ES2327334T3 - Metodo para mitigar la infestacion por plagas en plantas. - Google Patents

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Abstract

Un método para mitigar una infestación por plagas de plantas, comprendiendo dicho método a) identificar una secuencia de ADN de dicha plaga que sea crítica para su supervivencia, desarrollo, proliferación, b) clonar dicha secuencia de la etapa a) o un fragmento de la misma en un vector adecuado en una orientación respecto a un promotor o promotores, de modo que dicho promotor o promotores sea capaz de iniciar la transcripción de dicha secuencia de ADN en ARN o ARNbc tras la unión de un factor de transcripción apropiado a dicho promotor o promotores y c) introducir dicho vector en la planta en el que la plaga de plantas es una plaga de plantas que se alimenta de la planta.

Description

Método para mitigar la infestación por plagas en plantas.
La presente invención se refiere a la caracterización o identificación de la función de genes usando la inhibición por ARN bicatenario (ARNibc) y métodos de identificación del ADN responsable de la inducción de un fenotipo específico en una célula y un método de asignación de la función a secuencias de genes conocidas.
Se ha descrito recientemente en Nature Vol 391, págs. 806-811, Febrero 1998, que la introducción de ARN bicatenario en una célula da como resultado una interferencia potente y específica con la expresión de genes endógenos en la célula y siendo la interferencia sustancialmente más eficaz que proporcionar individualmente cualquier cadena de ARN como se propone en la tecnología antisentido. Se descubrió que esta reducción específica de la actividad del gen también sucedía en el helminto nematodo Caenorhabditis elegans (C. elegans) cuando se introducía el ARN en el genoma o en la cavidad corporal del helminto.
Los presentes inventores han utilizado esta técnica y la han aplicado adicionalmente para encontrar nuevos e ingeniosos métodos de asignación de funciones a genes o fragmentos de ADN que se han secuenciado en diversos proyectos, tales como, por ejemplo, el proyecto genoma humano, y a los que todavía hay que dar una función particular, y para usar en la identificación del ADN responsable de conferir un fenotipo particular.
El documento US 4.970.168 describe plantas transgénicas que expresan proteínas de cubierta del Virus X de la Patata y del Virus Y de la Patata, volviéndolas por lo tanto resistentes a la infección por virus.
Se puede citar el documento WO 99/53050 bajo el Artículo 54 (3) EPC solamente en la medida en la que el tema se describe en la solicitud generadora de prioridad US 09/056.767 presentada el 8 de abril de 1998. No se puede citar en términos de etapa inventiva. El documento WO 99/53050 describe métodos para obtener organismos resistentes a virus por suministro de células del organismo con un primer y segundo ADN quimérico. El primer ADN quimérico incluye una secuencia de nucleótidos sentido que se corresponde con la secuencia de un genoma viral. El segundo ADN quimérico incluye la secuencia de nucleótidos antisentido correspondiente, de modo que pueda producirse ARN bicatenario cuando se transcriben las regiones de ADN.
El documento EP 0616035 describe organismos que incorporan al menos dos genes diferentes con "acción inhibidora de patógenos" para producir organismos resistentes.
Gast (Nucleic Acids Research, Vol. 17, Nº 23 (1989)) describe el uso de ARN polimerasa T7 para transcripción in vitro.
La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas.
De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un método para mitigar una infestación por plagas de plantas, comprendiendo dicho método
a) identificar una secuencia de ADN de dicha plaga que es crítica para su supervivencia, desarrollo, proliferación,
b) clonar dicha secuencia de la etapa a) o un fragmento de la misma en un vector adecuado en una orientación respecto a un promotor o promotores, de modo que dicho promotor o promotores sea capaz de iniciar la transcripción de dicha secuencia de ADN en ARN o ARNbc tras la unión de un factor de transcripción apropiado a dicho promotor o promotores y
c) introducir dicho vector en la planta
en el que la plaga de plantas es una plaga de plantas que se alimenta de la planta.
Un método de identificación del ADN responsable de conferir un fenotipo en una célula puede comprender a) construir una genoteca de ADNc o genómico del ADN de dicha célula en una orientación en relación con el promotor (o promotores) capaz de promover la transcripción de dicho ADNc o ADN en ARN bicatenario (bc) tras la unión de un factor de transcripción apropiado a dicho promotor (o promotores), b) introducir dicha genoteca en una o más de dichas células que comprenden dicho factor de transcripción y c) identificar y aislar un fenotipo deseado de dicha célula que comprende dicha genoteca e identificar el fragmento de ADN o ADNc de dicha genoteca responsable de conferir dicho fenotipo.
La genoteca puede organizarse en combinaciones jerárquicas como se describe con más detalle en los ejemplos proporcionados, antes de la etapa b) tal como para incluir, por ejemplo, familias de genes.
Un método de asignación de función a una secuencia de ADN conocida puede comprender
a) identificar un homólogo (u homólogos) de dicho ADN en una célula, b) aislar el ADN homólogo (u homólogos) pertinente o un fragmento del mismo de dicha célula, c) clonar dicho homólogo o fragmento en un vector apropiado en una orientación con relación a un promotor (o promotores) capaz de promover la transcripción de ARNbc tras la unión de un factor de transcripción apropiado a dichos promotores, d) introducir dicho vector en dicha célula de la etapa a) que comprende dicho factor de transcripción, y e) identificar el fenotipo de dicha célula en comparación con el tipo silvestre.
En la invención, la secuencia de nucleótidos o de ADN puede proporcionarse tanto en una orientación con sentido como antisentido con relación a un solo promotor que tiene las propiedades definidas anteriormente, o como alternativa puede proporcionarse entre dos promotores idénticos. En ambas realizaciones el ARNbc se proporciona a partir de la transcripción iniciada a partir del promotor tras la unión de su factor de transcripción apropiado.
La célula de acuerdo con dicho método puede proceder de o estar contenida en un organismo. Cuando la célula está contenida en un organismo, el organismo puede adaptarse para expresar el factor de transcripción apropiado. El organismo puede ser cualquiera de una planta, animal, hongo o levadura pero preferiblemente puede ser el helminto nematodo C. elegans, que puede ser cualquiera de un tipo silvestre, un mutante nuc-1 o pha-ts de C. elegans o una combinación de dichas mutaciones. La genoteca de ADN o ADNc o el ADN homólogo o fragmento del mismo puede transfectarse o transformarse ventajosamente en un microorganismo, tal como una célula bacteriana o de levadura, que puede suministrarse al organismo, que es preferiblemente el helminto nematodo C. elegans. El microorganismo puede adaptarse para expresar el factor de transcripción apropiado. Preferiblemente, el microorganismo es
E. coli.
En cada uno de los métodos pertinentes, la genoteca de ADN, homólogo de ADN o fragmento de ADN puede construirse en un vector de ADN adecuado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica dicho factor de transcripción. Como alternativa, dicho factor de transcripción está codificado por un vector adicional. En una alternativa adicional más, la célula u organismo puede expresarse o adaptarse para expresar dicho factor de transcripción. Preferiblemente, cualquiera de los vectores usados en el método de acuerdo con la invención comprende un marcador de selección que puede ser, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que codifica sup-35 o un fragmento del mismo. La secuencia de nucleótidos puede orientarse en relación con un promotor de manera que la unión de un factor de transcripción al promotor inicia la transcripción del ADN en ARN bicatenario. La Figura 10 ilustra los vectores y la orientación de la secuencia de ADN que permite la producción de ARN bicatenario en C. elegans. De esta manera, en una realización el ADN se localiza entre dos promotores en un vector capaz de expresar ARNbc después de la unión de un factor de transcripción apropiado a dichos promotores. Como alternativa, el vector comprende dos copias de la secuencia de ADN organizada en una orientación sentido y antisentido con relación al promotor y cuyo marcador es de selección cuando está contenido en un C. elegans mutante pha-1. Preferiblemente, los promotores son cualquiera de los promotores T7, T3 o SP6 y el factor de transcripción comprende la polimerasa apropiada.
Preferiblemente el marcador de selección comprende una secuencia de nucleótidos capaz de inhibir o impedir la expresión de un gen en dicha célula y siendo dicho gen responsable de conferir un fenotipo conocido. Esta secuencia de nucleótidos puede ser parte de o idéntica a dicho gen que confiere dicho fenotipo, y estando dicha propia secuencia de nucleótidos orientada en relación con un promotor (o promotores) adecuado capaz de iniciar la transcripción de ARN bicatenario tras la unión de un factor de trascripción apropiado a dicho promotor (o promotores). Como alternativa, la secuencia de nucleótidos puede ser una parte de o idéntica a dicha secuencia génica que confiere dicho fenotipo, y siendo dicha secuencia de nucleótidos tal que permite la integración de dicho vector adecuado o adicional por recombinación homóloga en el genoma de dicha célula y a continuación dicha integración de dicha secuencia de nucleótidos es capaz de inhibir la expresión de dicha secuencia génica que confiere dicho fenotipo. Dicha secuencia de nucleótidos comprende codones de terminación suficientes para impedir la traducción de dicha secuencia de nucleótidos después de su integración en dicho genoma.
En dicho método, ventajosamente, pueden añadirse compuestos a dicha célula u organismo con el propósito de exploración para fenotipos deseados, tales como por ejemplo, resistencia o sensibilidad al compuesto cuando se compara con el tipo silvestre. Los promotores son preferiblemente inducibles. El factor de transcripción puede proceder de fagos, tal como por ejemplo, una polimerasa T7 dirigida por un promotor de fago. Sin embargo, cuando se utiliza C. elegans puede usarse un promotor específico de helmintos o específico de tejido, tal como let858, SERCA, UL6, myo-2 o myo-3. Preferiblemente, la cepa de E. coli es una cepa ARNasa III, e incluso más preferiblemente, ARNasa negativa.
Un método de generación de un organismo transgénico no humano que comprende un factor de transcripción exógeno y un transgén que comprende un promotor unido operativamente a un fragmento de ADN que se expresa tras la unión de dicho factor de transcripción al mismo, puede comprender a) proporcionar un primer organismo transgénico que comprende una primera construcción que incorpora ADN que codifica un factor de transcripción exógeno y un segundo organismo transgénico que comprende una segunda construcción que incluye al menos un promotor unido operativamente a una secuencia de ADN deseada que se expresa tras la unión del factor de transcripción de dicho primer organismo transgénico al mismo b) cruzar dichos primer y segundo organismos transgénicos y seleccionar los descendientes que expresan dicha secuencia de ADN deseada. Dichos primer y segundo organismos transgénicos pueden generarse mediante la transformación de dichas primera y segunda construcciones en los microorganismos respectivos para el posterior suministro al organismo respectivo. Preferiblemente, dicha segunda construcción comprende dicha secuencia de ADN deseada en una orientación en relación con dicho promotor de manera que es capaz de iniciar la transcripción de dicho ADN en ARNbc tras la unión de dicho factor de transcripción al mismo. En este documento, dicha segunda construcción comprende dos promotores que flanquean dicha secuencia de ADN deseada, pudiendo dichos promotores iniciar la transcripción de dicha secuencia de ADN en ARNbc tras la unión de dicho factor de transcripción a dichos promotores. Como alternativa, se proporciona dicha secuencia de ADN en una orientación sentido y antisentido en relación con dicho promotor para producir ARNbc tras la unión del factor de transcripción a los promotores. La primera y/o segunda construcciones pueden proporcionarse preferiblemente con un gen indicador unido operativamente a un promotor que es capaz de iniciar la transcripción de dicho indicador tras la unión de dicho factor de transcripción al mismo. Preferiblemente, el gen indicador codifica cualquiera de luciferasa, proteína verde fluorescente, \beta-galactosidasa o \beta-lactamasa.
Un método de validación de clones identificados en experimentos de vectores de doble híbrido en levadura, siendo dichos experimentos bien conocidos por los especialistas en la técnica y siendo dichos experimentos propuestos por primera vez por Chien et al. (1991) para detectar interacciones proteína-proteína, puede comprender proporcionar una construcción que incluye el ADN que codifica una proteína identificada en un experimento de vectores de doble híbrido, siendo su construcción tal que dicho ADN se proporciona en una orientación en relación con uno o más promotores capaz de promover la transcripción de dicho ADN en ARN bicatenario tras la unión de un factor de transcripción apropiado a dichos promotores, transformando una célula, tal como una célula bacteriana o, como alternativa, transformando un organismo que comprende dicho factor de transcripción con dichas construcciones e identificando un cambio fenotípico en dicha célula u organismo, que puede ser C. elegans o similar, comparado con el tipo silvestre. Preferiblemente, el factor de transcripción es inducible en la célula u organismo. Una vez más la secuencia de ADN puede localizarse entre dos promotores o tanto en una orientación sentido como antisentido en relación con un sólo promotor, como se ha descrito anteriormente. Preferiblemente, el promotor es un promotor de polimerasa de fago y dicho factor de transcripción es una ARN polimerasa, y preferiblemente polimerasas T7. Pueden usarse vectores para transformar dichas células u organismos y las propias células u organismos.
Como se ha mencionado anteriormente, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método de mitigación de infestación por plaga de plantas, comprendiendo dicho método a) identificar una secuencia de ADN de dicha plaga que es fundamental tanto para su supervivencia, desarrollo, proliferación o reproducción, b) clonar dicha secuencia de la etapa a) o un fragmento de la misma en un vector adecuado en relación con uno o más promotores capaces de transcribir dicha secuencia en ARN o ARNbc tras la unión de un factor de transcripción apropiado a dichos promotores y c) introducir dicho vector en la planta.
Por lo tanto, ventajosamente, el método de acuerdo con la invención proporciona un mecanismo particularmente selectivo para mitigar una infestación por plaga, y en algunos casos la infestación parasitaria de plantas, de manera que cuando la plaga se introduce en la planta digerirá el ARNbc expresado en la planta inhibiendo de esta manera la expresión del ADN dentro de la plaga, que es fundamental para su desarrollo, supervivencia, proliferación o reproducción. En una realización preferida, la plaga puede ser cualquiera de Tylenchulus ssp., Radopholus ssp., Rhadinaphelenchus ssp., Heterodera ssp., Rotylenchulus ssp., Pratylenchus ssp., Belonolaimus ssp., Canjanus ssp., Meloidogyne ssp., Globodera ssp., Nacobbus ssp., Ditylenchus ssp., Aphelenchoides ssp., Hirschmenniella ssp., Anguina ssp., Hoplolaimus ssp., Heliotylenchus ssp., Criconemella ssp., Xiphinema ssp., Longidorus ssp., Trichodorus ssp., Paratrichodorus ssp., Aphelenchs ssp. La secuencia de ADN o fragmento de la misma de acuerdo con este aspecto de la invención puede clonarse entre dos promotores específicos de tejido, tales como dos promotores específicos de raíz.
El vector usado en cada uno de los métodos para la construcción de dicha genoteca, comprende dos promotores idénticos orientados de manera que son capaces de iniciar la transcripción de una secuencia de ADN localizada entre dichos promotores en ARNbc tras la unión de un factor de transcripción apropiado a dichos promotores. La secuencia de ADN puede, por ejemplo, incluir un sitio de clonación múltiple. Preferiblemente, el vector de expresión comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un marcador de selección. La secuencia de nucleótidos que codifica dicho marcador de selección puede localizarse entre dos promotores idénticos orientados de manera que son capaces de iniciar la transcripción del ADN localizado entre dichos promotores en ARN bicatenario tras la unión de un factor de transcripción apropiado a dichos promotores. Preferiblemente, el marcador de selección comprende una secuencia de nucleótidos que codifica sup-35, para la introducción en C. elegans que tiene una mutación pha-1.
Preferiblemente, el factor de transcripción comprende una polimerasa de fago que se une a su correspondiente promotor o un promotor específico de C. elegans e incluso más preferiblemente una polimerasa T7. Preferiblemente, el vector incluye un sito de clonación múltiple entre dichos promotores idénticos.
Un vector de expresión para expresar un factor de transcripción apropiado puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica dicho factor de transcripción unido operativamente a secuencias de control de la expresión adecuadas. Preferiblemente, las secuencias del control de la expresión incluyen promotores que son promotores inducibles, constitutivos, generales o específicos de tejido, o combinaciones de los mismos. Preferiblemente, el factor de transcripción comprende una polimerasa de fago, y preferiblemente ARN polimerasa T7, T3 o SP6.
Un sistema de selección para identificar la transformación de una célula u organismo con un vector comprende un vector, como se describe en este documento, en el que dicho marcador de selección comprende una secuencia de nucleótidos capaz de inhibir o impedir la expresión de un gen en dicha célula u organismo, siendo dicho gen responsable de conferir un fenotipo conocido. Preferiblemente, dicha secuencia de nucleótidos corresponde a una parte de o es idéntica a dicho gen que confiere dicho fenotipo conocido, y estando dicha propia secuencia de nucleótidos localizada entre dos promotores idénticos capaces de iniciar la transcripción de ARN bicatenario tras la unión de un factor de transcripción apropiado a los mismos.
De manera alternativa, la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos que es una parte de o idéntica a dicha secuencia génica que confiere un fenotipo conocido en dicha célula u organismo, y que es tal que tras la integración de dicho vector por recombinación homóloga en el cromosoma de dicha célula u organismo dicha secuencia inhibe la expresión de dicha secuencia génica que confiere dicho fenotipo conocido.
Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos comprende codones de terminación suficientes para impedir la traducción de la secuencia de nucleótidos tras la integración en dicho cromosoma.
Preferiblemente, la secuencia génica conocida comprende un gen sup-35 o un fragmento del mismo que puede seleccionarse por identificación de descendientes que crecen a una temperatura superior a 25ºC tras la introducción en un helminto C. elegans mutante pha-1 et123ts.
Un método de asignación de función a una secuencia de ADN de un organismo multicelular comprende a) proporcionar i) una construcción que comprende dicho fragmento de ADN clonado entre dos promotores capaces de promover la transcripción en dicho organismo multicelular, en un organismo multicelular capaz de iniciar la transcripción a partir de dicho promotor; b) identificar el fenotipo de dicho organismo multicelular en comparación con el tipo silvestre.
La presente invención puede entenderse más claramente mediante los siguientes ejemplos que son puramente ejemplares con referencia a las figuras adjuntas, en las que:
La Figura 1 es una secuencia de nucleótidos del plásmido PGN1 de acuerdo con la presente invención.
La Figura 2 es una secuencia de nucleótidos del plásmido PGN100 de acuerdo con la presente invención.
La Figura 3 es una representación esquemática de los vectores usados y del régimen de transformación usado en los métodos descritos en este documento.
La Figura 4 es una ilustración de un vector de expresión usado de acuerdo con los métodos descritos en este documento.
La Figura 5 es una ilustración esquemática de los vectores de expresión de ARN polimerasa T7 usados para la transformación de C. elegans.
La Figura 6 es una ilustración del plásmido PGN1.
La Figura 7 es una representación esquemática de un vector mejorado para la inhibición por ARNbc que codifica el ARNbc de sup-35.
La Figura 8 es una ilustración de un vector para la integración en el genoma de C. elegans.
La Figura 9 es una ilustración de la posición de una secuencia (o secuencias) de ADN en relación con un promotor adecuado para iniciar la expresión de ARNbc a partir de la secuencia (o secuencias) de ADN.
La Figura 10 es una representación del plásmido pGN108.
La Figura 11 es una representación del plásmido pGN105.
La Figura 12 es una representación del plásmido pGN400.
La Figura 13 es una representación del plásmido pGN401.
La Figura 14 es una representación del plásmido pGN110.
La Figura 15 es una representación del plásmido pAS2 con promotores T7/T3/SP6 directos e inversos.
La Figura 16 es una representación del plásmido pGAD424 con promotores T7/T3/SP6 directos e inversos.
La Figura 17 es una representación del plásmido pAS2 -cyHA+, both T7-final.
La Figura 18 es una representación del plásmido pGAD424-without-FULL-ICE-BOTH-T7.
La Figura 19 (a) es una representación del plásmido pGN205 y (b) es una representación del plásmido pGN207.
Ejemplo A Construcción de una genoteca de ADNc ordenada y combinada jerárquicamente y aplicaciones de la misma Genoteca ordenada y combinada aleatoria
El vector es un vector de E. coli que contiene dos promotores T7, con un sitio de clonación múltiple (MCS) entre medias. Los dos promotores están orientados uno hacia el otro, y hacia el MCS. En presencia de ARN polimerasa T7, expresada en E. coli, C. elegans o cualquier otro organismo, se producirá ARN, comenzando a partir de los dos promotores T7. Como estos están orientados en sentido opuesto, se producirán ambas cadenas de ARN a partir del ADN insertado (clonado) en el MCS entre los dos promotores, dando como resultado la generación de ARN bicatenario (ARNbc) tras la unión de la ARN polimerasa T7 a los mismos.
En el MSC se construye una genoteca de ADNc de C. elegans usando técnicas de biología molecular convencionales. La genoteca se transforma dentro de E. coli, y las E. coli resultantes se cultivan y almacenan en placas multipocillo de 96. En esta fase, el ADN plásmido puede aislarse y almacenarse en placas multipocillo de 96 que se corresponden con los de las colonias de E. coli. Se puntúan aproximadamente 100.000 colonias. De este modo, la genoteca alojará aproximadamente 5 veces las variaciones totales de ADNc expresado de C. elegans, lo que proporciona la oportunidad de que las secuencias poco expresadas estén presentes en la genoteca. Esto dará como resultado aproximadamente 1041 placas de 96 pocillos. Las placas se combinan jerárquicamente según sea necesario. Por ahora la combinación de clones se dispone en un intervalo de 10 a 100. Si la combinación jerárquica es por 8 o 12 (son números más convenientes ya que las placas de 96 pocillos tienen una rejilla de 8 por 12), esto dará como resultado aproximadamente 87 placas multipocillo y aproximadamente 8352 pocillos. Si la combinación jerárquica es por 96 pocillos, que es una placa completa, dará como resultado aproximadamente 11 placas y aproximadamente 1041 pocillos. El ADN plásmido puede aislarse en cualquier fase de la combinación jerárquica, que sería menos complicado cuantas menos placas se usasen, pero daría como resultado una pérdida de complejidad aunque este no debería ser el caso en la combinación por 12. La combinación del ADN también puede llevarse a cabo con el ADN original.
Los siguientes experimentos describen cómo debe realizarse la combinación jerárquica, tanto para el ADN como para la genoteca de E. coli.
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Una genoteca ordenada para la tecnología de ARNi que contiene todos los genes del genoma de C. elegans, con aplicaciones de la misma
Como el proyecto de secuenciación del genoma está llegando a su fin, puede usarse esta información en la aplicación de la tecnología de inhibición por ARN de T7. Todos los genes del genoma de C. elegans pueden clonarse usando la tecnología de PCR. Se clonarán, con preferencia, los exones con una longitud mínima de 500 pb. Si los exones son demasiado pequeños, los fragmentos más pequeños se aislarán con PCR, o incluso partes de intrones y exones vecinos se aislarán con la tecnología de PCR de manera que se clone al menos una parte suficiente de la región traducida del gen. Para esto, es necesario realizar al menos 17000 reacciones de PCR. Esta colección de productos de PCR se clonará en un vector T7 como se ha descrito (dos promotores T7 orientados uno hacia el otro con un sitio de clonación múltiple entre medias). Cada producto PCR se clona independientemente, o puede usarse para generar una genoteca aleatoria, análoga a la genoteca de ADNc descrita. Si cada producto PCR se clona individualmente, la bacteria resultante y el ADN plásmido pueden combinarse de diversas maneras. En primer lugar, esta colección de productos PCR clonados individualmente en el vector de ARNi T7 puede combinarse aleatoriamente, como se ha descrito en la genoteca aleatoria. Esta combinación también puede hacerse de una manera más racional. Por ejemplo, pueden analizarse los genes del genoma de C. elegans usando herramientas bioinformáticas (biología in silico). Diversos genes del genoma pertenecerán a una familia de genes, o tendrán homólogos en el genoma. Estos miembros de la familia de genes se combinarán, o se combinarán los miembros que sean homólogos. De esta manera el número total de aproximadamente 1700 clones se reduce a una cantidad más manejable. Esta genoteca puede usarse para explorar fenotipos en los métodos que se describen en este documento. El fenotipo resultante proporciona una descripción funcional para el gen o familia de genes u homólogos de genes del genoma de C. elegans. Como la genoteca consta de una parte de todos los genes en el genoma, este método permite la descripción del genoma completo en términos fenotípico-funcionales. Para esto es necesario introducir el ARN bicatenario (ARNbc) en el helminto. Esta introducción de clones solos o clones combinados, siendo una combinación aleatoria o combinación racional, puede conseguirse de varias formas como se describe.
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Ejemplo de un vector para la expresión de ARNi bicatenario
Puede usarse cualquier vector que contenga un promotor T7, y que contenga un sitio de clonación múltiple (hay muchos disponibles en el mercado). Se diseñan cebadores que contienen el promotor T7 y un cebador con la cadena complementaria inversa, ambos con los extremos apropiados. Estos cebadores pueden hibridarse, y si están bien diseñados, clonarse en el vector de elección. La secuencia mínima para un promotor T7 es TAATACGACTCACTATAGGGCGA. Aunque puede usarse cualquier vector para la construcción de un vector de expresión T7, a continuación hay un ejemplo de cómo conseguir esto con el vector pGEM-3zf(-).
- Se digirió el vector pGEM-3zf(+) (PROMEGA) con HindIII y SalI
- Se mezclaron juntos los cebadores oGN1 y oGN2 a una concentración final de 1 \mug/30 \mul llevados a ebullición y enfriados lentamente a temperatura ambiente.
- El cebador se ligó en el vector usando procedimientos de ligamiento convencionales. El vector resultante es pGN1 (se muestra en la Figura 1) y contiene dos promotores T7 orientados uno hacia el otro, y contiene un sitio de clonación múltiple entre medias.
Las secuencias de oGN1 y oGN2 son:
-
oGN1: AGC TGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GCG AGA AGC TT
-
oGN2: TCG AAA GCT TCT CGC ATA ATA GTG AGT CGT ATT AC
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Ejemplo de la construcción de una genoteca
Puede aislarse ARN de todo organismo que sea sensible a ARNi. En general, el ARN aislado se copia después en ADNc bicatenario y posteriormente se prepara en vectores adecuados para la clonación. Existen varios procedimientos y pueden adquirirse kits de biología molecular de diversas firmas incluyendo promega, clontech, boehringer Mannheim, BRL, etc. que permiten:
- aislamiento de ARN,
- finalmente, puede aislarse ARN poliA (disponibles varias técnicas y kits)
- sintetizar la primera cadena con transcriptasa inversa de AMV, cebadores hexaméricos aleatorios y/o cebador oligo (dT)
- sintetizar la segunda cadena con ARNasa H, ADN Polimerasa I,
- nivelar los extremos con ADN Polimerasa T4
- adición de un adaptador con ADN ligasa T4
- finalmente, tratamiento con polinucleótido quinasa T4
- clonación del ADNc en el vector.
Puede considerarse la mezcla de ligamiento resultante como la genoteca de ADNc. El ligamiento contiene todo el ADNc del procedimiento ligado en el vector de interés.
Para ordenar la genoteca, el ligamiento debe transformarse en cepas de E. coli. 
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Aplicación de esta E. coli o genoteca de ADN Cepa de producción de ARN T7
- BL21 (DE3) es una cepa patrón: F-ompT[Ion]hsds(r-m-; y cepa B de E. coli) \lambda (DE3). Finalmente pueden usarse variantes de BL21 (DE3), aunque se usa BL21 (DE3)pLysS.
- es necesario construir cualquier otra cepa de E. coli que produzca la ARN polimerasa T7, que puede estar disponible. Esto puede generarse fácilmente usando un fago que esté disponible en el mercado, en este caso, se usa el vector \lambdaCE6 (proporcionado por Promega). Con este fago pueden transfectarse casi todas las cepas de E. coli y producirá ARN polimerasa T7.
- un mutante ARNasa III de E. coli:
En principio están disponibles diversas cepas, se elige usar en un primer experimento la cepa AB301-105: rna-19, suc-11, bio-3, gdhA2, his95, rnc-105, relA1, spoT1, metB1. (Kinder et al. 1973 Mol Gen. Genet 126: 53), pero pueden adaptarse mejor otras cepas. Esta cepa se infecta con \lambdaCE6 y de esta manera se construirá una variante que produzca T7. Pueden crecer helmintos C. elegans de tipo silvestre sobre las combinaciones de bacterias. La bacteria está expresando la ARN polimerasa T7. Esto da como resultado grandes cantidades de ARNbc en el intestino del C. elegans, que se difundirán en el organismo y darán como resultado la inhibición de la expresión. Esta genoteca puede usarse ahora para la exploración de varios fenotipos. Esta técnica tiene la ventaja de que es mucho más rápida para detectar genes pertinentes en determinadas rutas que la tecnología de C. elegans conocida. Además, si se encuentra un fenotipo interesante, el gen responsable puede clonarse fácilmente. Usando la combinación jerárquica se puede encontrar fácilmente en una segunda exploración el clon pertinente de la combinación. El ADN insertado de este clon puede secuenciarse después.
Este experimento da como resultado datos genéticos y bioquímicos en una etapa.
Las cepas de C. elegans de tipo silvestre pueden combinarse con compuestos para explorar para determinar el fenotipo, resistencia a fármacos y/o sensibilidad a fármacos. La cepa de C. elegans puede ser una cepa mutante, explorando para un fenotipo aumentado, un fenotipo reducido o un nuevo fenotipo. La cepa de C. elegans puede ser una cepa mutante, y la exploración de genoteca puede combinarse con compuestos. Por tanto puede explorarse para resistencia a fármacos, sensibilidad a fármacos, un fenotipo aumentado, un fenotipo reducido o un nuevo fenotipo. La cepa de E. coli puede ser cualquier cepa que exprese ARN polimerasa T7, como BL21 (DE3), por ejemplo, pero la formación del ARN bicatenario puede potenciarse usando una cepa de E. coli especial que sea ARNasaIII negativa. La ARNasaIII reconoce bucles específicos en el ARNbc. Finalmente, puede usarse una cepa de E. coli que tenga delecionadas otras ARNasas distintas de ARNasaIII o puede usarse una E. coli que tenga delecionada una o más ARNasas. La expresión de la ARN polimerasa T7 en la mayoría de las cepas y construcciones de E. coli conocidas que están disponibles para generar cepas de E. coli que producen ARN polimerasa T7, comprenden generalmente un promotor inducible. De esta manera la producción de ARN polimerasa T7 está regulada, y por tanto la producción de ARNbc. Ventajosamente, puede usarse esta característica para "estimular" el suministro a los helmintos C. elegans en fases específicas del desarrollo. Los helmintos se desarrollan sobre las cepas de E. coli no inducidas. Cuando el helminto ha alcanzado la fase de interés, se induce la producción de ARN T7 en la bacteria. Esto permite el estudio de la función de cualquier gen en cualquier punto del ciclo biológico del animal.
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Exploración de la genoteca para homólogos de genes humanos supuestamente interesantes y asignación de función a estos genes
Se han aislado cientos de genes en diversos proyectos, siendo proyectos genómicos, matrices de expresión diferencial, estudios de hibridación, etc. La genoteca de ADNc descrita puede proporcionar un modo para validar o asignar la función a estos genes de una manera más rápida y eficaz. En primer lugar es necesario identificar el homólogo u homólogos o los genes del helminto mediante herramientas informáticas (biología in silico). Se desarrollan cebadores de PCR y el fragmento de ADNc se aísla usando tecnología de PCR. Puede realizarse PCR sobre las combinaciones jerárquicas. Los pocillos de combinación o individuales positivos que contienen la bacteria que tiene el ADNc apropiado se suministra a C. elegans y se puntúa el fenotipo.
Puede realizarse PCR sobre ADNc aislado de C. elegans. El ADN resultante puede clonarse en el vector T7 y transformarse en la E. coli que produce ARNbc de la que se alimentan después los helmintos C. elegans. Dependiendo del modo más rápido y más fiable es necesario hacer una elección.
Si el gen pertenece a una familia de genes, puede ser necesario suministrar al helminto una mezcla de bacterias. Conteniendo cada una de ellas una parte del miembro de la familia de genes. Pueden realizarse cepas de E. coli, condiciones de cultivo, combinaciones con compuestos, como las descritas anteriormente.
Si se usa la genoteca racional, en la que todos los genes de C. elegans se clonan de manera organizada y estructurada, puede rastrearse fácilmente el homólogo de C. elegans y finalmente los otros homólogos, ortólogos y miembros de la familia de genes en la genoteca usando biología in silico. En esta etapa no está implicada una PCR y puede aislarse la bacteria y/o el ADN sobre el que crecerá el helminto.
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Ejemplos
La idea de la serie de experimentos era ensayar tanto el vector de ARNi como las diversas cepas de E. coli que se construyeron.
1) Construcción de un plásmido de ensayo
Puede usarse cualquier ADNc que proporcione un fenotipo claro en el helminto cuando se anula o usado en un experimento de ARNi. Se sabe que unc-22 es un buen candidato, pero son posibles otros genes. Se optó por un sistema sensible que puede usarse en una fase posterior. El sistema se ensayó con sup-35 en un fondo pha-1. Mediante PCR se aisló el exón 5 del sup-35 y se clonó en el vector de promotor T7 pGN1. El vector resultante se denominó pGN2. Los helmintos mutantes pha-1 (e2123) no pueden producir descendientes a temperaturas superiores de 25ºC. Esto es debido a un problema del desarrollo en la embriogénesis. Cuando sup-35 está anulado, o inhibido en esta cepa, los descendientes pueden crecer a esta temperatura. La combinación de helmintos mutantes pha-1 y ARNi de sup-35 es un buen sistema para validar las diversas opciones.
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2) Ensayo del ARNi usando una cepa de E. coli que produce ARNbc
- Se introdujo pGN2 en la cepa de E. coli BL21(DE3) y se indujo la ARN polimerasa T7 con IPTG. Los helmintos C. elegans (pha-1 (e2123)) se inocularon sobre esta bacteria, y se desarrollaron a la temperatura limitada de 25ºC. Como este mutante es un mutante embrionario a esta temperatura, no se observará descendencia. Si el gen sup-35 se inhibe de manera eficaz mediante el ARNbc presente en E. coli, se observará descendencia.
- Se introdujo pGN2 en la cepa de E. coli AB301-105 (DE3) y se indujo la ARN polimerasa T7 con IPTG. Los helmintos C. elegans (pha-1 (e2123)) se inocularon sobre esta bacteria, y se cultivaron a la temperatura limitada de 25ºC. Como este mutante es un mutante embrionario a esta temperatura, no se observará descendencia. Si el gen sup-35 se inhibe de manera eficaz mediante el ARNbc presente en E. coli, se observará descendencia.
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3) Mejora de la cepa de helminto para una mejor captación de ARNbc
Antes de desarrollar en placas C. elegans pha-1 sobre la cepa E. coli que produce el ARN bicatenario de sup-35. Se modificó por mutagénesis con EMS (etílico del ácido metanosulfónico) el helminto. La descendencia de este helminto mutado se desarrolló después en placas sobre la bacteria. El helminto que se alimenta de esta bacteria produce mayor descendencia que tiene una mutación que da como resultado una mejora de la captación de ARNbc y puede usarse para experimentos adicionales.
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Integración estable del vector que produce ARNbc en el genoma del helminto que produce ARN polimerasa T7
Puede construirse un vector de E. coli que contiene las siguientes características; dos promotores T7 dirigidos uno hacia el otro, con un sitio de restricción o un sitio de clonación múltiple entre medias. Además, el vector puede contener el ADN genómico de sup35 de C. elegans, modificado por ingeniería genética de manera que contiene varios codones de terminación a diversos intervalos, para que no pueda expresarse ninguna proteína de longitud completa a partir del fragmento de ADN genómico de sup35 como se ilustra en la Figura 8. Cualquier ADNc o fragmento de ADNc puede clonarse en el sitio de clonación múltiple entre los dos promotores T7. Cuando este vector se introduce en una cepa de C. elegans que expresa ARN polimerasa T7, el ADNc o fragmento de ADNc clonado entre los dos promotores T7 se transcribirá, generando ARNbc a partir del fragmento clonado.
El vector está diseñado para usarse en helmintos mutantes pha-1 (e2123) que expresan ARN polimerasa T7. La expresión de la ARN polimerasa T7 puede ser constitutiva o regulada, general o específica de tejido. Estos helmintos pha-1 (e2123) no pueden producir descendencia a temperaturas superiores a 25ºC, debido a un problema del desarrollo en la embriogénesis. Cuando se inhibe o se anula sup-35 en esta cepa, la descendencia puede crecer a esta temperatura.
Cuando el vector se introduce en el helminto, el vector puede integrase mediante recombinación homóloga (integración de tipo Campbell). Se ha demostrado que la recombinación homóloga se produce en C. elegans, aunque a bajas frecuencias (Plasterk y Groenen, EMBO J. 11: 287-290, 1992). La recombinación homóloga en el gen sup-35 dará como resultado una anulación del gen ya que los dos genes sup-35 resultantes alojarán los codones de terminación. Si se produce esta recombinación en los huevos, el helminto resultante y su descendencia tendrán una copia del vector integrado en el genoma. Esto puede seleccionarse ya que únicamente los helmintos cuyo sup-35 se haya anulado tendrán descendencia a temperaturas superiores a 25ºC. Además, el helminto resultante producirá de manera estable ARN bicatenario a partir del fragmento de ADN clonado entre los dos promotores T7. Este helminto puede considerarse ahora como una cepa estable de helminto transgénico con una reducción de la función del gen, del que se ha clonado un fragmento entre los dos promotores T7.
Se puede proporcionar ADN al helminto mediante varias técnicas incluyendo inyección, transformación biolística, impregnación en la solución de ADN, alimentación con bacterias. Pueden considerarse métodos nuevos y otros que aumenten las eficacias de transformación.
La cepa diana de C. elegans puede tener además otras mutaciones distintas de la mutación pha-1 (e2123) y puede expresar otros genes distintos de ARN polimerasa T7.
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Ejemplo B Vector de ARNi de doble híbrido en levadura
Puede construirse un vector de doble híbrido en levadura que aloje los dos promotores T7. Los vectores pueden diseñarse para replicarse tanto en levaduras como en E. coli. En general se preparan genotecas de ADNc para el sistema de doble híbrido en levadura en los vectores Ga14 o LexA. La genoteca se construye en vectores que tienen el dominio de activación de uno de estos genes. Puede construirse un vector que aún pueda funcionar en la exploración de doble híbrido en levadura pero que además contenga dos promotores T7 orientados uno hacia el otro con un sitio de clonación en el mismo entre medias. El orden de la secuencia en el plásmido será por tanto "estructura del plásmido, (GAL4-T7), MCS, T7, estructura". Puede usarse una genoteca de ADNc de C. elegans construida en este vector como una genoteca de doble híbrido en levadura patrón en un experimento para aislar proteínas que interaccionen con una proteína dada. Una vez aislado un clon, puede introducirse el plásmido en una cepa de E. coli que exprese la ARN polimerasa T7 y, por lo tanto, producirá ARNbc a partir del fragmento clonado. La bacteria que produce esta ARNbc puede suministrarse al helminto y pueden puntuarse los fenotipos. Como en el ejemplo anterior, este procedimiento de validación para un clon de doble híbrido en levadura recién aislado es notablemente más corto que el procedimiento convencional, que requiere etapas de clonación y/o PCR, experimentos de ARN y/o experimentos de anulación. En la mayoría de los casos los clones aislados se secuencian primero, y en base a la secuencia, se toma una decisión para continuar con experimentos adicionales. Cada clon aislado puede introducirse fácilmente en la E. coli apropiada y suministrarse al helminto. Después se realiza la validación mediante el análisis del fenotipo.
Para aplicar este procedimiento se realizó un doble híbrido en levadura usando un gen conocido como cebo y la genoteca recién construida como diana. Las proteínas codificadas por los clones en la diana que interaccionan con la proteína cebo, darán como resultado clones de levadura positivos que expresan la molécula indicadora de modo que puede observarse mediante tinción de LacZ con X-gal. El plásmido que codifica la proteína diana se aísla directamente a partir de la cepa de levadura y se introduce en E. coli. La E. coli es E. coli productora de ARN polimerasa T7. En este caso, se produce un ARN bicatenario a partir del ADN clonado en el sitio de clonación múltiple del vector. Cuando este ARNbc se suministra al helminto usando los métodos descritos anteriormente, el gen se ha inhibido en el helminto, dando como resultado un fenotipo particular.
- Este vector de doble híbrido en levadura puede usarse ventajosamente para construir una genoteca ordenada y combinada jerárquicamente como se ha descrito en el ejemplo anterior.
- También puede construirse una cepa de levadura que produce de forma condicionada ARN polimerasa T7. Después de los experimentos de doble híbrido en levadura, podría inducirse la expresión de la polimerasa T7, dando como resultado la producción de ARNbc en la célula de la levadura. Por consiguiente, la levadura podría suministrarse al helminto. Se dispone de pruebas que demuestran que los helmintos de C. elegans pueden alimentarse de levaduras.
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Construcción de una cepa productora de ARN polimerasa T7 y aplicaciones de la misma
Puede construirse una cepa de C. elegans que exprese ARN polimerasa T7. La expresión puede ser general y constitutiva, pero también podría estar regulada bajo un promotor específico de tejido, un promotor inducible, o un promotor temporal o un promotor que incluya una de estas características o una combinación de características. Puede introducirse ADN en esta cepa de C. elegans. Esto se hace por inyección, por bombardeo con partículas, por electroporación o como se ha mencionado anteriormente por alimentación. Si el ADN es un plásmido como se ha descrito en los ejemplos anteriores, es decir un plásmido que aloja un fragmento de ADNc clonado o un fragmento de PCR entre dos promotores T7 flanqueantes, entonces el ARNbc de este ADNc o fragmento de PCR se forma en la célula u organismo completo dando como resultado la regulación negativa del gen correspondiente. El ADN introducido puede tener una regulación negativa transitoria eficaz. El ADN introducido puede formar una matriz extracromosómica, pudiendo dicha matriz dar como resultado una anulación o reducción más catalítica de fenotipo funcional. El plásmido también podría integrarse en el genoma del organismo, dando como resultado la misma anulación o reducción catalítica de fenotipo funcional, pero transmitiéndose de forma estable.
- Mediante técnicas convencionales puede introducirse en el helminto con ARN polimerasa T7 un ADN plasmídico que aloja un ADNc o una parte de un ADNc o una EST o un fragmento de PCR de C. elegans clonado entre dos promotores T7 como se ha descrito en los ejemplos A) y B). Pueden analizarse los fenotipos. ADN de una genoteca ordenada y combinada como en el ejemplo A) puede introducirse en el helminto con ARN polimerasa T7, mediante técnicas convencionales (inyección, bombardeo). Pueden analizarse los fenotipos. Con la combinación jerárquica, el clon original puede encontrarse fácilmente.
- Puede realizarse el mismo procedimiento con un helminto mutante que expresa la ARN polimerasa T7. Explorando para fenotipos aumentados, reducidos o nuevos.
- Puede usarse el procedimiento para permitir la exploración de compuestos. Explorar con cualquier cepa de tipo silvestre o una cepa mutante para fenotipos aumentados o nuevos.
- El ADN podría introducirse en el helminto mediante nuevos métodos. Siendo uno de ellos el suministro de ADN mediante E. coli. En este caso la genoteca combinada jerárquicamente se suministra al animal. Para impedir la digestión del ADN de E. coli en el intestino del nematodo, se usará preferentemente un C. elegans deficiente en ADNasa, tal como nuc-1 (e1392). Este procedimiento sería uno de los más interesantes ya que sería independiente de las eficacias de transformación de otras técnicas, y generalmente más rápido y menos laborioso.
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2) Supuestas mejoras del método
- Se diseña un vector para que contenga el ADNc de sup-35 o una parte de este ADNc, clonado entre dos promotores T7. El resto del vector es como se ha descrito en los ejemplos A) y B). Este vector puede introducirse en un C. elegans mutante pha-1ts. En este caso existe un sistema de selección por temperatura y únicamente aquellos helmintos que hayan captado el ADN y expresen el ARN bicatenario de sup-35 sobrevivirán a temperaturas limitadas. La genoteca combinada jerárquicamente puede suministrarse mediante cualquier método descrito anteriormente.
- El vector puede usarse para construir una genoteca que se introduce en una E. coli que expresa ARN polimerasa T7. En este caso se tiene una exploración análoga a la de la parte A) con una exploración adicional para helmintos en los que sea activo el ARNbc de sup-35.
- El ADN y/o ARNbc de sup-35 podría suministrarse en un plásmido diferente. Para el suministro, tanto suministro de ADN (Ejemplo C) como suministro de ARNbc, Ejemplos A) y B), esto significa que los dos plásmidos podrían estar presentes en una bacteria, o que al helminto se le suministra una mezcla de bacterias, conteniendo una de ellas la construcción de sup-35.
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Ejemplo de la construcción de un C. elegans productor de ARN T7
Para producir ARN polimerasa T7 en el helminto, son posibles varias posibilidades. La polimerasa T7 puede expresarse bajo diversos promotores, siendo promotores inducibles, promotores constitutivos, promotores generales y promotores específicos (de célula) de tejido, o combinaciones de los mismos. Los ejemplos de estos promotores son el promotor de choque térmico hsp-16, el promotor intestinal ges 1, el promotor de cet858, pero también el promotor de dpy7 y el elemento promotor GATA1. En este ejemplo la ARN polimerasa T7 se expresa bajo el control del promotor hsp-16 que está disponible en el vector pPD49.78. La ARN polimerasa T7 se aísla como un producto de PCR usando los cebadores GN3 y GN4.
El producto de PCR resultante se digiere con NheI y NcoI, al igual que el vector en el que se quiere clonar, siendo el vector Fire pPD49.78. El vector resultante es pGN100 ilustrado en la Figura 2. Se incluyen oGN3: CAT GGC AGG ATG AAC ACG ATT AAC ATC GC y oGN4: ATG GCC CCA TGG TTA CGG GAA CGC GAA GTC CG de pGN100.
El vector se introduce en el helminto usando técnicas convencionales, tales como, por ejemplo, microinyección.
Después se construyeron las siguientes cepas:
-
Tipo silvestre (pGN100)
-
nuc-1 (e1392) (pGN100)
-
pha-1 (e2123) (pGN100)
-
pha-1; nuc-1 (pGN100)
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Todas estas cepas son capaces de producir ARN polimerasa T7 cuando se inducen por temperatura o de manera alternativa mediante metales tal como aplicación de cadmio o mercurio pesado. El procedimiento para inducción por temperatura es cambiar al animal a una temperatura de 30-33ºC durante al menos una hora, después el animal puede cambiarse de nuevo a temperaturas convencionales (15-25ºC).
La cepa de tipo silvestre que produce ARN polimerasa T7 puede usarse para la producción de cualquier ARN en el helminto. Más específicamente, los plásmidos de las genotecas descritas pueden introducirse en estos helmintos y pueden puntuarse los fenotipos.
El helminto mutante nuc-1 se usará para introducir el ADN a través de la bacteria de la que se alimenta el helminto. Como el helminto nuc-1 no digiere el ADN, el ADN plasmídico puede atravesar la pared intestinal. Si se capta por las células que producen la ARN polimerasa T7, se producirá ARNbc, inhibiendo de esta manera el gen a partir del que se transcribió el ARN.
Puede usarse la cepa mutante pha-1 que producía ARN polimerasa T7 para mejorar los procedimientos que se han descrito anteriormente. Puede introducirse ADN mediante bombardeo, microinyección o alimentación. Más específicamente, puede usarse esta cepa para los vectores que producen ARNbc a partir de sup-35 y a partir del gen de interés, pudiendo ser este último un producto de PCR, un ADNc o una genoteca como se ha descrito.
Para el suministro bacteriano del ADN puede usarse el mutante pha-1; nuc-1 que produce ARN polimerasa T7. Preferentemente el ADN será el plásmido que produce ARNbc tanto a partir de sup-35 como del gen de interés. Preferentemente la cepa de helminto producirá la ARN polimerasa T7 en el intestino. Preferentemente, el suministro se producirá por alimentación del helminto sobre la bacteria que aloja el plásmido.
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Aplicación de la tecnología ARNi en plantas
Los nematodos son responsables de una gran parte del daño inflingido en plantas y, más particularmente, en plantas usadas en la industria agrícola. Pueden aplicarse a plantas los procedimientos de ARNi de acuerdo con la invención para impedir que estos nematodos parasitarios se sigan alimentando. En una primera etapa, se aísla del nematodo parasitario de plantas un fragmento de ADN que es fundamental para la supervivencia o desarrollo de los animales, o para alimentarse o proliferar. Cualquier gen cuya expresión sea esencial es adecuado para este propósito.
Se clona una parte de este gen, un exón o ADNc. Este fragmento de ADN puede clonarse bajo la influencia de un promotor específico de tejido, preferiblemente un promotor específico de raíz, incluso más preferiblemente entre dos promotores específicos de raíz. Usando tecnología transgénica de plantas, puede introducirse en la planta de interés el ADN del gen clonado bajo el control del promotor específico de raíz. Para cada nematodo parásito, puede ser necesario un trozo diferente de ADN y, así mismo, será necesario un promotor diferente para cada estirpe de planta.
La raíz producirá ARN o ARNbc a partir del trozo de ADN introducido cuando se utiliza un promotor específico de raíz. Como el nematodo se alimenta de la planta, el nematodo consumirá o ingerirá el ARN y/o ARNbc. El ARN y/o ARNbc pueden introducirse en las células del nematodo y realizar su acción inhibidora sobre el ADN diana. Dependiendo de la naturaleza del trozo de ADN del helminto clonado, el nematodo no será capaz de sobrevivir, alimentarse, proliferar, etc. en ningún caso, impidiendo que el animal se siga alimentando de la planta, y protegiendo de esta manera la planta.
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Construcción de un C. elegans productor de ARN polimerasa T7
Para producir una ARN polimerasa T7 u otras ARN polimerasas en animales, y más particularmente en nematodos y más particularmente en C. elegans, pueden considerarse varias posibilidades. La ARN polimerasa T7 puede expresarse bajo diversos promotores. Estos promotores pueden ser promotores inducibles, promotores constitutivos, promotores generales, promotores específicos de tejido, o combinaciones de estos.
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Ejemplo 1 Construcción de un vector básico para la expresión de polimerasa T7 en C. elegans
A partir de \lambda CE6 (Novagen, Madison, Estados Unidos) se amplificó por PCR la secuencia codificante de la polimerasa T7 usando los cebadores oGN26 (ATGGAATTCTTACGCGAACGCGAAGTCCG) y oGN46 (CTCACCGG
TAATGAACACGATTAACATCGC), usando procedimientos convencionales (PCR, A practical approach, 1993, Ed. J. McPherson, et al, IRL Press). El fragmento de ADN resultante que codifica la ARN polimerasa T7 se digirió con AgeI y EcoRI y se insertó en el vector Fire pPD97.82 digerido con AgeI y EcoRI. La construcción resultante codifica una fase de lectura abierta de la ARN polimerasa T7 en fusión con la señal de localización nuclear (NLS) del antígeno T grande de SV40 con la secuencia de aminoácidos MTAPKKKRKVPV. Esta secuencia señal de localización nuclear es necesaria para translocar la ARN polimerasa T7 del citoplasma al núcleo, donde es capaz de unirse a sus promotores específicos, denominados promotores de T7. Cadena arriba de la secuencia codificante de la proteína de fusión de polimerasa T7 hay un promotor mínimo (myo-2) precedido por un sitio de clonación múltiple (MCS) en el que pueden insertarse varios promotores de C. elegans. Este plásmido (pGN105 que se muestra en la Figura 11) es un plásmido de ARN polimerasa T7 básico que permite la expresión de la polimerasa T7 en C. elegans. Los derivados de este plásmido en los que se clonan promotores en el sitio de clonación múltiple permiten la expresión inducible, constitutiva, general y específica de tejido de la ARN polimerasa T7 en C. elegans, ya que la expresión estará regulada por el promotor clonado en el sitio de clonación múltiple.
Aunque no se limita a estos ejemplos, se sabe que los siguientes promotores inducen la expresión en los siguientes tejidos.
let-858 (expresión ubicua), myo-2 (expresión en faringe), myo-3 (músculos de la pared corporal), egl-15 (músculos vulvares), unc-119 (pan-neuronal).
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Ejemplo 2 Construcción de un vector para la expresión de ARN polimerasa T7 en el tejido muscular de C. elegans
La secuencia codificante de la ARN polimerasa T7 se amplificó por PCR a partir de \lambda CE6 usando los cebadores oGN43 (GCCACCGGTGCGAGCTCATGAACACGATTAACATCGC) y oGN44 (CACTCAGTGGGCCCTTACG
CGAACGCGAAGTCCG) digeridos con AgeI/SpeI e insertados en el vector pGK13 digerido con AgeI/SpeI. (Este vector contiene el promotor fuerte SERCA que dirige la expresión en la faringe, el músculo vulvar, músculo de la cola y de la pared corporal). Se insertó una señal de localización nuclear (NLS) del antígeno T grande de SV40 en frente de la secuencia codificante de la polimerasa T7 por inserción de dos oligonucleótidos solapantes oGN45 (CCG
GATGACTGCTCCAAAGAAGAAGCGTAAGCT) y oGN46 (CTCACCGGTAATGAACACGATTAACATCGC) en los sitios de restricción SacI/AgeI. La construcción resultante se denominó pGN108, como se muestra en la Figura 10. La introducción de este plásmido en C. elegans da como resultado la expresión de la ARN polimerasa T7 en la faringe, músculo vulvar, músculos de la cola y de la pared corporal.
Para ensayar la expresión y la funcionalidad de la ARN polimerasa T7 en C. elegans bajo la regulación del promotor SERCA, se inyectó pGN108, que codifica la ARN polimerasa T7 bajo el control del promotor SERCA, en C. elegans. Se coinyectó un vector de ensayo. Este vector de ensayo codifica GFP bajo el control de un promotor T7 (pGN401 en la Figura 13). Se construyó el plásmido pGN401 insertando dos oligonucleótidos solapantes oGN41 (CCCGG
GATTAATACGACTCACTATA) y oGN42 (CCGGTATAGTGAGTCGTATTAATCCCGGGAGCT) en el vector Fire pPD97.82 abierto con SacI/AgeI, generando un promotor T7. Además se coinyectó un marcador de selección para seleccionar los transformantes (rol6, pRF4). El último vector de selección pRF4 es bien conocido para el especialista en la técnica. La F1 transgénica podía aislarse fácilmente ya que muestran el fenotipo rol 6. Estos C. elegans transgénicos expresaban todos GFP en la faringe, el músculo vulvar, el músculo de la cola y de la pared corporal. Estos datos muestran claramente que la ARN polimerasa T7 se expresa funcionalmente bajo la regulación del promotor SERCA, y que la ARN polimerasa T7 expresada se une al promotor T7 presente en pGN401 e inicia la transcripción del gen GFP, que después se expresa funcionalmente, dando como resultado fluorescencia en los tejidos musculares donde SERCA está induciendo la expresión de la ARN polimerasa T7.
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Ejemplo 3 Construcción de un vector para la expresión ubicua de polimerasa T7 en C. elegans
El gen de fusión de NLS-ARN polimerasa T7 se aisló a partir de pGN108 con XmaI/Bsp1201 y se clonó en el vector Fire pPD103.05 digerido con XmaI/Bsp1201. Esto da como resultado un vector en el que la ARN polimerasa T7 se clona bajo la regulación del promotor let858. Este promotor específico permite la expresión de ARN polimerasa T7 en todos los tejidos. El plásmido resultante se denominó pGN110 (Figura 14).
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Ejemplo 4 Construcción de un vector para la expresión mediada por ARN polimerasa T7 de fragmentos de ADN, genes y ADNc bajo el control de un promotor T7
Se digirió el vector Fire pPD97.82 con SacI/AgeI y se generó una secuencia de promotor T7 por inserción de dos oligonucleótidos solapantes oGN41 (CCCGGGATTAATACGACTCACTATA) y oGN42 (CCGGTATAGTGAGTCG
TATTAATCCCGGGAGCT) en los sitios de endonucleasas de restricción SacI/Age. Esta construcción (pGN400 Figura 12) contiene una fase de lectura abierta de GFP clonada entre los sitios de endonucleasas de restricción SacI y EcoRI bajo la regulación del promotor T7. En este vector puede clonarse cualquier gen, ADNc o fragmento de ADN por deleción del gen de GFP como un fragmento AgeI/SacI y clonando el fragmento de ADN de interés dentro del vector. Preferentemente el fragmento de ADN de interés puede obtenerse por amplificación por PCR, insertando los sitios SacI/AgeI en los cebadores. El fragmento de ADN resultante después de la amplificación por PCR el digerido y el gen de GFP en pGN400 se reemplaza por el fragmento de ADN amplificado. Todos los vectores que contengan un promotor T7 pueden usarse para el propósito de la expresión inducida por ARN polimerasa T7 en C. elegans, tales como los vectores pGEM y los vectores pBluescript disponibles en el mercado. Esto se demuestra claramente por el vector pGN401 que expresa GFP bajo la regulación del promotor T7 en un C. elegans transgénico que expresa ARN polimerasa T7.
El uso de pGN400 tiene la ventaja de que el vector incluye un fragmento 3' UTR de unc-54 que potencia la transcripción o la estabilidad del ARN.
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Generación de líneas permanentes de C. elegans con ARNi "pseudo knock-out" específico de tejido
En la actualidad, se obtienen C. elegans con genes anulados (knock out) después de mutagénesis aleatoria a gran escala y selección sib (selección de individuos morfológicamente iguales y genéticamente diferentes) basada en PCR. Este método es engorroso, consume mucho tiempo y es tedioso. Se ha descrito que introduciendo ARN bicatenario en una célula da como resultado una interferencia potente y específica de la expresión de genes endógenos. En C. elegans la expresión génica puede regularse negativamente inyectando ARN en la cavidad corporal del helminto, impregnando el helminto en una solución que contiene ARNbc o suministrándole E. coli que expresa el ARNbc correspondiente al gen de interés. Las células de C. elegans tienen la capacidad de captar ARNbc de su medio extracelular. Se ha descrito que el ARNm es la diana de esta interferencia genética mediada por ARNbc (Montgomery y Fire 1998). También se ha sugerido que el ARN diana se degrada en el núcleo antes de que pueda ocurrir la traducción. Aunque la reducción mediada por ARNi de la expresión génica puede pasarse a las siguientes generaciones, la heredabilidad es escasa y el efecto se pierde rápidamente en descendientes posteriores. Esto es probablemente debido a una disminución continua de la combinación de ARNbc. Se propone en este documento un método para construir líneas de C. elegans con un fenotipo ARNi permanente heredable. El método incluye la generación de líneas de C. elegans transgénicas introduciendo plásmidos que contienen fragmentos de ADNc del gen diana en orientación sentido y antisentido bajo el control de un promotor de helminto o mediante la transcripción de una repetición invertida del ADNc a partir de una sola construcción. Como alternativa, puede transcribirse ARNbc de un vector que aloja un ADNc flanqueado por dos promotores T7 en una cepa de C. elegans que expresa polimerasa T7. El resultado es un 3helminto transgénico con un fenotipo "pseudo-knock-out" estable heredable. La expresión del ADNc o de la polimerasa T7 puede ser general y constitutiva pero también podría regularse bajo un promotor específico de tejido. Al contrario que el ARNi inducido por ARNibc externo (inyectado, impregnado o suministrado) este método permitiría obtener la inhibición condicional específica de tejido de la expresión de genes.
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La inhibición de la expresión de unc-22 por interferencia con ARN da como resultado un fenotipo "inestable"
Se clonó ADNc de unc 22 (exón 22) en orientación sentido y antisentido en pPD103.05 (A. Fire Nº L2865) que contenía el promotor let 858 que es capaz de expresar secuencias de ARN en todos los tejidos. Los plásmidos resultantes se denominaron pGN205 (Figura 19a) y pGN207 (Figura 19b). Estas construcciones se introdujeron en C. elegans junto con un marcador de selección (rol-6; GFP). Los individuos transgénicos de la F1 (que expresan rol-6 o GFP) mostraron un fenotipo "inestable" indicando que el ARNi podría estar mediado por la transcripción endógena de ARN a partir de ADN transgénico. El fenotipo ARNi cosegregaba con el marcador de selección en descendientes posteriores. Esto dio como resultado la generación de líneas de C. elegans con fenotipo ARNi permanente.
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Generación de líneas estables con líneas de ARN polimerasa T7 y generación de helmintos dobles transgénicos
Un sistema de expresión en C. elegans basado en una ARN polimerasa exógena demanda dos plásmidos. Uno está codificado por la ARN polimerasa bajo el control de un promotor específico, mientras que el otro plásmido codifica el fragmento de ADN a expresar, bajo la regulación del promotor T7. En el caso de ARNi semiestable, también denominados knock out pseudoestables, el ADN de interés se clona entre dos promotores T7 para que pueda producirse ARNbc.
Como se sabe que el sistema de expresión de ARN polimerasa T7 es un sistema de alta expresión esto dará como resultado problemas para generar animales doblemente transgénicos. Si el gen a expresar en el nematodo C. elegans es tóxico, esto dará como resultado efectos letales y, por lo tanto, la construcción de un C. elegans sin expresión estable altamente regulada del gen de interés. Si el gen de interés es esencial para la supervivencia del organismo, el ARNi con un fragmento de ADN de este gen también dará como resultado efectos letales, de manera que no son posibles knock out pseudoestables.
Para solucionar este problema los presentes inventores han diseñado un sistema que consiste en dos animales transgénicos. El primer animal es transgénico para la ARN polimerasa T7. Esta ARN polimerasa T7 puede expresarse en todas las células o en células o tejidos específicos como se ha demostrado en ejemplos anteriores. El segundo animal transgénico es transgénico para el fragmento de ADN de interés. Este puede ser un gen o ADNc unido a un promotor T7, o si se quiere realizar ARNi, un fragmento de ADN de dicho gen clonado entre dos promotores T7.
Ambos animales transgénicos son viables y no muestran fenotipo anormal. Esto es porque la ARN polimerasa T7 expresada en el primer organismo transgénico no es tóxica para el organismo, incluso si se expresa a niveles relativamente altos. En el segundo organismo transgénico, el gen de interés no se expresa o el ARNbc no se produce ya que estos animales transgénicos no contienen la ARN polimerasa T7.
La expresión del gen o ADNc de interés o ARNi con un fragmento de ADN puede obtenerse ahora por apareamiento de los dos animales transgénicos. La descendencia de estos es doblemente transgénica y expresan el gen de interés o expresan ARNbc o el fragmento de ADN de interés. Para generar suficientes machos en dicho apareamiento, uno de los animales transgénicos machos puede ser un mutante de C. elegans con un fenotipo que favorezca la generación de machos. Un Ejemplo de dicho mutante es him-5. Preferentemente, dicho mutante se usará para generar un C. elegans transgénico para ARN polimerasa T7, mientras que el hermafrodita contiene el fragmento de ADN bajo la regulación del promotor T7.
Para seleccionar de manera eficaz la descendencia doble transgénica puede introducirse un segundo transgén en el segundo animal transgénico. Este transgén contiene un gen indicador bajo la regulación del promotor T7. El gen indicador puede ser GFP, luciferasa, beta-galactosidasa o beta-lactamasa, siendo un ejemplo de dicho transgén los vectores pGN400 y pGN401.
Para obtener la expresión inducible específica de tejido de un transgén en C. elegans se puede generar una reserva de machos (es decir, him-5) que lleven la construcción de polimerasa T7 bajo el control de diferentes promotores de C. elegans que permiten la expresión específica de tejido como tal. Estos machos pueden cruzarse con hermafroditas que lleven el gen de interés bajo el control del promotor T7.
Además, los transgenes pueden integrarse en el genoma del animal. Se han descrito métodos para generar la integración estable de un plásmido en el genoma del animal (Methods in cell biology, Vol. 48, 1995, ed. por Epstein y Shakes, Academic Press) e implica la radiación del animal.
Esto puede hacerse para ambos animales, pero preferentemente, los animales que expresan la ARN polimerasa T7 se someten a dicho tratamiento. Esto da como resultado una colección de nematodos C. elegans que expresan de forma estable la ARN polimerasa T7 bajo el control de diversos promotores, siendo ejemplos de dichos promotores el myo-2 (expresión en faringe), myo-3 (músculos de la pared corporal), egl-15 (músculos vulvares), unc-119 (pan-neuronal), SERCA (músculos), let858 (todas las células), ges-1 (intestino).
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Construcción de vectores de doble híbrido en levadura del promotor T7 de ARNi pGAD424 con T7/T3 y/o Sp6 directo e indirecto
En la mayoría de los experimentos de doble híbrido se clona una genoteca de ADNc en el plásmido pGAD424 (Figura 16) que se ha modificado por ingeniería genética con sitios de restricción adicionales en el polienlazador tal como un sitio NcoI (Clontech). Esta genoteca permite la exploración de proteínas de unión en un experimento de doble híbrido en levadura. Se construyó un nuevo vector de doble híbrido en levadura con las mismas posibilidades para realizar doble híbrido en levadura, pero que contienen dos promotores T7 adicionales, de manera que el vector puede usarse para knock out pseudo estables inducidos por ARN polimerasa T7. Para esto se insertó un T7 directo usando un enlazador de T7 (que consiste en los siguientes cebadores aattcttaatacgactcactatagggcc y catgggccctatagtgagtattaag) en el sitio EcoRI-NcoI de pGAD424. El vector resultante se denominó pGAD424-without-FULL-ICE-both-T7. Se tuvo cuidado de eliminar los codones de terminación y usar aminoácidos de máxima compatibilidad con el polienlazador. Se adoptó la misma estrategia para el T7 inverso (que consistía en ambos cebadores gatccgtcgacagatctccctatagtgagtcg
tattactgca y gtaatacgactcactatagggagatctgtcgacg) con BamHI y PstI. Para evitar la pérdida de SalI, se incluyó este sitio en el cebador.
El sitio SalI es importante ya que la mayoría de las genotecas se clonan en este sitio, se dispone de adaptadores. Esto hace al vector recién construido compatible con vectores existentes.
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pAS2 con T7/T3 y/o Sp6 directo e inverso
Se construyó un vector de doble híbrido en levadura análogo basado en pAS2 (Clontech). Mediante digestión parcial con EcoRV se fue capaz de eliminar una parte significativa del gen cyh2. La construcción correcta puede aislarse y revisarse mediante una digestión de restricción con BgIII. Este sitio de restricción está presente en el fragmento EcoRV de PAS2 a eliminar. Esto elimina el gen cyh2 que es un gen ligeramente tóxico y que está implicado en el retraso del crecimiento. Este gen no es esencial para la realización del ARNi y los experimentos de doble híbrido en levadura. Después de la eliminación del fragmento EcoRV, el sitio de restricción EcoRI que se localiza entre la secuencia de ADN que codifica GAL4BD y HA (epítopo) se vuelve única para el plásmido, y puede usarse para sustituir HA con un enlazador que contiene el promotor T7. Esto asegura la persistencia de todos los sitios de restricción, permitiendo tanto la clonación en fase de lectura como la compatibilidad con vectores previos y pGAD424. Se usaron los siguientes enlazadores (cebadores: aattcttaatacgactcactatagggca y tatgccctatagtgagtcgtat
taag) usando sitios de clonación EcorI y NdeI. Se adoptó la misma estrategia para el T7 inverso (cebadores: gatccgtc
gacagatctccctatagtgagtcgtattactgcacatgggccctatagtgagtcgtattaag y gtaatacgactcactatagggagatctgtcgacg) con BamHI y PstI. Para evitar la pérdida de SalI se incluyó en el cebador. El vector resultante se denominó pAS1-cyh2-HA+both
T7-final.
Tener el promotor T7 (o de manera alternativa el promotor T3 o SP6) en pGAD424 permite ir rápidamente de la proteína que interacciona al ARNi y asignar una función al fragmento de ADN aislado. Una ventaja adicional es la capacidad de generar mediante transcripción in vitro acoplada a traducción in vitro (hay un ATG en fase de lectura con GAL4DB o GAL4AD) una proteína marcada que puede usarse para controles in vitro (por ejemplo ensayos de inmunoprecipitación) de la interacción proteína-proteína real.
Las secuencias de los plásmidos producidos y la polimerasa SP6 y T3 se identifican en la Lista de Secuencias proporcionada a continuación:
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SECUENCIA ID Nº: 1
ARN polimerasa dependiente de ADN de SP6
Número de acceso Swissprot P06221
Secuencia de proteína:
1 
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SECUENCIA ID Nº: 2
ARN polimerasa dependiente de ADN de T3
Número de acceso Swissprot P07659
Secuencia de proteína:
2 
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SECUENCIA ID Nº: 3
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3
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7 
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pGN401
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8 
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pGN110
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9
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12
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SECUENCIA ID Nº: 9
pGAD424-without-FULL-ICE-BOTH-T7
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pGN205
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SECUENCIA ID Nº: 11
pGN207
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Claims (7)

1. Un método para mitigar una infestación por plagas de plantas, comprendiendo dicho método
a) identificar una secuencia de ADN de dicha plaga que sea crítica para su supervivencia, desarrollo, proliferación,
b) clonar dicha secuencia de la etapa a) o un fragmento de la misma en un vector adecuado en una orientación respecto a un promotor o promotores, de modo que dicho promotor o promotores sea capaz de iniciar la transcripción de dicha secuencia de ADN en ARN o ARNbc tras la unión de un factor de transcripción apropiado a dicho promotor o promotores y
c) introducir dicho vector en la planta
en el que la plaga de plantas es una plaga de plantas que se alimenta de la planta.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de ADN se proporciona entre dos promotores, de modo que la unión del factor de transcripción a los promotores da como resultado la transcripción del ADN en ARNbc.
3. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha secuencia de ADN se proporciona en una orientación sentido y antisentido respecto a dicho promotor, de modo que la unión del factor de transcripción al promotor da como resultado la transcripción del ADN en ARNbc.
4. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha plaga es un helminto nematodo.
5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho nematodo comprende cualquiera de Tylenchulus ssp., Radopholus ssp., Rhadinaphelenchus ssp., Heterodera ssp., Rotylenchulus ssp., Pratylenchus ssp., Belonolaimus ssp., Canjanus ssp., Meloidogyne ssp., Globodera ssp., Nacobbus ssp., Ditylenchus ssp., Aphelenchoides ssp., Hirschmenniella ssp., Anguina ssp., Hoplolaimus ssp., Heliotylenchus ssp., Criconemella ssp., Xiphinema ssp., Longidorus ssp., Trichodorus ssp., Paratrichodorus ssp., Aphelenchs ssp.
6. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha secuencia de ADN o fragmento de la misma se clona entre dos tejidos, preferiblemente promotores específicos de raíz.
7. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para mitigar una infestación parasitaria de plantas.
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