ES2327040T3 - Peptidos kdr y vacunas que los contienen. - Google Patents
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Abstract
Un nonapéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. Nº: 8.
Description
Péptidos KDR y vacunas que los contienen.
La presente invención está relacionada con
nuevos péptidos que son extremadamente útiles como vacunas para el
cáncer, y fármacos que contienen estos péptidos, para el tratamiento
y prevención de tumores.
Los genes de antígenos de rechazo tumoral se han
identificado principalmente para melanomas malignos, y de acuerdo
con esto, se han desarrollado inmunoterapias contra el cáncer que
utilizan estos genes. La WO 02/056 907 describe una composición que
comprende un conjunto ordenado y repetitivo de antígenos o de
determinantes antigénicos y un proceso para producir un antígeno o
determinante antigénico en un conjunto ordenado y repetitivo. El
antígeno o determinante antigénico ordenado y repetitivo se describe
por ser útil en la producción de vacunas para el tratamiento de
enfermedades infecciosas, el tratamiento de alergias y como fármaco
para prevenir o curar el cáncer y para inducir eficientemente
respuestas inmunes auto-específicas, en particular
respuestas de anticuerpos. Específicamente, con reconocimiento de
la importancia de los linfocitos T CD8-positivos en
las respuestas inmunes antitumorales, ha llamado la atención la
terapia con vacunas contra el cáncer que induce linfocitos T
CD8-positivos específicos de tumor in vivo, y
se está aplicando en varias aplicaciones clínicas. Además, también
se ha descrito el mecanismo por el que los péptidos que constan de
aproximadamente diez residuos de aminoácidos activan a los
linfocitos T a través de la ruta de Clase I, mediante la asistencia
de varias moléculas coestimuladoras para inducir linfocitos T
citotóxicos específicos de tumor (LTC). La WO 99/43 801 describe
que pueden utilizarse como vacunas contra el cáncer las secuencias
cortas de aminoácidos que presentan epítopos de la proteína Tek
para dirigir una respuesta celular inmune a las células
endoteliales. Los péptidos y los polipéptidos se unen a las
moléculas MHC, y la presentación de epítopos Tek puede estimular la
respuesta celular de linfocitos T citotóxicos o ayudantes. Además,
se han identificado activamente los péptidos restringidos a
moléculas de HLA individuales.
No obstante, el control completo de los tumores
es actualmente imposible. Esto puede ser debido a la heterogeneidad
de las células tumorales, a la reducción o desaparición de la
expresión de MHC de Clase I en las células tumorales y a la
ausencia de moléculas diana en las células tumorales. Además, los
péptidos de antígeno tumoral identificados actualmente existen en
algunos tipos de tumor, pero no en todos los tipos de tumor. Así,
para resolver estos problemas, los presentes inventores no utilizan
células tumorales como células diana, sino que se centran en las
células endoteliales de los vasos tumorales. Más específicamente,
las células endoteliales difícilmente presentan problemas
relacionados con un descenso o desaparición de la expresión de MHC
de Clase I, o heterogeneidad. Así, si se inducen los LTC dirigidos
contra los vasos tumorales, pueden superarse los problemas de la
terapia con vacunas convencionales contra el cáncer, como la
desaparición de la Clase I y la ausencia de una molécula diana,
independientemente del tipo de tumor, y pueden anticiparse
excelentes efectos terapéuticos. Se han iniciado estudios en la
angiogénesis tumoral a partir de hipótesis pioneras propuestas por
Folkman et al. en los años 70 y han sido desarrolladas desde
varias perspectivas. Se han llevado a cabo muchos estudios sobre
los receptores (VEGFR) del factor de crecimiento vascular endotelial
(VEGF) para evaluar su significancia en la angiogénesis tumoral. Se
han desarrollado exhaustivamente inhibidores de la angiogénesis como
fármacos orientados a dianas, particularmente en la terapia contra
el cáncer, y se han probado ya clínicamente. No obstante, las
terapias que utilizan este concepto para los tratamientos de vacunas
contra el cáncer no están todavía en uso. Una de las razones puede
ser inmunotolerancia al VEGFR, que se expresa en células normales.
No obstante, en la década de 1990, Plate, Millauer, y Risau et
al confirmaron que el VEGFR se expresan fuertemente en las
células endoteliales de los tejidos tumorales. Además, la respuesta
inmune a los autoantígenos como CEA y HER/neu, que también se
expresan en células normales, no es necesariamente de
inmunotolerancia. Por lo tanto, los presentes inventores
concluyeron que los VEGFR pueden utilizarse como dianas para la
terapia con una vacuna para el cáncer.
Recientemente, se describió que la inmunización
activa frente a los VEGFR puede inhibir la angiogénesis en tumores
y la metástasis (The Journal of Experimental Medicine, 2002, 195:
12, 1575-1584). No obstante, esta bibliografía
simplemente utilizó proteínas VEGFR solubles, y no realizó ninguna
investigación sobre las secuencias de aminoácido de los péptidos
efectivos.
Los presentes inventores se han centrado en las
posibles terapias con vacunas para el cáncer que la diana VEGFR2
(KDR/flk-1; denominada de ahora en adelante KDR), en
las que VEGFR2 se expresa fuertemente en células endoteliales de
tejido tumoral, y se cree que está involucrado en la proliferación
de células endoteliales a la señal de VEGF. Además, los presentes
inventores realizaron un cribado en busca de los péptidos que puede
utilizarse de forma efectiva como vacunas, examinando su
especificidad y completando esta invención.
Más específicamente, la presente invención
proporciona lo siguiente (de [1] a [18]):
[1] Un nonapéptido seleccionado de un grupo de
péptidos que constan de la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec.
Nº: 8.
[2] Un péptido con inducibilidad de células T
citotóxicas, en el que se sustituyen o añaden uno o dos aminoácidos
a la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec. Nº: 8.
[3] El péptido de [2], en el que el segundo
aminoácido del extremo N terminal es fenilalanina, tirosina,
metionina o triptófano.
[4] El péptido de [2] o [3], en el que el
aminoácido en C-terminal es fenilalanina, leucina,
isoleucina, triptófano o metionina.
[5] Un producto farmacéutico para tratar y/o
prevenir tumores, en el que el producto farmacéutico comprende uno
o más péptidos de los descritos en [1] a [4].
[6] Un producto farmacéutico para tratar la
retinopatía diabética, artritis reumatoide crónica, psoriasis y
aterosclerosis, en el que el producto farmacéutico comprende uno o
más péptidos de los descritos en [1] a [4].
[7] Un exosoma que presenta en su superficie un
complejo que comprende un péptido de los descritos en [1] a [4], y
un antígeno HLA.
[8] El exosoma de [7], en el que el antígeno HLA
es HLA-A24 o HLA-A02.
[9] El exosoma de [8], en el que el antígeno HLA
es HLA-A2402 o HLA-0201.
[10] Un método para inducir una célula
presentadora de antígenos con elevada inducibilidad de células T
citotóxicas utilizando un péptido de los descritos en [1] a
[4].
[11] Un método para inducir una células T
citotóxicas utilizando un péptido de los descritos en [1] a [4].
[12] Un método para inducir una célula
presentadora de antígenos con elevada inducibilidad de células T
citotóxicas, que comprende el paso de introducir un gen que
comprende un polinucleótido que codifica un péptido de los
descritos en [1] a [4] en una célula presentadora de antígenos.
[13] Una célula T citotóxica aislada que se
induce utilizando un péptido de los descritos en [1] a [4].
[14] Una célula presentadora de antígenos que
presenta un complejo de un antígeno HLA y un péptido de los
descritos en [1] a [4].
[15] La célula presentadora de antígenos de
[14], que se induce mediante el método de [10] o [11].
[16] Una vacuna para inhibir la angiogénesis en
un punto afectado, en el que la vacuna comprende un péptido de los
descritos en [1] a [4] como compuesto activo.
[17] La vacuna de [16], que se utiliza para su
administración a un sujeto cuyo antígeno HLA es
HLA-A24 o HLA-A02.
[18] La vacuna de [16] o [17], que se utiliza
para suprimir el crecimiento y/o metástasis de tumores malignos.
\vskip1.000000\baselineskip
Todas las figuras que no están relacionadas con
el nonapéptido de Id. de Sec. Nº: 8 se muestran sólo con propósitos
ilustrativos.
La Fig. 1 muestra la citotoxicidad de los clones
de LTC frente a las células diana.
La Fig. 2 muestra los resultados de los análisis
de tetrámero de HLA en los clones de LTC establecidos: (a) clones
de LTC inducidos por péptidos, y células de soporte; y (b) células
de soporte (control).
La Fig. 3 muestra el efecto de la vacunación
utilizando péptidos sobre la supervivencia de ratones BALB/c
inoculados con Colon 26.
La Fig. 4 muestra el efecto de la vacunación
utilizando péptidos sobre el crecimiento de tumores derivados de
Colon 26.
La Fig. 5 muestra el efecto de la vacunación
utilizando péptidos sobre la tasa de supervivencia de ratones
inoculados con B16.
La Fig. 6 muestra el efecto de la vacunación
utilizando péptidos sobre el crecimiento de tumores derivados de
melanoma B16. Antes de la exposición mediante inyección subcutánea
de células tumorales B16, los RTG A2/Kb se vacunaron dos veces, con
un intervalo de una semana, con CD pulsadas con KDR773 (círculos
negros), CD sólo (triángulos blancos), o HBSS (cuadrados blancos).
La figura muestra el crecimiento tumoral medio (P < 0,01).
La Fig. 7 muestra el efecto citotóxico del clon
de LTC C29-169 en células positivas para
HLA-A24 que presentan péptidos.
La Fig. 8 muestra el efecto citotóxico del clon
de LTC C29-169 en células positivas para
HLA-A24 que presentan péptidos.
La Fig. 9 muestra el efecto citotóxico del clon
de LTC KDR C85-775 (KWC85-775) en
células positivas para HLA-A0201 que presentan
péptidos.
La Fig. 10 muestra el efecto citotóxico del clon
de LTC KDR C85-775 (KWC85-775) en
células positivas para HLA-A0201 que presentan
péptidos KDR.
La Fig. 11 muestra el efecto citotóxico del clon
de LTC KDR C51-1328 (KWC51) en células positivas
para HLA-A0201 que presentan péptidos.
La Fig. 12 muestra el efecto citotóxico del clon
de LTC KDR C51-1328 (KWC51) en células positivas
para HLA-A0201 que presentan péptidos KDR.
La Fig. 13 muestra el efecto citotóxico del clon
de LTC KDR C44-773-2L
(KWC44-773-2L) en células positivas
para HLA-A0201 que presentan péptidos.
La Fig. 14 muestra el efecto citotóxico del clon
de LTC KDR C44-773-2L
(KWC44-773-2L) en células positivas
para HLA-A0201 que presentan péptidos.
La Fig. 15 muestra el efecto citotóxico del clon
de LTC KDR C44-773-2L
(KWC44-773-2L) en células positivas
para HLA-A0201 que presentan péptidos KDR.
La Fig. 16 muestra el efecto inhibidor de cada
tipo de anticuerpo en el efecto citotóxico del clon de LTC.
La Fig. 17 muestra la actividad inhibitoria de
los péptidos en la respuesta angiogénica inducida por las células
B16 en RTG A2/Kb. Los ratones se vacunaron dos veces con HBSS, CD no
pulsadas o CD pulsadas con los péptidos epítopo (KDR190, KDR772,
KDR773, KDR773-2L, KDR775 o KDR1084). Las flechas
indican vasos sanguíneos formados de nuevo, que se extienden con un
patrón característico en zig-zag.
La Fig. 18 muestra el efecto supresor de los
péptidos en el aumento de volumen de los tumores humanos en ratones
transgénicos.
La Fig. 19 muestra el efecto citotóxico del clon
de LTC KWC65-190 en células positivas para
HLA-A0201 que presentan péptidos, en presencia
(cajas negras) o ausencia (cajas blancas) de los péptidos.
La Fig. 20 muestra el efecto citotóxico del clon
de LTC KWC72-772 en células positivas para
HLA-A0201 que presentan péptidos, en presencia
(cajas negras) o ausencia (cajas blancas) de los péptidos.
La Fig. 21 muestra el efecto citotóxico del clon
de LTC KWC72-772 en células positivas para
HLA-A0201 que presentan péptidos KDR.
HePG2-VEGFR2: cajas negras;
HePG2-EGFP: cajas blancas.
La Fig. 22 muestra el efecto citotóxico del clon
de LTC C7-1318 en células positivas para
HLA-A24 que presentan péptidos, en presencia (cajas
negras) o ausencia (cajas blancas) de los péptidos.
La Fig. 23 muestra el efecto citotóxico del clon
de LTC KWC46 en células positivas para HLA-A24 que
presentan péptidos, en presencia (cajas negras) o ausencia (cajas
blancas) de los péptidos.
La Fig. 24 muestra el efecto citotóxico del clon
de LTC C18-189 en células positivas para
HLA-A24 que presentan péptidos, en presencia (cajas
negras) o ausencia (cajas blancas) de los péptidos.
La Fig. 25 muestra el efecto citotóxico del clon
de LTC C65-826 en células positivas para
HLA-A24 que presentan péptidos, en presencia (cajas
negras) o ausencia (cajas blancas) de los péptidos.
La Fig. 26 muestra el efecto citotóxico del clon
de LTC C7-1318 en células positivas para
HLA-A24 que presentan péptidos.
HT29-VEGFR2: cajas negras;
HT29-EGFP: cajas blancas.
La Fig. 27 muestra el efecto citotóxico del clon
de LTC KWC46 en células positivas para HLA-A24 que
presentan péptidos. HT29-VEGFR2: cajas negras;
HT29-EGFP: cajas blancas.
\newpage
La Fig. 28 muestra el efecto citotóxico del clon
de LTC C18-189 en células positivas para
HLA-A24 en células positivas para
HLA-A24 que presentan péptidos.
HT29-VEGFR2: cajas negras;
HT29-EGFP: cajas blancas.
La Fig. 29 muestra el efecto citotóxico del clon
de LTC C65-826 en células positivas para
HLA-A24 en células positivas para
HLA-A24 que presentan péptidos.
HT29-VEGFR2: cajas negras;
HT29-EGFP: cajas blancas.
La Fig. 30 muestra la actividad inhibitoria de
los péptidos sobre la respuesta angiogénica inducida por células
Colon 26 en ratones BALB/c. Los ratones se vacunaron dos veces con
HBSS, CD no pulsadas o CD pulsadas con un péptido epítopo (KDR189 o
KDR826). Las flechas indican vasos sanguíneos formado de nuevo que
presentan un patrón característico en zig-zag.
La Fig. 31 muestra la inhibición de la respuesta
angiogénica inducida por células Colon 26 en BALB/c mediante
péptidos. Las barras indican la media y las barras de error
verticales indican el error estándar.
La Fig. 32 muestra el efecto citotóxico de los
LTC, derivados de pacientes estimulados con péptidos, sobre células
positivas para HLA-A24, en presencia (rombos negros)
o ausencia (cuadrados blancos) de los péptidos.
(A) el efecto citotóxico de LTC derivados de un
paciente de cáncer de colon obtenido mediante estimulación con el
Id. de Sec. Nº: 8 (en el que la posición del aminoácido de
iniciación es KDR169);
(B) el efecto citotóxico de LTC derivados de un
paciente de cáncer de colon obtenidos mediante estimulación con el
Id. de Sec. Nº: 5 (en el que la posición del aminoácido de
iniciación es KDR189); y
(C) el efecto citotóxico de LTC derivados de un
paciente de cáncer de colon obtenidos mediante estimulación con el
Id. de Sec. Nº: 3 (en el que la posición del aminoácido de
iniciación es KDR220).
Debe notarse que todos los péptidos diferentes
de los péptidos dirigidos al Id. de Sec. Nº: 8 se mencionan sólo
con propósito ilustrativo.
Los presentes inventores consideraron en primer
lugar que varias proteínas se presentan in vivo en las
células presentadoras de antígeno tras ser degradadas a péptidos
9-meros (nonapéptidos), y se examinó la afinidad de
unión de péptidos parciales 9-meros o
10-meros de las proteínas KDR a los antígenos HLA,
que son los antígenos mayores de histocompatibilidad humanos
(antígenos MHC). Las letras en minúscula en las secuencias de los
péptidos que se muestran a la derecha en la Tabla 1 indican el
quinto aminoácido.
La secuencia de aminoácidos de la proteína KDR
humana es bien conocida, se describe en la patente estadounidense
Nº 5.861.301 por ejemplo, y un experto en la materia puede obtenerla
fácilmente. Los péptidos 9-meros y
10-meros pueden obtenerse sintetizando péptidos
iniciados a partir de cualquier posición, en base a la secuencia
completa de aminoácidos de la proteína KDR obtenida. Los péptidos
pueden sintetizarse de acuerdo con los métodos convencionales
utilizados en la química de péptidos. Los métodos de síntesis
comúnmente utilizados se describen, por ejemplo, en bibliografía
como Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins,
vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976; Peptide Synthesis
(Peputido Gousei), Maruzen Co., Ltd., 1975; Foundations and
Experiments in Peptide Synthesis (Peputido Gousei no Kiso to
Jikken), Maruzen Co., Ltd., 1985; y Development of Pharmaceuticals,
New Series (Iyakuhin no Kaihatsu, Zoku), Volumen 14, Peptide
Synthesis (Peputido Gousei), Hirokawa Shoten, 1991, y en
publicaciones como la Publicación Internacional Nº WO 99/67288. La
unión a los antígenos HLA puede analizarse mediante el aislamiento
de células que comprenden antígenos HLA en su superficie celular,
como las células dendríticas, y utilizando métodos convencionales
para medir la unión de los péptidos a las células.
Alternativamente, pueden utilizarse los
programas disponibles actualmente en Internet, como los descritos
en Parker K. C., J. Immunol. 152, 1994, para calcular las afinidades
de unión entre varios péptidos y los antígenos HLA in
silico. La afinidad de unión a los antígenos HLA puede
determinarse como se describe, por ejemplo, en Parker, K. C., J.
Immunol., 152, 1994; y Nukaya, I., Int. J. Cancer, 80, 1999.
Para obtener suficientes resultados,
preferiblemente se utilizan como antígenos HLA los antígenos tipo
A-24 y tipo A-02, que se cree que
son de elevada expresión entre los japoneses. Más preferiblemente,
se utilizan los subtipos A-2402 y
A-0201. No obstante, a nivel clínico, puede
seleccionarse de forma apropiada un péptido con un mayor nivel de
afinidad de unión a antígeno o mayor nivel de inducibilidad de
células T citotóxicas (LTC) tras la presentación del antígeno, al
predeterminar el tipo de antígeno HLA de un paciente en necesidad
de un tratamiento. Además, para obtener péptidos con niveles
elevados de afinidad de unión y de inducibilidad de LTC, puede
realizarse una sustitución o adición de uno, dos o varios
aminoácidos en base a la secuencia de aminoácidos del péptido
parcial de KDR que aparece en la naturaleza. Aquí, el término
"varios" significa cinco o menos, o preferiblemente tres o
menos. Además de los péptidos en la naturaleza, también se conoce
la regularidad de la secuencia de los péptidos presentados mediante
la unión a antígenos HLA (J. Immunol., 152, 3913, 1994;
Inmunogenetics. 41: 178, 1995; J. Immunol. 155: 4307, 1994). Así,
las modificaciones basadas en esta regularidad también pueden
realizarse en los péptidos obtenidos. Por ejemplo, los péptidos en
los que el segundo aminoácido del extremo
N-terminal se sustituye por fenilalanina, tirosina,
metionina o triptófano, y en el que el aminoácido en
C-terminal se sustituye por fenilalanina, leucina,
isoleucina, triptófano o metionina también pueden utilizarse
preferiblemente como péptidos con elevada afinidad de unión a
HLA-24. Por otro lado, los péptidos en los que el
segundo aminoácido del extremo N-terminal se
sustituye por leucina o metionina, y en el que el aminoácido en
C-terminal se sustituye por valina o leucina pueden
utilizarse preferiblemente como péptidos con elevada afinidad de
unión a HLA-0201. Además, también pueden añadirse de
uno a dos aminoácidos al extremo N y/o C-terminal
de los péptidos.
No obstante, cuando la secuencia de un péptido
es idéntica a la porción de una secuencia de aminoácidos de una
proteína endógena o exógena con una función diferente, esto puede
causar efectos colaterales como enfermedades autoinmunes o síntomas
alérgicos frente a sustancias específicas. Por lo tanto, es
preferible utilizar las bases de datos disponibles para realizar
búsquedas de homología, y evitar situaciones en las que una
secuencia se corresponde con la secuencia de aminoácidos de otra
proteína. Además, si las búsquedas de homología revelan que no
existen péptidos, incluso que comprendan una diferencia de uno o dos
aminoácidos, no existe riesgo de tales problemas causados por las
modificaciones de las anteriormente mencionadas secuencias de
aminoácido para aumentar la afinidad de unión a los antígenos HLA
y/o la inducibilidad de LTC.
Como se ha descrito anteriormente, se espera que
los péptidos con elevada afinidad de unión a los antígenos HLA
tengan una gran efectividad como vacunas del cáncer. No obstante, es
necesario determinar si los péptidos candidatos, que se seleccionan
utilizando como indicador la elevada afinidad de unión, realmente
presentan inducibilidad de LTC o no. La confirmación de la
inducibilidad de LTC se realiza induciendo las células presentadoras
de antígeno que comprenden antígenos MHC humanos (como los
linfocitos B, macrófagos y células dendríticas), más
específicamente células dendríticas derivadas de leucocitos
mononucleares de sangre periférica humana; estimulando las células
con los péptidos; mezclando las células con células positivas para
CD8; y luego midiendo la citotoxicidad frente a las células diana.
Como sistema de reacción, pueden utilizarse animales transgénicos
generados para expresar un antígeno HLA humano (por ejemplo, los
descritos en Hum. Immunol. 2000 Aug.; 61 (8):
764-79 Induction of CTL response by a minimal
epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on
HLA class II restricted T(H) response., BenMohamed L.,
Krishnan R., Longmate J., Auge C., Low L., Primus J., y Diamond
DJ.). Por ejemplo, mediante radiomarcaje de las células diana con
^{51}Cr o similar, puede calcularse la citotoxicidad a partir de
la radiactividad liberada de las células diana. Alternativamente,
la actividad puede analizarse midiendo el
IFN-\gamma producido y liberado por los LTC en
presencia de las células presentadoras de antígeno que tienen
péptidos inmovilizados, y visualizando la zona de inhibición en el
medio utilizando anticuerpos monoclonales
anti-IFN-\gamma.
Los resultados del análisis de la inducibilidad
de LTC de los péptidos descritos anteriormente revelaron que los de
elevada afinidad de unión a los antígenos HLA no necesariamente
muestran una elevada inducibilidad. Además, los nonapéptidos
seleccionados a partir de los péptidos que comprenden las secuencias
de aminoácido VYSSEEAEL (Id. de Sec. Nº: 2), GYRIYDVVL (Id. de Sec.
Nº: 3), SYMISYAGM (Id. de Sec. Nº: 5), RFVPDGNRI (Id. de Sec. Nº:
8), KWEFPRDRL (Id. de Sec. Nº: 11) o DFLTLEHLI (Id. de Sec. Nº: 12),
y los nonapéptidos y decapéptidos seleccionados a partir de los
péptidos que comprenden las secuencias de aminoácido AMFFWLLV (Id.
de Sec. Nº: 29), VIAMFFWLL (Id. de Sec. Nº: 30), AVIAMFFWL (Id. de
Sec. Nº: 33), KLIEIGVQT (Id. de Sec. Nº: 34), YMISYAGMV (Id. de
Sec. Nº: 40) o IQSDVWSFGV (Id. de Sec. Nº: 46), mostraron una
inducibilidad de LTC particularmente elevada.
La presente invención proporciona además
péptidos con inducibilidad de células T citotóxicas, en los que uno
o dos aminoácidos se sustituyen o se añaden a la secuencia de
aminoácidos de Id. de Sec. Nº: 8. Uno o dos aminoácidos pueden
sustituirse o añadirse a la secuencia de aminoácidos de Id. de Sec.
Nº: 8, que consta de nueve aminoácidos, siempre que exista
inducibilidad de LTC y las secuencias no se correspondan con la
secuencia de aminoácidos de otra proteína. En particular, por
ejemplo, el segundo aminoácido del extremo
N-terminal preferiblemente se sustituye por
fenilalanina, tirosina, metionina o triptófano, o el aminoácido en
C-terminal preferiblemente se sustituye por
fenilalanina, leucina, isoleucina, triptófano o metionina; o se
añaden uno o dos aminoácidos al extremo N-terminal
y/o C-terminal.
También se describen aquí los péptidos con
inducibilidad de células T citotóxicas, en los que uno, dos o varios
aminoácidos se sustituyen o se añaden a la secuencia de aminoácidos
de Id. de Sec. Nº: 29, 30, 33, 34, 40 o 46. Uno, dos o varios
aminoácidos pueden sustituirse o añadirse a la secuencia de
aminoácidos de Id. de Sec. Nº: 29, 30, 33, 34, 40, y 46, que
constan de nueve o diez aminoácidos, siempre que exista
inducibilidad de LTC y las secuencias no se correspondan con la
secuencia de aminoácidos de otra proteína. En particular, por
ejemplo, el segundo aminoácido del extremo
N-terminal preferiblemente se sustituye por leucina
o metionina, o el aminoácido en C-terminal
preferiblemente se sustituye por valina o leucina; o se añaden uno o
dos aminoácidos al extremo N-terminal y/o
C-terminal.
Un ejemplo de tal péptido modificado es el
péptido de Id. de Sec. Nº: 30, en el que el segundo aminoácido del
extremo N-terminal se sustituye por leucina (Id. de
Sec. Nº: 54), pero este ejemplo no es limitante. Los clones de LTC
obtenidos en la estimulación con estos péptidos modificados pueden
reconocer los péptidos originales y causar daños.
Los péptidos de esta invención pueden utilizarse
solos o en combinaciones de dos o más, como vacunas contra el
cáncer capaces de inducir los LTC in vivo. Mediante la
administración de los péptidos de esta invención, los péptidos se
presentan con una elevada densidad a los antígenos HLA de las
células presentadoras de antígeno. Los LTC que reaccionan
específicamente con los complejos formados entre los péptidos
presentados y los antígenos HLA se inducen, aumentando la agresión
frente a las células endoteliales vasculares en las células
tumorales diana. Alternativamente, las células presentadoras de
antígeno en cuya superficie celular se inmovilizan péptidos de esta
invención pueden obtenerse mediante la derivación de células
dendríticas de un sujeto, y su estimulación con los péptidos de
esta invención. Las células presentadoras de antígeno obtenidas se
readministran a los sujetos para inducir los LTC en los sujetos.
Como resultado, puede aumentarse la agresión hacia las células
diana.
Más específicamente, la presente invención
proporciona productos farmacéuticos para tratar tumores o prevenir
la proliferación, metástasis y similares de los tumores, en los que
los productos farmacéuticos comprenden uno o más péptidos de esta
invención. La angiogénesis en los lugares patológicos está
fuertemente asociada no sólo con los tumores, sino también con
enfermedades como la retinopatía diabética, artritis reumatoide
crónica, psoriasis y aterosclerosis, y con la metástasis de los
tumores sólidos (Folkman, J., Nature Med. 1: 27-31
(1995); Bicknell, R., Harris, A.L., Curr. Opin. Oncol. 8:
60-65 (1996)). Por lo tanto, los péptidos de esta
invención pueden utilizarse para tratar tumores, enfermedades como
la retinopatía diabética, artritis reumatoide crónica, psoriasis,
aterosclerosis y metástasis de los tumores sólidos.
Se confirmó que los péptidos de esta invención
inhibían la formación de vasos sanguíneos tortuosos, que son
morfológicamente diferentes de los vasos sanguíneos normales, y que
se forman en los tejidos tumorales malignos. Los resultados de
analizar la cicatrización y la fertilidad en ratones vacunados
también confirmó que los péptidos no provocan efectos adversos
sobre la angiogénesis fisiológica normal. Además, se analizó in
vitro la citotoxicidad frente a las células endoteliales no
proliferativas o proliferativas utilizando los clones de LTC que
reconocen los péptidos de esa invención. Estos clones mostraron una
mayor actividad frente a las células endoteliales proliferativas
que frente a las células endoteliales no proliferativas. Más
específicamente, estos pueden funcionar muy específicamente en los
trastornos que involucran células endoteliales proliferativas, y
particularmente el cáncer.
La estimulación in vivo e in vitro
de células dendríticas mediante los péptidos de esta invención
puede realizarse fácilmente mediante la exposición de células a una
elevada concentración de péptidos, lo que causa que estos péptidos
reemplacen a los péptidos originalmente inmovilizados sobre las
células. Por los tanto, los péptidos utilizados en esta invención
deben tener al menos cierto nivel de afinidad de unión a los
antígenos HLA.
Los productos farmacéuticos de esta invención
pueden administrarse directamente como los péptidos de esta
invención en sí mismos, o pueden administrarse como composiciones
farmacéuticas que se han formulado mediante los métodos de
formulación convencionales. En tales casos, los productos
farmacéuticos de esta invención pueden incluir de forma apropiada,
además de los péptidos de esta invención, transportadores,
excipientes y similares que normalmente se usan en los productos
farmacéuticos, sin limitaciones particulares. Los productos
farmacéuticos de esta invención pueden utilizarse para el
tratamiento y prevención de varios tumores, como el cáncer gástrico,
cáncer duodenal, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mama,
cáncer de próstata y tumores cerebrales. Los péptidos de esta
invención no atacan las células tumorales en sí mismas, sino que
atacan las células endoteliales de los vasos sanguíneos que se
forman de nuevo en los tejidos tumorales. Por lo tanto, una gran
variedad de tumores pueden ser objeto de tratamiento, y los
productos farmacéuticos de esta invención no tienen limitaciones
particulares es su utilización.
Los productos farmacéuticos para tratar y/o
prevenir tumores, que comprenden un péptido de esta invención como
compuesto activo, pueden administrarse con adyuvantes de forma que
la inmunidad celular se induzca de forma efectiva; pueden
administrarse con otros compuesto activos como los agentes
antitumorales; y pueden administrarse en formas granulares. Son
aplicables estos adyuvantes descritos en la bibliografía (Clin.
Microbiol. Rev., 7: 277-289, 1994) o similares.
Además, los productos farmacéuticos de esta invención pueden
administrarse como formulaciones de liposomas, como formulaciones
granulares unidas a cuentas de pocos micrómetros de diámetro, y
como formulaciones a los que se unen lípidos. Los métodos de
administración pueden realizarse, por ejemplo, por vía oral, por
vía intradérmica o por vía subcutánea, o a través de inyección
intravenosa, o similar. Puede utilizarse una administración
sistémica o una administración local en los alrededores del tumor
diana. Las dosis de los péptidos de esta invención pueden ajustarse
de forma apropiada, dependiendo de la enfermedad a tratar, edad y
peso de los pacientes, métodos de administración y similares.
Normalmente se administran preferiblemente de 0,001 mg a 1000 mg,
preferiblemente de 0,01 mg a 100 mg, más preferiblemente de 0,1 mg
a 10 mg, de los péptidos de esta invención una vez durante algunos
días y hasta varios meses. El experto en la materia podrá
seleccionar de forma adecuada las dosis apropiadas.
Alternativamente, la presente invención
proporciona vesículas intracelulares que presentan complejos
formados entre los péptidos de esta invención y los antígenos HLA
en su superficie. Estas vesículas intracelulares se denominan
exosomas. Los exosomas pueden prepararse, por ejemplo, de acuerdo
con los métodos específicamente descritos en la traducción japonesa
publicada de las publicaciones internacionales Nº Hei
11-510507 y 2000-512161. Los
exosomas pueden obtenerse preferiblemente utilizando células
presentadoras de antígeno obtenidas de sujetos que van a someterse
a terapia o profilaxis. Los exosomas de esta invención pueden
inocularse como vacunas del cáncer, como los péptidos de esta
invención.
El tipo de antígenos HLA a utilizar debe
corresponderse con el del sujeto en necesidad de terapia y/o
profilaxis. Por ejemplo, para los japoneses, el
HLA-A24 o HLA-A02, en particular
HLA-A2402 o HLA-0201, a menudo es
apropiado.
La presente invención también describe los
métodos para inducir las células presentadoras de antígeno
utilizando los péptidos de esta invención. Las células
presentadoras de antígeno pueden inducirse mediante la inducción de
células dendríticas a partir de monocitos de sangre periférica; y
luego poniéndolas en contacto (estimulándolas) con los péptidos de
esta invención, in vitro o in vivo. La administración
de los péptidos de esta invención a los sujetos induce en el cuerpo
del sujeto las células presentadoras de antígeno en las que los
péptidos de esta invención se inmovilizan. Alternativamente, los
péptidos de esta invención pueden inmovilizarse en las células
presentadoras de antígeno a administrar al sujeto como vacuna.
La presente invención también proporciona
métodos para inducir células presentadoras de antígeno con un
elevado nivel de inducibilidad de células T citotóxicas, en el que
dichos métodos comprenden la introducción in vitro en una
células presentadoras de antígeno de un gen que comprende un
polinucleótido que codifica un péptido de esta invención. Los genes
a introducir pueden estar en forma de DNA o RNA. Los métodos de
introducción pueden ser diferentes métodos comúnmente utilizados en
la materia, como los métodos de lipofección, electroporación y
fosfato cálcico, sin limitaciones particulares. Más específicamente,
los métodos pueden realizarse como se describen en, por ejemplo,
Cancer Res., 56: 5672, 1996; J. Immunol., 161: 5607, 1998; J. Exp.
Med., 184: 465, 1996; o la traducción japonesa publicada de las
publicaciones internacionales Nº 2000-509281.
Mediante la introducción de genes en las células presentadoras de
antígeno, los genes se someten a transcripción, traducción y
similares en las células. Las proteínas obtenidas se someten
entonces a un procesado de MHC de clase I o II y a la vía de
presentación para presentar los péptidos parciales.
Además, la presente invención describe los
métodos para inducir los LTC utilizando los péptidos de esta
invención. Mediante la administración de los péptidos de esta
invención a un sujeto, se inducen los LTC en el cuerpo del sujeto,
potenciando la inmunidad frente a las células endoteliales
angiogénicas en los tejidos tumorales. Alternativamente, los
métodos pueden utilizarse en métodos terapéuticos ex vivo, en
los que las células presentadoras de antígeno derivadas del sujeto,
células positivas para CD8, o leucocitos mononucleares de sangre
periférica se ponen en contacto (se estimulan) in vitro con
los péptidos de esta invención para inducir LTC, y luego las
células se devuelven al sujeto.
Además, la presente invención describe células T
citotóxicas, que se inducen utilizando los péptidos de esta
invención y luego se aíslan. Las células T citotóxicas, que se han
inducido mediante estimulación con las células presentadoras de
antígeno que presentan los péptidos de esta invención, se derivan
preferiblemente de los sujetos que se van a someter a terapia y/o
profilaxis. Los linfocitos T citotóxicos pueden administrarse solos
o, con propósito de obtener un efecto antitumoral, en combinación
con otros fármacos, los que incluye los péptidos, exosomas y demás
de esta invención. Los linfocitos T citotóxicos obtenidos actúan
específicamente frente a las células diana que presentan los
péptidos de esta invención, o preferiblemente, frente a las células
diana que presentan los mismos péptidos utilizados para la
inducción. Las células diana pueden ser células que expresan de
forma endógena el KDR, o células en las que se ha forzado la
expresión de KDR. Además, también pueden convertirse en diana las
células que presentan los péptidos de esta invención sobre su
superficie celular debido a la estimulación mediante estos
péptidos.
La presente invención también proporciona unas
células presentadoras de antígeno que presentan complejos formados
entre los antígenos HLA y los péptidos de esta invención. Las
células presentadoras de antígeno que se obtienen mediante el
contacto con los péptidos de esta invención, o con nucleótidos que
codifican los péptidos de esta invención, derivan preferiblemente
de sujetos a los que se desea someter a terapia y/o profilaxis. Las
células presentadoras de antígeno pueden administrarse como vacunas
en sí mismas, o en combinación con otros fármacos como los péptidos
de esta invención, exosomas y células T citotóxicas.
A continuación, se describe la presente
invención de forma específica utilizando Ejemplos, pero no debe
tomarse como una limitación de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Basados en la secuencia completa de aminoácidos
de la proteína KDR, se predijeron doce tipos de péptidos
9-meros (Id. de Sec. Nº: 1 a 12), y doce tipos de
péptidos 10-meros (Id. de Sec. Nº: 13 a 24)
ordenados desde la afinidad de unión más alta a
HLA-A*2402, utilizando el programa de Predicción de
Unión de Péptidos a HLA de la Sección de Análisis Molecular y
Bioinformática (BIMAS)
(http://bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform)
(Tabla 1). La Tabla 1 muestra la afinidad de unión de cada uno de
los 9-meros y 10-meros ordenados
desde el valor de afinidad más alto, junto con la posición de su N
terminal en la secuencia de aminoácidos de la proteína KDR. En la
tabla, CE652 (Id. de Sec. Nº: 25) se refiere a uno de los epítopos
del antígeno tumoral CEA (antígeno carcinoembrionario) descrito por
Nukaya, I. (Int. J. Cancer 80, 1999). Los péptidos de VIH (ILKEPVHGV
(Id. de Sec. Nº: 55) y RYLRDQQLL (Id. de Sec. Nº: 56)) se
utilizaron como péptidos de control negativo.
Los péptidos se sintetizaron de acuerdo con los
métodos de síntesis estándar en fase sólida utilizando Cleaved
PepSet (Mimotope, San Diego, CA), y se purificaron mediante HPLC de
fase reversa. La pureza (>95%) y el tipo de péptido se
determinaron individualmente utilizando HPLC y espectrometría de
masas.
\newpage
Ejemplo
2
Las líneas celulares de linfocitos B
inmortalizados de virus Epstein-Barr (EBV), TISI
(HLA-A24/24) y EHM (HLA-A3/3),
fueron proporcionados por Takara Shuzo Biotechnology Research
Laboratory.
El serotipaje de HLA se realizó utilizando 7 mL
de sangre periférica recogida de un sujeto sano. Se aislaron
linfocitos de sangre periférica (PBMC) de sangre periférica
HLA-A24-positiva utilizando
centrifugación por gravedad específica con Ficoll Paque
(Pharmacia).
Los PBMC obtenidos se dejaron reposar diez horas
en un frasco de cultivo (Corning, 43072). Tras eliminar las células
en suspensión, se cultivaron en medio AIM-V las
células adheridas al frasco (Invitrogen) suplementado con autosuero
al 2% añadiendo 1000 U/mL de GM-CSF humana
(proporcionado por Kirin Brewery), y 1000 U/mL de
IL-4 humana (Genzyme). Cinco días después, las
células se cultivaron durante otras 48 horas en 10 \mug/mL de
OK-432 (proporcionado por Chugai Pharmaceutical Co.,
Ltd.), y se utilizaron como células presentadoras de antígeno para
la inducción de LTC. Las células dendríticas (CD) se confirmaron que
eran CD mediante reacción con anticuerpos marcados con FITC
anti-Clase II, CD80, y CD86, y con anticuerpos
marcados con PE anti-Clase I, CD11c, CD40 (todos de
Beckton-Dickinson), y anticuerpos CD83 (Inmunotech);
seguido de análisis de los antígenos de superficie mediante
FACS-Calibur (Beckton- Dickinson) utilizando el
programa Cell Quest.
Las CD preinducidas se sometieron a un pulso
durante cuatro horas a 20ºC con doce clases de péptidos
9-meros (Id. de Sec. Nº: 1 a 12) (20 \mug/mL),
que se predijeron en el Ejemplo 1 que tenían alta afinidad de unión,
en presencia de 3 \mug/mL de
\beta2-microglobulina. Las CD resultantes se
mezclaron con células CD8-positivas seleccionadas
con cuentas magnéticas (Dynabeads M-450 y
Detachabeads) de los PBMC, en una proporción de 1:20 o 1:2, y
después se cultivaron en una placa de 48 pocillos (Corning), en
presencia de 10 ng/mL de IL-7 humana (Genzyme).
Tres días después, se añadió IL-2 (Sigma) a una
concentración final de 10 U/mL al cultivo. Siete y 14 días después,
las mismas CD se estimularon para inducir LTC, y 20 días después, se
midió la citotoxicidad de cada pocillo utilizando células TISI
pulsadas con péptido como dianas. Sólo los pocillos positivos se
cultivaron mediante un método de estimulación con líneas celulares
de alo-PBMC, linfocitos B
EBV-inmortalizadas (EHM), y 30 ng/mL de anticuerpo
anti-CD3. Se analizaron funcionalmente los LTC 14
días después.
Se evaluó la actividad citotóxica en un ensayo
de liberación de ^{51}Cr de cuatro horas. Las células diana se
sometieron a un pulso con péptidos a una concentración de 20
\mug/mL durante la noche. Las células diana se marcaron con 100
PCi de Na_{2}^{51}CrO_{4} a 37ºC durante una hora, y se
lavaron tres veces con RPMI1640. Se colocaron las células diana (1x
10^{4} células/100 \muL) y 100 \muL de células efectoras a
varias concentraciones con un volumen total de 200 \muL en una
placa microtitulada de 96 pocillos en forma de U (Corning), y se
cultivaron en un incubador de CO_{2} a 37ºC durante cuatro horas.
Tras el cultivo, se recogió 100 \muL de sobrenadante de cada
pocillo y se midió utilizando un contador \gamma. La
desintegración natural de la radioactividad fue en las células
diana y el medio, y la máximo desintegración de la radioactividad
fue en las células diana y HCl 1M. La actividad citotóxica
(porcentaje de lisis específica) se calculó mediante la siguiente
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
Actividad\
citotóxica\ (%\ de\ citotoxicidad) = (desintegración\ experimental -
desintegración\ natural)/ (máxima\ desintegración -
desintegración\ natural)\ x\
100
\vskip1.000000\baselineskip
Como resultado, se establecieron seis tipos de
líneas de LTC, como se muestra en la Tabla 2. En particular, los
nonapéptidos mostrados por Id. de Sec. Nº: 2 (posición del
aminoácido de iniciación en KDR1318), Id. de Sec. Nº: 3 (KDR220),
Id. de Sec. Nº: 5 (KDR189), Id. de Sec. Nº: 8 (KDR169), Id. de Sec.
Nº: 11 (KDR826), e Id. de Sec. Nº: 12 (KDR998) se determinaron que
eran efectivos como péptidos epítopo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Los seis tipos de líneas de LTC establecidas en
el Ejemplo 2 se diluyeron a 0,3, 1, o 3 células/pocillo en una
placa de 96 pocillos en forma de U. Se añadieron a cada pocillo 7x
10^{4} células/pocillo de alo-PBMC, 1x 10^{4}
células/pocillo de EHM, 30 ng/mL de anticuerpo
anti-CD3, y 125 U/mL de IL-2, y se
le añadió AIM-V suplementado con autosuero al 5%,
por lo que la concentración total fue de 150 \muL/pocillo. Diez
días después, se añadieron 50 \muL/pocillo de medio suplementado
con IL-2 ajustado a una concentración final de
IL-2 de 125 U/mL. Se analizaron funcionalmente los
LTC el día 14, y los LTC con actividad se cultivaron a gran
escala.
Como resultado, de cada uno de los cinco tipos
de nonapéptidos mostrados por Id. de Sec. Nº: 8 (en el que la
posición del aminoácido de iniciación es KDR169), Id. de Sec. Nº: 5
(KDR189), Id. de Sec. Nº: 3 (KDR220), Id. de Sec. Nº: 2 (KDR1318),
e Id. de Sec. Nº: 11 (KDR826), ocho tipos (C13-169,
C19-169, C29-169,
C53-169, C72-169,
C61-169, K5-169, y
K25-169), dos tipos (C12-189 y
C18-189), once tipos (KWC3, 23, 25, 26, 36, 42, 46,
58, 61, 70, y 77), un tipo (C7-1318), y un tipo
(C65-826) de clon de LTC se establecieron,
respectivamente (Tabla 3).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Ejemplo
4
Se analizó el grado de citotoxicidad de los diez
tipos de clones de LTC establecidos en el Ejemplo 3 variando la
proporción con las células diana (proporción E:T).
Como resultado, C53-169 derivado
del nonapéptido de Id. de Sec. Nº: 8 (en el que la posición del
aminoácido de iniciación es KDR169) mostró la mayor
citotoxicidad.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se sintetizó un tetrámero de HLA a partir de
HLA-A*2402 y el péptido de Id. de Sec. Nº: 8 (en el
que la posición del aminoácido de iniciación es KDR169). Más
específicamente, los vectores plasmídicos que expresan la cadena H
(aproximadamente 35 kDa) y la cadena L (aproximadamente 11 kDa) se
produjeron individualmente, y su proteína recombinante se expresó
utilizando E. coli. El vector plasmídico de la cadena H
contiene sólo el dominio extracelular, en el que el carboxilo
terminal se sustituyó con una secuencia de reconocimiento de enzima
de biotinilización. La cadena H y la cadena L forman un complejo de
péptidos de HLA mediante el replegamiento con un péptido
antigénico. Los complejos de péptidos de HLA se biotinilaron
mediante un enzima de biotinilización, el exceso de biotina se
eliminó mediante cromatografía de filtración en gel y cromatografía
de intercambio de iones, y los complejos de péptidos de HLA
biotinilados se aislaron y purificaron. El tetrámero de HLA se
sintetizó haciendo reaccionar el complejo de péptidos de HLA
biotinilado obtenido con estreptavidina (SA) en una proporción
molar de 4:1 para formar un tetrámero. Cuando se analizaron las
muestras, se utilizó SA marcada fluorescentemente con ficoeritrina
(PE) (SA-PE) para formar el tetrámero. La molécula
de CD8 se conoce porque se une al 245º aminoácido en el dominio a3,
que es una alanina, con la excepción de las porciones de
HLA-A, B, y C. Por lo tanto, los presentes
inventores mutaron la alanina en los tetrámeros de HLA en una
valina, para producir un tetrámero de HLA mutante capaz de detectar
de forma selectiva los LTC con alta avidez hacia los complejos de
péptidos de HLA, independientemente de la unión entre la molécula de
CD8 y el dominio
a3.
a3.
Los clones LCT establecidos se detectaron
mediante el mutante sintetizado tetrámero KDR169
HLA-A24. Como resultado, como se muestra en la Fig.
2, se vio que los clones LCT establecidos se tiñeron fuertemente
mediante las fracciones tetrámero-positivo y
CD8-positivo, y que reconocen específicamente los
complejos formados entre los péptidos de esta invención y los
antígenos HLA. Las señales en las fracciones
tetrámero-negativo y CD8-negativo se
debe a las células de soporte.
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Ejemplo
6
De forma similar al Ejemplo 1, se predijeron 15
tipos de péptidos 9-meros (Id. de Sec. Nº: 26 a 40),
y 12 tipos de péptidos 10-meros (Id. de Sec. Nº: 41
a 52) de la secuencia completa de aminoácidos de la proteína KDR,
ordenados desde la afinidad de unión más alta con
HLA-A*0201, utilizando el programa de Predicción de
Unión de Péptidos a HLA
(http://bimas.dcrt.nih.gov/cgibin/molbio/ken_parker_ comboform)
(Tabla 4). La tabla 4 muestra la afinidad de unión de cada uno de
los 9 meros y 10 meros ordenados desde el valor de afinidad más
alto, junto con la posición de su N terminal en la secuencia de
aminoácidos de la proteína KDR. En la tabla, CEA588 (Id. de Sec.
Nº: 53) se refiere a uno de los epítopos del antígeno tumoral CEA
(antígeno carcinoembrionario) descrito por Tanaka, H. et al.
(presentación de póster, AACR Nº3669, vol. 42,
p681-682, Marzo 2001).
Ejemplo
7
Los LCT se indujeron mediante un método de
vacunación, utilizando los 16 tipos de péptidos
9-meros y 10-meros (Id. de Sec. Nº:
26 a 41) predichos en el Ejemplo 6 en ratones transgénicos que
expresan HLA humano (A0201) (Hum. Immunol. 2000 Aug.; 61 (8):
764-79 Induction of CTL response by a minimal
epitope vaccine in HLAA*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA
class II restricted T(H) response., BenMohamed L., Krishnan
R., Longmate J., Auge C., Low L., Primus J., y Diamond DJ.).
Se obtuvieron ratones BALB/C
(H-2^{d}) de seis a ocho semanas de edad de CLEA
Japan. Los ratones transgénicos A2/Kb (RTG) fueron proporcionados
por F. Jim Primus, Ph. D. del Centro de Cáncer
Vanderbilt-Ingram. Los linfocitos T2 (deficientes
para TAP y HLA-A*0201-positivos)
fueron proporcionados por el Prof. H. Shiku de la Universidad de
Mie, Tercer Departamento de Medicina Interna.
La médula ósea se recogió del fémur y tibia del
ratón, y se retiraron los linfocitos y granulocitos utilizando
anticuerpos anti-CD4, CD8, Gr-1
(Beckton-Dickinson), anticuerpo
anti-B220 (Bioscience) y complemento de conejo
(PeL- Freez). Las células obtenidas se cultivaron en una placa de 6
pocillos. Las células en suspensión se recogieron al día siguiente
en medio RPMI1640 (Invitrogen) suplementado con FBS al 10% en otra
placa de 6 pocillos, a la que se le añadió 1000 U/mL de
GM-CSF de ratón (proporcinado por Kirin Brewery) y
1000 U/mL de IL-4 de ratón (PEPRO TECH). Tres días
después, se cambió la mitad del medio anterior, y dos días después,
las células se cultivaron durante 20 horas en 10 \mug/mL de OK-
432. Las células en suspensión resultantes se utilizaron como CD.
Las CD se hicieron reaccionar con anticuerpos marcados con FITC
anti-Clase II y CD40, y anticuerpos marcados con PE
anti-Clase I, CD11c, CD80, y CD86 (todos de
Beckton-Dickinson), y se confirmó que eran CD
mediante análisis de los antígenos de superficie mediante
FACS-Calibur (Beckton- Dickinson) utilizando el
programa Cell
Quest.
Quest.
Después, 100 \mug de cada péptido, 140 \mug
de péptido ayudante HbcAg120-140, y 100 \muL de
IFA se mezclaron (200 \muL en total). La mezcla se administró por
vía subcutánea en el abdomen derecho el día 0, y en el abdomen
izquierdo el día 11. Se recogieron los bazos de los ratones
vacunados el día 21, los eritrocitos se eliminaron hemolíticamente
utilizando el tampón de lisis rojo (Sigma), y se utilizó una porción
de las células como células respondedoras para el ensayo
IFN-\gamma ELISPOT. El resto de células se
colocaron en una placa de 24 pocillos (Corning) a 6x10^{6}
células/pocillo con células de soporte en una proporción de 3:1, y
se estimularon de nuevo. Se midió la citotoxicidad cinco días
después. Los esplenocitos libres de eritrocitos, que derivaban de
los ratones singénicos, se cultivaron durante tres días en presencia
de 25 \mug/mL de lipopolisacárido (LPS) para utilizar como
células de
soporte.
soporte.
En este Ejemplo, el método
IFN-\gamma ELISPOT se utilizó para evaluar la
inducibilidad de los LCT de acuerdo con los puntos (SPOT)
producidos por las células productoras de
IFN-\gamma. Se trató una placa de 96 pocillos de
fondo plano MAHA S45 (Millipore) a 4ºC durante la noche con
anticuerpo monoclonal
anti-IFN-\gamma de ratón
(Pharmingen). Al día siguiente, se lavó la placa con PBS que
contenía 0,05% de Tween 20, y después se hizo reaccionar con un
tampón de bloqueo a temperatura ambiente durante dos horas. Después
de esto, se añadieron las células T2 pulsadas y no pulsadas con
péptido a cada pocillo a 10^{5} células/100 \muL. Los
esplenocitos de los ratones vacunados se añadieron a cada pocillo a
un máximo de 4x 10^{6} células/100 \muL (200 \muL en total),
y se cultivaron durante la noche a 37ºC. Al día siguiente, cada
pocillo se lavó, y se hizo reaccionar durante dos horas con
anticuerpos biotinilados de rata
anti-IFN-\gamma de ratón
(Pharmingen). Tras lavar la placa extensivamente, se añadió
Extravidina a cada pocillo y se hizo reaccionar a temperatura
ambiente durante dos horas. Tras lavar, se añadió sustrato
conjugado de fosfatasa alcalina (BIO-RAD) a los
pocillos, que se dejó a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Los puntos azules resultantes de la producción de
IFN-\gamma se midieron utilizando liberación
compacta KS ELISPOT (Carl
Zeiss).
Zeiss).
Los puntos azules específicos se determinaron
como:
\text{Puntos
azules específicos}
=(TISI(+)SPOT-TISI(-)SPOT)
Aquellos que cumplen la siguiente condición se
consideraron efectivos:
TISI(+)SPOT/TISI(-)SPOT \geq
2
Como resultado, se obtuvieron cinco tipos de
péptidos epítopo, Id. de Sec. Nº: 29 (en el que la posición del
aminoácido de iniciación es KDR775), Id. de Sec. Nº: 30 (KDR773),
Id. de Sec. Nº: 33 (KDR772), Id. de Sec. Nº: 34 (KDR1328), y Id. de
Sec. Nº: 40 (KDR190) mediante el ensayo ELISPOT de
IFN-\gamma (Tabla 5).
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Ejemplo
8
Se recogió la médula ósea de ratones macho
BALB/c de seis a ocho semanas de edad (CLEA Japan, Inc.) con el
mismo motivo de anclaje que el HLA-A2402 humano.
Como en el Ejemplo 7, se añadieron GM-CSF (Kirin
Brewery) (1000 U/mL) e IL-4 (Genzyme) (1000 U/mL) a
la médula ósea y se cultivaron para preparar células dendríticas.
Las células dendríticas se sometieron a un pulso con el péptido de
Id. de Sec. Nº: 5 (en el que la posición del aminoácido de
iniciación es KDR189) y después se administró (1x 10^{6}
células/ratón) dos veces a nueve ratones BALB/c en el cuadrante
inferior derecho, con un intervalo de siete días. Siete días
después, se inoculó la línea celular de cáncer de colon (5x
10^{5} células), Colon 26 (Taiho Pharmaceutical), en los abdómenes
derechos de los ratones, y se analizaron las supervivencias de los
ratones y el crecimiento tumoral.
Primero, se analizó la expresión de KDR mediante
RT-PCR, como se indica en la Fig. 3, para confirmar
que la KDR no se expresa sólo en las células Colon 26, sino que se
expresa en los tejidos tumorales de los ratones inoculados con
Colon 26. Más específicamente, se confirmó la aparición de los vasos
tumorales en los tejidos tumorales, y para formar el tumor.
La Fig. 3 muestra la curva de supervivencia de
los ratones inoculados con Colon 26. 35 días después de la
inoculación del tumor, dos de nueve ratones sobrevivieron cuando se
administró como control HBSS sola (100 \muL) (Solución salina
equilibrada de Hank); cinco de nueve ratones sobrevivieron cuando se
inocularon con células dendríticas que no fueron pulsadas con
péptidos; y los nueve ratones sobrevivieron cuando se inocularon
con células dendríticas pulsadas con el péptido de Id. de Sec. Nº:
5.
La Fig. 4 muestra el efecto en el crecimiento de
los tumores derivados de Colon 26 en ratones. En comparación con el
control, se observaron efectos supresores en el crecimiento tumoral
cuando se inocularon células dendríticas, y se observaron efectos
de supresión remarcables cuando se inocularon células dendríticas
pulsadas con el péptido de Id. de Sec. Nº: 5.
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Ejemplo
9
Se llevaron a cabo búsquedas de homología para
los péptidos de esta invención (Id. de Sec. Nº: 2 (en el que la
posición del aminoácido de iniciación es KDR1318), Id. de Sec. Nº: 3
(KDR220), Id. de Sec. Nº: 5 (KDR189), Id. de Sec. Nº: 8 (KDR169),
Id. de Sec. Nº: 11 (KDR826), Id. de Sec. Nº: 30 (KDR773), y Id. de
Sec. Nº: 40 (KDR190)) utilizando el programa BLAST (http:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi). No se pudieron encontrar
péptidos con una secuencia completamente idéntica a ninguno de estos
péptidos (Tabla 6). Los péptidos 9-meros (KDR169)
de Id. de Sec. Nº: 8 capaces de inducir una fuerte actividad LCT en
el Ejemplo 4 poseen sólo una secuencia que contenía dos faltas de
coincidencia (homología del 77,8%), y dos secuencias que contenían
tres faltas de coincidencia (homología del 66,7%). El péptido de
Id. de Sec. Nº: 5 (KDR189), cuyo remarcable efecto antitumoral
in vivo se observó en el Ejemplo 8, posee sólo una secuencia
que contenía tres faltas de coincidencia (homología del
66,7%).
66,7%).
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Ejemplo
10
Se recogió la médula ósea de ratones macho A2/Kb
transgénicos (RTG) de seis a ocho semanas de edad que expresan el
HLA-A0201 humano. Como en el Ejemplo 8, se añadieron
GM-CSF (Kirin Brewery) (1000 U/mL) e
IL-4 (Genzyme) (1000 U/mL) a la médula ósea y
después se cultivaron para preparar células dendríticas. Las células
dendríticas se sometieron a un pulso con el péptido de Id. de Sec.
Nº: 30 (posición del aminoácido de iniciación en KDR773), y se
administraron (1x 10^{6} células/ratón) dos veces en el cuadrante
inferior izquierdo de doce ratones transgénicos A2/Kb, con un
intervalo de siete días. Siete días después, se inocularon células
de melanoma B16 (ATCC) (1x 10^{6} células) en el abdomen derecho
del ratón, y se analizaron las supervivencias y el crecimiento
tumoral de los ratones.
La Fig. 5 muestra la tasa de supervivencia de
los ratones inoculados con B16. 35 días después de la inoculación
tumoral, ocho de doce ratones sobrevivieron cuando se administró
HBSS sólo (100 \muL) como control; once de doce ratones
sobrevivieron cuando se inocularon con células dendríticas que no
fueron pulsadas con péptidos; y los doce ratones sobrevivieron
cuando se inocularon con células dendríticas pulsadas con el péptido
de Id. de Sec. Nº:
30.
30.
La Fig. 6 muestra el efecto en el crecimiento de
los tumores derivados de B16 en ratones. En comparación con el
control, se observaron efectos supresores en el crecimiento tumoral
cuando se inocularon células dendríticas, y se observaron efectos
de supresión remarcables cuando se inocularon células dendríticas
pulsadas con el péptido de Id. de Sec. Nº: 30.
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Ejemplo
11
Utilizando adenovirus, se forzó la expresión de
KDR (véase, J. Biol. Chem. 1994 Oct 28; 269 (43):
26988-95) en una cepa HT29 de cáncer de colon
humano HLA-A24-positivo (ATCC), de
acuerdo con el método descrito por Miyake, S. et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. 93, 1320-1324 (1996). Más
específicamente, basado en la titulación determinada por el ensayo
de placas de las células 293 humanas, las células se infectaron en
una multiplicidad específica. Las células HT29 se plaquearon a una
densidad celular de 10^{5} células en un disco de 60 mm, y se
incubaron durante 24 horas. Al día siguiente, se retiró el medio y
se cambió con 200 \muL de virus diluidos continuamente con medio
fresco. Las células se incubaron a 37ºC durante una hora, y después
se añadió medio de crecimiento a las células, que se cultivaron
durante 48 horas para usarse como células diana. Se utilizó como
control la cepa HT29
HLA-A24-positiva, forzada por los
adenovirus a expresar EGFP (véase, Leukemia 1999 Apr; 13 (4):
605-13). Las cepas HT29 forzadas a expresar KDR y
EGFP, respectivamente, pueden presentar potencialmente péptidos
parciales de cada proteína en sus correspondientes superficies
celulares.
Utilizando el clon de LCT
C29-169, inducido a partir del péptido de Id. de
Sec. Nº: 8 (posición del aminoácido de iniciación en KDR169), como
se describe en el Ejemplo 3, que se une a HLA-A24,
el efecto citotóxico sobre las células HT29
HLA-A24-positivas forzadas a
expresar KDR se midió mediante el ensayo de liberación de cromo.
Los resultados se muestran en la Fig. 7.
La actividad citotóxica se midió mediante el
ensayo de liberación de ^{51}Cr durante cuatro horas. Las células
diana se cultivaron en una placa de 6 pocillos a una concentración
de 1x 10^{6} células/pocillo durante 24 horas, infectadas con
adenovirus en los que se había insertado KDR o EGFP
(Ad-KDR o Ad-EGFP) a una MDI de 50,
y se utilizaron tras 48 horas. Las células diana se marcaron con 100
PCi de Na_{2}^{51}CrO_{4} a 37ºC durante una hora, y se
lavaron tres veces con RPMI1640. Se añadieron las células diana (1x
10^{4} células/100 \muL) y 100 \muL de células efectoras a
varias concentraciones (200 \muL en total) a una placa
microtitulada de 96 pocillos en forma de U (Corning), y se
cultivaron en un incubador de CO_{2} a 37ºC durante cuatro horas.
Tras el cultivo, se recogió 100 \muL de sobrenadante de cada
pocillo y se midió utilizando un contador \gamma para calcular la
citotoxicidad de la misma forma que en el Ejemplo
2.
2.
Como resultado, como se muestra en la Fig. 7, el
clon LCT C29-169 mostró un efecto citotóxico muy
remarcable hacia HT29
HLA-A24-positivas que expresan de
forma forzada KDR, en comparación con las células que expresan de
forma forzada EGFP.
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Ejemplo
12
El efecto citotóxico del clon LCT
C29-169 descrito en el Ejemplo 3, frente a la cepa
KT5 HUVEC, derivada de células endoteliales vasculares del cordón
umbilical humano HLA-A24-positivas
que expresan endógenamente KDR, se analizaron utilizando cepas
HUVEC KDR-positivas y
HLA-A24-negativas, y P8 como
control. Estas células presentan péptidos parciales de KDR en su
superficie celular.
La actividad citotóxica se midió mediante un
ensayo de liberación de ^{51}Cr de cuatro horas. Las células
diana se marcaron con 100 PCi de Na_{2}^{51}CrO_{4} a 37ºC
durante una hora, y se lavaron tres veces con RPMI1640. Se
añadieron las células diana (1x 10^{4} células/100 \muL) y 100
\muL de células efectoras a varias concentraciones (200 \muL en
total) a una placa microtitulada de 96 pocillos en forma de U
(Corning), y se cultivaron en un incubador de CO_{2} a 37ºC
durante cuatro horas. Tras el cultivo, se recogió 100 \muL de
sobrenadante de cada pocillo y se midió utilizando un contador
\gamma para calcular la citotoxicidad, de la misma forma que en
el Ejemplo 2.
Como aparece en los resultados de la Fig. 8, el
clon LCT C29-169 mostró un efecto citotóxico frente
a HUVEC HLA-A24-positiva que
expresan endógenamente KDR, y mostró un débil efecto citotóxico
frente a HUVEC HLA-A24-negativa.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
13
Utilizando el péptido de Id. de Sec. Nº: 40
(posición del aminoácido de iniciación en KDR190), el péptido
KDR773-2L (Id. de Sec. Nº: 54) en el que el segundo
aminoácido del N terminal en el péptido de Id. de Sec. Nº: 30
(KDR773) se ha convertido a leucina, el péptido de Id. de Sec. Nº:
29 (KDR775), el péptido de Id. de Sec. Nº: 34 (KDR1328), y el
péptido de Id. de Sec. Nº: 33 (KDR772), que se une a
HLA-A0201 y que se determinaron que eran efectivos
según el análisis ELISPOT del Ejemplo 7, se obtuvieron dos tipos
(KWC14-190 y KWC65-190), cuatro
tipos (KWC44-773-2L,
KWC76-773-2L,
KWC129-773-2L, y
KWC134-773-2L), dos tipos
(KWC81-775 y KWC85-775), doce tipos
(KWC16, KWC21, KWC22, KWC47, KWC51, KWC108, KWC117, KWC132, KWC151,
KWC153, KWC156, y KWC159), y un tipo (KWC72-772) de
clones LCT, respectivamente, como en el Ejemplo 3. Las
correspondientes citotoxicidades se muestran en la Tabla 7.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
Como aparece en los resultados de la Tabla 7,
los péptidos de Id. de Sec. Nº: 29, 33, 34, y 40, así como el
péptido de Id. de Sec. Nº: 54, en el que el segundo aminoácido del N
terminal en el péptido de Id. de Sec. Nº: 30 es leucina, pueden
todos inducir a los LCT con una citotoxicidad remarcable, y
mostraron así ser efectivos como péptidos
epítopo.
epítopo.
\newpage
Ejemplo
14
El péptido de Id. de Sec. Nº: 29 (posición del
aminoácido de iniciación en KDR775) se añadió a una cepa T2
HLA-A0201-positiva para producir una
célula diana. Utilizando la célula, el efecto citotóxico del clon
LCT (KDR C85-775 (KWC85-775))
obtenido del péptido de Id. de Sec. Nº: 29 en el Ejemplo 13 se
analizó mediante ensayo de liberación de cromo.
En los resultados, mostrados en la Fig. 9, el
clon LCT C85-775 (KWC85-775) mostró
claramente un efecto citotóxico frente a células
HLA-A0201-positivas que presentan el
péptido de Id. de Sec. Nº: 29. Por contra, no se observó en
absoluto efecto citotóxico frente a células control que no presentan
el péptido de Id. de Sec. Nº: 29.
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Ejemplo
15
El efecto citotóxico del clon LCT (KDR
C85-775 (KWC85-775)) frente a la
línea celular de carcinoma hepatocelular HePG2
HLA-A0201-positivo, forzado a
expresar KDR por los adenovirus, se examinó mediante ensayo de
liberación de cromo. HePG2 HLAA0201-positivo
forzado a expresar EGFP se utilizó como control.
En los resultados, mostrados en la Fig. 10, el
clon LCT KDR C85-775 (KWC85-775)
mostró un alto efecto citotóxico remarcable frente a células
HLA-A0201-positivas que presentan
péptidos KDR en la superficie, en comparación con la actividad
frente a células que presentan el péptido EGFP.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
16
El péptido de Id. de Sec. Nº: 34 (posición del
aminoácido de iniciación en KDR1328) se añadió a la cepa T2
HLA-A0201-positiva para producir
células diana. Utilizando estas células, el efecto citotóxico del
clon LCT (KDR C51-1328 (KWC51)) obtenido del
péptido de Id. de Sec. Nº: 34 en el Ejemplo 13 se examinó mediante
ensayo de liberación de cromo.
En los resultados, mostrados en la Fig. 11, el
clon LCT KDR C51-1328 (KWC51) mostró claramente un
efecto citotóxico frente a células
HLA-A0201-positivas que presentan el
péptido de Id. de Sec. Nº: 34. Por el contrario, no se observó
ningún efecto citotóxico frente a células control que no presentan
el péptido de Id. de Sec. Nº:
34.
34.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
17
El efecto citotóxico del clon LCT (KDR
C51-1328 (KWC51)) frente a la línea celular de
carcinoma hepatocelular HePG2
HLA-A0201-positiva, forzada a
expresar KDR por los adenovirus, se examinó mediante ensayo de
liberación de cromo. Se utilizó como control HePG2
HLAA0201-positivas forzadas a expresar EGFP.
En los resultados, mostrados en la Fig. 12, el
clon LCT KDR C51-1328 (KWC51) mostró un alto efecto
citotóxico remarcable frente a células
HLA-A0201-positivas que presentan
péptidos KDR en la superficie, en comparación con la actividad
frente a células que presentan el péptido EGFP.
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Ejemplo
18
El péptido de Id. de Sec. Nº: 54
(KDR773-2L), en el que el segundo péptido de Id. de
Sec. Nº: 30 se convierte en una leucina, se añadió a una cepa T2
HLA-A0201-positiva para producir
células diana. Utilizando estas células, el efecto citotóxico del
clon LCT (KDR C44-773-2L
(KWC44-773-2L)) obtenido del péptido
de Id. de Sec. Nº: 54 en el Ejemplo 13 se examinó mediante ensayo
de liberación de cromo. La Fig. 13 muestra los resulta-
dos.
dos.
En los resultados, mostrados en la Fig. 13, el
clon LCT KDR C44-773-2L
(KWC44-773-2L) mostró claramente un
efecto citotóxico frente a células
HLA-A0201-positivas que presentan
KDR773-2L. Por el contrario, no se observó ningún
efecto citotóxico frente a células control que no presentan
KDR773-2L.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
19
El efecto citotóxico del clon LCT (KDR
C44-773-2L
(KWC44-773-2L) obtenido del péptido
de Id. de Sec. Nº: 54 (KDR773-2L), en el que el
segundo péptido de Id. de Sec. Nº: 30 se ha convertido en una
leucina, se examinó mediante ensayo de liberación de cromo
utilizando la cepa T2
HLA-A0201-positiva pulsada con el
péptido no modificado de Id. de Sec. Nº: 30 (posición del
aminoácido de iniciación en KDR773) como célula diana.
\newpage
En los resultados, mostrados en la Fig. 14, los
clones LCT obtenidos mediante estimulación con el péptido
modificado pudieron reconocer y dañar el péptido
post-modificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
20
El efecto citotóxico del clon LCT (KDR
C44-773-2L
(KWC44-773-2L)) frente la línea
celular de carcinoma hepatocelular HePG2
HLA-A0201-positiva, forzada a
expresar KDR por los adenovirus, se examinó mediante ensayo de
liberación de cromo. Se utilizó como control HePG2
HLA-A0201-positivo forzado a
expresar EGFP.
En los resultados, mostrados en la Fig. 15, el
clon LCT KDR C44-773-2L
(KWC44-773-2L) mostró un alto efecto
citotóxico remarcable frente a células
HLA-A0201-positivas que presentan
péptidos KDR en la superficie, en comparación con la actividad
frente a células que presentan el péptido EGFP.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
21
Los presentes inventores determinaron si
diferentes anticuerpos pueden bloquear el efecto citotóxico del clon
LCT (KDR C51-1328 (KWC51)), obtenido del péptido de
Id. de Sec. Nº: 34, frente a la línea celular de carcinoma
hepatocelular HePG2
HLA-A0201-positiva, forzada a
expresar KDR por los adenovirus.
En los resultados, mostrados en la Fig. 16, la
función citotóxica se inhibió mediante un anticuerpo
anti-HLA de Clase I frente a antígenos de HLA
mostrados por las células diana, y anticuerpo
anti-CD8 frente a CD8 utilizado como marcador de
linfocitos T citotóxicos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
22
La presente actividad inhibidora de la
angiogénesis de péptidos epítopo se evaluó en ratones utilizando un
ensayo DAS (véase, Clinical Cancer Research, Vol. 5,
2185-2191, Agosto 1999; Cancer Research 62,
6116-6123, Noviembre 1, 2002).
Específicamente, un filtro de membrana se fijó a
ambos lados de una cámara en anillo, y se esterilizó con óxido de
etileno gas. Se prepararon las células de melanoma B16 a 5x 10^{5}
células/0,15 mL, y se inyectaron en la cámara. Los ratones (ratones
transgénicos A2/kb (derivados de B16)) se inmovilizaron cara abajo,
y se produjo un saco de aire al inyectar de 5 a 10 mL de aire en la
hipodermis dorsal murina utilizando una jeringa. Se realizó una
incisión de aproximadamente 1 cm en la parte inferior del saco. La
cámara en anillo, se rellenó con una solución de células en
suspensión, se implantó en la hipodermis dorsal, y se cerró la piel
utilizando una grapa de piel. Seis días después del implante, la
piel del ratón se retiró junto con la cámara, se fijó de forma
extendida, y se marcó con un anillo de goma negra para observar los
vasos sanguíneos formados de nuevo utilizando un microscopio. Los
vasos sanguíneos nuevamente formados mediante los factores
angiogénicos liberados por las células tumorales malignas,
característicamente discurren en forma de zigzag, y son
morfológicamente diferentes de los vasos sanguíneos que aparecen de
forma natural. Por lo tanto, los vasos sanguíneos de 3 mm o más
dentro del anillo de goma y que discurren en forma de zigzag se
determinaron como vasos sanguíneos de nueva formación, y se
analizaron utilizando un índice de angiogénesis (IA). El IA se
analiza en seis niveles, de 0 a 5 de acuerdo con el número de vasos
sanguíneos tortuosos. Todos aquellos con cinco o más vasos
sanguíneos tortuosos se calificaron como
5.
5.
La vacunación se realizó 14 días antes de la
implantación de la cámara, y se repitió al cabo de una semana (un
total de dos veces) inyectando respectivamente 5x 10^{4} células
de HBSS, CD solas, o CD pulsadas con péptido, en la vena de la
cola. Los resultados se muestran en la Fig. 17 y en la Tabla 8, a
continuación.
La Fig. 17 y la Tabla 8 muestran que la
formación de vasos sanguíneos tortuosos se suprimió claramente en
los grupos vacunados con CD pulsadas con los péptidos de Id. de Sec.
Nº: 40 (posición del aminoácido de iniciación en KDR190), Id. de
Sec. Nº: 33 (KDR772), Id. de Sec. Nº: 30 (KDR773), Id. de Sec. Nº:
54 (KDR773-2L), Id. de Sec. Nº: 29 (KDR775), e Id.
de Sec. Nº: 46 (KDR1084), respectivamente, en comparación con el
grupo al que se administró CD solas. Esto indicó un efecto
inhibidor de la angiogénesis estadísticamente significativo.
Se analizó la curación de heridas y la
fertilidad en ratones vacunados para observar los efectos adversos
de la vacunación utilizando estos péptidos epítopo en la
angiogénesis fisiológica normal. No obstante, no se encontraron
efectos adversos significativos en los ratones vacunados. Además,
utilizando los clones de LCT que reconocen los péptidos KDR, se
analizó la citotoxicidad frente a células endoteliales no
proliferativas o proliferativas in vitro para examinar los
efectos adversos en humanos. Como resultado, estos clones mostraron
una actividad más fuerte frente a células endoteliales
proliferativas que frente a células endoteliales no
proliferativas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
23
Utilizando los ratones transgénicos A2/Kb que
expresan el HLA-A0201 humano, los péptidos de Id. de
Sec. Nº: 30 (posición del aminoácido de iniciación en KDR773) y de
Id. de Sec. Nº: 34 (KDR1084) se mezclaron cada uno con adyuvante
incompleto de Freund, después se administraron al día 3 y 13 a los
ratones portadores de tumores de la cepa MC38 de cáncer de colon
para indicar cambios en el volumen del tumor.
El efecto antitumoral in vivo en un
modelo terapéutico de péptido de epítopo inmovilizado de
HLA-A*0201 (KDR773) se analizó utilizando el área
del tumor, utilizando el mismo método de vacunación como en el
Ejemplo 22. El resultado, como aparece en la Fig. 18, confirma un
efecto supresor significativo en el crecimiento tumoral por la
vacunación con los péptidos de Id. de Sec. Nº: 30 e Id. de Sec. Nº:
34.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
24
El péptido de Id. de Sec. Nº: 40 (posición del
aminoácido de iniciación en KDR190) se añadió a la cepa T2
HLA-A0201-positiva para producir
células diana. Utilizando estas células, se examinó el efecto
citotóxico del clon LCT (KWC65-190) obtenido del
péptido de Id. de Sec. Nº: 40 en el Ejemplo 13 utilizando un ensayo
de liberación de cromo.
En los resultados, mostrados en la Fig. 19, el
clon LCT KWC65-190 mostró claramente un efecto
citotóxico frente a células
HLA-A0201-positivas que presentan el
péptido de Id. de Sec. Nº: 40. Por el contrario, no se observó
ningún efecto citotóxico frente a células control que no presentan
el péptido de Id. de Sec. Nº: 40.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
25
El péptido de Id. de Sec. Nº: 33 (posición del
aminoácido de iniciación en KDR772) se añadió a la cepa T2
HLA-A0201-positiva para producir
células diana. Utilizando estas células, se examinó el efecto
citotóxico del clon LCT (KWC72-772) obtenido del
péptido de Id. de Sec. Nº: 33 en el Ejemplo 13 utilizando un ensayo
de liberación de cromo.
En los resultados, mostrados en la Fig. 20, el
clon LCT KWC72-772 mostró claramente un efecto
citotóxico frente a células
HLA-A0201-positivas que presentan el
péptido de Id. de Sec. Nº: 33. Por el contrario, no se observó
ningún efecto citotóxico frente a células control que no presentan
el péptido de Id. de Sec. Nº: 33.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
26
El efecto citotóxico del clon LCT
(KWC72-772) frente a la línea celular de carcinoma
hepatocelular
HePG2HLA-A0201-positiva, forzada a
expresar KDR por los adenovirus, se examinó mediante ensayo de
liberación de cromo. Se utilizó HePG2
HLA-A0201-positiva forzada a
expresar EGFP como control.
En los resultados, como se muestra en la Fig.
21, el clon LCT KWC72-772 mostró un alto efecto
citotóxico remarcable frente a células
HLA-A0201-positivas que presentan
péptidos KDR en su superficie, en comparación con la actividad
frente a células que presentan el péptido EGFP.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
27
Los péptidos de Id. de Sec. Nº: 2 (posición del
aminoácido de iniciación en KDR1318), Id. de Sec. Nº: 3 (KDR220),
Id. de Sec. Nº: 5 (KDR189), e Id. de Sec. Nº: 11 (KDR826) se
añadieron a la cepa de linfocitos B humanos A24-LCL
HLA-A24-positiva
(HLA-A24/24, Takara Shuzo) para producir células
diana. Utilizando estas células, los efectos citotóxicos de los
clones LCT, C7-1318, KWC46, C18-189,
y C65-826, descritos en el Ejemplo 3, se examinaron
mediante ensayo de liberación de cromo.
En los resultados, mostrados en la Fig. 22 a 25,
cada uno de los clones LCT, C7-1318, KWC46,
C18-189, y C65-826, mostró
claramente un efecto citotóxico frente a cada una de las células
HLA-A24-positivas que presentan los
péptidos de Id. de Sec. Nº: 2, 3, 5, y 11, respectivamente. Por el
contrario, no se observó ningún efecto citotóxico en absoluto o
casi ninguno frente a cada una de las células control, que no
presentaban los péptidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
28
Como para el Ejemplo 11, los efectos citotóxicos
de los clones LCT, C7-1318, KWC46,
C18-189, y C65-826, descritos en el
Ejemplo 3, frente a la cepa HT29 de cáncer de colon humano (ATCC),
forzada a expresar KDR por los adenovirus, se examinó mediante
ensayo de liberación de cromo. La cepa HT29
HLA-A24-positiva forzada a expresar
EGFP, se utilizó como control.
En los resultados, mostrados en las Fig. 26 a
29, todos los clones LCT, C7-1318, KWC46,
C18-189, y C65-826, mostraron un
alto efecto citotóxico remarcable frente a HT29
HLA-A24-positiva forzada a expresar
KDR, en comparación con la actividad frente a células forzadas a
expresar EGFP.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
29
Como para el Ejemplo 22, la actividad inhibidora
de la angiogénesis de los péptidos epítopos frente a la respuesta
angiogénica inducida por las células Colon 26 en ratones BALB/c se
analizó mediante un ensayo DAS.
Como aparece en los resultados de las Fig. 30 y
31, en los grupos vacunados con CD pulsadas con los péptidos de Id.
de Sec. Nº: 5 (posición del aminoácido de iniciación en KDR189) y
Id. de Sec. Nº: 11 (KDR826), respectivamente, la formación de vasos
sanguíneos tortuosos se suprimió claramente en comparación con el
grupo al que se le administró CD solas. Esto indico un efecto
supresor de la angiogénesis estadísticamente significativo.
\newpage
Ejemplo
30
La respuesta de los LCT frente a cada tipo de
los siguientes péptidos epítopo se investigó utilizando PBMC de
pacientes con cáncer tras la estimulación con cada péptido:
Péptidos de Id. de Sec. Nº: 8 (posición del
aminoácido de iniciación en KDR169), Id. de Sec. Nº: 5 (KDR189),
Id. de Sec. Nº: 3 (KDR220), Id. de Sec. Nº: 11 (KDR826), e Id. de
Sec. Nº: 17 (KDR1318), con alta afinidad de unión por
HLA-24; y péptidos de Id. de Sec. Nº: 40 (KDR190),
Id. de Sec. Nº: 33 (KDR772), Id. de Sec. Nº: 30 (KDR773), Id. de
Sec. Nº: 29 (KDR775), e Id. de Sec. Nº: 34 (KDR1328), con alta
afinidad de unión por HLA-
A0201.
A0201.
Utilizando el método escrito por Maeda, Y et
al. en Br. J. Cancer 87, 796-804 (2002), se
detectaron LCT específicos de péptido en PBMC. Primero, las PBMC
recogidas de pacientes (1x 10^{5} células) se incubaron con 10
\muM de cada péptido en una placa de 96 pocillos con el fondo en
forma de U, que comprende 200 \muL de medio. El medio consiste de
medio RPMI1640 al 45%, medio AIM-V al 45%,, FBS al
10%, 100 U/mL de interleuquina-2
(IL-2), y 0,1 \muM de solución de aminoácidos no
esenciales MEM. Cada tres días, la mitad del medio se retiró y se
sustituyó con medio fresco que contenía el péptido correspondiente
(20 \muM). Tras la incubación durante doce días, se recogieron
las células para analizar la capacidad de producir
IFN-\gamma en respuesta a cada péptido. Cuando la
cantidad de IFN-\gamma producida por las PBMC
estimuladas por el péptido en respuesta al péptido correspondiente
fue dos veces superior o más a la cantidad producida en respuesta al
péptido control VIH, el péptido analizado se consideró
positivo.
positivo.
Estos resultados mostraron que el precursor de
LCT se produce en pacientes de cáncer de tipo HLA-A2
y HLA-A24, así como en donantes sanos (Tabla 9). En
la tabla, los pacientes A, B, y C son pacientes de tipo
HLA-A24; y el paciente D es un paciente de tipo
HLA-A02. Los pacientes A y D son pacientes con
cáncer de colon; y los pacientes B y C son pacientes con melanoma.
CMV se refiere a los péptidos derivados de citomegalovirus
utilizados como control positivo. Los péptidos con alta afinidad de
unión por A-24 se describen en Kuzushima, K. et
al., Blood 2001, 98 (6): p1872-1881, y
similares; y los péptidos con alta afinidad de unión por
A-2 se describen en Solache, A. et al., J.
of Immunol. 1999, 163 (10); p5512-5518, y
similares.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Como para el Ejemplo 14 y similares, se realizó
un ensayo estándar de liberación de ^{51}Cr durante cuatro horas
para establecer líneas de LCT de los precursores de LCT (Fig.
32).
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona nuevos
péptidos, que inducen linfocitos T citotóxicos localizando las
células endoteliales formadas en un amplio rango de tejidos
tumorales, y que son extremadamente efectivos como vacunas contra
el cáncer. La presente invención también proporciona fármacos para
tratar y prevenir tumores, en los que los fármacos comprenden estos
péptidos.
<110> Oncotherapy Science, Inc.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PÉPTIDOS KDR Y VACUNAS QUE LOS
CONTIENEN
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
PH-1883-PCT
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 2002-267285
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-09-12
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 2003-062003
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-03-07
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 2003-167042
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-06-11
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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<210> 3
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 3
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\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 4
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 4
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\hskip0,8cm
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<210> 5
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 5
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\hskip0,8cm
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<210> 6
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 6
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\hskip0,8cm
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<210> 7
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 7
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\hskip0,8cm
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<210> 8
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 8
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\hskip0,8cm
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<210> 9
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 9
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\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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<210> 11
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
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\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
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<400> 16
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\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 17
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\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
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<400> 18
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<210> 19
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<211> 10
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
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artificial: Péptido sintético
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artificial: Péptido sintético
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artificial: Péptido sintético
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artificial: Péptido sintético
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
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<400> 41
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
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\hskip0,8cm
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<210> 43
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
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<400> 43
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\hskip0,8cm
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
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<212> PRT
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
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\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
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<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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<210> 48
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<211> 10
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
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\hskip0,8cm
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<210> 49
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
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<400> 49
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\hskip0,8cm
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<210> 50
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
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<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
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<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
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<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
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<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
Claims (22)
1. Un nonapéptido que consiste en la secuencia
de aminoácidos de Id. de Sec. Nº: 8.
2. El péptido de la reivindicación 1 que
comprende inducibilidad de células T citotóxicas, en el que uno o
dos aminoácidos se sustituyen o añaden a la secuencia de aminoácidos
de Id. de Sec. Nº: 8.
3. El péptido de la reivindicación 2, en el que
el segundo aminoácido del extremo N terminal es fenilalanina,
tirosina, metionina o triptófano.
4. El péptido de las reivindicaciones 2 o 3, en
el que el aminoácido C-terminal es fenilalanina,
leucina, isoleucina, triptófano o metionina.
5. Una composición farmacéutica que comprende
uno o más péptidos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. La utilización de uno o más péptidos de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la preparación de una
composición farmacéutica para tratar y/o prevenir tumores.
7. La utilización de uno o más péptidos de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la preparación de una
composición farmacéutica para tratar la retinopatía diabética,
artritis reumatoide crónica, psoriasis y aterosclerosis.
8. Un exosoma que presenta en su superficie un
complejo que comprende un péptido de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 y un antígeno HLA.
9. El exosoma de la reivindicación 8, en el que
el antígeno HLA es HLA-A24.
10. El exosoma de las reivindicaciones 8 o 9, en
el que el antígeno HLA es HLA-A2402.
11. Un método in vitro para inducir una
célula presentadora de antígenos con elevada inducibilidad de
células T citotóxicas utilizando un péptido de cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 4.
12. La utilización de un péptido de cualquiera
de las reivindicaciones de 1 a 4 para la preparación de una
composición farmacéutica para
(a) inducir una célula presentadora de antígenos
con elevada inducibilidad de células T citotóxicas; o
(b) inducir una célula T citotóxica.
13. El método de la reivindicación 11, que
además comprende inducir una célula T citotóxica.
14. El método de la reivindicación 11, en el que
dicho método comprende el paso de introducir un polinucleótido que
codifica un péptido de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4
en una célula presentadora de antígenos.
15. La utilización de un polinucleótido que
codifica un péptido, de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a
4, para la preparación de una composición farmacéutica para inducir
una célula presentadora de antígeno con elevada inducibilidad de
células T citotóxicas en una terapia génica.
16. Una célula T citotóxica aislada que se
induce utilizando un péptido de cualquiera de las reivindicaciones
de 1 a 4.
17. Una célula presentadora de antígenos que
presenta un complejo de un antígeno HLA y un péptido de cualquiera
de las reivindicaciones de 1 a 4.
18. La célula presentadora de antígenos de la
reivindicación 17, que se induce mediante el método de la
reivindicación 11 o 13, o mediante la utilización de la
reivindicación 12.
19. Una vacuna que comprende un péptido de
cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4 como compuesto
activo.
20. La utilización de un péptido de cualquiera
de las reivindicaciones de 1 a 4 como compuesto activo para la
preparación de una vacuna para inhibir la angiogénesis en un punto
afectado.
21. La utilización de un péptido de cualquiera
de las reivindicaciones de 1 a 4 como compuesto activo para la
preparación de una vacuna para suprimir el crecimiento y/o
metástasis de tumores malignos.
22. La utilización de las reivindicaciones 20 o
21, en la que la vacuna se utiliza para su administración a un
sujeto cuyo antígeno HLA es HLA-A24.
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