ES2272504T3 - Procedimiento para la deteccion de metilaciones de citosinas. - Google Patents

Procedimiento para la deteccion de metilaciones de citosinas. Download PDF

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Abstract

Procedimiento para la detección de metilaciones de citosinas en un ADN, caracterizado porque se realizan las siguientes etapas: a) una muestra de ADN genómico se incuba con una solución de un bisulfito (= hidrógeno-sulfito, disulfito) en el intervalo de concentraciones comprendidas entre 0, 1 y 6 mol/l, estando presente un disolvente desnaturalizante así como por lo menos un agente captador de radicales; b) la muestra tratada de ADN se diluye con agua o con una solución acuosa; c) la muestra de ADN se amplifica en una reacción con una polimerasa; d) realizándose antes de la etapa c) una desulfonación del ADN; e) se detecta en qué grado se ha modificado la secuencia mediante el tratamiento según la etapa a) con respecto a la muestra de ADN genómico y se saca una conclusión acerca del estado de metilación de por lo menos un locus en la muestra de ADN genómico.

Description

Procedimiento para la detección de metilaciones de citosinas.
El presente invento se refiere a un procedimiento para la detección de metilaciones de citosinas en ADN (ácidos desoxirribonucleicos).
Los planos de observación, bien estudiados después de los desarrollos metodológicos de los últimos años en la biología molecular, son los genes propiamente dichos, la traducción de estos genes en ARN (ácidos ribonucleicos) y las proteínas que resultan a partir de éstos. Cuándo se conecta un gen en el transcurso del desarrollo de un individuo, cuál es este gen y cómo se regulan la activación y la inhibición de determinados genes en células y tejidos determinadas/os se puede correlacionar con la magnitud y el carácter de la metilación de los genes y respectivamente del genoma. Por cuanto que unos estados patógenos se exteriorizan en un modelo modificado de metilación de genes individuales o del genoma.
La 5-metilcitosina es la base modificada covalentemente más frecuente en el ADN de células eucarióticas. Ella desempeña por ejemplo un cierto cometido en la regulación de la transcripción, en la impresión genética y en la génesis de tumores. La identificación de 5-metilcitosina como parte componente de una información genética presenta por lo tanto un considerable interés. Las posiciones de la 5-metilcitosina no se pueden identificar sin embargo mediante secuenciación, puesto que la 5-metilcitosina tiene el mismo comportamiento de apareamiento de bases que la citosina. Además de esto, en el caso de una amplificación por PCR (reacción en cadena de una polimerasa) se pierde totalmente la información epigenética, que llevan las 5-metilcitosinas.
Un método relativamente nuevo, y que entretanto se aplica con la mayor frecuencia, para la investigación de los ADN en cuanto a la existencia de 5-metilcitosina se basa en la reacción específica de un bisulfito con citosina, que después de una subsiguiente hidrólisis en condiciones alcalinas es transformada en uracilo, que en su comportamiento de apareamiento de bases se corresponde con la timidina. Por el contrario, la 5-metilcitosina no es modificada en estas condiciones. Por consiguiente, el ADN original es transformado de tal manera que la metilcitosina, que originalmente no puede ser diferenciada de la citosina por su comportamiento de hibridación, ahora puede ser detectada, mediante técnicas "normales" de biología molecular, como la citosina que ha quedado únicamente, por ejemplo mediante amplificación e hibridación o secuenciación. Todas estas técnicas se basan en un apareamiento de bases, que ahora se aprovecha totalmente. El estado de la técnica, en lo que concierne a la sensibilidad, es definido mediante un procedimiento, que encierra el ADN a investigar en una matriz de agarosa, de esta manera se evitan la difusión y la renaturalización del ADN (el bisulfito reacciona solamente en un ADN monocatenario) y reemplaza a todas las etapas de precipitación y purificación por una diálisis rápida (Olek, A. y colaboradores, Nucl. Acids. Res. 1996, 24, 5064-5066). Con este método se pueden investigar células individuales, lo cual demuestra el potencial del método. No obstante, hasta ahora se investigan solamente regiones individuales con una longitud hasta de aproximadamente 3.000 pares de bases, y no es posible una investigación global de células en cuanto a millares de posibles análisis de metilación. No obstante, tampoco este procedimiento puede analizar de una manera confiable fragmentos muy pequeños a partir de pequeñas cantidades de muestras. Éstos se pierden, a pesar de la protección contra la difusión a través de la matriz.
Una recopilación acerca de las posibilidades adicionales conocidas de detectar 5-metilcitosinas se puede tomar de los siguientes artículos de compendio: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255.
La técnica del bisulfito se utiliza hasta ahora, dejando aparte unas pocas excepciones (p.ej. Zechnigk, M. y colaboradores, Eur. J. Hum. Gen. 1997, 5, 94-98) solamente en la investigación. Sin embargo, siempre se amplifican unos cortos trozos específicos de un gen conocido de acuerdo con un tratamiento con bisulfito y o bien se secuencian completamente (Olek, A. y Walter, J., Nat. Genet. 1997, 17, 275-276) o se detectan posiciones individuales de citosinas mediante una "reacción de prolongación con cebadores" (Gonzalgo, M. L. y Jones, P. A., Nucl. Acids Res. 1997, 25, 2529-2531, documento de solicitud de patente internacional WO 9500669) o mediante un corte con enzimas (Xiong, Z. y Laird, P. W., Nucl. Acids Res. 1997, 25, 2532-2534). Además, también se ha descrito la detección por hibridación (Olek y colaboradores, documento WO 9928498).
Otras publicaciones, que se ocupan de la aplicación de la técnica del bisulfito para la detección de metilaciones en el caso de genes individuales son: Xiong, Z. y Laird, P. W. (1997), Nucl. Acids Res. 25, 2532; Gonzalgo, M. L. y Jones, P. A. (1997), Nucl. Acids Res. 25, 2529; Grigg, S. y Clark, S (1994), Bioassays 16, 431; Zeschnik, M. y colaboradores (1997), Human Molecular Genetics 6, 387; Teil, R. y colaboradores (1994), Nucl. Acids Res. 22, 695; Martin, V. y colaboradores (1995), Gene 157, 261; documentos WO 97 46705, WO 95 15373 y WO 45560.
Un compendio acerca del estado de la técnica en la preparación de agrupaciones de oligómeros (en inglés Oligomer Arrays) se puede deducir de una edición especial, aparecida en Enero de 1999, de Nature Genetics (suplemento de Nature Genetics, volumen 21, Enero de 1999), de la bibliografía allí citada y del documento de patente de los EE.UU. US 5.994.065 a través de métodos para la preparación de soportes sólidos para moléculas dianas, tales como oligonucleótidos en el caso de una señal de fondo inespecífica disminuida.
Para la exploración de una agrupación inmovilizada de ADN, se han utilizado muchas veces sondas marcadas fluorescentemente. Es especialmente apropiada para marcaciones por fluorescencia la simple disposición de colorantes Cy3 y Cy5 junto al OH en 5' de la respectiva sonda. La detección de la fluorescencia de las sondas hibridadas se efectúa por ejemplo a través de un microscopio confocal. Los colorantes Cy3 y Cy5 son obtenibles comercialmente, junto a muchos otros.
La espectrometría de masas por desorción/ionización mediante láser, asistida por una matriz (MALDI-TOF), es un desarrollo muy eficiente para el análisis de biomoléculas (Karas, M. y Hillenkamp, F. (1988), Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10000 daltons [ionización y desorción por láser de proteínas con unas masas moleculares superiores a 10.000 daltons]. Anal Chem. 60: 2299-2301). Un analito es embebido en una matriz absorbente de luz. Mediante un corto impulso de láser, la matriz se evapora y la molécula del analito se transporta de esta manera sin fragmentar a la fase gaseosa. Mediante choques con moléculas de la matriz se consigue la ionización del analito. Una tensión eléctrica aplicada acelera los iones en un tubo de vuelo exento de campo. A causa de sus diferentes masas, los iones se aceleran con diferente intensidad. Los iones más pequeños alcanzan al detector con anterioridad que los que tienen un mayor tamaño.
La espectroscopia por MALDI-TOF es excelentemente apropiada para el análisis de péptidos y proteínas. El análisis de ácidos nucleicos es algo más difícil (Gut, I. G. y Beck, S. (1995)), DNA and Matrix Assisted Laser Dessorption Ionization Mass Spectrometry. Molecular Biology: Current innovations and Future Trends [ADN y espectrometría de masas por desorción e ionización mediante láser asistida por una matriz. Biología molecular: Innovaciones actuales y futuras tendencias] 1:147-157). Para los ácidos nucleicos, la sensibilidad es aproximadamente 100 veces peor que para los péptidos y disminuye en un grado superior al proporcional con un tamaño creciente de los fragmentos. Para ácidos nucleicos, que tienen una cadena principal (espina dorsal) cargada negativamente múltiples veces, el proceso de ionización por medio de la matriz es esencialmente más ineficiente. En la espectroscopia por MALDI-TOF, la elección de la matriz desempeña un cometido eminentemente importante. Para la desorción de péptidos se han encontrado algunas matrices muy eficientes, que proporcionan una cristalización muy fina. Para los ADN existen ciertamente entretanto algunas matrices interesantes, pero con esto no se disminuye la diferencia de sensibilidades. La diferencia de sensibilidades se puede disminuir modificando el ADN por medios químicos de tal manera que éste sea más similar a un péptido. Los ácidos nucleicos derivatizados con fosforotioatos, en los cuales los fosfatos habituales de la cadena principal están reemplazados por tiofosfatos, se pueden transformar mediante una sencilla técnica química de alquilación en un ADN neutro en cuanto a cargas (Gut, I. G. y Beck, S. (1995), A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry [Un proceso para la alquilación selectiva de un ADN y detección por espectrometría de masas] Nucleic Acids Res. 23: 1367-1373). El acoplamiento de una "etiqueta con cargas" (en inglés "charge tag") con este ADN modificado da como resultado el aumento de la sensibilidad en la misma magnitud con la que se encuentra para péptidos. Una ventaja adicional del "etiquetado con cargas" es la estabilidad aumentada del análisis frente a impurezas, que dificultan en gran manera la detección de substratos sin
modificar.
Un ADN genómico se obtiene por métodos clásicos a partir de un ADN de muestras de células, tejidos u otras muestras experimentales. Esta metodología clásica se encuentra en referencias tales como la de Fritsch y Maniatis coordinadores de edición, Molecular Cloning: A Laboratory Manual [Clonación molecular: Un manual de laboratorio], 1989.
La urea mejora la eficiencia del tratamiento con un bisulfito antes de la secuenciación de 5-metilcitosina en un ADN genómico (Paulin R, Grigg GW, Davey MW, Piper AA. (1998), Nucleic Acids Res. 26: 5009-5010).
Clark y colaboradores ("High sensitivity mapping of methylated cytosines" [Cartografiado con alta sensibilidd de citosinas metiladas], Nucleic Acids Research, 1994, tomo 22, Nº 15, páginas 2990-2997) describen un procedimiento para el análisis de citosinas metiladas. Ellos describen en ese caso una etapa de desulfonación y una amplificación por PCR.
Un análisis de la metilación mediando utilización de un tratamiento con un bisulfito y de una amplificación por PCR con una mezcla de cebadores degenerados, es descrito por Wong y colaboradores ("p16-INK4a promoter is hypermethylated at a high frequency in esophageal adenocarcinomas" [el promotor p16-INK4a es hipermetilado con una alta frecuencia en adenocarcinomas esofágicos], Cancer Research, 1997, tomo 57, Nº 13, páginas 2619-
2622).
Además en el documento US 4.851.331 se describen un procedimiento para la determinación de una secuencia de nucleótidos en un ácido nucleico de una muestra biológica, y un estuche de ensayo correspondiente.
Además, Landegren y colaboradores ("A ligase mediated gene detection technique" [una técnica para la detección de genes, mediada por una ligasa], Science, 1988, tomo 241, Nº 4869, páginas 1077 - 1080) describen un procedimiento para la detección de genes.
Las posibilidades y los límites de las reacciones en cadena con ligasas modificadas en el caso de la detección y del análisis de unos ADN, que se diferencian en una base, se investigaron por Abravaya y colaboradores ("Detection of point mutation with a modified ligase chain reaction (Gap-LCR)" [Detección de una mutación puntual con una reacción en cadena de ligasa modificada, LCR de intersticio] Nucleic Acids Research, 1995, tomo 23, Nº 4, páginas 675 - 682).
Es misión del presente invento, por lo tanto, poner a disposición un procedimiento para la detección de metilaciones de citosinas en un ADN, que supere las desventajas del estado de la técnica.
El problema planteado por esta misión se resuelve mediante el recurso de que se pone a disposición un procedimiento para la detección de metilaciones de citosinas en un ADN, realizándose las siguientes etapas de trabajo:
a)
una muestra de ADN genómico se incuba con una solución de un bisulfito (= hidrógeno-sulfito, disulfito) en el intervalo de concentraciones comprendidas entre 0,1 y 6 mol/l, estando presente un disolvente desnaturalizante así como por lo menos un agente captador de radicales;
b)
la muestra tratada de ADN se diluye con agua o con una solución acuosa;
c)
la muestra de ADN se amplifica en una reacción con una polimerasa;
d)
realizándose antes de la etapa c) una desulfonación del ADN;
e)
se detecta en qué grado se ha modificado la secuencia mediante el tratamiento según la etapa a) con respecto a la muestra de ADN genómico y se saca una conclusión acerca del estado de metilación de por lo menos un sitio (locus) en la muestra de ADN genómico.
Conforme al invento, se prefiere en este caso que el reactivo y/o disolvente desnaturalizante se seleccione entre la siguiente lista de compuestos o clases de compuestos:
Poli(etilenglicol)-dialquil-éteres, dioxano y sus derivados sustituidos, acetonitrilo, alcoholes primarios, alcoholes secundarios, alcoholes terciarios, di(etilenglicol)-dialquil-éteres, tri-(etilenglicol)-dialquil-éteres, tetra(etilenglicol)dialquil-éteres, penta(etilenglicol)-dialquil-éteres, hexa(etilenglicol)-dialquil-éteres, DMSO (dimetil-sulfóxido), THF (tetrahidrofurano).
Se prefiere en este caso, además, que el agente captador de radicales esté seleccionado entre el siguiente conjunto de compuestos:
Di- y tri-hidroxibencenos, extracto de té verde (en inglés green tea extract), picnogenol (extracto de corteza de pino), extracto de Ginkgo Biloba (EGb 761), mezcla de flavonoides de diferentes extractos de frutas y legumbres (GNLD), bio-normalizadores (Sun-O Corp), DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazilo), NDGA (ácido nordihidroguayarético), trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-cromano-2-carboxílico), 2,6-di-terc.-butil-fenol, 4-metil-di-terc.-butil-fenol, 4-metoxi-di-terc.-butil-fenol, 2,6-di-terc.-butil-p-cresol, ácido 3,4-dihidroxi-benzoico, vitamina C, vitamina E, vitamina Q, hidroquinona, ubiquinona, lignanos, hidroxiterpenos, flavonoides, curcumina, taninos, compuestos de ácido retínico, Ge-132 bis-beta-carboxietil-germanio-sesquióxido, superóxido-dismutasa (SOD), superóxido-catalasa, alfa-naftoflavona, di(2-metil-5-cloro-fenil)-ditionato y derivados de Cu(II), mebendazol, extracto de alcaloides CS (= soluble en cloroformo),
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ácido 4-(3-hidroxi-1,4-dioxo-1,4-dihidronaftalen-2-il)-benzoico,
éster metílico de ácido(3-metoxi-1,4-dioxo-1,4-dihidronaftalen-2-il)-benzoico
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2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-hidroxi-6,7-dimetil-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-hidroxi-5-metil-1,4-naftoquinona,
3-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-2-hidroxi-5-metil-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-hidroxi-6-metil-1,4-naftoquinona,
3-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-2-hidroxi-6-metil-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-hidroxi-5,6-dimetil-1,4-naftoquinona,
2-(3-bromo-5-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-hidroxi-5,6-dimetil-1,4-naftoquinona,
3-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-2-hidroxi-5,6-dimetil-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-hidroxi-5,7-dimetil-1,4-naftoquinona,
3-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-2-hidroxi-5,7-dimetil-1,4-naftoquinona.
Se prefiere conforme al invento en este caso que se desnaturalice térmicamente la muestra de ADN genómico antes del tratamiento.
Se prefiere esencialmente conforme al invento que la etapa c) se lleve a cabo en dos etapas parciales de la siguiente manera:
a) una preamplificación por PCR con por lo menos un par de cebadores de diferente secuencia, que se hibridan inespecíficamente con una muestra de ADN previamente tratada de acuerdo con la reivindicación 1, y por lo tanto en la etapa de PCR proporcionan más de un material amplificado; b) una amplificación por PCR del producto formado en la preamplificación con cebadores de diferente secuencia, que en cada caso son idénticos o complementarios inversos con respecto a un segmento de la muestra de ADN previamente tratado de acuerdo con la reivindicación 1 [cadena (+) o cadena (-)] y se hibridan específicamente con el ADN que se ha de amplificar.
Se prefiere además conforme al invento que la amplificación de varios segmentos de ADN se lleve a cabo en un recipiente de reacción.
Se prefiere conforme al invento además de esto que para la reacción con una polimerasa se utilice una polimerasa de ADN estable frente al calor.
Se prefiere también que para la detección del ADN previamente tratado los productos de la PCR se hibriden sobre una agrupación de oligonucleótidos y a continuación se realicen las siguientes etapas parciales:
(a)
el ADN genómico amplificado se hibrida con por lo menos un oligonucleótido mediando formación de un dúplex, delimitando los mencionados oligonucleótidos hibridados, con su extremo 3' directamente o a una cierta distancia de hasta 10 bases, con las posiciones, que se han de investigar en lo que se refiere a su metilación en la muestra de ADN genómico;
(b)
el oligonucleótido con una secuencia conocida de n nucleótidos se prolonga por lo menos en un nucleótido mediante una polimerasa, llevando el nucleótido una marcación detectable, y siendo la prolongación dependiente del estado de metilación de la respectiva citosina en la muestra de ADN genómico.
Se prefiere conforme al invento que, para la detección del ADN previamente tratado, los productos de la PCR se hibriden sobre una agrupación de oligonucleótidos y a continuación se realicen las siguientes etapas parciales:
(a)
se hibrida un conjunto de oligonucleótidos con el ADN genómico amplificado mediando formación de un dúplex, consistiendo este conjunto de oligonucleótidos en dos diferentes especies, y delimitando los oligonucleótidos hibridados de la primera especie con su extremo 3' directamente o a una distancia de hasta 10 bases, con las posiciones, que se han de investigar en lo que se refiere a su metilación en la muestra de ADN genómico, e hibridándose el segundo oligonucleótido de la segunda especie con una segunda región de la molécula diana, de manera tal que el extremo 5' del oligonucleótido de la segunda especie esté separado por una laguna con el tamaño de un nucleótido individual o hasta de 10 nucleótidos desde el extremo 3' del oligonucleótido hibridado de la primera especie en el sitio de la posición seleccionada mencionada;
(b)
el oligonucleótido de la primera especie con una secuencia conocida de n nucleótidos se prolonga mediante una polimerasa en a lo sumo el número de nucleótidos, que están situados entre el extremo 3' del oligonucleótido de la 1ª especie y el extremo 5' del oligonucleótido de la 2ª especie, siendo la prolongación dependiente del estado de metilación de la respectiva citosina en la muestra de ADN genómico;
(c)
se incuban los oligonucleótidos en presencia de una ligasa, siendo unidos el oligonucleótido colindante de la primera especie, prolongado mediante la reacción de la polimerasa, y el oligonucleótido de la segunda especie, y obteniéndose de esta manera un producto de ligación, siempre y cuando que en la etapa precedente se hubiera efectuado una prolongación del oligonucleótido de la primera especie, de tal manera que entonces el extremo 3' con una función 3'-hidroxi presente del oligonucleótido prolongado delimite directamente con el extremo 5' del oligonucleótido de la segunda especie.
En tal caso se prefiere especialmente conforme al invento que los oligonucleótidos utilizados de la primera especie y/o los oligonucleótidos utilizados de la segunda especie contengan o bien solamente las bases T, A y C o sin embargo las bases T, A y G.
Se prefiere además conforme al invento que para la detección del ADN previamente tratado los productos de la PCR se hibriden sobre una agrupación de oligonucleótidos y a continuación se realicen las siguientes etapas parciales:
(a)
se hibrida el ADN genómico amplificado con por lo menos un oligonucleótido con una secuencia conocida de n nucleótidos, mediando formación de un dúplex, hibridándose los mencionados oligonucleótidos hibridados con su extremo 3' de una manera parcial o total con las posiciones, que se han de investigar en lo que se refiere a su metilación en la muestra de ADN genómico;
(b)
el oligonucleótido, siempre y cuando que se hubiera hibridado previamente con su extremo terminal en 3', sin apareamientos erróneos de bases, con la posición que se ha de investigar, se prolonga por lo menos en un nucleótido mediante una polimerasa, llevando por lo menos un nucleótido una marcación detectable y siendo la prolongación dependiente del estado de metilación de la respectiva citosina en la muestra de ADN genómico.
Se prefiere también conforme al invento que los productos de la PCR y/o los productos de la prolongación y/o los productos de la ligación sean provistos, para la detección, de una marcación detectable. En este caso se prefiere especialmente que las marcaciones sean marcaciones fluorescentes y/o que las marcaciones sean radionúclidos. Se prefiere especialmente en tal caso que las marcaciones de los nucleótidos sean marcaciones de masas desprendibles, que sean detectables en un espectrómetro de masas.
En particular, se prefiere también que los productos de la PCR y/o los productos de la prolongación y/o los productos de la ligación se detecten en su totalidad en el espectrómetro de masas y por consiguiente sean caracterizados inequívocamente por medio de su masa. Se prefiere conforme al invento también que en cada caso se detecte en el espectrómetro de masas un fragmento de los productos de la PCR y/o los productos de la prolongación y/o los productos de la ligación.
El procedimiento conforme al invento está caracterizado de manera preferida también por el hecho de que el fragmento del producto de la PCR y/o del producto de la prolongación y/o del producto de la ligación se produce por digestión con una o varias exo- o endo-nucleasas.
Se prefiere además que, para la mejor posibilidad de detección en el espectrómetro de masas, los fragmentos producidos sean provistos de una carga neta positiva o negativa individual.
Se prefiere muy especialmente que los productos de la PCR y/o los productos de la prolongación y/o los productos de la ligación sean detectados y visualizados mediante una espectrometría de masas con desorción/ionización mediante láser asistida por una matriz (MALDI-TOF) o mediante una espectrometría de masas por proyección de electrones (en inglés electrospray) (ESI).
El procedimiento conforme al invento es preferido también cuando se realiza de tal manera que el ADN genómico se obtiene a partir de una muestra de ADN, comprendiendo las fuentes para ADN p.ej. linajes celulares, sangre, un esputo, una defecación, una orina, un líquido de cerebro y médula espinal (cefalorraquídeo), un tejido embebido en parafina, por ejemplo un tejido de ojo, intestino, riñón, cerebro, corazón, próstata, pulmón, mama o hígado, portaobjetos histológicos y todas las posibles combinaciones de estos elementos.
Un objeto adicional del presente invento es la utilización de un procedimiento conforme al invento para el diagnóstico y/o pronóstico de episodios desventajosos para pacientes o individuos, perteneciendo estos episodios desventajosos por lo menos a una de las siguientes categorías: efectos indeseados de medicamentos; enfermedades de cáncer, fallos funcionales, daños o una enfermedad del sistema nervioso central (SNC); síntomas de agresión o trastornos del comportamiento; consecuencias clínicas, psicológicas y sociales de daños cerebrales; trastornos psicóticos y trastornos de la personalidad; demencia y/o síndromes asociados; una enfermedad, un fallo funcional y un daño cardiovascular; un fallo funcional, un daño o una enfermedad del tracto gastrointestinal; un fallo funcional, un daño o una enfermedad del sistema respiratorio; una lesión, una inflamación, una infección inmunidad y/o reconvalescencia; un fallo funcional, un daño o una enfermedad del cuerpo como desviación en el proceso de desarrollo; un fallo funcional, un daño o una enfermedad de la piel, de los músculos, del tejido conjuntivo o de los huesos; un fallo funcional, un daño o una enfermedad de los sistemas endocrino y metabólico; dolores de cabeza o un fallo funcional sexual.
Es objeto del invento también la utilización de un procedimiento conforme al invento para la distinción de tipos de células o de tejidos o para la investigación de la diferenciación celular.
Un objeto adicional del presente invento es finalmente un estuche de ensayo, que consiste en un reactivo que contiene un bisulfito, disolventes desnaturalizantes así como agentes captadores de radicales y cebadores para la preparación de los materiales amplificados, así como unas instrucciones para la realización de un ensayo de acuerdo con un procedimiento conforme al invento.
El presente invento pone a disposición un procedimiento automatizable para la detección de metilcitosina, que contiene solamente etapas de pipeteo. De esta manera se mejora la eficiencia de los procedimientos existentes, en lo que se refiere a la sencillez de manipulación, la calidad, los costos y, sobre todo, el caudal de realización.
Se describe un procedimiento automatizable para la detección de metilcitosina en muestras de ADN genómicos:
El ADN genómico que se ha de analizar es obtenido preferiblemente a partir de las fuentes usuales para ADN, tales como p.ej. linajes celulares, sangre, un esputo, una defecación, una orina, un líquido de cerebro y médula espinal (cefalorraquídeo), un tejido embebido en parafina, por ejemplo un tejido de ojo, intestino, riñón, cerebro, corazón, próstata, pulmón, mama o hígado, portaobjetos histológicos y todas las posibles combinaciones de los mismos.
En la primera etapa del procedimiento, el ADN empleado se trata preferiblemente con un bisulfito (= disulfito, hidrógeno-sulfito) de tal manera que todas las citosinas no metiladas en la posición 5 de la base sean modificadas de tal modo que resulte una base diferente en lo que se refiere al comportamiento de apareamiento de bases, mientras que las citosinas metiladas en la posición 5 permanezcan inalteradas.
La muestra de ADN genómico se desnaturaliza de una manera especialmente preferida por medios térmicos antes del tratamiento.
Si para la reacción se utiliza un bisulfito en el intervalo de concentraciones entre 0,1 y 6 mol/l, en las bases de citosina no metiladas tiene lugar una reacción por adición. Para el procedimiento conforme al invento deben estar presentes además un reactivo o disolvente desnaturalizante así como un agente captador de radicales.
En este caso, como reactivos o disolventes desnaturalizantes entran en cuestión preferiblemente los compuestos o las clases de compuestos siguientes:
Poli(etilenglicol)-dialquil-éteres, dioxano y sus derivados sustituidos, acetonitrilo, alcoholes primarios, alcoholes secundarios, alcoholes terciarios, di(etilenglicol)-dialquil-éteres, tri-(etilenglicol)-dialquil-éteres, tetra(etilenglicol)dialquil-éteres, penta(etilenglicol)-dialquil-éteres, hexa(etilenglicol)-dialquil-éteres, DMSO o THF.
Como agente captador de radicales es apropiado de manera preferida el conjunto de los compuestos enumerados en la lista 1 o sus derivados. La subsiguiente hidrólisis en condiciones alcalinas se realiza luego para la transformación de bases de nucleótidos de citosina no metilada en uracilo.
En la segunda etapa del procedimiento, la muestra tratada de ADN se diluye con agua o con una solución acuosa. De manera preferida, a continuación se lleva a cabo una desulfonación del ADN (durante 10-30 min, a 90-100ºC), a un valor alcalino del pH.
En la tercera etapa del procedimiento, la muestra de ADN se amplifica en una reacción en cadena de una polimerasa, preferiblemente con una polimerasa de ADN estable frente al calor. La amplificación de varios segmentos de ADN se realiza preferiblemente en un recipiente de reacción.
La etapa de procedimiento se lleva a cabo de manera preferible en dos etapas parciales. Se comienza con una preamplificación por PCR con por lo menos un par de cebadores de diferente secuencia, que se hibridan inespecíficamente con la muestra de ADN previamente tratada y por lo tanto en la etapa de PCR proporcionan más de un material amplificado. Después de ello se realiza una amplificación por PCR del producto formado en la preamplificación, con cebadores de diferente secuencia, que en cada caso son idénticos o complementarios inversos con un segmento de la muestra de ADN previamente tratada [cadena (+) o cadena (-)] y que se hibridan específicamente con el ADN que se ha de amplificar.
En este contexto queda claro que tales preamplificaciones no se realizan frecuentemente como reacciones PCR, sino como reacciones de prolongación con cebadores, que no exigen ninguna polimerasa estable frente al calor.
En la última etapa del procedimiento se detecta en qué grado se ha modificado la secuencia mediante el tratamiento con un reactivo que contiene un bisulfito con respecto a la muestra de ADN genómico y se saca una conclusión sobre el estado de metilación de por lo menos un locus en la muestra de ADN genómico.
Para la detección, los productos de la PCR se hibridan de manera especialmente preferida sobre una agrupación de oligonucleótidos.
En una variante preferida del procedimiento, después de la hibridación sobre una agrupación de oligonucleótidos se llevan a cabo las siguientes etapas parciales:
a)
el ADN genómico amplificado se hibrida con por lo menos un oligonucleótido mediando formación de un dúplex, delimitando los mencionados oligonucleótidos hibridados, con su extremo 3' directamente o a una distancia de hasta 10 bases, con las posiciones, que se han de investigar en lo que se refiere a su metilación en la muestra de ADN genómico;
b)
el oligonucleótido con una secuencia conocida de n nucleótidos se prolonga mediante una polimerasa, por lo menos en un nucleótido, llevando el nucleótido una marcación detectable y siendo la prolongación dependiente del estado de metilación de la respectiva citosina en la muestra de ADN genómico.
En una variante preferida adicional del procedimiento, después de la hibridación sobre una agrupación de oligonucleótidos se llevan a cabo las siguientes etapas parciales:
(a)
se hibrida un conjunto de oligonucleótidos con el ADN genómico amplificado mediando formación de un dúplex, consistiendo este conjunto de oligonucleótidos en dos especies diferentes, y delimitando los oligonucleótidos hibridados de la primera especie con su extremo 3' directamente o a una distancia de hasta 10 bases, con las posiciones, que se han de investigar en lo que se refiere a su metilación en la muestra de ADN genómico, e hibridándose el segundo oligonucleótido de la segunda especie con una segunda región de la molécula diana, de manera tal que el extremo 5' del oligonucleótido de la segunda especie esté separado por una laguna con el tamaño de un nucleótido individual o de hasta 10 nucleótidos desde el extremo 3' del oligonucleótido hibridado de la primera especie en el sitio de la mencionada posición seleccionada;
(b)
el oligonucleótido de la primera especie con una secuencia conocida de n nucleótidos se prolonga mediante una polimerasa en a lo sumo el número de nucleótidos que están situados entre el extremo 3' del oligonucleótido de la 1ª especie y el extremo 5' del oligonucleótido de la 2ª especie, siendo la prolongación dependiente del estado de metilación de la respectiva citosina en la muestra de ADN genómico;
(c)
se incuban los oligonucleótidos en presencia de una ligasa, siendo unidos el oligonucleótido colindante de la primera especie, prolongado mediante la reacción con una polimerasa, y el oligonucleótido de la segunda especie, y obteniéndose de esta manera un producto de ligación, siempre y cuando que en la etapa precedente se hubiera efectuado una prolongación del oligonucleótido de la primera especie de tal manera que entonces el extremo 3' con una función 3’-hidroxi presente del oligonucleótido prolongado colinde con el extremo 5' del oligonucleótido de la segunda especie que preferiblemente se presenta en estado fosforilado.
Los oligonucleótidos utilizados de la primera especie y/o los oligonucleótidos utilizados de la segunda especie contienen de manera especialmente preferida o bien solamente las bases T, A y C o sin embargo las bases T, A y G.
En una variante de nuevo preferida del procedimiento, después de la hibridación sobre una agrupación de oligonucleótidos se llevan a cabo las siguientes etapas parciales:
(a)
se hibrida el ADN genómico amplificado con por lo menos un oligonucleótido que tiene una secuencia conocida de n nucleótidos mediando formación de un dúplex, hibridándose los mencionados oligonucleótidos hibridados, con su extremo 3' parcial o totalmente con las posiciones, que se han de investigar en lo que se refiere a su metilación en la muestra de ADN genómico;
(b)
el oligonucleótido, siempre y cuando que se hubiera hibridado previamente con su extremo terminal 3' sin apareamientos erróneos de bases con la posición que se ha de investigar, se prolonga por lo menos en un nucleótido mediante una polimerasa, llevando por lo menos un nucleótido una marcación detectable y siendo la prolongación dependiente del estado de metilación de la respectiva citosina en la muestra de ADN genómico.
Los productos de la PCR y/o los productos de la prolongación y/o los productos de la ligación son provistos para la detección, de una manera especialmente preferida, de una marcación detectable.
Preferiblemente, las marcaciones de los productos de la PCR y/o de los productos de la prolongación y/o los productos de la ligación son marcaciones fluorescentes, radionúclidos o marcaciones de masas desprendibles, que se detectan en un espectrómetro de masas.
Los productos de la PCR y/o los productos de la prolongación y/o los productos de la ligación se pueden detectar preferiblemente en su totalidad en el espectrómetro de masas y por consiguiente son caracterizados inequívocamente mediante su masa.
De manera especialmente preferida, se detecta en cada caso un fragmento de los productos de la PCR y/o de los productos de la prolongación y/o de los productos de la ligación en el espectrómetro de masas.
El fragmento del producto de la PCR y/o del producto de la prolongación y/o del producto de la ligación se produce de manera preferida por digestión con una o varias exo- o endo-nucleasas.
Para la mejor posibilidad de detección en el espectrómetro de masas, los fragmentos producidos tienen de manera especialmente preferida una carga neta positiva o negativa individual.
Los productos de la PCR y/o los productos de la prolongación y/o los productos de la ligación se detectan y visualizan preferiblemente mediante una espectrometría de masas por desorción/ionización mediante láser asistida por una matriz (MALDI-TOF) o mediante una espectrometría de masas por proyección de electrones (ESI).
El presente invento se utiliza preferiblemente para el diagnóstico y/o pronóstico de episodios desventajosos para pacientes o individuos, perteneciendo estos episodios desventajosos por lo menos a una de las siguientes categorías: efectos indeseados de medicamentos; enfermedades de cáncer, fallos funcionales, daños o una enfermedad del sistema nervioso central (SNC); síntomas de agresión o trastornos del comportamiento; consecuencias clínicas, psicológicas y sociales de daños cerebrales; trastornos psicóticos y trastornos de la personalidad; demencia y/o síndromes asociados; una enfermedad, un fallo funcional y un daño cardiovascular; un fallo funcional, un daño o una enfermedad del tracto gastrointestinal; un fallo funcional, un daño o una enfermedad del sistema respiratorio; una lesión, una inflamación, una infección inmunidad y/o reconvalescencia; un fallo funcional, un daño o una enfermedad del cuerpo como desviación en el proceso de desarrollo; un fallo funcional, un daño o una enfermedad de la piel, de los músculos, del tejido conjuntivo o de los huesos; un fallo funcional, un daño o una enfermedad de los sistemas endocrino y metabólico; dolores de cabeza o un fallo funcional sexual.
El nuevo procedimiento sirve además de manera especialmente preferida para la diferenciación de tipos de células, tejidos para la investigación de la diferenciación de células.
Es objeto del presente invento, además, un estuche de ensayo que contiene un reactivo que contiene un bisulfito, disolventes desnaturalizantes así como agentes captadores de radicales de acuerdo con la lista 1, cebadores para la producción de los materiales amplificados y unas instrucciones para la realización de un ensayo.
Lista 1:
Di- y tri-hidroxibencenos, extracto de té verde (en inglés green tea extract), picnogenol (extracto de corteza de pino), extracto de Ginkgo Biloba (EGb 761), mezcla de flavonoides de diferentes extractos de frutas y legumbres (GNLD), bio-normalizadores (Sun-O Corp), DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazilo), NDGA (ácido nordihidroguayarético), trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-cromano-2-carboxílico), 2,6-di-terc.-butil-fenol, 4-metil-di-terc.-butil-fenol, 4-metoxi-di-terc.-butil-fenol, 2,6-di-terc.-butil-p-cresol, ácido 3,4-dihidroxi-benzoico, vitamina C, vitamina E, vitamina Q, hidroquinona, ubiquinona, lignanos, hidroxiterpenos, flavonoides, curcumina, taninos, compuestos de ácido retínico, Ge-132 bis-beta-carboxietil-germanio-sesquióxido, superóxido-dismutasa (SOD), superóxido-catalasa, alfa-naftoflavona, di(2-metil-5-cloro-fenil)-ditionato y derivados de Cu(II), mebendazol, extracto de alcaloides CS (= soluble en cloroformo),
4-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-hidroxi-1,2-naftoquinona,
4-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-metoxi-1,2-naftoquinona,
4-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-1,2-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-bromo-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-cloro-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-metoxi-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-hidroxi-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-1,4-naftoquinona,
4-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-hidroxi-5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetrahidro-1,2-antraquinona,
4-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-metoxi-5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetrahidro-1,2-antraquinona,
4-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetrahidro-1,2-antraquinona,
3-bromo-4-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetrahidro-1,2-antraquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-oxociclohexa-2,5-dieniliden)-indan-1,3-diona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-oxociclohexa-2,5-dieniliden)-3,4-epoxi-3-hidroxi-4-metoxi-3,4-dihidro-2H-naftalen-1-ona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-oxociclohexa-2,5-dieniliden)-3,4-epoxi-3,4-dimetoxi-3,4-dihidro-2H-naftalen-1-ona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-indan-1-ona, 3,3-bi-[2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-inden-1-on]-3-ilo,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-bromo-5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetrahidro-1,4-antraquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-cloro-5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetrahidro-1,4-antraquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-metoxi-5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetrahidro-1,4-antraquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-hidroxi-5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetrahidro-1,4-antraquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetrahidro-1,4-antraquinona,
2-bromo-3-(3-bromo-5-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetrahidro-1,4-antraquinona,
2-bromo-3-(3,5-dibromo-4-hidroxi-fenil)-5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetrahidro-1,4-antraquinona,
2-bromo-3-(3-bromo-5-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-hidroxi-5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetrahidro-1,4-antraquinona,
3-bromo-2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-1,4-antraquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-metoxi-1,4-antraquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-hidroxi-1,4-antraquinona,
5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetrahidronaftaleno-1,3-diol,
3-metoxi-5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetrahidronaftalen-1-ol,
ácido 4-(3-cloro-5,5,8,8-tetrametil-1,4-dioxo-1,4,5,6,7,8-hexahidroantracen-2-il)-benzoico,
4-(3-cloro-5,5,8,8-tetrametil-1,4-dioxo-1,4,5,6,7,8-hexahidroantracen-2-il)-benzoato de metilo,
ácido 4-(3-hidroxi-1,4-dioxo-1,4-dihidronaftalen-2-il)-benzoico,
éster metílico de ácido(3-metoxi-1,4-dioxo-1,4-dihidronaftalen-2-il)-benzoico
ácido 4-(3-hidroxi-5,5,8,8-tetrametil-1,4-dioxo-1,4,5,6,7,8-hexahidroantracen-2-il)-benzoico,
4-(3-hidroxi-1,4-dioxo-1,4-dihidronaftalen-2-il-azo)-benzoato de metilo,
ácido 4-(3-hidroxi-5,5,8,8-tetrametil-1,4-dioxo-1,4,5,6,7,8-hexahidroantracen-2-il-azo)-benzoico,
3-(3,5-di-terc.-butil-4-oxociclohexa-2,5-dieniliden)-5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetrahidrociclopenta[b]naftaleno-
1,2-diona,
3-(3,5-di-terc.-butil-4-oxociclohexa-2,5-dieniliden)-5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetrahidroantraceno-3H-1,2,4-triona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-metoxi-5,8-dimetil-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-metoxi-6,7-dimetil-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-metoxi-5-metil-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-2-metoxi-5-metil-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-metoxi-6-metil-1,4-naftoquinona,
3-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-2-metoxi-6-metil-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-metoxi-5,6-dimetil-1,4-naftoquinona,
3-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-2-metoxi-5,6-dimetil-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-metoxi-5,7-dimetil-1,4-naftoquinona,
3-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-2-metoxi-5,7-dimetil-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-etiltio-5-metil-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-etiltio-6-metil-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-hidroxi-5,8-dimetil-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-hidroxi-6,7-dimetil-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-hidroxi-5-metil-1,4-naftoquinona,
3-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-2-hidroxi-5-metil-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-hidroxi-6-metil-1,4-naftoquinona,
3-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-2-hidroxi-6-metil-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-hidroxi-5,6-dimetil-1,4-naftoquinona,
2-(3-bromo-5-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-hidroxi-5,6-dimetil-1,4-naftoquinona,
3-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-2-hidroxi-5,6-dimetil-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-hidroxi-5,7-dimetil-1,4-naftoquinona,
3-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-2-hidroxi-5,7-dimetil-1,4-naftoquinona.
El siguiente Ejemplo explica el invento.
Ejemplo Realización automática de la reacción con un bisulfito
En el presente Ejemplo se describe la aplicación del procedimiento a la detección del estado de metilación de citosinas en el gen del Factor VIII de una muestra de ADN genómico, que se había tratado con una endonucleasa de restricción según las indicaciones del fabricante. El procedimiento se basa en el empleo de un sistema automático de pipeteo (MWG RoboSeq 4204) con cuatro adaptadores movibles verticalmente por separado, para puntas de pipeteo intercambiables, que excluyen contaminaciones cruzadas. El sistema de pipeteo hace posible el pipeteo de 100 \mul con un error de menos que \pm 2 \mul. La placa de trabajo del sistema automático de pipeteo está equipada con seis bastidores para puntas de pipeteo y ocho posiciones de pipeteo, dos de las cuales pueden ser enfriadas, un bastidor enfriable para reactivos, un sistema de apilamiento para 10 placas de microtitulación, un puesto de lavado de puntas de pipeteo y un dispositivo para la separación de las puntas de pipeteo con respecto del adaptador. El sistema automático de pipeteo está unido, a través de un sitio de corte en serie, con un ordenador y es regulado a través de un programa lógico (software), que permite la libre programación de todas las etapas de pipeteo que son necesarias para la aplicación del procedimiento.
En la primera etapa de pipeteo, se pipetea a mano una parte alícuota de la muestra de ADN en una de 96 posiciones libremente seleccionables de una placa de microtitulación. La placa de microtitulación es a continuación calentada a 96ºC mediando utilización de un elemento ciclador maestro (Mastercycler) de Eppendorf para la desnaturalización de la muestra de ADN previamente tratada. La placa de microtitulación es transferida luego al sistema automático de pipeteo. En todas las posiciones, que contienen un ADN, se añaden por pipeteo, de una manera regulada por programa, consecutivamente desde el bastidor de reactivos partes alícuotas de un agente desnaturalizante (dioxano) de una solución 3,3 molar de hidrógeno-sulfito de sodio, y de una solución de un agente captador de radicales en el agente desnaturalizante utilizado. A continuación, la placa de microtitulación se incuba en el ciclador maestro de Eppendorf de manera tal que en la muestra de ADN, bajo la acción del hidrógeno-sulfito de sodio, todos los radicales de citosinas sin metilar sean transformados en un aducto con bisulfito.
Después del tratamiento con el bisulfito, la placa de microtitulación se transfiere desde el termociclador al sistema automático de pipeteo. Se dispone previamente una segunda placa de microtitulación del mismo tipo. En todas las cámaras, cuya posición equivalente en la primera placa de microtitulación contiene una muestra tratada de ADN con bisulfito se transfiere primeramente un tampón Tris-HCl de carácter básico (de pH 9,5) y a continuación se transfiere una parte alícuota del ADN tratado con bisulfito a la correspondiente posición de la segunda placa de microtitulación. En la solución de carácter básico los aductos con bisulfito de los radicales de citosina no metilados se transforman en radicales de uracilo.
La amplificación planificada de una cadena (en el ejemplo presente de la cadena del mismo sentido) del ADN tratado con bisulfito, se efectúa mediante una reacción en cadena de una polimerasa (PCR). Se utiliza un par de cebadores del tipo 1 (AGG GAG TTT TTT TTA GGG AAT AGA GGG A (SEQ-ID:1) y TAA TCC CAA AAC CTC TCC ACT ACA ACA A (SEQ-ID:2)), que permite la amplificación específica de una cadena de ADN tratado con bisulfito de una manera satisfactoria, pero no la de una cadena de ADN, cuyos radicales de citosina no metilados no habían sido transformados en radicales de uracilo o lo habían sido de una manera incompleta. Para la reacción PCR se dispone previamente en el sistema automático de pipeteo una tercera placa de microtitulación del mismo tipo. En todas las cámaras, cuyas posiciones equivalentes sobre la primera placa de microtitulación contienen una muestra tratada de ADN con el bisulfito, se pipetea automáticamente en primer lugar una parte alícuota de una solución original, que contiene un tampón de PCR, una polimerasa de ADN y un cebador del tipo 1. Después de esto se transfiere automáticamente desde cada posición de la segunda placa de microtitulación una parte alícuota del ADN diluido tratado con bisulfito a la correspondiente posición de la tercera placa de microtitulación, antes de que ésta sea transferida al aparato ciclador para la realización de la reacción PCR. El producto de la PCR es identificado mediante una electroforesis en gel de agarosa y una subsiguiente tinción con bromuro de etidio (Figura 1). La Figura 1 muestra la imagen de un gel de una cadena de ADN tratado con el bisulfito, amplificada por una PCR (a la izquierda marcador de pesos moleculares, a la derecha: producto de la PCR).
<110> Epigenomics AG
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<120> Procedimiento para la detección de metilaciones de citosina
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<130> E01/1204/WO
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<140>
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<141>
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<160> 2
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 28
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskip
agggagtttt ttttagggaa tagaggga 
\hfill
28 
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<210> 2
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<212> ADN
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskip
taatcccaaa acctctccac tacaacaa 
\hfill
28 
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Claims (24)

1. Procedimiento para la detección de metilaciones de citosinas en un ADN, caracterizado porque se realizan las siguientes etapas:
a)
una muestra de ADN genómico se incuba con una solución de un bisulfito (= hidrógeno-sulfito, disulfito) en el intervalo de concentraciones comprendidas entre 0,1 y 6 mol/l, estando presente un disolvente desnaturalizante así como por lo menos un agente captador de radicales;
b)
la muestra tratada de ADN se diluye con agua o con una solución acuosa;
c)
la muestra de ADN se amplifica en una reacción con una polimerasa;
d)
realizándose antes de la etapa c) una desulfonación del ADN;
e)
se detecta en qué grado se ha modificado la secuencia mediante el tratamiento según la etapa a) con respecto a la muestra de ADN genómico y se saca una conclusión acerca del estado de metilación de por lo menos un locus en la muestra de ADN genómico.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el reactivo y/o el disolvente desnaturalizante se seleccionan entre la siguiente lista de compuestos o clases de compuestos:
poli(etilenglicol)-dialquil-éteres, dioxano y sus derivados sustituidos, acetonitrilo, alcoholes primarios, alcoholes secundarios, alcoholes terciarios, di(etilenglicol)-dialquil-éteres, tri-(etilenglicol)-dialquil-éteres, tetra(etilenglicol)dialquil-éteres, penta(etilenglicol)-dialquil-éteres, hexa(etilenglicol)-dialquil-éteres, DMSO, THF.
3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el agente captador de radicales se selecciona entre el siguiente conjunto de compuestos:
di- y tri-hidroxibencenos, extracto de té verde (en inglés green tea extract), picnogenol (extracto de corteza de pino), extracto de Ginkgo Biloba (EGb 761), mezcla de flavonoides de diferentes extractos de frutas y legumbres (GNLD), bio-normalizadores (Sun-O Corp), DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazilo), NDGA (ácido nordihidroguayarético), trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-cromano-2-carboxílico), 2,6-di-terc.-butil-fenol, 4-metil-di-terc.-butil-fenol, 4-metoxi-di-terc.-butil-fenol, 2,6-di-terc.-butil-p-cresol, ácido 3,4-dihidroxi-benzoico, vitamina C, vitamina E, vitamina Q, hidroquinona, ubiquinona, lignanos, hidroxiterpenos, flavonoides, curcumina, taninos, compuestos de ácido retínico, Ge-132 bis-beta-carboxietil-germanio-sesquióxido, superóxido-dismutasa (SOD), superóxido-catalasa, alfa-naftoflavona, di(2-metil-5-cloro-fenil)-ditionato y derivados de Cu(II), mebendazol, extracto de alcaloides CS (= soluble en cloroformo),
4-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-hidroxi-1,2-naftoquinona,
4-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-metoxi-1,2-naftoquinona,
4-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-1,2-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-bromo-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-cloro-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-metoxi-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-hidroxi-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-1,4-naftoquinona,
4-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-hidroxi-5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetrahidro-1,2-antraquinona,
4-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-metoxi-5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetrahidro-1,2-antraquinona,
4-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetrahidro-1,2-antraquinona,
3-bromo-4-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetrahidro-1,2-antraquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-oxociclohexa-2,5-dieniliden)-indan-1,3-diona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-oxociclohexa-2,5-dieniliden)-3,4-epoxi-3-hidroxi-4-metoxi-3,4-dihidro-2H-naftalen-1-ona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-oxociclohexa-2,5-dieniliden)-3,4-epoxi-3,4-dimetoxi-3,4-dihidro-2H-naftalen-1-ona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-indan-1-ona, 3,3-bi-[2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-inden-1-on]-3-ilo,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-bromo-5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetrahidro-1,4-antraquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-cloro-5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetrahidro-1,4-antraquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-metoxi-5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetrahidro-1,4-antraquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-hidroxi-5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetrahidro-1,4-antraquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetrahidro-1,4-antraquinona,
2-bromo-3-(3-bromo-5-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetrahidro-1,4-antraquinona,
2-bromo-3-(3,5-dibromo-4-hidroxi-fenil)-5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetrahidro-1,4-antraquinona,
2-bromo-3-(3-bromo-5-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-hidroxi-5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetrahidro-1,4-antraquinona,
3-bromo-2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-1,4-antraquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-metoxi-1,4-antraquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-hidroxi-1,4-antraquinona,
5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetrahidronaftaleno-1,3-diol,
3-metoxi-5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetrahidronaftalen-1-ol,
ácido 4-(3-cloro-5,5,8,8-tetrametil-1,4-dioxo-1,4,5,6,7,8-hexahidroantracen-2-il)-benzoico,
4-(3-cloro-5,5,8,8-tetrametil-1,4-dioxo-1,4,5,6,7,8-hexahidroantracen-2-il)-benzoato de metilo,
ácido 4-(3-hidroxi-1,4-dioxo-1,4-dihidronaftalen-2-il)-benzoico,
éster metílico de ácido(3-metoxi-1,4-dioxo-1,4-dihidronaftalen-2-il)-benzoico
ácido 4-(3-hidroxi-5,5,8,8-tetrametil-1,4-dioxo-1,4,5,6,7,8-hexahidroantracen-2-il)-benzoico,
4-(3-hidroxi-1,4-dioxo-1,4-dihidronaftalen-2-il-azo)-benzoato de metilo,
ácido 4-(3-hidroxi-5,5,8,8-tetrametil-1,4-dioxo-1,4,5,6,7,8-hexahidroantracen-2-il-azo)-benzoico,
3-(3,5-di-terc.-butil-4-oxociclohexa-2,5-dieniliden)-5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetrahidrociclopenta[b]naftaleno-
1,2-diona,
3-(3,5-di-terc.-butil-4-oxociclohexa-2,5-dieniliden)-5,5,8,8-tetrametil-5,6,7,8-tetrahidroantraceno-3H-1,2,4-triona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-metoxi-5,8-dimetil-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-metoxi-6,7-dimetil-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-metoxi-5-metil-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-2-metoxi-5-metil-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-metoxi-6-metil-1,4-naftoquinona,
3-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-2-metoxi-6-metil-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-metoxi-5,6-dimetil-1,4-naftoquinona,
3-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-2-metoxi-5,6-dimetil-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-metoxi-5,7-dimetil-1,4-naftoquinona,
3-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-2-metoxi-5,7-dimetil-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-etiltio-5-metil-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-etiltio-6-metil-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-hidroxi-5,8-dimetil-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-hidroxi-6,7-dimetil-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-hidroxi-5-metil-1,4-naftoquinona,
3-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-2-hidroxi-5-metil-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-hidroxi-6-metil-1,4-naftoquinona,
3-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-2-hidroxi-6-metil-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-hidroxi-5,6-dimetil-1,4-naftoquinona,
2-(3-bromo-5-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-hidroxi-5,6-dimetil-1,4-naftoquinona,
3-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-2-hidroxi-5,6-dimetil-1,4-naftoquinona,
2-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-3-hidroxi-5,7-dimetil-1,4-naftoquinona,
3-(3,5-di-terc.-butil-4-hidroxi-fenil)-2-hidroxi-5,7-dimetil-1,4-naftoquinona.
4. Procedimiento de acuerdo con una o varias de las precedentes reivindicaciones, caracterizado porque la muestra de ADN genómico se desnaturaliza térmicamente antes del tratamiento.
5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa c) se lleva a cabo en dos etapas parciales de la siguiente manera:
a)
una preamplificación por PCR con por lo menos un par de cebadores de diferente secuencia, que se hibridan inespecíficamente con una muestra de ADN previamente tratada de acuerdo con la reivindicación 1, y por lo tanto en la etapa de PCR proporcionan más de un material amplificado;
b)
una amplificación por PCR del producto formado en la preamplificación con cebadores de diferente secuencia, que en cada caso son idénticos o complementarios inversos con respecto a un segmento de la muestra de ADN previamente tratado de acuerdo con la reivindicación 1 [cadena (+) o cadena (-)] y se hibridan específicamente con el ADN que se ha de amplificar.
6. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la amplificación de varios segmentos de ADN se lleva a cabo en un recipiente de reacción.
7. Procedimiento de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones, caracterizado porque para la reacción con una polimerasa se utiliza una polimerasa de ADN estable frente al calor.
8. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque para la detección del ADN previamente tratado, los productos de la PCR se hibridan sobre una agrupación de oligonucleótidos y a continuación se realizan las siguientes etapas parciales:
(a)
el ADN genómico amplificado se hibrida con por lo menos un oligonucleótido mediando formación de un dúplex, delimitando los mencionados oligonucleótidos hibridados, con su extremo 3' directamente o a una cierta distancia de hasta 10 bases, con las posiciones, que se han de investigar en lo que se refiere a su metilación en la muestra de ADN genómico;
(b)
el oligonucleótido con una secuencia conocida de n nucleótidos se prolonga por lo menos en un nucleótido mediante una polimerasa, llevando el nucleótido una marcación detectable, y siendo la prolongación dependiente del estado de metilación de la respectiva citosina en la muestra de ADN genómico.
9. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque para la detección del ADN previamente tratado, los productos de la PCR se hibridan sobre una agrupación de oligonucleótidos y a continuación se realizan las siguientes etapas parciales:
(a)
se hibrida un conjunto de oligonucleótidos con el ADN genómico amplificado mediando formación de un dúplex, consistiendo este conjunto de oligonucleótidos en dos diferentes especies, y delimitando los oligonucleótidos hibridados de la primera especie con su extremo 3' directamente o a una distancia de hasta 10 bases, con las posiciones, que se han de investigar en lo que se refiere a su metilación en la muestra de ADN genómico, e hibridándose el segundo oligonucleótido de la segunda especie con una segunda región de la molécula diana, de manera tal que el extremo 5' del oligonucleótido de la segunda especie esté separado por una laguna con el tamaño de un nucleótido individual o hasta de 10 nucleótidos desde el extremo 3' del oligonucleótido hibridado de la primera especie en el sitio de la posición seleccionada mencionada;
(b)
el oligonucleótido de la primera especie con una secuencia conocida de n nucleótidos se prolonga mediante una polimerasa en a lo sumo el número de nucleótidos, que están situados entre el extremo 3' del oligonucleótido de la 1ª especie y el extremo 5' del oligonucleótido de la 2ª especie, siendo la prolongación dependiente del estado de metilación de la respectiva citosina en la muestra de ADN genómico;
(c)
se incuban los oligonucleótidos en presencia de una ligasa, siendo unidos el oligonucleótido colindante de la primera especie, prolongado mediante la reacción de la polimerasa, y el oligonucleótido de la segunda especie, y obteniéndose de esta manera un producto de ligación, siempre y cuando que en la etapa precedente se hubiera efectuado una prolongación del oligonucleótido de la primera especie, de tal manera que entonces el extremo 3' con una función 3'-hidroxi presente del oligonucleótido prolongado delimite directamente con el extremo 5' del oligonucleótido de la segunda especie.
10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque los oligonucleótidos utilizados de la primera especie y/o los oligonucleótidos utilizados de la segunda especie o bien contienen solamente las bases T, A y C o sin embargo las bases T, A y G.
11. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque para la detección del ADN previamente tratado los productos de la PCR se hibridan sobre una agrupación de oligonucleótidos y a continuación se realizan las siguientes etapas parciales:
(a)
se hibrida el ADN genómico amplificado con por lo menos un oligonucleótido con una secuencia conocida de n nucleótidos, mediando formación de un dúplex, hibridándose los mencionados oligonucleótidos hibridados con su extremo 3' de una manera parcial o total con las posiciones, que se han de investigar en lo que se refiere a su metilación en la muestra de ADN genómico;
(b)
el oligonucleótido, siempre y cuando que se hubiera hibridado previamente con su extremo terminal en 3', sin apareamientos erróneos de bases, con la posición que se ha de investigar, se prolonga por lo menos en un nucleótido mediante una polimerasa, llevando por lo menos un nucleótido una marcación detectable y siendo la prolongación dependiente del estado de metilación de la respectiva citosina en la muestra de ADN genómico.
12. Procedimiento de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones, caracterizado porque los productos de la PCR y/o los productos de la prolongación y/o los productos de la ligación son provistos, para la detección, de una marcación detectable.
13. Procedimiento de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones, caracterizado porque las marcaciones son marcaciones fluorescentes.
14. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las marcaciones son radionúclidos.
15. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque las marcaciones de los nucleótidos son marcaciones de masas desprendibles, que son detectables en un espectrómetro de masas.
16. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque los productos de la PCR y/o los productos de la prolongación y/o los productos de la ligación se detectan en su totalidad en el espectrómetro de masas y por consiguiente son caracterizados inequívocamente mediante su masa.
17. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque en cada caso se detecta en el espectrómetro de masas un fragmento de los productos de la PCR y/o de los productos de la prolongación y/o de los productos de la ligación.
18. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado porque el fragmento del producto de la PCR y/o del producto de la prolongación y/o del producto de la ligación se produce por digestión con una o varias exo- o endo-nucleasas.
19. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 17 y 18, caracterizado porque para la mejor posibilidad de detección en el espectrómetro de masas, los fragmentos producidos son provistos de una carga neta positiva o negativa individual.
20. Procedimiento de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones, caracterizado porque los productos de la PCR y/o los productos de la prolongación y/o los productos de la ligación se detectan y visualizan mediante una espectrometría de masas con desorción/ionización mediante láser asistida por una matriz (MALDI-TOF) o mediante una espectrometría de masas por proyección de electrones (ESI).
21. Procedimiento de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones, obteniéndose el ADN genómico a partir de una muestra de ADN, comprendiendo las fuentes de ADN p.ej. linajes celulares, sangre, un esputo, una defecación, una orina, un líquido de cerebro y médula espinal (cefalorraquídeo), un tejido embebido en parafina, por ejemplo un tejido de ojo, intestino, riñón, cerebro, corazón, próstata, pulmón, mama o hígado, portaobjetos histológicos y todas las posibles combinaciones de estos elementos.
22. Utilización de un procedimiento de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones para el diagnóstico y/o pronóstico de episodios desventajosos para pacientes o individuos, perteneciendo estos episodios desventajosos por lo menos a una de las siguientes categorías: efectos indeseados de medicamentos; enfermedades de cáncer, fallos funcionales, daños o una enfermedad del sistema nervioso central (SNC); síntomas de agresión o trastornos del comportamiento; consecuencias clínicas, psicológicas y sociales de daños cerebrales; trastornos psicóticos y trastornos de la personalidad; demencia y/o síndromes asociados; una enfermedad, un fallo funcional y un daño cardiovascular; un fallo funcional, un daño o una enfermedad del tracto gastrointestinal; un fallo funcional, un daño o una enfermedad del sistema respiratorio; una lesión, una inflamación, una infección inmunidad y/o reconvalescencia; un fallo funcional, un daño o una enfermedad del cuerpo como desviación en el proceso de desarrollo; un fallo funcional, un daño o una enfermedad de la piel, de los músculos, del tejido conjuntivo o de los huesos; un fallo funcional, un daño o una enfermedad de los sistemas endocrino y metabólico; dolores de cabeza o un fallo funcional sexual.
23. Utilización de un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes para la distinción de tipos de células o de tejidos o para la investigación de la diferenciación celular.
24. Estuche para realización de un ensayo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 21, que consiste en un reactivo que contiene un bisulfito, disolventes desnaturalizantes, así como agentes captadores de radicales y cebadores para la producción de los materiales amplificados.
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