PL213379B1 - Sposób wytwarzania rosliny odpornej na zakazenie szkodnikiem roslinnym - Google Patents

Sposób wytwarzania rosliny odpornej na zakazenie szkodnikiem roslinnym

Info

Publication number
PL213379B1
PL213379B1 PL384205A PL38420599A PL213379B1 PL 213379 B1 PL213379 B1 PL 213379B1 PL 384205 A PL384205 A PL 384205A PL 38420599 A PL38420599 A PL 38420599A PL 213379 B1 PL213379 B1 PL 213379B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
ssp
promoter
dna
promoters
vector
Prior art date
Application number
PL384205A
Other languages
English (en)
Inventor
Geert Plaetinck
Christ Platteeuw
Katherine Mortier
Thierry Bogaert
Original Assignee
Devgen Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26313977&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL213379(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from GBGB9814536.0A external-priority patent/GB9814536D0/en
Application filed by Devgen Nv filed Critical Devgen Nv
Publication of PL213379B1 publication Critical patent/PL213379B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1079—Screening libraries by altering the phenotype or phenotypic trait of the host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8285—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for nematode resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10211—Podoviridae
    • C12N2795/10241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2795/10243—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/40—Systems of functionally co-operating vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Catching Or Destruction (AREA)

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania rośliny odpornej na zakażenie szkodnikiem roślinnym żerującym na roślinie.
Ostatnio opisano w Nature, tom 391, str. 806-811, Luty 98, że wprowadzanie dwuniciowego RNA do komórki powoduje silną i specyficzną ingerencję w ekspresję endogennych genów w komórce, która to ingerencja jest istotnie bardziej wydajna niż dostarczanie poszczególnych nici RNA, jak to się proponuje w technice antysensu. Ta specyficzna redukcja aktywności genu została także stwierdzona u nicienia Caenorhabditis elegans (C. elegans), gdy RNA wprowadzano do genomu lub jamy ciała robaka.
Twórcy wynalazku zastosowali tą technikę i użyli jej także do rozwinięcia nowych sposobów przypisywania funkcji genom lub fragmentom DNA, które zostały zsekwencjonowane w różnych projektach, takich jak przykładowo, projekt poznania ludzkiego genomu i którym nie przypisano dotychczas określonej funkcji oraz do zastosowania w identyfikowaniu DNA odpowiedzialnego za nadawanie określonego fenotypu.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania rośliny odpornej na zakażenie szkodnikiem roślinnym żerującym na roślinie, polegający na tym, że transformuje się roślinę lub komórkę roślinną sekwencją DNA z tego szkodnika roślinnego, przy czym ta sekwencja DNA, lub jej fragment, jest klonowana w odpowiednim wektorze w takiej orientacji względem promotora(lub promotorów), że wspomniany promotor (lub promotory) inicjuje transkrypcję tej sekwencji DNA do dsRNA po związaniu odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego ze wspomnianym promotorem (lub promotorami), z wytworzeniem rośliny odpornej na zakażenie szkodnikiem roślinnym.
Korzystnie wspomnianą sekwencję DNA dostarcza się pomiędzy dwoma promotorami tak, że wiązanie czynnika transkrypcyjnego z promotorem wywołuje transkrypcję DNA do dsRNA.
Korzystnie wspomnianą sekwencję DNA dostarcza się w orientacji sensownej i antysensownej względem wspomnianego promotora tak, że wiązanie czynnika transkrypcyjnego z promotorem wywołuje transkrypcję DNA do dsRNA.
Korzystniej jako promotor(lub promotory) stosuje się promotor(lub promotory) tkankowo-specyficzny.
Jeszcze korzystniej jako promotor(lub promotory) stosuje się promotor(lub promotory) specyficzny dla korzeni.
Korzystnie szkodnikiem roślinnym jest nicień.
Korzystniej nicieniem jest dowolny spośród: Tylenchulus ssp. Radopholus ssp., Rhadinaphelenchus ssp., Heterodera ssp., Rotylenchulus ssp., Pratylenchus ssp., Belonolaimus ssp., Canjanus ssp., Meloidogyne ssp., Globodera ssp., Nacobbus ssp., Ditylenchus ssp., Aphelenchoides ssp., Hirsehmaniella ssp., Anguina ssp., Hoplolaimus ssp., Heliotylenchus ssp., Criconemella ssp., Xiphinema ssp., Longidorus ssp., Triehodorus ssp., Parartichodorus ssp. i Aphelenchs ssp.
Zatem, opisano tutaj sposób identyfikowania DNA odpowiedzialnego za nadawanie pewnego fenotypu w komórce, który obejmuje: a) konstruowanie biblioteki cDNA lub genomowej z DNA tej komórki w orientacji wobec promotora lub promotorów pozwalającej na inicjację transkrypcji wspomnianego cDNA lub DNA do dwuniciowego (ds) RNA po związaniu odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego do wspomnianego promotora lub promotorów, b) wprowadzanie wspomnianej biblioteki do jednej lub więcej komórek zawierających wspomniany czynnik transkrypcyjny, oraz c) identyfikowanie i izolowanie danego fenotypu wspomnianej komórki zawierającej wspomnianą bibliotekę i identyfikowanie fragmentu DNA lub cDNA ze wspomnianej biblioteki odpowiedzialnego za nadawanie danego fenotypu.
Biblioteka może być zorganizowana w zbiory hierarchiczne, co opisano szczegółowo w opisanych przykładach, przed etapem b), tak aby obejmowała, przykładowo, rodziny genów.
Opisano tutaj również sposób przypisywania funkcji znanej sekwencji DNA, który obejmuje: a) identyfikowanie homologu lub homologów wspomnianej sekwencji DNA w komórce, b) izolowanie odnośnego homologu lub homologów DNA lub jego fragmentu z komórki, c) klonowanie wspomnianego homologu lub jego fragmentu do odpowiedniego wektora w orientacji wobec promotora lub promotorów pozwalającej na inicjację transkrypcji wspomnianego cDNA lub DNA do dwuniciowego (ds) RNA po związaniu odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego do wspomnianego promotora lub promotorów, d) wprowadzanie wspomnianego wektora do wspomnianej komórki z etapu a) zawierającej wspomniany czynnik transkrypcyjny, oraz e) identyfikowanie fenotypu wspomnianej komórki w porównaniu z typem dzikim.
PL 213 379 B1
Sekwencja nukleotydowa lub DNA mogą być dostarczane w orientacji sensownej i antysensownej wobec pojedynczego promotora, którego cechy zdefiniowano powyżej, lub alternatywnie może być umieszczana pomiędzy dwoma identycznymi promotorami. dsRNA dostarczany jest w wyniku transkrypcji inicjowanej przez promotor po związaniu z odpowiednim czynnikiem transkrypcyjnym.
Komórka taka może pochodzić z organizmu lub może być zawarta w organizmie. Gdy komórka zawarta jest w organizmie, organizm może być przystosowany do ekspresjonowania odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego. Organizmem może być dowolna roślina, zwierzę, grzyb lub drożdże, a dogodnie jest to nicień C. elegans, który moż e być typu dzikiego, moż e być mutantem C. elegans nuc-1 lub pha-ts, lub kombinacją tych mutacji. Biblioteka DNA lub cDNA lub homologu DNA lub jego fragmentu może być, dogodnie, transfekowana lub transformowana do mikroorganizmu, takiego jak komórka bakteryjna lub drożdżowa, która może stanowić pokarm dla organizmu, którym jest dogodnie nicień C. elegans. Mikroorganizm może być przystosowany do ekspresjonowania odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego. Dogodnie mikroorganizmem jest E. coli.
Biblioteka DNA, homologu DNA lub fragmentu DNA może być skonstruowana w odpowiednim wektorze, który obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą wspomniany czynnik transkrypcyjny. Alternatywnie, wspomniany czynnik transkrypcyjny może być kodowany przez dodatkowy wektor. Ewentualnie komórka lub organizm może ekspresjonować lub może być przystosowana do ekspresji wspomnianego czynnika transkrypcyjnego. Dogodnie, dowolny wektor stosowany w sposobie według wynalazku zawiera marker selekcyjny, którym może być przykładowo sekwencja nukleotydowa kodująca sup-35 lub jej fragment. Sekwencja nukleotydowa może być zorientowana względem promotora w taki sposób, ż e wiązanie czynnika transkrypcyjnego do promotora inicjuje transkrypcję DNA w dwuniciowy RNA. Figura 10 prezentuje wektory i orientację sekwencji DNA, która umożliwia produkcję dwuniciowego RNA w C.elegans. DNA może być umieszczony pomiędzy dwoma promotorami w wektorze zdolnym do ekspresji dsRNA poprzez wiązanie odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego do wspomnianych promotorów. Alternatywnie, wektor zawiera dwie kopie sekwencji DNA zorganizowane w sensownej i antysensownej orientacji względem promotora i którego marker może być selekcjonowany gdy znajduje się w mutancie pha-1 C. elegans. Dogodnie promotory stanowią dowolny z promotorów T7, T3 lub SP6 a czynnik transkrypcyjny odpowiednią polimerazę.
Dogodnie marker selekcyjny obejmuje sekwencję nukleotydową zdolną do inhibicji lub zapobiegania ekspresji genu we wspomnianej komórce, przy czym gen ten jest odpowiedzialny za nadawanie znanego fenotypu. Ta sekwencja nukleotydowa może być częścią wspomnianego genu lub może być identyczna ze wspomnianym genem nadającym wspomniany fenotyp, przy czym ta sekwencja nukleotydowa jest w orientacji wobec odpowiedniego promotora lub promotorów pozwalającej na inicjację transkrypcji dwuniciowego RNA po związaniu odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego do wspomnianego promotora lub wspomnianych promotorów. Alternatywnie ta sekwencja nukleotydowa może być częścią lub może być identyczna ze wspomnianą sekwencją genu nadającą wspomniany fenotyp, przy czym ta sekwencja nukleotydowa jest taka, że pozwala na integrację wspomnianego odpowiedniego lub dodatkowego wektora poprzez rekombinację homologiczną z genomem wspomnianej komórki i po wspomnianej integracji wspomniana sekwencja nukleotydowa jest zdolna do inhibicji ekspresji wspomnianej sekwencji genu nadającej wspomniany fenotyp. Sekwencja nukleotydowa zawiera kodony stopu wystarczające do zapobiegania translacji wspomnianej sekwencji nukleotydowej po jej integracji ze wspomnianym genomem.
Dogodnie w sposobie tym mogą być dodawane do wspomnianej komórki lub organizmu związki w celu poszukiwania pożądanych fenotypów, takich jak przykł adowo, oporność na antybiotyki lub wrażliwość na związek w porównaniu z typem dzikim. Promotory są dogodnie indukowalne. Czynnik transkrypcyjny może w pewnych realizacjach być pochodzenia fagowego, tak jak przykładowo, polimeraza T7 kontrolowana przez promotor fagowy. Jednakże, gdy stosowany jest C. elegans mogą zostać użyte promotory specyficzne dla robaków lub szczególnej tkanki, takie jak przykładowo, let858, SERCA, UL6, myo-2 lub myo-3. Dogodnie, szczep E. coli jest negatywny względem RNazy III, a dogodniej jest to szczep negatywny pod względem RNazy.
Opisano tutaj również sposób wytwarzania transgenicznego organizmu nie-człowieka obejmującego egzogenny czynnik transkrypcyjny i transgen zawierający promotor operacyjnie związany z fragmentem DNA, ekspresjonowany po przyłączeniu do niego tego czynnika transkrypcyjnego, który to sposób obejmuje:
a) dostarczenie pierwszego organizmu transgenicznego zawierającego pierwszy konstrukt zawierający DNA kodujący egzogenny czynnik transkrypcyjny i drugiego organizmu transgenicznego
PL 213 379 B1 zawierającego drugi konstrukt zawierający przynajmniej jeden promotor operacyjnie związany z pożądaną sekwencją DNA, która jest ekspresjonowana po przyłączeniu do niego czynnika transkrypcyjnego z pierwszego organizmu transgenicznego, b) krzyżowanie wspomnianego pierwszego i drugiego organizmu transgenicznego i selekcjonowanie potomstwa ekspresjonującego wspomnianą pożądaną sekwencję DNA. Pierwszy i drugi organizm transgeniczny może być wytworzony poprzez transformowanie wspomnianego pierwszego i drugiego konstruktu do odpowiednich mikroorganizmów służących następnie do karmienia odpowiedniego organizmu. Dogodnie wspomniany drugi konstrukt zawiera pożądaną sekwencję DNA w orientacji wobec wspomnianego promotora pozwalającej na inicjację transkrypcji wspomnianego DNA do dsRNA po związaniu do niego wspomnianego czynnika transkrypcyjnego. Wspomniany drugi konstrukt zawiera dwa promotory flankujące wspomnianą pożądaną sekwencję DNA, które to promotory mogą inicjować transkrypcję wspomnianej sekwencji DNA do dsRNA po związaniu wspomnianego czynnika transkrypcyjnego do wspomnianych promotorów. Alternatywnie wspomniana sekwencja DNA jest dostarczana w orientacji sensownej lub antysensownej wobec wspomnianego promotora w celu uzyskiwania produkcji dsRNA po związaniu czynnika transkrypcyjnego do promotora.
Pierwszy i/lub drugi konstrukt mogą być dogodnie wyposażone w gen reporterowy operacyjnie związany z promotorem, który jest zdolny do inicjacji transkrypcji wspomnianego reportera po związaniu do niego wspomnianego czynnika transkrypcyjnego. Dogodnie wspomniany gen reporterowy zawiera dowolną spośród sekwencji kodujących lucyferazę, białko zielonej fluorescencji, β galaktozydazę lub β-laktamazę.
Opisano tutaj także sposób oceny klonów zidentyfikowanych w eksperymencie z dwuhybrydowym wektorem drożdżowym, które to eksperymenty są dobrze znane fachowcom i które to eksperymenty zostały po raz pierwszy zaproponowane przez Chien i wsp. (1991) w celu wykrywania oddziaływań białko-białko. Sposób ten obejmuje dostarczanie konstruktu zawierającego DNA kodujący białko zidentyfikowane w eksperymencie z dwuhybrydowym wektorem drożdżowym, przy czym konstrukt ten jest taki, że wspomniany DNA jest w orientacji wobec promotora lub promotorów pozwalającej na inicjację transkrypcji wspomnianego DNA do dwuniciowego RNA po związaniu odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego do wspomnianego promotora lub promotorów, transformowanie komórki, takiej jak komórka bakteryjna lub alternatywnie transformowanie organizmu zawierającego wspomniany czynnik transkrypcyjny wspomnianym konstruktem, i identyfikowanie zmian fenotypowych we wspomnianej komórce lub organizmie, którym może być C. elegans lub podobny, w porównaniu z typem dzikim. Dogodnie, czynnik transkrypcyjny jest indukowalny w komórce lub organizmie. Ponownie, sekwencja DNA może być umieszczana pomiędzy dwoma promotorami lub może być w orientacji sensownej, jak i antysensownej wobec pojedynczego promotora, jak opisano poprzednio. Dogodnie, promotor jest promotorem fagowej polimerazy a wspomniany czynnik transkrypcyjny jest polimerazą RNA, zwłaszcza polimerazą RNA T7. Ujawniono tutaj również wektory stosowane do transformowania wspomnianych komórek lub organizmów i komórki lub organizmy jako takie.
Sposób łagodzenia ataku szkodników roślinnych według wynalazku obejmuje: a) identyfikowanie sekwencji DNA ze wspomnianego nicienia, która jest kluczowa dla jego przetrwania, wzrostu, rozmnażania, b) klonowanie wspomnianej sekwencji z etapu a) lub jej fragmentu do odpowiedniego wektora w orientacji wobec promotora lub promotorów pozwalającej na inicjację transkrypcji wspomnianej sekwencji DNA do RNA lub dsRNA po związaniu odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego do wspomnianego promotora lub promotorów, oraz c) wprowadzanie wspomnianego wektora do rośliny.
Zatem, korzystnie, sposób według wynalazku dostarcza szczególny mechanizm selekcyjny do łagodzenia ataku szkodników, a w pewnych przypadkach ataku pasożytów roślinnych, w którym szkodniki żerujące na roślinie zjadają ekspresjonowane w roślinie dsRNA i w ten sposób roślina inhibituje u szkodnika ekspresję DNA, który jest kluczowy dla jego wzrostu, przetrwania, rozmnażania lub reprodukcji. W korzystnej realizacji wynalazku, nicieniem może być Tylenchulus ssp. Radopholus ssp., Rhadinaphelenchus ssp., Heterodera ssp., Rotylenchulus ssp., Pratylenchus ssp., Belonolaimus ssp., Canjanus ssp., Meloidogyne ssp., Globodera ssp., Nacobbus ssp., Ditylenchus ssp., Aphelenchoides ssp., Hirschmaniella ssp., Anguina ssp., Hoplolaimus ssp., Heliotylenchus ssp., Criconemella ssp., Xiphinema ssp., Longidorus ssp., Trichodorus ssp., Parartichodorus ssp., Aphelenchs ssp. Sekwencja DNA lub jej fragment zgodnie z tym aspektem wynalazku może być wklonowana pomiędzy dwa tkankowo-specyficzne promotory, takie jak promotory specyficzne dla korzeni.
Wektor ekspresyjny stosowany w dowolnym sposobie według wynalazku do konstruowania wspomnianej biblioteki może zawierać dwa identyczne promotory w orientacji wobec wspomnianej
PL 213 379 B1 sekwencji DNA pozwalającej na inicjację transkrypcji wspomnianej sekwencji DNA do dwuniciowego RNA po związaniu odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego do wspomnianych promotorów. Sekwencja DNA może, przykładowo, obejmować miejsce wielokrotnego klonowania. Dogodnie, wektor ekspresyjny zawiera dodatkowo sekwencję nukleotydową kodującą marker selekcyjny. Wspomniana sekwencja nukleotydowa kodująca wspomniany marker selekcyjny może być umieszczona pomiędzy dwoma identycznymi promotorami zdolnymi do inicjacji transkrypcji sekwencji nukleotydowej do dsR NA po związaniu czynnika transkrypcyjnego do promotorów. Dogodnie marker selekcyjny zawiera sekwencję nukleotydową kodującą sup-35, do wprowadzania do C.elegans posiadającego mutację pha-1.
Dogodnie, czynnik transkrypcyjny zawiera polimerazę fagową wiążącą się z odpowiednim promotorem lub promotorem specyficznym dla C. elegans, dogodniej polimerazę RNA T7. Dogodnie, wektor zawiera miejsce wielokrotnego klonowania pomiędzy wspomnianymi identycznymi promotorami.
Opisano również wektor ekspresyjny do ekspresji odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego do stosowania w sposobie według wynalazku, który to wektor zawiera sekwencję nukleotydową kodującą wspomniany czynnik transkrypcyjny operacyjnie związany z odpowiednimi sekwencjami kontrolującymi ekspresję. Dogodnie, sekwencje kontrolujące ekspresję obejmują promotory, które są indukowalne, konstytutywne, ogólne lub tkankowo-specyficzne, lub ich kombinacje. Korzystnie czynnik transkrypcyjny obejmuje polimerazę fagową, a dogodnie polimerazę RNA T7, T3 lub SP6.
Opisano również system selekcyjny do identyfikowania transformacji komórki lub organizmu wektorem tutaj opisanym, który to system zawiera wektor tutaj opisany, w którym marker selekcyjny zawiera sekwencję nukleotydową zdolną do inhibicji lub zapobiegania ekspresji genu we wspomnianej komórce lub organizmie, który to gen jest odpowiedzialny za nadawanie znanego fenotypu. Dogodnie wspomniana sekwencja nukleotydowa odpowiada części wspomnianego genu lub jest identyczna ze wspomnianym genem nadającym wspomniany znany fenotyp, i która to sekwencja nukleotydowa jest umieszczona pomiędzy dwoma identycznymi promotorami zdolnymi do inicjacji transkrypcji sekwencji nukleotydowej do dwuniciowego RNA po związaniu czynnika transkrypcyjnego do wspomnianych promotorów. Alternatywnie, sekwencja nukleotydowa zawiera sekwencję nukleotydową, która jest częścią lub jest identyczna z sekwencją wspomnianego genu, który nadaje znany fenotyp wspomnianej komórce lub organizmowi, i która to sekwencja nukleotydowa pozwala na integrację wspomnianego wektora poprzez rekombinację homologiczną z chromosomem wspomnianej komórki lub organizmu i po wspomnianej integracji wspomniana sekwencja nukleotydowa jest zdolna do inhibicji ekspresji wspomnianej sekwencji genu nadającej wspomniany znany fenotyp. Dogodnie sekwencja nukleotydowa zawiera kodony stopu wystarczające do zapobiegania translacji sekwencji nukleotydowej po jej integracji ze wspomnianym genomem.
Dogodnie sekwencja znanego genu zawiera gen sup-35 lub jego fragment, który może być selekcjonowany poprzez identyfikowanie potomstwa wzrastającego w temperaturze powyżej 25°C po wprowadzeniu do genomu mutanta pha-1 et123ts robaka C.elegans.
Wspomniana sekwencja znanego genu może zawierać gen sup-35 lub jego fragment, który może być selekcjonowany poprzez identyfikowanie potomstwa wzrastającego w temperaturze powyżej 25°C po wprowadzeniu wspomnianego wektora do genomu mutanta pha-1 et123ts robaka C.elegans.
Opisano tutaj także sposób przypisywania funkcji sekwencji DNA z organizmu wielokomórkowego, który to sposób obejmuje a) dostarczanie (i) konstruktu zawierającego fragment DNA sklonowany pomiędzy dwoma promotorami zdolnymi do inicjacji transkrypcji w tym organizmie wielokomórkowym z tego promotora;
b) identyfikowanie fenotypu wspomnianego organizmu wielokomórkowego w porównaniu z typem dzikim.
Niniejszy wynalazek może stać się łatwiejszy do zrozumienia w świetle poniższych przykładów, które są jedynie przykładami odnoszącymi się do załączonych figur, na których:
Figura 1 jest sekwencją nukleotydową plazmidu PGN1 tutaj opisanego.
Figura 2 jest sekwencją nukleotydową plazmidu PGN100 tutaj opisanego.
Figura 3 przedstawia schematycznie zastosowane wektory i drogę transformacji wykorzystaną w sposobach tutaj opisanych.
Figura 4 przedstawia wektor ekspresyjny zastosowany zgodnie z wynalazkiem.
Figura 5 przedstawia schemat wektorów ekspresyjnych polimerazy RNA T7 zastosowanych do transformacji C. elegans.
Figura 6 przedstawia plazmid PGN1.
PL 213 379 B1
Figura 7 przedstawia diagram prezentujący wzmocniony wektor do inhibicji dsRNA kodujący dsRNA sup-35.
Figura 8 przedstawia wektor do integracji z genomem C. elegans.
Figura 9 przedstawia pozycję sekwencji DNA względem odpowiedniego promotora inicjującego ekspresję dsRNA z sekwencji DNA.
Figura 10 przedstawia plazmid pGN108.
Figura 11 przedstawia plazmid pGN105.
Figura 12 przedstawia plazmid pGN400.
Figura 13 przedstawia plazmid pGN401.
Figura 14 przedstawia plazmid pGN110.
Figura 15 przedstawia plazmid pAS2 z promotorami T7/T3/SP6, zgodnym i odwrotnym.
Figura 16 przedstawia plazmid pGAD424 z promotorami T7/T3/SP6, zgodnym i odwrotnym.
Figura 17 przedstawia plazmid pAS2-cyh2-HA+, obydwa T7-końce.
Figura 18 przedstawia plasmid pGAD424-without-FULL-ICE-BOTH-T7.
Figura 19 (a) przedstawia plazmid pGN205, a (b) przedstawia plazmid pGN207.
P r z y k ł a d A: Konstruowanie uporzą dkowanej i hierarchicznie pogrupowanej biblioteki cDNA i jej zastosowania.
Losowo uporządkowana i pogrupowana biblioteka:
Wektorem jest wektor E. coli posiadający dwa promotory T7, z miejscem wielokrotnego klonowania (MCS) pomiędzy nimi. Obydwa promotory są skierowane do siebie, i do MCS. W obecności polimerazy RNA T7, ekspresjonowanej w E. coli, C. elegans lub dowolnym innym organizmie, produkowany będzie RNA, startując z promotorów T7. Ze względu na to, że są one ukierunkowane w przeciwnych sensach, obydwie nici RNA będą produkowane z DNA wbudowanego (sklonowanego) w MCS pomię dzy dwoma promotorami, co powoduje wytworzenie dwuniciowego RNA (dsRNA) po związaniu do niego polimerazy RNA T7.
Biblioteka cDNA C. elegans jest konstruowana w MSC za pomocą typowych technik biologii molekularnej. Biblioteka transformowana jest do E. coli, a uzyskane E. coli namnażane w hodowlach i przechowywane w 96-studzienkowych płytkach. Na tym etapie, DNA plazmidowy może być izolowany i przechowywany na 96-studzienkowych płytkach odpowiadającym koloniom E. coli. Zebranych jest około 100,000 kolonii. Dzięki temu biblioteka odpowiada w przybliżeniu 5-krotnej całkowitej ekspresji różnorodności cDNA z C. elegans, co daje możliwość obecności w bibliotece słabo ekspresjonowanych sekwencji. Uzyskuje się w wyniku tego około 1041 96-studzienkowych płytek. Gdy jest to konieczne, płytki grupowane są hierarchicznie. W celu pogrupowania klonów dzielone są one w zakresach od 10 do 100. Gdy grupowanie hierarchiczne następuje co 8 lub co 12 (liczby te są najbardziej odpowiednie, ponieważ płytki 96-studzienkowe posiadają 8 na 12 rzędów), daje to około 87 płytek kilko-studzienkowych i około 8352 studzienek. Gdy grupowanie hierarchiczne następuje co 96 studzienek, co odpowiada pełnej płytce, daje to około 11 płytek i około 1041 studzienek. W dowolnym etapie grupowania hierarchicznego, plazmidowy DNA może być izolowany, co jest tym mniej pracochłonne, im mniej płytek jest zastosowanych, lecz może zaowocować utratą kompleksowości, pomimo, że nie powinno to nastąpić przy grupowaniu co 12. Grupowanie DNA może być także prowadzone z oryginalnym DNA.
Eksperymenty poniżej opisują jak powinno być przeprowadzone hierarchiczne grupowanie, zarówno w przypadku biblioteki E. coli, jak i DNA.
Uporządkowana biblioteka do techniki RNAi, z każdym genem z genomu C. elegans, wraz z jej zastosowaniami.
Jako że projekt sekwencjonowania genomu ma się ku końcowi, informacje te mogą być zastosowane do stosowania techniki inhibicji RNA T7. Każdy gen z genomu C. elegans może być sklonowany za pomocą PCR. Dogodnie, klonowane są egzony o minimalnej długości 500 pz. Jeśli egzon jest zbyt mały, mniejsze fragmenty będą izolowane za pomocą PCR, lub nawet części intronów i sąsiednich egzonów będą izolowane techniką PCR, dzięki czemu przynajmniej wystarczająca część regionu genu ulegającego translacji będzie sklonowana. W tym celu należy przeprowadzić przynajmniej 17000 reakcji PCR. Taka kolekcja produktów PCR zostanie sklonowana w wektorze T7 zgodnie z opisem (dwa promotory T7 ukierunkowane do siebie z miejscem wielokrotnego klonowania pomię dzy nimi). Każdy produkt PCR jest klonowany niezależnie, lub może być stosowany do generowania losowej biblioteki, analogicznie do opisanej biblioteki cDNA. Gdy każdy produkt PCR jest klonowany niezależnie, uzyskiwane bakterie i plazmidowy DNA mogą być grupowane różnymi sposobami. Po
PL 213 379 B1 pierwsze, kolekcja niezależnie sklonowanych produktów PCR w wektorze RNA T7 i może być grupowana losowo, jak to opisano dla biblioteki losowej. Grupowanie można także prowadzić w bardziej racjonalny sposób. Przykładowo, geny z genomu C. elegans mogą być analizowane narzędziami bioinformatycznymi (biologia in silico). Różne geny z genomu mogą należeć do rodziny genów, lub posiadać homologi w genomie. Można zatem grupować członków rodziny genów, lub grupować członków będących homologami. W ten sposób całkowita liczba około 17000 klonów jest zredukowana do bardziej użytecznej ilości. Biblioteka ta może być zastosowana do poszukiwania fenotypów. Uzyskany fenotyp dostarcza funkcjonalnego opisu genu lub rodziny genów lub homologów genu z genomu C. elegans. Jako że biblioteka stanowi część wszystkich genów z genomu, sposób ten umożliwia opisanie pełnego genomu cechami funkcjonalno-fenotypowymi. W tym celu konieczne jest wprowadzenie dwuniciowego RNA (dsRNA) do robaków. Takie wprowadzenie pojedynczych klonów, lub klonów pogrupowanych, pogrupowanych losowo lub racjonalnie może być przeprowadzone kilkoma opisanymi metodami.
Przykład wektora do ekspresji dwuniciowego RNAi
Dowolny wektor zawierający promotor T7 może zostać wykorzystany, zwłaszcza zawierający miejsce wielokrotnego klonowania (wiele z nich jest dostępnych komercyjnie). Zaprojektowano startery zawierające promotor T7 i starter z odwrotną nicią komplementarną, obydwa z odpowiednimi końcami. Startery te mogą hybrydyzować, i gdy są dobrze zaprojektowane, być wklonowane do wybranego wektora. Minimalną sekwencją promotora T7 jest TAATACGACTCACTATAGGGCGA. Pomimo tego, że do konstruowania wektora ekspresyjnego T7 może być zastosowany dowolny wektor, poniżej podano przykład wykorzystujący w tym celu wektor pGEM-3zf(-).
- Wektor pGEM-3zf(+) (PROMEGA) trawiono Hind III i Sal I.
- Startery oGN1 i oGN2 mieszano wspólnie w ostatecznym stężeniu 1 μg/30 μ|, gotowano i schładzano powoli do temperatury pokojowej.
- Starter ligowano do wektora stosując standardową procedurę ligacyjną. Uzyskano tak wektor pGN1 (pokazany na Figurze 1), który zawiera dwa promotory T7 skierowane do siebie, otaczające leżące pomiędzy nimi miejsce wielokrotnego klonowania.
Sekwencje oGN1 i oGN2 są następujące:
- oGN1: AGC TGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GCG AGA AGC TT
- oGN1: TCG AAA GCT TCT CGC ATA ATA GTG AGT CGT ATT AC
Przykład konstruowania biblioteki
RNA może być izolowany z każdego, wrażliwego względem RNAi organizmu. Ogólnie, wyizolowany RNA jest następnie kopiowany w postaci dwuniciowego cDNA, a następnie, umieszczany w odpowiednich wektorach do klonowania. Istnieje kilka procedur oraz zestawów, produkowanych przez różne firmy, włączając Promega, Clontech, Boehringer Mannheim, BRL, itp., stosowanych w biologii molekularnej i pozwalających na:
- izolację RNA,
- ewentualnie możliwość wyizolowania RNA poliA (dostępnych jest kilka technik oraz zestawów),
- syntezę pierwszej nici za pomocą odwrotnej transkryptazy AMV, losowych heksamerowych starterów i/lub starterów oligonukleotydowych (dT),
- syntezę drugiej nici za pomocą RNAzy H, Polimerazy DNA I,
- przygotowanie tępych końców za pomocą Polimerazy DNA T4,
- dodatek adaptera za pomocą ligazy DNA T4,
- ewentualną obróbkę za pomocą kinazy polinukleotydowej T4,
- klonowanie cDNA do wektora.
Otrzymana mieszanina ligacyjna może być rozumiana jako biblioteka cDNA. Ligacja obejmuje wszystkie cDNA stosowane w procedurze ligacji do odpowiedniego wektora. W celu uporządkowania biblioteki, wymagane jest transformowanie produktu ligacji do szczepów E. coli.
Zastosowanie tych szczepów E. coli lub biblioteki DNA
Szczep produkujący RNA T7:
Standardowym szczepem jest BL21 (DE3):
F-ompT[lon]hsds(r-m-; oraz szczep E. coli B) λ (DE3). Ewentualnie mogą być zastosowane warianty BL21, mimo zastosowania BL21(DE3) pLys.
- Powinien być skonstruowany jakikolwiek inny, dostępny szczep E. coli, produkujący polimerazę RNA T7. Można to wykonać w prosty sposób, stosując handlowo dostępny preparat faga, w tym wypadku wykorzystano, wektor λCΕ6 (dostarczany przez Promega). Prawie każdy szczep E. coli może być transfekowany za pomocą tego faga i będzie produkował polimerazę RNA T7.
PL 213 379 B1
- Mutant RNAzy III E. coli:
Z pośród rożnych, dostępnych początkowo szczepów, do zastosowania w pierwszym eksperymencie wybrano szczep AB301-105: rna-19, suc-11, bio-3, gdhA2, his95, rnc-105, relA1, spoT1, metB1. (Kinder i wsp., 1973, Mol.Gen.Genet 126:53), ale inne szczepy mogą lepiej nadawać się do tego celu. Szczep ten zainfekowano λ CE6, co pozwoliło na uzyskanie wariantu produkującego polimerazę RNA T7.
Dziki typ robaków C.elegans może być hodowany na podłożu bakteryjnym. Bakterie ekspresjonują polimerazę RNA T7. Powoduje to powstanie dużych ilości dwuniciowego RNA w jelicie C.elegans, który dyfunduje następnie w organizmie i wywołuje inhibicję ekspresji. Biblioteka ta może być wykorzystana do skriningu kilku fenotypów. Technika ta jest zalecana ze względu na większą szybkość wykrycia istotnych genów, biorących udział w pewnych ścieżkach, niż znana, stosowana w badaniach C.elegans, technologia. Ponadto, w przypadku znalezienia interesującego fenotypu, umożliwia ona łatwe sklonowanie odpowiedzialnego genu.
Zastosowanie hierarchicznie uporządkowanej metody pozwala na łatwe wykrycie w drugim skriningu istotnego dla eksperymentu klonu z całego zbioru. DNA, jaki uległ insercji w tym klonie może być następnie sekwencjonowany. Eksperyment ten dostarcza w jednym etapie dane genetyczne i biochemiczne.
Dziki typ szczepów C.elegans może być stosowany w połączeniu ze związkami służącymi do skriningu fenotypu, oporności na leki i/lub wrażliwości na leki. Szczep C.elegans może być szczepem zmutowanym, o wzmocnionym fenotypie, zredukowanym fenotypie, lub nowym fenotypie. Szczep C.elegans może być szczepem zmutowanym a w skriningu biblioteki wykorzystywane różne związki. Dlatego też, skrining może być wykonany pod kątem oporności na leki, wrażliwości na leki, wzmocnionego fenotypu, zredukowanego fenotypu, lub nowego fenotypu. Szczep E. coli może być jakimkolwiek ekspresjonującym polimerazę RNA T7 szczepem, jak na przykład, BL21(DE3), ale tworzenie dwuniciowego RNA może być wzmocnione dzięki użyciu specjalnego szczepu E. coli, negatywnego pod względem RNAzy III. RNaza III rozpoznaje specyficzne pętle w dwuniciowym RNA. Ostatecznie, możliwe jest zastosowanie szczepu E. coli, w którym nastąpiła delecja RNAz innych niż RNaza III lub szczepu E. coli charakteryzującego się delecją jednej lub więcej RNAz. W większości znanych szczepów E. coli i konstruktów, zdolnych do generowania szczepów E. coli produkujących polimerazę RNA T7, ekspresja polimerazy RNA T7, ogólnie obejmuje indukowany promotor. Tym sposobem regulowana jest produkcja polimerazy RNA T7, a zatem też produkcja dwuniciowego RNA. Dogodnie, właściwość ta może być wykorzystana do pulsowego karmienia robaków C.elegans podczas specyficznych etapów ich wzrostu. Robaki hodowane są na nieindukowanych szczepach E. coli. W momencie, gdy osiągają odpowiednie stadium, indukuje się w bakteriach produkcję RNA T7. Pozwala to na badanie działania jakiegokolwiek genu, w jakimkolwiek punkcie cyklu życiowego zwierzęcia.
Skrining biblioteki pod kątem homologii z przypuszczalnie genami ludzkimi będącymi przedmiotem zainteresowania i przypisywanie funkcji tym genom
Podczas realizacji różnorodnych projektów, będących projektami genomowymi, ekspresjonowania różnicującego, analiz hybrydyzacyjnych itp., wyizolowano setki genów. Opisana biblioteka cDNA może dostarczać sposób na ocenę i /lub przypisanie funkcji tym genom w szybki i skuteczny sposób. Przede wszystkim, homologi z robaka lub homologi czy geny powinny być zidentyfikowane metodami bioinformatycznymi (biologia in silico). Przygotowywane są startery PCR oraz wyizolowane fragmenty cDNA przy użyciu technologii PCR. Reakcja PCR może być wykonana na hierarchicznie uporządkowanym zbiorze. Pozytywne zbiory lub pojedyncze studzienki zawierające bakterie posiadające odpowiedni cDNA są dostarczane jako karma dla C.elegans i odczytywany jest fenotyp.
PCR może być wykonany na cDNA wyizolowanym z C. elegans. Otrzymany DNA może być klonowany do wektora T7 i transformowany w produkujących dwuniciowy RNA E. coli, które następnie podawane są z karmą robakom C.elegans. Odpowiednią metodę należy wybrać zależnie od jej szybkości i wiarygodności.
W przypadku jeżeli gen należy do rodziny genów, może zaistnieć potrzeba karmienia robaków mieszaniną bakterii. Każda z nich obejmuje część członków rodziny genów. Szczepy E. coli, warunki wzrostu, stosowanie dodatkowych związków można opracować zgodnie z opisem powyżej.
Zastosowanie odpowiedniej biblioteki, w której wszystkie geny C.elegans są wklonowane w zorganizowany i określony sposób pozwala na łatwe wykrycie w tej bibliotece, za pomocą metod biologii in silico, homologów C.elegans i możliwie innych homologów, ortologów i członków rodziny genowej. Etap ten nie obejmuje PCR i umożliwia izolację obecnych podczas wzrostu robaków bakterii i/lub DNA.
PL 213 379 B1
P r z y k ł a d y
Założenie serii eksperymentów miało na celu przetestowanie zarówno wektora RNAi, jak i różnych, skonstruowanych szczepów E. coli.
1) Konstrukcja testowego plazmidu
W eksperymencie tym moż na zastosować jakikolwiek cDNA wywoł ują cy wyraź ny fenotyp robaków, w przypadku inaktywacji genu lub użyty w eksperymencie RNAi. Wiadomo, że odpowiednim kandydatem jest unc-22, ale możliwe jest zastosowanie innych genów. Wykorzystano system wrażliwości, możliwy do wykorzystania na etapie późnego stadium. System testowano za pomocą sup-35 i tł a pha-1. Egzon 5 pochodzą cy z sup-35 wyizolowano za pomocą PCR i wklonowano do wektora pGN1 z promotorem T7. Tak otrzymany wektor oznaczono jako pGN2. Mutanty robaków pha-1 (e2123) nie są zdolne do wydania potomstwa w temperaturach wyższych niż 25°C. Wynika to z zakłóceń rozwojowych na etapie embriogenezy. W przypadku, gdy sup-35 ulega inaktywacji lub inhibicji w takim szczepie, potomstwo może rosnąć w tej temperaturze. Połączone zastosowanie mutantów robaków pha-1 oraz sup-35 RNAi jest dobrym systemem do oceny różnych opcji.
2) Testowanie RNAi za pomocą szczepu E. coli, produkującego dwuniciowy RNA
- pGN2 został wprowadzony do szczepu E. coli BL21(DE3), a następnie za pomocą IPTG indukowano polimerazę RNA T7. Robaki C.elegans (pha-1 (e2123)) inokulowano do tych bakterii i hodowano w restrykcyjnej temperaturze 25°C. Ponieważ w takiej temperaturze hodowane są mutanty embrionowe, nie obserwuje się podczas takiej hodowli pojawiania się potomstwa. Natomiast w sytuacji skutecznej inhibicji genu sup-35 przez dwuniciowy RNA obecny w E. coli, zaobserwuje się obecność potomstwa.
- pGN2 został wprowadzony do szczepu E. coli AB301-105 (DE3), a nastę pnie za pomocą IPTG indukowano polimerazę RNA T7. Robaki C.elegans (pha-1 (e2123)) inokulowano do tych bakterii i hodowano w restrykcyjnej temperaturze 25°C. Ponieważ w takiej temperaturze hodowane są mutanty embrionowe, nie obserwuje się podczas takiej hodowli pojawiania się potomstwa. Natomiast w sytuacji skutecznej inhibicji genu sup-35 przez dwuniciowy RNA obecny w E. coli, zaobserwuje się obecność potomstwa.
3) Udoskonalenie szczepu robaków w celu lepszego pobierania dwuniciowego RNA
Przed rozpoczęciem hodowli C.elegans pha-1 na płytkach, w obecności szczepu E. coli, produkującego dwuniciowy RNA sup-35, robaki poddano mutagenezie za pomocą EMS (metanosulfonian etylu). Potomstwo tak zmutowanych robaków umieszczano na płytkach z bakteriami. Robaki wzrastające na tych bakteriach dawały większe ilości potomstwa, charakteryzującego się mutacją, co powodowało zwiększone pobieranie dwuniciowego RNA i pozwalało na zastosowanie w kolejnych eksperymentach.
Stabilne włączenie wektora odpowiedzialnego za produkcję dwuniciowego RNA do genomu robaków produkujących polimerazę RNA T7.
Wektor E. coli skonstruowano tak, by posiadał następujące właściwości: dwa promotory T7, skierowane ku sobie i pomiędzy tymi dwoma promotorami miejsce restrykcyjne lub miejsce wielokrotnego klonowania. Ponadto, wektor może zawierać genomowy DNA C.elegans sup-35, skonstruowany tak, by zawierał kilka kodonów stop w różnych obszarach tak, by nie było ekspresji pełnej długości białka z fragmentu genomowego DNA sup35, jak przedstawiono na Figurze 8. W miejscu wielokrotnego klonowania, pomiędzy dwoma promotorami T7, może być klonowany jakikolwiek cDNA lub fragment cDNA. Gdy taki wektor wprowadzany jest do szczepu C.elegans ekspresjonującego polimerazę RNA T7, to cDNA lub fragment cDNA wklonowany pomiędzy dwoma promotorami T7, ulega transkrypcji, generując z wklonowanego fragmentu dwuniciowy RNA.
Wektor zaprojektowany jest do zastosowania w przypadku mutantów pha-1 (e2123) robaków ekspresjonujących polimerazę RNA T7. Ekspresja polimerazy RNA T7 może mieć charakter konstytutywny lub podlegać regulacji, zachodzić ogólnie lub tkankowo-specyficznie. Robaki pha-1 (e2123) nie mogą wytwarzać potomstwa w temperaturze wyższej niż 25°C, co wynika z zakłóceń rozwojowych podczas embriogenezy. Natomiast, w przypadku gdy, sup-35 ulega inhibicji lub inaktywacji w tym szczepie, możliwy jest wzrost potomstwa w tej temperaturze.
Po wprowadzeniu do robaków wektora, może on ulec integracji w wyniku homologicznej rekombinacji (integracja typu Campbell). Wykazano, że taka homologiczna rekombinacja zachodzi u C.elegans, jednak z niską czę stotliwoś cią (Plasterk i Groenen, EMBO J. 11:287-290, 1992). Homologiczna rekombinacja w obrębie genu sup-35 daje w wyniku jego inaktywację, jako że dwa otrzymane geny sup-35 zawierają kodony stop. W rezultacie, robak i jego potomstwo, jeżeli taka rekombinacja zaszła w jajeczkach, posiada, zintegrowaną w swoim genomie kopię wektora. Dzięki temu może być
PL 213 379 B1 przeprowadzona na podstawie posiadania potomstwa w temperaturze wyższej niż 25°C selekcja robaków z inaktywowanym sup-35. Ponadto, taki robak trwale produkuje dwuniciowy RNA, pochodzący z fragmentu DNA wklonowanego uprzednio pomię dzy dwoma promotorami T7. Tak scharakteryzowany typ robaka można uważać za trwale transgeniczny szczep organizmu o zredukowanej funkcji genu, z którego fragment został wcześniej wklonowany pomię dzy dwoma promotorami T7.
DNA może być dostarczany do organizmu robaków za pomocą kilku technik, włączając iniekcję, transformację balistyczną, moczenie w roztworze DNA, dodatek do karmy bakterii. Można rozważyć nowe i inne metody zwiększające wydajność transformacji.
Docelowy szczep C.elegans może, dodatkowo, zawierać inne mutacje, niż mutację pha-1 (e2123) i ekspresjonować inne geny, niż polimerazę RNA T7.
Przykład B: Drożdżowy wektor dwuhybrydowy RNAi
Drożdżowy wektor dwuhybrydowy skonstruowany został tak, by zawierał dwa promotory T7. Wektory takie zaprojektowano tak, by ulegały replikacji, zarówno w drożdżach, jak i w E. coli. Ogólnie, biblioteki cDNA w przypadku drożdżowego systemu dwuhybrydowego konstruowane są w wektorach Gal4 lub LexA. Biblioteka konstruowana jest w wektorach posiadających domenę aktywacyjną jednego z tych genów. Wektor można skonstruować w taki sposób, aby wciąż przeprowadzać skrining, ale żeby również zawierał on te dwa promotory T7, zorientowane ku sobie i obejmował miejsce klonowania pomiędzy nimi. Ułożenie sekwencji w plazmidzie będzie zatem miało postać: szkielet plazmidu, (GAL4-T7), MCS, T7, szkielet. Biblioteka cDNA C.elegans skonstruowana w takim wektorze może być zastosowana jako standardowa drożdżowa, dwuhybrydowa biblioteka w eksperymencie izolacji białek oddziałujących z danym białkiem. Po wyizolowaniu klonu, plazmid może być wprowadzany do szczepu E. coli ekspresjonującego polimerazę RNA T7, w wyniku czego uzyska się produkcję dwuniciowego RNA, pochodzącego od wklonowanego fragmentu. Bakterie produkujące taki dwuniciowy RNA mogą być włączone do pokarmu robaków i można oceniać fenotypy. Jak w poprzednim przykładzie, taka procedura oceny dla nowo wyizolowanego drożdżowego dwuhybrydowego klonu jest znacznie krótsza niż standardowa procedura, wymagająca PCR i/lub etapów klonowania, eksperymentów z wykorzystaniem RNA i/lub eksperymentów inaktywujących gen. W większości przypadków, wyizolowane klony są na początku sekwencjonowane, a na podstawie sekwencji podejmowana jest decyzja czy eksperyment powinien być dalej kontynuowany. Każdy wyizolowany klon może być łatwo wprowadzony do odpowiedniego szczepu E. coli i dostarczony robakom. Ocenę przeprowadza się następnie przez analizę fenotypową.
W celu zastosowania tej procedury przygotowano droż d ż ową podwójną hybrydę , wykorzystują c znany gen jako przynętę oraz nowo skonstruowaną bibliotekę jako cel. Docelowe białka kodowane przez klony oddziałujące z białkiem przynętą dały w rezultacie pozytywne klony drożdżowe, ekspresjonujące cząsteczkę reporterową, tak jak obserwowane to jest w przypadku LacZ oznaczanego za pomocą X-gal. Plazmid kodujący docelowe białko izolowany jest bezpośrednio ze szczepu drożdży i wprowadzany do E. coli. Szczep E. coli jest szczepem produkującym polimerazę RNA T7. W tym przypadku, dwuniciowy RNA produkowany jest z DNA wklonowanego w miejscu wielokrotnego klonowania wektora. Po wprowadzeniu takiego dwuniciowego RNA, wraz z karmą do organizmu robaków, za pomocą opisanych uprzednio metod, gen ulega inhibicji u tych organizmów, co skutkuje określonym fenotypem.
- Taki droż d ż owy dwuhybrydowy wektor moż e być dogodnie zastosowany do konstruowania uporządkowanej i hierarchicznie pogrupowanej biblioteki, jak opisano w poprzednim przykładzie.
- Możliwe jest skonstruowanie szczepu drożdży warunkowo produkującego polimerazę RNA T7. W wyniku zastosowania w eksperymentach drożdżowych podwójnych hybryd, można uzyskać indukcję ekspresji polimerazy T7, co wywołuje w rezultacie produkcję dwuniciowego RNA w komórkach drożdżowych. Konsekwentnie, drożdże mogą być dostarczane w pokarmie robakom. Wykazano, że robaki C.elegans mogą otrzymywać w karmie drożdże.
Konstrukcja szczepu produkującego polimerazę RNA T7 i jego zastosowania
Możliwe jest skonstruowanie szczepu C.elegans tak, by produkował on polimerazę RNA T7. Ekspresja może mieć charakter konstytutywny i ogólny, ale możliwe jest też uzyskanie jej regulacji pod tkankowo-specyficznym promotorem, promotorem ulegającym indukcji, lub promotorem czasowym lub promotorem posiadającym jedną z tych właściwości lub też ich kombinację. Do tak przygotowanego szczepu C.elegans może być wprowadzany DNA. Wprowadzenie DNA uzyskuje się w wyniku iniekcji, czy wstrzeliwania cząsteczek, dzięki zastosowaniu elektroporacji, lub, jak wcześniej wspomniano, poprzez dostarczenie wraz z karmą. W przypadku, gdy DNA ma postać plazmidu, jak opisano
PL 213 379 B1 w poprzednich przykł adach, np. jest plazmidem zawierają cym wklonowany fragment cDNA lub fragment otrzymany w wyniku PCR, pomiędzy dwoma flankującymi promotorami T7, w komórkach lub w całym organizmie powstaje dwuniciowy RNA, pochodz ący od tego cDNA lub fragmentu PCR, co wywołuje inhibicję odpowiedniego genu. Tak wprowadzony DNA może wydajnie pośredniczyć w przejś ciowej inhibicji. Wprowadzony DNA moż e tworzyć struktury pozachromosomalne, które mogą powodować w rezultacie więcej katalitycznych inaktywacji lub redukcji funkcji fenotypowych. Plazmid może również ulec integracji do genomu organizmu, powodując takie katalityczne inaktywacje lub redukcję funkcji fenotypowych, ale w postaci utrwalonej i stabilnie przenoszonej.
- W wyniku zastosowania standardowych metod możliwe jest wprowadzenie do organizmu robaka produkującego polimerazę RNA T7, plazmidu DNA zawierającego cDNA lub część cDNA lub EST, lub fragment PCR pochodzący z C.elegans, wklonowany pomiędzy dwoma promotorami T7, jak opisano w Przykładach A) oraz B). Możliwa jest analiza fenotypów - DNA, pochodzący z uporządkowanej biblioteki, jak w Przykładzie A) może być wprowadzony do organizmu robaków, produkujących polimerazę RNA T7, w wyniku zastosowania standardowych technik (iniekcja, wstrzeliwanie). Możliwa jest analiza fenotypów. Wyjściowy klon może być łatwo odnaleziony przy użyciu metody hierarchicznego uporządkowania.
- Taka sama procedura moż e być zastosowana w przypadku mutantów robaków ekspresjonujących polimerazę RNA T7. Możliwy jest skrining dla wzmocnionego, zredukowanego lub nowego fenotypu.
- Procedura może być zastosowana w celu przeprowadzenia skriningu związków. Skrining, zarówno dla dzikiego szczepu, jak i dla zmutowanego możliwy jest dla wzmocnionego lub nowego fenotypu.
- DNA moż e być wprowadzony do organizmu robaków w wyniku zastosowania nowych metod. Jedną z nich jest dostarczenie DNA poprzez E. coli. W tym przypadku, hierarchicznie uporządkowana biblioteka jest dostarczana jako karma zwierzęciu. W celu zapobiegnięcia trawieniu DNA E. coli w jelicie nicienia, dogodnie stosuje się C. elegans z niedoborem DNAzy, taki jak nuc-1 (e1392). Procedura ta jest jedną z najbardziej interesujących ze względu na brak zależności od wydajności transformacji, jaka występuje w przypadku innych technik, i ogólnie, pozwala na szybsze i mniej pracochłonne wykonanie eksperymentu.
2) Przypuszczalne wzmocnienie metody
- wektor projektowany jest tak, by zawierał cDNA sup-35 lub część tego cDNA, wklonowany pomiędzy dwoma promotorami T7. Pozostała część wektora jest taka jak opisano w Przykładzie A) i B). Taki wektor może być wprowadzony do mutanta pha-1ts C.elegans. W tym przypadku stosuje się system selekcji oparty na temperaturze, wskazujący robaki, które posiadają zdolność przeżycia w restrykcyjnej temperaturze dzięki uprzedniemu pobraniu DNA i ekspresji dwuniciowego RNA sup35. Możliwe jest otrzymanie hierarchicznej uporządkowanej biblioteki poprzez zastosowanie jakiejkolwiek metody opisanej powyżej.
- do konstrukcji biblioteki wprowadzonej do ekspresjonującej polimerazę RNA T7 E. coli moż e być zastosowany wektor. W tym przypadku możliwy jest analogiczny skrining, jak w części A), wraz z dodatkowym skriningiem robaków, u których aktywny jest dwuniciowy RNA sup-35.
- DNA i/lub dwuniciowy RNA sup-35 mogą być dostarczone za pomocą odrębnych plazmidów. W przypadku karmienia, zarówno DNA dostarczanym z karmą (Przykład C), jak i dwuniciowym RNA dostarczanym z karmą Przykład A) i B), możliwe jest dostarczenie dwóch plazmidów, obecnych w jednej bakterii, lub dostarczenie z karmą mieszaniny bakterii, z których jedna zawiera konstrukt sup-35.
Przykład konstrukcji C.elegans produkującego RNA T7
W celu uzyskania produkcji polimerazy RNA T7 w organizmie robaka, dostępnych jest kilka możliwości. Polimeraza T7 może być ekspresjonowana pod kontrolą różnych promotorów, promotorów ulegających indukcji, promotorów konstytutywnych, ogólnych i tkankowo- (komórkowo) specyficznych, lub promotorów będących kombinacją wyżej wymienionych. Przykładami takich promotorów są promotor szoku cieplnego hsp-16, promotor jelitowy ges1, promotor pochodzący z cet858, jak również promotor z dpy7 oraz element promotorowy GATA1. W powyższym przykładzie polimeraza RNA T7 ekspresjonowana jest pod kontrolą promotora hsp16, dostępnego w wektorze pPD49.78. Polimeraza RNA T7 izolowana jest jako produkt PCR z użyciem starterów GN3 oraz GN4.
Otrzymany w wyniku reakcji PCR produkt trawiony jest za pomocą enzymów NheI oraz NcoI, jak wektor, który ma być użyty do klonowania, wektor Fire pPD49.78. Otrzymany wektor jest wektorem pGN100, przedstawionym na Figurze 2 i obejmuje oGN3: CAT GGC AGG ATG AAC ACG ATT AAC ATC GC, oGN4: ATG GCC CCA TGG TTA CGG GAA CGC GAA GTC CG.
PL 213 379 B1
Wektor wprowadzany jest do organizmu robaka za pomocą standardowych technik, na przykład mikroiniekcji.
W kolejnym etapie konstruowane są następujące szczepy:
- Dziki typ (Pgn100)
- nuc-1 (e1392) (pGN100)
- pha-1 (e2123) (pGN100)
- pha-1; nuc-1 (pGN100)
Wszystkie wymienione szczepy są zdolne do produkcji polimerazy RNA T7 pod wpływem indukcji temperaturowej lub, alternatywnie, w wyniku indukcji uzyskanej dzięki obecności metali, takich jak zastosowanie metali ciężkich, jak kadm lub rtęć. Procedura indukcji za pomocą temperatury polega na podwyższeniu temperatury dla zwierzęcia do 30-33°C przez przynajmniej godzinę, a następnie powrót do standardowej temperatury (15-25°C).
W celu uzyskania produkcji jakiegokolwiek RNA w organizmie robaka może być zastosowany dziki typ szczepu produkującego polimerazę RNA T7. Bardziej specyficznie, do organizmów robaków mogą być wprowadzone plazmidy pochodzące z opisanych bibliotek, a następnie może być przeprowadzana ocena fenotypowa.
Mutant nuc-1 robaka może być wykorzystany w eksperymencie wprowadzenia DNA przez bakterie, poprzez dostarczanie bakterii z pokarmem. Ze względu na to, że mutant nuc-1 nie posiada zdolności trawienia DNA, plazmidowy DNA może przejść poprzez ściany jelita. Jeżeli jest on pobrany przez komórki produkujące polimerazę RNA T7, możliwa jest produkcja dwuniciowego RNA i przez to inhibicja genu, z którego ten RNA uległ transkrypcji.
Szczep mutanta pha-1, produkujący polimerazę RNA T7 może być zastosowany do wzmocnienia procedury, jak opisano powyżej. DNA może być wprowadzony w wyniku wstrzeliwania, mikroiniekcji lub karmienia. Bardziej specyficznie, szczep ten może być wykorzystany dla wektorów produkujących dwuniciowy RNA pochodzący z sup-35 i z będącego przedmiotem zainteresowania genu, którym może być produkt PCR, cDNA lub biblioteka, zgodnie z tym, jak opisano powyżej.
Mutant pha-1; nuc-1 produkujący polimerazę RNA T7 może być wykorzystany w eksperymencie opartym na bakteryjnym dostarczeniu DNA. DNA dogodnie jest plazmidem, produkującym dwuniciowy RNA pochodzący z zarówno sup-35, jak i genu będącego przedmiotem zainteresowania. Mutant ten będzie preferencyjnie produkował polimerazę RNA T7 w jelicie. Dostarczenie będzie preferencyjnie zachodziło dzięki wzrostowi robaka w obecności bakterii posiadających plazmid.
Zastosowanie technologii RNAi u roślin
Nicienie powodują znaczną część szkód występujących u roślin, w szczególności dotyczy to roślin uprawnych. Zgodnie z wynalazkiem, procedury RNAi mogą być zastosowane w przypadku roślin w celu uniemożliwienia dłuższego żerowania pasożytniczych nicieni. W pierwszym etapie, izolowany jest z pasożytującego na roślinie nicienia krytyczny dla przeżycia lub wzrostu, bądź też dla odżywiania lub proliferacji fragment DNA. Odpowiedni do tego celu jest jakikolwiek gen, którego ekspresja jest ważna do przeżycia.
Następnie poddaje się klonowaniu część, egzon lub cDNA tego genu. Taki fragment DNA może być wklonowany pod kontrolą tkankowo-specyficznego promotora, korzystnie, promotora specyficznego dla korzenia, a nawet korzystniej, pomiędzy dwoma, specyficznymi dla korzenia promotorami. DNA wklonowanego genu pod kontrolą promotora specyficznego dla korzenia wprowadza się do docelowej rośliny za pomocą technologii transgenicznych roślin. Możliwe jest uzyskanie dla każdego pasożytniczego nicienia odmiennych fragmentów DNA i podobnie dla każdej odmiany roślinnej istnieje potrzeba zastosowania różnego promotora.
W ten sposób, w przypadku wykorzystania specyficznego dla korzenia promotora, korzeń będzie produkował RNA lub dwuniciowy RNA pochodzący z wprowadzonego fragmentu DNA. Ze względu na to, że nicienie odżywiają się na roślinach, RNA i/lub dwuniciowy RNA będzie spożywany lub przyjmowany przez nicienie. Umożliwia to dostarczenie RNA i/lub dwuniciowego RNA do komórek nicieni, a następnie jego inhibujące działanie względem docelowego DNA. W zależności od charakteru wklonowanego fragmentu DNA, nicienie są niezdolne do przeżycia, odżywiania się, proliferacji, itd., w każdym przypadku uniemożliwia to dalsze żerowanie zwierzęcia na roślinie i przez to zapewnia tej roślinie ochronę.
Konstrukcja C.elegans produkującego polimerazę RNA T7 Istnieje kilka możliwości uzyskania produkcji polimerazy RNA T7, lub innych polimeraz RNA, u zwierząt, a szczególnie, u nicieni, zwłaszcza w przypadku C.elegans. Polimeraza RNA T7 może ulegać ekspresji pod kontrolą różnych promotorów.
PL 213 379 B1
Promotory te mogą mieć charakter indukowany lub konstytutywny, ogólny, bądź tkankowo-specyficzny, lub też mają być kombinacją wyżej wymienionych promotorów.
P r z y k ł a d 1:
Konstrukcja podstawowego wektora służącego do ekspresji polimerazy T7 u C.elegans
Dzięki zastosowaniu PCR dokonano, zgodnie z standardowymi procedurami, amplifikacji sekwencji kodującej polimerazę T7 z λ CE6 (Novagen, Medison, USA), przy czym w reakcji tej wykorzystano następujące startery: oGN26 (ATGGAATTCTTACGCGAACGCGAAGTCCG) oraz oGN46 (CTCACCGGTAATGAACACGATTAACATCGC) (PCR, A practical approach, 1993, Ed. J.McPherson i wsp., IRL Press). Otrzymany fragment DNA, kodują cy polimerazę RNA T7 trawiono enzymami AgeI oraz Eco RI, a następnie wstawiano do wektora Fire pPD97.82, trawionego AgeI i Eco RI. Tak otrzymany konstrukt kodował otwartą ramkę odczytu dla polimerazy RNA T7, w połączeniu z białkiem sygnałowym lokalizacji jądrowej dużego antygenu T SV40 (NLS) o sekwencji aminokwasowej MTAPKKKRKVPV. Taka sekwencja sygnałowa lokalizacji jądrowej konieczna jest do translokacji polimerazy RNA T7 z cytoplazmy do jądra, gdzie możliwe jest wiązanie ze specyficznymi dla niej promotorami, określonymi jako promotory T7. Powyżej sekwencji kodującej białko fuzyjne polimerazy T7 znajduje się minimalny promotor (myo-2), poprzedzony przez miejsce wielokrotnego klonowania (MSC), w którym możliwe jest wstawienie kilku promotorów C.elegans. Plazmid ten (pGN105, przedstawiony na Figurze 11) jest podstawowym plazmidem polimerazy RNA T7 umożliwiającym ekspresję polimerazy T7 u C.elegans . Pochodne tego plazmidu zawierają wklonowane w miejscu wielokrotnego klonowania promotory, zapewniające indukowaną, konstytutywną, ogólną lub też tkankowo-specyficzną ekspresję polimerazy RNA T7 u C.elegans, ponieważ ekspresja ta podlega kontroli i regulacji, zależnie od wklonowanego, w miejscu wielokrotnego klonowania, promotora.
Znana jest indukcja ekspresji wymienionych promotorów w następujących tkankach: let-858 (ogólna ekspresja), myo-2 (ekspresja w gardzieli), myo-3 (mięśnie ciała), egl-15 (mięśnie sromowe), unc-119 (pan-neurony), ale te promotory nie stanowią ograniczenia.
P r z y k ł a d 2:
Konstrukcja wektora do ekspresji polimerazy RNA T7 w tkance mięśniowej C.elegans
Dzięki zastosowaniu PCR dokonano amplifikacji sekwencji kodującej polimerazę T7 z λ CE6 (Novagen, Medison, USA), przy czym w reakcji tej, wykorzystano następujące startery: oGN43 (GCCA-CCGGTGCGAGCTCATGAACACGATTAACATCGC) oraz OGN44 (CACTAGTGGGCCCTTACGCGA-ACGCGAAGTCCG). Następnie trawiono za pomocą enzymów Agel/Spel i wstawiano do wektora pGK13, trawionego Agel/Spel.(Wektor ten zawierał silny promotor SERCA, kierujący ekspresją w gardzieli, mięśniach sromowych, mięśniach ogona i ciała). Sygnał lokalizacji jądrowej (NLS) dużego antygenu T SV40 wstawiono z przodu sekwencji kodującej polimerazę T7 poprzez wstawienie w miejscach restrykcyjnych Sacl/Agel dwóch, zachodzących oligonukleotydów oGN45 (CCGGATGACTGCTCCAAAGAAGAAGCGTAAGCT) oraz oGN46(CTCACCGGTAATGAACACGATTAACATCGC). Otrzymany konstrukt, przedstawiony na Figurze 10, nazwano pGN108. Wprowadzenie tego plazmidu do C.elegans wywoływało ekspresję polimerazy RNA T7 w mięśniach gardła i sromu oraz mięśniach ogona i ciała.
W celu sprawdzenia ekspresji i działania polimerazy RNA T7, pod kontrolą i regulacją promotora SERCA u C.elegans, wstrzykiwano do jego organizmu pGN108, kodujący polimerazę RNA T7, pod kontrolą promotora SERCA. Jednocześnie wstrzykiwano testowy wektor, kodujący GFP, pod kontrolą promotora T7 (pGN401 na Figurze 13). Plazmid pGN401 skonstruowano poprzez wstawienie w miejscu Sacl/Agel otwartego wektora FIRE pPD97.82 dwóch zachodzących oligonukleotydów oGN41 (CCCGGGATTAATACGACTCACTATA) oraz OGN42 (CCGGTATAGTGAGTCGTATTAATCC-CGGGAGCT), tworząc promotor T7. Ponadto, wraz z plazmidami, wstrzyknięto marker selekcyjny, pozwalający na określenie stopnia transformacji (ro16, pRF4). Specjalistom w dziedzinie dobrze znany jest ten ostatni wektor selekcyjny pRF4. Transgeniczne F1 mogą być łatwo uzyskane ze względu na pojawiający się fenotyp ro16. Tak uzyskane transgeniczne C.elegans, wszystkie, ekspresjonują GFP w gardzieli, mięśniach sromowych, mi ęśniach ogona i ciał a. Zatem dane te jasno wskazują na to, ż e polimeraza RNA T7 jest funkcjonalnie ekspresjonowana pod kontrolą promotora SERCA. Tak ekspresjonowana polimeraza RNA T7 wiąże się z promotorem T7, obecnym w pGN401 i inicjuje transkrypcję genu GFP, który jest następnie funkcjonalnie ekspresjonowany, co wywołuje pojawienie się fluorescencji w tkankach mięśni, w których promotor SERCA indukuje ekspresję polimerazy RNA T7.
P r z y k ł a d 3:
Konstrukcja wektora niespecyficznej ekspresji polimerazy T7 u C.elegans
PL 213 379 B1
Z pGNl08 izolowano gen fuzyjny NLS-polimerazy RNA T7 za pomocą Xmal/Bsp1201 i klonowano do wektora Fire pPD103.05, trawionego Xmal/Bsp1201. W rezultacie otrzymano wektor, w którym polimeraza RNA T7 znajduje się pod kontrolą promotora let858. Ten specyficzny promotor umożliwia ekspresję polimerazy RNA T7 we wszystkich tkankach. Tak otrzymany plazmid nazwano pGN110 (Figura 14).
P r z y k ł a d 4:
Konstrukcja wektora do ekspresji fragmentów DNA, genów i cDNA, zależnej od polimerazy RNA T7 pod kontrolą promotora T7
Wektor Fire pPD97.82 trawiono za pomocą Sacl/Agel i, poprzez wstawienie w miejscach restrykcyjnych Sacl/Agel dwóch zachodzących oligonukleotydów oGN41 (CCCGGGATTAATACGACTCACTATA) oraz oGN42 (CCGGTATAGTGAGTCGTATTAATCCCGGGAGCT) generowano sekwencję promotora T7. Konstrukt ten (pGN400, Figura 12) zawierał otwartą ramkę odczytu GFP, wklonowaną pomiędzy miejscami restrykcyjnymi endonukleaz SacI i EcoRI pod kontrolą promotora T7. Do takiego wektora, w wyniku dokonania delecji genu GFP w postaci fragmentu Agel/SacI i wklonowaniu do wektora fragmentu DNA będącego przedmiotem zainteresowania, może być wklonowany jakikolwiek gen, cDNA lub fragment DNA. Dogodnie, fragment DNA będący przedmiotem zainteresowania można uzyskać za pomocą reakcji amplifikacji PCR, poprzez wstawienie miejsca Sacl/Afel w startery. Tak otrzymany po amplifikacji PCR fragment DNA jest trawiony i gen GFP w pGN400 zastępowany amplifikowanym fragmentem DNA.
W celu uzyskania indukowanej ekspresji polimerazy RNA T7 u C.elegans możliwe jest użycie jakiegokolwiek wektora zawierającego promotor T7, takiego jak handlowo dostępne wektory pGEM i pBluescript. Wykazano to jasno na przykładzie wektora pGN401, ekspresjonującego GFP pod kontrolą promotora T7 u transgenicznych C.elegans, ekspresjonujących polimerazę RNA T7.
Zastosowanie pGN400 ma zaletę związaną z tym, że wektor ten zawiera fragment 3'UTR, pochodzący z unc-54, powodujący wzmocnienie transkrypcji lub stabilności RNA.
Wytwarzanie trwałych, tkankowo-specyficznych pseudo inaktywacji RNAi linii C.elegans
Inaktywacja genu u C. elegans uzyskiwana jest obecnie w wyniku losowych, przeprowadzanych na dużą skalę mutagenez i opartej na PCR sib-selekcji. Metoda ta jest niewygodna, czasochłonna oraz mało interesująca. Wykazano, że wprowadzenie dwuniciowego RNA do komórki wywołuje silne i specyficzne oddziaływanie na ekspresję endogennych genów. W przypadku C.elegans można uzyskać zahamowanie ekspresji genu poprzez wstrzyknięcie RNA do jamy ciała robaka, moczenie robaka w roztworze zawierającym dwuniciowy RNA lub karmienie bakteriami E. coli, ekspresjonującymi odpowiadający badanemu genowi, dwuniciowy RNA. Komórki C.elegans posiadają zdolność pobierania dwuniciowego RNA z ich zewnątrzkomórkowego środowiska. Stwierdzono, że mRNA jest celem genetycznych oddziaływań, w których pośredniczy taki dwuniciowy RNA (Montgomery i Fire, 1998). Sugerowano również, że degradacja docelowego RNA ma miejsce w jądrze, przed możliwą translacją. Mimo że mediowana poprzez RNAi redukcja ekspresji genu może zostać przekazana następnym pokoleniom, dziedziczność jest słaba i efekt ten jest szybko tracony u kolejnego potomstwa. Zjawisko to wywołane jest prawdopodobnie w wyniku stałego obniżania ilości dwuniciowego RNA. W niniejszym eksperymencie zaproponowano metodę stworzenia linii C.elegans o stałym, dziedzicznym fenotypie RNAi. Metoda ta obejmuje wytwarzanie transgenicznych linii C.elegans poprzez wprowadzenie plazmidów zawierających fragmenty cDNA docelowego genu w sensownej i antysensownej orientacji, pod kontrolą promotora pochodzącego z tych robaków lub też, poprzez transkrypcję cDNA o odwrotnie powtórzonej sekwencji z pojedynczego konstruktu. Alternatywnie, możliwe jest uzyskanie transkrypcji dwuniciowego RNA z wektora zawierającego cDNA, flankowanego przez dwa promotory T7 w ekspresjonującym polimerazę T7 szczepie C.elegans. W wyniku tego otrzymuje się transgeniczny organizm o dziedzicznie stabilnym pseudo inaktywowanym fenotypie. Ekspresja cDNA lub polimerazy T7 może mieć charakter ogólny i konstytutywny, ale też może podlegać regulacji pod kontrolą tkankowo-specyficznego promotora. W przeciwieństwie do RNAi indukowanego poprzez pochodzący z zewnątrz dwuniciowy RNAi (wstrzykiwany, wchłaniany poprzez moczenie lub podawany jako pożywienie), metoda ta umożliwia uzyskanie warunkowej, tkankowo-specyficznej inhibicji ekspresji genu.
Inhibicja ekspresji unc-22 poprzez zakłócenia RNA wywołujące pojawienie się kurczącego się fenotypu.
cDNA unc-22 (egzon22) wklonowano w sensownej i antysensownej orientacji w pPD103.05. (A.Fire nr L2865), zawierającym zdolny do ekspresji sekwencji RNA we wszystkich tkankach, promotor let 858. Otrzymane plazmidy nazwano pGN205 (Figura 19a) oraz pGN207 (Figura 19b). Konstrukty
PL 213 379 B1 te wprowadzono do C.elegans wraz z markerem selekcyjnym (rol-6; GFP). Transgeniczne osobniki F1 (ekspresjonujące rol-6 lub GFP) wykazywały kurczący się fenotyp, wskazując, że RNAi mogłaby być zależna od endogennej transkrypcji RNA z transgenicznego DNA. Fenotyp RNAi przenoszony był wraz z markerem selekcyjnym do kolejnego potomstwa. W ten sposób otrzymano linie C.elegans o stałym fenotypie RNAi.
Produkcja stabilnych linii polimerazy RNA T7 oraz podwójnie transgenicznych robaków
System ekspresji u C.elegans oparty na egzogennej polimerazie RNA wymaga obecności dwóch plazmidów. Jeden z plazmidów powinien kodować polimerazę RNA pod kontrolą specyficznego promotora, podczas gdy drugi, mający ulec ekspresji fragment DNA, pod kontrolą promotora T7. W przypadku częściowo stabilnego RNAi zaprojektowano również pseudo-stabilne inaktywacje genu i DNA będący przedmiotem zainteresowania klonowano pomiędzy dwoma promotorami T7, wywołując tym produkcję dwuniciowego RNA.
Ze względu na to, że system ekspresji polimerazy RNA T7 jest systemem wysokiej ekspresji, wywołuje to problemy związane z otrzymaniem podwójnie transgenicznych zwierząt. Jeżeli mający ulec ekspresji w nicieniu C.elegans gen jest toksyczny, powoduje to efekt letalny i w skutek tego w konstrukcie C.elegans brak silnie regulowanej, stabilnej ekspresji genu będącego przedmiotem zainteresowania. Jeżeli będący przedmiotem zainteresowania gen jest istotny dla przeżycia organizmu, RNAi wraz z fragmentem DNA z tego genu wywołuje również letalny efekt, tak więc nie są możliwe pseudo-stabilne inaktywacje genu.
W celu ominięcia tego problemu opracowano zgodnie z wynalazkiem system obejmujący dwa transgeniczne zwierzęta. Pierwsze jest transgeniczne ze względu na polimerazę RNA T7, która może ulegać ekspresji we wszystkich komórkach lub specyficznych komórkach, bądź też w tkankach, jak wykazano w poprzednich przykładach. Drugie zwierzę jest transgeniczne ze względu na będący przedmiotem zainteresowania fragment DNA. Gen ten, lub cDNA, związany jest z promotorem T7 lub, w celu uzyskania RNAi, fragment DNA takiego genu wklonowany jest pomiędzy dwa promotory T7.
Oba transgeniczne zwierzęta są żywotne i nie wykazują jakiejkolwiek nieprawidłowości fenotypowej. Uzyskano ten efekt dzięki temu, że w przypadku pierwszego transgenicznego organizmu, ekspresjonowana polimeraza RNA T7 nie jest toksyczna, nawet jeśli poziom ekspresji jest wysoki. W przypadku drugiego transgenicznego organizmu, gen będący przedmiotem zainteresowania nie ulega ekspresji lub też nie jest produkowany dwuniciowy RNA, ze względu na to, że zwierzęta te nie posiadają polimerazy RNA T7.
Ekspresję genu lub cDNA będącego przedmiotem zainteresowania, czy też RNAi z fragmentem DNA można obecnie uzyskać poprzez skrzyżowanie dwóch transgenicznych zwierząt. Tak uzyskane potomstwo jest podwójnie transgeniczne i ekspresjonuje gen będący przedmiotem zainteresowania lub też ekspresjonuje dwuniciowy RNA będącego przedmiotem zainteresowania fragmentu DNA.
W celu uzyskania odpowiedniej liczby osobników męskich w wyniku takiej krzyżówki, jeden z takich transgenicznych osobników może być mutantem C.elegans o fenotypie sprzyjającym powstawaniu potomstwa męskiego. Przykładem takiego mutanta jest him-5. Preferencyjnie taki mutant umożliwi otrzymanie transgenicznych pod względem polimerazy RNA T7 C.elegans, gdzie hermafrodyty zawierają fragment DNA pod kontrolą promotora T7.
W celu dokonania skutecznej selekcji podwójnie transgenicznego potomstwa możliwe jest wprowadzenie transgenu do drugiego transgenicznego zwierzęcia. Taki transgen powinien zawierać gen reporterowy pod kontrolą promotora T7. Genem reporterowym może być GFP, lucyferaza, betagalaktozydaza lub beta-laktamaza. Przykładem takiego transgenu są wektory pGN400 oraz pGN401.
W celu uzyskania indukowanej, tkankowo-specyficznej ekspresji transgenu C.elegans wykorzystuje się stado osobników męskich (np. him-5) posiadających konstrukt polimerazy T7 pod kontrolą różnych promotorów C.elegans, umożliwiających tkankowo-specyficzną ekspresję. Osobniki takie krzyżuje się z hermafrodytami, przenoszącymi gen będący przedmiotem zainteresowania pod kontrolą promotora T7.
Ponadto, wprowadzane geny mogą ulec integracji z genomem zwierzęcia. Metody pozwalające na trwałą integrację plazmidu z genomem zwierzęcia zostały opisane (Methods in cell biology, Vol.48, 1995, ed. Epstein i Shakes, academic press) i obejmują napromieniowanie zwierzęcia. Metody te mogą być zastosowane względem obu zwierząt, lecz zalecane jest poddać takim działaniom zwierzęta ekspresjonujące polimerazę T7. Pozwala to otrzymać kolekcję nicieni C.elegans trwale ekspresjonujących polimerazę RNA T7 pod kontrolą różnych promotorów. Przykładami takich promotorów są myo-2 (ekspresja w gardzieli), myo-3 (mięśnie ciała), egl-15 (mięśnie sromowe), unc-119 (pan-neurony), SERCA (mięśnie), let858 (wszystkie komórki), ges-1 (jelito).
PL 213 379 B1
Konstrukcja drożdżowych wektorów dwuhybrydowych RNAi z promotorem T7 pGAD424 posiadający zgodny i odwrotny T7/T3 oraz/lub Sp6
Większość eksperymentów związanych z systemem podwójno hybrydowym opiera się na wklonowaniu biblioteki cDNA do plazmidu pGAD424 (Figura 16), zaprojektowanego tak, by zawierał dodatkowe miejsca restrykcyjne w obrębie sekwencji poliłącznikowej, takiej jak miejsce NcoI (Clontech). Biblioteka ta umożliwia skrining białek wiążących w eksperymentach wykorzystujących podwójne drożdżowe hybrydy. Skonstruowano nowy drożdżowy, dwuhybrydowy wektor o takich samych możliwościach drożdżowego systemu dwuhybrydowego, ale zawierający dodatkowo dwa promotory T7, pozwalające na wykorzystanie polimerazy RNA T7 do indukowanych, pseudo stabilnych inaktywacji genów. W tym celu wstawiono zgodny T7, stosując sekwencję łącznikową T7 (składającą się z następujących starterów: aattcttaatacgactcactatagggcc oraz catgggccctatagtgagtcgtattaag), w miejscu ECORI-NCOI wektora pGAD424. Otrzymany w ten sposób wektor oznaczono jako pGAD424-withoutFULL-ICE-both-T7. Zwrócono uwagę na wyeliminowanie kodonów stop oraz zastosowanie sekwencji poliłącznikowej o maksymalnie zgodnych aminokwasach. Taką samą strategię obrano w przypadku odwrotnego T7 (składającego się z obu starterów: gatccgtcgacagatctccctatagtgagtcgtattactgca oraz gtaatacgactcactatagggagatctgtcgacg), za pomocą BamH1 oraz Pst1. W celu uniknięcia utraty miejsca Sali, włączono to miejsce w sekwencję startera.
Miejsce SalI jest istotne ze względu na to, że większość bibliotek klonowanych jest w tym miejscu, a sekwencje adaptacyjne są dostępne. Czyni to nowo skonstruowany wektor zgodnym z istniejącymi wektorami.
pAS2 zawierający zgodny i odwrotny T7/T3 i/lub Sp6
W oparciu o pAS2 (Clontech) skonstruowano analogiczny drożdżowy, dwuhybrydowy wektor. Częściowe trawienie za pomocą EcoRV spowodowało usunięcie znacznej części genu cyh2. Prawidłowy konstrukt można wyizolować i sprawdzić poprzez trawienie restrykcyjne BglII. To miejsce restrykcyjne występuje we fragmencie EcoRV PAS2, do eliminacji. Wyklucza to słabo toksyczny gen cyh2, uczestniczący w procesie opóźniania wzrostu. Gen ten nie jest istotny do przeprowadzania RNAi oraz eksperymentów związanych z drożdżowymi podwójnymi hybrydami. Po usunięciu fragmentu EcoRV, miejsce restrykcyjne EcoRI, zlokalizowane pomiędzy sekwencjami DNA kodującymi GAL4DB oraz HA (epitop), pozostaje jedynym w plazmidzie i może być wykorzystane do podstawienia HA promotorem T7, zawierającym sekwencję łącznikową. Zapewnia to utrzymanie wszystkich miejsc klonowania, pozwalając obu na klonowanie w ramce i zgodność z poprzednimi wektorami oraz pGAD424. Zastosowano, wykorzystując miejsca klonowania EcoRI oraz Ndel, następującą sekwencję łącznikową (startery: aattcttaatacgactcactatagggca oraz tatgccctatagtgagtcgtattaag). Taką samą strategię obrano w przypadku odwrotnego T7 (startery: gatccgtcgacagatctccctatagtgagtcgtattact-gcacatgggccctatagtgagtcgtattaag oraz gtaatacgactcactatagggagatctgtcgacg), stosując BamH1 oraz Pst1. W celu uniknięcia utraty SalI miejsce to zostało włączone do sekwencji startera. Tak otrzymany wektor nazwano pAS2-cyh2-HA+both T7-final.
Obecność promotora T7 (lub alternatywnie, T3, lub promotora SP6) w pGAD424 pozwala na szybkie przejście z oddziaływania białkiem do RNAi i przypisanie funkcji wyizolowanemu fragmentowi DNA. Dodatkową zaletą jest możliwość uzyskania in vitro transkrypcji, połączonej z translacją in vitro (Obecność w ramce ATG zarówno GAL4DB, jak i GAL4AD) znakowanego białka, które może być wykorzystane jako kontrola in vitro (np. testy grupujące podzbiory) oddziaływań typu białko-białko.
Sekwencje otrzymanych plazmidów oraz polimerazy T3 i SP6 określono w wykazie sekwencji, przedstawionym poniżej:
PL 213 379 B1
Zależna od DNA polimeraza RNA SP 6
Nr dostępu swissprot P06221 Sekwencja białka:
Nr Id. Sekw. 1 aqdlhaiqlq leeemfnggi rrfeadqqrq iaagsesdta wnrrllseli apmaegiqay keeyegkkgr apralaflqc venevaayit mkwmdmlnt datlqaiams vaeriedqvr
121 fskleghaak yfekvkkslk asrtksyrha hnvawaeks vaekdadfdr weawpketql
181 gigttlleil egsvfyngep vfmramrtyg gktiyylqts esvgqwisaf kehvaqlspa
241 yapcvipprp wrtpfnggfh tekvasrirl vkgnrehvrk ltqkqmpkvy kainalqntq
301 wginkdvlav ieevirldlg ygvpsfkpli dkenkpanpv pvefqhlrgr elkemlspeq
361 wqqfinwkge carlytaetk rgsksaawr mvgqarkysa fesiyfvyam dsrsrvyvqs
421 stlspqsndl gkallrfteg rpvngvealk wf.cinganlw gwdkktfdrr vsnvldeefq
481 dmcrdiaadp ltftqwakad apyeflawcf eyaqyldlvd egradefrth lpvhqdgscs
541 giqhysamlr devgakavnl kpsdapqdiy gavaqvvikk nalymdadda ttftsgsvtl
601 sgtelramas awdsigitrs ltkkpvmtlp ygstrltcre svidyivdle ekeaqkavae
661 grtankvhpf eddrqdyltp gaaynymtal iwpsisewk apivamkmir qlarfaakrn
721 eglmytlptg fileąkimat emlrvrtclm gdikmslqve tdivdeaamm gaaapnfvhg
781 hdashliltv celvdkgvts iavihdsfgt hadntltlrv alkgqmvamy idgnaląkll
841 eehevrwmvd tgievpeqge fdlneimdse yvfa
Zależna od DNA polimeraza RNA T 3 Nr Id. Sekw. 2
Nr dostępu swissprot P07659 Sekwencja biała:
mniieniekn dfseielaai pfntladhyg salakeąlal ehesyelger rflkmlerga kageiadnaa akpllatllp klttrivewl eeyaskkgrk psayaplqll kpeasafitl
121 kvilasltst nmtticaaag mlgkaiedea rfgrirdlea khfkkhveeq lnkrhgqvyk
181 kafraqvvead migrgllgge awsswdkett mhvgirliem liestglvel ąrhnagnags
241 dhealqlaqe yvdvlakrag alagispmfą pcwppkpwv aitgggywan grrplalvrt
301 hskkglmrye dvympevyka vnlaqntawk inkkvlawn eivnwkncpv adipslerąe
361 lppkpddidt neaalkewkk aaagiyrldk arvsrrisle fmlegankfa skkaiwfpyn
421 mdwrgrvyav pmfnpągndm tkglitlakg kpigeegfyw lkihgancag vćkvpfperi
481 afiekhvddi lacakdpinn twwaeądspf cflafcfeya gvthhglsyn cslplafdgs
541 csgiąhfsam lrdevggrav nllpsetvqd iygivaqkvn eilkqdaing tpnemitvtd
601 kdtgeisekl klgtstlaqq wlaygvtrsv tkrsvmtlay gskefgfrqq vlddtiqpai
661 dsgkglmftą pnąaagymak liwdavsvtv vaaveamnwl ksaakllaae vkdkktkeil
721 rhrcavhwtt pdgfpvwqey rkpląkrldm iflgqfrlqp tintlkdsgi dahkqesgia
781 pnfvhsqdgs hlrmtwyah ekygiesfal ihdsfgtipa dagklfkavr etmvityenn
841 dvladfysqf adqlhetqld kmpplpkkgn lnlqdilksd fafa
PL 213 379 B1
Nr Id. Sekw. 3 pGNIOS:
gttgtcgtaaagagatgtttttartttacttucaccgggtcctctctctctgccagcacagctcagtgtiggctgtgtgctcgggctcctgccaccggcgg cc tc atcttcttc ttc ttcttc tc tc ctgctctc gcttatc acttcrtcattca ttc ttattcc ttttcatc atca aactagcatttcttactttatttattttmc aa ttttca attticagataaaaccaaactacttgggttacagccgtcaacagatccccgggattggccaaaggacccaaaggtatgtttcgaatgaiactaacataa catagaacattttcaggaggacccttgcttggagggtaccggatgactgctccaaagaagaagcgtaagctcatgaacacgattaacatcgctaagaa cgactrctctgacatcgaactggctgctatcccgttcaacactctggctgaccattacggTgagcgmagctcgcgaacagTtggcccngagcatgag tcttacgagatgggtgaagcacgcrtccgcaagatgtttgagcgtcaacttaaagctggtgaggttgcggataacgctgccgccaagcctctcatcact accctactccctaagatgattgcacgcatcaacgactggttigaggaagtgaaagctaagcgcggcaagcgcccgacagccttccagttcctgcaag aaatcaagccggaagccgiagcgucatcaccattaagaccactctggcngcctaaccagtgctgacaatacaaccgttcaggctgtagcaagcgc aatcggtcgggccattgaggacgaggcicgcncggtcgtatccgtgaccttgaagctaagcacttcaagaaaaacgttgaggaacaactcaacaag cgcgtagggcacgtctacaagaaagcamatgcaagttgtcgaggctgacatgctctctaagggtctactcggtggcgaggcgtggtcncgtggca taaggaagactctattcatgtaggagtacgctgcatcgagatgctcattgagtcaaccggaatggttagcttacaccgccaaaatgctggcgugtagg tcaagactctgagactaTcgaactcgcacctgaatacgctgaggctatcgcaacccgtgcaggtgcgctggctggcatctctccgatgnccaacctig cgtagttcctcctaagccgtggactggcattactggtggtggctattgggctaacggtcgtcgtcctctggcgctggigcguctcacagtaagaaagc actgatgcgctacgaagacgntacaTgcctgaggtgtacaaagcgattaacartgcgcaaaacaccgcatggaaaatcaacaagaaagtcctagcg gtcgccaacgtaaicaccaagtggaagcattgtccggtcgaggacatccctgcgattgagcgtgaagaactcccgatgaaaccggaagacatcgac atgaatcctgaggctctcaccgcgtggaaacgtgctgccgctgctgtgtaccgcaagacaaggctcgcaagtctcgccgtatcagccngagttcatg cttgagcaagccaataagtttgctaaccataaggccatctggticccnacaacatggactggcgcggttcgtgtttacgctgtgtcaatgttcaacccgc aaggtaacgatatgaccaaaggacgtctucgctggcgaaaggtaaaccaatcggtaaggaaggttactactggctgaaaatccacggtgcaaactg tgcgggigtcgataaggtttcgtttcctgagcgcatcaagttcattgaggaaaaccacgagaacatcatggcngcgctaagtctccactggagaacac ttggtgggctgagcaagattctccgttctgcttccttgcgttctgctttgagtacgctggggracagcaccacggcctgagctaraactgctcccttccgc tggcgtttgacgggtcttgctctggcatccagcacttctccgcgatgctccgagatgaggtaggiggtcgcgcggttaacngcttcctagrgaaaccgt tcaggacatctacgggangttgctaagaaagtcaacgagattctgcaagcagacgcaatcaatgggaccgataacgaagtagttaccgtgaccgat gagaacactggtgaaatctctgagaaagtcaagctgggcactaaggcactggctggtcaatggciggcttacggtgttactcgcagtgtgactaagc gttcagicatgacgctggcttacgggtccaaagagttcggcttccgtcaacaagtgctggaagataccattcagccagctattgattccggcaagggtc tgatgttcactcagccgaatcaggctgctggatacatggctaagctgatttgggaatccgtgagcgtgacggtggtagctgcggngaagcaatgaac tggcttaagtctgctgctaagctgctggctgctgaggtcaaagataagaagactggagagattcncgcaagcgtXgcgctgtgcat!gggtaactccT gatggtttccctgtgtggcaggaatacaagaagcctattcagacgcgcttgaacctgatgnccrcgg:cagttccgcttacagcctaccattaacacca acaaagatagcgagattgatgcacacaaacaggagtctggtatcgctcctaactngtaca:agccaagacggtagccaccttcgtaagactgtagtg tgggcacacgagaagtacggaatcgaatcttttgcactgattcacgactccttcggtaccattccggctgacgctgcgaacctgttcaaagcagtgcgc gaaaciatggttgacacautgagtcrtgtgatgtactggctgatttctacgaccagttcgctgaccagttgcacgagtctcaattggacaaaatgccagc acnccggctaaaggtaacngaacctccgtgacatcnagagtcggacttcgcgucgcgtaagggcccactagtcggccgtacgggccctttcgtct cgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaaccictgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagc ccgtcagggcgcgtcagcgggtgflggcgggigtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgt gaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcggccttaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataat ggmcttagacgtcaggtggcactmcggggaaatgtgcgcggaacccctatngtttatttttcttaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaat aaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttnitgcggcamtgccttcctgtm tgctcacccagaaacgctggtgaaagiaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatc cttgagagttttcgccccgaagaacgmtccaatgatgagcacttttaaagtictgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagca actcggtcgccgcatacactattctcagaaigacttggttgagtacxcaccagtcacagaaaagcaicttacggatggcatgacagtaagagaattatg cagtgctgccataaccatgagtgataacacigcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagcxaaccgcttttttgcacaacatgg gggatcatgtaactcgccttgaicgngggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaa caacgttgcgcaaactattaactggcgaaciacttactciagcrtcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttc tgcgctcggcccttccggcTggctggrnattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggT aagccctcccgtatcgtagttatciacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaa gcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctca tgaccaaaatcccttaacgtgagtmcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctg ctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagc gcagataccaaataccgtccnctagtgttgccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttac cagtggctgctgccagtggcgaiaagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggg gttcgtgcacacagcccagcnggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagcattgagaaagcgccacgcttcccgaaggg agaaaggcggacaggutccggtaagcggcagggicggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatcmatagtc ctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgamflgtgatgctcgtcaggggggcggagccutggaaaaacgccagcaacgcggccttmac ggtTcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgtiarcccctgattctgtggauaccgtanaccgcctttgagtgagctgataccgctc gccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgccicxccccgcgcgttggccg attcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaanaatg:gagttagcxcactcartaggcacccca ggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaantcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagctgt aagttttaacatgatcrtacTaactaactattctcatttaaattttcagagcttaaaaatggctgaaatcacicacaacgatggatacgctaacaacttggaa atgaaataagcttgcatgccigcagagcaaaaaaatactgcttttccttgcaaaattcggtgcmcticaaagagaaactmgaagtcggcgcgagcat
PL 213 379 B1 ttccttctttgacttctctctttccgccaaaaagcctagcattmattgataarttgattacacacactcagagttcttcgacatgataaagtgtttcattggcac tcgccctaacagtacatgacaagggcggattattatcgatcgatattgaagacaaactccaaatgtgtgctcattttggagccccgtgtggggcagctg ctctcaatatattactagggagacgaggagggggaccttatcgaacgtcgcatgagccattctttcttctttatgcactctcttcactctctcacacattaat cgattcatagactcccatattccttgatgaaggtgtgggtttttagctttttttcccgatttgtaaaaggaagaggctgacgatgttaggaaaaagagaacg gagccgaaaaaacatccgtagtaagtcttccttttaagccgacacttmagacagcattcgccgctagttttgaagtttaaattttaaaaaataaaaattag tttcaattttttttaattactaaataggcaaaagmtftcaagaactctagaaaaactagcttaattcatgggtactagaaaaattcttgttttaaatttaatattta tcttaagatgtaattacgagaagcnrntgaaaattctcaattaaaagaatttgccgatttagaataaaagtcttcagaaatgagtaaaagctcaaattaga agtngtttttaaaggaaaaacacgaaaaaagaacactatttatctmcctccccgcgtaaaattagttgttgtgataatagtgatccgctgtcumgcact cggctcttcacaccgtgcttccrctcacttgacccaacaggaaaaaaaaacatcacgtctgagacggtgaattgccttatcaagagcgtcgtctctttca cccagtaacaaaaaaaatttggmctttactttatatttatgtaggtcacaaaaaaaaagtgatgcagtmgtgggtcggttgtctccacaccacctccgc ctccagcagcacacaatcatcncgigtgttctcgacgattccttgtatgccgcggtcgtgaatgcaccacattcgacgcgcaactacacaccacactc acmcggtggtattactacacgtcatcgttgttcgtagtctcccgctctttcgtccccactcactcctcattattccccttggtgtattgattttttttaaatggta caccacrcctgacgntctaccncngrntccgtccatttagattttatctggaaatttttttaaaamtaggccagagagttctagttcttgttctaaaagtcta ggtcagacatacamtctamctcatcaaaaaaaaagttgataaagaaaactggttattcagaaagagtgtgtctcgttgaaattgattcaaaaaaaaatt cccacccctcgcttgtnctcaaaaratgagatcaacggartttttccttctcgattcaattmtgctgcgctctgtctgccaaagtgtgtgtgtccgagcaaa agatgagagaatnacaaacagaaatgaaaaaaagttggccaaataatgaagttttatccgagattgatgggaaagatattaatgttctttacggtttgga ggggagagagagatagattttcgcatcaaactccgccttttacatgtcttttagaatctaaaatagatttttctcatcatttttaatagaaaatcgagaaatta cagtaatttcgcaattttcttgccaaaaatacacgaaatttgtgggtctcgccacgatctcggtcTtagtggttcatttggtttaaaagtttataaaatttcaaa ttctagtgrttaatttccgcataattggacctaaaatgggtttttgtcatcattttcaacaagaaatcgtgaaaatcctgttgtttcgcaattrtcttttcaaaaata cacgaaatatatggtaatttcccgaaatartgagggtctcgccacgatttcagtcacagtggccaggatttatcacgaaaaaagttcgcctagtctcacat ttccggaaaaccgaatctaaanagmmgtcatcattttgaacaaaaaatcgagacatccctatagtttcgcaattttcgtcgcttnctctccaaaaatga cagtctagaattaaaattcgctggaactgggaccatgatatcttttctccccgtttttcattttattttttattacactggattgactaaaggtcaccaccaccg ccagtgtgtgccatatcacacacacacacacacacaatgtcgagattttatgtgttatccctgcttgatttcgttccgttgtctctctctctctancatcrmg agccgagaagctccagagaatggagcacacaggatcccggcgcgcgatgtcgtcgggagatggcgccgcctgggaagccgccgagagatatca gggaagatcgtctgarnctcctcggatgccacctcatctctcgagmctccgcctgttactccctgccgaacctgatatttccc
PL 213 379 B1 pGN105 Nr Id. Sekw. 4 aagcttgcatgcctgcaggccttggtcgactctagacactmcagctacctagatacatggatatccccgcctcccaatccacccacccagggaaaaa gaagggctcgccgaaaaatcaaagttatctccaggctcgcgcatcccaccgagcggttgacttctctccaccacttttcatrttaaccctcggggtacg ggattggccaaaggacccaaaggtargmcgaatgatactaacaraacatagaacamtcaggaggacccttgcttggagggtaccgagctcagaa aaaatgactgctccaaagaagaagcgiaaggtaccggUatgaacacgattaacatcgctaagaacgacttctctgacatcgaactggctgctatccc gttcaacactctggctgaccattacggtgagcgtttagctcgcgaacagttggcccrtgagcatgagtcnacgagatgggtgaagcacgcmcgcaa gatgttigagcgtcaacnaaagctggtgaggttgcggataacgctgccgccaagcctctcatcactaccctactccctaagatgattgcacgęatcaa cgactggtttgaggaagtgaaagctaagcgcggcaagcgcccgacagccttccagttcctgcaagaaatcaagccggaagccgtagcgtacatca ccartaagaccactctggcngcctaaccagtgctgacaatacaaccgttcaggctgtagcaagcgcaatcggtcgggccattgaggacgaggctcg cttcggtcgtatccgtgaccttgaagctaagcacttcaagaaaaacgttgaggaacaactcaacaagcgcgtagggcacgtctacaagaaagcattta tgcaagtigtcgaggctgacatgctctctaagggtciactcggtggcgaggcgtggtcttcgtggcataaggaagactctattcatgtaggagtaegct gcatcgagatgctcatigagtcaaccggaatggttagcttacaccgccaaaatgclggcgtagtaggtcaagactctgagactatcgaactcgcacct gaatacgctgaggctatcgcaacccgtgcaggigcgctggctggcatctctccgatgnccaaccttgcgtagttcctcctaagccgtggactggcatt actggtggtggctattgggctaacggTcgtcgtcctctggcgctggtgcgtactcacagtaagaaagcacigatgcgctacgaagacgtttacatgact gaggtgtacaaagcgattaacattgcgcaaaacaccgcatggaaaatcaacaagaaagtcctagcggtcgccaacgtaatcaccaagtggaagcat tgtccggtcgaggacatccctgcgangagcgtgaagaactcccgatgaaaccggaagacatcgacatgaatcctgaggcictcaccgcgtggaaa cgigctgccgctgctgtgtaccgcaaggacagggctcgcaagłctcgccgtateagccttgagttcatgcttgagcaagccaataagtttgctaaccat aaggccatctggttcccnacaacarggactggcgcggtcgtgtttacgccgtgtcaatgttcaacccgcaaggtaacgatatgaccaaaggactgctt acgctggcgaaaggiaaaccaatcggtaaggaaggrtactactggctgaaaatecacggtgcaaactgtgcgggtgtcgataaggttccgttccctg agcgcatcaagticattgaggaaaaccacgagaacatcatggcttgcgciaagtcKcaeiggagaacaettggtgggctgagcaagatJctccgttct gcttccttgcgTtcJgctngagtacgctggggtacagcaccacggcctgagctataactgctcccttccgctggcgtttgacgggtcRgctctggcatc cagcacttctccgcgatgctccgagatgaggtaggtggKgcgcggtiaacttgcttcctagtgagacegttcaggacatctacgggattgRgctaag aaagtcaacgagattctacaagcagacgcaatcaatgggaccgataacgaagtagttaccgtgaccgatgagaacaciggtgaaatctctgagaaa gtcaagctgggcaciaaggcactggcrggtcaatggctggctcacggtgnactcgcagtgtgactaagcgncagtcatgacgctggctucgggtc caaagagttcggcitccgtcaacaagtgctggaagataccattcagccagctattgattccggcaagggtccgatgttcactcagccgaatcaggctg ctggaiacatggctaagctgatngggaatctgtgagcgtgacggtggtagctgeggtigaagcaatgaactggcrtaagtctgetgctaagcrgctgg ctgctgaggtcaaagauagaagactggagagaRcttcgcaagcgttgcgctgtgcattgggtaactcctgatggtttccctgtgtggcaggaaUca agaagcctattcagacgcgcttgaacctgatgttcctcggtcagttccgcttacagcctaccattaacaccaacaaagatagcgagattgatgcacaca aacaggagtctggtatcgctcctaactttgtacacagccaagacggtagccaccttcglaagactgtagtgtgggcacacgagaagtacggaatcga atcttttgcactgattcacgactccticggtaccattccggctgacgctgcgaacctgttcaaagcagtgcgcgaaactatggngacacatatgagtcn gTgatgtactggctgatttctacgaccagttcgctgaccagttgcacgagtctcaattggacaaaatgccagcacttccggctaaaggtaactigaaccl ccgtgacatcttagagtcggacncgcgttcgcgtaagaattccaactgagcgccggtcgctaccattaccaacttgtctggtgtcaaaaataataggg gccgctgicaKagagtaagtnaaactgagttctactaactaacgagtaatatttaaamtcagcatctcgcgcccgtgcctctgacRctaagtccaan actcttcaacatccctacatgctcntctccctgtgctcccaccccctatttttgttanatcaaaaaaacttcttcttaatttctttgttttttagcttcttrtaagtca cctctaacaatgaaartgtgtagattcaaaaatagaattaattcgtaaiaaaaagtcgaaaaaaangtgctccctccccccattaataataattctatccca aaatctacacaatgttctgtgtacacTtcnatgttttttttacttctgataaattttttttgaaacatcatagaaaaaaccgcacacaaaataccttatcatatgtt acgracagttlatgaccgcaatrtrtarncttcgcacgtcigggcctctcatgacgtcaaatcatgctcatcgigaaaaagtmggagiatmtggaartttt caatcaagtgaaagmatgaaattaattncctgcttttgctttttgggggttreccctattgtttgtcaagagtttcgaggacggcgttmcttgctaaaatca caagtattgatgagcacgatgcaagaaagatcggaagaaggtttgggtttgaggctcagtggaaggxgagtagaagttgataatngaaagtggagta gtgtctatggggtrtttgccttaaatgacagaatacattcccaatataccaaacataactgtttccactagtcggccgtacgggccctttcgtctcgcgcg tncggtgatgacegtgaaaacctcigacacatgcagctcccegaeacggtcacagcttgicTgaagcggatgccgggagcagaeaagcccgtca gggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggctaacatgcggcatcagagcagattgacigagagtgcaccaatgcggtgtgaaata ccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcggccttaagggcctcgtgatacgcctattmaiaggnaatgtcatgataataatggtttctt agacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctattigtrtattinctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaalaaccct gaaaatgcRcaataatartgaaaaaggaagagatgagaRcaacarnccgtgKgccctancccmntgcggcattngcc«cctgtttttgctca cccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgag agrtncgccccgaagaacgtmecaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtanatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcg gtegccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaageatcttacggatggcatgacagtaagagaanatgcagtg ctgccataaccaTgagtgataacactgcggccaacrtacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggat calgtaactcgccngatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgiagcaatggcaacaacg ngcgcaaactattaactggcgaactaemctctagcttcccggcaacaanaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgct cggcccnccggctggctggmatrgcigataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcangcagcactggggccagatggtaagccc tcccgtatcgtagttalctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgatiaagcaKg gtaacigtcagaccaagTnacicatatatacmagangatnaaaacttcantttaarnaaaaggatciaggEgaagatccrmtgataatctcatgacca aaatcccttaacgtgagtntcgnccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgiaatctgctgcn gcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggiggmgtttgccggatcaagagctaccaacEctmtccgaaggtaactggcttcagcagagcgcaga taccaaatactgtccnctagtgtagccgtagttaggceaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgetaaKctgnaccagtg gctgctgccagtggcgataagtcgtgicttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggncg
PL 213 379 B1 tgcacacagcccagcttggagegaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagcattgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaa aggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtc gggtttcgccacctctgacttgagcgłcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttc ctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccg cagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattca ttaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaartaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctt tacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagctgtaagtn aaacatgatcttactaactaactattctcatttaaattttcagagcttaaaaatggctgaaatcactcacaacgatggatacgctaacaacrtggaaatgaa at
PL 213 379 B1
Nr Id, Sekw, 5 pGN400:
aagcttgcargcctgcaggccnggtcgactctagacacttttcagciacctagatacatggataiccccgcctcccaatccacccacccagggaaaaa gaagggctcgccgaaaaatcaaagnatctccaggctcgcgcatcccaccgagcggttgacnctctccaccacttttcattttaaccctcggggtacg ggattggccaaaggacccaaaggtatgmcgaatgatactaacataacatagaacamtcaggaggacccttgcttggagggtaccgagctcccgg gattaatacgactcactataccggtagaaaaaatgagtaaaggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatggtgatgttaatg ggcacaaatmctgtcagtggagagggtgaaggtgatgcaacatacggaaaacttacccttaaamatttgcactactggaaaactacctgtrccatgg gtaagtttaaacatatatatactaactaaccctgattatttaaattttcagccaacacttgtcactacttTctgttatggtgttcaatgcttctcgagatacccag atcatatgaaacggcatgacttmcaagagrgccatgcccgaaggttaigtacaggaaagaactatatttttcaaagatgacgggaactacaagacac gtaagtrtaaacagttcggtactaactaaccatacatatttaaattttcaggtgctgaagtcaagttrgaaggtgatacccttgnaatagaatcgagttaaa aggtattgarmaaagaagatggaaacattcttggacacaaattggaatacaactataactcacacaatgtatacatcatggcagacaaacaaaagaat ggaatcaaagttgtaagmaaacatgatmactaactaactaatctgamaaatmcagaacncaaaattagacacaacangaagatggaagcgttca actagcagaccattatcaacaaaatactccaatlggcgatggccctgtccttttaccagacaaccatracctgtccacacaatctgccctttcgaaagatc ccaacgaaaagagagaccacatggtccttcttgagtttgtaacagctgctgggattacacatggcatggatgaactatacaaatagcattcgtagaartc caactgagcgccggtcgctaccanaccaacttgtctggtgtcaaaaataataggggccgctgtcatcagagtaagtttaaacigagttctactaaclaa cgagtaatatttaaattncagcatctcgcgcccgtgcctctgacttctaagtccaattactcttcaacatccctacatgctctttctccctgtgctcccaccc cctatttttgttattatcaaaaaaacttcncttaatttctttgttrtttagcttcttttaagtcacctctaacaatgaaattgtgtagattcaaaaatagaattaancg taataaaaagtcgaaaaaaattgtgctccctccccccattaataataattctatcccaaaatctacacaatgttctgtgtacacttcttatgtttttmacttctg ataaattttmtgaaacatcatagaaaaaaccgcacacaaaataccttatcatatgttacgtttcagmatgaccgcaatttttatttcttcgcacgtctgggc ctctcargacgtcaaatcatgctcatcgtgaaaaagtmggagtatttttggaatttticaatcaagtgaaagtnatgaaattaattttcctgcttttgctmtg ggggtttcccctattgtttgtcaagagtttcgaggacggcgtttttcttgctaaaatcacaagtartgatgagcacgatgcaagaaagatcggaagaagg mSSgmgaggctcagtggaaggtgagtagaagttgataattrgaaagtggagragtgtctatggggnmgccttaaatgacagaatacancccaat ataccaaacataactgmcctactagtcggccgtacgggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccg gagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcrggctta actatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcggc cttaagggccicgtgatacgcctatmtataggttaatgtcatgaUataatggtttcttagacgtcaggtggcacttncggggaaatgtgcgcggaacc cctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtatt caacamccgtgicgccctrancccnnngcggcattttgcctTcctgttrngctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagtt gggtgcacgagtgggttacarcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgaTgagcactmaaa gnctgctatgiggcgcggtatratcccgrattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcac cagtcacagaaaagcatcrtacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctga caacgarcggaggaccgaaggagcraaccgcmtngcacaacatgggggatcatgtaacicgccttgarcgttgggaaccggagctgaatgaagc cataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcrtcccggc aaeaanaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccrtccggctggctggtttattgctgataaatctggagccg gtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactat ggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggigcctcactgattaagcattggtaacTgtcagaccaagtttactcatatatacmagangamaaa acttcatttnaatnaaaaggatctaggtgaagatcctttngataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccg tagaaaagatcaaaggatcncngagatccttmttctgcgcgtaatctgctgcngcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccgg atcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccactt caagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactca agacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactga gatacctacagcgtgagcangagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggag agcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacrtgagcgtcgatttttgtgatgctcgtc aggggggcggagcctatggsaaaaegccagcaacgcggcctmtacggttcctggccttttgctggcctmgctcacatgttcmcctgcgtutccc ctganctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaag cggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgnggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtrtcccgactggaaagcgggc agtgagcgcaacgcaanaatgigagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcgg ataacaamcacacaggaaacagcratgaccatgattacgccaagcigtaagmaaacatgaicttactaactaactattctcatnaaattncagagctt aaaaatggctgaaatcactcacaacgatggatacgctaacaacttggaaatgaaat
PL 213 379 B1
Nr Id. Sekw. 6 pGN401 gatcccggcgcgcgatgtcgtcgggagatggcgccgcctgggaagccgccgagagatatcagggaagatcgtctgatttctcctcggatgccacct catctcTcgagttTctccgcctgnactccctgccgaacctgatafficccgngtcgtaaagagatgtrtttattttacttttcaccgggtcctcrcTctcrgcc agcacagctcagtgttggcigTgtgctcgggctcctgccaccggcggcctcatcttcttcncttcncrctcctgctctcgctutcacttcttcattcattcti anccttttcatcatcaaactagcamcttacmamatttttticaarmcaattttcagataaaaccaaactacttgggttacagccgtcaacagatccccg ggattggccaaaggacccaaaggtatgmcgaatgatactaacataacatagaacanttcaggaggacccttgcttggagggtaccggtagaaaaa atgagtaaaggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatggtgatgttaatgggcacaaattttctgtcagtggagagggtga aggrgatgcaacatacggaaaacnacccttaaatttamgcactactggaaaactacctgttccatgggtaagittaaacatatatataciaactaaccct gattatttaaattftcagccaacacttgtcactactttctgttatggtgttcaatgcttctcgagaiacccagatcatatgaaacggcatgactttttcaagagt gccatgcccgaaggrtatgtacaggaaagaactatatttttcaaagatgacgggaactacaagacacgtaagtttaaacagttcggtactaactaaccat acatatttaaattttcaggtgctgaagtcaagtttgaaggtgatacccttgttaatagaatcgagttaaaaggtattgattttaaagaagatggaaacattctt ggacacaaattggaatacaactataactcacacaatgtatacatcatggcagacaaacaaaagaatggaatcaaagttgtaagtttaaacnggacttac taactaacggattatatttaaattncagaacttcaaaattagacacaacattgaagatggaagcgttcaactagcagaccattatcaacaaaatactccaa nggcgatggcccigtcctmaccagacaaccattacctgtccacacaatctgccctttcgaaagatcccaacgaaaagagagaccacatggtccttct tgagtttgtaacagctgctggganacacatggcatggatgaactatacaaatagcattcgtagaattccaactgagcgccggtcgctaccanaccaac ttgtctggigtcaaaaataataggggccgctgtcatcagagtaagtttaaactgagttctactaactaacgagtaatatttaaattttcagcatctcgcgccc gtgcctctgactictaagTccaanactcttcaacatccctacaigctctnciccctgtgctcccaccccciattmgttanaicaaaaaaacttcttcnaaK tctttgttttttagcttcttttaagtcacctctaacaatgaaattgtgtagattcaaaaatagaartaancgtaataaaaagtcgaaaaaaattgtgctccctcc ccccatmtaataartcutcccaaaatcucacaatgTtctgtgtacacncnatgnttmtacitctgataaatntttttgaaacatcaUgaaaaaaccg cacacaaaataccttatcatatgttacgtttcagtttatgaccgcaatttttatncttcgcacgtctgggcctctcatgacgtcaaatcatgctcatcgtgaaa aagrrttggagtatrtrtggaamncaatcaagtgaaagntatgaaattaatntcctgctmgcttmgggggtncccctattgtngtcaagagtncgag gacggcgtrrttcttgctaaaatcacaagtattgatgagcacgatgcaagaaagatcggaagaaggtttgggmgaggctcagtggaaggtgagtag aagngataatngaaagiggagtagtgtctatggggtttttgccttaaatgacagaatacattcccaatataccaaacaiaactgtttcctaciagicggcc gtacgggcccggtacccagcnngncccmagtgagggttaattgcgcgcttggcgtaatcatggtcatagctgmcctgtgtgaaartgttatccget cacaanccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaaUgcgttgcgctcactgc ccgctrtccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcc tcgcrcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggata acgcaggaaagaacargtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtrmccataggctccgcccccct gacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtg cgctctccTgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgiggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcag ncggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaa cccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtg gtggcctaactacggctacactagaaggacagtamggtatctgcgctctgctgaagccagttaccrtcggaaaaagagttggtagctcngatccgg caaacaaaccaccgctggtagcggtggttmngtttgcaagcagcaganacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcmtctacg gggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggicatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttuaaattaaaaatgaag tmaaatcaatcuaagtatatatgagtaaacnggtctgacagttaccaatgctttatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgncatccat agttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgcrgcaatgataccgcgagacccacgctcaccg gctccagamatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgc cgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagmgcgcaacgttgttgccattgctacaggcarcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttc attcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggnagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagt aagttggccgcagtgnatcactcatggttatggcagcactgcataattctcnactgtcatgccatccguagatgcttttctgtgactggtgagtactcaa ccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaattcgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtg ctcatcattggaaaacgncttcggggcgaaaactcicaaggatcuaccgctgttgagaiccagttcgaigtaacccactcgtgcacccaactgatcttc agcatcttttactrtcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaata ctcaractcttcctmtcaatanangaagcatttatcagggnattgtctcatgagcggatacatatngaatgtamagaaaaataaacaaaiaggggnc cgcgcacatttccccgaaaagTgccacctaaattgtaagcgttaatatmgrtaaaattcgcgttaaattmgttaaatcagctcattttttaaccaataggc cgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgnccagtnggaacaagagtccactanaaagaacgtgga ciccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgrgaaccatcaccctaatcaagtmnggggtcgaggtgccgtaaa gcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgattiagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaa aggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgGgtaacGacGacacccgccgęgcraatgcgccgcucagggcgcgtc ccancgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctanacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaag gcganaagrtgggtaacgccagggmtcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgagcgcgcgtaatacgactcactatagggcgaattg gagctccaccgcggtggcggccgctctagaactagtg
PL 213 379 B1
Nr Id. Sekw. 7 pGNUO:
gatcetccaaaatcgtcRccgctctgaaaaacgaaagtggaccRtgacatccgaaaaaatgggcgaaaaaatgaaaRgagcRmgggtcgaaaa aaatgRRiagaatgctgagaacacgRaaacacgaagatcataRtaRRgagacccggatgctctgaaaatgłctgacatagaRtaaaaaagcatat ataiantttcatmcaacgtgaaagtmglgcaactnatagaatctcctanggcacangmtttatttaactgaggcagntngaacaccrtittgaaacn tgaatctctRgaagtttactgtcgaaaagactgacRgagcgRcgaaatgccagaagaaaactatamgaatctcgcgctaaaRgagaaatgcaacc gcgctccactggacaanggaaaaaaaatnancggaggcgacaacggtattttcgaaanganttctgtgtactttctcattnnataaancrtcrttgatn atcgttcgtttgtgagaaamaangtancaaacttttttatagtaagataccggtggtaccgcUgccgtacgaacccgggattggccaaaggaccca aaggtatgmcgaatgatactaacataacatagaacattttcaggaggacccttgc«ggagggtaccggatgactgctccaaagaagaagcgtaagc tcatgaacacgattaacatcgctaagaacgacttctctgacalcgaactggctgctatcccgttcaacactctggctgaccattacggtgagcgtttagct cgcgaacagRggcccRgagcatgagtcRacgagaigggtgaagcacgcRccgcaagatgRtgagcgtcaacRaaagctggrgaggRgcgga taacgctgccgccaagcctctcatcactaccctactccctaagatgattgcacgcatcaaegactggtngaggaagtgaaagctaagcgcggcaag cgcccgacagccnccagncctgcaagaaatcaagccggaagccgtagcgtacatcaccanaagaccactctggcttgcctaaccagtgctgaca atacaaccgRcaggctgtagcaagcgcaatcggtcgggccaRgaggacgaggctcgcRcggtcgtatccgtgaccRgaagctaagcacRcaa gaaaaacgttgaggaacaactcaacaagcgcgtagggcacgtctacaagaaagcatttatgcaagttgtcgaggctgacatgctctctaagggtcta ctcggtggcgaggcgtggtcttcgtggcataaggaagactctancatgtaggagtacgctgcatcgagatgctcattgagtcaaccggaatggnag cRacaccgccaaaatgciggcgtagraggtcaagactctgagactatcgaactcgcacctgaatacgctgaggctatcgcaacccgtgcaggtgcg ctggctggcatctctccgatgttccaaccKgcgtagttcctcctaagccgtggactggcanactggtggtggctattgggctaacggttgtcgtcctc:
ggcgctggtgcgtactcacagtaagaaagcactgatgcgctacgaagacgrttacatgcetgaggtgtacaaagcgattaacangcgcaaaacacc gcatggaaaatcaacaagaaagtcctagcggtcgccaacgtaatcaccaagtggaagcaRgtccggtcgaggacatccctgcgaRgagcgtgaa gaactcccgatgaaaccggaagacatcgacatgaatcctgaggctctcaccgcgtggaaacgtgctgccgctgctgtgtaccgcaagacaaggctc gcaagtctcgccgtatcagccRgagRcatgcngagcaagccaaiaagRtgctaaccataaggccatctggRcccRacaacaiggactggcgcg gRcgtgRtacgctgtgtcaatgRcaacccgcaaggtaacgatatgaccaaaggacgtcRacgctggcgaaaggtaaaccaatcggtaaggaagg nactactggctgaaaatccacggtgcaaactgtgcgggtgtcgataaggtttcgmcctgagcgcatcaagttcattgaggaaaaccacgagaacat catggcRgcgctaagtctccactggagaacacRggtgggctgagcaagaRCtccgRctgcRccRgcgRctgcRtgagtacgctggggtacagc accacggcctgagctataactgetcccRccgctggegRtgacgggtcRgctctggcatccagcacRctccgcgatgctccgagatgaggtaggig gtcgcgcggRaacRgcRcctagtgaaaccgRcaggacatctacgggaRgRgciaagaaagtcaacgagaRctgcaagcagacgcaatcaatg ggaccgataacgaagtagnaccętgaccgatgagaacactggtgaaatctctgagaaagtcaagctgggcactaaggcactggctggtcaatgget ggcttacggtgttactcgcagtgtgactaagcgncagtcatgacgctggcnacgggiccaaagagttcggcnccgtcaacaagtgctggaagatac cancagccagctattganccggcaagggtctgatgncactcagccgaatcaggctgctggatacatggctaagctgatttgggaatccgtgagcgt gacggtggtagcTgcggngaagcaatgaactggcnaagictgctgctaagctgctggctgctgaggtcaaagataagaagactggagagartcttc gcaagcgRgcgctgtgcaRgggtaactcctgatggntccctgtgtggcaggaatacaagaagccJaRcagacgcgcRgaacctgatgRcctcgg tcagneegcnaeagcctaccattaacaccaacaaagatagcgagattgatgcacacaaacaggagKtggtatcgctcctaactttgtacacagcca agacggiagccaccRcgtaagacigtagtgtgggcacacgagaagtacggaatcgaatcRRgcactgaRcacgactCCRCggiaccaRccggc tgacgctgcgaacctgttcaaagcagtgcgcgaaactatggttgacacatatgagtcttgtgatgtactggctgamctacgaccagncgctgaccag
RgcacgagtctcaaRggacaaaatgccagcacRccggcuaaggtaacRgaacctccgtgacarcRagagtcggacRcgcgRcgcgtaaggg ccctcgtcgagtcggtcacaatcacctgaaactccaaaggcagccagtgaggaacgtgaagaagaagaaaaagagtcatctgaacaggRtgaRR cRtctggtcaaaaagatgaaaRaRgaRRcagccagatactcccaaaactagcagcgagaagtctgcaagrcgncacagtcgcccagagaatcgc gggaagtgagccaagaggtatgRTRcaaaaatcaataactgatcataaRRTaRgRtggtgaaRtaagaaaataataRcgaaaaRcctctgaaRat caagangcagtanaantcgagaaaaangagatancatagagctatigtaaatmcngamcagactgaaacttcggaaaatcaagagaaaatcaa agaaaaggatgacggggatgaicagcctggcacaccgaacagctatagaagccgggaaacReaccagctccaaaaaggtccaaggagaccag gtttgtcaaaagcttcctgcgartaattctcatttcaatttttcagagaatcagagtctcctgaaaaatccccggncgttcaagatctcccagaaggtcnca gcacgRccccgtcacgatctcctagacggcgccgagaaagaagctcagaaagaaagcaatccgaagagccagcaccgctaccagagaaaaaga agaaagagccgctggataRctacgaacaagaaccggaggagcatataRccacccgccaaacRcgacRatgcaacaacagaRagtgataagca aagtgaacagtatcagagaatgaangggaaagaatgaagaaaaagattcacggattggttaacagagtcaacgcgaagaatcttgncaaangtca gagaacncncaagagaatgtgancgncaaagtgagigagaaaatcgaaggaaaaggaaagaattaamaatmtcaggggacnctctgccgTg acanancaagcrcaggcmctcaccagganctctaacgtctatgcagctnggcggcagttatcaactcgaaanccctcatgtcggigaacncnctc cgtcgtctgangtacagncaaaagaagtttccgtagaaatgacagaggcgtcacggtgaacgtgatcaaattcatcgcacamganaatcaacaag
RgctcacgaagRcRgcgctgeaaatcatgaRctgatgcRgaagaaccaactgatgattcagRgaagtcgccaRgcgRcctgaaagagtgigga gcaaagcttctggagangctccagcagctcttaacagtgtctacgaccgtcttcgtgcaattctcatggaaactgaaagatcggaaaatgcactggatc gacgtancagtatatgangagactgcaatgcagancgaaaggacaaatttgcgguaggtagaaUtataaatagtttattagaaaaaaataaattag aataaRiaaaRcciactagccaaicaggcgacotRRgcgcatagRctaRaRgaaaaatRggagaamctcataRctegctcggaaatctggaan cgacgagatcttctggcnctgtgcagctgcatcgctttgtgcteccmctcgcngtcncigtgtacaccaagaaccngngagncatcaacigaatct gtgactggcrtgngctcactggatgcactagacgactganctcgagaaatcagartgagttgcgattagggtgacctagaaattgggaataalacgaa cRRgaaaataRcaggagganaaaaaaaRaRctcgacaatcctacaaaRtacRaRgcaccatgRgctccaacaRRtcaRaaaagRaatgaaaa aatgtagaaaatcggaaaRggcaaRRcagaccaRtRaagcattncaaaaaaaaaRgcagcjgaaataaatglcaRRcagataaatcgagcgaR ncigttgTctgacactagtttttagtmaaaaaatgttggaagaacatggtgcaataggtaatncatagaantccatgtgttnnttcaanaaccaattatc caaatcRccaaactcacaRRgcęgagctgggctatcaagaatctgctgcagRRataagacgagcatctctgatatcactgaaaaRaaRRtaatca aaacRgaatatcaactaaacccacRanaacrttctcgatcnctgtcgRcggtacgatgacggtgaagaagccaaRgtagtagRgaRTggRcaagt
PL 213 379 B1 cctncggtgngtacgtcagtgtcctgcaatgctaRTagRataacnaggcctaagancaantaatgaagtgaRaaatRgRctctgaacctcnaaga tgatctntggattagaaacatataagacaggmacctatcianaaaaaacagarcaaaatagatacgaccaaatcggataatccatgcciacciggcat ctaggaacgtgncnagaagatncnacguatcgtatgaagaaaiaacaamgaicgnggccagcaaaaalagggtntaagtgggaagTgntnat tagctaaccggaaaattnaiagrcrnnngcaagaaaccactgaaaaccccctaattgutacattnnggagcagcttctggTcnTngagcaataaaat tcgataaaacagaatnaagtgtaaangttcacantagmctatmatcaaartngngctcaaaaacartcgaagctgcrctaaaaaaatgcanaaaaa aggggmtcagtggttntcacanaaaaaagctaattnaaciaaaaatccatcatatnccaactngtcacaacaataaaatgctggtcaaaatgtgncg aaaaaatgtttmnTRaatnTtauatnaaaaatagttttctttcgctgggacacatacatttttgggcgtaaattttcagttcaaatttccantttacaacca!
aatcataaagctacgtctgaicjctctcgcacnacctgcgcctgancgaaagaacaaccgtagccaaaagaacaagaagaacaagcacgttgttgt ggtagtggacgttcalcacgcaatactgaccaatggtcgtggggtctcactttccgtactattgagagaggggagactgaagatggcaattgaggaca gtgtcncgacgcacgcatgcatccataagcauatccaggagggatggagagaaaaatcttgtnctaagcccctccctttgtaatacatacacatatet aataccgaagaatggctaattgaalggacgtcagctgngctgiagRgccaaggcatcatcgatgaaataactgaaagaaagaaRaaataaKaRgc aggcgtatccggcggtcaRgaagacRggacRgangaggaggaggatcagatcatccatacacRaaRtggaggatgcggRgatccggaaaatg ggcttagtaagtgactgaccacacgcggggggcanaatnaataaangaanccantcagatgtgttcaaactagatccagaattcgaaaagaacga ggaggtttatgaggagatccgtaaggaaatcatrggaaacgccgatamcggatgaggatggtggcgacgagttggatgatgaagaagagggtagt gatgtggaagaggctccgaagaagactacagaganangataatactgatcagaaRgactgctncagaaggtancattrtgagmtgggecggcaa atctgiaagngccggRgccgaaaatngctgaatttgccggaaaaaaaaanccggaatRantaaaaactttnguaaaanaaanaaatngcaacn neagagaagtctacctgacaatgcaatcatetRggacłaccaagaagctgctcacaaattgctgaaaatgaaganccagacagcatgcaggtcagc gatgRgeaaagaaaaattttcgaccaaaaaaaccaaccaatcataaaatttaaaaaaaaactccgtnRRCTtnTttnatacgagaaaaaccaaaaaa atgtatttttgccaaattctaaaatactatccccgaaattncaatattttctctttcagaacgaactctgcgcgatgcttgtcgaRgttgtgctcaacagcgta cctacgagcgattciacggaatgcicatcgaacgRictgccgacttcgcctcgaataccagcaatactRgaaaagctctgccaggacacgtaRccac gaRcaccgaangacatcacaaaactgcggaaRtggctcgccnaRgctcantgctctcgacggatgctaRgactggaagaRRggccgatatgaa aatgaccgaagaggacacaacncRctggcagaatctatanaaautataRtaaigaacngtggaggcgatgggaatggRaaacRcancgagag ttactgatccgtgagtncctagagagagttgtrncgtancaarmccctanncagaactnggctcattgctttgttgganatKccacgaactaatccg aacagcgcacgamtcgatcaacncncacaatgattggangggtggtngacgnggaacttcgigaatggciggcaaagggtctcaagaagaaga agggaatgctggatcagngaaęgccgaatcaagctcagancatcgicgicncggancgtcagactcgtctgaRcncggaRctgacgancatcc gactcgtcncagaRcctcatcncncagaatcagagccagaaccaccgaagaaaaagaagaagaagaacagtgaagagagRccaaaaagaag gaaaaagagaataRggtcgacgggaicgtggagacaagagagctgaacgtcaicgigatcaaagtgtggagaacaaggacaaggatcgicgacg tcgccagganctgacgaaaaicgtcggccagaacgaggagatgaccgcaaggatcggagtaaagatcgtcgtcgtcaagacteggatgatgagg atcggaaaggtcgTgaacgtcgggaagancaggggaaagacgtcgcggagatcgggatcgacgtgatcgaaacaaggatcaggaggatcaccg tgaagatcgccgtgaccgaagcaaggatcgtgaggatcgacgtgatcgccgtcgtcatgactctgatgatgatcgtaaaactcgtcgggatagaagt gaagagcgaggaggacgtcgtcgtgaagtggaatcggatgaicgacgccgacgtcgttgaaRReaaaRRaaatactgaataRTgRRRncctaR amaRttnctcRtgtgRRRRcRgcRtctaaaaaaRaaRcaatccaaatctaaacatgagcggtRRtRctcntccgtctcccaattcgtanccgct cctctcatctgaacacaatg:gcaagtnatRatcnctcgctRcaRtcaRaggacgtggggggaaRggtggaagggggaaacacacaaaagga'.g aiggaaatgaaataaggacacacaatatgcaacaacancaattcagaaatatggaggaaggtRaaaagaaaacataaaaatataugaggaggaa ggaaaactagtaaaaaataagcaaagaaaRaggcgaacgatgagaaRgtcctcgcttggcaaatgcgaatccgtatggagaggcacgntggcga aggcaaatgncggtatggagatctgiaaaaaRRuagRgaaaRtggtgRgctctntacaaaaRRccgaRRcgcRgaaanacggtgccaggtct cgacacgtcnccaarttncaaancaaaagagccRiaatgggctgUgRgctaatnctcgRtngaaaaRRtcflccgtttaatcgaaaRtgatgtatR tatRatgaRRcaataaaRtcaaagaaactggtgaaaactcggaaaangtgaactacagtaatccaatccttaaaggcgcacaccRRaaatgtccgc cccaatacgatantRRaagattcgctagagcggccgccaccgcggtggagctccaancgccctatagtgagtcgtanacaaRcactggccgtcgt tRacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgRacccaacttaatcgccttgcagcacatccccccRcgccagctggcgtaatagcgaagaggccc gcaccgatcgcccncccaacagRgcgtagcctgaatggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcaRaagcgcggcgggtgtggtggRacgc gcagcgtgaccgctacacngccagcgccctagcgcccgctccntcgcRtcttcccttcctHctcgccacgRcgccggcRtccccgtcaagctctt aatcgggggcscccTRagggnccgarctagtgcRtacggcacctcgaccccaaaaaacngattagggtgatggRcacgtagtgggccatcgccct gatagacggRmcgcccnigacgnggagtccacgncntaatagtggactcngnccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtcianctRt gaRtttaaggganRgccgatRcggccanggnaaaaaatgagctgantaacaaaaaRtaacgcgaanRaacaaaataRaacgRttcaaRtca ggtggcacRRCggggaaatgtgcgcggaacccctaRtgntaRRtciaaatacancaaaiatgtatccgctcatgagacaaiaaccctgaiaaaigc ncaataatangaaaaaggaagagtatgagiattcaacamccgtgtcgcccRanccctnRigeggcaRRgccncctgnRtgctcacccagaaac gctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagngggtgcacgagtgggRacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccngagagRRcgcc ccgaagaacgRRccaatgatgagcacnRaaagnctgctatgiggcgcggtanatcccgtangacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcat acactaRctcagaatgacttggngagtaetcaccagtcacagaaaagcatcRacggatggcacgacagtaagagaattatgcagtgctgccataag catgagtgataacactgcggccaacnacRctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcRRRtcacaacatgggggatcatgtaactcg ccngatcgttgggaaccggagetgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgRgcgcaaact artaactggcgaactacnactctagcRcccggcaacaaRaatagaciggatggaggcggataaagngcaggaccacnctgcgctcggcccttcc ggctggctggRtangctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtttcaKgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgt agRaictacacgacgggcagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgaRaagcaRggtaactgtcag accaagRtactcatatatacRTagaRganTaaaacRcaRRiaanraaaaggatcttggtgaagatectRRgauatcicatgaccaaaatcccRaa cgtgagnRcgnccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcncngagatccRRRtcigcgcgtaatctgcigcRgcaaacaaaa aaaccaccgctaccagcggtggtngmgccggatcaagagcaccaactcRRiccgaaggtaactggcRcagcagagcgcagataccaaatact gtccncugtgiagccgtagttaggccaccacncaagaactctgiagcaccgcctacaucc:cgctctgcaatcctgnaccag:ggcigctgccag tggcgataagTcgtgicnaccgggRggactcaagacgaiagnaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcc cagcnggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagcangagaaagcgccacgcRcccgaagggagaaaggcggacagg tatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcRccaggggggaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtncgccac ctctgacRgagcgtcgantRgtgatgctcgtcaggggggccgagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctRttacggttcctggccttRgct ggccttngctcacatgRctttcctgcgttatcccctgaRctgtggataaccgtanaccgcctngagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacga ccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgancattaatgcagctg gcacgacaggntcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaaRaatgtgagRacctcactcanaggcaccccaggcRtacacRtatgct tccggctcctatgRgtgtggaattgtgagcggataacaaRtcacacaggaaacagctatgaccatganacgccaagctcggaaRaaccctcactaa agggaacaaaagctgggggg
PL 213 379 B1
Nr Id. Sekw. 8 pAS2-cyh2-HA*bothT7-fmai gaiccgtcgacagatctccctatagtgagtcgtattactgcagccaagctaattccgggcgaamcttatgatttatgarnttattattaaataagnataaaaaaa ataagtgtttacaaatmaaagtgactcrtaggtmaaaacgaaaattcttgttcTtgagtaactcmcctgtaggtcaggngcmctcaggtaugcatgaggt cgctcnattgaccacacctctaccggcatgcaagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgcicacaanccacacaacatac gagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgccuatgagtgagguactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctnccagtcgggaaacctgt cgtgccagctggattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcncctcgctcactgacrcgctgcgctcggtcg ttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggcc agcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagag gtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcnaccggatecctgtc cgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagcTcacgctgUggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaac cccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaaca ggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgct gaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggttttmgtttgcaagcagcagattacgcgc agaaaaaaaggatctcaagaagaiccrrtgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaa aaggatcttcacctagatccnnaaartaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgctuatcagtgaggc acctatctcagcgatcTgtctatticgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgc aatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatcc gcctccatccagtctatuattgttgccgggaagctagagtaagtagrtcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtca cgctcgtcgtttggtttggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcct ccgatcgttgtcagaaguagnggccgcagtgttaicactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgac tggtgagtactcaaccaagtcanctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaac tttaaaagtgctcatcanggaaaacgncrtcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactg atcttcagcatcttttacmcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgngaat acicatactcttcctttttcaaurtartgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaauggggnccgc gcacatticcccgaaaagtgccacctgaacgaagcatctgtgcttcattttgttgaacaaaaatgcaacgcgagagcgctaarttttcaaacaaagaatctga gctgcamttacagaacagaaatgcaacgcgaaagcgctattnaccaacgaagaatctgtgcttcatttttgtaaaacaaaaatgcaacgcgagagcgctaa tmtcaaacaaagaatctgagctgcatmtacagaacagaaatgcaacgcgagagcgctattttaccaacaaagaatctatacttcttttttgttcucaaaaatg catcccgagagcgcttttmctaacaaagcatcttagattactttttttctcctttgtgcgctctataaigcagtctcttgataactttttgcactgtaggtccgttaag gttagaagaaggctacmggtgtctttmctcttccataaaaaaagcctgactccacttcccgcgmactgattactagcgaagcrgcgggtgcannticaag ataaaggcatccccganatattctataccgatgtggattgcgcatactttgtgaacagaaagtgatagcgttgatgattcncattggtcagaaaanatgaacg gtltcttc tattttgtctcta tataciac gtaia gg aaatgtnacattnc gtattgttncg attcactctatg aatag ttc ttactacaatttttttgtctaaagag taatac tagagataaacataaaaaatgtagaggtcgagtttagatgcaagttcaaggagcgaaaggtggatgggtaggttatatagggatatagcacagagatatata gcaaagagatactrttgagcaatgtttgtggaagcggtattcgcaatattttagtagcrcgttacagtccggtgcgtttttggttttttgaaagtgcgtcttcagagc gcttttggttttcaaaagcgcrctgaagttcctatactttctagagaataggaacttcggaataggaacrtcaaagcgtttccgaaaacgagcgcttccgaaaat gcaacgcgagctgcgcacatacagctcactgttcacgtcgcacctatatctgcgtgttgcctgtatautatatacatgagaagaacggcatagtgcgtgtttat gcttaaatgcgtacnatatgcgtctantatgtaggatgaaaggtagtctagtacctcctgtgatattatcccanccatgcggggtatcgtatgcttccttcagca ctaccctttagctgttctatatgctgccactcctcaattggattagtctcatccttcaatgctatcatttcctttgatattggatcatattaagaaaccattattatcatga cattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctrtcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagcicccggagacggtca cagcngtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggciggcnaactatgcggcatcag agcagattgtactgagagtgcaccatagatcaacgacattactatatatataatataggaagcatttaatagacagcatcgtaatatatgtgtactttgcagttatg acgccagatggcagtagtggaagaunctttattgaaaaatagcKgtcaccttacgtacaatcttgatccggagcttttctittntgccgattaagaattaattcg gtcgaaaaaagaaaaggagagggccaagagggagggcattggtgactattgagcacgtgagtatacgtgattaagcacacaaaggcagcttggagtatg tctgttatiaatttcacaggtagttctggtccattggtgaaagtttgcggcttgcagagcacagaggccgcagaatgtgctctagattccgatgctgacttgctg ggtattatatgtgtgcccaatagaaagagaacaattgacccggttattgcaaggaaaatttcaagtcttgtaaaagcatataaaaatagTtcaggcactccgaa atacttggttggcgtgtncgiaaicaaccmggaggatgmtggctctggtcaatgattacggcattgatatcgtccaactgcatggagatgagtcgtggca agaataccaagagttcctcggttigccagttattaaaagactcgtatttccaaaagactgcaacatactactcagtgcagcttcacagaaacctcancgtnan cccngtttgattcagaagcaggtgggacaggtgaacrtnggattggaactcgatttctgactgggrtggaaggcaagagagccccgaaagcrtacarmaT gttagcrggtggactgacgccagaaaatgttggtgatgcgcnaganaaatggcgttattggtgngatgtaagcggaggtgtggagacaaatggtgtaaaa gactctaacaaaatagcaaatncgicaaaaatgciaagaaataggttattactgagtagtatttatttaaguttgtttgtgcacngccgaictatgcggtgtgaa ataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggaaattgtaaacgnaatattngtuaaancgcgttaaatttttgttaaatcagctcatttttiaacc aataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgrtgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgt ggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttrtttggggtcgaggtgccgtaaag cactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatnagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggag cgggcgctagggcgcrggcaagtgiagcggrcacgcrgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcnaatgcgccgctacagggcgcgicgcgccancg ccattcaggctgcgcaactgngggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagn
PL 213 379 B1 gggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtcgtccaagctncgegagctcgagatcccgagctttgcaaattaaagccttc gagegtcccaaaaccttctcaagcaaggttttcagtataatgttacatgcgtacacgcgtctgtacagaaaaaaaagaaaaatttgaaatataaataacgttctt aatactaacataactataaaaaaataaatagggacctagacttcaggngtctaactccttccttttcggttagagcggatgtggggggagggcgtgaatgtaa gcgtgacataactaattacatgatatccttttgttgtttccgggtgtacaatatggacttcctcttnctggcaaccaaacccatacatcgggattcctataatacctt cgttggtctccctaacatgtaggtggcggaggggagatatacaatagaacagataccagacaagacataatgggctaaacaagactacaccaattacactg cctcattgatggtggtacataacgaactaatactgtagccctagacttgatagccatcatcatatcgaagtttcactaccctttttccatttgccatctattgaagta ataataggcgcatgcaacrtcttttcittttttttcttttctctctcccccgttgttgtctcaccatatccgcaatgacaaaaaaaatgatggaagacactaaaggaaa aaattaacgacaaagacagcaccaacagatgtcgttgttccagagctgatgaggggtatcttcgaacacacgaaactttttccrtccttcattcacgcacacta ctctctaatgagcaacggtatacggccttccttccagttacttgaatttgaaataaaaaaagtttgccgctttgctatcaagtataaatagacctgcaattattaatc ttttgtttcctcgtcartgttctcgttccctttcttccttgtttctttttctgcacaatatttcaagctataccaagcatacaatcaactccaagcttgaagcaagcctcct gaaagatgaagctactgtcttctatcgaacaagcatgcgatatttgccgacttaaaaagctcaagtgctccaaagaaaaaccgaagtgcgccaagtgtctga agaacaactgggagtgtcgctactctcccaaaaccaaaaggtctccgctgactagggcacatctgacagaagtggaatcaaggctagaaagactggaaca gctatttctactgatttttcctcgagaagaccttgacatgattttgaaaatggattctttacaggatataaaagcattgttaacaggattatttgtacaagataatgtg aa&aagatgccgtcacagatagattggcttcagtggagactgatatgcctctaacattgagacagcatagaataagtgcgacatcatcatcggaagagagt agtaacaaaggtcaaagacagttgactgtatcgccggaattcttaatacgactcactatagggcatatggccatggaggccccggg
PL 213 379 B1
Nr Id. Sekw. 9 pGAD424-without-FULL-ICE-BOTH-T7 gatccgtcgacagaTctccciatagtgagtcgtanactgcagagatctargaatcgtagatactgaaaaaccccgcaagticacttcaactgtgcatcgtgca ccatctcaamcmcatnaucatcgtmgccttcttttatgtaactatactcctctaagtttcaatcrtggccatguacctcigatctaugaartrtttaaatgacta gaattaatgcccatcntrmggacctaaancncatgaaaataunacgagggcttattcagaagctttggacttcttcgccagaggmggtcaagtctccaa tcaaggttgtcggcttgtctaccttgccagaaatttacgaaaagatggaaaagggtcaaatcgttggtagatacgttgttgacacttctaaataagcgaatttctt atgamatgatttttattattaaataagttataaaaaaaataagtgtatacaaatmaaagtgactcnaggttttaaaacgaaaattcttgncttgagtaactcmcc tgtaggtcaggttgctttctcaggtatagcatgaggtcgctcttartgaccacacctctaccggcatgcccgaaattcccctaccctatgaacauttccatmgt aatttcgtgtcgtttctattatgaatttcamataaagtttatgtacaaatatcataaaaaaagagaarctttttaagcaaggattttcttaacttcttcggcgacagca tcaccgacttcggtggtactgnggaaccacctaaatcaccagttctgatacctgcatccaaaacctttttaactgcatcttcaatggccttaccttcttcaggcaa gttcaatgacaatncaacatcattgcagcagacaagatagtggcgatagggtcaaccttattctttggcaaatctggagcagaaccgtggcatggttcgtaca aaccaaatgcggtgttcttgtctggcaaagaggccaaggacgcagatggcaacaaacccaaggaacctgggataacggaggcttcatcggagatgatatc accaaacatgttgctggtgattataaTaccamaggtgggttgggttcrtaactaggatcatggcggcagaatcaatcaattgatgttgaaccttcaatgtagga aattcgttcttgatggmcctccacagtttttctccataatcttgaagaggccaaaacattagctttatccaaggaccaaataggcaatggtggctcatgttglag ggccatgaaagcggccancngtgarcctrtgcacttctggaacggtgtattgttcactatcccaagcgacaccatcaccatcgtcttcctttctcttaccaaagt aaatacctcccactaattctctgacaacaacgaagtcagtacctttagcaaattgtggcttgattggagataagtctaaaagagagtcggatgcaaagttacat ggtcttaagttggcgtacaartgaagttctnacggatttttagtaaaccttgttcaggtctaacactacctgtaccccatttaggaccacccacagcacctaacaa aacggcatcaaccttcttggaggcttccagcgcctcatctggaagtgggacacctgtagcatcgatagcagcaccaccaattaaatgattttcgaaatcgaac ttgacanggaacgaacarcagaaatagcrttaagaaccttaatggcttcggctgtgatttcttgaccaacgtggtcacctggcaaaacgacgatcttcttaggg gcagacattagaatggtatatccttgaaatatatatatatattgctgaaatgtaaaaggtaagaaaagttagaaagtaagacgattgctaaccaccTattggaaa aaacaataggtccttaaataatattgtcaacncaagtattgtgatgcaagcatttagtcatgaacgcttctctattctttatgaaaagccggttccggcctctcac ctttcctttnctcccaatttrtcagtrgaaaaaggtatatgcgtcaggcgacctctgaaanaacaaaaaatttccagtcatcgaatttgattctgtgcgatagcgc ccctgtgtgttctcgttatgttgaggaaaaaaataatggttgctaagagattcgaactcttgcatcttacgatacctgagtattcccacagttggggatctcgactc tagctagaggatcaattcgtaatcatggicatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagrgtaa agcctggggtgcctaatgagtgaggtaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctggattaatgaatc ggccaacgcgcggggagaggcggmgcgtattgggcgctcnccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatc agctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgia aaaaggccgcgttgctggcgtttnccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggact ataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggataccrgtccgccmctcccttcgggaagcg tggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctg cgccrtatccggUacratcgtctigagtccaacccggtaagacacgacttatcgccaciggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgt aggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggcucactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaa agagttggtagctcrtgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaa gatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcrtcacctagatcctttt aaattaaaaatgaagttnaaatcaatctaaagtatatatgagttaacnggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgaictgtctart tcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacg ctcaccggctccagamatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactnatccgccKcatccagtcrattaattgT tgccgggaagctagagtaagtagitcgccagttaaragtrtgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgrttggtaiggcttca ttcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagti ggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcat tctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaa acgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcacc agcgmctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatatt attgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgcc acctgacgtcuagaaaccattartatcatgacattaacctauaaaataggcgtarcacgaggcccmcgtctcgcgcgmcggtgatgacggtgaaaacct ctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggt gtcggggctggcnaactatgcggcaicagagGagattgtactgagagtgcaGeataacgcatttaagGataaaGacgcactatgccgttcttcteatgtatat atatatacaggcaacacgcagatataggtgcgacgtgaacagtgagctgtatgtgcgcagctcgcgttgcattttcggaagcgctcgtmcggaaacgcm gaagtTcctattccgaagttcctattctcragctagaaagtataggaacttcagagcgcttttgaaaaccaaaagcgctctgaagacgcactttcaaaaaacca aaaacgcaccggactgtaacgagctacraaaatattgcgaataccgcttccacaaacattgctcaaaagtatctctttgctatatatctctgtgctatatccctata taacctacccatccaccmcgctccttgaacTtgcatctaaactcgacctctacattttttatgtttatctctagtattactctttagacaaaaaaartgtagtaagaac tattcatagagtgaarcgaaaacaatacgaaaatgtaaacatrtccratacgtagtataragagacaaaatagaagaaaccgttcataatntctgaccaatgaa gaatcatcaacgctatcacmctgttcacaaagtatgcgcaatccacatcggtatagaatataatcggggatgcctttatcttgaaaaaatgcacccgcagctt cgctagtaatcagtaaacgcgggaagtggagtcaggctttttttatggaagagaaaatagacaccaaagtagccttcttcttaccrtaacggacctacagtgc aaaaagttatcaagagactgcattatagagcgcacaaaggagaaaaaaagtaatctaagatgctttgttagaaaaatagcgctctcgggatgcatttttgtaga acaaaaaagaagtatagancmgttggraaaatagcgctctcgcgttgcatttctgrtctgtaaaaatgcagctcagattctttgtttgaaaaattagcgctctcg
PL 213 379 B1 cgttgcatttttgtttttcaaaaatgaagcacagattcttcgttggtaaaatagcgctttcgcgttgcatttctgttctgtaaaaatgcagctcagattetttgtttgaa aaattagcgctctcgcgtłgcatttttgttctacaaaatgaagcacagatgcttcgttgcttgcatgcaacttettttctttttttttcttttctctetcccccgttgttgtct caccatatccgcaatgacaaaaaaaatgatggaagacactaaaggaaaaaattaacgacaaagacagcaccaacagatgtcgOgttccagagctgatga ggggtatcttcgaacacacgaaactttttccttccttcattcacgcacactactctctaatgagcaacggtatacggccttccttccagttacttgaatttgaaataa aaaaagtttgccgctttgctatcaagtataaatagacctgcaattattaatcttttgtttcctcgtcattgttctcgttccctłtcttccttgtttctttttctgcacaatattt caagctataccaagcatacaatcaactccaagctttgcaaagatggataaagcggaattaattcccgagcctccaaaaaagaagagaaaggtcgaattggg taccgccgccaattttaatcaaagtgggaatattgctgatagctcattgtccttcactttcactaacagtagcaacggtccgaacctcataacaactcaaacaaa ttctcaagcgctttcacaaccaattgcctcctctaacgttcatgataacttcatgaataatgaaatcacggctagtaaaattgatgatggtaataattcaaaaccac tgtcacctggttggacggaccaaactgcgtataacgcgtttggaatcactacagggałgtttaataccactacaatggatgatgtatataactatctattcgatga tgaagataccccaccaaacccaaaaaaagagatcgaattcttaatacgactcactatagggcccatggacgaagaatccagttcattcttatgtacctatgctg agaatcgtgccaataagaagccaatacttccttagatgatgcaataaatattaaaataaaacaaaacagaaggctg
PL 213 379 B1
Nr Id. Sekw. 10 pGN205:
ccggtggtaccgggccccccctcgaggtcgacggtatcgataagctttcgtcattgaaaagaaggataagaatggacgatgggaagaagctctcgtt gttccaggagatcagaaaacagcaactgttccaaatcnaaggagggagaagaatatcaattcagaatttctgctcgtaacaaggctggaactggaga tccttctgatccttctgatcgtgttgttgcgaagccaagaaaccttgctccaagaattcatcgtgaagatctttctgatacaactgtcaaggtcggagccac tctcaagttcattgttcatattgatggigagccagcaccagatgtaacatggtcattcaatggaaaaggaatcggagagagcaaggctcaaattgaaaa tgagccatacatctcgagatttgcttTgccaaaggcacttcgtaagcaaagtggaaaatttaccatcactgcaaccaacattaatggaactgacagtgtc actatcaatarcaaggtaaaaagcaagccaacgaaaccaaagggaccaatcgaggtaactgatgtcttcgaagatcgtgcaactcttgactggaaac caccagaggatgacggaggagagccaangagttctargaaattgaaaagatgaacaccaaggacggaatctgggttccatgtggacgtagtggag atacccacttcacagtcgancactcaacaagggagatcattacaagttccgtgtcaaggctgtcaacagcgaaggaccttctgatccattggaaactg aaaccgatattttggctaaaaatccantgatcgrccagatagaccaggtcgtccagagccaactgattgggattctgatcatgttgatctcaagtgggat ccactagnctagaagcgctgctaagggggccctcgtcgagtcggtcacaatcacctgaaactccaaaggcagccagtgaggaacgtgaagaaga agaaaaagagtcatcigaacaggmgattttctttctggtcaaaaagatgaaattattgattttcagccagatactcccaaaactagcagcgagaagtct gcaagtcgttcacagtcgcccagagaatcgcgggaagtgagccaagaggtatgtttncaaaaatcaaxaactgatcaiaattltuttgtttggtgaant aagaaaataarattcgaaaattc ctctg aattatcaagattgcagtattaatttcgagaaaaang ag atattcatagagc tattgtaaattttcttgatttcag actgaaacttcggaaaatcaagagaaaatcaaagaaaaggatgacggggatgatcagcciggcacaccgaacagctatagaagccgggaaacttc accagctccaaaaaggtccaaggagaccaggtttgtcaaaagcttcctgcgattaattctcatttcaatttttcagagaatcagagtctcctgaaaaatcc ccggttcgttcaagatctcccagaaggtcttcagcacgttccccgtcacgatctcctagacggcgccgagaaagaagctcagaaagaaagcaatccg aagagccagcaccgctaccagagaaaaagaagaaagagccgctggatattctacgaacaagaaccggaggagcatatattccacccgccaaactt cgacttatgcaacaacagattagtgataagcaaagtgaacagUtcagagaatgaattgggaaagaatgaagaaaaagattcacggattggttaacag agtcaacgcgaagaatcttgttcaaattgtcagagaacttcttcaagagaatgtgattcgttcaaagtgagtgagaaaatcgaaggaaaaggaaagaat taatttaatttttcaggggacnctctgccgtgacattattcaagctcaggctttctcaccaggattctctaacgtctatgcagctttggcggcagttatcaac tcgaaattccctcatgtcggtgaacncnctccgtcgtctgattgtacagttcaaaagaagtttccgtagaaatgacagaggcgtcacggtgaacgtgat caaattcatcgcacatttgattaatcaacaagttgctcacgaagttcttgcgctggaaatcatgattctgatgcttgaagaaccaactgatgattcagttga agtcgccattgcgttcctgaaagagtgtggagcaaagcttctggagattgctccagcagctcttaacagtgtctacgaccgtcttcgtgcaattctcatg gaaactgaaagatcggaaaatgcactggatcgacgtattcagtatatgattgagactgcaatgcagattcgaaaggacaaatttgcggtaaggtagaa tatataaatagtnattagaaaaaaaiaaattagaataatttaaattcctactagc caatc aggc gaccttmg c g catagttctattattgaaaaatttgga g aatttctcatattctcgctcggaaatctggaattcgacgagarcnctggcnctgtgcagctgcatcgctttgtgctccctttctcgcttgtcttctgtgtaca ccaagaaccttgttgagttcatcaactgaatctgtgactggcttgttgctcactggatgcactagacgactgattctcgagaaatcagattgagttgcgatt agggtgacctagaaattgggaataatacgaacttttgaaaatatrcaggaggattaaaaaaattattctcgacaatcctacaaatttacttattgcaccatgt tgctccaacatttttcattaaaagttaatgaaaaaatg tagaaaatc ggaaattggcaattttc agaccatttaaag cattttcaaaaaaaaattgcag ctg a aataaatgtcattttcagataaatcgagcgattttctgttgtctgacactagtttttagttttaaaaaatgttggaagaacatggtgcaataggtaatncatag aatttccatgtgttttttttcaattaaccaattatccaaatcttccaaactcacattttgcggagctgggctatcaagaatctgctgcagttttataagacgagc atctctgatatcactgaaaattaatttttaatcaaaacttgaatatcaactaaacccacttattaactttctcgatcttctgtcgttcggtacgatgacggtgaa gaagccaattgtagtagttgatttggttcaagtcctttcggtgttgtacgtcagtgtcctgcaatgctatttagttataacttaggcctaagattcaatttaatg aagtgattaaatttgttctctgaacctcttaagatgatcttttggattagaaacatataagacaggtttacctatctanaaaaaacagatcaaaatagatacg accaaatcggataatccatgcctacctggcatctaggaacgtgttcttagaagatttcttacgtaatcgtatgaagaaataacaatttgatcgnggccag caaaaatagggttttaagtgggatagtgtttttattagctaaccggaaaattttatagtttttttttgcaagaaaccactgaaaaccccctaattgtatacattn ttggagcagcnctggtcttmgagcaataaaattcgataaaacagaatttaagtgtaaattgttcacatttagtnctattttatcaaattttgttgctcaaaaa cattcgaagctgctctaaaaaaatgcattaaaaaaggggttttcagtggtttttcacattaaaaaagctaattttaactaaaaatccatcatatttccaactttg tcacaacaataaaatg ctggicaaaa tgrgttc gaaaaaatgttttttittttaatttttataatttaaaaatag tmctttcgctgggacacatacatttttgg g c gtaaattttcagttcaaattTccatnnacaaccataatcataaagctacgtctgatctctctcgcacttacctgcgcctgattcgaaagaacaaccgtagc caaaagaacaagaagaacaagcacgtagttgtggtagtggacgttcatcacgcaatactgaccaatggtcgtggggtctcactttccgtactattgaga gaggggagactgaagatggcaattgaggacagtgtcttcgacgcacgcatgcatccataagcataatccaggagggatggagagaaaaatcttgttt ctaagcccctccctttgtaatacatacacatatctaataccgaagaatggctaattgaatggacgtcagctgttgctgtagttgccaaggcatcatcgatg aaataactgaaagaaagaattaaataattattgcaggcgtatccggcggtcattgaagacnggacttgartgaggaggaggatcagatcatccataca cttaatttggaggatgcggttgatccggaaaatgggcttagtaagtgactgaccacacgcggggggcatfaatttaataaattgaanccatttcagatgt gttcaaactagatccagaattcgaaaagaacgaggaggtttatgaggagatccgtaaggaaatcattggaaacgccgatatttcggatgaggatggTg gcgacgagttggatgatgaagaaeagggtagtgatgtggaagaggctccgaagaagactacagagattattgataatactgatcagaaKgactgctt tcagaaggtattcanttgagnngegccggcaaatctgtaagttgccggttgccgaaaatttgctgaatttgccggaaaaaaaaattccggaatttattta aaaactttttgtaaaaattaaatraaamgcaacttttcagagaagtctacctgacaatgcaatcatcmggactaccaagaagctgctcacaaattgctg aaaatgaagattccagacagcaigcaggtcagcgatgttgcaaagaaaaattttcgaccaaaaaaaccaaccaatcataaaatttaaaaaaaaactcc gtttmtctttttttttatacgagaaaaaccaaaaaaatgtamngccaaattctaaaatactatccccgaaattttcaatattttctctttcagaacgaactcig cgcgatgcttgtcgattgttgtgctcaacagcgtacctacgagcgattctacggaatgctcatcgaacgtnctgccgacttcgcctcgaa&ccagcaa tactttgaaaagctctgccaggacacgtattccacgattcaccgaattgacatcacaaaactgcggaamggctcgccttattgctcatttgctctcgacg gatgctattgactggaagatmggccgatatgaaaatgaccgaagaggacacaacttcttctggcagaatctatattaaatatatatttaatgaacttgtg gaggcgatgggaatggttaaactTcancgagagttactgatccgtgagtttcctagagagagttgrmcgUflcaattttccctatmcagaacmggcr cattgctttgttggattatrcccacgaactaatccgaacagcgcacgattttcgatcaacttcttcacaatgattggattgggtggtttgacgttggaacttc gtgaatggctggcaaagggtctca3gaagaagaagggaatgctggatcagttgaaggccgaatcaagctcagattcatcgtcgtcttcggattcgtca gactcgtctgattcttcggattctgacgancatccgactcgtcttcagattcctcatcttcrtcagaatcagagccagaaccaccgaagaaaaagaagaa
PL 213 379 B1 gaagaacagtgaagagagnccaaaaagaaggaaaaagagaatattggtcgacgggatcgtggagacaagagagctgaacgtcatcgtgatcaaa gtgtggagaacaaggacaaggatcgtcgacgtcgccaggattctgacgaaaatcgtcggccagaacgaggagatgaccgcaaggatcggagtaa agatcgtcgtcgtcaagactcggatgatgaggatcggaaaggtcgtgaacgtcgggaagattcaggggaaagacgtcgcggagatcgggatcgac gtgatcgaaacaaggatcaggaggatcaccgtgaagatcgccgtgaccgaagcaaggatcgtgaggatcgacgtgatcgcegtcgtcatgactctg atgatgatcgtaaaactcgtcgggatagaagtgaagagcgaggaggacgtcgtcgtgaagtggaatcggatgatcgacgccgacgtcgttgaatttt caaattttaaatactgaaEatttgttttttttcctattatttatttattctctttgtgttttttttcttgctttctaaaaaattaattcaatccaaatctaaacatgagcggtt ttttttctctttccgtctcccaattcgtattccgctcctctcatctgaacacaatgtgcaagtttatttatcttctcgctttcatttcattaggacgtggggggaatt ggtggaagggggaaacacacaaaaggatgatggaaatgaaataaggacacacaatatgcaacaacattcaattcagaaatatggaggaaggtttaa aagaaaacataaaaatatatagaggaggaaggaaaactagtaaaaaataagcaaagaaattaggcgaacgatgagaattgtcctcgcttggcaaatg cgaatccgtatggagaggcacgtttggcgaaggcaaatgttcggtatggagatctgtaaaaatttttaagttgaaatttggtgttgctcttttacaaaatttt ccgattttcgcttgaaattacggtgccaggtctcgacacgtcttccaatttttcaaattcaaaagagcctttaatgggctgtagttgctaatttctcgtttttga aaatttttcttccgtttaatcgaaatttgatgttttttatttatgattttcaataaatttcaaagaaactggtgaaaactcggaaaattgtgaactacagtaatcca atccttaaaggcgcacaccttttaaatgtccgccccaatacgatatttttttaagattcgctagagcggccgccaccgcggtggagctccaattcgccct atagtgagtcgtattacaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccc cttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgtagcctgaatggcgaatgggacgcgccctgtagcg gcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttct cgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgat tagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttcmaatagtggactcttgttccaaact ggaacaacactcaaccctatttcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaa cgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatat gtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtargagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttg cggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgclggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactgga tctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtatt gacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcat gacagtaagagaattatgcagtgctgccataagcatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaacc gctttttttcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgat gcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggata aagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcag cactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacgggcagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagat aggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaa gatccttntgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcc tttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggt aactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacct cgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagc ggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagcattgagaaag cgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggg aacgcctggtatctttaegtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgattmgtgatgctcgtcaggggggccgagcctatggaaaaacg ccagcaacgcggccntttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcct ttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgc ctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagtta cctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcctatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatg accatgattacgccaagctcggaattaaccctcactaaagggaacaaaagctgggggggatcctccaaaatcgtcttecgctctgaaaaacgaaagt ggacctttgacatccgaaaaaatgggcgaaaaaatgaaattgagctttttgggtcgaaaaaaatgtttttagaatgctgagaacacgttaaacacgaag atcatatttattttgagacccggatgctctgaaaatgtctgacatagatttaaaaaagcatatatatatttttcattttcaacgtgaaagttttgtgcaactttata gaatctcctattggcacattgttttttatttaactgaggcagtttttgaacacctttttgaaactttgaatctctttgaagtatactgtcgaaaagactgacttga gcgttcgaaatgccagaagaaaactatarttgaatctcgcgctaaattgagaaatgcaaccgcgctccactggacaattggaaaaaaaatttattcgga ggcgacaacggtatmcgaaattgatmcigtgtattttctcattttttataaattcttctttgatttatcgttcgtttgtgagaaatttaattgtattcaaactttttt atagtaagata
PL 213 379 B1
Nr Id. Sekw. 11 pGN207:
ccggtggtaccgctagccgtacgaacccgggnctagaactagtggatcccacttgagatcaacatgatcagaatcccaatcagttggctctggacga cctggtctatctggacgatcaaatggatttnagccaaaatatcggtttcagtttccaatggatcagaaggtccttcgctgngacagccttgacacggaa cttgtaatgatctcccttgttgagtgaatcgactgtgaagtgggtatctccactacgtccacatggaacccagattccgtccttggtgttcatcttttcaam caugaactcaattggctctcctccgtcatcctctggtggtttccagtcaagagttgcacgatcncgaagacatcagttacctcgattggtccctttggttt cgttggcttgctttttaccttgatattgatagtgacactgtcagttccattaatgttggttgcagtgatggtatattttccactttgcttacgaagtgcctttggca aagcaaatctcgagargtatggctcarntcaatttgagccrtgcrctctccgattcctmccattgaatgaccatgttacatctggtgctggctcaccatca atatgaacaatgaacttgagagtggctccgaccttgacagttgtatcagaaagatcttcacgatgaattcttggagcaaggtttcttggcttcgcaacaac acgatcagaaggatcagaaggatcTccagttccagccttgttacgagcagaaattctgaattgatattcnctccctccnaagatttggaacagttgctgt tttctgatctcctggaacaacgagagcttcttcccatcgtccattcttatccttcttttcaatgacgaaagcttatcgataccgtcgacctcgagggggggc cctcgtcgagtcggtcacaatcacctgaaactccaaaggcagccagtgaggaacgtgaagaagaagaaaaagagicatctgaacaggtttgattttct ttctggtcaaaaagatgaaanangattttcagccagatactcccaaaactagcagcgagaagtctgcaagtcgttcacagtcgcccagagaatcgcg ggaagtgagccaagaggtatgmncaaaaatcaataactgatcataatmtattgtttggtgaatttaagaaaataatattcgaaaattcctctgaattatc aagattgcagtattaatttcgagaaaaattgagatattcatagagctattgtaaattttcttgatttcagactgaaacttcggaaaatcaagagaaaatcaaa gaaaaggatgacggggatgatcagcctggcacacęgaacagctatagaagccgggaaacttcaccagctccaaaaaggtccaaggagaccagg:
ttgtcaaaagcttcctgcgaRaattctcatttcaatttttcagagaatcagagtctcctgaaaaatccccggttcgttcaagatctcccagaaggtcttcag cacgttccccgtcacgatctcctagacggcgccgagaaagaagctcagaaagaaagcaarccgaagagccagcaccgctaccagagaaaaagaa gaaagagccgctggatattctacgaacaagaaccggaggagcatatattccacccgccaaacttcgacttatgcaacaacagattagtgataagcaa agtgaacagtatcagagaatgaangggaaagaatgaagaaaaagattcacgganggttaacagagtcaacgcgaagaatcttgttcaaattgtcag agaacttcttcaagagaatgtgancgttcaaagtgagtgagaaaatcgaaggaaaaggaaagaattaatttaatttttcaggggacttctctgccgtgac attattcaagctcaggctttctcaccaggattctctaacgtctatgcagctttggcggcagttatcaactcgaaattccctcatgtcggtgaacttcttctcc gtcgtctgattgtacagttcaaaagaagrttccgtagaaatgacagaggcgtcacggtgaacgtgatcaaattcatcgcacatttgattaatcaacaagtt gctcacgaagttcttgcgctggaaatcatgattctgatgcttgaagaaccaactgatgattcagttgaagtcgccattgcgttcctgaaagagtgtggag caaagcttctggagattgctccagcagctcttaacagtgtctacgaccgtcttcgtgcaattctcatggaaactgaaagatcggaaaatgcactggatcg acgtattcagtatatgattgagactgcaatgcagattcgaaaggacaaatttgcggtaaggiagaatatataaatagtnattagaaaaaaataaattaga ataatttaaattcctactagccaatcaggcgaccmrtgcgcatagncttttangaaaaatttggagaatttctcauttctcgctcggaaatctggaattc gacgagatcttctggcttctgtgcagctgcatcgctttgtgctccctttctcgcttgtcnctgtgtacaccaagaaccttgttgagttcatcaactgaatctgt gaciggcrtgttgctcactggatgcactagacgactgattctcgagaaatcagattgagttgcgattagggtgacctagaaattgggaataattcgaact tttgaaaatattcaggagg a ttaaaaaaattattctc gacaatc ctac aaatttac ttattgcac catgttgctccaacatttttcattaaaagttaa tg aaaaa atgtagaaaatcggaaattggcaatntcagaccatttttaagcattttcaaaaaaaaangcagctgaaataaatgtcattttcagataaatcgagcgatttt cigttgtctgacactagtttttagttttaaaaaatgttggaagaacatggtgcaataggtaatttcatagaamccatgtgmtttttcaattaaccaattatcc aaatcttccaaactcacattttgcggagctgggctatcaagaatctgctgcagttttataagacgagcatctctgatatt:actgaaaatuatttttaatcaa aacttgaatatcaactaaacccacttattaactttctcgatcttctgtcgttcggtacgatgacggtgaagaagccaattgtagtagttgatttggttcaagtc ctttcggtgttgtacgtcagtgtcctgcaatgctatttagnataacnaggcctaagattcaatttaatgaagtgattaaatttgttctctgaacctcttaagat gatcttttggattagaaacatataagacaggtttacctatctattaaaaaacagatcaaaatagatacgaccaaatcggataatccatgcctacctggcat ctaggaacgtgttcttagaagatttcnacgtaatcgtatgaagaaataacaatttgatcgttggccagcaaaaatagggttttaagtgggatagtgtttttat tagctaaccggaaaattttatagtttttttttgcaagaaaccactgaaaacccccuattgtatacattttttggagcagcnctggtctttttgagcaataaaat tcgataaaacagaatttaagtgtaaattgttcacatttagtttctattttatcaaattttgttgctcaaaaacancgaagctgcTctaaaaaaatgcattaaaaa aggggttttcagtggttttxcacattaaaaaagctaattttaactaaaaatccatcatatttccaactttgtcacaacaataaaatgctggtcaaaatgtgttcg aaaaaatgtttttttttttaatttttataatttaaaaatagttttctttcgctgggacacatacatttttgggcgtaaattttcagttcaaatttccatttttacaaccat aatcataaagctacgtctgatctctctcgcacttacctgcgcctgattcgaaagaacaaccgtagccaaaagaacaagaagaacaagcacgtagttgt ggtagtggacgttcatcacgcaatactgaccaatggtcgtggggtctcactttccgtactattgagagaggggagactgaagatggcaattgaggaca gtgtcttcgacgcacgcatgCatccataagcataatccaggagggatggagagaaaaatcttgtttctaagcccctccctttgtaatacatacacatatct aataccgaagaatggctaattgaatggacgtcagctgttgctgtagttgccaaggcatcatcgatgaaataactgaaagaaagaattaaataattangc aggcgtatccggcggtcattgaagacttggacttgattgaggaggaggatcagatcatccatacacttaatttggaggatgcggttgatccggaaaatg ggcttagtaagtgactgaccacacgcggggggcattaatttaataaattgaattccatttcagatgtgttcaaactagatccagaattcgaaaagaacga ggaggtttatgaggagatccgtaaggaaatcattggaaacgccgatatttcggatgaggatggtggcgacgagttggatgatgaagaagagggt2gt gatgtggaagaggctccgaagaagactacagagattattgataatactgatcagaattgactgctttcagaaggtattcatmgagttttgggccggcaa atctgtaagttgccggttgc c gaaa atttgct gaatttgccggaaaaaaaaattcc ggaatttatttaaaaac tttttg taaaaattaaattaaatttgcaactt ttcagagaagtctacctgacaatgcaatcatctttggactaccaagaagctgctcacaaattgctgaaaatgaagattccagacagcatgcaggtcagc gatgttgcaaagaaaaatrncgaccaaaaaaaccaaccaatcataaaatttaaaaaaaaactccgttttTttctttttttitatacgagaaaaaccaaaaaa atgtatttttgccaaattctaaaatactatccccgaaattttcaatattttctctttcagaacgaactctgcgcgatgcttgtcgattgttgtgctcaacagcgta cctacgagcgattctacggaatgctcatcgaacgtttctgccgacttcgcctcgaataccagcaatacragaaaagctctgccaggacacgtattccac gattcaccgaattgacatcacaaaactgcggaatttggctcgccttattgctcatttgctctcgacggatgctattgactggaagattttggccgatatgaa aatgaccgaagaggacacaacttcnctggcagaatctatattaaatatatatttaatgaacngtggaggcgatgggaatggttaaacttcattcgagag ttactgatccgtgagtttcctagagagagttgttttcgtattcaattttccctattttcagaactttggctcaRgctttgttgganartcccacgaactaatccg aacagcgcacgattttcgatcaacncttcacaatgattggattgggtggtttgacgttggaacttcgtgaatggctggcaaagggtctcaagaagaaga agggaatgctggatcagngaaggccgaatcaagctcagattcatcgtcgtcttcggattcgtcagactcgtctgattcncggattctgacgattcatcc gactcgtcttcagattcctcatcttcncagaatcagagccagaaccaccgaagaaaaagaagaagaagaacagtgaagagagttccaaaaagaag
PL 213 379 B1 gaaaaagagaatartggtcgacgggatcgtggagacaagagagctgaacgtcatcgtgatcaaagtgtggagaacaaggacaaggatcgtcgacg tcgccaggattctgacgaaaatcgtcggccagaacgaggagatgaccgcaaggatcggagtaaagatcgtcgtcgtcaagactcggatgatgagg atcggaaaggtcgtgaacgtcgggaagattcaggggaaagacgtcgcggagatcgggatcgacgtgatcgaaacaaggatcaggaggatcaccg tgaagatcgccgtgaccgaagcaaggatcgtgaggatcgacgtgatcgccgtcgtcatgactctgatgatgatcgtaaaactcgtcgggatagaagt gaagagcgaggaggacgtcgtcgtgaagtggaatcggatgatcgacgccgacgtcgttgaattttcaaattttaaatactgaatatttgttttttttcctatt atttatttattctctttgtgtmttRcngctttctaaaaaanaattcaatccaaatctaaacatgagcggtRtttttctctttccgtctcccaattcgtattccgct cctctcatctgaacacaatgtgcaagtttatttatcttctcgctttcatttcattaggacgtggggggaattggtggaagggggaaacacacaaaaggatg atggaaatgaaataaggacacacaatatgcaacaacattcaattcagaaatatggaggaaggtttaaaagaaaacataaaaatatatagaggaggaa ggaaaactagtaaaaaataagcaaagaaattaggcgaacgatgagaattgtcctcgcttggcaaatgcgaatccgtatggagaggcacgtttggcga aggcaaatgttcggtatggagatctgtaaaaatttttaagttgaaatttggtgttgctcttttacaaaattttccgattttcgcttgaaattacggtgccaggtct cgacacgtcttccaatttncaaattcaaaagagcctttaatgggctgtagttgctaatttctcgtttttgaaaatttttcttccgtttaatcgaaatttgatgtattt tatttatgattttcaataaatttcaaagaaactggtgaaaactcggaaaattgtgaactacagtaatccaatccttaaaggcgcacaccttttaaatgtccgc cccaatacgatatttttnaagaitcgctagagcggccgccaccgcggtggagctccaattcgccctatagtgagtcgtattacaattcactggccgtcgt tttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccccttcgccagctggcgtaatagcgaagaggccc gcaccgatcgcccttcccaacagttgcgtagcctgaatggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggnacgc gcagcgtgaccgctacacngccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctnctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctcta aatcgggggctccctttagggttccgatttagtgcttłacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccct gatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattctttt gatttataagggattttgccgatncggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttca ggtggcacrtttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgc ttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtatteaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttngctcacccagaaac gctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgcc ccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtanatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcat acactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataag catgagtgataacactgcggccaacttactlctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgctttttttcacaacatgggggatcatgtaactcg ccttgatcgttgggaaccggagcjgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaact attaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggccettcc ggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcatłgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgt agttatctacacgacgggcagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcag accaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatccctiaa cgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaa aaaccaccgctaccagcggtggmgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatact gtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacataccTcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccag tggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcc cagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagcattgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacagg tatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccaggggggaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccac ctctgacttgagcgtcgattrngtgatgctcgtcaggggggccgagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgct ggccttttgctcacatgttctncctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacga ccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctg gcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttacctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgct tccggctcctatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagctcggaattaaccctcactaa agggaacaaaagctgggggggatcctccaaaatcgtcttccgctctgaaaaacgaaagtggacctttgacatccgaaaaaatgggcgaaaaaatga aattgagctttttgggtcgaaaaaaatgtttttagaatgctgagaacacgttaaacacgaagatcatatttattngagacccggatgctctgaaaatgtctg acatagatttaaaaaagcafataatantttcattttcaacgtgaaagtttłgtgcaacmatagaatctcctatlggcacattgttttttatnaactgaggcag tttttgaacacctttttgaaacttigaatctctttgaagtatactgtcgaaaagactgacttgagcgttcgaaatgccagaagaaaactatatttgaatctcgc gctaaattgagaaatgcaaccgcgctccactggacaanggaaaaaaaatttattcggaggcgacaacggtatttrcgaaattgattttctgtgtattttct catmttataaattcttctttgarttatcgttcgłttgtgagaaatttaattgtattcaaacttttnatagtaagata

Claims (7)

1. Sposób wytwarzania rośliny odpornej na zakażenie szkodnikiem roślinnym żerującym na roślinie, znamienny tym, że transformuje się roślinę lub komórkę roślinną sekwencją DNA z tego szkodnika roślinnego, przy czym ta sekwencja DNA, lub jej fragment, jest klonowana w odpowiednim wektorze w takiej orientacji względem promotora(lub promotorów), że wspomniany promotor(lub promotory) inicjuje transkrypcję tej sekwencji DNA do dsRNA po związaniu odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego ze wspomnianym promotorem(lub promotorami), z wytworzeniem rośliny odpornej na zakażenie szkodnikiem roślinnym.
PL 213 379 B1
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wspomnianą sekwencję DNA dostarcza się pomiędzy dwoma promotorami tak, że wiązanie czynnika transkrypcyjnego z promotorem wywołuje transkrypcję DNA do dsRNA.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wspomnianą sekwencję DNA dostarcza się w orientacji sensownej i antysensownej wzglę dem wspomnianego promotora tak, ż e wiązanie czynnika transkrypcyjnego z promotorem wywołuje transkrypcję DNA do dsRNA.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako promotor (lub promotory) stosuje się promotor(lub promotory) tkankowo-specyficzny.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że jako promotor (lub promotory) stosuje się promotor(lub promotory) specyficzny dla korzeni.
6. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 5, znamienny tym, że szkodnikiem roślinnym jest nicień.
7. Sposób według jednego z zastrz. 6, znamienny tym, że nicieniem jest dowolny spośród: Tylenchulus ssp. Radopholus ssp., Rhadinaphelenchus ssp., Heterodera ssp., Rotylenchulus ssp., Pratylenehus ssp., Belonolaimus ssp., Canjanus ssp., Meloidogyne ssp., Globodera ssp., Naeobbus ssp., Ditylenehus ssp., Aphelenehoides ssp., Hirsehmaniella ssp., Anguina ssp., Hoplolaimus ssp., Heliotylenchus ssp., Criconemella ssp., Xiphinema ssp., Longidorus ssp., Triehodorus ssp., Parartiehodorus ssp. i Aphelenchs ssp.
Rysunki pGNl gagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgaaattgraaacgnaatam tgttaaaancgcgttaaatamgttaaaicagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccnataaatcaaaagaat agaccgagatagggngagigrtgticcagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgicaaagggcgaa aaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcacccaaatcaagtittttgcggtcgaggtgccgtaaagcictaaat cggaaccctaaagggagcccccgantagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaag cgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcnaatgcgc cgctacagggcgcgtccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcncgctaiucgcca gctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacgg ccagtgaangtaaiacgactcactatagggcgaattcgagctcggtacccggggatcctctagagtcgaaagcnctcgccctat agtgagtcgtanacagcngagtattctatagtgtcacctaaaiagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaaKgtt atccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacatt aattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggag aggcggtttgcgtattgggcgctcnccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcag ctcactcaaaggcggtaatacggnatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaa ggccaggaaccgtaaaaaggccgcgngctggcgtttttcgataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgct caagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtticcccctggaagctccctcgtgcgctcwctgttc cgaccctgccgcnaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgcittctcatagctcacgctgtaggtatctca gncggtgtaggxcgticgciccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgtxcagcccgaccgcxgcgccttatccggtaacta tcgtcttgagtccaacccggraagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgt aggcggtgctacagagttcngaagrggtggcctaactacggctacactagaaggacagtaraggtatctgcgctctgctgaagc cagttacctTCggaaaaagagnggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtmtttgtngcaagcagc agattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgt taagggattttggtcatgaganatcaaaaaggatcttcacctagatccttnaaattaaaaatgaagttttaaatcaatciaaagtatat atgagtaaacnggtcizacaznaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctamcgttcatccatagttgcct gactccccgicgrgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgct
PL 213 379 B1 / (c-d. ) caccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaacraatccgcctcc atccagtctattaartgttgcczggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagrngcgcaacgttgttggcaagcucaggca tcgtggtgtcacgctcgtcgmggtatggcrtcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacaigatcccccatgttgtg caaaaaagcggrtagctccncggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttaicactcatggttatggcagcact gcataattctcttactgtcaigccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcartctgagaataccgcgccc ggcgaccgagttgctcngcccggcgtcaatacgggataatagtgtatgacatagcagaactttaaaagtgctcatcanggaaaa cgttcttcggggcgaaaacicicaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcaca gcatctttiacntcaccagcgmctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacg gaaatgngaaiactcaiac:OTCctttrtcaatanattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatarttgaatgtai ttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcaigacatt aacctataaaaataggcgtaicacgaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcc cggagacggtcacagcngtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgrcagcgggtgnggcgggt gtcggggctggcnaactatgcggcaicagagcagangtactga
PONIOO ctagcatgaacacgattaacatcgctaagaacgacttctctgacaicgaactggctgctatcccgticaacactctggctgaccatt acggtgagcgtttagctcgcgaacagttggcccrtgagcaigagtcttacgagatgggtgaagcacgcnccgcaagatgtttga g;gtcaacttaaagctggtgaggttgcggataacgctgccgccaagcctctcatcactaccctactccctaagatgattgcacgc atcaacgactggtttgaggaagtgaaagctaagcgcggcaagcgcccgacagccttccagrtccigcaagaaaicaagccgga agccgtagcgtacatcaccanaagaccactctggcttgcctaaccagtgctgacaatacaaccgncaggctgtagcaagcgca atcggtcgggccangaggacgaggctcgcttcggtcgtatccgtgaccttgaagctaagcacttcaagaaaaacgttgaggaa caactcaacaagcgcgtagggcacgtctacaagaaagcatttatgcaagttgtcgaggctgacaigctctctaagggtctactcg gtggcgaggcgtggtcttcgtagcataaggaagactctaitcatgtaggagtacgctgcatcgagatgctcattgagtcaaccgg aatggttagcttacaccgccaaaatgctggcgtagtaggtcaagactctgagactatcgaactcgcacctgaatacgctgaggct atcgcaacccgtgcaggtgcgctggctggcatctctccgatgttccaaccttgcgiagttcctcctaagccgtggactggcattac tggtggtggctactgggctaacggrcgtcgtcctctggcgctggtgcgtactcacagtaagaaagcactgaigcgciacgaagac gmacatgcctgaggtgtacaaagcgattaacattgcgcaaaacaccgcatggaaaatcaacaagaaagtcctagcggtcgcc aacgtaatcaccaagtggaagcattgtccggtcgaggacatccctgcgartgagcgtgaagaactcccgatgaaaccggaaga catcgacatgaatcctgaggcrctcaccgcgtggaaacgtgctgccgctgctgtgtaccgcaaggacagggctcgcaagtctc gccgutcagccttgagttcaigcttgagcaagccaataagtttgctaaccataaggccatctggttcccttacaacatggactggc gcggtcgtgtttacgccgtgtcaafgncaacccgcaaggtaacgatatgaccaaaggactgcttacgctggcgaaaggtaaac caatcggiaaggaaggttaciactzgctgaaaatccacggtgcaaactgtgcgggtgtcgaiaaggticcgttccctgagcgcat caagttcattzaggaaaaccacgagaacatcatggcngcgctaagtctccactggagaacacttggtzggctgagcaagattct ccguctgcnccttgcgttcrgcmzagtacgctggggtacagcaccacggcctgagctataactgctcccttccgctggcgtrtg acgggtcttgctctggcatccagcacttctccgcgatgctccgagatgaggtaggtggtcgcgcggttaacrtgcttcctagtgag accgttcaggacatctacgggangngctaagaaagtcaacgagattctacaagcagacgcaatcaatgggaccgataacgaa gtagttaccgtgaccgatgagaacactggtgaaatctctgagaaagtcaagctgggcactaaggcactggctggtcaaiggctg gctcacggtgnactcgcagtzTgactaagcgttcagtcatgacgctggcttacgggtccaaagagttcggcnccgtcaacaagt gctgzaagataccancazccagciattgattccggcaagggtccgatgttcactcagccgaatcaggctgcxggatacatggct aagctgatttgggaatctgtzagcgxgacggtggtagctgcggttgaagcaatgaactggcttaagxctgctgctaagcxgcigg
PL 213 379 B1 sż&.s. ęc.d. a) ctgctgaggtcaaagatiagaagaciggagagattcttcgcaagcgttgcgctgtgcangggtaactcctgatggtttccctgtgt ggcaggaatacaagaagcctattcagacgcgcttgaacctgargttcctcggrcagrtccgcnacagcctaccattaacaccaac aaagatagcgagattgatgcacacaaacaggagtctggtatcgctcctaacTttgtacacagccaagacggtagccaccttcgta agactgtagtgtgggcacacgagaagtacggaatcgaatcttttgcactgancacgactccticggtaccattccggctgacgct gcgaacctgttcaaagcastgcgcgaaactatggttgacacatatgagtcngtgaigtactggctgantctacgaccagttcgct gaccagttgcacgagtctcaattggacaaaatgccagcacttccggctaaaggtaacttgaacctccgtgacatcttagagtcgg acttcgcgttcgcgtaaccarggtartgatatctgagctccgcatcggccgctgtcarcagatcgccaictcgcgcccgtgcctctg acnctaagtccaattacrcitcaacatccctacatgctctttctccctgtgctcccaccccciattrttgttattatcaaaaaaacttcnc ttaamctttgttttnagcrtcraaagtcacctctaacaatgaaattgtgtagancaaaaatagaanaancgtaaiaaaaagtcga aaaaaattgtgctccctccccccanaataataattctatcccaaaatctacacaargttctgtgtacacncttatgmtnttacticiga taaartttttttgaaacaicatagaaaaaaccgcacacaaaataccttatcatatgttacgttrcagmaigaccgcaatttttarttcttc gcacgtctgggcctctcatgacgtcaaatcaigctcatcgtgaaaaagttnagagtaimggaaimtcaaicaagtgaaagnta tgaaanaattttcctgctmgCTttttąjgggtttcccctaagtttgtcaagagtttcgaggacggcgttgtcngciaaaatcacaag tangatgagcacgatgcaagaaagatcggaagaaggtttgggtttgaggctcagtggaaggtgagtagaagttgauatttgaa agtggagtagtgtciargsggrttttgccttaaatgacagaatacattcccaaiataccaaacataactgtttcctaciagtcggccgt acgggccctrtcgtctczcgcgracggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtct gtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgc ggcatcagagcagattgncTgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatca ggcggccttaagggccicgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggntcnagacgtcaggtggcacttttcg gggaaaigtgcgcggaacccctattigtttatttttctaaatacattcaaaiaigtatccgctcatgagacaataaccctgataaaigct tcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgccettattcccmnigcggcartttgccttcctgtttKg ctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagrtgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaaca gcggtaagatccttgagagrmcgccccgaagaacgtmccaatgatgagcactmaaagtictgcraigtggcgcggtaitatc ccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacanattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaa aagcatcttacggatggcarzacagtaagagaattatgcagtgctgccaiaaccatgagtgataacactgcggccaacttacnct gacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccrtgatcgttgggaacc ggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaa ctggcgaactacttactcugcticccggcaacaattaatagactggatggaggcggaiaaagttgcaggaccacttctgcgcic ggcccttccggctggaggtnattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggcca gatggtaagccctcccgtaccgtagjtatctacacgacggggagtcaggcaactatggaigaacgaaatagacagatcgctgag ataggigcctcactgattjazcattzgtaactgtcagaccaagtttactcatautactttagattgatnaaaacttcatitnaatttaaa aggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccnaacgtgagttncgnccacigagcgtcagaccccgtag aaaagatcaaaggatcttcngagaicctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtgg tttgtttgccggatcaagagctaccaactcmttccgaaggtaactggcticagcagagcgcagataccaaatactgtcntctagt gtagccgtagttaggccaccacrccaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgc cagtggcgataagtcgtgtcnaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggg gttcgtgcacacagcccągmgzagcgaacgacctacaccgaactgagacacciaęagcgtgagcattgagaaagcgccac gcttcccgaagggagaaaggcgzacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttcca gggggaaacgcctggtatCTtatagtcctgtcgggtncgccacctctgactigagcgtcgatttttgtgaigcicgtcagggggg cggagcctatggaaaaaczccagcaacgcggcctttttacggrtcctggcOTttgctggęCTtrtgcicacatgttctttcctgcgtt atcccctgattctgtggacasccgtatiaccgcctttgagigagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcga gtcagigagcgaggaagcggaazagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgrtggccgancanaatgcagctgg cacgacaggracccgactzgaaagcgggcagtgagcgcaacgcaanaatgtgagnagctcactcanaggcaccccaggct ttacacmatgcttccggetcztaczngtgtggaartgtgagczgataacaatncacacaggaaacagctatgaccatganacg ccaagcttgcatgcctgcazgtcgactcxagaggatcaagagcamgaatcagaatatggagaacggagcatgagcatmcga agtr.raagatgcactagaacaaagcgtgnzgcncctcigagcccgcttxccnatatacccgcanc:gcagccnacagaatgti
77Ć·. A? (c.d. 2} ctagaaggtcctagatgcattcgtngaaaaiactcccggtgggtgcaaagagacgcagacggaaaatgtatctgggtctctttatt gtgtacactacttttccatgtaccgaatgtgagtcgccctccttttgcaacaagcagctcgaatgttctagaaaaaggtggaaaata gtaiaaaiaccgttgaaaataaataccgaacaacatttgctctaattgtgaaanagaaatcttcaaactataatcatctcactggatc cccgggattggccaaaggacccaaaggtatgtttcgaatgatactaacataacatagaacattttcaggaggacccttgg
PL384205A 1998-07-03 1999-07-02 Sposób wytwarzania rosliny odpornej na zakazenie szkodnikiem roslinnym PL213379B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9814536.0A GB9814536D0 (en) 1998-07-03 1998-07-03 Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
GBGB9827152.1A GB9827152D0 (en) 1998-07-03 1998-12-09 Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL213379B1 true PL213379B1 (pl) 2013-02-28

Family

ID=26313977

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL384205A PL213379B1 (pl) 1998-07-03 1999-07-02 Sposób wytwarzania rosliny odpornej na zakazenie szkodnikiem roslinnym
PL347978A PL201425B1 (pl) 1998-07-03 1999-07-02 Sposób łagodzenia zakażenia roślin nicieniami i zastosowanie sekwencji DNA z nicienia
PL390495A PL216779B1 (pl) 1998-07-03 1999-07-02 Sposób wprowadzania dsRNA lub DNA zdolnego do produkcji dsRNA do organizmu

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL347978A PL201425B1 (pl) 1998-07-03 1999-07-02 Sposób łagodzenia zakażenia roślin nicieniami i zastosowanie sekwencji DNA z nicienia
PL390495A PL216779B1 (pl) 1998-07-03 1999-07-02 Sposób wprowadzania dsRNA lub DNA zdolnego do produkcji dsRNA do organizmu

Country Status (27)

Country Link
US (3) US20030061626A1 (pl)
EP (5) EP1197567B2 (pl)
JP (3) JP4353639B2 (pl)
KR (4) KR20060071438A (pl)
CN (3) CN1900319A (pl)
AT (2) ATE419383T1 (pl)
AU (1) AU769223B2 (pl)
BR (1) BR9911802A (pl)
CA (2) CA2789083C (pl)
CY (2) CY1108920T1 (pl)
CZ (2) CZ303494B6 (pl)
DE (5) DE1093526T1 (pl)
DK (2) DK1197567T4 (pl)
ES (2) ES2327334T3 (pl)
GB (4) GB9827152D0 (pl)
HU (1) HU230602B1 (pl)
IL (3) IL140467A0 (pl)
IN (2) IN2001DE00006A (pl)
IS (1) IS2816B (pl)
MX (1) MX234065B (pl)
NO (1) NO327729B1 (pl)
NZ (1) NZ509182A (pl)
PL (3) PL213379B1 (pl)
PT (2) PT1197567E (pl)
RU (1) RU2240349C2 (pl)
WO (1) WO2000001846A2 (pl)
ZA (1) ZA200007653B (pl)

Families Citing this family (257)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
AUPP249298A0 (en) 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
WO1999049029A1 (en) * 1998-03-20 1999-09-30 Benitec Australia Ltd Control of gene expression
GB9827152D0 (en) * 1998-07-03 1999-02-03 Devgen Nv Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
EP2314700A1 (en) * 1999-01-28 2011-04-27 Medical College of Georgia Research Institute, Inc Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded RNA
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
US7601494B2 (en) 1999-03-17 2009-10-13 The University Of North Carolina At Chapel Hill Method of screening candidate compounds for susceptibility to biliary excretion
US20040138168A1 (en) * 1999-04-21 2004-07-15 Wyeth Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences
WO2000063364A2 (en) * 1999-04-21 2000-10-26 American Home Products Corporation Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences
US6924109B2 (en) * 1999-07-30 2005-08-02 Agy Therapeutics, Inc. High-throughput transcriptome and functional validation analysis
US6423885B1 (en) 1999-08-13 2002-07-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells
CA2386270A1 (en) 1999-10-15 2001-04-26 University Of Massachusetts Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
GB9927444D0 (en) * 1999-11-19 2000-01-19 Cancer Res Campaign Tech Inhibiting gene expression
US7829693B2 (en) 1999-11-24 2010-11-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
DE10100586C1 (de) 2001-01-09 2002-04-11 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines Ziegens
GB9930691D0 (en) * 1999-12-24 2000-02-16 Devgen Nv Improvements relating to double-stranded RNA inhibition
US8273866B2 (en) 2002-02-20 2012-09-25 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (SINA)
US7491805B2 (en) 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US8202979B2 (en) 2002-02-20 2012-06-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid
US7833992B2 (en) 2001-05-18 2010-11-16 Merck Sharpe & Dohme Conjugates and compositions for cellular delivery
US8202846B2 (en) 2000-03-16 2012-06-19 Cold Spring Harbor Laboratory Methods and compositions for RNA interference
EP1272630A2 (en) 2000-03-16 2003-01-08 Genetica, Inc. Methods and compositions for rna interference
PT1309726E (pt) 2000-03-30 2010-03-08 Whitehead Biomedical Inst Mediadores de interferência por rna específicos de sequência de rna
US7083947B2 (en) 2000-05-19 2006-08-01 Devgen Nv Assay techniques using nematode worms
GB0012233D0 (en) * 2000-05-19 2000-07-12 Devgen Nv Vector constructs
GB0012229D0 (en) 2000-05-19 2000-07-12 Devgen Nv Lipid uptake assays
GB2362383B (en) * 2000-05-19 2003-12-31 Devgen Nv Gene expression system
AU2001275474A1 (en) * 2000-06-12 2001-12-24 Akkadix Corporation Materials and methods for the control of nematodes
US20030190635A1 (en) * 2002-02-20 2003-10-09 Mcswiggen James A. RNA interference mediated treatment of Alzheimer's disease using short interfering RNA
US20040259247A1 (en) 2000-12-01 2004-12-23 Thomas Tuschl Rna interference mediating small rna molecules
US7767802B2 (en) 2001-01-09 2010-08-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
US7423142B2 (en) 2001-01-09 2008-09-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
AU2002241980B2 (en) 2001-01-25 2008-01-31 Virxsys Corporation Methods and compositions for identifying gene function
NZ526507A (en) 2001-01-26 2005-07-29 Commw Scient Ind Res Org Methods and means for producing efficient silencing construct using recombinational cloning
EP1229134A3 (en) 2001-01-31 2004-01-28 Nucleonics, Inc Use of post-transcriptional gene silencing for identifying nucleic acid sequences that modulate the function of a cell
US20040110177A1 (en) * 2001-02-02 2004-06-10 Axel Ullrich Method for identifying functional nucleic acids
WO2003070887A2 (en) * 2002-02-20 2003-08-28 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF POLYCOMB GROUP PROTEIN EZH2 GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US9994853B2 (en) 2001-05-18 2018-06-12 Sirna Therapeutics, Inc. Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference
EP1572067A4 (en) 2001-05-18 2009-05-13 Sirna Therapeutics Inc CONJUGATES AND COMPOSITIONS FOR CELLULAR RELEASE
US7517864B2 (en) 2001-05-18 2009-04-14 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
WO2003070888A2 (en) * 2002-02-20 2003-08-28 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of checkpoint kinase-1 (chk-1) gene expression using short interfering nucleic acid
US20050148530A1 (en) 2002-02-20 2005-07-07 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7109165B2 (en) 2001-05-18 2006-09-19 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
WO2005078097A2 (en) 2004-02-10 2005-08-25 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF GENE EXPRESSION USING MULTIFUNCTIONAL SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (Multifunctional siNA)
EP2345720A3 (en) 2001-07-12 2012-01-25 University of Massachusetts In vivo production of small interfering RNAs that mediate gene silencing
US7612194B2 (en) * 2001-07-24 2009-11-03 Monsanto Technology Llc Nucleic acid sequences from Diabrotica virgifera virgifera LeConte and uses thereof
US7608758B2 (en) 2001-08-31 2009-10-27 Riken Plant system for comprehensive gene function analysis with the use of full-length cDNA
DE10163098B4 (de) 2001-10-12 2005-06-02 Alnylam Europe Ag Verfahren zur Hemmung der Replikation von Viren
US7745418B2 (en) 2001-10-12 2010-06-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting viral replication
US20030150017A1 (en) * 2001-11-07 2003-08-07 Mesa Jose Ramon Botella Method for facilitating pathogen resistance
DE10202419A1 (de) 2002-01-22 2003-08-07 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines durch eine Chromosomen-Aberration entstandenen Zielgens
US20030166282A1 (en) * 2002-02-01 2003-09-04 David Brown High potency siRNAS for reducing the expression of target genes
US20060009409A1 (en) 2002-02-01 2006-01-12 Woolf Tod M Double-stranded oligonucleotides
EP2213737B1 (en) 2002-02-01 2012-11-07 Life Technologies Corporation Double-stranded oligonucleotides
AU2003207708A1 (en) 2002-02-20 2003-09-09 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of map kinase genes
AU2003216255A1 (en) * 2002-02-20 2003-09-09 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF MDR P-GLYCOPROTEIN GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US9181551B2 (en) 2002-02-20 2015-11-10 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US7667029B2 (en) 2002-02-20 2010-02-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of checkpoint kinase-1 (CHK-1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
EP1474433A4 (en) * 2002-02-20 2005-02-23 Sirna Therapeutics Inc TARGET LOCALIZATION TARGETED BY RNA INTERFERENCE AND TARGET VALIDATION WITH SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
EP1476459A4 (en) * 2002-02-20 2005-05-25 Sirna Therapeutics Inc INHIBITION OF RNA INTERFERENCE-INDUCED CHROMOSOME TRANSLOCATION GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (SINA)
US9657294B2 (en) 2002-02-20 2017-05-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
AU2003228667A1 (en) * 2002-04-22 2003-12-19 Sirna Therapeutics Inc. Nucleic acid mediated disruption of hiv fusogenic peptide interactions
US20040180438A1 (en) 2002-04-26 2004-09-16 Pachuk Catherine J. Methods and compositions for silencing genes without inducing toxicity
WO2003095652A2 (de) * 2002-05-08 2003-11-20 Xantos Biomedicine Ag EXPRESSIONSKONSTRUKTE ZUR HERSTELLUNG VON DOPPELSTRANG (ds) RNA UND DEREN ANWENDUNG
WO2003100094A2 (en) * 2002-05-23 2003-12-04 Devgen Nv Method for determining the influence of a compound on cholesterol transport
WO2004001044A1 (en) * 2002-06-21 2003-12-31 Sinogenomax Company Ltd. Randomised dna libraries and double-stranded rna libraries, use and method of production thereof
US7803984B2 (en) * 2002-07-10 2010-09-28 Kansas State University Research Foundation Compositions and methods for controlling plant parasitic nematodes
US7655790B2 (en) 2002-07-12 2010-02-02 Sirna Therapeutics, Inc. Deprotection and purification of oligonucleotides and their derivatives
AU2003260370B2 (en) 2002-08-05 2008-05-22 Silence Therapeutics Gmbh Further novel forms of interfering RNA molecules
WO2004014933A1 (en) 2002-08-07 2004-02-19 University Of Massachusetts Compositions for rna interference and methods of use thereof
US20040198967A1 (en) * 2002-09-04 2004-10-07 Provost, Fellows And Scholars Of The College Of The Holy And Undivided Trinity Of Queen Elizabeth Compositions and methods for tissue specific or inducible inhibition of gene expression
US7956176B2 (en) 2002-09-05 2011-06-07 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
CA2507189C (en) 2002-11-27 2018-06-12 Sequenom, Inc. Fragmentation-based methods and systems for sequence variation detection and discovery
EP1597361A2 (en) * 2002-12-23 2005-11-23 Devgen NV Kinase sequences useful for developing compounds for the prevention and/or treatment of metabolic diseases and nucleotide sequences encoding such kinase sequences
EP1622572B1 (en) 2003-04-30 2017-12-20 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
IL155783A (en) 2003-05-05 2010-11-30 Technion Res & Dev Foundation Multicellular systems of pluripotent human embryonic stem cells and cancer cells and uses thereof
DK1633784T3 (da) 2003-05-09 2011-10-24 Diadexus Inc OVR110 antistofsammensætninger og -anvendelsesfremgangsmåder
JP2006527593A (ja) * 2003-06-17 2006-12-07 デヴゲン エヌブイ 代謝性疾患の予防及び／又は治療のための化合物を開発するために有用なアルコールデヒドロゲナーゼ配列
WO2005024068A2 (en) 2003-09-05 2005-03-17 Sequenom, Inc. Allele-specific sequence variation analysis
WO2005049841A1 (en) * 2003-11-17 2005-06-02 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Insect resistance using inhibition of gene expression
CN102321584B (zh) 2003-12-31 2014-01-08 宾夕法尼亚州研究基金会 预测并克服对卵巢癌化疗的抗性的方法及预测结肠癌发生的方法
US20060019914A1 (en) 2004-02-11 2006-01-26 University Of Tennessee Research Foundation Inhibition of tumor growth and invasion by anti-matrix metalloproteinase DNAzymes
US7622301B2 (en) * 2004-02-24 2009-11-24 Basf Plant Science Gmbh Compositions and methods using RNA interference for control of nematodes
US7608394B2 (en) * 2004-03-26 2009-10-27 Sequenom, Inc. Methods and compositions for phenotype identification based on nucleic acid methylation
US9249456B2 (en) 2004-03-26 2016-02-02 Agena Bioscience, Inc. Base specific cleavage of methylation-specific amplification products in combination with mass analysis
ES2671522T3 (es) 2004-04-02 2018-06-06 The Regents Of The University Of California Métodos y composiciones para tratar y prevenir una enfermedad asociada con la integrina alfa V beta 5
US20060021087A1 (en) 2004-04-09 2006-01-26 Baum James A Compositions and methods for control of insect infestations in plants
AU2005238034A1 (en) 2004-04-23 2005-11-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Inhibition of hairless protein mRNA
US10508277B2 (en) 2004-05-24 2019-12-17 Sirna Therapeutics, Inc. Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference
JP4852539B2 (ja) 2004-06-22 2012-01-11 ザ・ボード・オブ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・イリノイ 腫瘍細胞増殖をＦＯＸＭ１ｓｉＲＮＡによって阻害する方法
US7968762B2 (en) 2004-07-13 2011-06-28 Van Andel Research Institute Immune-compromised transgenic mice expressing human hepatocyte growth factor (hHGF)
US20100132058A1 (en) 2004-07-23 2010-05-27 Diatchenko Luda B Methods and materials for determining pain sensitivity and predicting and treating related disorders
CA2577036A1 (en) 2004-08-18 2006-02-23 Genesense Technologies Inc. Small interfering rna molecules against ribonucleotide reductase and uses thereof
CA2940718C (en) * 2004-09-24 2019-06-18 J.R. Simplot Company Gene silencing
US20060247197A1 (en) 2004-10-04 2006-11-02 Van De Craen Marc Method for down-regulating gene expression in fungi
JP2008515458A (ja) 2004-10-13 2008-05-15 ユニバーシティ オブ ジョージア リサーチ ファウンデーション， インコーポレーテッド 線虫抵抗性の遺伝子組換え植物
CN101107362A (zh) 2004-10-21 2008-01-16 文甘扎公司 用于赋予对植物病害生物和植物病原体抗性的方法和材料
WO2006045591A2 (en) * 2004-10-25 2006-05-04 Devgen N.V. Method and constructs for delivering double stranded rna to pest organisms
AU2005298337A1 (en) 2004-10-25 2006-05-04 Devgen Nv RNA constructs
EP1841793B1 (en) 2005-01-07 2010-03-31 Diadexus, Inc. Ovr110 antibody compositions and methods of use
US8088976B2 (en) * 2005-02-24 2012-01-03 Monsanto Technology Llc Methods for genetic control of plant pest infestation and compositions thereof
DE202005004135U1 (de) * 2005-03-11 2005-05-19 Klocke Verpackungs-Service Gmbh Mehrkomponentenverpackung mit Applikator
EP1866414B9 (en) 2005-03-31 2012-10-03 Calando Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of ribonucleotide reductase subunit 2 and uses thereof
JP2008540571A (ja) 2005-05-12 2008-11-20 ウィスコンシン・アルムニ・リサーチ・ファウンデーション Ｐｉｎ１の遮断は活性化した免疫細胞によるサイトカイン産生を防ぐ
CN101213301B (zh) 2005-05-31 2013-02-27 德福根有限公司 用于防治昆虫和蜘蛛类动物的RNAi
US8703769B2 (en) 2005-07-15 2014-04-22 The University Of North Carolina At Chapel Hill Use of EGFR inhibitors to prevent or treat obesity
AU2006292362B2 (en) 2005-09-16 2013-02-14 Monsanto Technology Llc Methods for genetic control of insect infestations in plants and compositions thereof
ES2545093T3 (es) 2005-09-16 2015-09-08 Devgen N.V. Métodos basados en plantas transgénicas para plagas de plantas usando ARNi
HUE027349T2 (en) 2005-09-16 2016-09-28 Devgen Nv Double-stranded RNA as an insecticide
EP2980220A1 (en) 2005-09-20 2016-02-03 BASF Plant Science GmbH Improved methods controlling gene expression
US9286469B2 (en) * 2005-12-16 2016-03-15 Cisco Technology, Inc. Methods and apparatus providing computer and network security utilizing probabilistic signature generation
CA2636070A1 (en) * 2006-01-06 2007-08-02 North Carolina State University Cyst nematode resistant transgenic plants
WO2007080126A2 (en) 2006-01-12 2007-07-19 Devgen N.V. Dsrna as insect control agent
CA2627795C (en) 2006-01-12 2019-01-22 Devgen N.V. Dsrna as insect control agent
US8906876B2 (en) 2006-01-12 2014-12-09 Devgen Nv Methods for controlling pests using RNAi
US20080022423A1 (en) * 2006-02-03 2008-01-24 Monsanto Technology Llc IN PLANTA RNAi CONTROL OF FUNGI
WO2007095469A2 (en) * 2006-02-10 2007-08-23 Monsanto Technology Llc Identification and use of target genes for control of plant parasitic nematodes
AU2007214547B2 (en) * 2006-02-13 2012-09-20 Monsanto Technology Llc Selecting and stabilizing dsRNA constructs
WO2007104570A2 (en) * 2006-03-16 2007-09-20 Devgen N.V. Nematode control
US8968702B2 (en) 2006-03-30 2015-03-03 Duke University Inhibition of HIF-1 activation for anti-tumor and anti-inflammatory responses
PL216037B1 (pl) * 2006-06-09 2014-02-28 Inst Biotechnologii I Antybiotykow Kaseta ekspresyjna, zastosowanie kasety ekspresyjnej, wektor, komórka gospodarza oraz sposób otrzymywania polipeptydu
CN101511181B (zh) 2006-07-11 2013-08-21 新泽西医科和牙科大学 蛋白、编码该蛋白的核酸和相关的应用方法
EP2074209A2 (en) 2006-07-28 2009-07-01 Children's Memorial Hospital Methods of inhibiting tumor cell aggressiveness using the microenvironment of human embryonic stem cells
US8444971B2 (en) 2006-11-27 2013-05-21 Diadexus, Inc. OVR110 antibody compositions and methods of use
CN101195821A (zh) * 2006-12-04 2008-06-11 中国科学院上海生命科学研究院 利用RNAi技术改良植物抗虫性的方法
US20100129358A1 (en) 2006-12-22 2010-05-27 University Of Utah Research Foundation Method of detecting ocular diseases and pathologic conditions and treatment of same
US8455188B2 (en) 2007-01-26 2013-06-04 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Modification of exosomal components for use as a vaccine
US20080184391A1 (en) * 2007-01-29 2008-07-31 Kuppuswamy Subramaniam Pathogen resistant transgenic plants, associated nucleic acids and techniques involving the same
WO2008103643A1 (en) * 2007-02-20 2008-08-28 Monsanto Technology, Llc Invertebrate micrornas
PL2129680T3 (pl) 2007-03-21 2015-10-30 Brookhaven Science Ass Llc Łączone kompozycje cząsteczek antysensownych o strukturze spinki do włosów oraz sposoby modulacji ekspresji
WO2009014565A2 (en) 2007-04-26 2009-01-29 Ludwig Institute For Cancer Research, Ltd. Methods for diagnosing and treating astrocytomas
US20100291042A1 (en) 2007-05-03 2010-11-18 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Multipotent stem cells and uses thereof
US8097422B2 (en) 2007-06-20 2012-01-17 Salk Institute For Biological Studies Kir channel modulators
CN102149826A (zh) * 2007-06-29 2011-08-10 波士顿生物医药公司 通过微小rna装置进行细菌介导的基因调节
US9689031B2 (en) 2007-07-14 2017-06-27 Ionian Technologies, Inc. Nicking and extension amplification reaction for the exponential amplification of nucleic acids
WO2009012263A2 (en) 2007-07-18 2009-01-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Tissue-specific micrornas and compositions and uses thereof
ES2651911T3 (es) 2007-08-14 2018-01-30 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Métodos mejorados de silenciamiento génico
KR101142209B1 (ko) 2007-09-22 2012-05-04 재단법인서울대학교산학협력재단 섭취 ＲＮＡｉ를 이용한 꼬마선충에서 두 유전자의동시발현 억제방법
US7968525B1 (en) 2007-12-03 2011-06-28 University Of Florida Research Foundation, Inc. Use of RNA interference to validate new termiticide target sites and a method of termite control
CN102037123A (zh) 2008-04-04 2011-04-27 卡兰多制药股份有限公司 Epas1抑制剂的组合物和用途
CN107267514A (zh) 2008-04-10 2017-10-20 孟山都技术公司 用于根结线虫防治的方法和组合物
GB0807018D0 (en) 2008-04-17 2008-05-21 Fusion Antibodies Ltd Antibodies and treatment
EP2350264A4 (en) 2008-11-06 2012-08-29 Univ Johns Hopkins TREATMENT OF CHRONIC INFLAMMATION OF THE RESPIRATORY TRACT
EP2687609B1 (en) 2008-11-10 2017-01-04 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Method for treating solid tumor
EP2379722B1 (de) 2008-12-16 2016-09-07 c-LEcta GmbH Expressionsvektor
WO2010074783A1 (en) 2008-12-23 2010-07-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Phosphodiesterase inhibitors and uses thereof
EP2379076B1 (en) 2008-12-23 2014-11-12 The Trustees of Columbia University in the City of New York Phosphodiesterase inhibitors and uses thereof
EP2408458A1 (en) 2009-03-19 2012-01-25 Merck Sharp&Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF SIGNAL TRANSDUCER AND ACTIVATOR OF TRANSCRIPTION 6 (STAT6) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
EP2408917A2 (en) 2009-03-19 2012-01-25 Merck Sharp&Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF BTB AND CNC HOMOLOGY 1, BASIC LEUCINE ZIPPER TRANSCRIPTION FACTOR 1 (BACH 1) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA) SEQUENCE LISTING
EP2408915A2 (en) 2009-03-19 2012-01-25 Merck Sharp&Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF GATA BINDING PROTEIN 3 (GATA3) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
WO2010107952A2 (en) 2009-03-19 2010-09-23 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF CONNECTIVE TISSUE GROWTH FACTOR (CTGF) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
AU2010229847A1 (en) 2009-03-27 2011-10-13 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of the intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1)gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
JP2012521760A (ja) 2009-03-27 2012-09-20 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション 低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いたアポトーシスシグナル調節キナーゼ１（ＡＳＫ１）遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介性阻害
US20120004281A1 (en) 2009-03-27 2012-01-05 Merck Sharp & Dohme Corp RNA Interference Mediated Inhibition of the Nerve Growth Factor Beta Chain (NGFB) Gene Expression Using Short Interfering Nucleic Acid (siNA)
WO2010111471A2 (en) 2009-03-27 2010-09-30 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF SIGNAL TRANSDUCER AND ACTIVATOR OF TRANSCRIPTION 1 (STAT1) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
JP2012521764A (ja) 2009-03-27 2012-09-20 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション 低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いた胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介性阻害
US20100257634A1 (en) * 2009-04-03 2010-10-07 Venganza Inc. Bioassay for gene silencing constructs
US8283332B2 (en) 2009-04-17 2012-10-09 University Of Louisville Research Foundation, Inc. PFKFB4 inhibitors and methods of using the same
EP2258858A1 (en) 2009-06-05 2010-12-08 Universitätsklinikum Freiburg Transgenic LSD1 animal model for cancer
SI2453923T1 (sl) 2009-07-14 2016-04-29 Mayo Foundation For Medical Education And Research S peptidi posredovana ne-kovalentna dostava aktivnih učinkovin preko krvno možganske bariere
CA2767409C (en) 2009-07-24 2018-10-30 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for treating and preventing disease associated with .alpha.v.beta.5 integrin
WO2011025860A1 (en) * 2009-08-28 2011-03-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Compositions and methods to control insect pests
CA2785996C (en) 2009-12-07 2021-04-13 The Johns Hopkins University Sr-bi as a predictor of human female infertility and responsiveness to treatment
KR101718534B1 (ko) 2009-12-09 2017-03-22 닛토덴코 가부시키가이샤 Ｈｓｐ４７ 발현의 조절
US10640457B2 (en) 2009-12-10 2020-05-05 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Histone acetyltransferase activators and uses thereof
WO2011072243A1 (en) 2009-12-10 2011-06-16 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Histone acetyltransferase activators and uses thereof
EP3000885B1 (en) 2009-12-18 2018-07-25 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Organic compositions to treat hsf1-related diseases
WO2011076807A2 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Novartis Ag Lipids, lipid compositions, and methods of using them
US8673565B2 (en) 2010-01-26 2014-03-18 National Jewish Health Methods and compositions for risk prediction, diagnosis, prognosis, and treatment of pulmonary disorders
JP2013519869A (ja) 2010-02-10 2013-05-30 ノバルティス アーゲー 筋肉成長のための方法および化合物
AU2011255203B2 (en) 2010-05-21 2016-01-21 Peptimed, Inc. Reagents and methods for treating cancer
GB201009601D0 (en) 2010-06-08 2010-07-21 Devgen Private Ltd Method for down-grading gene expression in fungi
US9168297B2 (en) 2010-06-23 2015-10-27 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Regulation of skin pigmentation by neuregulin-1 (NRG-1)
CA2805265A1 (en) 2010-08-02 2012-02-09 Merck Sharp & Dohme Corp. Rna interference mediated inhibition of catenin (cadherin-associated protein), beta 1 (ctnnb1) gene expression using short interfering nucleic acid (sina)
WO2012024170A2 (en) 2010-08-17 2012-02-23 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF HEPATITIS B VIRUS (HBV) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
WO2012027206A1 (en) 2010-08-24 2012-03-01 Merck Sharp & Dohme Corp. SINGLE-STRANDED RNAi AGENTS CONTAINING AN INTERNAL, NON-NUCLEIC ACID SPACER
WO2012027467A1 (en) 2010-08-26 2012-03-01 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF PROLYL HYDROXYLASE DOMAIN 2 (PHD2) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20140134231A1 (en) 2010-10-11 2014-05-15 Sanford-Burnham Medical Research Institute Mir-211 expression and related pathways in human melanoma
WO2012051567A2 (en) 2010-10-15 2012-04-19 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Obesity-related genes and their proteins and uses thereof
WO2012058210A1 (en) 2010-10-29 2012-05-03 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACIDS (siNA)
CA2816584A1 (en) 2010-11-01 2012-05-10 Peptimed, Inc. Compositions of a peptide-based system for cell-specific targeting
ES2746554T3 (es) 2010-11-02 2020-03-06 Univ Columbia Métodos para tratar los trastornos de pérdida de cabello
US9198911B2 (en) 2010-11-02 2015-12-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for treating hair loss disorders
US9150926B2 (en) 2010-12-06 2015-10-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Diagnosis and treatment of adrenocortical tumors using human microRNA-483
AU2011338682B2 (en) 2010-12-06 2017-04-27 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double stranded oligonucleotide compounds comprising threose modifications
WO2012088420A1 (en) 2010-12-22 2012-06-28 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Histone acetyltransferase modulators and usese thereof
CN103492572A (zh) 2011-03-03 2014-01-01 夸克医药公司 用于治疗肺疾病和损伤的组合物和方法
TWI658830B (zh) 2011-06-08 2019-05-11 日東電工股份有限公司 Ｈｓｐ47表現調控強化用類視色素脂質體
US10196637B2 (en) 2011-06-08 2019-02-05 Nitto Denko Corporation Retinoid-lipid drug carrier
CA2857374A1 (en) 2011-09-02 2013-03-07 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Camkii, ip3r, calcineurin, p38 and mk2/3 inhibitors to treat metabolic disturbances of obesity
US9352312B2 (en) 2011-09-23 2016-05-31 Alere Switzerland Gmbh System and apparatus for reactions
CN103917556B (zh) 2011-10-14 2018-02-06 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗HtrA1抗体及使用方法
JP6294229B2 (ja) 2011-10-18 2018-03-14 ダイセルナ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＤｉｃｅｒｎａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． アミン陽イオン性脂質およびその使用
JP6118331B2 (ja) 2011-11-03 2017-04-19 クォーク ファーマシューティカルズ インコーポレーティッドＱｕａｒｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． 神経保護のための方法および組成物
EP3459565A1 (en) 2012-03-29 2019-03-27 The Trustees of Columbia University in the City of New York Methods for treating hair loss disorders
WO2013158966A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Futuragene Israel Ltd. Bronze bug control agents
BR112014026363A2 (pt) 2012-04-23 2017-06-27 Futuragene Israel Ltd molécula de ácido ribonucleico, dsrna, vetor, célula hospedeira, tecido vegetal, ácido nucleico isolado, método de produção de planta resistente a pragas e método de inibição de infestação de pragas
WO2013165816A2 (en) 2012-05-02 2013-11-07 Merck Sharp & Dohme Corp. SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA) COMPOSITIONS
WO2014018554A1 (en) 2012-07-23 2014-01-30 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Ptprs and proteoglycans in autoimmune disease
BR112015007123A2 (pt) 2012-10-03 2017-08-08 Futuragene Israel Ltd molécula de ácido ribonucléico de filamento duplo (dsrna) isolada, vetor, célula hospedeira, tecido vegetal, ácido nucléico isolado, e, métodos para produzir uma planta resistente a uma praga e para inibir uma infestação de praga
AU2013329372B2 (en) 2012-10-08 2018-07-12 St. Jude Children's Research Hospital Therapies based on control of regulatory T cell stability and function via a Neuropilin-1:Semaphorin axis
US9920316B2 (en) 2013-03-14 2018-03-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
CA2907152A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Fusion proteins and methods thereof
EP2810952A1 (en) 2013-06-03 2014-12-10 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Novel pest control methods
JP6896420B2 (ja) 2013-07-03 2021-06-30 シティ・オブ・ホープＣｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ 抗癌組成物
EP3055426B1 (en) 2013-10-09 2019-06-19 The United States of America as represented by The Secretary Department of Health and Human Services Detection of hepatitis delta virus (hdv) for the diagnosis and treatment of sjögren's syndrome and lymphoma
US10004814B2 (en) 2013-11-11 2018-06-26 Sirna Therapeutics, Inc. Systemic delivery of myostatin short interfering nucleic acids (siNA) conjugated to a lipophilic moiety
US9682123B2 (en) 2013-12-20 2017-06-20 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods of treating metabolic disease
WO2015098113A1 (ja) 2013-12-27 2015-07-02 独立行政法人医薬基盤研究所 悪性腫瘍の治療薬
EP3169309B1 (en) 2014-07-16 2023-05-10 Novartis AG Method of encapsulating a nucleic acid in a lipid nanoparticle host
WO2016059187A1 (en) * 2014-10-16 2016-04-21 Universite De Strasbourg Method of capturing and identifying novel rnas
WO2016077624A1 (en) 2014-11-12 2016-05-19 Nmc, Inc. Transgenic plants with engineered redox sensitive modulation of photosynthetic antenna complex pigments and methods for making the same
EP3778644A3 (en) 2014-12-23 2021-06-02 The Trustees of Columbia University in the City of New York Fgfr-tacc fusion proteins and methods thereof
US10264976B2 (en) 2014-12-26 2019-04-23 The University Of Akron Biocompatible flavonoid compounds for organelle and cell imaging
US10781446B2 (en) 2015-03-09 2020-09-22 University Of Kentucky Research Foundation RNA nanoparticle for treatment of gastric cancer
CN111961103B (zh) 2015-03-09 2023-06-16 肯塔基大学研究基金会 用于脑肿瘤治疗的rna纳米颗粒
US11085044B2 (en) 2015-03-09 2021-08-10 University Of Kentucky Research Foundation miRNA for treatment of breast cancer
US11279768B1 (en) 2015-04-03 2022-03-22 Precision Biologics, Inc. Anti-cancer antibodies, combination therapies, and uses thereof
CN107614685B (zh) 2015-04-17 2021-10-19 肯塔基大学研究基金会 Rna纳米颗粒及其使用方法
WO2016176617A2 (en) 2015-04-29 2016-11-03 New York University Method for treating high-grade gliomas
US10669528B2 (en) 2015-06-25 2020-06-02 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion, enrichment, and maintenance
US10072065B2 (en) 2015-08-24 2018-09-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research Peptide-mediated delivery of immunoglobulins across the blood-brain barrier
CA2997947A1 (en) 2015-09-09 2017-03-16 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Reduction of er-mam-localized app-c99 and methods of treating alzheimer's disease
WO2017059118A1 (en) 2015-09-29 2017-04-06 Duke University Compositions and methods for identifying and treating dystonia disorders
KR102162324B1 (ko) 2015-10-30 2020-10-07 제넨테크, 인크. 항-HtrA1 항체 및 이의 사용 방법
JP6457704B2 (ja) 2015-12-13 2019-01-23 日東電工株式会社 高活性及びオフターゲット削減のためのｓｉＲＮＡ構造
US11072777B2 (en) 2016-03-04 2021-07-27 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Methods and compositions for ex vivo expansion of very small embryonic-like stem cells (VSELs)
WO2017161001A1 (en) 2016-03-15 2017-09-21 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion
WO2017173327A1 (en) 2016-03-31 2017-10-05 The Schepens Eye Research Institute, Inc. Endomucin inhibitor as an anti-angiogenic agent
EP3516062A1 (en) 2016-09-21 2019-07-31 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Myostatin irna compositions and methods of use thereof
CN107858405B (zh) * 2017-10-12 2021-09-24 华南农业大学 一种测定外源dsRNA对瓢虫毒性影响的方法
US20210162007A1 (en) 2018-04-09 2021-06-03 President And Fellows Of Harvard College Modulating nuclear receptors and methods of using same
CN109183158B (zh) * 2018-08-31 2021-11-23 中国烟草总公司郑州烟草研究院 一种全长转录因子酵母单杂交文库的构建方法
CN109266677B (zh) * 2018-08-31 2021-11-23 中国烟草总公司郑州烟草研究院 一种全长转录因子酵母双杂交文库的构建方法
US20210393740A1 (en) 2018-09-19 2021-12-23 La Jolla Institute For Immunology Ptprs and proteoglycans in rheumatoid arthritis
EP4365289A3 (en) 2018-11-16 2024-07-10 Nitto Denko Corporation Rna interference delivery formulation and methods for malignant tumors
CN113287013B (zh) * 2019-01-04 2025-04-15 国立大学法人京都大学 溃疡性大肠炎以及原发性硬化性胆管炎的检查方法
US12215382B2 (en) 2019-03-01 2025-02-04 The General Hospital Corporation Liver protective MARC variants and uses thereof
CN110229839B (zh) * 2019-06-04 2021-06-08 中国农业大学 一种提升大肠杆菌dsRNA表达产率的方法
CN110746497A (zh) * 2019-11-18 2020-02-04 维塔恩(广州)医药有限公司 肺炎衣原体相关抗原短肽及其应用
CN110804088A (zh) * 2019-11-18 2020-02-18 维塔恩(广州)医药有限公司 巨细胞病毒相关抗原短肽及其应用
EP3825408A1 (en) 2019-11-19 2021-05-26 FRAUNHOFER-GESELLSCHAFT zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Methods of multi-species insect pest control
CN115176005A (zh) 2019-12-18 2022-10-11 诺华股份有限公司 用于治疗血红蛋白病的组合物和方法
JP7682181B2 (ja) 2019-12-18 2025-05-23 ノバルティス アーゲー ３－（５－メトキシ－１－オキソイソインドリン－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン誘導体及びその使用
WO2021142191A1 (en) 2020-01-08 2021-07-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treatment of fibrodysplasia ossificans progressiva
US20210222128A1 (en) 2020-01-22 2021-07-22 Massachusetts Institute Of Technology Inducible tissue constructs and uses thereof
US11642407B2 (en) 2020-02-28 2023-05-09 Massachusetts Institute Of Technology Identification of variable influenza residues and uses thereof
CN113638055B (zh) * 2020-05-22 2023-07-07 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) 一种制备双链rna测序文库的方法
WO2022147481A1 (en) 2020-12-30 2022-07-07 Ansun Biopharma Inc. Combination therapy of an oncolytic virus delivering a foreign antigen and an engineered immune cell expressing a chimeric receptor targeting the foreign antigen
US20250127809A1 (en) 2021-06-23 2025-04-24 Novartis Ag Compositions and methods for the treatment of hemoglobinopathies
WO2023012165A1 (en) 2021-08-02 2023-02-09 Universite De Montpellier Compositions and methods for treating cmt1a or cmt1e diseases with rnai molecules targeting pmp22
CN113533007B (zh) * 2021-08-06 2023-11-24 青岛瑞斯凯尔生物科技有限公司 一种抗体染色标记装置及其方法
AU2022366987A1 (en) 2021-10-14 2024-05-16 Arsenal Biosciences, Inc. Immune cells having co-expressed shrnas and logic gate systems
KR20250068649A (ko) 2022-09-13 2025-05-16 아스널 바이오사이언시스, 인크. 공동 발현된 tgfbr shrna를 갖는 면역 세포
EP4587570A2 (en) 2022-09-16 2025-07-23 Arsenal Biosciences, Inc. Immune cells with combination gene perturbations
KR20250158048A (ko) 2023-03-03 2025-11-05 아스널 바이오사이언시스, 인크. Psma 및 ca9을 표적으로 하는 시스템
WO2025199338A1 (en) 2024-03-20 2025-09-25 Arsenal Biosciences, Inc. Systems targeting slc34a2 and tmprss4 and methods of use thereof

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US589801A (en) * 1897-09-07 woltereck
EP0215907B1 (en) 1985-03-21 2001-05-23 Johnston, Stephen, Ph.D. Parasite-derived resistance
US6608241B1 (en) 1985-10-29 2003-08-19 Monsanto Technology Llc Protection of plants against viral infection
IL81737A (en) 1986-03-28 1992-11-15 Calgene Inc Regulation of gene expression in plant cells
US5017488A (en) * 1986-04-01 1991-05-21 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Highly efficient dual T7/T3 promoter vector PJKF16 and dual SP6/T3 promoter vector PJFK15
US4970168A (en) * 1989-01-27 1990-11-13 Monsanto Company Virus-resistant plants
WO1990014090A1 (en) 1989-05-19 1990-11-29 Hem Research, Inc. SHORT THERAPEUTIC dsRNA OF DEFINED STRUCTURE
HUT57265A (en) 1989-11-03 1991-11-28 Zaadunie Bv Process for producing plants of diminished infection-sensitivity
US5837848A (en) * 1990-03-16 1998-11-17 Zeneca Limited Root-specific promoter
EP0524254A4 (en) * 1990-03-30 1993-04-28 The President And Fellows Of Harvard College A binary genetic system to control expression of a transgene in a transgenic animal
US5831011A (en) * 1990-07-27 1998-11-03 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis genes encoding nematode-active toxins
US5459252A (en) * 1991-01-31 1995-10-17 North Carolina State University Root specific gene promoter
AU676471B2 (en) 1992-03-20 1997-03-13 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Fungus-responsive chimaeric gene
DE4234131C2 (de) * 1992-10-09 1995-08-24 Max Planck Gesellschaft Transgener pathogen-resistenter Organismus
CA2088379A1 (en) * 1993-01-29 1994-07-30 University Of British Columbia Biological systems incorporating stress-inducible genes and reporter constructs for environmental biomonitoring and toxicology
IL104830A (en) * 1993-02-23 2001-01-28 Yissum Res Dev Co A chimeric plasmid containing a non-structural gene for the protease of the potato virus and its various uses
DE4317845A1 (de) 1993-05-28 1994-12-01 Bayer Ag Desoxyribonukleinsäuren
US5482845A (en) * 1993-09-24 1996-01-09 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for construction of normalized cDNA libraries
AU2904395A (en) * 1994-06-15 1996-01-05 Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The Method to identify tumor suppressor genes
US5691140A (en) * 1995-05-18 1997-11-25 New England Biolabs, Inc. Bidirectional in vitro transcription vectors utilizing a single RNA polymerase for both directions
GB9510944D0 (en) * 1995-05-31 1995-07-26 Bogaert Thierry Assays and processes for the identification of compounds which control cell behaviour,the compounds identified and their use in the control of cell behaviour
DE69610310T2 (de) * 1995-06-02 2001-03-15 M&E Biotech A/S, Horsholm Verfahren zur identifikation von biologisch aktiven peptiden und nukleinsäuren
US5679551A (en) * 1995-10-31 1997-10-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Unique double-stranded RNAS associated with the Trichomonas vaginalis virus
US5898031A (en) * 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
DE19631919C2 (de) * 1996-08-07 1998-07-16 Deutsches Krebsforsch Anti-Sinn-RNA mit Sekundärstruktur
ATE279523T1 (de) * 1996-08-09 2004-10-15 Keygene Nv Resistenz gegen nematoden und/oder blattläuse
JP2001503972A (ja) * 1996-09-18 2001-03-27 ユング，クリスチャン 線虫抵抗性遺伝子
DE69736438T2 (de) 1996-10-03 2007-08-02 Kato, Hajime, Kawasaki Methode zur dampfreformierung von kohlenwasserstoffen
EA199900535A1 (ru) 1996-12-18 2000-02-28 Эксон Кемикэл Пейтентс Инк. Смеси полимеров, которым придана совместимость, приготовленные с использованием полифункционального агента
GB9703146D0 (en) 1997-02-14 1997-04-02 Innes John Centre Innov Ltd Methods and means for gene silencing in transgenic plants
US6506559B1 (en) * 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
AUPP249298A0 (en) * 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
NZ507093A (en) * 1998-04-08 2003-08-29 Commw Scient Ind Res Org Methods and means for reducing the phenotypic expression of a nucleic acid of interest in a plant
AR020078A1 (es) * 1998-05-26 2002-04-10 Syngenta Participations Ag Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta
GB9814536D0 (en) 1998-07-03 1998-09-02 Devgen Nv Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
GB9827152D0 (en) * 1998-07-03 1999-02-03 Devgen Nv Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
AUPR621501A0 (en) 2001-07-06 2001-08-02 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Delivery of ds rna
AU2006292362B2 (en) 2005-09-16 2013-02-14 Monsanto Technology Llc Methods for genetic control of insect infestations in plants and compositions thereof

Also Published As

Publication number Publication date
ES2327334T3 (es) 2009-10-28
JP2009112311A (ja) 2009-05-28
DE29924298U1 (de) 2002-09-12
GB2370275B (en) 2002-11-27
IL181727A0 (en) 2007-07-04
DK1484415T3 (da) 2009-10-12
DK1197567T3 (da) 2009-05-04
IL140467A0 (en) 2002-02-10
IL140467A (en) 2007-07-04
ES2320527T3 (es) 2009-05-25
US8114980B2 (en) 2012-02-14
IS5802A (is) 2001-01-02
NO20010019L (no) 2001-03-05
HU230602B1 (hu) 2017-02-28
CA2332619C (en) 2012-12-11
GB0206600D0 (en) 2002-05-01
EP1484415A3 (en) 2008-02-13
PL201425B1 (pl) 2009-04-30
ES2320527T5 (es) 2015-11-16
KR20060071438A (ko) 2006-06-26
EP1484415B1 (en) 2009-06-10
BR9911802A (pt) 2002-01-22
KR20010074639A (ko) 2001-08-04
CA2789083C (en) 2016-03-15
EP2045336A3 (en) 2009-06-10
CZ304897B6 (cs) 2015-01-07
IL181727A (en) 2015-08-31
EP1197567B2 (en) 2015-10-07
CN1657620A (zh) 2005-08-24
EP1484415A2 (en) 2004-12-08
GB2349885A (en) 2000-11-15
RU2240349C2 (ru) 2004-11-20
DK1197567T4 (en) 2015-12-07
GB9827152D0 (en) 1999-02-03
DE29924299U1 (de) 2002-09-12
JP2002519072A (ja) 2002-07-02
GB2370275A (en) 2002-06-26
GB0118514D0 (en) 2001-09-19
CZ303494B6 (cs) 2012-10-24
EP2045336A2 (en) 2009-04-08
AU4907999A (en) 2000-01-24
EP1093526A2 (en) 2001-04-25
CN1323354A (zh) 2001-11-21
JP2014058514A (ja) 2014-04-03
PT1197567E (pt) 2009-04-09
CA2789083A1 (en) 2000-01-13
MX234065B (es) 2006-02-01
KR20040066200A (ko) 2004-07-23
US20040133943A1 (en) 2004-07-08
CY1109324T1 (el) 2014-07-02
MXPA00012955A (es) 2002-04-10
PT1484415E (pt) 2009-07-27
EP1197567A3 (en) 2003-01-02
GB0020485D0 (en) 2000-10-11
GB2362885B (en) 2002-07-31
CA2332619A1 (en) 2000-01-13
NZ509182A (en) 2004-01-30
HUP0103571A2 (hu) 2002-01-28
NO327729B1 (no) 2009-09-14
NO20010019D0 (no) 2001-01-02
US20040187170A1 (en) 2004-09-23
WO2000001846A3 (en) 2000-06-15
GB2362885A (en) 2001-12-05
IS2816B (is) 2012-11-15
ATE433500T1 (de) 2009-06-15
ATE419383T1 (de) 2009-01-15
WO2000001846A2 (en) 2000-01-13
CZ200114A3 (en) 2001-06-13
JP5847776B2 (ja) 2016-01-27
CY1108920T1 (el) 2014-07-02
HK1029142A1 (en) 2001-03-23
DE69940984D1 (de) 2009-07-23
CN1198938C (zh) 2005-04-27
IN2006DE03568A (pl) 2007-08-31
EP1197567A2 (en) 2002-04-17
PL347978A1 (en) 2002-05-06
EP2374901A1 (en) 2011-10-12
KR100563295B1 (ko) 2006-03-27
AU769223B2 (en) 2004-01-22
HUP0103571A3 (en) 2006-01-30
US20030061626A1 (en) 2003-03-27
KR20070041607A (ko) 2007-04-18
CN1900319A (zh) 2007-01-24
GB2349885B (en) 2003-01-29
DE69940219D1 (de) 2009-02-12
DE1093526T1 (de) 2001-10-11
ZA200007653B (en) 2002-09-19
IN2001DE00006A (pl) 2007-02-09
JP4353639B2 (ja) 2009-10-28
EP1197567B1 (en) 2008-12-31
PL216779B1 (pl) 2014-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL213379B1 (pl) Sposób wytwarzania rosliny odpornej na zakazenie szkodnikiem roslinnym
Ryder et al. Transposable elements as tools for genomics and genetics in Drosophila
WO2001049844A1 (en) Compositions and methods for gene silencing
Maduro et al. MED GATA factors promote robust development of the C. elegans endoderm
Johnson et al. Heritable and inducible gene knockdown in C. elegans using Wormgate and the ORFeome
US7005423B1 (en) Characterization of gene function using double stranded RNA inhibition
AU2004200852B2 (en) Characterisation of gene function using double stranded RNA inhibition
Geurts Sleeping Beauty transposon system-based applications for mouse germline mutagenesis
Yang Sex determination and RNAi in Drosophila
Hongbao Brookdale University Hospital and Medical Center, Brooklyn, New York 11212, USA ma8080@ gmail. com