ES2327013T3

ES2327013T3 - Preparacion terapeutica de fviia de muy alta pureza y metodo para su obtencion.

Info

Publication number: ES2327013T3
Application number: ES07380021T
Authority: ES
Inventors: Salvador Grancha Gamon; Pere Ristol Debart; Juan Ignacio Jorquera Nieto
Original assignee: Grifols SA
Current assignee: Grifols SA
Priority date: 2006-02-17
Filing date: 2007-02-05
Publication date: 2009-10-22
Anticipated expiration: 2027-02-05
Also published as: PT1820509E; US7531513B2; JP2007217415A; ATE435657T1; EP1820509A1; EP1820509B1; PL1820509T3; ES2257225B1; US20070197440A1; JP5196799B2; DE602007001467D1; ES2257225A1

Abstract

Método para la obtención de una preparación terapéutica de FVIIa que tiene una pureza de, como mínimo, 1000 UI/mg de proteína estando libre de proteínas de origen no humano, estando dicho método caracterizado porque el FVII se purifica a partir de la FrII+III, FrIII o equivalente del fraccionamiento de Cohn y comprende la precipitación con PEG, la cromatografía y su activación.

Description

Preparación terapéutica de FVIIa de muy alta pureza y método para su obtención.

La presente invención se refiere a una preparación terapéutica de FVIIa de muy alta pureza y un método para su obtención, que presentan notables características de novedad y actividad inventiva.

Antecedentes

El tratamiento de los problemas hemorrágicos en hemofilia y otros desórdenes relacionados, como enfermedad hepática, se realiza mediante terapia sustitutiva con factores de la coagulación.

El tratamiento de elección en la hemofilia A (déficit del factor VIII de la coagulación) comprende la administración de dicho factor VIII (FVIII), tanto a nivel profiláctico, como en episodios agudos. Desafortunadamente, uno de los problemas de la terapia con FVIII es la aparición de anticuerpos inhibidores frente al FVIII, lo cual merma la eficacia de este tratamiento.

Otros tratamientos alternativos incluyen la administración de concentrados del complejo de protrombina activado (APCC). El APCC consiste en una mezcla de factores de coagulación dependientes de la vitamina K (factores II, VII, IX y X) y otras proteínas acompañantes (fundamentalmente Proteína C y proteína S). El tratamiento con estos APCCs produce el incremento de niveles de los factores no deficitarios, encontrándose además algunos de los factores en su forma activada, por esto se pueden desencadenar fenómenos trombogénicos en el paciente, como la coagulación intravascular diseminada.

La capacidad del factor VII activado (FVIIa) para iniciar la coagulación independientemente de la actividad del factor VIII es de gran utilidad terapéutica, ya que permite restaurar la hemostasia en pacientes hemofílicos que han desarrollado anticuerpos inhibidores contra el factor VIII y que, por tanto, no responden adecuadamente a la terapia sustitutiva. En comparación con otros factores, el FVIIa presenta una semivida biológica corta (unas 4 horas) mientras que los otros factores del APCC presentan una semivida mas larga, lo cual provoca su acumulación.

Otra ventaja del tratamiento con FVIIa purificado es que su acción se localiza por la disponibilidad de su cofactor, el factor tisular, que se libera en los puntos lesionados (hemartrosis, extracciones dentales, intervenciones quirúrgicas, etc.). En la actualidad se tiende a considerar al FVIIa como un agente hemostático global, con una amplia posibilidad de indicaciones, como sobredosis de dicumarínicos, fallo hepático, sangrado incoercible, entre otras.

Además, en la administración de FVIIa de alta pureza, por su elevada actividad, la infusión de proteína es mínima y no se infunden otras proteínas no necesarias.

Las preparaciones de FVIIa de origen plasmático, han presentado hasta el momento una actividad de FVIIa relativamente baja, en comparación con la de la presente invención. La patente US4479938 por "Therapeutic composition containing factor VIIa" ("Composición terapéutica que contiene factor VIIa") de BAXTER TRAVENOL LAB muestra un FVIIa de baja pureza, al igual que la patente EP0346241 por "Process for preparing a factor VIIa fraction, and its use as a medicament" ("Proceso de preparación de una fracción de factor VIIa y su uso como medicamento") de FOND NAT TRANSFUSION SANGUINE, que también muestra la preparación de un FVII de baja pureza, con una actividad entre 95 y 130 UI de FVIIa/mg de proteína.

Los métodos conocidos de purificación del FVIIa a nivel industrial parten del complejo de protrombina o de fracciones equivalentes del fraccionamiento plasmático, como muestra la patente EP0346241 y se basan en métodos que incluyen precipitaciones selectivas y la utilización de la centrifugación como método de separación de precipitados. Como hemos visto, en los procesos de purificación basados en la precipitación el grado de purificación obtenido es limitado, describiendo además procesos complejos en que la separación de precipitados es por centrifugación, el cual es un método industrialmente complejo y caro.

La patente EP 0391974 por "Process for the purification of vitamin K-dependent blood clotting factors" ("Proceso de purificación de factores de la coagulación dependientes de vitamina K") de CENTRAL BLOOD LAB AUTHORITY se refiere fundamentalmente a la purificación del FIX, a partir del complejo de protrombina, mediante la cromatografía con una columna metal quelante. Como subproducto, procedente de los lavados de la obtención del FIX, se reivindica la obtención del FVII, no de FVIIa. Este FVII obtenido es de baja pureza (alrededor de una UI por mg. de proteína) y se caracteriza por no contener FII, pero si puede contener cantidades significativas de otros factores vitamina K dependientes. Por el método descrito, no es posible la obtención de un FVIIa de alta pureza. La cromatografía en columna metal quelante utiliza una resina activada con Cobre. En el método descrito en la presente invención la cromatografía metal quelante utiliza una resina con níquel, que no requiere activación previa; los lavados se realizan a conductividades elevadas, lo cual permite una estabilización del FVII en la columna y la elución no requiere la presencia de aminoácidos. Esto, ligado también a que se parte de un material de mayor pureza, permite la obtención de un producto de alta pureza, que no sería alcanzable según la patente EP 0391974.

Otros métodos de purificación del FVIIa plasmático se basan en el aislamiento y separación del FVII por inmunoafinidad (con anticuerpos monoclonales) [Vox Sanguinis (2003) 84, 54-64]. Con este método se consigue una pureza elevada (actividad específica del orden de 40.000 UI/mg de proteína), pero no se puede descartar la presencia, en el producto final, de proteínas de origen no humano procedentes de los anticuerpos monoclonales liberados por la resina empleada. Estas proteínas no humanas serían responsables de reacciones antigénicas en los pacientes tratados.

Otro aspecto a destacar es el material de partida del proceso de purificación del FVIIa, que ha sido tradicionalmente el complejo de protrombina (PTC) o fracción equivalente. Esto implica que este material pueda ser destinado únicamente para la obtención de uno de los dos productos, o bien PTC o bien FVIIa. La posibilidad de purificar el FVIIa a partir de un material alternativo, que sea una fracción de desecho no utilizada en el fraccionamiento, como el precipitado de la suspensión de la FrII+III, abre la posibilidad de un aprovechamiento más eficiente del plasma fraccionado.

Resumen de la invención

Por la presente invención se consigue una preparación terapéutica de FVIIa de muy alta pureza a partir del plasma humano, con, como mínimo, 1000 UI/mg de proteína o preferentemente 6000 UI/mg de proteína y a una concentración de, como mínimo, 12000 UI/ml. El método de obtención de este FVIIa parte de la FrII+III, FrIII o equivalente del fraccionamiento de Cohn y comprende la precipitación con PEG y la cromatografía y el producto resultante está libre de proteínas de origen no humano.

Descripción de la invención

De acuerdo con la presente invención se describe y reivindica una preparación terapéutica de FVIIa, procedente de plasma humano, con una pureza de, como mínimo, 1000 UI/mg proteína, pudiendo alcanzar más de 6000 UI/mg de proteína. Esta preparación terapéutica de FVIIa está libre de proteínas de origen no humano y en ella el FVIIa está presente a una concentración de, como mínimo, 12000 UI/ml.

Este FVII se purifica a partir de la fracción II+III o de la fracción III o equivalentes, del fraccionamiento del plasma humano y el método de purificación comprende la precipitación con PEG y la cromatografía.

En una primera etapa la suspensión de la fracción de partida (FrII+III, Fr III o equivalente) se precipita a una concentración entre el 3 y el 5% de PEG y el precipitado resultante se solubiliza y reprecipita a concentración entre el 5 y el 7% de PEG, recuperando el sobrenadante de esta precipitación.

A partir de este sobrenadante, el FVII se captura por cromatografía de intercambio iónico con una resina del tipo Q Sepharosa o Q cerámica y se realiza la elusión por cambio de pH.

Este eluido rico en FVII se purifica opcionalmente por cromatografía de interacción hidrofóbica con una resina del tipo Octyl Sepharosa. Una característica de este procedimiento es que se realiza en ausencia de sales de amonio.

Adicionalmente se realiza una etapa de purificación del FVII por cromatografía Metal Quelante con la resina Ni Sepharosa HP.

La activación del FVII se realiza en presencia de calcio.

Al tratarse de un producto de origen biológico, es aconsejable la inclusión de, como mínimo, una, o preferiblemente dos o más etapas de eliminación de agentes patógenos. Por su eficacia contrastada, es conveniente, por ejemplo, la inclusión de una etapa de eliminación de virus por tratamiento con solvente/detergente previa a cualquiera de las etapas cromatográficas. Este método, y el producto obtenido, permiten también la inclusión de etapas adicionales de eliminación de virus, por ejemplo, por nanofiltración.

En una forma de realización preferente del método descrito, el FVII se purifica a partir de la FrII+III, mediante la precipitación con PEG entre 3,5 y 4,5% a pH entre 5 y 5,4. El precipitado obtenido se resuspende y precipita con PEG entre 5,5 y 6,5% a un pH entre 6 y 7. La adsorción del FVII del sobrenadante de esta precipitación se realiza por intercambio iónico, con una resina del tipo Q-Sepharosa FF, a un pH próximo a la neutralidad y eluyendo el FVII a un pH entre 5 y 6.

Posteriormente, se realiza opcionalmente una purificación del FVII por cromatografía de interacción hidrofóbica, adsorbiendo el FVII en una resina del tipo Octyl Separosa FF. Esta adsorción se realiza a pH neutro. La elución del FVII purificado se realiza mediante una solución que contiene fosfato disódico anhidro 10 mmol/l citrato trisódico dihidratado 10 mmol/l Na, Cl 500 mmol/l a pH neutro.

El eluido, rico en FVII, se aplica a una columna metal quelante, con una resina Ni Separosa HP, adsorbiendo el FVII a un pH entre 7,5 y 8,5. Esta resina permite la realización de lavados en condiciones de elevada conductividad y también a un pH entre 6 y 7. La elución del FVII con una solución que contiene fosfato disódico anhidro 10 mmol/l, NaCl 25 mmol/l, ajustado a pH neutro permite la obtención de un FVII de alta pureza, con una actividad específica alrededor de 200 UI/mg de proteína.

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La activación del FVII puede realizarse mediante la adición de calcio, aplicada a cualquiera de los materiales intermedios o final, del proceso de purificación, lo cual no variará las condiciones de obtención ni del FVII descrito.

Asimismo, se pueden implementar una o varias etapas de reducción de agentes patógenos, aplicadas al proceso descrito, sin variar la esencia de la invención.

Ejemplo

A continuación se adjunta, a título ilustrativo, un ejemplo de realización de la presente invención, dividido en las etapas sucesivas 1 a 4.

Etapa 1

Obtención de una fracción impura de FVII al precipitar la extracción de la fracción de la II+III

La suspensión inicial de la fracción II+III, se realizó con una solución de extracción fosfato 5 mmol/l y sorbitol 5%.

Una vez completada la suspensión se mantuvo durante 1 hora en agitación entre 2-6ºC. Después de ajustar el pH, a la suspensión de la fracción II+III se le adicionó PEG hasta una concentración final del 4% (p/p).Después de la adición, se mantuvo la suspensión en agitación durante 30 minutos. A la suspensión obtenida anteriormente, se le añadió bentonita agitándola posteriormente durante 20 minutos, momento a partir del cual se iniciará una etapa de reposo de, como mínimo, 4 horas. Posteriormente se inició el proceso de centrifugación durante 20 minutos. Una vez finalizado el proceso de centrifugación se separó el sobrenadante del precipitado. Este último fue disuelto en solución tampón fosfato, realizándose las valoraciones analíticas de FVII, tanto en este material como en la suspensión inicial de la fracción II+III. Para el ensayo de actividad se empleó el kit COASET®FVII (CHROMOGENIX). Este método se basa en dos pasos. En el primero, el Factor X se activa a FXa por la vía extrínseca (FVII-tromboplastina).El factor VII es completamente activado a FVIIa durante este proceso, por lo tanto, en este ensayo no hay interferencia con el FVII preactivado. En el segundo paso el Factor Xa generado, hidroliza el sustrato cromogénico S-2765 liberándose el grupo cromogénico pNA. El color se lee fotométricamente a 405 nm. El Factor Xa generado y en consecuencia la intensidad de color, es proporcional a la actividad de Factor VII de la muestra. El precipitado de PEG reconstituido muestra una actividad de Factor VII de 0,86 UI/ml. Estos resultados indican que la actividad de FVII esta presente en la fracción II+III, y que se recupera significativamente en el precipitado, obtenido al adicionar PEG 4% en las condiciones descritas.

Etapa 2

Obtención y purificación parcial de una fracción de FVII a partir de precipitado de PEG 4%, mediante las siguientes etapas secuenciales 1.- Precipitación con PEG al 6%

La suspensión de la fracción de precipitado de PEG al 4% se realizó con una solución de extracción (fosfato 5 mmol/l, citrato 5 mmol/l y NaCl 50 mmol/ pH 7,5 con NaOH 0,5 mol/l) a una temperatura de 20-25ºC. Una vez completada la resuspensión se mantuvo durante 2 horas en agitación, enfriándose después hasta 5ºC y ajustando el pH a 6,5. Esta suspensión, se diluyó con una solución compuesta por fosfato 45 mmol/l, NaCl 50 mmol/l a pH 6,5 a 5\pm3ºC y se le adicionó PEG hasta obtener una concentración final de PEG del 6% (p/p). Finalmente se procedió a clarificar el sobrenadante de PEG al 6% mediante una filtración con una placa de profundidad para separar el precipitado del PEG. Una vez finalizado el proceso, la solución filtrada fue analizada con relación a la actividad de FVII y su contenido en proteína (estimado por densidad óptica), obteniendo una actividad especifica de 0,11 UI/UA. Este valor ha sido calculado dividiendo la actividad del FVII (UI/ml) entre la proteína aproximada, valorado mediante el método descrito en la etapa 1.

En este punto se realiza la implementación de una etapa de inactivación de virus mediante tratamiento con un disolvente orgánico asociado a un detergente. Estos reactivos de inactivación de virus son posteriormente separados en las etapas cromatográficas siguientes.

2.- Cromatografía de Intercambio Iónico

A partir del sobrenadante de PEG al 6% clarificado de la fracción II+III, se realizó una dilución al 20% con API ajustando el pH a 7,5 con el fin de disminuir la conductividad. A continuación se adicionaron resinas Q Sepharose FF (previamente equilibradas) a la solución anterior, la cual sé mantuvo bajo agitación moderada durante una hora. Posteriormente se procedió al empaquetamiento de la columna (FINE LINE FF) con la suspensión con resinas. Una vez empaquetada se realizó el lavado de las resinas mediante fosfato 10 mmol/l, citrato 10 mmol/l, NaCl 100 mmol/l ajustado a pH 7,5 y a una temperatura de 2-8ºC. Finalizado el lavado, se inyectó la solución de elución Q en la columna. Esta elución se realizó con fosfato 10 mmol/l NaCl 200 mmol/l ajustado a pH 5,5 a una temperatura de 2-8ºC. El Eluido Q fue valorado, obteniéndose una actividad específica de FVII de 1,16 UI/UA.

3.- Cromatografía de Interacción Hidrofóbica

Se partió del Eluido Q Sepharose, el cual fue ajustado a 2,5 mol/ de NaCl, pH 7,0 y a una temperatura de 25\pm3ºC. A continuación se realizó el equilibrado de la columna (Octyl Sepharose FF) con fosfato 10 mmol/l, citrato 10 mmol/l, NaCl 2500 mmol/l a pH 7,0 y a una temperatura de 25\pm3ºC. El siguiente paso fue la inyección del eluido en la columna y el lavado con la misma solución de equilibrado (a una temperatura de 25\pm3ºC). Seguidamente se realizó la elución con fosfato 10 mmol/l citrato 10 mmol/l Na, Cl 500 mmol/l a pH 7,0 y una 25\pm3ºC de temperatura. El eluido octyl se valoró obteniendo unos resultados de actividad específica de FVII de 3,79 UI/UA. Como podemos observar, los resultados obtenidos en esta etapa 2 reflejan un aumento de la actividad específica a lo largo de las tres etapas de 34 veces respecto al valor inicial en el sobrenadante de PEG 6% clarificado.

Etapa 3

Obtención de una fracción pura de FVII, a partir del eluido octyl mediante cromatografía MC en Ni Sepharose HP

En primer lugar, se realizó el equilibrado de la Columna Ni Sepharose HP con fosfato 10 mmol/l, NaCl 1 mol/l ajustado a pH 8,0\pm0,05. A continuación se inyectó el Eluido Octyl en la columna. Seguidamente se realizaron dos lavados, un primer lavado en condiciones de elevada conductividad (1 mol/l NaCl), seguido de un segundo lavado con una reducción de pH (6,5). Finalmente, se procedió a la elución específica con una solución que comprende fosfato 10 mmol/l, NaCl 25 mmol/l, ajustado a pH 7,0. Al eluido Ni resultante se le realizaron las valoraciones analíticas, obteniendo unos resultados de actividad específica de 204 UI/UA, lo que representa un incremento de pureza respecto al Eluido Q de en unas 54 veces.

Etapa 4

Activación del FVII mediante la adición de calcio

En esta etapa se activó el FVII a FVIIa mediante la adición de calcio, partiendo de un eluido Ni Sepharose. Para ello, la fracción conteniendo el FVII fue incubada a 30ºC durante 20 horas en presencia de tris 50mmol/l, NaCl 30mmol/l y CaCl_{2} 2 mmol/l para producir la autoactivación del FVII. Las valoraciones analíticas de estas muestras para la actividad de FVIIa, se han realizado con el kit STACLOT®VIIa-rTF (DIAGNOSTICA STAGO) frente al 1er estándar internacional de FVIIa. El principio de este método se basa en que el rsTF posee una función específica como cofactor del FVIIa. El rsTF en presencia de FVIIa, fosfolípidos y calcio produce coagulación del plasma. En este sistema el tiempo de coagulación observado presenta una relación inversa con el nivel de FVII inicialmente presente en el plasma. EL rsTF no activa el FVII a FVIIa, por lo tanto, el FVII presente en el ensayo no interfiere en le ensayo. Paralelamente se han realizado las valoraciones de la actividad de FVII por el método descrito en la etapa 1. Los resultados de actividad de FVII y FVIIa en la fracción activada así obtenida muestra un ratio de 30,3 UI FVIIa/UI FVII.

La combinación de los procedimientos descritos en las cuatro etapas, permite estimar la actividad específica de un Factor VII activado obtenido a partir del eluido Ni entorno a las 6056 UI/UA.

Con objeto de eliminar partículas víricas u otros patógenos que pudieran estar presentes, se implementa una etapa final de nanofiltración de la solución por nanofiltros de 15 nanómetros de tamaño de poro.

Si bien la invención se ha explicado en la descripción anterior, incluyendo un ejemplo ilustrativo, se comprenderá que en base a lo que se ha dado a conocer, los expertos en la materia podrán introducir variantes y alternativas incluidas dentro de la invención, que queda limitada solamente por las siguientes reivindicaciones.

Claims

1. Método para la obtención de una preparación terapéutica de FVIIa que tiene una pureza de, como mínimo,
1000 UI/mg de proteína estando libre de proteínas de origen no humano, estando dicho método caracterizado porque el FVII se purifica a partir de la FrII+III, FrIII o equivalente del fraccionamiento de Cohn y comprende la precipitación con PEG, la cromatografía y su activación.

2. Método, según la reivindicación 1, caracterizado porque la suspensión de FrII+III, FrIII o equivalente se precipita a una concentración entre 3 y 7% de PEG.

3. Método, según la reivindicación 1, caracterizado por que el FVII se captura por cromatografía de intercambio iónico.

4. Método, según la reivindicación 1, caracterizado porque la elución cromatográfica se realiza por cambio de pH.

5. Método, según la reivindicación 1, caracterizado porque el FVII se purifica por cromatografía de interacción hidrofóbica.

6. Método, según la reivindicación 1, caracterizado porque el procedimiento se realiza en ausencia de sales de amonio.

7. Método, según la reivindicación 1, caracterizado porque se realiza una etapa de purificación del FVII por cromatografía Metal Quelante.

8. Método, según la reivindicación 7, caracterizado porque la resina Metal Quelante es Ni Sepharosa HP.

9. Método, según la reivindicación 1, caracterizado porque el FVII se activa en presencia de calcio.

10. Método, según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende, como mínimo, una etapa específica de eliminación de virus.

11. Método, según la reivindicación 10, caracterizado porque comprende una etapa de eliminación de virus por nanofiltración.

12. Método, según la reivindicación 10, caracterizado porque comprende una etapa de eliminación de virus por tratamiento con solvente/detergente.

13. Preparación terapéutica de FVIIa obtenida por el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque su una pureza es, como mínimo, de 1000 UI/mg proteína.

14. Preparación terapéutica de FVIIa, según la reivindicación 13, caracterizada porque su pureza es de, como mínimo, 6000 UI/mg de proteína.

15. Preparación terapéutica de FVIIa, según la reivindicación 14, caracterizada porque el FVIIa está presente a una concentración de, como mínimo, 12000 UI/ml.

16. Preparación terapéutica de FVIIa, según la reivindicación 13, caracterizada por que el FVIIa procede de plasma humano.

17. Preparación terapéutica de FVIIa, según la reivindicación 16, caracterizada por que ha sido sometida, como mínimo, a una etapa de eliminación de agentes patógenos.