ES2328944T3 - Procedimiento de deteccion y cuantificacion in vitro de adn de vih mediante pcr cuantitativa. - Google Patents
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Abstract
Método in vitro de detección cuantitativa de ADN del virus VIH que comprende una doble amplificación del ADN viral presente en la muestra utilizando una doble PCR cuantitativa anidada, de forma que una primera pareja de cebadores de PCR, representados por SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, la cual se une específicamente al gen gag en posiciones 1260 a 1482 se utiliza en la primeraamplificación, y una segunda pareja de cebadores de PCR con una temperatura de fusión (Tm) diferente a la de la primera pareja de cebadores, se une al gen gag dentro del fragmento amplificado por la primera pareja de cebadores, caracterizado porque la amplificación y la detección del ADN viral se lleva a cabo en un único capilar por muestra con una mezcla de reacción que contiene los dos pares de cebadores y las sondas.
Description
Procedimiento de detección y cuantificación
in vitro de ADN de VIH mediante PCR cuantitativa.
La invención se adscribe al ámbito de los
procedimientos y dispositivos de diagnosis basados en PCR. En
concreto se trata de detectar y cuantificar el ADN de VIH en
pacientes.
Los principales parámetros utilizados en el
seguimiento de la infección por el VIH son la "carga viral" en
plasma (cuantificación de ARN de VIH) y el porcentaje o número de
linfocitos CD4[1]. Es de gran importancia conocer el número
de copias de ADN de VIH presentes en las células, especialmente en
pacientes en Terapia Anti-retroviral de Gran
Actividad (TARGA) donde la carga viral ha disminuido, incluso a
nivel indetectable y se ha observado un incremento o estabilización
del porcentaje o número de linfocitos CD4, así como en individuos
en interrupción de tratamiento. [3]
Utilidades de la cuantificación del ADN
viral:
- Diagnóstico de la infección por el VIH en
niños procedentes de madres seropositivas y en individuos adultos
en periodo ventana (en interrupción del tratamiento). La ventaja es
que al ser cuantitativo se sabrá el número de copias de ADN de VIH
presentes en las células en el momento más cercano a la infección
pudiendo convertirse en un marcador pronóstico de evolución de la
infección.
- En pacientes tratados con terapia
antirretroviral de alta eficacia (TARGA), donde la carga viral es
indetectable (< 400 copias/ml; ultrasensible < 50 copias/ml),
actualmente sólo existe como marcador de sistema inmune los
linfocitos CD4, sería de gran importancia tener un marcador
virológico y en este sentido se podría utilizar el número de copias
de ADN de VIH presentes en las células como marcador pronóstico de
evolución, que prediga cuándo va a surgir un rebote de carga viral
y evitar la aparición de cepas resistentes.
- En pacientes en interrupciones de tratamiento.
Antes de las interrupciones del tratamiento antirretroviral uno de
los requisitos que debe reunir el paciente es tener carga viral
indetectable, sería de gran valor saber el número de copias de ADN
de VIH presentes en las células antes de la interrupción y saber qué
tiempo pueden estar sin tratamiento para que no haya un rebote de
carga viral y surjan resistencias a los antirretrovirales.
- En pacientes en los que se va a aplicar un
tratamiento inmunológico o vacuna terapéutica, donde sería de gran
importancia conocer el número de copias de ADN de VIH presentes en
las células para ver hasta qué punto el número de células
infectadas es importante para conseguir un sistema inmunológico
funcional a largo plazo y que pueda controlar la replicación del
VIH por si mismo.
- Detectar subpoblaciones celulares infectadas
que puedan actuar como reservorio del VIH y que potencialmente no
pueden ser infectadas por él.
- Aplicación a la investigación básica en
distintos estudios in vitro e in vivo.
- Como un parámetro para detección y seguimiento
del VIH inactivo.
- En general será una técnica muy útil para su
aplicación en la clínica diaria habitual y en los ensayos clínicos
de pacientes VIH+.
\vskip1.000000\baselineskip
La aplicación de nuevas terapias
antiretrovirales a la infección por VIH ha promovido drásticos
cambios en la evolución natural de esta infección, por esta razón
es muy interesante conocer la relación entre reconstitución del
Sistema Inmune y permanencia del VIH en el paciente, incluso se
podría llegar a conocer en qué momento el sistema inmune podría
controlar la infección y poder suprimir un tratamiento
antirretroviral. Las actuales técnicas de cuantificación de carga
viral y genotipado o fenotipado no son suficientes para poder
predecir la evolución de la infección cuando la carga viral es
indetectable independientemente del porcentaje o número de
linfocitos T CD4.
La cuantificación del ADN viral que propone la
presente invención constituye una técnica novedosa que podría ser
útil como marcador diagnóstico, pronóstico de evolución de la
infección y de seguimiento de la misma. Además permitiría detectar
las subpoblaciones celulares que actúan de reservorio para el
VIH.
Presentamos un método innovador para cuantificar
el ADN de VIH, (Carga de ADN viral) en células infectadas, de un
modo sencillo, reproducible y rápido por PCR cuantitativa a tiempo
real. El método presentado detecta y cuantifica todas las formas de
ADN de VIH presentes en la célula, tanto integrado como no
integrado, aunque haya muy poco número de copias, aplicando en este
caso una forma de realización de la invención que convierte al
método en ultrasensible. En este momento no hay un método capaz de
detectar ADN VIH proviral (integrado en el genoma) de modo
específico, reproducible, fácil y rápido.
El objetivo último de cualquier organismo vivo
es su perpetuación en el tiempo. La única forma que tiene de
conseguirlo el VIH, al igual que otros retrovirus, es insertar su
genoma en el ADN celular.
En las primeras fases del ciclo de infección, al
finalizar el proceso de descapsidación, se inicia la reacción de
retro-transcripción dando lugar al Complejo de
Pre-Integración (PIC), con el genoma viral ahora en
forma de ADN, que se dirige hacia el núcleo. Allí, dicho PIC, puede
ser objeto de diferentes procesos: recircularización del ADN viral
con uno o dos extremos LTR (Long Terminal Repeat), secuencias
grandes repetidas en los extremos), o integración en el cromosoma
celular [2]. Sólo en este último caso se establece el provirus
funcional, la única forma infectiva. De este modo el VIH no será
detectado por el sistema inmune y podrá permanecer en la célula, se
replicará con el resto del ADN celular generando nuevas células
portadoras del VIH. En condiciones óptimas este ADN del VIH será
transcrito y traducido por la maquinaria celular generando nuevas
partículas VIH que infectarán nuevas células [2].
Actualmente es posible cuantificar el número de
partículas virales circulantes en plasma por la técnica de "Carga
Viral" (detección del ARN de VIH) que, junto con el marcador
inmunológico de cuantificación de linfocitos CD4, son los dos
parámetros utilizados habitualmente en el seguimiento de la
infección por el VIH en pacientes por parte del personal médico,
para introducir un tratamiento antirretroviral, o cambiar el
mismo.
El número de partículas virales que pueden
infectar una misma célula es variable, así como el número de veces
que se retrotranscribe un mismo RNA, de modo que la cantidad de ADN
viral contenido en una célula es variable, pudiendo haber un gran
cantidad de copias o muy bajo número de las mismas.
El ADN proviral representa una amenaza oculta
para la vida de la célula, y por tanto para la vida de la persona
infectada, porque se puede activar y aumentar la carga viral sin que
ningún parámetro de los utilizados lo haya previsto, produciendo un
fallo de la terapia antirretroviral y surgiendo cepas resistentes.
Por esta razón, en pacientes que inician por primera vez un
tratamiento antirretroviral, o están en TARGA, en otro tratamiento
terapéutico, o inician una interrupción del mismo puede ser
importante conocer el comportamiento y variaciones del ADN
proviral, "Carga Proviral".
En los últimos años se han desarrollado varios
ensayos para la detección y cuantificación de ADN proviral
utilizando la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR), pero estos métodos no han sido capaces de detectarlo en
todos los casos [4] [5] [6] ya que sólo operan con indicios de la
posición en la que se integra el ADN viral en el genoma celular. En
la actualidad es bien conocida la secuencia del genoma del VIH y por
tanto se han podido diseñar parejas de cebadores u oligonucleótidos
que anillan en algún gen del VIH y así poder detectar su presencia
por PCR y cuantificar el ADN total.
En el estado de la técnica se describen métodos
para la detección del ADN de VIH, por PCR, diseñando cebadores que
anillan en el gen viral pol y en el gen gag ya que son
los genes que tienen una secuencia menos variable. En concreto, el
gen gag tiene 1300 pb, de donde se pueden obtener cientos o
miles de parejas de cebadores diferentes, cada una con
características también distintas, sobre todo en base a su
"temperatura de fusión" (Tm). Unas técnicas utilizan una PCR
sencilla con cebadores de pol o gag, o bien una "PCR
anidada", es decir, dos PCRs consecutivas con igual o distinta
pareja de cebadores para cada una, utilizando como ADN molde para
la segunda el producto amplificado en la primera. La detección del
producto en estos dos tipos de PCR se hace por visualización del
producto amplificado en gel de agarosa. La información obtenida es
sólo, por consiguiente, cualitativa, no cuantitativa, a diferencia
del método de nuestra invención.
Otros métodos proponen cuantificar el producto
de PCR por un ELISA o una hibridación sobre el producto amplificado
después de realizada la electroforesis en gel de agarosa.
Además, el documento Yourno et al., J
Clinical Microbiol. 30, 2887-2892 (1992) describe un
método para la detección del VIH en muestras de sangre. El método
está basado en PCR anidada utilizando cebadores gag y una sonda
interna.
El método de la invención utiliza la técnica de
PCR cuantitativa a tiempo real de Roche
"LightCycler-qPCR" (LC-qPCR),
aunque podría utilizarse con cualquier sistema de PCR cuantitativa
(Applied Bio-System), mediante la correspondiente
adaptación del programa de amplificación, curvas patrón y otros
parámetros conocidos por cualquier técnico que opere este tipo de
métodos de PCR cuantitativa. Para el método de la invención se han
diseñado cebadores para el gen gag, y una pareja de sondas
tipo F.R.E.T. (Fluorescence Resonance Transfer) para la detección
del producto de ADN amplificado. Esto permite una mayor precisión en
la detección del producto específico, no detectando posibles
productos secundarios no deseados, ya que es necesario que unan
dichas sondas en sus posiciones exactas del producto para que éste
sea cuantificado, a diferencia de la sonda Taqman®, que al actuar
en solicitarlo, puede cuantificar productos no específicos al unir
en productos con secuencia parecida a su diana. En la actualidad no
hay descrito ningún método de cuantificación de ADN pro viral de
VIH utilizando el sistema LightCycler-qPCR de PCR
cuantitativa.
Un objeto de la presente invención es
desarrollar parejas de oligonucleótidos que se unan específicamente
al gen gag del virus VIH y permitan la amplificación del ADN
viral por PCR.
Un segundo objeto de la invención es desarrollar
una pareja de sondas que permite detectar de forma eficaz por
fluorescencia, el producto de ADN viral de VIH amplificado por PCR,
eliminando el fondo inespecífico.
Un tercer objeto de la invención es un método de
detección in vitro de ADN viral de VIH y que permite la
detección de ADN proviral de VIH.
Otro objeto de la invención son los dispositivos
de ensayo, que comprendan los oligonucleótidos de la invención,
utilizando opcionalmente también las sondas de la invención.
Una realización preferida de la invención
consiste en aplicar el método de detección también a muestras con
carga viral baja (<100 copias).
Otra realización preferida de la invención
consiste en modificar el método de detección y cuantificación de
ADN de VIH desarrollando una segunda pareja de cebadores que permita
acortar los tiempos de ensayo aumentando al mismo tiempo la señal
de fluorescencia específica del ADN viral presente en la muestra
ensayada.
Un objeto adicional de la invención consiste en
el uso de los oligonucleótidos y las sondas en dispositivos y/o
métodos de detección de ADN viral de VIH.
La invención consiste en un método innovador
para la cuantificación de ADN de VIH en células. Este método se
caracteriza por su sensibilidad, reproducibilidad y especificidad
para la detección/cuantificación del ADN del VIH en muestras con
número de copias iniciales medio/alto y también una forma preferida
de realización de la invención consiste en un método ultrasensible
para la detección de muestras con copias iniciales bajas.
Un punto importante y a destacar en este método
es la extracción del ADN, que debe obtenerse puro y limpio, y su
cuantificación por espectrofotometría UV para poder conocer la
cantidad de molde que se pone en la reacción de PCR, y así poder
normalizar los resultados por \mug de ADN o por 10^{6}
células.
A priori no se puede estimar si la
cantidad de ADN de VIH presente en cada muestra es detectable por el
método convencional de la invención o si es necesario recurrir al
método ultrasensible. Por este motivo, se realiza primero la
LC-qPCR-Gag, y si no se obtiene
amplificación se aplica el método ultrasensible para muestras con
bajo número de copias de ADN VIH iniciales. Sólo en el caso que el
número de linfocitos CD4 sea inferior a 400 células/ml, se aplica
directamente el método ultrasensible para muestras con bajo número
de copias de ADN del VIH iniciales.
Sólo las células T presentes en las células
mononucleares de sangre periférica del paciente son potenciales
portadoras del ADN viral y de acuerdo con la información obtenida
por este método el número de copias de ADN viral por linfocito T
varía en función del número de linfocitos CD4, por este motivo, la
cuantificación del ADN de VIH debe ser analizada en comparación con
el número de linfocitos CD4 y la carga viral para así poder evaluar
mejor la evolución de la infección.
Para aplicar el método de la invención se
utiliza el aparato de PCR cuantitativa denominado LightCycler
(Roche) formado por un termociclador que enfría y calienta las
muestras por aire. Este aparato tiene acoplado un fluorímetro que
detecta la fluorescencia emitida, por ejemplo atribuible a las
sondas tipo FRET que se unen al producto formado en cada ciclo de
la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Para que este aparato
dé un número de copias o cuentas en las muestras debe extrapolar la
fluorescencia obtenida en éstas a una recta o curva patrón que se
obtiene poniendo un número de copias de ADN conocido en cada punto
de dicha recta. El aparato, acoplado a un ordenador, asocia la
fluorescencia obtenida en cada punto de la curva con el número de
copias de ADN respectivo y lo representa en una gráfica de
fluorescencia frente a número de copias, gráfica que se ajusta a
una recta que nos permite calcular, en base a la fluorescencia
medida en la muestra problema, el número de copias de ADN viral
presente en la misma.
Para detectar el ADN de VIH por PCR se necesita
una pareja de cebadores, oligonucleótidos o iniciadores que se unan
en algún gen viral y utilizar un programa adecuado [8]. El VIH es un
retrovirus con alta capacidad de mutación, principalmente en el gen
env y en presencia de tratamiento antirretroviral, también en
el gen pol. Por este motivo los iniciadores deben unirse en
genes más conservados, con menos variabilidad, como el gen gag,
y así poder detectar todas las variantes posibles del VIH, en
todas las formas presentes en la célula, integrado y no
integrado.
Para este método innovador se han diseñado dos
cebadores, F-Gag y R-Gag (SEQ ID NO:
1 y SEQ ID NO: 2), que amplifican un fragmento de 222 pb del gen
gag (en las posiciones 1260 a 1482) ya que, como se ha
mencionado anteriormente, es un gen con secuencia muy conservada. A
lo largo de la presente memoria descriptiva los términos cebador,
iniciador u oligonucleótido se emplean indistintamente.
Para determinar las mejores condiciones del
programa que se debía aplicar para la realización de la PCR se
repitieron varios experimentos, modificando la temperatura de unión
de los cebadores, concentración de los mismos, la concentración de
MgCl_{2} y el número de ciclos. Las condiciones seleccionadas
fueron: un programa que tiene una desnaturalización inicial de 10
minutos a 95ºC, seguida de 35 ciclos de amplificación con 1 minuto
a 95ºC, 30 segundos a 65ºC y 1 minuto a 72ºC, con una elongación
final de 4 minutos a 72ºC. Cada 25 \mul de mezcla de reacción
contiene de 0.5 a 1 \mul g de ADN genómico, 0.8 \mul M de cada
cebador, 0.10 mM dCTP, 0.10 mM dGTP, 0.10 mM dATP, 0.10 mM dTTP, 1
U de enzima ADN polimerasa Amplitaq Roche, 50 mM KCL, 3.5 mM
MgCl_{2} y 10 mM de Tris-HCl (pH 8.3). El producto
amplificado se comprobó en un gel de agarosa al 2% (Fig. 1).
Una forma preferida de realización de la
invención consiste en modificar el método haciendo una PCR anidada
utilizando además de la primera pareja de cebadores (SEQ ID NO: 1 y
2) en una primera amplificación, una segunda pareja de cebadores
F2-Gag y R2-Gag (SEQ ID NO: 7 y 8),
que amplifica, a su vez, en una segunda etapa, el producto
amplificado resultante de la primera etapa de amplificación
(Producto Gagl). Esta segunda pareja de cebadores se une en el
interior del fragmento amplificado por la primera pareja (entre las
posiciones 1286 y 1435), dando un producto Gag2 de 149 pb, sobre el
que se unen las sondas P1-Gag y
P2-Gag (entre las posiciones 1320 y 1381).
El ADN genómico fue extraído de 10^{6} células
con el kit "Wizard SV Genomic DNA purification system" de
PROMEGA (cat. #A2360), y resuspendido en 100 \mul de agua libre de
nucleasas PROMEGA (cat. #P119C). Finalmente, se cuantificó este ADN
con el espectrofotómetro "Nano-Drop
3.0.0/3".
El aparato para la realización de la PCR
cuantitativa es un LightCycler, un termociclador por aire que
incorpora un fluorímetro para la detección y cuantificación de los
productos amplificados sin necesitar un análisis
post-PCR en gel de agarosa de los productos
obtenidos como sucede en la realización de una PCR convencional La
amplificación se realiza en capilares de vidrio utilizando una
enzima ADN polimerasa modificada con gran eficiencia, alta
velocidad de elongación y capacidad para soportar rápidos cambios de
temperatura (20ºC/seg). La ventaja de la utilización de capilares
de vidrio es que permite un rápido calentamiento y enfriamiento de
la mezcla de reacción, y por lo tanto, se realizan ciclos y
programas muy cortos [7] [9]. Los productos amplificados se
detectan por Sybr-Green, compuesto marcador que se
une a ADN de doble cadena por intercalación y emite fluorescencia
al ser excitado con luz de longitud de onda adecuada. Otro modo de
detección/cuantificación es la utilización de sondas ADN (SEQ ID
NO: 5 y SEQ ID NO: 6) marcadas con fluorocromos (tipo F.R.E.T.), que
se unen específicamente al producto amplificado. La cuantificación
de los productos se realiza por extrapolación de la fluorescencia
obtenida en cada una de las muestras respecto a una curva patrón
realizada con número de copias conocido.
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Esta forma de realización de la invención se
utiliza para muestras cuya carga de ADN viral se presupone alta. Al
inicio del desarrollo del método de cuantificación de ADN del VIH se
adaptó la PCR-Gag convencional a las condiciones de
la PCR cuantitativa LightCycler (LC-qPCR). El
programa para el nuevo termociclador comienza con 10 minutos de
desnaturalización a 95ºC, seguidos de 40 ciclos con 15 segundos de
desnaturalización a 95ºC, 10 segundos para el anillamiento de
cebadores y puntual recolección de fluorescencia ("single data
collection"), y 20 segundos de elongación a 72ºC. Cada 20 \mul
de mezcla de reacción contiene de 0.5 \mug a 1 \mug de ADN
genómico, 0.5 \muM de cada cebador (F-Gag y
R-Gag), 0.10 mM de dATP, 0.10 mM de dCTP, 0.10 mM de
dTTP, 0.10 mM de dGTP, y 1 U de enzima ``LightCycler FastStart DNA
polimerasa (Roche), 50 mM KCl, 3.5 mM MgCl_{2}, y l0 mM
Tris-HCl (pH 8,3). La detección de los productos
amplificados se realiza con Syber-Green. Este
marcador detecta sólo ADN de doble cadena, por lo que no interfiere
con los cebadores utilizados, excepto si éstos forman dímeros. La
curva patrón se obtiene utilizando dilución seriada en saltos de un
orden de magnitud desde 10^{4} a 1 copia por mezcla de reacción,
con ADN procedente de células de la línea 8E5, línea celular
linfoide que se caracteriza por portar un único provirus VIH por
célula. Para producir esta recta o curva patrón se extrae el ADN de
10 alícuotas de 1 millón de células por alícuota, y se mide o
cuantifica en espectrofotómetro UV. Se realiza el promedio del peso
del ADN genómico obtenido y se determina en una media de 5 pg, el
peso del ADN genómico de una célula 8E5, lo que significa que 5 pg
de ADN corresponden a una copia de ADN de VIH.
El sistema de detección por
Syber-Green del producto amplificado es
inespecífico, ya que se une a todo el ADN de doble cadena presente
en la mezcla de reacción, como por ejemplo los dímeros de cebadores,
dando por tanto mucho fondo y generando unos datos de
cuantificación con error. Aunque el programa de ordenador del
sistema del LightCycler-qPCR permitiese restar la
fluorescencia de fondo obtenida, control negativo del resto de
muestras, se cometería un error importante, ya que el fondo debido a
los dímeros de cebadores es distinto en cada muestra, dependiendo
de la cantidad inicial de molde que tengan, cuanto más molde inicial
menos dímeros de cebadores se formarán, por ello no se puede restar
la misma cantidad de fluorescencia a cada i muestra. Sin embargo,
este error es asumible en caso de muestras con una carga de ADN
viral alta.
\vskip1.000000\baselineskip
Para poder evitar estos problemas en la
cuantificación del ADN del VIH, cuando la carga de ADN viral no es
alta o no se presupone alta, se diseñó una pareja de sondas de ADN
marcadas con fluorocromos, tipo F.R.E.T., denominadas
P1-Gag y P2-Gag (SEQ ID NO: 5 y SEQ
ID NO: 6), que hibridan específicamente en una región entre los
cebadores F-Gag y R-Gag del producto
amplificado en la PCR-Gag. De este modo sólo se
detecta y cuantifica el producto específico de la PCR no habiendo
señal de fondo y siendo datos reales.
Para mejorar y aumentar la precisión del método
de detección con Syber-Green se realizó una curva
patrón nueva más exacta que la anterior con ADN de células 8E5.
Para realizar esta curva patrón, el producto amplificado con la
PCR-Gag convencional, con ADN de células 8E5, fue
clonado en las dianas EcoRI (SEQ ID NO: 4) y BamHI (SEQ ID NO: 3)
dentro del plásmido Bluescript II(-) (pBSKII-), Stratagene #212216,
crecido en bacterias Escherichia Coli DH5a y purificado por
Maxiprep. El plásmido con el inserto se denominó "pBSKGag" y
después de cuantificarlo en espectro-fotómetro UV y
determinado el número de moléculas de plásmido por \mul, se hizo
una dilución seriada del mismo con saltos de un orden de magnitud
desde 10^{10} a 1 molécula/\mul. Los cebadores representados
como SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, se utilizan para clonar el
producto amplificado entre las dianas Bam HI y Eco RI del plásmido
pBSK(-) y utilizarlo como ADN molde en la recta patrón. Estos
cebadores representados por SEQ ID NO: 3 y SEO ID NO: 4 son los
mismos que SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 pero con las bases añadidas
en 5' correspondientes a las dianas de las enzimas de restricción
reseñadas. Cada 20 \mul de mezcla de reacción de
LC-qPCR-Gag contiene de 0.5 a 1
\mug de ADN genómico como molde, 0.2 \muM de cada sonda
fluorescente P1-Gag y P2-Gag, 0.5
\muM de cada cebador F-Gag y
R-Gag, 0.10 mM de dATP, 0.10 mM de dCTP, 0.10 mM de
dTTP, 0.10 mM de dGTP, y 1 U de enzima ``LightCycler FastStart DNA
polimerasa (Roche), 50 mM KCl, 3.5 mM MgCl_{2}, y 10 mM
Tris-HCl (pH 8,3).
Con el objeto de comprobar la exactitud de la
curva patrón y asegurarnos que todos los confórmeros del plásmido
pBSK-Gag presentes y cuantificados por
espectrofotometría UV en dicha curva daban el producto esperado en
dicha PCR se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 1%
(Figura 2), con 500 ng de dicho plásmido para observar los
diferentes confórmeros del mismo: lineal, circular relajado (con un
corte en una de sus hebras) y superenrollado. Los tres confómeros
fueron recortados del gel y extraídos por separado con GENECLEAN®
Spin kit - BIO101 (Cat. #1101-200) en 20 \mul de
agua libre de nucleasas. Se cogieron 5 \mul como molde de cada
uno para la PCR-Gag y para ver el resultado se
cargaron 10 \mul de dicha PCR en un gel de agarosa 2%. El
producto de Gag se obtuvo de los tres confórmeros, lo que claramente
indica que todo el plásmido pBSK-Gag cuantificado
da producto en la PCR-Gag. En conclusión las copias
teóricas de ADN de la curva patrón son muy próximas a las
reales.
De los resultados obtenidos en diferentes
ensayos con la curva patrón (Fig. 4) deducimos que se pueden tomar
al menos 4 puntos, de los 7 totales. La tasa media de variación
entre las diferentes curvas patrón, es menor en los puntos de
10^{8} a 10^{5} (de -0.1 a +0.1) que en los puntos 10^{4} y
10^{3}, -0.2 a +0.2, y en el punto 100 es -3.5. Los puntos
restantes 10 y 1 tienen una tasa de variación media de -59.1 y
-319.0 respectivamente, demasiado altas, ya que tienen problemas de
amplificación asociados a las muestras con ADN diana en bajo número
de copias; por este motivo estos puntos nunca están incluidos en la
curva patrón real, así que el límite inferior de detección con esta
qPCR (Tabla 1), sería de 100 copias.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Ejemplo
4
La cuantificación en muestras con bajo número de
copias en el ADN molde es muy difícil porque pueden no detectarse
copias o detectarse más número de copias de las que realmente están
presentes en la muestra. La formación de dímeros de cebador y
productos de amplificación no específicos son problemas asociados a
este tipo de muestras, ya que se generan más fácilmente que el
producto de interés. Estos artefactos de amplificación compiten con
las secuencias diana por los reactivos de la mezcla de reacción de
PCR dando valores anómalos de amplificación y cuantificación.
Para aumentar el número de copias en el molde de
la LC-qPCR realizamos una "PCR anidada" o doble
PCR, una combinación de la PCR-Gag convencional y
la LC-qPCR-Gag, utilizando los
mismos cebadores en las dos PCRs, F-Gag y
R-Gag. De este modo se puede detectar el ADN diana
cuando hay muy poca cantidad en la muestra. La primera
PCR-Gag convencional permite generar suficiente
producto de la muestra inicial, para a continuación ser utilizado
como molde en la LC-qPCR-Gag. De
este modo hay suficiente ADN diana de partida no compitiendo los
artefactos ni dímeros de cebador por el producto específico de la
PCR, permitiendo así su correcta cuantificación.
Para realizar la LC-qPCR se
utilizan como molde 10 \mul de los 25 \mul de la PCRGag
convencional de las muestras de pacientes y se ponen tres puntos de
la curva patrón con bajo número de copias; 100, 10 y 1 copia por
mezcla de reacción. La cuantificación obtenida en la
LC-qPCR corresponde al número de copias presentes
en los 10 \mul de PCR convencional utilizados como molde en la
LC-qPCR, no son las copias reales existentes en la
muestra. Utilizando las cuentas obtenidas en cada uno de los puntos
de la curva con 100, 10 y 1 de copia inicial se obtiene la
eficiencia (E) de la PCRGag convencional, aplicando la ecuación:
[8]
(1)Tn =
To(E)^{n}
donde Tn es el número de
copias al final de la PCR, To es el número de copias
iniciales en el molde, E es la eficiencia de la reacción
de PCR (suele estar entre 1,8 y 2), y n es el número de
ciclos de la PCR. El punto de la curva patrón 100 tiene
To(100) = 100 y su Tn(100) en la
PCR-Gag convencional es su
To(100)q en la LCqPCR-Gag.
Introduciendo estos valores en la ecuación (1) se obtiene el valor
de
E:
La E obtenida en (3) de la
PCR-Gag convencional se calcula para los tres puntos
de la curva patrón, 100-10-1, y se
determina la E media (1.8-2), que se puede
asumir que es la misma para todas las muestras de la misma
reacción, de modo que a partir de ella se puede determinar el número
de copias iniciales presentes en las muestras de pacientes,
To(pi), (4). La E de una PCR no es exactamente la
misma para todas las muestras, ni en todos los ciclos de la
reacción, ya que depende del número de ADN diana presente en el
molde. En los ciclos iniciales, el molde es pequeño, y la E
también, según aumenta la cantidad de molde la E también lo
hace, ya que hay más molde y se producen más copias llegando la
amplificación a ser exponencial, acercándose, por tanto, la
E a 2.
En la
LC-qPCR-Gag se obtiene para cada
muestra de paciente su To(pi)q, que es su
Tn(pi) de la PCR-Gag convencional, que
introduciéndolo en (4) se obtiene el To(pi).
(4)To pi = Tn
pi/E^{35}
El factor exponencial de E depende del número de
ciclos de PCR aplicados.
Los algoritmos consignados conforman el programa
de ordenador diseñado y comprendido en la presente invención para
la correcta aplicación del método de medición del ADN viral descrito
(Esquema explicativo en Figura 3).
\vskip1.000000\baselineskip
La técnica descrita se aplicó a un grupo de
pacientes VIH infectados en tratamiento con terapia TARGA con
"carga viral" baja o indetectable. Se realizó la
LC-qPCR-Gag no obteniéndose cuentas
en algunas de ellas, por lo que se aplicó el método para muestras
con bajo número de copias iniciales, realizando primero una
PCR-Gag convencional, y a continuación 10 \mul de
ésta se utilizan como molde para la
LC-qPCR-Gag.
Los resultados obtenidos en estas muestras
fueron inferiores a 435 copias/\mug ADN (1306 copias/10^{6}
células), habiendo muestras con menos de 1 copia/\mug ADN, es
decir, 1 copia por 333333 células (ya que el genoma de una célula
humana equivale aproximadamente a 3 pg). Sólo en los casos en los
que no se obtuvo amplificación se puede decir que tienen "ADN VIH
no detectable".
Las muestras con valores medios/altos de VIH ADN
se detectan en la primera
LC-qPCR-Gag y están entre 1874 y
3367 copias/\mug ADN (de 5623 a 10100 copias/10^{6}células).
(Tablas 2 y 3.).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Con objeto de evitar deficiencias en la
detección del genoma del VIH en muestras con poca cantidad de ADN,
y además simplificar el método y disminuir el tiempo de ensayo,
procesando todas las muestras por igual sin tener en cuenta si
podrían tener alto o bajo número de copias, se llevó a cabo otra
forma preferida de realización de la invención que consiste en una
PCR cuantitativa anidada.
El procedimiento consiste en realizar una PCR
anidada [8] [10][11] utilizando una segunda pareja de cebadores que
se unen en una zona interna del producto amplificado con los
cebadores F-Gag/R-Gag de 222 pb
(Gagl). Esta segunda pareja de cebadores,
F2-Gag/R2-Gag, se unen en las
secuencias que separan los oligonucleótidos
F-Gag-P1-Gag, y
P2-Gag-R-Gag,
respectivamente, pero con una temperatura de fusión (Tm) 10ºC
inferior a la pareja F-Gag/R-Gag,
dando un producto de 149 pb, Gag2. Estas diferencias en las
Tm permite diseñar un programa de "PCR cuantitativa anidada"
en un único capilar por muestra con una mezcla de reacción en la que
están presentes las dos parejas de cebadores y las sondas. Cada 20
\mul de mezcla de reacción de
LC-qPCR-Gag 2,0 contiene de 10 a
200 ng de ADN genómico como molde, 0.2 \muM de cada sonda
fluorescente P1-Gag y P2-Gag, 0.05
\muM de los cebadores F-Gag y
R-Gag, 0.5 \muM de los cebadores
F2-Gag y R2-Gag, 0.10 mM de dATP,
0.10 mM de dCTP, 0.10 mM de dTTP, 0.10 mM de dGTP, y 1 U de enzima
``LightCycler FastStart DNA polimerasa(Roche), 50 mM KCl,
3.5 mM MgCl_{2}, y 10 mM Tris-HCl (pH 8,3).
Se realiza una primera amplificación en la que
hibridan en el ADN molde los cebadores
F-Gag/R-Gag exclusivamente, no lo
hacen los cebadores F2-Gag y R2-Gag,
aunque está presente su secuencia de unión, ya que su temperatura
de unión es 10ºC menor que la pareja F-Gag y
R-Gag. Después de los 15 ciclos de esta primera
amplificación, se realiza una desnaturalización a 95ºC, que es la
Tm del producto Gag1, así se desnaturalizan los productos obtenidos
en la Amplificación 1 y quedan dispuestos para que anillen los
cebadores de la Amplificación 2. A continuación se inicia dicha
amplificación donde la temperatura de fusión es 92ºC, a la cual solo
se desnaturaliza el producto Gag2, y no Gagl, de este
modo el producto que se obtiene en esta amplificación sólo proviene
de Gag2, así no se contarán varios productos provenientes del
mismo ADN molde inicial. Los productos Gagl, no se
cuantifican aunque se unan las sondas en ellos ya que al
termociclador LightCycler se le programa, a través de su aplicación
informática, para que sólo cuantifique fluorescencia durante la
Amplificación 2 (Ver esquema en la Figura 5).
Para calcular la Tm (temperatura de fusión o
desnaturalización) se aplica una fórmula que tiene en cuenta el
número de bases G/C y A/T:
Tm = (wA+xT) *2
+ (yG+zC) *
4
donde w,x,y,z son el número
respectivo de bases A,T,G,C en la
secuencia.
En la presente invención se introdujo la
secuencia en el programa de la página de internet:
http://www.basic.nwu.
edu/biotools/oligocalc.html y el propio programa calculó cada valor de Tm.
edu/biotools/oligocalc.html y el propio programa calculó cada valor de Tm.
Para poder cuantificar las muestras es necesario
extrapolar la fluorescencia obtenida en ellas en una recta patrón
para la que se ha utilizado el plásmido pBSK-Gag que
tiene clonado el producto de amplificación Gagl.
El mayor problema que puede presentar este
método es la propia cuantificación de las muestras, ya que la
cuantificación de fluorescencia se produce en la segunda
amplificación, por lo tanto lo que se asocia esa fluorescencia con
el producto obtenido en la primera amplificación, y no con el número
de copias iniciales presentes en cada muestra. Este problema es
anulado por la propia técnica de cuantificación, al referirse ésta a
la recta patrón. En dicha recta patrón ocurre lo mismo que en el
resto de muestras, pero al asignarle a la fluorescencia obtenida en
la segunda amplificación el número de copias reales presentes al
inicio de la PCR la fluorescencia extrapolada en dicha recta patrón
de las diferentes muestras dará como resultado las copias iniciales
presentes en cada una de ellas. En definitiva, lo que se consigue
con este método es amplificar la señal de fluorescencia de cada
unidad Gag, aumentando la sensibilidad del método.
El aumento de sensibilidad del método viene dado
por la Amplificación 1, pero si se produce una amplificación
excesiva podría saturar e igualar el ADN molde para la Amplificación
2 en todas las muestras, obteniéndose número de cuentas parecido en
todas las muestras aunque no todas tuviesen inicialmente cantidades
similares. Para decidir el número de ciclos de la amplificación 1
que aumentan la sensibilidad del método si saturar el molde para la
segunda amplificación, se realizaron varias LC-qPCR
Gag 2.0 con diferentes cantidades de ADN de células 8E5 como molde,
de 550 ng hasta 0.00055 ng, en diferentes repeticiones inter e
intra-ensayo, concluyendo que el número de ciclos a
los que se obtiene más precisión (menos error), incluso con
cantidades pequeñas de ADN molde (0.55 ng por reacción) es de 15
ciclos (Tabla 4).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La reproducibilidad en los resultados obtenidos
con este método se aprecia en la Tabla 5. La variación en los
duplicados, intra-ensayo, es muy baja, excepto
cuando la cantidad de ADN molde es muy baja, a partir de 0.55 ng,
la variación inter-ensayo también es muy baja, no
llegando a ser superior a 1 unidad hasta 0.55 ng de ADN molde, con
cantidades inferiores la variabilidad es muy alta, por este motivo
se han tomado como cantidades óptimas de ADN molde para este método
de 5 ng a 500 ng.
La recta patrón se obtiene como se describe en
el Ejemplo 3.
1. Guidelines for the Use of Antiretroviral
Agents in HIV-1-Infected Adults and
Adolescents. Developed by the Panel on Clinical Practices for
Treatment of HIV Infection convened by the Department of Health and
Human Services (DHHS). March 23, 2004.
2. Warner C. Greene and B. Matija
Peterlin. 2002. Charting HIV's remarcable voyage
through the cell:basis science as a passport to future therapy.
Nature Medicine. 8 (7).
3. Yupi Zhao, Min Yu,
Johann W. Miller, and Ram Yogev. 2002.
Quantification of HIV-1 proviral DNA by using Taqman
Technology. Journal of Clinical Microbiology. 40(2).
p. 675-678.
4. Una O'Doherty, W. J. Swiggard,
Deepa Jeyakumar, David McGain and Michael H.
Malin. 2002. A sensitive, quantitative assay for
HIV-1 integration. Journal of Virology.
76(21). p 10942-10950.
5. Scott L. Butter, Mark S.T.
Hansen and Frederic D. Bushman. 2001.
Aquantitative assay for HIV DNA integration in vivo.
Nature Medicine. 7(5).
6. L. G. Kostrikis, G. Toulomi, R.
Karinicolas, and A. Hatzakis. 2002.
Quantita-tion of HTV-1 DNA forms
with the second témplate swich in peripheral blood cells predios
disease progression independently of plasma RNA load. 76(20),
p. 10099-10108.
7. Stefan Mener, Cari Witter,
Kan-Ichi Nakagawara. 2001. Rapid Cycle
Real Time PCR. Methods and Applications. Ed. Springer.
8. A. Rolfs, I. Schuller, U.
Finckh, I. Weber-Rolfs. 1992.
PCR: Clinical Diagnostics and Research. Ed.
Springer-Verlag.
9. I.A. Teo, J.W. Choi, J.
Morlese, G. Taylor, S. Shaunak. 2002.
LightCycler qPCR opti-misation for low copy number
target DNA. J Immunology Methods.
Figura 1: PCR-Gag, producto de
222 pb. Las bandas obtenidas corresponden al producto amplificado
con los cebadores F-Gag y R-Gag
sobre el ADN viral.
Figura 2: A) Electroforesis en gel agarosa 1%
del plásmido pBSK-Gag. Se aprecian los tres
confórmeros, 1 lineal, 2 relajado, 3 superenrollado. B)
Electroforesis en gel agarosa 2% de los productos de la
PCR-Gag con cada confórmero del plásmido
pBSK-Gag. El marcador en los dos geles es un patrón
en escalera de 100 pb en cada banda.
Figura 3: Esquema explicativo del sistema de
cuantificación en muestras con bajo número de copias.
Figura 4: Gráficos de las Curva patrón
pBSK-Gag de LC-qPCR Gag de la Tabla
1. Las gráficas a-f representan las curvas patrón
obtenidas en diferentes experimentos y demuestran la
reproducibilidad del método, el coeficiente de correlación y el
error obtenido en cada uno de dichos experimentos.
Figura 5: Esquema explicativo de la doble PCR
cuantitativa anidada utilizando parejas distintas de cebadores en
cada paso de amplificación.
\vskip1.000000\baselineskip
La lista de referencias citadas por el
solicitante es, únicamente, para conveniencia del lector. No forma
parte del documento de patente europea. Si bien se ha tenido gran
cuidado al compilar las referencias, no pueden excluirse errores u
omisiones y la OEP declina toda responsabilidad a este respecto.
\bulletYourno et al. J.
Clinical Microbiol., 1992, vol. 30,
2887-2892 [0015]
\bulletWarner C. Greene; B.
Matija Peterlin. Charting HIV's remarkable voyage through the
cell: basis science as a passport to future therapy. Nature
medicine, 2002, vol. 8 (7) [0061]
\bulletYupi Zhao; Min Yu;
Johann W. Miller; Ram Yogev. Quantification of
HIV-1 proviral DNA by using Taqman Technology.
Journal of Clinical Microbiology, 2002, vol. 40 (2),
675.678 [0061]
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H. Malin. A sensitive, quantitative assay for
HIV-1 Integration. Journal of Virology,
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\bulletScott L. Butter; Mark S.
T. Hansen; Frederic D. Bushman. Aquantitative assay
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2001, vol. 7 (5) [0061]
\bullet L. G. Kosirikis; G.
Toulomi; R. Karinicolas; A. Hatzakis.
Quantitation of HIV-1 DNA forms with the second
template swich in peripheral blood cells predics disease progression
independently of plasma. RNA load, 2002, vol. 76 (20),
10099-10108 [0061]
\bullet Stefan Mener; Carl
Witter; Kan-Ichi Nakagaware. Rapid
Cycle Real Time PCR. Methods and Applications. Springer,
2001 [0061]
\bullet A. Rolfs; I. Schuller;
U. Finckh; I. Weber-Roles. PCR:
Clinical Diagnostics and Research. 1992 [0061]
\bullet I. A. Teo; J. W. Choi;
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qPCR optimisation for low copy number target DNA. J Immunology
Methods, 2002 [0061]
<110> Genomadrid
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento de detección y
cuantificación in vitro de ADN de VIH mediante PCR
cuantitativa
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P-100143
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<223> F-Gag
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAGTAGAAGA GAAGGCTTTC AGCCCA
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<223> R-Gag
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGGTTCTCT CATCTGGCCT GGTG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
F-Gag-Bam
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGGATCCCG TAGTAGAAGA GAAGGCTTTC AGCCCA
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
R-Gag-Eco
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGAATTCCG TTGGTTCTCT CATCTGGCCT GGTG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> P1-Gag
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAGCCACCCC ACAAGATTTA AACACCATGT
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Sonda
\vskip0.400000\baselineskip
<223> P2-Gag
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAACACAGTGG GGGGACATCA AGCAGCCAT
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<223> F2-Gag
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAAGTAATAC CCATGTTTTC AG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<223> R2-Gag
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGCAGAATGG GATAGATTGC A
\hfill
Claims (11)
1. Método in vitro de detección
cuantitativa de ADN del virus VIH que comprende una doble
amplificación del ADN viral presente en la muestra utilizando una
doble PCR cuantitativa anidada, de forma que una primera pareja de
cebadores de PCR, representados por SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, la
cual se une específicamente al gen gag en posiciones 1260 a 1482 se
utiliza en la primeraamplificación, y una segunda pareja de
cebadores de PCR con una temperatura de fusión (Tm) diferente a la
de la primera pareja de cebadores, se une al gen gag dentro del
fragmento amplificado por la primera pareja de cebadores,
caracterizado porque la amplificación y la detección del ADN
viral se lleva a cabo en un único capilar por muestra con una mezcla
de reacción que contiene los dos pares de cebadores y las
sondas.
2. El método según la reivindicación 1,
caracterizado porque un segundo par de cebadores SEQ ID NO: 7
y SEQ ID NO: 8, se unen específicamente dentro del fragmento del
gen gag amplificado por la primera pareja de cebadores entre las
posiciones 1286 y 1435 de dicho gen.
3. Método según las reivindicaciones 1 o 2,
caracterizado porque la secuencia de nucleótido de una de las
sondas es la representada por SEQ ID NO: 5.
4. Método según las reivindicaciones 1 a 3,
caracterizado porque la secuencia de nucleótido de la segunda
sonda es la representada por SEQ ID NO: 6.
5. Método según las reivindicaciones 1 a 4,
caracterizado porque la primera pareja de cebadores es la
representada por SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, la segunda pareja de
cebadores es la representada por SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 y las
secuencias de nucleótidos de las sondas es la representada por SEQ
ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las
sondas están marcadas con fluorocromos tipo F.R.E.T. por
consiguiente el número de copias de ADN viral presente en el ensayo
se cuantifica extrapolando la fluorescencia obtenida a una recta o
curva patrón de referencia previamente calibrada.
7. Kit de ensayo para cuantificar ADN del virus
VIH caracterizado porque comprende una mezcla de reacción en
un único capilar que contiene:
- i)
- al menos una primera pareja de cebadores PCR representada por SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 que se une específicamente al gen gag entre las posiciones 1260 y 1482 de dicho gen,
- ii)
- al menos una segunda pareja de cebadores PCR representada por SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 con una temperatura de fusión (Tm) diferente de la de la primera pareja de cebadores y que se une específicamente al gen gag dentro del fragmento determinado por la primera pareja de cebadores que usa como producto de partida el previamente amplificado por dicha primera pareja de cebadores,
y, conjuntamente o por separado, en un
reactivo,
- iii)
- una pareja de cebadores que se unen específicamente al fragmento del gen gag comprendido entre el segundo par de cebadores.
8. Kit de ensayo según la reivindicación 7
caracterizado porque uno de los cebadores es el representado
por SEQ ID NO: 5.
9. Kit de ensayo según las reivindicaciones 7 u
8, caracterizado porque el segundo de los cebadores es el
representado por SEQ ID NO: 6.
10. Kit de ensayo según las reivindicaciones 7 a
9, caracterizado porque la primera pareja de cebadores es la
representada por SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, la segunda pareja de
cebadores es la representada por SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, y la
pareja de sondas es la representada por SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO:
6.
11. Kit de ensayo según las reivindicaciones 7 a
10, caracterizado porque la pareja de sondas
oligonucleotídicas está marcada con fluorocromos tipo FRET.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200401986 | 2004-08-06 | ||
| ES200401986 | 2004-08-06 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2328944T3 true ES2328944T3 (es) | 2009-11-19 |
Family
ID=35517608
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES05777709T Expired - Lifetime ES2328944T3 (es) | 2004-08-06 | 2005-07-14 | Procedimiento de deteccion y cuantificacion in vitro de adn de vih mediante pcr cuantitativa. |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
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