JPH10511549A - 酵素の安定化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 高い水含量を有する液体組成物を含む液体組成物中において酵素を安定化させる方法およびそれにより形成された安定化された酵素液体組成物。本発明は、酵素をその不溶性状態となるようにし、その不溶性を維持するための薬剤を添加することに関与する。そのような不溶性状態の例には、酵素結晶がある。この方法によって安定化された酵素は、高い水含量を有する液体組成物を含む液体組成物と組み合わせるために有用である。この方法は酵素含有液体洗剤組成物の調製に特に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 酵素の安定化 発明の分野 本発明は、酵素の安定化、特に洗剤配合物等の液体組成物における酵素の安定 性を促進させる方法、および、それによって調製された、酵素含有液体洗剤配合 物を含む、安定化された酵素を含有する液体組成物に関する。 発明の背景 洗剤配合物等の、酵素含有液体組成物の製造においてよく遭遇する主要な問題 は、酵素含有エアロゾル（または霧）の形成である。そのような酵素含有エアロ ゾルは作業範囲の安全性に重要に関係している。この問題は、プロセシングおよ び／または配合条件が商業的規模で実行され、それによって引き起こされる危険 を減らすために商業的生産者に特別な予防措置をとることを要求している場合に とくにあてはまるものである。 酵素を含む液体組成物の製造および使用において遭遇する他の主要な問題は、 液体組成物における酵素の安定性（そして、それ故に活性）の維持である。 酵素の安定性の問題は、高い水含量および／または高ｐＨを有する液体組成物 中に酵素が含まれている場合に特にあてはまる。そのような組成物中の水含量は 、酵素を可溶化し、酵素活性の消失という結果となる。そのような組成物の高ｐ Ｈは、酵素の変性につながり、酵素活性の消失という結果となる。 液体洗剤配合物は、酵素安定性に関連した特定の問題を示している。これは、 そのような洗剤配合物が頻繁に高い水含量と高ｐＨを有していることによる。こ れらの条件は酵素を可溶化させるのみならず、酵素の変性並びにその他の酵素安 定性および活性に好ましくなく作用するという結果となる。 上記に鑑み、液体組成物、特に洗剤配合物において、その酵素活性が輸送およ び貯蔵の間保存されるように、酵素の安定化を改善するためにかなりの努力がな されてきた。 液体スラリー洗剤配合物中の酵素の安定性（貯蔵寿命）を改善するための課題 の例には、様々な種類の添加物の使用が含まれる。そのような、提案された添加 物には、アルカリ金属５ホウ酸（米国特許第４４０４１１４号）、カルシウムイ オンと低分子量カルボン酸または塩の組合せ（米国特許第４３１８８１８号およ び第４３０５８３７号）および抗酸化剤と親水性ポリオールとの組合せ（米国特 許第４２４３５４３号）が含まれる。最後に、亜硫酸ナトリウム等の還元アルカ リ金属塩の利用が、特にホウ酸またはホウ酸アルカリ金属含有配合物が改良され た場合において提案されている（米国特許第４４６２９２２号）。 残念ながら、そのような安定化剤および添加物の利用は必ずしも液体組成物に おいて好ましいかまたは有用ではない。これは、少なくとも部分的には、それら は汚染された流出物および／または存在する他の使用の問題の形成に繋がるとい う事実によるものである。さらには、そのような安定化剤や添加物の使用は、そ れとともに調製された組成物のコストを上昇させる。 最終的に、そのような酵素含有組成物中の安定化剤の存在は、上記の引例中で 提案されているように、酵素含有エアロゾル（霧）の形成の問題を減少または排 除するものではない。 酵素結晶を、それ自体単独または安定化剤と組み合わせての何れかで液体組成 物中の酵素の安定性の改善のために用いることが教示、開示または提案されてい る開示はこれまでに知られていない。もちろん、そして恐らく酵素結晶はそのよ うな組成物中で急速に可溶化されるという事実（その結果劣悪な貯蔵安定性とな る）によるが、酵素結晶を水性配合物で用いることは拒否されてきた。 乾燥（粒状）および無水（スラリー）洗剤配合物において、改善された酵素の 安定性を得るために酵素結晶を使用することは開示されているが（特許出願番号 ＷＯ９１／０９９４１）、それらの液体組成物、および特に水成分を有する液体 組成物（水性組成物）においての使用は避けられてきた。これは、少なくとも部 分的には、そのような酵素結晶が（上記で詳細に議論された従来の酵素の状態の ように）容易に可溶化するからである。そのため、それらは液体組成物中、特に 高い水含量を有する液体組成物中で使用された場合、劣悪な貯蔵安定性を示す。 従って、酵素含有液体組成物、特に酵素含有液体洗剤配合物を製造する場合の 酵素含有エアロゾル（霧）の形成を減少および／または排除する問題に対する解 決を提供する必要が残されているように見える。この見地から、液体洗剤配合物 を含む安定な酵素含有液体組成物を提供する方法を、これらに通常関連している 酵素含有エアロゾル（霧）の形成を減少および／または排除しながら提供する必 要が残されているように見える。さらにこの見地から、液体洗剤配合物を含む安 定な酵素含有液体組成物であって、減少された酵素含有エアロゾルレベルを有す るものを提供する必要が残されているように見える。 さらに、特に液体洗剤配合物を含む、酵素含有液体組成物において、その酵素 活性を保存するための酵素の安定化の改善の問題に対する解決を提供する必要が 残されているように見える。この見地から、液体洗剤配合物を含む安定な酵素含 有液体組成物を提供するための方法を提供する必要が残されているように見える 。さらにこの見地から、液体洗剤配合物を含む安定な酵素含有液体組成物であっ て、酵素がその酵素活性の実質的な部分を長期間にわたって保持しているものを 提供する必要が残されているように見える。 発明の概要 安定な酵素含有液体組成物および、特に高い水含量を有する液体組成物（水性 組成物）を提供することが本発明の主要な目的である。 安定な酵素含有液体洗剤配合物および、特に高い水含量を有する液体洗剤配合 物（水性組成物）を提供することが本発明の別の主要な目的である。 安定な酵素含有液体組成物および、特に高い水含量を有する液体組成物（水性 組成物）を提供するための方法を提供することが本発明のさらなる主要な目的で ある。 安定な酵素含有液体洗剤配合物および、特に高い水含量を有する液体洗剤配合 物（水性組成物）を提供するための方法を提供することが本発明のさらなる別の 主要な目的である。 本発明の別の側面においては、酵素含有液体洗剤配合物を含む酵素含有液体組 成物の製造の間に、酵素含有エアロゾル（霧）の形成を減少させるかまたは排除 することは、本発明のさらなる目的である。 本発明の教示にしたがって、ここに開示されているのは安定な酵素含有液体組 成物の製造方法である。この方法は、液体配合物中に取り込まれる、関心の持た れている酵素を不溶性状態とすることを含む。この方法は、さらに、液体配合物 において、不溶性状態にある酵素と酵素を不溶性状態に保持する薬剤と組み合わ せることを含む。この方法により、本発明の安定な酵素含有液体組成物が提供さ れる。 好ましくは、本発明の酵素の不溶性状態は酵素の結晶化により形成されてもよ く、それにより酵素結晶が形成され提供される。他には、酵素の不溶性状態は酵 素のアモルファス状態を形成することにより提供されてもよく、それによりアモ ルファス酵素が形成され提供される。 好ましい実施例においては、この方法は、関心の持たれている酵素を、不溶性 状態にある酵素を維持するための薬剤が存在する間に不溶性状態とすることを含 む。 別の好ましい実施例においては、この方法は、関心の持たれている酵素を、そ の不溶性状態にある酵素と、不溶性状態にある酵素を維持するための薬剤とを組 み合わせる前に不溶性状態とすることを含む。 好ましくは、酵素はプロテアーゼである。特に好ましい実施例においては、酵 素はセリンプロテアーゼである。別の好ましい実施態様においては、酵素はアル カリプロテアーゼである。 他には、酵素はアルファアミラーゼである。 本発明の方法は、安定な酵素含有液体洗剤配合物を製造するために使用するこ とが好ましい。 好ましくは、不溶性状態にある酵素を維持するための薬剤は、結晶化剤である 。特に好ましい実施例においては、結晶化剤は塩化ナトリウムである。 望まれるならば、液体配合物は水性配合物、すなわち、水成分を有する配合物 であってもよい。さらに望まれるならば、この水性配合物は５０％（ｖ／ｖ）ま たはそれより高い水含量を有する水性配合物であっても良い。 本発明の別の側面においては、ここに開示されているのは安定な酵素含有液体 組成物である。これらの液体組成物は、液体配合物、不溶性酵素、および不溶性 酵素をその不溶性（結晶またはアモルファス）状態に保持するための薬剤を含む 。このような組成物においては、不溶性酵素はその不溶性（結晶またはアモルフ ァ ス）状態（状況）に保持されており、それにより酵素は安定なままであり、そし てその酵素活性の実質的な部分を保持している。 好ましくは、本発明の酵素の不溶性状態は酵素の結晶型であり、それにより酵 素結晶が形成され提供される。他には、酵素の不溶性状態は酵素のアモルファス 状態を形成することにより提供されてもよく、それによりアモルファス酵素が形 成され提供される。 好ましい実施例においては、この方法は、関心の持たれている酵素を、不溶性 状態にある酵素を維持するための薬剤が存在する間に不溶性状態とすることを含 む。 別の好ましい実施例においては、この方法は、関心の持たれている酵素を、そ の不溶性状態にある酵素と、不溶性状態にある酵素を維持するための薬剤とを組 み合わせる前に不溶性状態とすることを含む。 好ましくは、酵素はプロテアーゼである。特に好ましい実施例においては、酵 素はセリンプロテアーゼである。別の好ましい実施態様においては、酵素はアル カリプロテアーゼである。 他には、酵素はアルファアミラーゼである。 本発明の方法は、安定な酵素含有液体洗剤配合物を製造するために使用するこ とが好ましい。 好ましくは、不溶性状態にある酵素を維持するための薬剤は、結晶化剤である 。特に好ましい実施例においては、結晶化剤は塩化ナトリウムである。 さらに好ましくは、本発明の安定な酵素含有液体組成物は安定な酵素含有液体 洗剤組成物である。 望まれるならば、液体配合物は水性配合物、すなわち、水成分を有する配合物 であってもよい。さらに望まれるならば、この水性配合物は５０％（ｖ／ｖ）ま たはそれより高い水含量を有する水性配合物であっても良い。 本発明の方法と組成物の、これらの、およびさらなる目的と利点は、以下の実 施例を考慮しつつ、以下の記載を読むことにより容易に明白となるであろう。 好ましい実施態様の記述 本発明の主要な側面は、液体組成物において、酵素を不溶性状態（結晶または アモルファス）に維持し、酵素に貯蔵安定性を与えるものである。このことは、 少なくとも部分的には、酵素の不溶性（結晶またはアモルファス）状態は、ｐＨ 、熱、貯蔵等の極限条件の下での変性に耐性を有することによる。このことはさ らに、少なくとも部分的には、（液体組成物においては）不溶性（結晶またはア モルファス）状態にある酵素は可溶性状態にあるものより活性が低いことによる 。 従って、本発明の安定な、酵素含有液体組成物とは、酵素含有液体組成物であ って、そこにおいて酵素が不溶性（すなわち結晶またはアモルファス）状態に維 持されているものである。この不溶性状態において、酵素はｐＨ、熱、貯蔵等の 極限条件の下での変性に耐性を有することによる。このように、酵素はそれらの 使用時までの長期間にわたって活性で安定である。そのような本発明の酵素含有 液体組成物は、洗剤配合物であって、そこにおいて長時間の期間にわたって酵素 活性の実質的な部分を保持するよう、酵素が安定に保持されているものを含む。 本発明の酵素含有液体組成物は、不溶性（結晶またはアモルファス）状態にあ る酵素、酵素をその不溶性状態に維持するための薬剤（すなわち酵素結晶化剤） 、および、不溶性酵素および酵素の不溶性維持のための薬剤がその中へ組み合わ せられる液体配合物を含む。 酵素の不溶性状態を維持する薬剤は、当業者に知られている何れのそのような 薬剤でもよい。好ましくは、この薬剤は酵素結晶化剤である。本発明の教示にし たがって液体配合物中において結晶化酵素と共に配合されうる好ましい結晶化剤 は、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム（米国特許第５０４１３７７号および第 ５２５６５７７号）、有機酸（ＷＯ９１／０９９４３および米国特許第５２８１ ５２６号を参照）およびアミノ酸（１９９２年４月８日出願の米国特許出願第８ ６５２５２号を参照）であってもよい。この点においては、塩化ナトリウムの使 用が最も好ましい。 本発明の方法において用いられ得る、酵素をその不溶性状態に維持するための （結晶化）薬剤の量（濃度）は、本発明の液体組成物に含まれるように、酵素の 不溶性状態を維持するための（結晶化）薬剤が含まれる配合物の型および詳細に よって、含まれる酵素によって並びに作成される組成物が用いられ、および／ま たは使用まで保存される条件によって要求されるように変化するであろう。この ような変化は当業者によって決定できる。 しかしながら、ここにおいて、最終組成物中に組み合わせられる結晶化剤の濃 度は約２％（ｗ／ｖ）の結晶化剤から約１０％の結晶化剤の間であるであろうこ とが考慮されたことに注意されたい。約５％の結晶化剤の濃度が好ましいであろ うことが、さらに考慮された。 本発明の方法とともに組成物中において用いられ得る酵素には、不溶性状態（ すなわち結晶またはアモルファス）に維持されることができる酵素が含まれる。 好ましくは、その様な酵素は、セリンプロテアーゼ（スブチリシンおよびスブチ リシン型プロテアーゼ等）、中性プロテアーゼおよびアルカリプロテアーゼを含 むプロテアーゼである。このようなプロテアーゼの例には、ＯＰＴＩＭＡＳＥ（ ＳＯＬＶＡＹ ＥＮＺＹＭＥＳ，Ｉｎｃ．）およびＯＰＴＩＣＬＥＡＮ（ＳＯＬ ＶＡＹ ＥＮＺＹＭＥＳ，Ｉｎｃ．）の商標で市販されているアルカリプロテア ーゼが含まれる。 本発明の組成物において有用であると考えられている別の酵素には、ＴＥＮＥ ＳＥ（ＳＯＬＶＡＹ ＥＮＺＹＭＥＳ，Ｉｎｃ．）およびＴＡＫＡＴＨＥＲＭ（ ＳＯＬＶＡＹ ＥＮＺＹＭＥＳ，Ｉｎｃ．）の商標で市販されているアルファア ミラーゼ、他のアミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼおよび／または洗剤配合物（ すなわち衣類や皿の洗浄用）において一般に用いられている何れの他の酵素をも 含まれる。 これらの酵素のタンパク質工学的に操作された変異体の使用、および、液体組 成物中での異なった酵素システムの結合もまた、本発明の範囲内である。 本発明の組成物中に含まれるべき詳細な酵素（または酵素の組合せ）は、組成 物の意図された利用にしたがって変化する。例えば、衣類などの織物の洗浄のた めの洗剤配合物は、アルカリプロテアーゼを含むであろう。事情によって、酵素 の組合せもまた本発明の背景の範囲内で用いられてもよい。 本発明の方法において用いられる酵素の量（濃度）もまた、本発明の酵素組成 物に含まれるように、酵素の不溶性状態を維持するための（結晶化）薬剤が含ま れる配合物の型および詳細によって、含まれる酵素によって並びに作成される組 成物が用いられ、および／または使用まで保存される条件によって要求されるよ うに変化するであろう。このような変化は当業者によって決定できる。 しかしながら、ここにおいて、最終配合物に含まれる酵素の濃度は少なくとも 約０．０１％（ｗ／ｖ）で、より詳細には少なくとも約０．１％（ｗ／ｖ）であ ることが考慮された。さらに好ましくは、前記の酵素濃度は少なくとも約０．５ ％（ｗ／ｖ）である。最も好ましくは、前記の酵素濃度は少なくとも約１．０％ （ｗ／ｖ）である。また好ましいのは、前記の酵素濃度は少なくとも約２．０％ （ｗ／ｖ）である。 さらに、ここにおいて、最終配合物に含まれる酵素の濃度は約５．０％（ｗ／ ｖ）より大きくはなく、より詳細には約２．０％（ｗ／ｖ）より大きくはないこ とが考慮された。最も好ましくは、前記の酵素濃度は少なくとも約１．０％（ｗ ／ｖ）である。さらに好ましいのは、前記の酵素濃度は約０．５％（ｗ／ｖ）よ り高くない。また好ましいのは、前記の酵素濃度は少なくとも約０．１％（ｗ／ ｖ）である。 本発明の液体組成物中に含まれる酵素の詳細な不溶性状態（物理的状態）（す なわち結晶またはアモルファス）もまた、配合物の物理的状態およびその意図さ れている使用によって変化する。そのような変化は当業者によって決定されうる 。 不溶性（結晶またはアモルファス）酵素および不溶性状態にある酵素を維持す るための薬剤（結晶化剤等）が組み合わされて投入される本発明の液体配合物は 、何れの好適な液体配合物であってもよい。そのような配合物は、望まれるなら 、界面活性剤（すなわち、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸等のアニオン性界面 活性剤、アルコールエトキシレート等のノニオン系界面活性剤、カチオン性界面 活性剤または両イオン性）、安定化剤（すなわちプロピレングリコール）および ｐＨ緩衝剤等の他の更なる成分を、名目上しかし僅かに含有する。この見地から 、ここにおいて、本発明の原理は、水性スラリー配合物を含む、水成分を有する 液体配合物に応用可能であることに注意されたい。もちろん、本発明の方法およ び原理は、５０％（ｖ／ｖ）より大きい水含量を有する水性配合物に対してすら 応用可能である。 上記のように、本発明の液体配合物は、望まれるのであれば、洗剤配合物であ ってもよい。もちろん、ここにおいて、本発明の教示は、液体洗剤配合物の製造 、 貯蔵、および使用において特に応用可能であることに注意されたい。より詳細に は、本発明の教示は、水成分を含有する液体洗剤配合物の製造、貯蔵、および使 用において特に応用可能であることに注意されたい。このような市販されている 洗剤配合物には、ＤＯＵＢＬＥ ＰＯＷＥＲ ＳＵＲＦ（Ｌｅｖｅｒ Ｂｒｏｔ ｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．Ｕ．Ｓ．Ａ）、ＤＹＮＡＭＯ（Ｃｏｌｇａｔｅ−Ｐａｌｍｏ ｌｉｖｅ，Ｉｎｃ．，Ｕ．Ｓ．Ａ）およびＳＴＡＩＮ ＯＵＴ（Ｃｌｏｒａｘ， Ｉｎｃ．，Ｕ．Ｓ．Ａ）が含まれる。 不溶性（結晶またはアモルファス）酵素および不溶性状態にある酵素を維持す るための薬剤（結晶化剤等）が組み合わされて投入される本発明の洗剤組成物（ 配合物）は、何れの好適な洗剤組成物（配合物）であってもよい。そのような配 合物は、望まれるなら、界面活性剤（すなわち、直鎖アルキルベンゼンスルホン 酸等のアニオン性界面活性剤、アルコールエトキシレート等のノニオン系界面活 性剤、カチオン性界面活性剤または両イオン性）、安定化剤（すなわちプロピレ ングリコール）、他の酵素（アミラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼおよび オキシダーゼを含むがこれに限定されない）、洗剤ビルダー（ゼオライト、ジホ スフェートおよびトリホスフェート等）、添加剤（ヒドロキシプロピルセルロー スまたはメチルセルロースのようなセルロース派生体およびデキストリンのよう な炭水化物バインダー等）およびｐＨ緩衝剤（洗剤組成物をその所望のｐＨに維 持するため）でリン酸や炭酸をふくむもの等の他の更なる成分を含有する。 本発明の安定な酵素含有液体組成物は、それらがこれまで配合されてきた多様 な目的のために用いられてもよい。この見地から、洗剤配合物は、衣類や皿の洗 濯のための（例えば自動皿洗い機）および／またはそれとともに必要である他の 表面のための洗浄組成物において用いられてもよい。 他の本発明の重要な側面においては、液体配合物中において、不溶性状態（結 晶またはアモルファス）にある適当な酵素を、不溶性状態の酵素を維持するため の適当な薬剤（結晶化剤等）とともに組み合わせることにより、酵素が顕著な貯 蔵安定性の改善を示している酵素含有液体組成物が提供されることが発見された ことである。 本発明の液体組成物を製造するための本発明の方法は、酵素を問題の不溶性状 態にすることを含む。この見地から、この方法は問題の酵素を結晶化することを 含んでもよい。別の選択としては、その方法は、酵素がそのアモルファス状態と なるようにされてもよい。この不溶性状態にある酵素の形成の後、続いて不溶性 状態（結晶またはアモルファス）にある酵素を、酵素の不溶性状態（結晶または アモルファス）を維持するための薬剤と、液体配合物中において組み合わせる。 このやり方において、本発明の安定な酵素含有液体組成物が提供される。 本発明の方法にしたがった酵素の結晶化は、当業者に公知の何れの適切な方法 によってもよい。そのような方法には、米国レター特許番号第５２５６５５７号 に記載されている、アミノ酸および／または有機酸を用いて酵素が結晶化される ものが含まれる。他の適当な方法は、米国特許番号第５２８１５２６号に記載さ れている。 本発明に従って、酵素は当業者に公知の何れの方法を用いてアモルファス状態 とされてもよい。このような方法には、米国レター特許番号第４６７３６４７号 に記載されているものが含まれる。 不溶性（結晶化）酵素および酵素をその不溶性状態に維持するための薬剤（結 晶化剤）を所望の配合物中（洗剤配合物を含む）において組み合わせることは、 いくつかの異なったやり方で成され得る。 不溶性酵素と前述の薬剤との組合せは、不溶性酵素の生成を、酵素を不溶性状 態に維持するための薬剤（および液体配合物であって、そこからおよび／または その中に不溶性状態の酵素が生成されるもの）の存在下で行うことにより成され てもよい。このやり方では、生成された不溶性状態にある酵素は直ちに、中でそ の酵素がその前述の不溶性状態にされた液体組成物中で、不溶性状態にある酵素 と結合される。 他には、不溶性酵素と前述の薬剤との組合せは、不溶性酵素を最初に生成させ 、続いて酵素を不溶性状態に維持するための薬剤をそれに添加することによって 成されてもよい。この場合、前述の薬剤は、不溶性酵素と前述の薬剤が液体組成 物中において組み合わされるように、不溶性状態にある酵素に添加される際に、 溶液中にあっても（液体組成物中にあっても）よい。他には、不溶性酵素と前述 の薬剤が液体組成物の存在下において組み合わされるように、液体組成物は不溶 性 酵素と前述の薬剤との混合物に添加されてもよい。 しかしながら、選択した詳細な方法に関係なく、全ての場合において、その不 溶性状態にある酵素と前述の薬剤は、液体組成物の存在下に、薬剤が液体（すな わち水）に結合し、それによって酵素をその不溶性状態に維持するよう結合され る。 不溶性状態にある酵素と前述の酵素をその不溶性状態に維持するための薬剤と の組合せは酵素活性に影響を与えない（例えば酵素の変性等）であろう温度で行 われなければならない。この見地から、ここでは温度は約５℃より低くはなく約 ５０℃より高くもないことが好ましいと考えられる。 不溶性状態にある酵素と前述の酵素をその不溶性状態に維持するための薬剤と の組合せは酵素活性に影響を与えない（例えば酵素の変性等）であろうｐＨで行 われなければならない。この見地から、ここではｐＨは約４．０より低くはなく 約１３．０より高くもないことが好ましいと考えられる。 本発明の安定な酵素含有液体組成物を製造するための上記の本発明の方法は、 酵素含有エアロゾル（霧）の形成に関連した問題を顕著に減少させることに注意 されたい。このことは不溶性（すなわち結晶）酵素を液体配合物中に取り込むこ とにより、また液体（洗剤等）配合物中の酵素の不溶性（すなわち結晶）を維持 することにより達成された。 本発明は、それが改善された安定性（そして、それ故に経済的な効果を有する ）および安全性（低アレルギー性）を提供するという事実により有用である。 このように、本発明の、洗浄配合物を含む安定な酵素含有液体組成物を、本発 明の、洗浄配合物を含む安定な酵素含有液体組成物の製造方法と共に記述してき たが、これから以下の実施例を本発明の説明のために示すが、これらは限定的な 意味を持つものではなく、そのように読まれるべきものでもない。実施例１ アルカリプロテアーゼをバシルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａ ｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）より得、記述された手順に従って、米国特許第５２５ ６５５７号の実施例１において特定された条件下で結晶化させた。このような手 順において、アルカリプロテアーゼ結晶は１０％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム（酵 素をその結晶状態に保持するための試薬）の存在下に生成された。このやり方に おいては、安定化されたアルカリプロテアーゼは、塩化ナトリウムによって維持 されるその不溶性状態となるよう生成された。 結晶化酵素の濃度を続いて、約１００００００ＤＵ（Ｄｅｌｆｔ Ｕｎｉｔｓ ）／ｇの活性に、蒸留水の添加により希釈した（ｐＨ６．５−７．０）。 溶液を標準化するために、塩化ナトリウムを、その塩化ナトリウム濃度を１０ ％（ｗ／ｖ）まで引き上げるために添加した。以下の内容物もまた、そのそれぞ れの濃度を以下に記載のとおりに引き上げるために添加した：ホウ酸をその濃度 を１．０％（ｗ／ｖ）に引き上げるために添加した；塩化カルシウムをその濃度 を１．０％（ｗ／ｖ）に引き上げるために添加した；およびコーンシロップ固体 をその濃度を＞５０％（ｗ／ｖ）乾燥固体ベース（ｄｓｂ）に引き上げるために 添加した。 溶液のｐＨを酸性酸（ａｃｉｄｉｃ ａｃｉｄ）（０．１Ｍ）によりｐＨ４． ５に調整した。 このやり方により、本発明に従った安定結晶酵素含有液体組成物が提供された 。実施例２ ０．１Ｍホウ酸バッファー溶液（ｐＨ ８．５）で、ホウ酸（０．１Ｍ）およ びホウ酸ナトリウム（０．１Ｍ）から成るものを調製した。 １０％（ｖ／ｖ）の酵素結晶化剤（塩化ナトリウム）を含む安定結晶化酵素含 有液体組成物を、続いて、５％（ｖ／ｖ）酵素結晶化剤（塩化ナトリウム）を含 有する安定な結晶化酵素含有液体組成物が生成されるようホウ酸バッファーに添 加した（１：１（ｖ／ｖ））。この液体組成物のアルカリプロテアーゼは、約５ ０００００−８０００００ＤＵ／ｇの初期活性を有していた。 同様のアルカリプロテアーゼ（１００００００ＤＵ／ｇの初期活性）の液体組 成物で、ＯＰＴＩＣＬＥＡＮ Ｌ−１０００（ＳＯＬＶＡＹ ＥＮＺＹＭＥ，Ｉ ｎｃ．）の名のプロピレングリコール中に調製されたものを得た。 本発明の結晶化状態のアルカリプロテアーゼを有する液体組成物およびプロピ レングリコール中に配合されたアルカリプロテアーゼの液体組成物の両方の、そ れぞれの試料を５０℃、ｐＨ８．５で、選択された時間的間隔（０、３、６、１ ２、２４および３８時間）で取りやめられるまで保温し、アルカリプロテアーゼ 活性を記述された手順に従って、米国特許第５２５６５５７号の実施例１におい て特定された条件下で測定した。 結果を表１にまとめる。 表１に見られるとおり、結晶化（不溶性）状態のアルカリプロテアーゼは高い ｐＨおよび高い温度で、可溶性状態にあった同じプロテアーゼと比べてより安定 であった。実施例３ 液体状態にある（ＯＰＴＩＣＬＥＡＮ Ｌ−１０００）アルカリプロテアーゼ および実施例１からの安定化された結晶化アルカリプロテアーゼ結晶の水性安定 性を、続いて異なったｐＨで比較した。 実施例１由来の１０％（ｖ／ｖ）の酵素結晶化剤（塩化ナトリウム）を含む安 定結晶化酵素含有液体組成物を、５％（ｖ／ｖ）酵素結晶化剤（塩化ナトリウム ）を含有する安定な結晶化酵素含有液体組成物が生成されるよう実施例２記載の とおりにホウ酸バッファーに添加した（１：１（ｖ／ｖ））。この液体組成物の アルカリプロテアーゼは、約５００００００−８０００００ＤＵ／ｇの初期活性 を有していた。 液体ＯＰＴＩＣＬＥＡＮ Ｌ−１０００もまた、実施例２記載のとおりに得た 。 本発明の結晶化状態のアルカリプロテアーゼを有する液体組成物およびプロピ レングリコール中に配合されたアルカリプロテアーゼの液体組成物の両方の、そ れぞれの試料を５０℃で、異なったｐＨで（すなわちｐＨ４からｐＨ１０まで） で２４時間、その時間で取りやめられるまで保温し、アルカリプロテアーゼ活性 を記述された手順に従って、米国特許第５２５６５５７号の実施例１において特 定された条件下で測定した。 結果を表２にまとめる。 ここでも再び、表２の結果により、結晶化（不溶性）酵素は可溶性酵素と比較 してより安定であることが確認されている。実施例４ 液体状態のアルカリプロテアーゼの貯蔵安定性を、続いて、水性スラリー洗剤 配合物中にある本発明の安定な結晶化アルカリプロテアーゼ配合物と比較した。 １０％（ｖ／ｖ）の酵素結晶化剤（塩化ナトリウム）を含む安定結晶化酵素含 有液体組成物を実施例１に記載のとおりに得た。 結晶を続いて約５００００００ＤＵ／ｇに、マイクロフィルトレーションを用 いて米国特許第５２５６５５７号に記載されたとおりに濃縮した。 続いて、結晶濃縮物の１部（ｗ／ｗ）（１００ｇ）を４部（ｗ／ｗ）のスラリ ー洗剤ベース（４００ｇ）と混合し、洗剤ベース中にＯＰＴＩＣＬＥＡＮ Ｌ− １０００のプロテアーゼ活性（１００００００ＤＵ／ｇ）に相当する活性を有す る洗剤ベース中のアルカリプロテアーゼ結晶を生成した。 ここにおいて試験された水性スラリー洗剤配合物はＤＯＢＵＬＥ ＰＯＷＥＲ ＳＵＲＦ（Ｌｅｖｅｒ Ｂｒｏｔｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．）として 知られている市販の配合物である。この配合物は活性液体酵素を含んでいる。こ のように、試験されるべきアルカリプロテアーゼの洗剤配合物への添加の前に、 この洗剤配合物中に前から存在する酵素を、洗剤スラリーを６０℃で全ての活性 酵素が破壊されるまで加熱することにより不活性化させた（１０分間）。この残 存水性スラリー洗剤配合物を、本発明の配合物の安定性の試験のためのベースと なる洗剤配合物として続いて用いた。 液体ＯＰＴＩＣＬＥＡＮ Ｌ−１０００もまた、実施例２記載のとおりに得た 。 本発明の結晶化状態のアルカリプロテアーゼを有する液体組成物およびＯＰＴ ＩＣＬＥＡＮ Ｌ−１０００の両方の、それぞれの試料を３７℃で、選択された 時間的間隔（表３で特定）で取りやめられるまで保温し、アルカリプロテアーゼ 活性を記述された手順に従って、米国特許第５２５６５５７号の実施例１におい て特定された条件下で測定した。 結果を表３にまとめる。 スラリー洗剤配合物中のアルカリプロテアーゼ結晶の貯蔵安定性における顕著 な改善は、配合物中の十分量の酵素結晶化剤、すなわちＮａＣｌ（結晶濃縮物由 来）の存在による結晶構造の維持によるものであろう。 アルカリプロテアーゼ結晶のマイクロフィルター濃縮物は１０％（ｗ／ｖ）の 塩化ナトリウムを含有する。２０％（ｗ／ｖ）のアルカリプロテアーゼ結晶マイ クロフィルター濃縮物を含有する洗剤スラリー配合物は、２％（ｗ／ｖ）の、貯 蔵の間にアルカリプロテアーゼ結晶の再可溶化を防いだであろう塩化ナトリウム を含有している。実施例５ 水性洗剤スラリー配合物（ＤＯＵＢＬＥ ＰＯＷＥＲ ＳＵＲＦ）を得、上記 実施例４のとおりに熱処理（その酵素を不活性化させるために）した。 液体ＯＰＴＩＣＬＥＡＮ Ｌ−１０００もまた、実施例２記載のとおりに得た 。 １０％（ｖ／ｖ）の酵素結晶化剤（塩化ナトリウム）を含む安定結晶化酵素含 有液体組成物を実施例１に記載のとおりに得た。 ９９ｇのスラリー洗剤ベースの試料の各々に、１ｇの液体アルカリプロテアー ゼ（１００００００ＤＵ／ｇ）または１ｇの安定結晶酵素含有液体組成物の何れ かを添加した。その結果生成された水性スラリー洗剤配合物は、統一されている 濃度へ混合された。初期活性を確認した後、これらの試料を３７℃で貯蔵した。 試料を時期的に取りやめ（以下の表４に示されるように）、活性を、記述された 手順に従って、米国特許第５２５６５５７号の実施例１において特定された条件 下で測定した。 結果を表４に示す。 表４の参照により見られる結果は、アルカリプロテアーゼが塩化ナトリウムに よって安定化されていない場合は急速な酵素の不活性化が生じていることを示し ている。塩化ナトリウム結晶と組み合わされたアルカリプロテアーゼ結晶を含む スラリー洗剤中の活性の喪失は、塩化ナトリウム結晶と組み合わされていない（ 安定化されていない）アルカリプロテアーゼ結晶を含むスラリー洗剤中の活性の 喪失と比較して、顕著に低かった。 表４の結果は、スラリー洗剤組成物中において用いられた安定化された結晶化 酵素は活性の喪失を有することを示しているが、これは配合物中の低濃度の塩化 ナトリウムによる、スラリー洗剤配合物中における結晶の低速での再可溶化によ るものであろうと信じられていることに注意されたい。このように、洗剤配合物 中での改善された酵素の安定性が、結晶状態にある酵素を適当な濃度の酵素結晶 化剤とともに取り込むことにより成された。 本発明の安定な酵素含有液体組成物およびその製造方法の変更は、本発明の基 本の精神から離れることなく成され得るであろう。従って、当業者にとって、添 付されたクレームの範囲内で、本発明がここに特定して記載された以外にも実施 できるであろうことは理解されるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 パテル，チマンバイ ピー アメリカ合衆国 インディアナ州 46545 ミシャワカ オールド ベッドフォード トレイル 54304

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．酵素をその不溶性状態となるようにし、液体配合物において、不溶性状態に ある酵素と不溶性状態にある酵素を維持する薬剤とを組合せ、それにより安定な 酵素含有液体組成物を作成することから成る、安定な酵素含有液体組成物の製造 方法。 ２．前記酵素をその不溶性状態となるようにする工程が、酵素が結晶形をとるよ うに酵素を結晶化させることから成ることを特徴とする請求の範囲第１項記載の 方法。 ３．前記液体配合物において組み合わせる工程が、液体配合物において、酵素結 晶と、結晶状態にある酵素を維持するための酵素結晶化剤とを組合せ、それによ り安定な酵素含有液体配合物を生成することから成ることを特徴とする請求の範 囲第２項記載の方法。 ４．前記結晶化剤が塩化ナトリウムであることを特徴とする請求の範囲第３項記 載の方法。 ５．前記酵素がプロテアーゼであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方 法。 ６．前記酵素がセリンプロテアーゼであることを特徴とする請求の範囲第１項記 載の方法。 ７．前記セリンプロテアーゼがアルカリプロテアーゼであることを特徴とする請 求の範囲第１項記載の方法。 ８．前記液体配合物が水性配合物であり、それにより水性組成物が生成されるこ とを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。 ９．前記液体配合物が洗剤配合物であることを特徴とする請求の範囲第１項記載 の方法。 10．酵素を結晶化し、それにより結晶状態を有する酵素を提供し、水性洗剤配合 物において、結晶化酵素と結晶化状態にある酵素を維持するための結晶化剤とを 組合せ、それにより安定な酵素含有水性洗剤組成物を生成することから成る、安 定な酵素含有水性洗剤組成物の製造方法。 11．少なくとも１つの不溶性状態にある酵素、不溶性状態にある酵素を維持する ための薬剤および液体配合物を含み、そこにおいて前記不溶性状態にある酵素と 前記薬剤が、前記酵素が安定でありその酵素活性が保持されているように組み合 わされていることを特徴とする安定な酵素含有液体組成物。 12．前記不溶性状態にある酵素が結晶酵素であることを特徴とする請求の範囲第 １１項記載の酵素含有液体組成物。 13．前記不溶性状態にある酵素を維持するための薬剤が結晶化剤であることをさ らに特徴とする請求の範囲第１２項記載の酵素含有液体組成物。 14．前記結晶化剤が塩化ナトリウムであることを特徴とする請求の範囲第１３項 記載の酵素含有液体組成物。 15．前記酵素がプロテアーゼであることを特徴とする請求の範囲第１１項記載の 酵素含有液体組成物。 16．前記酵素がセリンプロテアーゼであることを特徴とする請求の範囲第１１項 記載の酵素含有液体組成物。 17．前記セリンプロテアーゼがアルカリプロテアーゼであることを特徴とする請 求の範囲第１１項記載の酵素含有液体組成物。 18．前記液体配合物が水性配合物であり、それにより水性組成物が生成されるこ とを特徴とする請求の範囲第１１項記載の酵素含有液体組成物。 19．前記液体配合物が洗剤配合物であり、それにより洗剤組成物が生成されるこ とを特徴とする請求の範囲第１１項記載の酵素含有液体組成物。 20．少なくとも１つの結晶酵素、結晶状態にある酵素を維持するための薬剤およ び水性洗剤配合物を含み、そこにおいて前記結晶酵素と前記薬剤が、前記酵素が 結晶状態を維持し、その酵素活性が保持されているように組み合わされているこ とを特徴とする安定な酵素含有液体組成物。