PT2014678E

PT2014678E - Péptidos kdr e vacinas que os contêm

Info

Publication number: PT2014678E
Application number: PT08018875T
Authority: PT
Inventors: Takuya Tsunoda; Hideaki Tahara; Satoshi Wada
Original assignee: Oncotherapy Science Inc
Priority date: 2002-09-12
Filing date: 2003-09-12
Publication date: 2012-01-05
Also published as: HK1151037A1; EP2261248A3; EP1548032B1; US20090252752A1; CY1113379T1; HK1151032A1; SI2014678T1; US20060216301A1; EP2014679B1; ES2327040T3; JP4185143B2; EP2261247A2; EP2261248A2; EP1548032B9; CN101139392B; EP2014678B1; EP2270042B1; US20120328636A1; HK1151036A1; HK1125659A1

Description

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DESCRIÇÃO "PÉPTIDOS KDR E VACINAS QUE OS CONTÊM"

Campo Técnico A presente invenção diz respeito a péptidos para utilização no tratamento ou na prevenção de tumores que são extremamente úteis como vacinas contra o cancro, e a medicamentos que contêm esses péptidos, para o tratamento e a prevenção de tumores.

Conhecimento Preliminar

Principalmente em melanomas malignos têm-se identificado genes de antigénios de rejeição tumoral, e consequentemente, estão a surgir imunoterapias oncológicas que utilizam esses genes. Especificamente, com o reconhecimento da importância de células T CD8-positivas em respostas imunitárias antitumorais, uma terapia com uma vacina contra o cancro que induz in vivo células T CD8-positivas especificas de tumores tem recebido atenção, estando a ser utilizada em diversos tratamentos clínicos. Além disso, esclareceu-se também o mecanismo pelo qual péptidos constituídos por aproximadamente dez restos de aminoácidos activam células T por meio do ciclo Classe I, utilizando o auxílio de diversas moléculas co-esti-muladoras, para induzir células T citotóxicas (CTLs) específicas de tumores. Além do mais, identificam-se rapidamente péptidos restringidos a moléculas individuais do sistema HLA.

Contudo, o controlo completo de tumores é presentemente impossível. Isso pode ser devido à heterogeneidade das 2 células tumorais, a uma diminuição ou ao desaparecimento da expressão do subgrupo Classe I da região MHC em células tumorais, e à ausência de moléculas-alvo nas células tumorais. Além disso, os péptidos antigénicos tumorais actualmente identificados existem em alguns tipos de tumores, mas são capazes de não existirem em todos os tipos de tumores. Dessa forma, para fazer desaparecer esses problemas, os inventores indicados não utilizaram células tumorais como células-alvo, mas ao invés concentraram-se nas células endoteliais dos vasos tumorais. Mais especificamente, as células endoteliais dificilmente apresentam guaisquer problemas que incluam uma diminuição ou o desaparecimento da expressão do subgrupo Classe I da região MHC, ou heterogeneidade. Consequentemente, caso se possam induzir CTLs que têm como alvos vasos tumorais, podem ultrapassar-se, independentemente do tipo de tumor, problemas da terapia convencional com vacinas contra cancros, tal como o desaparecimento do subgrupo Classe I e a ausência de uma molécula-alvo, podendo prever-se excelentes efeitos terapêuticos. Os estudos sobre angiogénese tumoral iniciaram--se a partir de uma hipótese pioneira proposta por Folkman et al., em 1970 e foram conduzidos a partir de vários ângulos. Outros estudos realizaram-se a partir de receptores (VEGFRs) dos factores de crescimento endoteliais vasculares (VEGF) para avaliar o seu significado em angiogénese tumoral. Têm-se desenvolvido com eficácia inibidores de angiogénese como fármacos orientados para alvos, principalmente na terapia do cancro, estando já a serem ensaiados sob o ponto de vista clinico. No entanto, terapias que utilizam esse conceito de tratamentos com vacinas contra cancros não estão ainda a serem utilizadas. Uma das razões pode ser tolerância imunitária aos VEGFRs, a qual é expressa em células normais. Contudo, em 1990, Plate, Millauer, e Risau et al., 3 confirmaram que os VEGFRs eram intensamente expressos nas células endoteliais dos tecidos tumorais. Além disso, a resposta imunitária a auto-antigenes como, por exemplo, CEA ("Carcinoembryonic Antigen") e HER/neu (proteína oncogénica), que são igualmente expressos em células normais, não constitui necessariamente um elemento de tolerância imunitária. Consequentemente, os inventores mencionados concluíram que na terapia com vacinas contra cancros se podem utilizar VEGFRs como alvos.

Recentemente, foi comunicado que a imunização activa contra VEGFRs pode inibir angiogénese em tumores, e metástases (The Journal of Experimental Medicine, 2002, 195:12, 1575-1584). Contudo, essa literatura utilizou simplesmente proteínas VEGFR solúveis, e não realizou qualquer investigação relativa às sequências de aminoácidos de verdadeiros péptidos.

Descrição da Invenção

Os presentes inventores concentraram-se em possíveis terapias com vacinas contra cancros que têm como alvos VEGFR2 (kdr/flk-1; referido seguidamente como KDR), sendo os VEGFR2 intensamente expressos em células endoteliais de tecidos tumorais, e suspeitando-se estarem implicados na proliferação de células endoteliais a partir do sinal VEGF. Além disso, os inventores mencionados seleccionaram péptidos que podem utilizar-se eficazmente como vacinas, examinando a sua especificidade, e concluindo a presente invenção. A presente invenção permite a obtenção de [1] a [18] como segue. 4 [1] Um nonapéptido ou decapéptido escolhido entre um grupo de péptidos constituídos pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID N°:30, 29, 33, 34, 40, 46 ou 54 para utilização no tratamento ou na prevenção de tumores.

[2] Um nonapéptido escolhido entre um grupo de péptidos constituídos pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID N°:2, 3, 5, 11, ou 12 para utilização no tratamento ou na prevenção de tumores.

[3] Composição farmacêutica para utilização no tratamento e/ou na prevenção de tumores, consistindo essa composição farmacêutica em um ou mais péptidos definidos na reivindicação 1. ou 2..

[4] Uma vacina para utilização no tratamento ou na prevenção de tumores, vacina essa que compreende o péptido definido na reivindicação 1. ou 2. como um componente activo.

[5] A vacina de acordo com a reivindicação [4], para utilização no tratamento ou na prevenção de tumores, a qual se utiliza para administração a um paciente cujo antigénio HLA é HLA-A02 ou HLA-A24.

[6] A vacina de acordo com a reivindicação 4. ou 5., para utilização no tratamento ou na prevenção de tumores que se utiliza para suprimir o crescimento e/ou as metástases de tumores malignos.

Breve Descrição dos Desenhos

Fig. 1 mostra a citotoxicidade de clones de CTLs contra as células-alvo.

Fig. 2 mostra os resultados de análises de clones estabelecidos de CTLs com tetrâmeros de HLA: 5 (a) clones de CTLs induzidos por péptidos, e células alimentadoras ("feeder cells")/ e (b) células alimentadoras (controlo).

Fig. 3 mostra o efeito da vacinação utilizando péptidos da presente invenção sobre a taxa de sobrevivência de murganhos BALB/c inoculados com células tumorais Cólon 26.

Fig. 4 mostra o efeito da vacinação utilizando péptidos da presente descrição sobre o crescimento de tumores derivados de células Colon 26.

Fig. 5 mostra o efeito da vacinação utilizando péptidos da presente descrição sobre a taxa de sobrevivência de murganhos inoculados com BI6.

Fig. 6 mostra o efeito da vacinação utilizando péptidos da presente descrição sobre o crescimento de tumores derivados de melanoma BI6. Antes da estimulação ("challenge") com uma injecção subcutânea de células tumorais BI6, vacinaram-se A2/Kb TGM (murganhos transgénicos A2/Kb) duas vezes, com um intervalo de uma semana, com DC [Dendritic Cells (Células Dendriticas)] pulsadas por KDR773 (círculos pretos), só DC (triângulos brancos), ou HBSS [Hank's Balanced Salt Solution (Solução Salina Equilibrada de Hank)] (quadrados brancos). A figura mostra o crescimento tumoral médio (P< 0,01) .

Fig. 7 mostra o efeito citotóxico do clone de CTLs C29--169 por meio de péptidos apresentadores de células HLA--A24-positivas da presente descrição.

Fig. 8 mostra o efeito citotóxico do clone de CTLs C29--169 por meio de péptidos apresentadores de células HLA--A24-positivas da presente descrição.

Fig. 9 mostra o efeito citotóxico do clone de CTLs KDR-C85-775 (KWC85-775) por meio de péptidos apresentadores 6 de células HLA-A0201-positivas da presente descrição. Fig. 10 mostra o efeito citotóxico do clone de CTLs KDR-C85-775 (KWC85-775) por meio de péptidos KDR apresentadores de células HLA-A0201-positivas.

Fig. 11 mostra o efeito citotóxico do clone de CTLs KDR-C51-1328 (KWC51) por meio de péptidos apresentadores de células HLA-A0201-positivas da presente descrição.

Fig. 12 mostra o efeito citotóxico do clone de CTLs KDR-C51-1328 (KWC51) por meio de péptidos KDR apresentadores de células HLA-A0201-positivas.

Fig. 13 mostra o efeito citotóxico do clone de CTLs KDR-C44-773-2L (KWC44-773-2L) por meio de péptidos apresentadores de células HLA-A0201-positivas.

Fig. 14 mostra o efeito citotóxico do clone de CTLs KDR-C44-773-2L (KWC44-773-2L) por meio de péptidos apresentadores de células HLA-A0201-positivas.

Fig. 15 mostra o efeito citotóxico do clone de CTLs KDR-C44-773-2L (KWC44-773-2L) por meio de péptidos KDR apresentadores de células HLA-A0201-positivas.

Fig. 16 mostra o efeito inibitório de cada um dos tipos de anticorpos sobre o efeito citotóxico dos clones de CTLs.

Fig. 17 mostra a actividade inibitória dos péptidos da presente descrição sobre a resposta angiogénica induzida por células B16 em murganhos transgénicos A2/Kb (A2/Kb TGM). Vacinaram-se os murganhos duas vezes com HBSS, DC não pulsadas, ou DC pulsadas por péptidos designados epitopos da presente descrição (KDR190, KDR772, KDR773, KDR773-2L, KDR775, ou KDR1084). As setas indicam vasos sanguíneos recentemente formados, que se dispõem de acordo com um característico modelo padrão em ziguezague.

Fig. 18 mostra o efeito supressor dos péptidos da 7 presente descrição sobre o crescimento em volume de tumores humanos em murganhos transgénicos.

Fig. 19 mostra o efeito citotóxico de clones de CTLs KWC65-190 por meio de péptidos apresentadores de células HLA-A0201-positivas, na presença (quadrados pretos) ou na ausência (quadrados brancos) desses péptidos.

Fig. 20 mostra o efeito citotóxico de clones de CTLs KWC72-772 por meio de péptidos apresentadores de células HLA-A0201-positivas, na presença (quadrados pretos) ou na ausência (quadrados brancos) desses péptidos.

Fig. 21 mostra o efeito citotóxico de clones de CTLs KWC72-772 por meio de péptidos KDR que apresentam células HLA-A0201-positivas. HePG2-VEGFR2: quadrados pretos; HePG2-EGFP: quadrados brancos.

Fig. 22 mostra o efeito citotóxico de clones de CTLs C7-1318 por meio de péptidos que apresentam células HLA--A24-positivas da presente descrição, na presença (quadrados pretos) ou na ausência (quadrados brancos) desses péptidos.

Fig. 23 mostra o efeito citotóxico de clones de CTLs KWC46 por meio de péptidos que apresentam células HLA--A24-positivas da presente descrição, na presença (quadrados pretos) ou na ausência (quadrados brancos) desses péptidos.

Fig. 24 mostra o efeito citotóxico de clones de CTLs C18-189 por meio de péptidos que apresentam células HLA--A24-positivas da presente descrição, na presença (quadrados pretos) ou na ausência (quadrados brancos) desses péptidos.

Fig. 25 mostra o efeito citotóxico de clones de CTLs C65-826 por meio de péptidos apresentadores de células HLA-A24-positivas, na presença (quadrados pretos) ou na ausência (quadrados brancos) desses péptidos. 8

Fig. 26 mostra o efeito citotóxico de clones de CTLs C7-1318 por meio de péptidos que apresentam células HLA-A24-positivas da presente descrição. HT2 9-VEGFR2: quadrados pretos; HT29-EGFP: quadrados brancos.

Fig. 27 mostra o efeito citotóxico de clones de CTLs KWC46 por meio de péptidos que apresentam células HLA--A24-positivas da presente descrição. HT29-VEGFR2: quadrados pretos; HT29-EGFP: quadrados brancos.

Fig. 28 mostra o efeito citotóxico de clones de CTLs C18-189 por meio de péptidos que apresentam células HLA--A24-positivas da presente descrição. HT29-VEGFR2: quadrados pretos; HT29-EGFP: quadrados brancos.

Fig. 29 mostra o efeito citotóxico de clones de CTLs C65-826 por meio de péptidos que apresentam células HLA--A24-positivas da presente descrição. HT29-VEGFR2: quadrados pretos; HT29-EGFP: quadrados brancos.

Fig. 30 mostra a actividade inibidora dos péptidos da presente descrição sobre a resposta angiogénica induzida por células Colon 26 em murganhos BALB/c. Vacinaram-se os murganhos duas vezes com HBSS, DC não pulsadas, ou DC pulsadas por um péptido epitopo da presente descrição (KDR189 ou KDR826). As setas indicam vasos sanguíneos recentemente formados, que se dispõem de acordo com um característico modelo padrão em ziguezague.

Fig. 31 mostra a inibição por péptidos da presente descrição da resposta angiogénica induzida por células Colon 26 em BALB/c. As barras indicam a média, e as barras de erro verticais indicam o erro padrão.

Fig. 32 mostra o efeito citotóxico de CTLs, provenientes de doentes estimulados com os péptidos da presente descrição, sobre células HLA-A24-positivas, na presença (diamantes pretos) ou na ausência (quadrados brancos) desses péptidos. 9 (A) 0 efeito citotóxico de CTLs provenientes de doentes com cancro do cólon obtidas por estimulação com SEQ ID No: 8 (na qual a posição de iniciação dos aminoácidos é KDR169); (B) 0 efeito citotóxico de CTLs provenientes de doentes com cancro do cólon obtidas por estimulação com SEQ ID No: 5 (na qual a posição de iniciação dos aminoácidos é KDR189); e (C) 0 efeito citotóxico de CTLs provenientes de doentes com cancro do cólon obtidas por estimulação com SEQ ID No: 3 (na qual a posição de iniciação dos aminoácidos é KDR220). Método para Realizar a Invenção

Inicialmente os inventores da presente invenção consideraram que diversas proteínas são apresentadas in vivo sobre células apresentadoras de antigénios após serem degradadas em péptidos 9-mer (nonapéptidos), e examinaram a afinidade de ligação de péptidos 9-mer ou 10-mer parciais de proteínas de KDRs a antigénios HLA, que são antigénios do complexo major de histocompatibilidade dos humanos (antigénios do MHC) . As letras minúsculas das sequências de péptidos apresentadas no lado direito do Quadro 1 indicam os quintos aminoácidos. A sequência de aminoácidos de proteínas de KDRs no homem é bem conhecida, descrita na Patente de invenção norte-americana No. 5 8 61 301 por exemplo, podendo qualquer perito na arte obtê-la facilmente. Os péptidos 9-mer e 10-mer podem obter-se sintetizando péptidos iniciados a partir de qualquer posição, com base em toda a extensão da sequência de aminoácidos da proteína obtida de KDRs. Os péptidos podem 10 sintetizar-se de acordo com processos convencionais utilizados na química de péptidos. Processos de síntese normalmente utilizados estão descritos, por exemplo, em documentos como Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976; Peptide Synthesis (Peputido Gousei), Maruzen Co., Ltd., 1975; Foundations and Experiments in Peptide Synthesis (Peputidi Gousei no Kiso to Jikken) , Maruzen Co, Ltd, 1985; e Development of Pharmaceuticals, New Series (Iyakuhin no Kaihatsu, Zoku), Volume 14, Peptide Synthesis (Peputido Gousei), Hirokava Shoten, 1991, e em publicações como Publicação da Patente de invenção internacional No. WO 99/67288. A ligação a antigénios HLA pode determinar-se utilizando células isoladas que abrangem antigénios HLA sobre a sua superfície celular, como células dendríticas, e utilizando processos convencionais para avaliar a ligação dos péptidos às células.

Por outro lado, programas de software já disponíveis na Internet, como os descritos em Parker K. C., J. Immunol. 152, 1994 podem utilizar-se para calcular in silico as afinidades de ligação entre diversos péptidos e antigénios HLA. A afinidade de ligação a antigénios HLA pode determinar-se como descrito, por exemplo, em Parker K. C., J. Immunol. 152, 1994; e Nukaya, I., Int. J. Câncer, 80, 1999.

Para obter resultados adequados, como antigénios HLA utilizam-se de preferência antigénios do tipo A-24 e do tipo A-02, citados por serem extremamente expressos entre os Japoneses. Mais preferivelmente, utilizam-se subtipos como A--2402 e A-0201. No entanto, sob o ponto de vista clínico, mediante a determinação prévia do tipo de antigénio HLA de um doente que necessita de tratamento, pode seleccionar-se 11 adequadamente um péptido de modo a apresentar um elevado nível de afinidade de ligação àquele antigénio, ou nível de poder de induzir ("inducibility") células T citotóxicas (CTL) após apresentação de antigénios. Além disso, para se obterem péptidos com elevados níveis de afinidade de ligação e de poder de induzir ("inducibility") CTLs, pode proceder-se à substituição ou à adição de um, dois, ou diversos aminoácidos com base na sequência de aminoácidos do péptido KDR parcial que ocorre naturalmente. Aqui, o termo "diversos" significa cinco ou menos, ou preferivelmente três ou menos. Em acréscimo aos péptidos que ocorrem na natureza, conhece-se já a ordem da sequência dos péptidos desenvolvidos utilizando a ligação a antigénios HLA (J. Immunol., 152, 3913, 1994/ Immunogenetics, 41:178, 1995/ J. Immunol. 155:4307, 1994). Portanto, modificações baseadas nessa ordem podem realizar-se também nos péptidos obtidos. Por exemplo, péptidos nos quais o segundo aminoácido a partir do N-terminal é substituído por fenilalanina, tirosina, metionina, ou triptofano, e nos quais o aminoácido do C-terminal é substituído por fenilalanina, leucina, isoleucina, triptofano, ou metionina podem também utilizar-se de preferência como péptidos de elevada afinidade de ligação aos HLA-24. Por outro lado, péptidos nos quais o segundo aminoácido a partir do N-terminal é substituído por leucina ou metionina, e nos quais o aminoácido do C-terminal é substituído por valina ou leucina podem utilizar-se de preferência como péptidos com elevada afinidade de ligação aos HLA-0201. Além disso, pode(m) adicionar-se também um ou dois aminoácido(s) ao N- e/ou C-terminal(ais) dos péptidos.

Contudo, quando uma sequência de um péptido é idêntica a uma parte de uma sequência de aminoácidos de uma proteína endógena ou exógena com uma função diferente, pode originar efeitos secundários como doenças auto-imunitárias ou sintomas 12 alérgicos contra substâncias específicas. Consequentemente, para evitar situações nas quais uma sequência corresponde ("matches") à sequência de aminoácidos de uma outra proteína é preferível utilizar bases de dados ("databases") disponíveis para realizar pesquisas de homologia. Além disso, quando as pesquisas de homologia revelam que não existem péptidos que compreendem sequer uma ou duas diferenças nos aminoácidos, não existe o risco desses problemas devidos a modificações das sequências de aminoácidos mencionadas antes para aumentar a afinidade de ligação aos antigénios HLA e/ou o poder de induzir ("inducibility") CTLs.

Como descrito antes, supõe-se que péptidos com elevada afinidade de ligação aos antigénios HLA sejam muito eficazes como vacinas contra cancros. Contudo, é necessário averiguar se os péptidos candidatos, que se seleccionam utilizando como indício a elevada afinidade de ligação, possuem ou não real poder de induzir ("inducibility") CTLs. A confirmação do poder de induzir ("inducibility") CTLs obtém-se mediante a indução de células apresentadoras de antigénios que compreendem antigénios do MHC ("complexo major de histocompatibilidade") em humanos (como linfócitos B, macrófagos, e células dendríticas), mais especificamente células dendríticas provenientes de leucócitos mononucleares humanos de sangue periférico; a estimulação dessas células com os péptidos; a mistura das mesmas células com células CD8-positivas; e a avaliação em seguida da citotoxicidade contra as células-alvo. Como sistema reaccional, podem utilizar-se animais transgénicos procriados para expressar um antigénio HLA humano (por exemplo, os descritos em Hum. Immunol. 2000 Aug.;61(8):764-79 Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLAA*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA 13 class II restricted T(H)response., BenMohMED L., Krishnan R., Longmate J., Auge C., Low L., Primus J., and Diamond DJ.) . Por exemplo, submetendo as células-alvo a marcação radioactiva com 51Cr ou semelhante, a citotoxicidade pode calcular-se a partir da radioactividade libertada por essas células-alvo. Alternativamente, pode examinar-se a actividade mediante a avaliação do IFN-γ ("interferão γ ou imunitário") produzido e libertado pelas CTLs na presença de células apresentadoras de antigénios que imobilizam os péptidos, e a visualização da zona de inibição nos meios utilizando anticorpos monoclonais anti-IFN-γ.

Os resultados do estudo sobre o poder dos péptidos induzirem ("inducibility") as CTLs como descrito antes revelaram que os que possuem elevada afinidade de ligação aos antigénios HLA não possuem necessariamente elevado poder de indução ("inducibility"). Além disso, nonapéptidos escolhidos entre péptidos que compreendem a sequência de aminoácidos de VYSSEEAEL (SEQ ID No: 2), GYRIYDWL (SEQ ID No: 3), SYMISYAGM (SEQ ID No: 5), RFVPDGNRI (SEQ ID No: 8), KWEFPRDRL (SEQ ID

No: 11), ou DFLTLEHLI (SEQ ID No: 12), e nonapéptidos e decapéptidos escolhidos entre péptidos que compreendem a sequência de aminoácidos de AMFFWLLV (SEQ ID No: 29) ! VIAMFFWLL (SEQ ID No: 30) , AVIAMFFWL (SEQ ID No: 33) ! KLIEIGVQT (SEQ ID No: 34), YMISYAGMV (SEQ ID No: 40), ou iqsdvwsfgv (SEQ ID No: 46), demonstraram principalmente elevado poder de induzir ("inducibility") as CTLs. A presente invenção descreve ainda péptidos com poder de induzir ("inducibility") células T citotóxicas, em que um, dois ou alguns aminoácido(s) é/são substituído(s) ou acrescentado(s) à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nos: 2, 3, 5, 8, 11, ou 12. Sequências de aminoácidos constituídas 14 por nove aminoácidos de SEQ ID Nos: 2, 3, 5, 8, 11, ou 12, em que um, dois, ou alguns aminoácido(s) pode(m) ser substituído(s) ou acrescentado(s), podem poder induzir ("inducibility") CTLs, contanto que as sequências não correspondam à sequência de aminoácidos de uma outra proteína. Em particular, por exemplo, o segundo aminoácido a partir do N-terminal é preferivelmente substituído por fenilalanina, tirosina, metionina, ou triptofano, ou o aminoácido do C-terminal é preferivelmente substituído por fenilalanina, leucina, isoleucina, triptofano, ou metionina; ou acrescenta(m)-se um ou dois aminoácido(s) ao N-terminal e/ou ao C-terminal. A presente invenção descreve também péptidos com poder de induzir ("inducibility") células T citotóxicas, em que um, dois, ou alguns aminoácido(s) é/são substituído(s) ou acrescentado(s) à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nos: 29, 30, 33, 34, 40, ou 46. Sequências de aminoácidos constituídas por nove ou dez aminoácidos de SEQ ID Nos: 29, 30, 33, 34, 40, ou 46, em que um, dois, ou alguns aminoácido (s) são substituído(s) ou acrescentado(s), podem poder induzir ("inducibility") CTLs, contanto que as sequências não correspondam à sequência de aminoácidos de uma outra proteína. Em particular, por exemplo, o segundo aminoácido a partir do N-terminal é preferivelmente substituído por leucina ou metionina, ou o aminoácido do C-terminal é preferivelmente substituído por valina ou leucina; ou acrescenta(m)-se um ou dois aminoácido(s) ao N-terminal e/ou ao C-terminal. Um exemplo de um tal péptido modificado é o péptido de SEQ ID No: 30, em que o segundo aminoácido a partir do N-terminal é substituído por leucina (SEQ ID No: 54), embora esse exemplo não seja limitativo. Clones das CTLs 15 obtidos mediante estimulação por esses péptidos modificados podem reconhecer os péptidos originais, e induzirem danos.

Os péptidos de acordo com a presente invenção podem utilizar-se individualmente ou em associações de dois ou mais, como vacinas contra cancros capazes de induzirem CTLs ín vivo. Pela administração de péptidos de acordo com a presente invenção, os péptidos distribuem-se em uma elevada densidade nos antigénios HLA de células apresentadoras de antigénios. As CTLs que reagem especificamente com os complexos formados entre os péptidos apresentados ("displayed") e os antigénios HLA são induzidas, reforçando o ataque contra as células endoteliais vasculares nas células tumorais a serem utilizadas como alvo. Alternativamente, as células apresentadoras de antigénios sobre cuja superfície celular os péptidos de acordo com a presente invenção são imobilizados podem obter-se recolhendo células dendríticas provenientes de um paciente, e estimulando-as com os péptidos de acordo com a presente invenção. As células apresentadoras de antigénios obtidas administram-se novamente aos pacientes para induzirem CTLs nesses pacientes. Como consequência, pode reforçar-se o ataque dirigido contra as células-alvo.

Mais especificamente, a presente invenção proporciona medicamentos para tratar tumores ou prevenir proliferação, metástases, e outras situações relativas a tumores, contendo esses medicamentos um ou mais péptido(s) de acordo com a presente invenção. A angiogénese em locais patológicos está intimamente associada não apenas a tumores, mas também a doenças como retinopatia diabética, artrite reumatóide crónica, psoríase, e aterosclerose, e às metástases de tumores sólidos (Folkman, J., Nature Med. 1: 27-31 (1995); Bicknell, R., Harris, A. L., Curr. Opin. Oncol. 8:60-65 16 16 (1996)). presente doenças crónica, sólidos.

Consequentemente, os péptidos de acordo com a invenção podem utilizar-se para tratar tumores, como retinopatia diabética, artrite reumatóide psoriase, aterosclerose, e metástases de tumores

Confirmou-se os péptidos de acordo com a presente invenção inibirem a formação de vasos sanguíneos tortuosos, que são sob o ponto de vista morfológico diferentes dos vasos sanguíneos normais, e que se formam em tecidos tumorais malignos. Os resultados da análise da cicatrização da lesão e da fertilidade em murganhos vacinados confirmaram também que os péptidos não possuem qualquer efeito adverso sobre angiogénese fisiológica normal. Além do mais, mediante a utilização de clones de CTLs que reconhecem os péptidos de acordo com a presente invenção, analisou-se in vitro a citotoxicidade contra células endoteliais não proliferativas ou proliferativas. Esses clones exibiram actividade mais forte contra células endoteliais proliferativas do que contra células endoteliais não proliferativas. Mais discriminadamente, podem actuar muito especificamente em doenças associadas a células endoteliais proliferativas, e principalmente cancro. A estimulação in vivo e in vitro de células dendríticas pelos péptidos de acordo com a presente invenção pode realizar-se facilmente expondo as células a uma elevada concentração dos péptidos, o que faz com que esses péptidos substituam os péptidos originalmente imobilizados sobre as células. Consequentemente, os péptidos estudados na presente invenção devem possuir pelo menos um determinado nível de afinidade de ligação aos antigénios HLA. 17

Os medicamentos de acordo com a presente invenção podem administrar-se expressamente sob a forma dos próprios péptidos da presente invenção, ou podem administrar-se sob a forma de composições farmacêuticas que sejam formuladas utilizando processos de formulação convencionais. Em tais casos, os medicamentos de acordo com a presente invenção podem incluir de um modo adequado, além dos péptidos de acordo com a mesma invenção, veículos, excipientes, e produtos semelhantes que se utilizam habitualmente em medicamentos, sem limitações específicas. Os medicamentos de acordo com a presente invenção podem utilizar-se no tratamento e na prevenção de diversos tumores, como cancro gástrico, cancro duodenal, cancro do cólon, cancro do pulmão, cancro da mama, cancro da próstata, e tumores cerebrais. Os péptidos de acordo com a presente invenção não têm como alvo as próprias células tumorais, mas sim as células endoteliais dos vasos sanguíneos que se apresentam recém-formadas nos tecidos tumorais. Consequentemente, uma enorme diversidade de tumores pode constituir o alvo do tratamento, não sendo os medicamentos de acordo com a presente invenção especialmente limitados na sua utilização.

Os medicamentos para o tratamento e/ou a prevenção de tumores, que contêm um péptido de acordo com a presente invenção como um componente activo, podem administrar-se com adjuvantes de tal modo que a imunidade celular seja eficazmente induzida; podem administrar-se com outros componentes activos como agentes antitumorais; e podem administrar-se sob formas granulares. Esses adjuvantes descritos na bibliografia (Clin. Microbiol. Rev., 7:277-289, 1994) ou semelhantes são apropriados. Portanto, os medicamentos de acordo com a presente invenção podem administrar-se sob a forma de formulações de lipossomas, sob 18 a forma de formulações granulares ligadas a microesferas com poucos micrómetros ("micrometers") de diâmetro, e sob a forma de formulações às quais se ligam lipidos. Pode proceder-se à administração, por exemplo, por via oral, por via intradérmica, ou por via subcutânea, ou por meio de injecção endovenosa, ou semelhante. Nas vizinhanças do tumor-alvo pode proceder-se a administração sistémica ou administração local. As doses dos péptidos de acordo com a presente invenção podem ajustar-se de um modo adequado, dependendo da doença a tratar, idade e peso dos doentes, modos de administração, e outros factores. Habitualmente, 0,001 mg a 1 000 mg, preferivelmente 0,01 mg a 100 mg, mais preferivelmente 0,1 mg a 10 mg, dos péptidos de acordo com a presente invenção administram-se de preferência uma vez durante alguns dias a alguns meses. Qualquer perito na arte pode escolher correctamente as doses apropriadas.

Por outro lado, a presente invenção proporciona vesículas intracelulares que apresentam complexos formados entre os péptidos de acordo com a presente invenção e antigénios HLA sobre as suas superfícies. Essas vesículas intracelulares denominam-se exossomas. Os exossomas podem preparar-se, por exemplo, de acordo com os processos especificamente descritos na Tradução Japonesa Publicada com os Nos de Publicação Internacionais Hei 11-510507 e 2000-512161. Os exossomas podem preparar-se de preferência utilizando células apresentadoras de antigénios obtidas a partir de doentes que se destinam a ser o alvo da terapia ou da profilaxia. Os exossomas de acordo com a presente invenção podem inocular-se como vacinas contra cancros, sob a forma de péptidos de acordo com a presente invenção. 19 0 tipo de antigénios HLA a utilizar devem ajustar-se ("match") aos do doente com necessidade da terapia e/ou da profilaxia. Por exemplo, para a população japonesa, o antigénio HLA-A24 ou HLA-A02, especialmente o HLA-A2402 ou o HLA-0201, é geralmente apropriado. A presente invenção descreve também processos de indução de células apresentadoras de antigénios utilizando os péptidos de acordo com a mesma invenção. As células apresentadoras de antigénios podem instigar-se ("induced") mediante indução de células dendríticas dos monócitos sanguíneos periféricos; e estimulando-as ("contacting") depois com os péptidos de acordo com a presente invenção, in vitro ou in vivo. A administração a pacientes de péptidos de acordo com a presente invenção estimula ("induces") no corpo desses pacientes células apresentadoras de antigénios nas quais os péptidos da presente invenção se imobilizam. Alternativamente, os péptidos de acordo com a presente invenção podem imobilizar-se nas células apresentadoras de antigénios ao administrarem-se a pacientes sob a forma de uma vacina. A presente invenção proporciona também processos de indução de células apresentadoras de antigénios com um elevado nível de poder de induzir ("inducibility") células T citotóxicas, na qual os processos mencionados compreendem a introdução in vitro a uma célula apresentadora de antigénios de um gene que engloba um polinucleótido que codifica um péptido de acordo com a presente invenção. Os genes a introduzir podem apresentar-se sob a forma de ADN ou ARN. Os processos de introdução podem ser processos diversos comummente utilizados na arte, como processos de lipofecção, de electroporação, e de fosfato de cálcio, sem limitações 20 especiais. Mais especificamente, os processos podem realizar--se como descritos em, por exemplo, Câncer Res., 56:5672, 1996; J. Immunol., 161:5607, 1998; J. Exp. Med., 184:465, 1996; ou Published Japanese Translation of International Publication No 2000-509281. Mediante inserção dos genes dentro de células apresentadoras de antigénios, os genes sofrem transcrição, tradução, e outros processos nas células. As proteínas obtidas submetem-se depois ao processamento de genes da classe I ou da classe II do MHC e a uma via de apresentação para exibirem péptidos parciais.

Além disso, a presente invenção descreve processos de indução de CTLs utilizando os péptidos de acordo com a mesma invenção. Mediante a administração de péptidos de acordo com a presente invenção a um paciente, CTLs são induzidas no organismo do doente, aumentando a imunidade contra as células endoteliais angiogénicas nos tecidos tumorais. Alternativamente, os processos podem utilizar-se em métodos terapêuticos ex vivo, em que se estimulam ("are contacted") ín vitro células apresentadoras de antigénios, células CD8--positivas, ou leucócitos mononucleares do sangue periférico provenientes do doente com os péptidos de acordo com a presente invenção para induzir CTLs, depois do que se reintroduzem as células no doente.

Além disso, a presente invenção descreve células T citotóxicas, que são induzidas utilizando os péptidos de acordo com a presente invenção e seguidamente isoladas. As células T citotóxicas, que são induzidas por estimulação com células apresentadoras de antigénios que apresentam os péptidos de acordo com a presente invenção, são preferivelmente provenientes de pacientes indicados como alvo de terapia e/ou de profilaxia. As células T citotóxicas podem 21 administrar-se individualmente ou, com o objectivo de efeito antitumoral, em associação com outros fármacos, incluindo os péptidos, exossomas, e os restantes produtos de acordo com a presente invenção. As células T citotóxicas obtidas actuam especificamente contra células-alvo que apresentam os péptidos de acordo com a presente invenção, ou preferivelmente, contra células-alvo que apresentam os péptidos iguais aos utilizados para indução. As células-alvo podem ser células que de um modo endógeno expressam receptores KDR, ou células obrigadas a expressar receptores KDR. Além disso, células que apresentam os péptidos de acordo com a presente invenção sobre a sua superfície celular devido à estimulação por esses péptidos podem igualmente serem utilizadas como alvo. A presente invenção proporciona também células apresentadoras de antigénios que apresentam complexos formados entre antigénios HLA e os péptidos de acordo com a presente invenção. As células apresentadoras de antigénios que se obtêm por contacto com os péptidos de acordo com a presente invenção, ou com nucleótidos que codificam os péptidos de acordo com a presente invenção, são de preferência provenientes de pacientes a serem utilizados como alvo de terapia e/ou de profilaxia. As células apresentadoras de antigénios podem administrar-se como vacinas individualmente, ou em associação com outros fármacos como os péptidos de acordo com a presente invenção, exossomas, e células T citotóxicas.

Melhor Método para Realizar a Invenção

Seguidamente na presente descrição, relatar-se-á pormenorizadamente a nova invenção utilizando Exemplos, 22 embora não seja para ser interpretada como estando limitada aos mesmos.

[Exemplo 1] Previsão de ligação de 1(HLA-A*2402) a péptidos derivados de VEGFR-2 (KDR)

Com base na sequência completa de aminoácidos da proteína dos KDR, anteciparam-se doze tipos de péptidos 9-mer (SEQ ID Nos: 1 a 12), e doze tipos de péptidos 10-mer (SEQ ID Nos: 13 a 24) dela resultantes com a mais elevada afinidade de ligação ao antigénio HLA-A*2402, utilizando o software HLA Peptide Binding Prediction de Biolnformatics & Molecular Analysis Section (BIMAS) (http://bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/-molbio/ken arker comboform) (Quadro 1). 0 Quadro 1 mostra a afinidade de ligação de cada um dos 9-mer e 10-mer a partir do valor mais elevado, simultaneamente com a posição dos seus N-terminais na sequência de aminoácidos da proteína dos KDR. No quadro, CE652 (SEQ ID No: 25) refere-se a um dos epitopos do antigénio tumoral CEA (antigénio carcinoembriónico) que foi relatado por Nukaya, I (Int. J. Câncer 80, 1999) . Como péptidos de controlo negativo utilizaram-se péptidos de HIV (ILKEPVHGV (SEQ ID No: 55) e RYLRDQQLL (SEQ ID No: 56)).

Os péptidos sintetizaram-se de acordo com processos padronizados de síntese em fase sólida utilizando Cleaved PepSet (Mirnotope, San Diego, CA) , e purificaram-se por HPLC em fase reversa. A pureza (>95%) e o tipo de péptido determinaram-se individualmente utilizando HPLC e espectrometria de massa. 23

Quadro 1 Ligação de HLA-A*2402 a péptidos derivados de KDR SEQ ID No: POSIÇÃO DE INICIAÇÃO SEQUÊNCIA DE AA* (9-mer) AFINIDADE DE LIGAÇÃO*1 SEQ ID No: POSIÇÃO DE INICIAÇÃO SEQUÊNCIA DE AA (10-mer) AFINIDADE DE LIGAÇÃO*1 1 KDR583 WYKLGPQPL7* 240 13 KDR950 DYVGalPVDL*3 420 2 KDR1318 VYSSEEAEL 220 14 KDR434 SYQYgTTQTL*3 360 3 KDR220 GYRIYDWL 200 15 KDR1058 DYVRkGDARL*3 300 4 KDR920 KFGNLSTYL*3 48 16 KDR304 LYTCaASSGL*3 200 5 KDR189 SYMISYAGM 38 17 KDR1318 VYSSeEAELL*3 200 6 KDR828 EFPRDRLKL*3 33 18 KDR734 LYTCqACSVL*3 200 7 KDR1152 TFSELVEHL*3 29 19 KDR926 TYLRsKRNEF*3 198 8 KDR169 RFVPDGNRI*3 22 20 KDR353 KYLGyPPPEI*3 165 9 KDR331 AFGSGMESL*3 20 21 KDR116 VYVQdYRS P F*3 150 10 KDR604 KNLDTLWKL*3 16 22 KDR395 NYTViLTNPI*3 72 11 KDR826 KWEFPRDRL 12 23 KDR777 FFWLLIVIIL*3 24 12 KDR998 DFLTLEHLI 9 24 KDR193 SYAGmVFCEA*3 9,2 25 CE652*1 TYACFVSNL*3 200 *1 Parker KC: 1994 J. Immunol 152 *2 Nukava I: 1999 Int. J. Câncer 80 *3Aqui as sequências estão especificadas a titulo meramente ilustrativo [Exemplo 2] Estabelecimento de linhas de CTLs utilizando os péptidos previstos

Takara Shuzo Biotechnology Research Laboratory forneceu linhas de células B imortalizadas por virus Epstein-Barr (EBV), TISI (HLA-A24/24) e EHM (HLA-A3/3). A serotipagem de HLA realizou-se utilizando 7 ml de sangue periférico colhido em um indivíduo saudável. Isolaram--se linfócitos mononucleares do sangue periférico (PBMCs) provenientes de sangue periférico HLA-A24-positivo utilizando centrifugação com gradiente de densidade Ficoll Paque (Pharmacia).

Deixaram-se repousar os PBMCs obtidos durante 10 horas em um frasco para cultura (Corning, 43072) . Após remoção das células suspensas, cultivaram-se as células que aderiram ao 24 frasco em meio AIM-V (Invitrogen) acrescentado de 2% de auto--soro mediante a adição de 1 000 U/ml de GM-CSF humano (Factor Estimulante de Colónias de Macrófagos e de Granulócitos) (fornecido por Kirin Brewery), e de 1 000 U/ml de IL-4 humana (Genzyme). Cinco dias mais tarde, cultivaram--se as células durante mais 48 horas em 10 pg/ml de OK-432 (fornecidos por Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.), e utilizaram-se como células apresentadoras de antigénios para indução de CTLs. As células dendriticas (DCs) confirmaram-se serem mesmo DCs mediante reacção com anticorpos CD80 e CD86 anti-classe II marcados com FITC (Isotiocianato de Fluoresceina) e anticorpos CDllc, CD40 (todos provenientes de Beckton-Dickinson), e CD83 (Immunotech) anticlasse I marcados com PE ("Phycoerythrin" corante vermelho fluorescente derivado de uma alga); seguida por análise dos antigénios de superfície por FACS-Calibur (Beckton-Dickinson) utilizando um programa ("software") Cell Quest. DCs (células dendriticas) pré-induzidas foram pulsadas durante 4 horas à temperatura de 20 °C por 12 tipos de péptidos 9-mer (SEQ ID Nos: 1 a 12) (20 pg/ml), que se previu no Exemplo 1 apresentarem elevada afinidade de ligação, na presença de 3 pg/ml de microglobulina β2. As DCs resultantes misturaram-se com células CD8-positivas seleccionadas por microesferas magnéticas ("magnetic beads") (Dynabeads M-450 e Detachabeads) a partir de PBMC [Peripheral blood mononuclear lymphocytes (Linfócitos mononucleares do sangue periférico)], em uma proporção de 1:20 ou 1:2, e cultivaram-se seguidamente em uma placa de 48 cavidades (Corning) , na presença de 10 ng/ml de IL-7 humana (Genzyme). Três dias mais tarde, adicionou-se à cultura a concentração final de 10 U/ml de IL--2 (Sigma) . E sete e 14 dias mais tarde, estimularam-se as mesmas DCs para induzirem CTLs, e 20 dias mais tarde, 25 determinou-se a citotoxicidade para cada cavidade utilizando como alvos células TISI pulsadas por péptidos. Cultivaram-se apenas as cavidades positivas através de um processo de estimulação com allo-PBMC, linhas de células B imortalizadas por EBV (EHM), e 30 ng/ml do anticorpo anti-CD3. Catorze dias mais tarde analisaram-se os CTLs sob o ponto de vista funcional. A actividade citotóxica avaliou-se por meio de um ensaio de libertação de 51Cr de quatro horas. Durante a noite uma concentração de 20 pg/ml das células-alvo foi pulsada por péptidos. As células-alvo foram marcadas com 100 pCi de Na251Cr04 à temperatura de 37 °C durante uma hora, e lavaram--se depois três vezes com o meio RPMI 1640. As células-alvo (lxloVlOO μΐ) e 100 μΐ de células efectoras a diversas concentrações com um volume total de 200 μΐ colocaram-se em uma placa de microtitulação em forma de U com 96 cavidades (Corning), e cultivaram-se durante quatro horas à temperatura de 37 °C em uma incubadora de CO2. Concluída a cultura, colheram-se de cada cavidade 100 μΐ de sobrenadante, e avaliaram-se utilizando um contador γ. O decaimento natural indicou a radioactividade das células-alvo e o decaimento médio, e máximo indicou a radioactividade das células-alvo e de HC1 1M. A actividade citotóxica (percentagem da lise específica) calculou-se através da fórmula seguinte:

Actividade citotóxica (Citotoxicidade em %)=

(Decaimento expenmental-Decaimento natural)/(Decaimento máximo-Decaimento natural)xlOO

Como resultado desenvolveram-se ("were established") seis tipos de linhas de CTLs, como se mostra no Quadro 2. Em particular, os nonapéptidos representados por SEQ ID No: 2 (posição de iniciação do aminoácido KDR1318), SEQ ID No: 3 (KDR220), SEQ ID No: 5 (KDR189) , SEQ ID No: 8 (KDR169), SEQ 26 ID No: 11 (KDR826), e SEQ ID No : 12 (KDR998) foram apresentados por serem eficazes como péptidos epitopos. Quadro 2 ACTIVIDADE CITOTÓXICA SEQ POSIÇÃO SEQUÊNCIA AFINIDADE x20 X2 ID DE DE AA DE Pep(+) Pep (- ) Pep(+) Pep (-) No: INICIAÇÃO LIGAÇÃO*1 1 KDR583 WYKLCPQPL*3 240 6% 4% 0% 0% 2 KDR1318 VYSSEEAEL 220 39% 21% 8% 3% 3 KDR220 GYRIYDWL 200 57% 2% 20% 0% 4 KDR920 KFGNLSTYL*3 48 3% 4% 0% 2% 5 KDR189 SYMISYAGM 38 41% 3% 20% 0% 6 KDR828 EFPRDRLKL*3 33 3% 2% 1% 0% 7 KDR1152 TFSELVEHL*3 29 0% 0% 0% 0% 8 KDR169 RFVPDGNRI*3 22 98% 2% 53% 0% 9 KDR331 Ar GSGMESL*3 20 6% 6% 0% 0% 10 KDR604 KNLDTLWKL*3 16 3% 2% 1% 1% 11 KDR826 KWEFPRDRL 12 23% 0% 11% 0% 12 KDR998 DFLTLEHLI 9 13% 4% 8% 0% 25 CÊ652*"2 TYACFVSNL*3 200 29% 16% 7% 1% *1 Parker KC: 1994 J. Immunol 152 *2 Nukava I: 1999 Int. J. Câncer 80 * 3 os péptidos estão especificados a titulo meramente ilustrativo [Exemplo 3] Estabelecimento de clones de CTLs provenientes de péptidos previstos

Em uma placa de microtitulação em forma de U com 96 cavidades diluiram-se os seis tipos de linhas de CTLs estabelecidos no Exemplo 2 até 0,3, 1 ou 3 células/cavidade. A cada cavidade adicionaram-se 7xl04 células/cavidade de allo-PBMC, lxlO4 células/cavidade de EHM, 30 ng/ml de anticorpo anti-CD3, e 125 U/ml de IL-2, e adicionou-se também AIM-V acrescentado de 5% de auto-soro, de tal modo que a concentração total indicou 150 μΐ/cavidade. Dez dias mais tarde, adicionaram-se 50 μΐ/cavidade de meio acrescentado de IL-2 até uma concentração final de IL-2 de 125 U/ml. No 14° 27 dia analisaram-se os CTLs sob o ponto de vista funcional, e cultivaram-se em larga escala os CTLs com actividade.

Como resultado, a partir de cada um dos cinco tipos de nonapéptidos representados por SEQ ID No: 8 (posição de iniciação do aminoácido KDR169) , SEQ ID No: 5 (KDR189) , SEQ ID No: 3 (KDR220), SEQ ID No: 2 (KDR1318), e SEQ ID No: 11 (KDR826), estabeleceram-se oito tipos (C13-169, C19-169, C29--169, C53-169, C72-169, C61-169, K5-169, e K25-169), dois tipos (C12-189 e C18-189), onze tipos (KWC3, 23, 25, 26, 36, 42, 46, 58, 61, 70, e 77), um tipo (C7-1318), e um tipo (C65--826) de clones de CTLs, respectivamente (Quadro 3).

Quadro 3 ACTIVIDADE CITOTÓXICA x20 X2 NOME DO CLONE Pep(+) Pep(-) P ( + ) P (-) C13-169 98% 2% 66% 2% C19-169 94% 2% 50% 0% C29-169 100% 1% 70% 28 C53-169 100% O Q. Δ. O 91% 2% C72-169 87% 1% 39% 0% C61-169 88% 0% 38% 0% K5-169 36% 0% 6% 0% K25-169 27% 0% 5% 0% C12-189 27% 18% 7% 3% C18-189 67% 18% 28% 7% KWC3 54% 2% 11% 1% KWC23 95% 1% 49% 1% KWC25 93% 1% 70% 1% KWC26 87% 1% 34% 0% KWC36 62% 2% 11% 2% KWC42 67% 0% KWC46 94% 1% 51% 0% KWC58 76% 0% KWC61 1 70% 2% 19% 1% KWC70 92% 3% 64% 2% KWC77 99% 3% 70% 2% C65-826 38% 6% 8% 3% C7-1318 84% 1% 62% 1% [Exemplo 4] Determinação da citotoxicidade dos clones formados de CTLs

Os níveis de citotoxicidade dos dez tipos de clones de CTLs formados no Exemplo 3 analisaram-se fazendo variar as suas proporções na presença de células-alvo (razão E:T).

Como resultado, o C53-169 proveniente do nonapéptido de SEQ ID No: 8 (posição de iniciação do aminoácido KDR169) exibiu a mais acentuada citotoxicidade.

[Exemplo 5] Análise dos clones de CTLs formados pelos tetrâmeros-HLA A partir de um HLA-A*2402 e de um péptido de SEQ ID No: 8 (posição de iniciação do aminoácido KDR169) sintetizou-se um tetrâmero HLA. Mais especificamente, produziram-se 29 separadamente vectores plasmidiais que expressam a cadeia H (aproximadamente 35 kDa) e a cadeia L (aproximadamente 11 kDa), e expressaram-se as suas proteínas recombinantes utilizando E. coli. 0 vector plasmidial que expressa a cadeia H é apenas constituído pelo domínio extracelular, no qual o terminal carboxilo foi substituído por uma sequência de identificação através de uma enzima de biotinilação. A cadeia H e a cadeia L formam um complexo de péptidos HLA por "refolding" ("reenovelamento") com um péptido antigénico. Os complexos de péptidos HLA foram biotinilados utilizando uma enzima de biotinilação, a biotina em excesso removeu-se por cromatografia de filtração em gele e cromatografia de troca iónica, e isolaram-se e purificaram-se os complexos de péptidos HLA biotinilados. 0 tetrâmero HLA sintetizou-se fazendo reagir o complexo preparado biotinilado de péptidos HLA com streptavidin (SA) em uma proporção molar de 4:1 para formar um tetrâmero. Durante a análise das amostras, utilizou-se para formar o tetrâmero a SA marcada por fluorescência com ficoeritrina [PE (um corante vermelho fluorescente) ] . A molécula CD8 é conhecida por se ligar ao 245° aminoácido no domínio oí3, que é a alanina, com excepção das porções A, B, e C dos HLA. Consequentemente, os inventores da presente invenção provocaram nos tetrâmeros HLA a mutação da alanina em valina, de modo a gerar um tetrâmero HLA mutante capaz de detectar de um modo selectivo CTLs com elevada avidez (afinidade) para complexos de péptidos HLA, independente da ligação entre a molécula CD8 e o domínio oí3 .

Os clones de CTLs preparados detectaram-se utilizando o mutante tetramérico HLA-A24KDR169 sintetizado. Como resultado, conforme apresentado na Fig. 2, observou-se que os clones de CTLs preparados coravam intensamente pelas fracções tetrâmero-positivas e CD8-positivas, e reconheciam especificamente complexos formados entre os péptidos de 30 acordo com a presente invenção e antigénios HLA. Os sinais nas fracções tetrâmero-negativas e CD8-negativas são devidos a células alimentadoras.

[Exemplo 6] Previsão de ligação de 2(HLA-A*0201) a péptidos derivados dos receptores VEGFR-2 (KDR)

De um modo muito semelhante ao do Exemplo 1, previram-se 15 tipos de péptidos 9-mer (SEQ ID Nos: 26 a 40), e 12 tipos de péptidos 10-mer (SEQ ID Nos: 41 a 52) de acordo com a sequência completa de aminoácidos da proteína KDR, a partir da mais elevada afinidade de ligação a HLA-A*0201, utilizando um software de Previsão de Ligação de Péptidos HLA [HLA Peptide Binding Prediction software (http: //bimas. dcrt. nih. gov/cgibin/molbio/ken parke.r__com.bof orm) ] (Quadro4) . 0 Quadro 4 mostra a afinidade de ligação de cada um dos 9 mer e 10 mer a partir do mais elevado valor, simultaneamente com a posição dos seus N-terminais na sequência de aminoácidos da proteína dos KDR. No quadro, CEA588 (SEQ ID No: 53) refere-se a um dos epitopos do antigénio tumoral CEA (antigénio carcinoembriónico) apresentado por Tanaka, H. et al. (póster de apresentação, AACR #3669, vol. 42, pág. 681-682, Março 2001).

Quadro 4 Ligação de HLA-A*0201 a péptidos derivados de KDR SEQ ID No: Posição de iniciação Sequência de AA (9 mer) Afinidade de ligação SEQ ID No: Posição de iniciação Sequência de AA (10 mer) Afinidade de ligação 26 KDR 1093 VLLWEIFSL*2 1792 41 KDR 1094 LLWEIFSLGA* 1092 27 KDR 633 SLQDQGDYV*2 769 42 KDR 5 VLLAvALWLC* 539 28 KDR 5 VLLAVALWL*2 739 43 KDR 313 LMTKKNSTFV* 470 2 31 31 29 KDR 775 AMFFWLLLV 427 30 KDR 773 VIAMFFWLL 270 31 KDR 1034 ILLSEKNW*2 179 32 KDR 604 KNLDTLWKL*2 128 33 KDR 772 AVIAMFFWL 113 34 KDR 1328 KLIEIGVQT 107 35 KDR 698 IMWFKDNET*2 76 36 KDR 608 TLWKLNATM*2 41 37 KDR 491 FQGGNKIEV*2 32 38 KDR 435 YQYGTTQTL*2 32 39 KDR 505 ALIEGKNKT*2 31 40 KDR 190 YMISYAGMV 30 44 KDR 779 WLLLvIILRT* 292 45 KDR 505 2 ALIEgKNKTV* 285 46 KDR10 1084 IQSDvWSFGV 285 47 KDR 733 GLYTcQACSV* 223 48 KDR 780 2 LLLVIILRTV* 201 49 KDR 6 2 LLAVaLWLCV* 201 50 KDR 137 2 YITEnKNKTV* 180 51 KDR 1035 2 LLSEkNWKI*2 167 52 KDR 4 KVLLaVALWL* 133 2 53 CEA 588*1 DVLYGPDTPI* 0,25 2 *1 Tanaka H et al.: Póster apresentado no AACR 2001 (Encontro Anual de 2001 da American Association for Câncer Research) *2 os péptidos estão especificados a titulo meramente ilustrativo [Exemplo 7] Determinação de péptidos epitopos que imobilizam HLA-A* 02 01

Induziram-se CTLs através de um processo de vacinação, utilizando os 16 tipos de péptidos 9-mer e 10-mer (SEQ ID No: 26 A 41) previstos no Exemplo 6 em murganhos transgénicos que expressam antigénios HLA (A0201) humanos (Hum. Immunol. 2000 Aug.; 61(8):764-79 Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLAA*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T (H) response., BenMohamed L., Krishnan R., Longmate J., Auge C., Low L., Primus J., and Diamond DJ.). CLEA Japão, Inc. forneceu murganhos BALB/C(H-2d) de seis a oito semanas. Os murganhos transgénicos A2/Kb (TGM) foram fornecidos por F. Jim Primus, Ph. D. do Vanderbilt-Ingram Câncer Center. As células T2 [células TAP (Transportador associado ao Processamento de Antigénios)-deficientes e HLA- 32 -A*0201-positivas)] foram fornecidas pelo Prof. H. Shiku do Third Department of Internai Medicine da Mie University. A medula óssea foi colhida no fémur e na tibia dos murganhos, tendo-se eliminado os linfócitos e os granulócitos utilizando anticorpos anti-CD4, CD8, Gr-1 (Beckton-Dickinson) , anticorpo anti-B220 (Bioscience) e complemento de coelho (PeL-Freez). As células obtidas cultivaram-se em uma placa de 6 cavidades. As células suspensas separaram-se no dia seguinte ao da cultura com meio RPMI1640 (Invitrogen) suplementado com 10% de FBS (Fetal Bovine Serum) em uma outra placa de 6 cavidades, a que se adicionaram 1 000 U/ml de GM-CSF (Factor Estimulante de Colónias de Macrófagos e de Granulócitos) de murganho (fornecido por Kirin Brewery) e 1 000 U/ml de IL-4 de murganho (PEPRO TECHO). Três dias depois, substituiu-se metade do meio mencionado antes, e outros dois dias mais tarde, cultivaram-se as células durante 20 horas em 10 pg/ml de OK-432. As células suspensas resultantes utilizaram-se como DCs. Fizeram-se reagir as DCs com anticorpos anti-Classe II e CD40 marcados com FITC (Isotiocianato de fluoresceina) e anticorpos anti-Classe I, CDllc, CD80, e CD86 marcados com PE (Corante fluorescente vermelho) (todos fornecidos por Beckton-Dickinson), e confirmaram-se serem DCs por análise dos antigénios de superfície em um citómetro de fluxo FACSCalibur (Beckton--Dickinson) utilizando o software Cell-Quest.

Seguidamente, misturaram-se 100 pg de cada péptido, 140 pg do péptido auxiliar ("helper") HbcAgl20-140, e 100 pl de IFA [Incomplete Freund's Adjuvant (Adjuvante de Freund incompleto)] (200 pl no total). A mistura administrou-se por via subcutânea no abdómen direito no dia 0, e no abdómen esquerdo no dia 11. No dia 21 recolheram-se os baços dos 33 murganhos vacinados, removeram-se os eritrócitos provocando hemólise mediante a aplicação de tampão de lise de eritrócitos (Sigma), e utilizou-se uma parte dessas células como células que respondem (responder cells) a um ensaio ELISPOT para detectar a presença de uma citocina especifica chamada interferon-gama (IFN-γ). Colocaram-se as células remanescentes em uma placa de 24 cavidades (Corning) na concentração de 6xl06 células/cavidade com células alimentadoras (Feeder cells) na razão de 3:1, e estimularam--se de novo. Cinco dias mais tarde avaliou-se a citotoxicidade. Os esplenócitos sem eritrócitos, que derivaram de murganhos singénicos, cultivaram-se durante três dias na presença de 25 pg/ml de lipopolissacáridos (LPS) para se utilizarem como células alimentadoras (feeder cells).

Nesse Exemplo, utilizou-se o método de ELISPOT para detectar a presença de uma citocina especifica chamada interferon-gama (IFN-γ) de modo a avaliar o poder de induzir ("inducibility") CTLs de acordo com as manchas exibidas pelas células produtoras de IFN-γ. Durante a noite, tratou-se à temperatura de 4 °C uma placa MAHA S45 (Millipore) de selecção múltipla com 96 cavidades e fundo plano com anticorpo monoclonal anti-IFN-γ de murganho (Pharmingen). No dia seguinte, lavou-se a placa com PBS (Soro fisiológico tamponado com um fosfato) contendo 0,05% de Tween 20, depois do que reagiu com um tampão bloqueador à temperatura ambiente durante duas horas. Seguidamente, adicionaram-se a cada cavidade células T2 pulsadas por péptidos e células T2 não pulsadas na concentração de 105 células/100 μΐ. A cada cavidade adicionaram-se ainda esplenócitos de murganhos vacinados em um máximo de 4xl06 células/100 μΐ (200 μΐ no total), e cultivaram-se durante a noite à temperatura de 37 °C. No dia seguinte, lavou-se cada uma das cavidades, e fez- 34 -se reagir durante duas horas com anticorpos murinos anti--IFN-γ de murganho biotinilados (Pharmingen). Após lavagem perfeita da placa, adicionou-se Extravidin a cada cavidade e fez-se reagir à temperatura ambiente durante duas horas. Após lavagem, adicionou-se substracto conjugado com fosfatase alcalina (BIO-RAD) às cavidades, que se conservaram em repouso durante cinco minutos à temperatura ambiente. As manchas azuis resultantes da produção de IFN-γ (interferão--gama) avaliaram-se utilizando o sistema KS ELISPOT RELEASE, a última versão do KS ELISPOT COMPACT (Cari Zeiss).

As manchas azuis especificas determinaram-se segundo a fórmula:

Mancha azul especifica=(TISI(+)SPOT-TISI(-)SPOT)

As que satisfizeram a condição seguinte consideraram-se efectivas: TISI(+)SPOT/TISI(-)SPOT > 2

Como resultado, obtiveram-se cinco tipos de péptidos epitopos , SEQ ID No: 29 (posição de iniciação do aminoácido KDR775), SEQ ID No: 30 ( KDR773), SEQ ID No: 33 (KDR772), SEQ ID No: 34 C KDR1328), e SEQ ID O 0 (KDR190 ) por ensaio ELISPOT para IFN-γ (Quadro 5) . Quadro 5 Análise ELISPOT ANÁLISE ELISPOT x 40 (SCF) SEQ INICIAÇÃO POSIÇÃO AFINIDADE MURGANHO 1 MURGANHO 2 ID SEQUÊNCIA DE Pep(+) Pep(-) Pep(+) Pep(-) No: DE AA LIGAÇÃO 26 KDR 1093 VLLWEIFSL*2 1792 5 8 7 1 41 KDR 1094 LLWEIFSLGA*2 1092 0 0 0 0 27 KDR 633 SLQDQGDYV*2 769 0 0 0 0 28 KDR 5 VLLAVALWL*2 739 6 0 7 3 29 KDR 775 AMFFWLLLV 427 95 32 322 17 30 KDR 773 VLAMFFWLL 270 171 6 193 1 31 KDR 1034 ILLSEKNW*2 179 0 0 0 0 35 32 KDR 604 KNLDTLWKL*2 128 0 7 0 0 33 KDR 772 AVLAMFFWL 113 88 19 143 31 34 KDR 1328 ELIEIGVQT 107 0 0 81 5 35 KDR 698 IMWFKDNET*2 76 0 0 0 0 36 KDR 608 TLWELNATM*2 41 0 0 0 0 37 KDR 491 FQGGNKIEV*2 32 0 0 0 0 38 KDR 435 YQYGTTQTL*2 32 0 0 0 0 39 KDR 505 ALIEGKNKT*2 31 0 0 0 0 40 KDR 190 YMISYAGMV 30 122 6 33 11 53 CEA5 588*1 DVLYGPDTPI*2 0,25 229 2 230 6 *1 Tanaka H et al. : Póster apresentado no AACR 2001 (Encontro Anual de 2001 da American

Association for Câncer Research) *2 os péptidos são apresentados a titulo meramente ilustrativo.

[Exemplo 8] Confirmação do efeito antitumoral in vivo -1

Colheu-se medula óssea de murganhos machos BALB/c com seis a oito semanas (CLEA Japan, Inc.) com aquele mesmo motivo âncora como o antigénio HLA-A2402 humano. Como no Exemplo 7, adicionaram-se GM-CSF (Kirin Brewery) (1 000 U/ml) e IL-4 (Genzyme) (1 000 U/ml) à medula óssea e cultivaram-se para preparar células dendriticas. As células dendriticas foram pulsadas pelo péptido de SEQ ID No: 5 (posição de iniciação do aminoácido KDR189) e administradas depois (lxlO6 células/murganho) duas vezes a nove murganhos BALB/c no quadrante inferior direito, com um intervalo de sete dias. Sete dias mais tarde, inoculou-se uma linha de células de cancro do cólon (5xl05 células), Colon 26 (Taiho

Pharmaceutical), nos abdómenes direitos dos murganhos, e examinaram-se a sobrevivência e o desenvolvimento tumoral nos murganhos.

Primeiro, analisou-se a expressão de KDR por RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) , como indicado na Fig. 3, para confirmar que KDR não foi expresso unicamente em células Colon 26, mas também nos tecidos tumorais de murganhos inoculados com Colon 26. Mais 36 especificamente, confirmou-se que os vasos tumorais apareceram em tecidos tumorais, e formaram o tumor. A Fig. 3 mostra a curva de sobrevivência de murganhos inoculados com Colon 26. Trinta e cinco dias depois da inoculação do tumor, dois dos nove murganhos sobreviveram quando se administrou HBSS [Hank's Balanced Salt Solution (Solução Salina Equilibrada de Hank)] individualmente (100 μΐ) como um controlo; cinco dos nove murganhos sobreviveram quando inoculados com células dendriticas que não foram pulsadas por péptidos; e todos os nove murganhos sobreviveram quando inoculados com células dendriticas pulsadas pelo péptido de SEQ ID No: 5. A Fig. 4 mostra o efeito sobre o aumento de tumores derivados de Colon 26 em murganhos. Em comparação com o controlo, observaram-se efeitos supressores sobre o desenvolvimento tumoral quando se inocularam células dendriticas, e observaram-se impressionantes efeitos supressores quando se inocularam células dendriticas pulsadas pelo péptido de SEQ ID No: 5.

[Exemplo 9] Pesquisas de homologia relativas aos péptidos de acordo com a presente invenção

As pesquisas de homologia relativas aos péptidos de acordo com a presente invenção (SEQ ID No: 2 (posição de iniciação do aminoácido KDR1318), SEQ ID No: 3 (KDR220), SEQ ID No: 5 (KDR189), SEQ ID No: 8 (KDR169), SEQ ID No: 11 (KDR826), SEQ ID No: 30 (KDR773), e SEQ ID No: 40 (KDR190))

realizaram-se utilizando o programa BLAST (http://www.ncbl.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi). Não se observaram péptidos com uma sequência completamente idêntica 37 a qualquer um desses péptidos (Quadro 6) . 0 péptido 9-mer (KDR169) de SEQ ID No: 8 capaz de induzir acentuadamente a actividade de CTLs no Exemplo 4 apresentava apenas uma sequência contendo dois malpareamentos (homologia 11,8%), e duas sequências contendo três malpareamentos (homologia 66,7%). 0 péptido de SEQ ID No: 5 (KDR189) , cujo acentuado efeito anti-tumoral in vivo foi observado no Exemplo 8, apresentava apenas uma sequência contendo três malpareamentos (homologia 66,7%).

Quadro 6 Análise de homologia utilizando o programa BLAST (http:// WWW o I icbl.nl: m.nih. gov/bl ast/bl .ast.cqi ) KDR169 KDR189 KDR826 KDR220 KDR1318 KDR773 KDR190 IDENTIDADE (9/9) 0 0 0 0 0 0 0 IDENTIDADE (8/9) 0 0 3 0 0 0 0 IDENTIDADE (7/9) 1 0 2 0 2 2 0 IDENTIDADE (6/9) 2 1 - 0 - 2 0 [Exemplo 10] Confirmação do efeito anti-tumoral in vivo - 2

Colheu-se medula óssea em murganhos transgénicos A2/Kb (TGM) machos com seis a oito semanas que expressam HLA-A0201 humanos. Como no Exemplo 8, adicionaram-se à medula óssea GM--CSF (Kirin Brewery) (1 000 U/ml) e IL-4 (Genzyme) (1 000 U/ml) e procedeu-se depois à cultura para preparar células dendriticas. As células dendriticas foram pulsadas pelo péptido de SEQ ID No: 30 (posição de iniciação do aminoácido KDR773), e administradas (lxlO6 células/murganho) duas vezes no quadrante inferior esquerdo de doze murganhos transgénicos A2Kb, com um intervalo de sete dias. Sete dias mais tarde, inocularam-se (1X106 células) células de melanoma B16 (ATCC) nos abdómenes direitos dos murganhos, e examinaram-se a sobrevivência e o crescimento tumoral nos murganhos. 38 A Fig. 5 mostra a taxa de sobrevivência de murganhos inoculados com BI6. Trinta e cinco dias depois da inoculação tumoral, oito dos doze murganhos sobreviveram quando se lhes administraram 100 μΐ de HBSS individualmente como controlo; onze dos doze murganhos sobreviveram quando inoculados com células dendriticas que não foram pulsadas por péptidos; e todos os doze murganhos sobreviveram quando inoculados com células dendriticas pulsadas por péptidos de SEQ ID No: 30. A Fig. 6 mostra o efeito sobre o crescimento em murganhos de tumores derivados de murganhos BI 6. Em comparação com o controlo, observaram-se efeitos supressores contra o crescimento tumoral quando se realiza a inoculação com células dendriticas, e observaram-se acentuados efeitos supressores a partir da inoculação de células dendriticas pulsadas pelo péptido de SEQ ID No: 30.

[Exemplo 11] Actividade citotóxica contra células que de um modo forçado expressam KDR

Utilizando adenovirus, o péptido KDR (ver, J. Biol. Chem. 1994 Oct 28; 269(43): 26988-95) foi expresso de um modo forçado na estirpe HT29 de cancro de cólon humano HLA-A24-positiva (ATCC), de acordo com o processo descrito por Miyake, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 93, 1320-1324 (1996). Mais especificamente, com base no titulo determinado mediante ensaio em placa de células 293 humanas, infectaram--se as células em uma situação de multiplicidade especifica. Plaquearam-se as células HT29 a uma densidade celular de 105 células em uma placa de 60 mm, e incubaram-se durante 24 horas. No dia seguinte, separou-se o meio e substituiu-se por 200 μΐ de vírus continuamente diluídos com meio recente. Incubaram-se as células durante uma hora à temperatura de 37 39 °C, e adicionou-se depois o meio de crescimento às células, que se cultivaram durante 48 horas para se utilizarem como células-alvo. A estirpe HT29 HLA-A24-positiva, forçada por adenovirus para expressar EGPF (ver, Leukemia 1999 Apr; 13(4):605-13), utilizou-se como controlo. Estirpes HT29 que de um modo forçado expressam KDR e EGPF, respectivamente, podem apresentar eventualmente péptidos parciais de cada proteína sobre a sua respectiva superfície celular.

Utilizando clones C29-169 de CTLs, induzidos pelo péptido de SEQ ID No: 8 (posição de iniciação do aminoácido KDR169), como descrito no Exemplo 3, que se liga aos antigénios HLA-A24, avaliou-se o efeito citotóxico sobre células HT29 HLA-A24-positivas forçadas a expressar KDR realizando um ensaio de libertação de crómio. Os resultados estão apresentados na Fig. 7.

Avaliou-se a actividade citotóxica realizando um ensaio de libertação de 51Cr durante quatro horas. Cultivaram-se as células-alvo em uma placa de 6 cavidades em uma concentração de lxlO6 células/cavidade durante 24 horas, infectadas com adenovirus nos quais se inseriu KDR ou EGFP (Ad-KDR ou Ad--EGFP) a 50 MOI, e utilizaram-se decorridas 48 horas. Marcaram-se as células-alvo com 100 pCi de Na251Cr04 à temperatura de 37 °C durante uma hora, e lavaram-se três vezes com RPMI1640. As células-alvo (lxlO4 células/100 μΐ) e 100 μΐ de células efectoras em diferentes concentrações adicionaram-se (200 μΐ no total) a uma placa microtituladora com 96 cavidades em forma de U (Corning), e cultivaram-se em uma incubadora de C02 à temperatura de 37 °C durante quatro horas. Concluída a cultura, separaram-se 100 μΐ de sobrenadante de cada uma das cavidades e avaliaram-se 40 utilizando um contador γ para calcular a citotoxicidade, como no Exemplo 2 pelo mesmo método.

Como resultado, conforme se mostra na Fig. 7, clones C29-169 de CTLs exibiram efeito citotóxico notavelmente elevado relativamente a estirpes HT29 HLA-A24-positivas que de um modo forçado expressam KDR, em comparação com o relacionado com as células que de um modo forçado expressam EGFP.

[Exemplo 12] Actividade citotóxica contra células que de um modo endógeno expressam KDR 0 efeito citotóxico dos clones C29-169 de CTLs descritos no Exemplo 3, contra a estirpe KT5 de HUVEC, células endoteliais vasculares umbilicais humanas HLA-A24-positivas que de um modo endógeno expressam KDR, examinou-se utilizando a estirpe HUVEC KDR-positiva e HLA-A24-negativa, P8, como controlo. Essas células apresentam péptidos parciais de KDR sobre a sua superfície celular. A actividade citotóxica avaliou-se realizando um ensaio de libertação de 51Cr de quatro horas. Marcaram-se as células-alvo com 100 pCi de Na251Cr04 à temperatura de 37 °C durante uma hora, lavaram-se depois três vezes com RPMI1640. Células-alvo (lxlO4 células/100 μΐ) e 100 μΐ de células efectoras em diferentes concentrações adicionaram-se (200 μΐ no total) a uma placa microtituladora de 96 cavidades em forma de U (Corning) , e cultivaram-se em uma incubadora de C02 à temperatura de 37 °C durante quatro horas. Concluída a cultura, separaram-se 100 μΐ de sobrenadante de cada uma das cavidades e avaliaram-se utilizando um contador γ para 41 calcular a citotoxicidade como no Exemplo 2 pelo mesmo método.

Como é evidente a partir dos resultados da Fig. 8, clones C29-169 de CTLs exibiram efeito citotóxico contra HUVEC HLA-A24-positivas que de um modo endógeno expressam KDR, e demonstraram fraco efeito citotóxico contra HUVEC HLA--A24-negativas.

[Exemplo 13] Estabelecimento de clones de CTLs utilizando péptidos de ligação aos HLA-A0201

Utilizando o péptido de SEQ ID No: 40 (posição de iniciação do aminoácido KDR190), o péptido KDR773-2L (SEQ ID No: 54) no qual o segundo aminoácido do N-terminal no péptido de SEQ ID No: 30 (KDR773) foi convertido em leucina, o péptido de SEQ ID No: 29 (KDR775), o péptido de SEQ ID No: 34 (KDR1328), e o péptido de SEQ ID No: 33 (KDR772), que se ligam aos antigénios HLA-A0201 e que de acordo com a análise ELISPOT do Exemplo 7, foram indicados como sendo eficazes, obtiveram-se como no Exemplo 3 dois tipos (KWC14-190 e KWC65--190), quatro tipos (KWC44-773-2L, KWC7 6-773-2L, KWC129- 773-2L, e KWC134-773-2L), dois tipos (KWC81-775 e KWC85-775), doze tipos (KWC16, KWC21, KWC22, KWC47, KWC51, KWC108, KWC117, KWC132, KWC151, KWC153, KWC156, e KWC159) , e um tipo (KWC72-772) de clones de CTLs, respectivamente. As respectivas citotoxicidades estão apresentadas no Quadro 7.

Quadro 7 ACTIVIDADE CITOTÓXICA x2Õ x2 NOME DO CLONE Pep(+) Pep(-) Pep(+) Pep(-) KWC14-190 43% 0% 9% 0% KWC65-190 83% 0% 27% 0% KWC44-773-2L 87% 0% 64% 0% 42 KWC7 6-7 73-2L 83% 2% 68% 1% KWC12 9-7 7 3-2L 89% 0% 82% 1% KWC134-7 7 3-2L 89% 2% 54% 2% KWC81-775 86% 0% 64% 0% KWC85-775 90% 0% 63% 0% KWC16 95% 0% 85% 0% KWC21 100% 0% 91% 0% KWC22 93% 0% 77% 0% KWC47 109% 2% 87% 1% KWC51 101% 0% 93% 1% KWC108 71% 2% 23% 2% KWC117 83% 0% 42% 0% KWC132 102% 0% 55% 0% KWC151 102% 0% 101% 0% KWC153 47% 0% 18% 0% KWC156 64% 0% 23% 0% KWC159 93% 0% 86% 0% KWC72-772 101% 0% 67% 0%

Como é evidente a partir dos resultados do Quadro 7, os péptidos de SEQ ID Nos: 29, 33, 34, e 40, bem como o péptido de SEQ ID No: 54, na qual o segundo aminoácido do N-terminal do péptido de SEQ ID No: 30 é a leucina, podem todos induzir CTLs com grande citotoxicidade, tendo-se assim demonstrado serem eficazes como péptidos epitopos.

[Exemplo 14] À estirpe T2 HLA-A0201-positiva adicionou-se o péptido de SEQ ID No: 29 (posição de iniciação do aminoácido KDR775) para produzir uma célula-alvo. Mediante a utilização dessa célula o efeito citotóxico do clone de CTLs (KDR C85-775 (KWC85-775) ) obtido a partir do péptido de SEQ ID No: 29 no Exemplo 13 foi examinado por ensaio de libertação do crómio. 43

Nos resultados, apresentados na Fig. 9, o clone C85-775 de CTLs (KWC85-775) mostrou inequivocamente um efeito citotóxico contra células HLA-A0201-positivas que apresentam o péptido de SEQ ID No: 29. Em contraste, observou-se ausência absoluta de efeito citotóxico contra células de controlo que não apresentam o péptido de SEQ ID No: 29.

[Exemplo 15] 0 efeito citotóxico do clone (KDR C85-773(KWC85-775)) de CTLs contra a linha de células de carcinoma hepatocelular HePG2 HLA-A0201-positivas, forçadas por adenovirus para expressar KDR, foi examinado realizando um ensaio de libertação de crómio. A HePG2 HLA-A0201-positivas forçadas para expressar EGFP utilizou-se como controlo.

Nos resultados, apresentados na Fig. 10, o clone de KDR C85-775(KWC85-775) apresentou efeito citotóxico acentuadamente elevado contra células HLA-A0201-positivas que apresentam péptidos KDR sobre a superfície, em comparação com a actividade contra células que apresentam o péptido EGFP.

[Exemplo 16] À estirpe T2 HLA-A0201-positiva adicionou-se o péptido de SEQ ID No: 34 (posição de iniciação do aminoácido KDR1328) para produzir células-alvo. Utilizando essas células, examinou-se o efeito citotóxico do clone (KDR C51-1328 (KWC51) ) de CTLs obtido a partir do péptido de SEQ ID No 34 no Exemplo 13 realizando um ensaio de libertação de crómio. 44

Nos resultados, apresentados na Fig. 11, o clone KDR C51-1328(KWC51) de CTLs demonstrou inequivocamente um efeito citotóxico contra células HLA-A0201-positivas que apresentam o péptido de SEQ ID No: 34. Em contraste, não se observou qualquer efeito citotóxico contra células controlo que não apresentam o péptido de SEQ ID No: 34.

[Exemplo 17] 0 efeito citotóxico do clone (KDR C51-1328 (KWC51)) de CTLs contra a linha de células de carcinoma hepatocelular HePG2 HLA-A0201-positivas, forçadas por adenovirus para expressar KDR, foi examinado realizando um ensaio de libertação de crómio. A HePG2 HLA-A0201-positivas forçadas para expressar EGFP utilizou-se como controlo.

Nos resultados, apresentados na Fig. 12, o clone KDR C51-1328 (KWC51) de CTLs apresentou citotoxicidade acentuadamente elevada contra células HLA-A0201-positivas que apresentam péptidos KDR sobre a superfície, em comparação com a actividade contra células que apresentam o péptido EGFP.

[Exemplo 18] 0 péptido de SEQ ID No: 54 (KDR773-2L), em que o segundo péptido de SEQ ID No: 30 é convertido em leucina, adicionou--se à estirpe T2 HLA-A0201-positiva para gerar células-alvo. Utilizando essas células, examinou-se o efeito citotóxico do clone (KDR C44-773-2L(KWC44-773-2L)) de CTLs obtido a partir do péptido de SEQ ID No: 34 no Exemplo 13 realizando um 45 ensaio de libertação de crómio. A Fig. 13 mostra os resultados.

Nos resultados, apresentados na Fig. 13, o clone KDR C44-773-2L(KWC44-773-2L) de CTLs apresentou inequivocamente um efeito citotóxico contra células HLA-A0201-positivas que apresentam KDR773-2L. Em contraste, não se observou qualquer efeito citotóxico contra células controlo que não apresentam KDR773-2L.

[Exemplo 19] 0 efeito citotóxico do clone (KDR C44-773-2L(KWC44-773--2L) de CTLs obtido a partir do péptido de SEQ ID No: 54 (KDR773-2L) , em que o segundo péptido de SEQ ID No: 30 se converteu em leucina, examinou-se realizando um ensaio de libertação de crómio que utiliza a estirpe T2 HLA-A0201-positiva pulsada pelo péptido não modificado de SEQ ID No: 30 (posição de iniciação do aminoácido KDR773) como a célula-al vo .

Nos resultados, apresentados na Fig. 14, clones de CTLs obtidos por estimulação com o péptido modificado poderá identificar e lesar o péptido pós-modificação.

[Exemplo 20] O efeito citotóxico do clone (KDR C44-773-2L(KWC44-773--2L)) de CTLs contra a linha de células de carcinoma hepatocelular HePG2 HLA-A0201-positiva, forçada por adenovirus para expressar KDR, examinou-se realizando um ensaio de libertação de crómio. A HePG2 HLA-A0201-positivas forçada a expressar EGFP utilizou-se como controlo. 46

Nos resultados, apresentados na Fig. 15, o clone KDR C44-773-2L(KWC44-773-2L) de CTLs apresentou efeito citotóxico acentuadamente elevado contra células HLA-A0201-positivas que apresentam péptidos KDR sobre a superfície, em comparação com a actividade contra células que apresentam o péptido EGFP.

[Exemplo 21]

Os inventores da presente invenção averiguaram se diversos anticorpos podem bloquear o efeito citotóxico do clone (KDR C51-1328(KWC51)) de CTLs, obtido a partir do péptido de SEQ ID No: 34, contra a linha de células de carcinoma hepatocelular HePG2 A0201-positivas, forçadas por adenovírus para expressarem KDR.

Nos resultados, apresentados na Fig. 16, a função citotóxica foi inibida pelo anticorpo anti-HLA de Classe I contra antigénios HLA apresentados pelas células-alvo, e anticorpo anti-CD8 contra moléculas CD8 utilizado como marcador de células T citotóxicas.

[Exemplo 22] Exame da actividade inibidora da angiogénese realizando um ensaio DAS (saco de ar dorsal) A efectiva actividade inibidora da angiogénese pelos péptidos epitopos foi avaliada em murganhos utilizando um ensaio DAS (ver, Clinicai Câncer Research, vol. 5, 2185-2191, Agosto de 1999; Câncer Research 62, 6116-6123, November 1, 2002).

Especificamente, fixou-se um filtro de membrana a ambos os lados do circuito da cavidade ("chamber ring"), e 47 esterilizou-se com óxido de etileno. Prepararam-se células de melanoma B16 na concentração de 5xl05 células/0,15 ml, e injectaram-se na câmara. Imobilizaram-se murganhos (murganhos transgénicos A2/kb (derivados de B16)) com a porção frontal da cabeça para baixo, originando-se um saco de ar injectando, mediante a utilização de uma seringa, 5 a 10 ml de ar na hipoderme dorsal murina. Fez-se uma incisão de aproximadamente 1 cm na parte inferior do saco. O circuito da cavidade, cheio com solução de células em suspensão, foi implantado na hipoderme dorsal, e suturou-se a pele utilizando um grampeador ("stapler") da pele. Seis dias após a implantação, a pele do murganho foi descorticada simultaneamente com a câmara, fixada sob uma forma distendida, e marcada com um círculo de borracha preto para, utilizando um microscópio, observar os vasos sanguíneos recém-formados. Esses vasos sanguíneos recém-formados pelos factores angiogénicos e libertados pelas células tumorais malignas dispõem-se de um modo característico em zigue-zague, sendo diferentes sob o ponto de vista morfológico dos vasos sanguíneos iniciais que ocorrem naturalmente. Consequentemente, os vasos sanguíneos de 3 mm ou maiores no interior do círculo de borracha e dispondo-se em ziguezague definiram-se como vasos sanguíneos recém-formados, e avaliaram-se utilizando um índice angiogénico (AI). Os Ais apreciaram-se relativamente a seis níveis, de 0 a 5 de acordo com o número de vasos sanguíneos tortuosos. Verificou-se serem cinco os com cinco ou mais vasos sanguíneos tortuosos A vacinação realizou-se 14 dias antes da implantação da câmara, e repetiu-se uma semana depois (um total de duas vezes) mediante a injecção de, respectivamente, 5xl04 células de HBSS, DC individualmente, ou DC pulsadas por péptidos, na 48 veia da cauda. Os resultados estão apresentados na Fig. 17 e no Quadro 8, que se mostram seguidamente.

Quadro 8 Efeito do ensaio DAS INOCULAÇÃO ESTIMULAÇÃO C/ PÉPTIDOS ÍNDICE ANGIOGÉNICO (AI) P VEÍCULO - ( 0,7±0,2) HBSS - ( 4,5±0,2) DC NENHUMA (4,2±0,4) DC KDR190 (SEQ ID No: 40) (3,6±0,5) 0,3453 DC KDR7 72 (SEQ ID No: 33) (2,8±0,5) 0,0346 DC KDR773 (SEQ ID No: 30) (2,2±0,7) 0,0034 DC KDR773-2L (SEQ ID No: 54) (1,3±0,8) 0,0001 DC KDR775 (SEQ ID No:29) (2,2±0,5) 0,0007 DC KDR1084 (SEQ ID No: 46) (1,7±0,3) < 0, 0001 A Fig. 17 e o Quadro 8 mostram que a formação de vasos sanguíneos tortuosos foi nitidamente suprimida nos grupos vacinados com DCs pulsadas pelos péptidos de SEQ ID No: 40 (posição de iniciação do aminoácido KDR190), SEQ ID No: 33 (KDR7 72) , SEQ ID No: 30 (KDR773), SEQ ID No: 54 (KDR773-2L) , SEQ ID No: 29 (KDR775) , e SEQ ID No: 46 (KDR1084), respectivamente, quando se comparou com o grupo ao qual se administraram DCs individualmente. Isto indicou um efeito inibidor da angiogénese significativo sob o ponto de vista estatístico.

Em murganhos vacinados analisaram-se a cicatrização de feridas e a fertilidade de modo a observar os efeitos adversos da vacinação utilizando esses péptidos epitopos na angiogénese fisiológica normal. Contudo, nos murganhos vacinados não se observaram efeitos adversos significativos. Além disso, utilizando clones de CTLs que reconhecem péptidos KDR, ensaiou-se in vitro a citotoxicidade contra células endoteliais não proliferativas ou proliferativas para estudar os efeitos adversos no homem. Como resultado, esses clones 49 exibiram uma actividade mais acentuada contra as células endoteliais proliferativas do que contra as células endoteliais não proliferativas.

[Exemplo 23]

Utilizando murganhos transgénicos A2/Kb que expressam HLA-A0201 humanos, misturou-se cada um dos péptidos de SEQ ID No: 30 (posição de iniciação do aminoácido KDR773) e de SEQ ID No: 34 (KDR1084) com adjuvante de Freund incompleto, depois do que se administraram no 3o e 13° dias a murganhos portadores de tumores implantados com estirpe MC38 de cancro de cólon para assim se identificarem alterações no volume tumoral. 0 efeito anti-tumoral in vivo de um modelo terapêutico de péptido epitopo imobilizado em HLA-A*0201 (KDR773) foi avaliado utilizando a área do tumor, aplicando um processo de vacinação igual ao do Exemplo 22. O resultado, como é evidente de acordo com a Fig. 18, confirma um significativo efeito de supressão do crescimento tumoral por vacinação com os péptidos de SEQ ID No: 30 e de SEQ ID No: 34.

[Exemplo 24] (posição de iniciação do estirpe T2 HLA-A0201-posi-Utilizando essas células, O péptido de SEQ ID No: 40 aminoácido KDR190) foi acrescido à tiva para produzir células-alvo. examinou-se o efeito citotóxico do clone de CTLs (KWC65-190) 50 obtido a partir do péptido de SEQ ID No: 40 do Exemplo 13 utilizando um ensaio de libertação de crómio.

Nos resultados, apresentados na Fig. 19, o clone de CTLs KWC65-190 demonstrou inequivocamente um efeito citotóxico contra células HLA-A0201-positivas que apresentam o péptido de SEQ ID No: 40. Em contraste, não se observou absolutamente nenhum efeito citotóxico contra células de controlo que não apresentam o péptido de SEQ ID No: 40.

[Exemplo 25] O péptido de SEQ ID No: 33 (posição de iniciação do aminoácido KDR772) foi acrescido à estirpe T2 HLA-A0201-positiva para produzir células-alvo. Utilizando essas células, examinou-se o efeito citotóxico do clone de CTLs (KWC72-772) obtido a partir do péptido de SEQ ID No: 33 do Exemplo 13 utilizando um ensaio de libertação de crómio.

Nos resultados, apresentados na Fig. 20, o clone de CTLs KWC72-772 demonstrou inequivocamente um efeito citotóxico contra células HLA-A0201-positivas que apresentam o péptido de SEQ ID No: 33. Em contraste, não se observou absolutamente nenhum efeito citotóxico contra células de controlo que não apresentam o péptido de SEQ ID No: 33.

[Exemplo 26] O efeito citotóxico do clone de CTLs (KWC72-772) contra HePG, a linha de células de carcinoma hepatocelular, HLA--A0201-positivas, forçadas por adenovírus para expressar KDR, examinou-se por ensaio de libertação de crómio. HePG HLA- 51 -A0201-positivas forçadas a expressar EGFP utilizou-se como controlo.

Nos resultados, como se mostra na Fig. 21, o clone de CTLs KWC72-772 exibiu essencialmente elevado efeito citotóxico contra células HLA-A0201-positivas que apresentam péptidos KDR sobre a sua superfície, em comparação com a actividade contra células que apresentam o péptido EGFP.

[Exemplo 27]

Para produzir células-alvo os péptidos de SEQ ID No: 2 (posição de iniciação do aminoácido KDR1318), SEQ ID No: 3 (KDR22 0) , SEQ ID No: 5 (KDR189) , e SEQ ID No: 11 (KDR826) foram acrescentadas a A24-LCL estirpe de B-linfócitos humanos HLA-A24-positivos (HLA-A24/24, Takara Shuzo). Utilizando essas células, os efeitos citotóxicos de clones de CTLs, C7--1318, KWC46, C18-189, e C65-826, descritos no Exemplo 3, examinaram-se por ensaio de libertação de crómio.

Nos resultados, apresentados nas Figs 22 a 25, cada um dos clones de CTLs C7-1318, KWC46, C18-189, e C65-826 demonstrou inequivocamente um efeito citotóxico contra cada uma das células HLA-A24-positivas que apresentam os péptidos de SEQ ID No: 2, 3, 5, e 11, respectivamente. Em contraste, dificilmente qualquer ou absolutamente nenhum efeito citotóxico se observou contra cada uma das células de controlo, as quais não apresentam os péptidos.

[Exemplo 28]

Tal como para o Exemplo 11, examinaram-se os efeitos citotóxicos dos clones de CTLs, C7-1318, KWC46, C18-189, e 52 C65-826, descritos no Exemplo 3, contra a estirpe HT29 de cancro de cólon humano (ATCC) , forçada por adenovirus para expressar KDR, através de um ensaio de libertação de crómio. Como controlo utilizou-se a estirpe HT29 HLA-A24-positiva que de um modo forçado expressa EGFP.

Nos resultados, apresentados nas Figs. 26 a 29, todos os clones de CTLs, C7-1318, KWC46, C18-189, e C65-826, exibiram essencialmente elevado efeito citotóxico contra células HT29 HLA-A24-positivas que de um modo forçado expressam KDR, em comparação com a actividade contra células que de um modo forçado expressam EGFP.

[Exemplo 29]

Tal como para o Exemplo 22, avaliou-se a actividade inibidora da angiogénese de péptidos epitopos contra a resposta angiogénica induzida por células Cólon 26 em murganhos BALB/c realizando um ensaio DAS.

Como é evidente a partir dos resultados das Figs. 30 e 31, nos grupos vacinados com DCs pulsadas pelos péptidos de SEQ ID No: 5 (posição de iniciação do aminoácido KDR189) e de SEQ ID No: 11 (KDR826), respectivamente, a formação de vasos sanguíneos turtuosos foi inequivocamente suprimida quando em comparação com o grupo a que se administrou DCs individualmente. Isso indicou um efeito de supressão da angiogénese estatisticamente significativo.

[Exemplo 30]

A resposta dos CTLs contra cada um dos tipos dos seguintes péptidos epitopos foi investigada utilizando PBMC 53 de pacientes com cancro após estimulação com cada um dos péptidos: Péptidos de SEQ ID No: 8 (posição de iniciação do aminoácido KDR169), SEQ ID No: 5 (KDR189), SEQ ID No: 3 (KDR220), SEQ ID No: 11 (KDR826), e SEQ ID No: 17 (KDR1318), com elevada afinidade de ligação ao HLA-24; e péptidos de SEQ ID No: 40 (KDR190) , SEQ ID No: 33 (KDR772), SEQ ID No: 30 (KDR773), SEQ ID No: 29 (KDR775) , e SEQ ID No: 34 (KDR1328), com elevada afinidade de ligação aos HLA-A0201.

Utilizando o processo relatado por Maeda, Y et al., em Br. J. Câncer 87, 796-804 (2002), detectaram-se em PBMCs CTLs específicos de péptidos. Primeiro, incubaram-se PBMCs colhidas em doentes (lxlO5 células) com 10 pm de cada um dos péptidos em uma placa de 96 cavidades e fundo em forma de U contendo 200 μΐ de meio. 0 meio consistia em 45% de meio RPMI1640, 45% de meio AIM-V, 10% de FAB, 100 U/ml de interleucina 2 (IL-2), e 0,1 μΜ de solução MEM com aminoácidos não essenciais. Cada três dias, removeu-se metade do meio e substituiu-se por meio recente contendo o péptido correspondente (20 μΜ) . Após incubação durante doze dias, colheram-se células para avaliar a capacidade de produção de IFN-γ em resposta a cada um dos péptidos. Quando a quantidade de IFN-γ produzida pelas PBMCs estimuladas pelos péptidos em resposta a um péptido correspondente foi duas vezes ou mais do que a quantidade produzida em resposta ao péptido HIV de controlo, tal péptido em ensaio foi considerado positivo.

Esses resultados mostraram que em doentes com cancro do tipo HLA-A2 e HLA-A24 é produzido um precursor dos CTLs, tal como em um dador saudável (Quadro 9). Nesse quadro, os 54 doentes A, B, e C são doentes do tipo HLA-A24; e o doente D é um doente do tipo HLA-A02. Os doentes A e D são doentes com cancro do cólon; e os doentes B e C são doentes com melanoma. CMVs aplica-se a péptidos derivados de citomegalovirus utilizados como controlos positivos. Os péptidos com elevada afinidade de ligação a antigénios A-24 estão descritos em Kuzushima, K. et al., Blood 2001, 98(6):p 1872-1881, e semelhantes; e os péptidos com elevada afinidade de ligação a antigénios A-2 estão descritos em Solache, A. et al., J. of Immunol. 1999, 163(10); p 5512 - 5518, e semelhantes.

Quadro 9 Precursor de CTLs derivado de doente com cancro

Doente A Doente B Doente C Doente D Cavidades Positivas Cavidades Totais Cavidades Positivas Cavidades Totais Cavidades Positivas Cavidades Totais Cavidades Positivas Cavidades Totais CMV 1 32 1 24 0 16 CMV 5 20 KDR169 12 32 4 32 1 24 KDR190 3 24 KDR189 3 32 1 32 0 24 KDR772 3 24 KDR220 0 32 3 32 0 24 KDR773 1 24 KDR826 11 32 3 32 0 24 KDR775 2 24 KDR1318 0 32 9 32 1 24 KDR1328 0 24

Como no Exemplo 14 e similares, durante quatro horas realizou-se um ensaio convencional de libertação de 51Cr para estabelecer linhas de CTLs a partir de precursores de CTLs (Fig. 32) .

Aplicabilidade Industrial A presente invenção apresenta péptidos para utilização no tratamento ou na prevenção de tumores, que induzem células T citotóxicas através de células endoteliais de condução até ao alvo ("by targeting the endothelial cells") formadas em uma vasta série de tecidos tumorais, e que são extremamente eficazes como vacinas contra cancros. A presente invenção 55 apresenta também medicamentos para o tratamento e a prevenção de tumores, caso os medicamentos contenham esses péptidos. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC.

<120> KDR PEPTIDES AND VACCINES COMPRISING THE SAME <130> L1360 EP/2S3 <150> EP 03 79 5432.8 <151 >2003-09-12 <150> JP 2002-267285 <151> 2002-09-12 <150> JP 2003-62003 <151 > 2003-03-07 <150> JP 2003-167042 <151 > 2003-06-11 <160> 56 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 9

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Trp Tyr Lys Leu Giy Pro Gin Pro Leu 1 5 <210> 2 <211> 9

<212> PRT <213> Homo sapiens <400>2

Vai Tyr Ser Ser Glu Glu Ala Glu Leu 1 . 5

<210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>3 61y Tyr Arg lie Tyr Asp Vai Vai Leu 1 5 <210> 4 <211>9

<212> PRT <213> Homo sapiens 56 <400>4

Lys Phe Gly Asn Leu Ser Thr Tyr Leu 1 5 <210> 5 <211> 9

<212> PRT <213> Homo sapiens <400>5

Ser Tyr Met Ile Ser Tyr Ala Gly Het 1 5 <210>6 <211>9

<212> PRT <213> Homo sapiens <400>6

Glu Phe Pro Arg Asp Arg Leu Lys Leu 1 5 <210> 7 <211> 9

<212> PRT <213> Homo sapiens <400>7

Thr Phe Ser Glu Leu Vai Giu Bis Leu 1 S <210> 8 <211>9

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8

Arg Phe Vai Pro Asp Gly Asn Arg Ile 1 5 <210> 9 <211>9

<212> PRT <213> Homo sapiens <400>9

Ala Phe Gly Ser Gly Het Glu Ser Leu 1 5 57 <210> 10 <211>9

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10

Lys Asn Leu Asp Thr Leu Trp Lys Leu 1 5 <210> 11 <211> 9

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11

Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asp Arg Leu 1 5 <210> 12 <211> 9

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12

Asp Phe Leu Thr Leu Glu His Leu Ile 1 5

<210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221 > Source <223> /note ="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 13

Asp Tyr Vai Gly Ala Ile Pro Vai Asp Leu 15 10

<210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 58 <221 > Source <223> /note ="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 14

Ser Tyr Gin Tyr Gly Tbr Thr Gin Tftr Leu 1 S 10

<210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221 > Source <223> /note ="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 15

Asp Tyr Vai Arg Lys Gly Asp Ala Arg Leu 1 5 10

<210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221 > Source <223> /note ="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 16

Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu 15 10

<210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221 > Source <223> /note ="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 17

Vai Tyr Ser Ser Glu Glu Ala Glu Leu Leu 1 5 10 <210> 18 59

<211 > 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221 > Source <223> /note ="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 18

Leu Tyr Thr Cys Gin Ala Cys Ser Vai Leu 1 5 10

<210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221 > Source <223> /note ="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 19 fhr Tyr Leu Arg Ser Lys Àrg Asn Glu Phe 1 5. 10

<210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221 > Source <223> /note ="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 20

Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile *1.5 10 <210> 21

<211 > 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221 > Source <223> /note ="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 21 60

Vai Tyr Vai Gin Asp Tyr Arg Ser Pro Phe 1 5 10

<210> 22 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221 > Source <223> /note ="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 22

Asn Tyr Thr Vai Ile Leu Thr Asn Pro Ile 1 5 10

<210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221 > Source <223> /note =''Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 23

Phe Phe Trp Leu Leu Leu Vál Ile Ile Leu 1 5 10

<210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221 > Source <223> /note ="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 24

Ser Tyr Ala Gly Met Vai Phe Cys Glu Ala 15 10 <210> 25 <211> 9

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 61 61 Vai Ser Asn. Leu

Thr Tyr Ala Cys Phe 1 5 <210> 26 <211> 9

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26

Vai Leu Leu Trp Glu He Phe Ser Leu 1 5 <210> 27 <211> 9

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27

Ser Leu Gin Asp Gin Gly Asp Tyr Vai 1 5 <210> 28 <211> 9

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28

Vai Leu Leu Ala Vai Ala Leu Trp Leu 1 5 <210> 29 <211> 9

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29

Ala Met Phe Phe Trp Leu Leu Leu Vai 1 5 <210> 30 <211>9

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 62 62 Val Ile Ala Met 1

Phe Phe Trp Leu Leu 5 <210> 31 <211> 9

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31

Ile Leu Leu Ser Glu Lys Asn Val Val 1 S <210> 32 <211> 9

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32

Lys Asn Leu Asp Thr Leu Trp Lys Leu 1 5 <210> 33 <211> 9

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33

Ala Val Ile Ala Met Phe Phe Trp Leu 1 5 <210> 34 <211> 9

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34

Lys Leu Ile Glu Ile Gly Val Gin Thr 1 5 <210> 35 <211> 9

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 63 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Ile Met Trp Phê Lys Asp Asn Glu Thr 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Thr Leu Trp Lys Leu Asn Ala Thr Met 1 5 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Phe Gin Gly Gly Asn Lys Ile Glu Vai 1 5 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Tyr Gin Tyr Gly Thr Thr Gin Thr Leu *1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT Ala Leu 11a Glu Gly Lys Asn Lys Thr 1 5 <213> Homo sapiens <400> 40

Tyr Met Ile Ser Tyr Ala Gly Met Vai 1 5 64

<210> 41 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221 > Source <223> /note ="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 41

Leu Leu Trp Glu 11« Phe Ser Leu Gly Ala 1 5 10

<210> 42 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221 > Source <223> /note ="Description of Artificial Sequence : Synthetic peptides" <400> 42 vai Leu Leu Ala Vai Ala Leu Trp Leu Cys 1 5 10

<210> 43 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221 > Source <223> /note ="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 43

Leu Met Thr Lys Lvs Asn Ser Thr Phe Vai 1 '5 10

<210> 44 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221 > Source <223> /note ="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 44 65

Trp Leu Leu Leu Vai Ile He Leu Arg Thr 1 5 10

<210> 45 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221 > Source <223> /note ="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 45

Ais Leu He 6.1 u Gly Lys Asn Lys Thr Vai 1 5 10

<210> 46 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221 > Source <223> /note ="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 46

Ile <ãln Ser Asp Vai Trp Ser Phe Gly Vai 15 10

<210> 47 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221 > Source <223> /note ="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 47

Gly Leu Tyr Thr Cys Gin Ala Cys Ser Vai 1 5 10

<210> 48 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221 > Source <223> /note ="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 48 66

Leu Leu Leu Vai lie 1 5 lie Leu Arg Thr Vai 10

<210> 49 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221 > Source <223> /note ="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 49

Leu Leu Ala Vai Ala Leu Trp Lea Cys Vai 1 5 10

<210> 50 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221 > Source <223> /note ="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 50

Tyr Ils Thr Glu Asn Lys Asn Lys Thr Vai 15 10

<210> 51 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221 > Source <223> /note ="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 51

Leu Leu Ser Glu Lys Asn Vai Vai Lys lie 1 5 10 <210> 52

<211 > 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221 > Source <223> /note ="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" 67 <400> 52

Lys Vai Leu Leu Ais Vai Ala Leu Trp Leu 15 10 <210> 53 <211 > 10

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53

As p Vai Leu Tyr Gly Pr o Asp Thr Pr d 1.1. e 1 5 10

<210> 54 <211>9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221 > Source <223> /note ="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 54

Vai Leu Ala Met Phe Phe Trp Leu Leu 1 5

<210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> /note ="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 55 lie Leu Lys Glu Pro Vai His Gly Vai 1 5 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <213> Artificial Sequence <220> <221> Source <223> /note ="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 56 68

Arg Tyr Leu Ara Asp Gin Gin Leu Leu 1 ' 5

Lisboa, 15 de Dezembro de 2011.

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Nonapéptido ou decapéptido escolhido entre os péptidos constituídos pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID N° : 30, 29, 33, 34, 40, 46 ou 54 para utilização no tratamento ou na prevenção de tumores.

2. Nonapéptido escolhido entre os péptidos constituídos pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID N°: 2, 3, 5, 11, ou 12 para utilização no tratamento ou na prevenção de tumores.

3. Composição farmacêutica para utilização no tratamento e/ou na prevenção de tumores, composição farmacêutica essa constituída por um ou mais péptidos definidos na reivindicação 1. ou 2..

4. Vacina para utilização no tratamento ou na prevenção de tumores, vacina essa que compreende um péptido definido na reivindicação 1. ou 2. como um componente activo.

5. Vacina de acordo com a reivindicação 4., para utilização no tratamento ou na prevenção de tumores, a qual se utiliza para administração a um paciente cujo antigénio HLA é HLA-A02 ou HLA-A24.

6. Vacina de acordo com a reivindicação 4. ou 5., para utilização no tratamento ou na prevenção de tumores que se utiliza para reprimir o crescimento e/ou as metástases de tumores malignos. Lisboa, 15 de Dezembro de 2011.