La reacción puede tener lugar en solución, además de también en ADN
unido a una fase sólida. Preferentemente se usa disulfito sódico
(=bisulfito sódico/metasulfito sódico), ya que es más soluble en
agua que el sulfito sódico. La relación entre la sal bisulfito en
solución acuosa u los aniones de sulfito de hidrógeno necesaria para
la conversión de citosina es desproporcionada. Cuando la
concentración de bisulfito se trata más adelante, se refiere a la
concentración de sulfito de hidrógeno y aniones sulfito en la
solución de la reacción. Para el procedimiento de acuerdo con la
invención, son posibles los intervalos de concentración de 0,1 a 6
mol/l (véase anteriormente). Particularmente se prefiere un
intervalo de concentración de 1 a 6 mol/l y más particularmente
preferido de 2-4 mol/l. No obstante, cuando se usa
dioxano, la concentración máxima de bisulfito que se puede usar es
menor (véase más adelante). Al seleccionar la concentración de
bisulfito se debe considerar que una concentración elevada de
bisulfito conduce a una alta conversión y también a un índice de
descomposición alto debido al pH menor.
El dioxano se puede utilizar en diferentes
concentraciones. Preferentemente, la concentración de dioxano
asciende a 10-35% (vol/vol), particularmente
preferida es de 20 a 30%, y más particularmente preferida es de 22
a 28%, especialmente 25%. Una concentración de dioxano superior al
35% supone un problema, ya que ello tiene como resultado una
formación de dos fases dentro de la solución de reacción. En formas
de reacción particularmente preferidas con una concentración de
dioxano de 22-28%, la concentración final preferida
de bisulfito asciende a 3,3 a 3,6 mol/l y en la forma de
realización más particularmente preferida con una concentración de
dioxano del 25% asciende a 3,5 mol/l (véase Ejemplos).
Los compuestos de
n-alquilenglicol de acuerdo con la invención se
pueden utilizar en un intervalo de concentraciones diferente. El
DME se usa, preferentemente, en concentraciones entre
1-35% (vol/vol). Ésta es, preferentemente, entre el
5 y el 25%, y más preferentemente es del 10% de DME.
Los secuestrantes preferidos utilizados de
acuerdo con la invención son derivados de cromano por ejemplo ácido
2-carboxílico de
6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano
(también conocido como: Trolox-C^{TM}). En la
solicitud de patente WO 01/98528 (= DE 100 29 915; = solicitud de
EE.UU 10/311,661) se enumeran otros secuestrantes.
La conversión con bisulfito se puede realizar en
un amplio intervalo de temperaturas de 0 a 95ºC (véase lo que
antecede). No obstante, dado que a temperaturas más elevadas los
índices tanto de conversión como de descomposición del ADN aumenta,
en una forma de realización preferida la temperatura de reacción se
encuentra entre 30-70ºC. Particularmente preferido
es un intervalo entre 45-60ºC, más particularmente
preferido entre 50-55ºC. El tiempo de reacción
óptimo del tratamiento con bisulfito depende de la temperatura de
reacción. Normalmente, el tiempo de reacción asciende a entre 1 y 18
horas (véase: Grunau y col. 2001, loc. cit.). Habitualmente, el
tiempo de reacción es de 4-6 horas para una
temperatura de reacción de 50ºC.
En una forma de realización particularmente
preferida del procedimiento de acuerdo con la invención, la
conversión con bisulfito se lleva a cabo a temperaturas de reacción
suaves, en el que la temperatura de reacción se incrementa
claramente durante un tiempo breve al menos una vez durante el curso
de la conversión. De este modo, la eficacia de la conversión con
bisulfito puede aumentarse claramente de forma sorprendente. Los
incrementos de temperatura de corta duración se denominan en lo
sucesivo "termopicos". La temperatura de reacción
"estándar" fuera de los termopicos se indica como la
temperatura de reacción básica. La temperatura de reacción básica
asciende a entre 0 y 80ºC, preferentemente entre
30-70ºC, más preferentemente a
45-55ºC, tal y como se ha descrito en lo que
antecede. La temperatura de reacción durante un termopico aumenta a
más de 85ºC en al menos un termopico. El número óptimo de
termopicos es una función de la temperatura de reacción básica.
Cuanto mayor es el número óptimo de termopicos, menor es la
temperatura de reacción básica. En cada caso es necesario al menos
un termopico. Y, por otro lado, en principio se puede concebir
cualquier número de termopicos. Por supuesto, debe tenerse en
cuenta que con un número grande de incrementos de temperatura, el
índice de descomposición del ADN también aumenta y ya no queda
garantizada una conversión óptima. Por tanto, el número preferido de
termopicos es entre 1 y 10 termopicos cada vez, en función de la
temperatura de reacción básica. Por tanto, se prefiere un número de
dos a 5 termopicos. Los termopicos incrementan la temperatura de
reacción preferentemente a 85-100ºC, particularmente
preferido a 92-98ºC y más preferentemente a
94ºC-96ºC.
El tiempo de duración de los termopicos también
depende del volumen del lote de la reacción. Debe garantizarse que
la temperatura se incrementa uniformemente por toda la solución de
la reacción total. Para un lote de reacción de 20 \mul, al usar
un termociclador se prefiere una duración entre 15 segundos y 1,5
minutos, especialmente una duración entre 20 y 50 segundos. En una
forma de realización preferida particular la duración es de 30
segundos. Trabajando con un volumen de 100 \mul, el intervalo
preferido se encuentra entre 30 segundos y 5 minutos, especialmente
entre 1 y 3 minutos. Particularmente preferidos son 1,5 minutos.
Para un volumen de 600 \mul se prefiere una duración de 1 a 6
minutos, especialmente entre 2 y 4 minutos. Particularmente
preferida es una duración de 3 minutos. Un experto en la técnica
podrá fácilmente determinar duraciones adecuadas de los termopicos
en relación con varios volúmenes de reacción.
El uso descrito en lo que antecede de los
termopicos conduce a índices de conversión significativamente
mejores en la reacción de conversión con bisulfito, incluso cuando
no se utilizan los disolventes desnaturalizantes descritos en lo que
antecede. De acuerdo con la invención, en el presente documento un
procedimiento para la conversión de ADN con bisulfito se
caracteriza porque la temperatura de reacción básica asciende a 0ºC
a 80ºC y porque la temperatura de reacción aumenta durante un
tiempo breve a más de 85ºC al menos una vez durante el curso de la
conversión. El material inicial se puede procesar como se ha
descrito en lo que antecede.
Los intervalos de temperatura preferidos, el
número de termopicos y su duración corresponden a los intervalos
indicados en lo que antecede. En consecuencia, la temperatura de
reacción básica asciende a entre 0 y 80ºC, preferentemente entre
30-70ºC, más preferentemente a
45-55ºC. La temperatura de la reacción aumenta a más
de 85ºC en al menos un termopico. El número preferido de termopicos
es entre 1 y 10 termopicos, en función de la temperatura de reacción
básica. Particularmente preferidos son de dos a cinco termopicos.
Durante los termopicos la temperatura de reacción aumenta
preferentemente a 85-100ºC, particularmente
preferido a 92-98ºC y más preferentemente a
94ºC-96ºC.
El tiempo de duración de los incrementos de
temperatura también depende del volumen del lote de la reacción
(véase en lo que antecede).
Una vez completada la conversión con bisulfito,
el ADN se desulfona y purifica. Para este fin se conocen diferentes
procedimientos (p. ej., véase: el documento DE 101 54 317 A1 =
documento US 10/416,624; Grunau y col. 2001, loc. cit.).
Normalmente, la solución de la reacción se trata primero con
hidróxido sódico. Posteriormente se llevan a cabo una neutralización
y precipitación en alcohol del ADN. La purificación se realiza por
medio de una ultrafiltración. Tal procedimiento posee varias
ventajas técnicas y tiene como resultado una purificación
sorprendentemente exitosa del ADN convertido. El índice de
recuperación del ADN convertido es muy elevado (>85%, véase el
Ejemplo 6). Esto es cierto tanto para ADN de alto peso molecular
como para ADN fragmentado, como el que se encuentra en, por
ejemplo, los fluidos corporales. En contraste con ello, los
procedimientos convencionales para aislar ADN tratado con bisulfito
sólo conducen a un índice de recuperación de aproximadamente el 25%.
La ultrafiltración también posee otras ventajas. Por ejemplo, la
purificación es muy flexible con respecto al volumen de las muestras
que se vayan a usar. Además, las sales de bisulfito se pueden
eliminar casi completamente. Además, se puede realizar una
desulfonación en la membrana del filtro, que adicionalmente tiene
como resultado un ahorro de tiempo. El experto en la técnica conoce
diferentes sistemas de ultrafiltración comercialmente disponibles
que se pueden usar para el procedimiento de acuerdo con la
invención. En una forma de realización preferida se usan columnas
de Millipore Microcon^{TM}. Por tanto, la purificación se puede
llevar a cabo de acuerdo con un protocolo modificado del
fabricante. Para este fin, la solución de reacción con bisulfito se
mezcla con agua y se carga en la membrana de ultrafiltración.
Posteriormente, la solución de reacción se centrifuga durante
aproximadamente 15 minutos y después se lava con 1 x tampón TE. En
este tratamiento el ADN permanece en la membrana. A continuación se
realiza la desulfonación. Para este fin, se añaden 0,2 mol/l de Nang
y el ADN se incuba durante 10 minutos. A continuación se realiza
otra centrifugación (10 minutos), seguida por una etapa de lavado
con 1 x tampón TE. Posteriormente se eluye el ADN. Para este fin,
la membrana se mezcla con 50 \mul de 1 x tampón TE caliente (50ºC)
durante 10 minutos. Se vuelca la membrana de acuerdo con las
instrucciones del fabricante y se lleva a cabo otra centrifugación,
por medio de la cual el ADN se elimina de la membrana. En este
momento se puede usar el eluato directamente para las reacciones de
detección que se pretenden realizar. El experto en la técnica
conoce que otros procedimientos pueden estar indicados con otros
sistemas de ultrafiltración y que también se puede obtener un buen
rendimiento variando las condiciones indicadas en lo que antecede.
Las formas de realización correspondientes también forman parte de
esta invención.
El uso descrito en lo que antecede también
facilita una purificación claramente mejor del ADN convertido con
bisulfito cuando no se utilizan los disolventes de desnaturalización
descritos en lo que antecede o cuando la conversión se realiza sin
termopicos. Por tanto, de acuerdo con la invención se caracteriza
un procedimiento para la conversión de ADN con bisulfito en el que
la purificación del ADN convertido tiene lugar por medio de
ultrafiltración. Por tanto, el material inicial se puede procesar
como se ha descrito en lo que antecede. También se pueden utilizar
termopicos. Los intervalos de temperatura preferidos, el número de
termopicos y su duración corresponden a los intervalos indicados en
lo que antecede (véase anteriormente). Asimismo, la ultrafiltración
se realiza preferentemente como se ha descrito en lo que antecede.
En consecuencia, se pueden utilizar diferentes sistemas de
ultrafiltración. En una forma de realización preferida se usan
columnas de Millipore Microcon^{TM}. Preferentemente, la
purificación se realiza como se ha descrito en lo que antecede de
acuerdo con un protocolo modificado del fabricante. El experto en la
técnica conoce que otros procedimientos pueden estar indicados con
otros sistemas de ultrafiltración y que también se puede obtener un
rendimiento todavía mejor variando las condiciones indicadas en lo
que antecede.
El ADN que se ha convertido y purificado a
través de las diferentes formas de realización descritas en lo que
antecede se puede analizar ahora de diferentes modos. Es
particularmente preferido amplificar el ADN primero por medio de
una reacción en cadena de la polimerasa. Por tanto, se puede
asegurar una amplificación selectiva del ADN metilado o no metilado
a través de diferentes procedimientos, por ejemplo mediante el
procedimiento denominado "HeavyMethyl" (para revisión:
Cottrell y col.; A real-time PCR assay for
DNA-methylation using
methylation-specific blockers. Nucleic Acids Res.
2004 Jan 13;32(1):e10. Documento WO 02/072880.) o la
denominada "PCR sensible a metilación" "MSP"; véase:
Herman y col.: Methylation-specific PCR: a novel
PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci
U S A. 1996 Sep 3;93(18):9821-6). Los
amplificados obtenidos pueden detectarse a través de procedimientos
convencionales, por ejemplo a través de reacciones de extensión del
cebador ("MsSNuPE"; véase, por ejemplo: Documento DE 100 10
280= documento US 10/220,090) o a través de hibridación con
matrices oligoméricas (véase, por ejemplo: Adorjan y col., Tumour
class prediction and discovery by microarray-based
DNA methylation analysis. Nucleic Acids Res. 2002 Mar
1;30(5):e21). En otra forma de realización particularmente
preferida, los amplificados se analizan con el uso de variantes de
PCR en tiempo real (véase: Documento US 6.331.393 "Methyl
Light"). Por tanto, variantes preferidas son los procedimientos
"Taqman" y "Lightcycler"
Los procedimientos desvelados en el presente
documento se usan para el diagnóstico y/o pronóstico de
acontecimientos adversos para pacientes o individuos, según los
cuales estos acontecimientos adversos pertenecen a al menos una de
las categorías siguientes: interacciones farmacológicas indeseadas;
enfermedades cancerosas; malfunciones, daños o enfermedades del
SNC; síntomas de agresividad o alteraciones de la conducta;
consecuencias clínicas, psicológicas y sociales del daño cerebral;
alteraciones psicóticas y trastornos de la personalidad; demencia
y/o síndromes asociados; enfermedades, malfunción y daños
cardiovasculares; malfunción, daños o enfermedad del tracto
gastrointestinal; malfunción, daños o enfermedad del sistema
respiratorio; lesión, inflamación, infección, inmunidad y/o
convalecencia; malfunción, daños o enfermedad del cuerpo como
anomalía en el proceso del desarrollo; malfunción, daño o enfermedad
de la piel, los músculos o el tejido conjuntivo o de los huesos;
malfunción, daños o enfermedad endocrina y metabólica; dolores de
cabeza o malfunción sexual.
El nuevo procedimiento también sirve de un modo
particularmente preferido para distinguir tipos de células, tejidos
o para investigar la diferenciación celular.
El nuevo procedimiento también sirve de un modo
particularmente preferido para analizar la respuesta de un paciente
a un tratamiento farmacológico.
También se puede usar un kit, que contiene un
reactivo que contiene bisulfito, reactivos o disolventes
desnaturalizantes, además de secuestrantes, cebadores para la
producción de los amplificados así como, opcionalmente, un tubo de
ultrafiltración o instrucciones para realizar un ensayo, para
efectuar el procedimiento de la presente invención.
Los ejemplos siguientes explican la
invención.
Ejemplo
1
En el presente ejemplo se describe la aplicación
del procedimiento para detectar el estado de metilación de las
citosinas en el gen del factor VIII de una muestra de ADN genómico,
que se trata con una endonucleasa de restricción de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. El procedimiento se basa en el uso de
un sistema de pipeteado automático (MWG RoboSeq 4204) con cuatro
adaptadores separados verticalmente móviles para puntas de pipeta
intercambiables con el fin de excluir contaminaciones cruzadas. El
sistema de pipeteado posibilita el pipeteado de 100 \mul
[alícuotas] con un error inferior a \pm 2 \mul. La placa
operativa del sistema de pipeteado automático está equipada con
seis gradillas para puntas de pipeteado y ocho posiciones de
pipeteado, dos de las cuales pueden enfriarse, una gradilla para
reactivos que se puede enfriar, un sistema de aplicación para 10
placas de microtitulación, una estación de lavado de puntas de
pipetas y un dispositivo para separar las puntas de pipeta del
adaptador.
El sistema de pipeteado automático está
conectado a un ordenador a través de una interfaz en serie y está
controlado por un programa de software que permite la programación
libre de todas las etapas del pipeteado necesarias para la
aplicación del procedimiento.
En la primera etapa del procedimiento, un
alícuota de la muestra de ADN se pipetea a mano en una de las 96
posiciones seleccionables libremente de una placa de
microtitulación. Después, la placa de microtitulación se calienta
posteriormente hasta 96ºC con el uso de un Eppendorf MasterCycler
para desnaturalizar la muestra de ADN pretratada. Después, la placa
de microtitulación se transfiere al sistema de pipeteado
automático. Los alícuotas de un agente desnaturalizante (dioxano) se
pipetean una solución 3,3M de hidrógeno sulfito de sodio y una
solución de un secuestrante en el agente desnaturalizado una después
de la otra de un modo controlado por el programa desde la gradilla
para reactivos a todas las posiciones que contienen ADN. A
continuación, la placa de microtitulación se incuba en el Eppendorf
Mastercycler, de modo que todos los residuos de citosina sin
metilar en la muestra de ADN se convierten en un aducto de
bisulfito con la acción del hidrógeno sulfito de sodio.
Después del tratamiento con bisulfito, la placa
de microtitulación se transfiere desde el termociclador al sistema
de pipeteado automático. Después se coloca una segunda placa de
microtitulación del mismo tipo. Se transfieren un tampón
Tris-HCl básico (pH 9,5) en primer lugar y después
un alícuota del ADN tratado con bisulfito a las correspondientes
posiciones de la segunda placa de microtitulación en todas las
cámaras cuyas posiciones equivalentes de la primera placa de
microtitulación contienen una muestra de ADN tratada con bisulfito.
Los aductos de bisulfito de los residuos de citosina sin metilar se
convierten en residuos de uracilo en la solución básica.
La amplificación dirigida de una hebra (la hebra
sentido en el presente ejemplo) del ADN tratado con bisulfito se
realiza mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se usa
un par de cebadores de tipo 1 (AGG GAG TTT TTT TTA GGG AAT AGA GGG
A (SEC ID Nº 1) y TAA TCC CAA AAC CTC TCC ACT ACA ACA A (SEC ID Nº
2) que permiten la amplificación específica de una hebra de ADN
tratada con éxito con bisulfito, pero no una hebra de ADN, cuyos
residuos de citosina sin metilar no se habían convertido en residuos
de uracilo o se habían convertido de forma incompleta. Una tercera
placa de microtitulación del mismo tipo se coloca en el sistema de
pipeteado automático para la reacción de PCR. En todas las cámaras,
cuyas posiciones equivalentes en la primera placa de microtitulación
contienen una muestra de ADN tratada con bisulfito, primero se
pipetea automáticamente un alícuota de una solución madre que
contiene un tampón de PCR, una ADN polimerasa y un cebador de tipo
1. Después, un alícuota del ADN diluido tratado con bisulfito se
transfiere automáticamente de cada posición de la segunda placa de
microtitulación a la posición correspondiente de la tercera placa
de microtitulación, antes de que ésta última se transfiera al
ciclador para realizar la reacción de PCR. El producto de la PCR se
identifica mediante electroforesis en gel de agarosa y posterior
tinción con bromuro de etidio (Fig. 1). La Figura 1 muestra la
imagen del gel de una hebra de ADN tratada con bisulfito
amplificada mediante PCR (izquierda: marcador de peso molecular,
derecha: producto de la PCR).
Se mostrará que el procedimiento optimizado con
bisulfito posibilita un análisis sensible de metilación para ADN
obtenido de fluidos corporales. Para este fin se mezcló 1 ml de
plasma humano con una cantidad específica de ADN humano. El ADN se
aisló de las muestras de plasma mediante el procedimiento Magna
Pure (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los
100 \mul del eluato resultantes de la purificación se utilizaron
completamente en la siguiente reacción con bisulfito. Como control
se efectuó la conversión de acuerdo con un procedimiento estándar
(Frommer y col., loc. cit.). El procedimiento pata el procedimiento
de acuerdo con la invención fue el siguiente: El eluato se mezcló
con 354 \mul de la solución de bisulfito (5,89 mol/l) y 146 \mul
de dioxano que contiene un secuestrante de radicales (ácido
2carboxílico de
6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano,
98,6 mg en 2,5 ml de dioxano).
La mezcla de reacción se desnaturalizó durante 3
min a 99ºC y después se incubó con el siguiente programa de
temperaturas durante un total de 5 horas: 30 min 50ºC; un termopico
(99,9ºC) durante 3 minutos; 1,5 h 50ºC; un termopico (99,9ºC)
durante 3 minutos; 3 h 50ºC. Las mezclas de reacción tanto del
control como del procedimiento de acuerdo con la invención se
purificaron después mediante ultrafiltración con una columna
Millipore Microcon^{TM}. La purificación se realizó esencialmente
de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para este fin, la
mezcla de reacción se mezcló con 300 \mul de agua, se cargó en la
membrana de ultrafiltración, se centrifugó durante 15 minutos y
después se lavó con 1 x tampón TE. En este tratamiento el ADN
permanece en la membrana. A continuación se realiza la
desulfonación. Para este fin, se añadieron 0,2 mol/l y se
incubaron durante 10 minutos. A continuación se realizó una
centrifugación (10 minutos), seguida por una etapa de lavado con 1 x
tampón TE. Después de esto se eluyó el ADN. Para este fin, la
membrana se mezcló con 50 \mul de 1 x tampón TE caliente (50ºC)
durante 10 minutos. La membrana se volcó de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Posteriormente se realizó otra
centrifugación con lo que el ADN se eliminó de la membrana. Para la
siguiente PCR en tiempo real Lightcycler se utilizaron 10 \mul
del eluato. Se analizó una región del gen de la
beta-actina humana (véase Miyamoto: Nucleotide
sequence of the human beta-actin promoter 5'
flanking region; Nucleic Acids Res. 15 (21), 9095 (1987)). Se
usaron los siguientes cebador y sondas: Cebador directo: TGG TGA
TGG AGG AGG TTT AGT AAG T (SEC ID 3); cebador inverso: AAC CAA TAA
AAC CTA CTC CTC CCT TAA (SEQ ID 4); sonda donante: TTG TGA ATT TGT
GTT TGT TAT TGT GTG TTG-flou (SEC ID 5); sonda
aceptora: LC Red640-TGG TGG TTA TTT TTT TTA TTA GGT
TGT GGT-Phos (SEC ID 6). La amplificación se
realizó por medio de un ensayo específico con bisulfito. Las
señales fluorescentes se detectaron y calcularon con el software
Lightcycle. La cantidad de ADN convertido y aislado pudo
cuantificarse mediante una comparación con curvas de calibración.
El procedimiento optimizado produjo una concentración de ADN de
133,21 ng/100 \mul, mientras que el procedimiento convencional
condujo a una concentración de 41,03 ng/100 \mul. El
procedimiento de acuerdo con la invención posibilitó un rendimiento
tres veces superior al obtenido con el procedimiento
convencional.
Se mostrará que el procedimiento optimizado con
bisulfito posibilita un análisis sensible de metilación para ADN
obtenido de fluidos corporales. Para este fin se mezcló 1 ml de
plasma humano con una cantidad específica de ADN humano. El ADN se
aisló de las muestras de plasma mediante el procedimiento Magna Pure
(Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los 100
\mul del eluato resultantes de la purificación se utilizaron
completamente en la siguiente reacción con bisulfito. Como control
se efectuó la conversión de acuerdo con un procedimiento estándar
(Frommer y col., loc. cit.). El procedimiento pata el procedimiento
de acuerdo con la invención fue el siguiente: El eluato se mezcló
con 354 \mul de la solución de bisulfito (5,89 mol/l) y 46
\mul de DME que contiene un secuestrante de radicales (ácido
2-carboxílico de
6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano,
98,6 mg en 787 \mul de DME). La mezcla de reacción se
desnaturalizó durante 3 minutos a 9ºC y posteriormente se incubó
con el siguiente programa de temperaturas durante un total de 5 h.
30 min 50ºC; un termopico (99,9ºC) durante 3 minutos; 1,5 h 50ºC; un
termopico (99,9ºC) durante 3 minutos; 3 h 50ºC. Las mezclas de
reacción tanto del control como del procedimiento de acuerdo con
la invención se purificaron después mediante ultrafiltración con una
columna Millipore Microcon^{TM}. La purificación se realizó
esencialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para
este fin, la mezcla de reacción se mezcló con 300 \mul de agua,
se cargó en la membrana de ultrafiltración, se centrifugó durante
15 minutos y después se lavó con 1 x tampón TE. En este tratamiento
el ADN permanece en la membrana. A continuación se realiza la
desulfonación. Para este fin, se añadieron 0,2 mol/l y se incubaron
durante 10 minutos. A continuación se realizó una centrifugación (10
minutos), seguida por una etapa de lavado con 1 x tampón TE.
Después de esto se eluyó el ADN. Para este fin, la membrana se
mezcló con 50 \mul de 1 x tampón TE caliente (50ºC) durante 10
minutos. La membrana se volcó de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Posteriormente se realizó otra centrifugación por medio
de la cual el ADN se eliminó de la membrana. Para la siguiente PCR
en tiempo real Lightcycler se utilizaron 10 \mul del eluato. Una
región del gen de la beta-actina humana se analizó
usando los cebadores y las sondas descritos en el ejemplo 2. La
amplificación se realizó por medio de un ensayo específico con
bisulfito. Los resultados calculados por el software Lightcycler se
muestran en la Figura 2. Las curvas de la izquierda corresponden al
procedimiento optimizado, mientras que las curvas de la derecha
corresponden al procedimiento convencional. Se muestra que el
procedimiento optimizado produce una señal fluorescente
significativa, incluso con un número pequeño de ciclos. Por tanto,
el rendimiento de ADN es superior que el obtenido con el
procedimiento convencional. La cantidad de ADN se puede cuantificar
mediante una comparación con curvas de calibración. El
procedimiento optimizado produjo una concentración de ADN de 133,27
ng/100 \mul, mientras que el procedimiento convencional condujo a
una concentración de 41,03 ng/100 \mul. El procedimiento de
acuerdo con la invención posibilitó un rendimiento tres veces
superior al obtenido con el procedimiento convencional.
A 1 \mul de ADN humano altamente puro digerido
con Mssl (Promega; 160 ng) se añadieron 2 \mul de ddH_{2}O. Las
muestras se desnaturalizaron durante 10 minutos a 96ºC. Después se
añadieron aproximadamente 10 \mul de solución de bisulfito (5,85
mol/l) y 7 \mul de una mezcla de secuestrante de radicales/dioxano
(5 \mul de dioxano más 2 \mul de secuestrante). Después de
esto, se extrajo la primera muestra (valor 0 h) y se colocó en
hielo. La mezcla de reacción se incubó durante 30 segundos a 96ºC y
después durante 59,5 minutos a 50ºC. La segunda muestra (valor de 1
h) se extrajo y se colocó en hielo. La tercera muestra (valor de 2
h) se incubó una vez más durante 30 segundos a 96ºC y durante 59,5
minutos a 50ºC. Posteriormente, esta muestra también se colocó en
hielo. La cuarta muestra (valor de 3 h) se incubó una vez más
durante 30 segundos a 96ºC y durante 59,5 minutos a 50ºC y
posteriormente también se enfrió. A las muestras se añadieron 30
\mul de ddH_{2}O. La mezcla de reacción se purificó mediante
columnas G25 Sephadex. El eluato se mezcló con 50 \mul de
Tris-HCl 100 mmol/l (pH 9,5) y se desulfonó a 96ºC
durante 20 minutos. Para cada reacción de PCR se usaron 2 \mul de
esta solución. Dos fragmentos específicos de bisulfito, dos
fragmentos no específicos y un fragmento genómico se amplificaron
cada vez en la PCR. Los fragmentos específicos de bisulfito se
amplifican con más intensidad, le más lejos que ha progresado la
conversión con bisulfito. Los fragmentos no específicos se
amplifican con independencia de la conversión con bisulfito y
proporcionan una indicación de la degradación del ADN. El fragmento
genómico sólo se amplifica en la medida en la que todavía hay
presente ADN genómico que no se ha convertido. Por tanto, la
amplificación del ADN genómico es una medida de una conversión
incompleta con bisulfito. Los amplificados separados en genes de
agarosa se pueden apreciar en la Figura 3. Se muestra que en el
procedimiento de acuerdo con la invención una gran parte del ADN se
ha convertido incluso después de una hora. El ADN genómico ya no se
puede detectar después de tres horas como máximo, es decir, la
conversión con bisulfito es completa. En el tratamiento con
bisulfito convencional, los valores correspondientes se producen,
como muy pronto, tras 5 horas (véase más adelante).
Las muestras que se trataron como en el ejemplo
4 se incubaron con un tiempo de reacción de 3 ó 5 horas con dos
termopicos. Los controles se hicieron reaccionar sin termopicos. La
purificación y la PCR se realizaron como se ha descrito en lo que
antecede. Se amplificaron dos fragmentos específicos de bisulfito.
Uno de los fragmentos era rico en citosina. Por tanto, fue necesario
un tiempo de reacción relativamente largo con el fin de conseguir
una conversión completa. En contraste con ello, el otro fragmento
fue pobre en citosina y, por tanto, completamente convertido después
de relativamente poco tiempo. Los resultados de las amplificaciones
se muestran en la Figura 4. La conversión convencional con
bisulfito se puede apreciar en las figuras de la izquierda, mientras
que la conversión optimizada con termopicos se puede apreciar en
las figuras de la derecha. El fragmento rico en citosina se
representa en la izquierda todas las veces, mientras que el
fragmento pobre en citosina se representa en la derecha. Se muestra
que el procedimiento de acuerdo con la invención posibilita una
detección más sensible. Por tanto, el fragmento rico en citosina
puede detectarse claramente incluso después de 3 horas con un
tratamiento con termopico, mientras que no se puede detectar con el
procedimiento convencional incluso después de 5 horas de tiempo de
reacción.
Se mostrará que el procedimiento de acuerdo con
la invención posibilita una conversión y purificación con bisulfito
muy eficaz. Para este fin se disolvieron diferentes cantidades de
M13-ADN y ADN humano en 100 \mul de agua. Las
soluciones de ADN se mezclaron con 354 \mul de la solución de
bisulfito (5,89 mol/l) y 146 \mul de dioxano que contiene un
secuestrante de radicales (ácido 2-carboxílico de
6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano,
98,6 mg en 2,5 ml de dioxano). La mezcla de reacción se
desnaturalizó durante 3 minutos a 9ºC y posteriormente se incubó
con el siguiente programa de temperaturas durante un total de 5 h:
30 minutos a 50ºC; un termopico (99,9ºC) durante 3 minutos; 3 horas
50ºC. Posteriormente las mezclas de reacción se purificaron mediante
ultrafiltración a través de una columna Millipore Microcon^{TM}.
La purificación se realizó esencialmente de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Para este fin, la mezcla de reacción
se mezcló con 300 \mul de agua, se cargó en la membrana de
ultrafiltración, se centrifugó durante 15 minutos y después se lavó
con 1 x tampón TE. En este tratamiento el ADN permanece en la
membrana. A continuación se realiza la desulfonación. Para este
fin, se añadieron 0,2 mol/l y se incubaron durante 10 minutos. A
continuación se realizó una centrifugación (10 minutos), seguida por
una etapa de lavado con 1 x tampón TE. Después de esto se eluyó el
ADN. Para este fin, la membrana se mezcló con 50 \mul de 1 x
tampón TE caliente (50ºC) durante 10 minutos. La membrana se volcó
de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Posteriormente se
realizó otra centrifugación por medio de la cual el ADN se eliminó
de la membrana. Las concentraciones de ADN se determinaron después
fluorométricamente (verde oliva). Los datos se muestran en la Tabla
1. El índice de recuperación de ADN asciende a al menos el 75%. En
los procedimientos conocidos para la conversión y purificación con
bisulfito de ADN, los índices de recuperación, en contraste, se
encuentran por debajo del 25%.
La Fig. 1 muestra el resultado del ejemplo 1. Se
muestra el patrón en gel de una hebra de ADN tratada con bisulfito
amplificada con PCR (izquierda: marcador de peso molecular,
derecha: producto de la PCR).
La Fig. 2 muestra los resultados del Ejemplo 3
(uso de DME). El ADN se aisló de muestras de plasma, se trató con
bisulfito y se amplificó mediante una PCR Lightcycler. En el eje Y
se muestra la señal fluorescente medida en cada ciclo. En el eje X
se indica el número de ciclos. Las curvas del procedimiento de
acuerdo con la invención se muestran en la izquierda y las del
procedimiento convencional se muestran en la derecha. Se muestra
que el procedimiento optimizado produce una señal fluorescente
significativa, incluso con un número pequeño de ciclos. El
rendimiento de ADN es superior que el obtenido con el procedimiento
convencional.
La Fig. 3 muestra los resultados del ejemplo 4.
Se muestra el gel resultante de una electroforesis tras una
amplificación mediante PCR. Dos fragmentos específicos de
bisulfito, dos fragmentos no específicos y un fragmento genómico se
amplificaron cada vez. La figura superior muestra el valor cero
(tiempo de reacción = 0 horas). La segunda figura de la parte
superior muestra la reacción con un termopico y durante una hora de
tiempo de reacción total. La tercera figura de la parte superior
corresponde a la reacción con dos termopicos y dos horas de tiempo
de reacción total. La figura más inferior muestra una reacción con
tres termopicos y tres horas de tiempo de reacción. Una gran parte
del ADN se convierte incluso después de una hora con el
procedimiento de acuerdo con la invención (segunda figura desde
arriba). Como máximo después de tres horas el ADN genómico ya no se
puede detectar (figura más inferior).
La Fig. 4 muestra los resultados del ejemplo 5.
Se muestra la electroforesis en gel tras una amplificación mediante
PCR. Se amplificaron dos fragmentos diferentes específicos de
bisulfito. Las figuras de la izquierda muestran el tratamiento con
bisulfito convencional, mientras que las de la derecha muestran el
procedimiento de acuerdo con la invención. En la parte superior se
muestra un tiempo de reacción de 3 horas y en la parte inferior se
muestra un tiempo de reacción de 5 horas. Una detección claramente
más sensible es posible con el procedimiento de acuerdo con la
invención (termopicos). Por tanto, el fragmento mostrado en la
calle izquierda se puede detectar tras 3 horas de tiempo de
reacción, mientras que el fragmento del procedimiento convencional
todavía no se puede detectar incluso después de 5 horas de
incubación.
<110> Epigenómica AG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para la detección de
metilaciones de citosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagggagtttt ttttagggaa tagaggga
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaatcccaaa acctctccac tacaacaa
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggtgatgga ggaggtttag taagt
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaccaataaa acctactcct cccttaa
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda de detección
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgtgaattt gtgtttgtta ttgtgtgttg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda de detección
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggtggttat tttttttatt aggttgtggt
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (14)
1. Un procedimiento para el diagnóstico y/o
pronóstico de enfermedades cancerosas, interacciones farmacológicas
indeseadas, enfermedad cardiovascular o inflamación en un paciente o
individuo, caracterizado porque se realizan las siguientes
etapas:
- a)
- Se extrae el ADN de muestras de tejido o de fluidos corporales,
- b)
- El ADN se convierte con bisulfito,
- c)
- El ADN convertido se purifica mediante ultrafiltración.
2. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado además porque la conversión
con bisulfito del ADN, en el que el ADN genómico se hace reaccionar
con un reactivo de bisulfito, se lleva a cabo en presencia de un
compuesto con la fórmula siguiente:
n =
1-35000
m = 1-3
R_{1} = H, Me, Et, Pr, Bu
R_{2} = H, Me, Et, Pr, Bu
3. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 2, caracterizado además porque dicho compuesto
implica un compuesto de n-alquilenglicol.
4. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 3, caracterizado además porque dicho compuesto
implica un éter dialquílico.
5. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 4, caracterizado además porque dicho compuesto
implica un éter dimetílico de dietilenglicol (DME).
6. El procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 2 a 5, caracterizado porque dicho compuesto
está presente en una concentración de 1-35% en
volumen,
7. El procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 2 a 5, caracterizado porque dicho compuesto
está presente en una concentración de 5-25% en
volumen,
8. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque la conversión con
bisulfito del ADN, en el que el ADN genómico aislado se hace
reaccionar con un reactivo de bisulfito, se lleva a cabo a una
temperatura en el intervalo de 0-80ºC y que la
temperatura de la reacción se incrementa hasta un intervalo de
85-100% brevemente durante el curso de la conversión
(termopico).
9. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 8, caracterizado además porque el número de
incrementos de la temperatura de duración breve (termopicos)
asciende de 2 a 5.
10. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 8, caracterizado porque durante los
incrementos de la temperatura de duración breve (termopicos) la
temperatura de reacción aumenta a 85 a 100ºC.
11. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 10, caracterizado porque los incrementos de
la temperatura de duración breve (termopicos) incrementan la
temperatura de reacción a 90 a 98ºC.
12. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 8, caracterizado además porque el ADN
convertido se purifica a través de partículas magnéticas.
13. El procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 12, caracterizado además porque el ADN
convertido se analiza mediante uno de los siguientes procedimientos:
MSP, Heavy Methyl, MsSNuPE, Methyl Light.
14. El procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque la conversión
con bisulfito del ADN se lleva a cabo en presencia de un compuesto
del grupo de dioxano, uno de sus derivados y un éter cíclico
alifático similar.
Applications Claiming Priority (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10347399 | 2003-10-09 | ||
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|---|---|---|---|---|
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| US7662549B1 (en) * | 2000-10-27 | 2010-02-16 | The University Of Southern California | Methylation altered DNA sequences as markers associated with human cancer |
| EP1379685A2 (en) * | 2000-11-08 | 2004-01-14 | University Of Southern California | Assay for the detection and quantitation of hemimethylation |
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