ES2328397T3 - Medida de la velocidad de union de una sustancia de union y un analito. - Google Patents
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Abstract
Un método para medir la velocidad de unión de una sustancia de unión y un analito, comprendiendo el método: disponer la sustancia de unión y el analito en un medio, y caracterizado porque comprende además: llevar a cabo la sonicación del medio suficientemente para romper la unión entre la sustancia de unión y el analito; y hacer que cese dicha sonicación del medio y determinar la velocidad de unión en un momento predeterminado al o después del cese de dicha sonicación.
Description
Medida de la velocidad de unión de una sustancia
de unión y un analito.
La presente invención se refiere a un método
para medir la velocidad de unión de una sustancia de unión y un
analito, por ejemplo en un ensayo tal como un inmunoensayo. La
velocidad de unión medida puede ser útil, por ejemplo, para deducir
la concentración, la cantidad o la presencia del analito.
Los métodos de inmunoensayo existentes que
implican la medida de la velocidad de unión tienen el problema de
que no puede conocerse el momento exacto en el que empieza realmente
la reacción debido a dificultades prácticas en la mezcladura. Esto
limita la determinación exacta de las velocidades de unión
iniciales. Así, típicamente, se requiere una velocidad de reacción
inicial constante. Por ejemplo, métodos que utilizan una velocidad
inicial constante se han descrito en las Patentes de EE. UU. Nº
4.205.954, 5.371.021 y 5.583.055. En otro tipo de método, se mide
la velocidad de unión máxima, por ejemplo según se describe en las
Patentes de EE. UU. Nº 4.157.871, 4.204.837, 4.268.171, 4.766.083 y
4.835.110.
Una desventaja de estos métodos es el tiempo
relativamente prolongado necesario para reunir suficiente
información procedente del reactor para poder determinar la
concentración de la muestra. Una desventaja adicional es la
necesidad de iniciar la medida real inmediatamente después de la
adición de la muestra.
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona un método para medir la velocidad de unión de una
sustancia de unión y un analito, llevando a cabo la sonicación de
la sustancia de unión y el analito en un medio a fin de romper la
unión entre la sustancia de unión y el analito, haciendo cesar la
sonicación y determinando la velocidad de unión al cese de dicha
sonicación o un momento predeterminado posterior.
El método puede usarse para deducir la
concentración, la cantidad o la presencia del analito a partir de la
velocidad de unión determinada, por ejemplo como un ensayo o
inmunoensayo. La sonicación, típicamente ultrasonicación en forma
de un impulso corto, rompe la unión y restablece la reacción de
unión hasta una condición inicial conocida. Por ejemplo, cuando el
complejo de unión se aglutina, la aglutinación puede reducirse
visiblemente o desaparecer. La reacción de unión comienza al cesar
la sonicación. El punto del tiempo en el que esto ocurre se conoce
exactamente y esto hace posible determinar la velocidad de unión
inicial de un modo exacto. Habitualmente, la velocidad de unión
determinada es la velocidad al cese real de la sonicación, pero en
algunos casos puede ser un momento predeterminado posterior.
Como resultado, el método es más rápido que los
métodos convencionales así como es más fiable y sensible. Puede
usar sólo un reaccionante. También puede usar el principio del
inmunoensayo homogéneo sin necesidad de separar ligandos unidos y
no unidos. El analito, por ejemplo una muestra de sangre o un
patrón, puede añadirse al medio antes de llevar a cabo el método,
debido a que la sonicación romperá la unión o aglutinación que se
produce antes de la medida real. Una ventaja adicional de la
invención es que la posible agregación no específica del
reaccionante durante el almacenamiento puede romperse eficazmente
mediante la misma etapa de sonicación usada para el ensayo.
De acuerdo con la invención, no hay necesidad de
que la velocidad de reacción sea lineal, debido a que el momento de
inicio de la reacción se conoce exactamente, de modo que no hay
necesidad de usar los métodos más engorrosos descritos en la
técnica anterior.
Ventajosamente, la velocidad de unión puede
determinarse realizando medidas en una pluralidad de momentos
después del cese de dicha sonicación y deduciendo la velocidad de
unión en dicho momento predeterminado mediante extrapolación a
partir de las medidas.
La extrapolación puede llevarse a cabo, por
ejemplo, ajustando una curva a las medidas y calculando la velocidad
de unión en dicho momento predeterminado a partir de la curva
ajustada. Alternativamente, puede llevarse a cabo una forma de
extrapolación más complicada. En un ejemplo, se calcula una
estimación inicial de la velocidad de unión en dicho momento
predeterminado a partir de una primera curva ajustada a los datos y
usada para determinar un algoritmo de ajuste de la curva. A
continuación, una segunda curva se ajusta a las medidas usando el
algoritmo de ajuste de la curva y la velocidad de unión en dicho
momento predeterminado se determina a partir de la curva
ajustada.
Sin embargo, la velocidad de unión puede
calcularse de otros modos. Por ejemplo, una alternativa es aplicar
una técnica en la que se mide una propiedad en dos puntos del tiempo
y se toma la diferencia como representativa de la velocidad de
unión. En este caso, aunque la diferencia no esté en las unidades
correctas, es representativa de la velocidad debido a que el
intervalo entre las medidas es fijo. Por ejemplo, si las medidas son
representativas de la cantidad de al menos uno de la sustancia de
unión, el analito o el complejo de la sustancia de unión unido, la
diferencia es proporcional a la velocidad, la velocidad real es
igual a la diferencia dividida por el intervalo entre las medidas.
El término "velocidad de unión" se usa en esta solicitud para
cubrir técnicas tales en las que se calcula un valor representativo
de la velocidad incluso si no está en las unidades apropiadas. Sin
embargo, esta técnica alternativa no se prefiere ya que da como
resultado un valor representativo de la velocidad media a lo largo
del intervalo, en vez de la velocidad al cese real de la
sonicación.
\newpage
Las medidas pueden ser medidas representativas
de la cantidad de al menos uno de la sustancia de unión, el analito
o el complejo unido de la sustancia de unión y el analito, siendo
típicamente medidas ópticas, usando, por ejemplo, pero no
exclusivamente turbidometría, nefelometría o fluorometría. En
general, la velocidad de unión puede determinarse fotométricamente,
como, por ejemplo, en métodos de inmunoensayo fotométricos para la
velocidad de unión conocidos, o de cualquier otro modo.
Una técnica opcional es llevar a cabo, antes de
añadir una muestra que contiene el analito a la sustancia de unión
contenida en un medio, una sonicación de la misma naturaleza que la
realizada subsiguientemente para romper la unión y para tomar una
medida preliminar. A continuación, la medida preliminar puede
sustraerse de cada una de las medidas realizadas después del cese
de dicha sonicación, o puede extraerse del valor extrapolado de la
medida en el momento predeterminado. Así, se obtiene el valor neto
de la propiedad medida. Esto abre la posibilidad de medir una
propiedad constante de la muestra sustrayendo la medida preliminar
tomada de la sustancia de unión en ausencia de la muestra. Esto
permite la medida de una propiedad, por ejemplo la absorbancia de
la muestra u otra propiedad óptica, sin la perturbación de la
reacción en marcha que también afecta a la propiedad. El
conocimiento del valor de la propiedad puede usarse, por ejemplo,
para la medida del contenido de hemoglobina y el hematocrito de una
muestra de sangre.
Un modo alternativo de alcanzar esto es
extrapolar la medida de nuevo al momento del cese de la sonicación.
En muchas situaciones prácticas, esta técnica alternativa es el
único modo eficaz para medir la propiedad sin perturbar la reacción
en marcha. En esos casos, esto sólo puede hacerse midiendo en primer
lugar la propiedad de la muestra en tampón y a continuación
añadiendo un segundo reaccionante para iniciar la reacción. La
evitación de tal procedimiento complicado es otra ventaja de la
sonicación de la presente invención.
El método es aplicable generalmente a cualquier
tipo de unión que sea capaz de romperse mediante sonicación. Puede
romperse la unión específica y posiblemente no específica entre las
partículas. Típicamente, la unión es unión no covalente reversible.
Típicamente, uno o ambos de la sustancia de unión y el analito es
una proteína. El método es aplicable a la unión entre dos o más
entidades.
El método tiene aplicación particular a la unión
inmunológica. En este caso, la sustancia de unión puede ser un
anticuerpo, un antígeno (proteínico o no proteínico) o un hapteno.
Según se usa en la presente memoria, el término "anticuerpo"
incluye fragmentos que se unen a un analito. Tales fragmentos
incluyen fragmentos Fv, F(ab') y F(ab')_{2}. Por
otra parte, el anticuerpo o el fragmento puede ser un anticuerpo
quimérico, un anticuerpo para CDR o un anticuerpo humanizado.
Una alternativa es aplicar el método a la unión
entre un receptor y un ligando.
La sustancia de unión y el analito pueden estar
dispuestos en el medio en cualquier forma adecuada. Una posibilidad
es simplemente suspender tanto la sustancia de unión como el analito
en el medio, por ejemplo con la sustancia de unión revestida sobre
partículas portadoras insolubles. Sin embargo, pueden aplicarse
igualmente técnicas más complicadas.
El presente método puede aplicarse para analizar
analitos procedentes de una amplia gama de muestras, incluyendo
muestras tanto clínicas como no clínicas tales como muestras
higiénicas. Pueden usarse muestras procedentes de diferentes
fluidos corporales tales como sangre entera, suero, plasma, fluido
espinal, fluido ascítico, orina, saliva, semen y muestras para
verificar la higiene, tales como alimento, leche, barridos de
control de esterilidad procedentes de superficies o agua.
Habitualmente, el analito se determina a partir
de la muestra sin procesamiento adicional, sin embargo, si es
necesario, la muestra puede pretratarse antes del ensayo, por
ejemplo centrifugarse, hemolizarse o enriquecerse.
La sonicación es la aplicación de ondas sonoras
(sonido audible o ultrasonido) al medio. Se conocen muchos tipos de
aparatos para realizar la sonicación y puede usarse cualquier tipo
de aparato de sonicación debido a que el método no depende de la
naturaleza del propio aparato. Un ejemplo no limitativo es usar el
aparato de sonicación descrito en la Solicitud de Patente
Internacional Nº PCT/EP06/004243 (publicada como
WO-2006/119932) presentada simultáneamente con esta
solicitud.
La frecuencia de la sonicación puede
seleccionarse de un amplio intervalo de frecuencias. La energía
disociativa se incrementa a medida que se incrementa la frecuencia,
permitiendo así que se use una amplia elección de fuerzas
disruptivas para cualquier aplicación práctica. La elección de la
frecuencia y la potencia puede realizarse para cualquier unión dada
mediante una prueba simple de diferentes frecuencias y potencias
para seleccionar una frecuencia y una potencia que proporcionen la
ruptura necesaria de la unión. Habitualmente, la frecuencia es al
menos 1 kHz, pero más típicamente la frecuencia es al menos 20 kHz,
en cuyo caso la sonicación puede denominarse ultrasonicación.
Habitualmente, la frecuencia es como mucho 1000 kHz. La sonicación
se aplica durante un período suficientemente prolongado para romper
la unión, siendo este típicamente del orden de segundos.
Existen algunas técnicas conocidas que usan
ultrasonido en inmunoensayos, pero de una manera diferente de la
presente invención. Algunos de los usos conocidos del ultrasonido
son como sigue.
Se sabe que el ultrasonido puede usarse para
mejorar inmunoensayos de aglutinación de partículas revestidas
usando un campo ultrasónico de onda estacionaria. Se publicó una
gran cantidad de informes desde mediados de los 80 hasta finales de
los 90, en los que se usaba ultrasonido para mejorar tanto la
velocidad como la sensibilidad de un ensayo de aglutinación. Tales
documentos describen solo la aglutinación mejorada con ultrasonido,
mientras que ninguna de las publicaciones de este grupo presenta la
utilización de ultrasonido para romper enlaces
ligando-antiligando específicos. Ejemplos de
documentos que describen tal mejora ultrasónica de la aglutinación
son GB-A-2.233.089, las Patentes de
EE. UU. Nº 4.575.485, 5.227.312, 5.665.605, 5.853.994, 5.912.182 y
Ellis et al. "Diagnostic particle agglutination using
ultrasound: a new technology to rejuvenate old microbiological
methods" J. Med. Microbiol. 49 853 (2000). En la presente
invención, la sonicación rompe la unión, que es el efecto opuesto
de mejorar o conducir la reacción de unión. Sin embargo, tal uso del
ultrasonido para mejorar la reacción puede usarse en el presente
método llevando a cabo la ultrasonicación mejorada (típicamente, un
ultrasonido de energía suficientemente baja de una frecuencia
adecuada) después del cese de la sonicación que rompe la unión, si
tal mejora fuera necesaria.
Las siguientes publicaciones describen el uso de
ultrasonido para romper enlaces ligando- antiligando. En la Patente
de EE. UU. Nº 4.615.984 y Haga et al. "Effect of Ultrasonic
Irradiation on the Dissociation of Antigen-Antibody
Complexes. Application to Homogenous Enzyme Immunoassay" Chem.
Pharm. Bull. 35 3822 (1987), el ultrasonido se usa para disociar el
complejo ligando-aglutinante permitiendo la
reutilización del aglutinante. La reutilización del aglutinante
tiene lugar en un ensayo separado. En la Patente de EE. UU. Nº
6.086.821 se usa fuerza ultrasónica para disociar complejos
antígeno-anticuerpo para medir afinidades de unión
entre el antígeno y el anticuerpo, sin embargo, no se describe ni
se reivindica una medida de la velocidad de reacción ni la
invención se usa para una medida de la concentración de un analito.
En la Patente de EE. UU. Nº 6.368.553 se describe un dispositivo de
ensayo que usa fuerza ultrasónica para disociar complejos
antígeno-anticuerpo para detectar analitos en
presencia de un reaccionante marcado, sin embargo, no se describe o
reivindica una medida de la velocidad de reacción.
El método hace posible una medida cuantitativa
muy rápida, debido a que la velocidad de reacción inicial puede
calcularse después de solo unos pocos segundos (típicamente
0,5-30 s) de la medida de la curva de velocidad.
Preferiblemente, la medida lleva 1-15 segundos, o
aún más preferiblemente 1-10 segundos. Por supuesto,
en principio, la reacción puede seguirse tanto tiempo como sea
necesario para reunir datos suficientes para la exactitud necesaria,
incluso decenas de minutos.
Por otra parte, la medida puede repetirse si es
necesario para una exactitud mejorada repitiendo la sonicación y
midiendo la velocidad inicial de nuevo.
Un ejemplo no limitativo del presente método se
describirá ahora con referencia a los dibujos, en los que:
La Fig. 1 es una gráfica de la curva de
calibración para el ejemplo.
El método se realizó con respecto a anticuerpos
para CRP como la sustancia de unión y CRP como el analito.
Partículas de látex revestidas con anticuerpos
para CRP se obtuvieron del estuche QuikRead CRP (Nº cat. 67961)
fabricado por Orion Diagnostica Oy, Finlandia. El revestimiento de
las partículas de látex se llevó a cabo de la manera descrita en
EP-A-0.946.871. La concentración de
partículas de látex se ajustó hasta 2 g/l con 0,15 mol/l de tampón
de tris(hidroximetil)aminometano-HCl,
pH 8,4, que contenía 0,171 mol/l de NaCl y albúmina de suero bovino
al 0,1%.
Se preparó una serie de soluciones estándar de
CRP que tenían concentraciones de 0, 5, 9, 19, 59, 78, 125, 151,
221, 400 y 600 mg/l. Se efectuó el siguiente procedimiento para cada
una de las soluciones estándar.
1 ml de suspensión de látex en tampón se pipeteó
en una cubeta, y se añadieron 12 \mul de patrón.
La ultrasonicación se realizó usando un método y
un aparato descritos en la Solicitud de Patente Internacional Nº
PCT/EP06/004243 (publicada como WO-2006/119932)
presentada simultáneamente con esta solicitud. Esto permitía una
construcción simple y un procedimiento rápido. Por otra parte, la
cubeta puede cerrarse completamente durante la ultrasonicación, lo
que evita la extensión de material posiblemente infeccioso o de otro
modo perjudicial procedente de la cubeta durante la
ultrasonicación.
Posteriormente, la cubeta se situó entre el
cabezal de ultrasonicación con conformación de tenedor situado
dentro de un fotómetro. El cabezal de ultrasonicación contactaba
directamente con la cubeta desde ambas caras, pero no obstruía la
trayectoria de luz del fotómetro. El fotómetro se fijó para
registrar la absorbancia a 653 nm tres veces por segundo y se
inició la medida.
Posteriormente, la cubeta se sometió a
ultrasonidos durante 6 segundos con una frecuencia de sonicación de
37 kHz y la reacción de aglutinación se dejó avanzar después de la
ultrasonicación durante un minuto. Cuando la ultrasonicación se
detiene, la reacción de aglutinación se inicia inmediatamente. El
momento al final de la ultrasonicación se definió como tiempo
cero.
Posteriormente, las lecturas de absorbancia de
cada uno de los experimentos se representaron con la absorbancia en
el eje y y el tiempo en el eje x. Un polinomio de segundo grado de
la forma y = ax^{2}+bx+c se ajustó a través de los puntos
experimentales partiendo de 2/3 segundos después del final de la
sonicación y terminando tres segundos después del final de la
sonicación. El valor de la primera derivada (y = 2ax+b) del
polinomio de segundo grado en el tiempo cero es la velocidad de
reacción inicial de la reacción de aglutinación. Las velocidades de
reacción iniciales obtenidas de cada uno de los patrones expresadas
como unidades de absorbancia por segundo se representaron como una
curva de calibración que se muestra en la Fig. 1. Esta curva de
calibración era lineal desde 5 mg/l hasta 600 mg/l.
En general, cualquier función matemática podía
ajustarse a la curva de velocidad. La velocidad de reacción inicial
en el momento en el que se detiene la ultrasonicación o un momento
predeterminado posteriormente puede calcularse calculando el valor
de la primera derivada de la función matemática en el momento
apropiado.
Claims (23)
1. Un método para medir la velocidad de unión de
una sustancia de unión y un analito, comprendiendo el método:
- disponer la sustancia de unión y el analito en un medio, y
caracterizado porque comprende
además:
- llevar a cabo la sonicación del medio suficientemente para romper la unión entre la sustancia de unión y el analito; y
- hacer que cese dicha sonicación del medio y determinar la velocidad de unión en un momento predeterminado al o después del cese de dicha sonicación.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que dicha etapa de determininar la velocidad de unión
comprende:
- realizar medidas en una pluralidad de momentos después del cese de dicha sonicación; y
- deducir la velocidad de unión en dicho momento predeterminado mediante extrapolación a partir de las medidas.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2,
en el que dicha etapa de deducir la velocidad de unión en dicho
momento predeterminado mediante extrapolación comprende:
- ajustar una curva a las medidas; y
- calcular la velocidad de unión en dicho momento predeterminado a partir de la curva ajustada.
4. Un método de acuerdo con la reivindicación 2,
en el que dicha etapa de deducir la velocidad de unión en dicho
momento predeterminado mediante extrapolación comprende:
- ajustar una primera curva a las medidas;
- calcular una estimación inicial de la velocidad de unión en dicho momento predeterminado a partir de la primera curva ajustada;
- determinar un algoritmo de ajuste de la curva a partir de dicha estimación inicial de la velocidad de unión en dicho momento predeterminado;
- ajustar una segunda curva a las medidas usando el algoritmo de ajuste de la curva determinado; y
- calcular la velocidad de unión en dicho momento predeterminado a partir de la segunda curva ajustada.
5. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 2 a 4, en el que dicha pluralidad de momentos
están a menos de 30 segundos desde el cese de dicha sonicación.
6. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que dicha etapa de determinar la velocidad de unión
comprende:
- realizar una primera medida en o después del cese de dicha sonicación y una segunda medida a un intervalo predeterminado después de la primera medida; y
- tomar la diferencia entre las medidas primera y segunda como la velocidad de unión determinada.
7. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 2 a 6, en el que dichas medidas son medidas de
una cantidad representativa de la cantidad de al menos uno de la
sustancia de unión, el analito o el complejo unido de la sustancia
de unión y el analito.
8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7,
en el que dichas medidas se llevan a cabo ópticamente.
9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8,
en el que dichas medidas son medidas de absorción de luz por el
medio, de luz dispersada por el medio o de fluorescencia procedente
del medio.
10. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 7 a 9, que comprende además determinar el
valor de dicha cantidad al cese de dicha sonicación mediante
extrapolación a partir de las medidas.
11. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 7 a 9, en el que:
- dicha etapa de disponer la sustancia de unión y el analito en un medio comprende añadir una muestra que contiene el analito a la sustancia de unión contenida en un medio;
- dicho método comprende además, antes de añadir la muestra que contiene el analito a la sustancia de unión, llevar a cabo dicha sonicación y realizar una medida preliminar.
12. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha etapa de determinar la
velocidad de unión se lleva a cabo fotométricamente.
13. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que la unión es unión
inmunológica.
14. Un método de acuerdo con la reivindicación
13, en el que la sustancia de unión en un anticuerpo, un antígeno o
un hapteno.
15. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 12, en el que uno de la sustancia de unión
y el analito es un receptor y el otro de la sustancia de unión y el
analito es un ligando.
16. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que la unión es no
covalente.
17. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que la sustancia de unión
está revestida sobre partículas portadoras insolubles.
18. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que dicha sonicación se
lleva a cabo a una frecuencia de al menos 1 kHz.
19. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 17, en el que dicha sonicación se lleva a
cabo a una frecuencia de al menos 20 kHz.
20. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que dicha sonicación se
lleva a cabo a una frecuencia de como mucho 1000 kHz.
21. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que dicho momento
predeterminado es al cese de dicha sonicación.
22. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, que comprende además determinar
la cantidad, la concentración o la presencia de un analito a partir
de la velocidad de unión determinada.
23. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, que comprende además
- repetir dichas etapas de llevar a cabo la sonicación del medio y determinar la velocidad de unión en un momento predeterminado; y
- promediar las velocidades de unión determinadas repetidamente.
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