ES2329875T3 - Procedimiento de preparacion de un polipeptido il-18 fisiologicamente activo. - Google Patents
Procedimiento de preparacion de un polipeptido il-18 fisiologicamente activo. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2329875T3 ES2329875T3 ES01958830T ES01958830T ES2329875T3 ES 2329875 T3 ES2329875 T3 ES 2329875T3 ES 01958830 T ES01958830 T ES 01958830T ES 01958830 T ES01958830 T ES 01958830T ES 2329875 T3 ES2329875 T3 ES 2329875T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- caspase
- baselineskip
- human
- polypeptide
- precursor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 61
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 54
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 11
- 101710090333 Caspase-5 Proteins 0.000 claims abstract description 66
- 102100038916 Caspase-5 Human genes 0.000 claims abstract description 65
- 101710090338 Caspase-4 Proteins 0.000 claims abstract description 59
- 102100025597 Caspase-4 Human genes 0.000 claims abstract description 59
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 58
- 101000960954 Homo sapiens Interleukin-18 Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 102000043959 human IL18 Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 26
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 13
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 abstract description 2
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 description 84
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 description 82
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 61
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 41
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 30
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 29
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 29
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 28
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 28
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 28
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 26
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 24
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 23
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 23
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 21
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 21
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 20
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 16
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 15
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 14
- 108010066496 Ubiquitin-Specific Proteases Proteins 0.000 description 13
- 102000018390 Ubiquitin-Specific Proteases Human genes 0.000 description 13
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 13
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 12
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 11
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 11
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 11
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 11
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 11
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 11
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 11
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 10
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 10
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 9
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 8
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 7
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 7
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 7
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007989 BIS-Tris Propane buffer Substances 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N bis-tris propane Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCCNC(CO)(CO)CO HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 6
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 6
- 101000933112 Homo sapiens Caspase-4 Proteins 0.000 description 5
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 5
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 5
- XSYUPRQVAHJETO-WPMUBMLPSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidaz Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 XSYUPRQVAHJETO-WPMUBMLPSA-N 0.000 description 4
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 150000002411 histidines Chemical group 0.000 description 4
- 102000051832 human CASP4 Human genes 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000001477 Deubiquitinating Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108010093668 Deubiquitinating Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 3
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 3
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 3
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 2
- 101000741072 Homo sapiens Caspase-5 Proteins 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000050388 human CASP5 Human genes 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M rubidium chloride Chemical compound [Cl-].[Rb+] FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical group 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000809257 Homo sapiens Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 101150106931 IFNG gene Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 1
- 239000006391 Luria-Bertani Medium Substances 0.000 description 1
- 108090000143 Mouse Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100427359 Mus musculus Usp4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000000447 Th1 cell Anatomy 0.000 description 1
- 102100038463 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 4 Human genes 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N aebsf Chemical compound NCCC1=CC=C(S(F)(=O)=O)C=C1 MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 description 1
- UUVBYOGFRMMMQL-UHFFFAOYSA-N calcium;phosphoric acid Chemical compound [Ca].OP(O)(O)=O UUVBYOGFRMMMQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002570 interstitial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000012263 liquid product Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000031942 natural killer cell mediated cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- -1 prodominium Proteins 0.000 description 1
- 238000001814 protein method Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 229940102127 rubidium chloride Drugs 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Un procedimiento de producción de un polipéptido IL-18 humano activo a partir de un polipéptido precursor de IL-18 humana, que comprende: (i) Co-expresar bicistrónicamente la caspasa 4 o la caspasa 5 con el polipéptido precursor de IL-18 humana usando un vector de expresión bicistrónica que comprende una secuencia que codifica el precursor de IL- 18 humana seguido de una secuencia que codifica la caspasa 4 o la caspasa 5 separado por una región intergénica que incluye una secuencia Shine-Delgarno; y (ii) Purificar el polipéptido activo.
Description
Procedimiento de preparación de un polipéptido
IL-18 fisiológicamente activo.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para producir un polipéptido fisiológicamente activo
y, más particularmente, a un procedimiento para producir
IL-18 humana activa.
IL-18, también conocida como
factor que induce interferón-\gamma, es una nueva
citoquina recientemente descubierta. IL-18 activa
contiene 157 restos de aminoácidos. Está dotada de potentes
actividades biológicas, entre ellas la inducción de la producción
de interferón-\gamma por células T y esplenocitos,
la intensificación de la actividad asesina de las células NK y la
promoción de la diferenciación de células T CD4+ vírgenes en
células Th1. Además, IL-18 humana aumenta la
producción de GM-CSF y disminuye la producción de
IL-10. También se ha observado que la
IL-18 tiene mayor poder para inducir
interferón-\gamma que IL-12 y
genera la señal a través de un receptor diferente y utiliza una
ruta característica para la transducción de la señal.
IL-18, la secuencia nucleotídica
codificante de la misma, y ciertas propiedades químicas y
fisicoquímicas de la proteína purificada son conocidas (Ushio, S.,
et al., 1996, J. Immunology, 156,
4274-4279; Dinarello, C.A., et al. 1998, J.
Leukocyte Biology, 1998. 63, 658-664).
En el documento de EE.UU. 5.192.324, Kabushiki
Kaisha Hayashibara Seibutsu Kayaku Kenkyujo ("Hayashibara"),
que corresponde a la EP 0692536, publicado el 17 de Enero de 1996,
se divulga una proteína de ratón que induce la producción de
IFN-gamma por células inmunocompetentes,
caracterizándose además la proteína por tener propiedades
fisicoquímicas y una secuencia de aminoácidos parcialmente definida.
También se divulga una proteína que tiene una secuencia de 157
aminoácidos, dos fragmentos de la misma, ADN (471 pb (pares de
bases)) codificante de la proteína, hibridomas, métodos de
purificación de la proteína y métodos para detectar la proteína.
El documento de EE.UU. 6.214.584, de
Hayashibara, que corresponde al EP 0712931, publicada el 22 de Mayo
de 1996, divulga una proteína humana de 157 aminoácidos y homólogos
de la misma, ADN que codifica la proteína, transformantes,
procedimientos para preparar la proteína, anticuerpos monoclonales
contra la proteína, hibridomas, métodos de purificación de la
proteína, métodos para detectar la proteína y métodos de tratamiento
y/o prevención de tumores malignos, enfermedades víricas,
enfermedades infecciosas bacterianas y enfermedades inmunes.
El documento de WO 97/24441, de Incyte
Pharmaceuticals, Inc., publicado el 10 de Julio de 1997, divulga una
proteína de 193 aminoácidos que corresponde al precursor de
IL-18 y a ADN codificante.
En las células humanas, los polipéptidos
formados por la expresión de genes pueden ser procesados por enzimas
intracelulares para ser parcialmente digeridos y recibir cadenas de
azúcar. Los polipéptidos que se incorporarán satisfactoriamente en
productos farmacéuticos pueden ser los que fueron procesados del
mismo modo que en las células humanas. Se sabe que la mayoría de
las citoquinas se producen habitualmente como precursores sin
actividad biológica, y después son procesados por las enzimas
intracelulares para convertirse en polipéptidos activos.
El polipéptido IL-18 existe
habitualmente en las células humanas en forma de un precursor de 193
aminoácidos y sin actividad biológica. El precursor de
IL-18 se denomina también
Pro-IL-18. Un procedimiento para
producir IL-18 activa a partir de su precursor está
descrito en la Patente de EE.UU. 5.879.942, de Hayasihibara, que
corresponde a la Patente Europea EP 0819757, publicada el 21 de
Enero de 1998. La patente divulga una enzima o una proteína que
convierte un precursor de IL-18 en
IL-18 activa.
Otro procedimiento para producir
IL-18 activa a partir de su precursor está descrito
en la Patente de EE.UU. Nº 5.891.663, de Hayashibara, que
corresponde a la Patente Europea EP 0821005, publicada el 28 de
Enero de 1998. La patente divulga poner en contacto precursor de
IL-18 con la enzima que convierte
interleuquina-1\beta ("ICE"). Las doctrinas
de las patentes y referencias se incorporan por referencia.
El papel de ICE como mediador de apoptosis e
inflamación ha sido estudiado exhaustivamente en la bibliografía.
También se conoce que ICE puede procesar precursores tanto de
interleuquina-1 como de
interleuquina-18 a formas activas (Thornberry, NA,
et al., 1992, Nature 356, 768-774; Ghayur, T
et al., 1997, Nature 386, 619-623).
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere a métodos para
la activación in vitro del precursor de IL-18
humana (también conocido como
Pro-IL-18) con una enzima
activadora, que comprenden poner en contacto el precursor de
IL-18 humana con una enzima activadora, tal como
caspasa 4 o caspasa 5. Más específicamente, la presente invención
proporciona un método por el que la caspasa 4 y la caspasa 5 actúan
sobre un precursor de IL-18 para escindir en un
sitio específico y producir un polipéptido activo que induce la
producción de IFN-\gamma en células
inmunocompe-
tentes.
tentes.
La presente invención se refiere además a
métodos para la activación in vivo del precursor de
IL-18 humana, que comprenden
co-expresar la proteína con una proteasa activadora.
Los autores describen métodos para la activación in vivo de
IL-18 utilizando proteasas tales como caspasa 4,
también conocida como ICE_{REL}II, caspasa 5, también conocida
como ICE_{REL}III, y proteasa específica para ubiquitina, que
actúan sobre un precursor del polipéptido IL-18
para convertirlo en un polipéptido activo que induce la producción
de IFN-\gamma.
La presente invención proporciona un método para
producir polipéptido IL-18 humano de un polipéptido
precursor de IL-18 humana que comprende:
- I)
- Co-expresar bicistrónicamente la caspasa 4 o la caspasa 5 con el polipéptido precursor de IL-18 humana usando un vector de expresión bicistrónica que comprende una secuencia que codifica el precursor de IL-18 humana seguido de una secuencia que codifica la caspasa 4 o la caspasa 5 separado por una región intergénica que incluye una secuencia Shine-Delgarno; y
- II)
- Purificar el polipéptido activo.
\vskip1.000000\baselineskip
La Fig. 1 muestra la secuencia de aminoácidos
del precursor de IL-18 humana (SEQ ID NO:1).
La Fig. 2 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos que codifican la IL-18 humana de longitud
completa (SEQ ID NO:2).
La Fig. 3 muestra la secuencia de aminoácidos de
IL-18 humana activa (SEQ ID NO: 3).
La Fig. 4 muestra la secuencia de aminoácidos de
la caspasa 4 truncada en el extremo N-terminal y
marcada con 6-his (SEQ ID NO:4).
La Fig. 5 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos de la caspasa 4
truncada en el extremo N-terminal marcado con
6-his (SEQ ID NO:5).
La Fig. 6 muestra la secuencia de aminoácidos de
la caspasa 5 truncada en el extremo N-terminal
marcada con 6-his (SEQ ID NO:6).
La Fig. 7 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos de la caspasa 5
truncada en el extremo N-terminal marcada con
6-his (SEQ ID NO:7).
La Fig. 8 es una diagrama esquemático de una
caja de expresión bicistrónica contenida dentro de
pET28-ProIL-18/Casp 4 para la
co-expresión de
Pro-IL-18 y caspasa 4 truncada en
E. coli.
La Fig. 9 muestra una secuencia de la caja de
expresión de Pro-IL-18/Caspasa 4
dentro de pET28 (SEQ ID NO:8).
La Fig. 10 muestra la secuencia anotada de la
caja de expresión de
Pro-IL-18/Caspasa 4. La numeración
corresponde a la posición dentro del vector pET28a.
La Fig. 11 muestra la inducción de
Pro-IL-18/Caspasa 4.
La Fig. 12 es un diagrama esquemático de la caja
de expresión bicistrónica contenida dentro de
pET28-Pro-IL18/caspasa 5 truncada
para la co-expresión de Pro-IL8 y
caspasa 5 en E. coli.
La Fig 13 muestra una secuencia de la caja de
expresión de Pro-IL-18/Caspasa 5
dentro de pET28 (SEQ ID
NO:9).
NO:9).
La Fig. 14 muestra el diagrama de secuencia
anotado de la caja de expresión de
Pro-IL-18/caspasa-5
truncada que detalla las características de secuencia reguladoras y
la traducción de Pro-IL-18 y caspasa
5 truncada. La numeración corresponde a la colocación dentro del
vector pET28a.
La Fig. 15 muestra la inducción de
Pro-IL-18/Caspasa 5.
La Fig. 16 muestra la secuencia de aminoácidos
de Ub-IL-18 (SEQ ID NO: 10).
La Fig. 17 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos de
Ub-IL-18 (SEQ ID NO:11).
La Fig. 18 muestra la secuencia de ácidos
nucleicos de la caja de expresión de
Ub-IL-18/Ubp-1
dentro del vector pET28 (SEQ ID NO:12).
La Fig. 19 muestra la secuencia anotada de
Ub-IL-18/Ubp-1
dentro del vector pET28. La numeración corresponde a la posición
dentro de pET28.
La Fig. 20 muestra la expresión de
Ub-IL-18 y el procesamiento por
Ubp-1.
La Fig. 21 muestra el ensayo de actividad de
IL-18 utilizando células KG-1 (línea
celular mielomonocítica humana) para vigilar la producción de
IFN-\gamma (IL-18 expresada de
varios modos, según se indica).
La Fig. 22 muestra el ensayo de actividad de
IL-18 utilizando PBMC humanas purificadas para
vigilar la producción de IFN-\gamma
(IL-18 expresada de varios modos, según se
indica).
\vskip1.000000\baselineskip
Las caspasas 4 y 5 son miembros de una familia
de cisteína-proteasas que incluyen la enzima que
convierte interleuquina-1\beta (ICE), que escinde
preferentemente substratos que contienen un segmento de activación
de proteasa que comprende la secuencia de aminoácidos XEYD, donde X
se selecciona de un grupo de aminoácidos formado por W, L, F, Y, I,
V, D ó E; E es ácido glutámico; Y se selecciona de un grupo de
aminoácidos formado por H, I, A, T, S, P ó E; y D es ácido
aspártico (Munday, N.A., et al., 1995, J. Biol. Chemistry,
270, 15870-15876; Talanian, R.V. et
al., 1997, J. Biol. Chemistry 272,
9677-82; Thornberry, N.A. et al. 1997 J.
Biol. Chemistry 272, 17907-11). El reconocimiento
del substrato por caspasa-5 se piensa que es
esencialmente el mismo para ICE y caspasa-4 y
distinto de otros miembros de la familia caspasa (Talanian, R.V.
et al, 1997, J. Biol. Chemistry 272,
9677-82; Thornberry, N.A. et al. 1997 J.
Biol. Chemistry 272, 17907-11). Caspasa 4 está
divulgada en el documento EP-B-0 754
234. Caspasa 5 está divulgada en los documentos de EE.UU. 5.552.536
y 5.760.180.
Las proteasas específicas para ubiquitina son
una familia de enzimas independientes de ATP que pueden escindir
con precisión el péptido ubiquitina de 76 aminoácidos,
evolutivamente conservado, en el extremo N de proteínas que están
fusionadas a él. Estas proteasas escinden específicamente el enlace
peptídico entre el resto de aminoácido carboxi terminal de una
proteína ubiquitina y el grupo \alpha-amino de
cualquier proteína no ubiquitina a la que está unida ubiquitina.
Las proteasas específicas para ubiquitina procedentes de
Saccharomyces cerevisiae, Ubp1, Ubp-2 y
Ubp-3, por ejemplo, son conocidas y se pueden
expresar recombinantemente para catalizar reacciones de
desubiquitinación que ocurren específicamente en proteínas de fusión
de ubiquitina, tanto in vivo como in vitro (Baker, RT
et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:
23364-23375; Baker, RT et al., 1994 J. Biol.
Chem. 269: 25381-25386). La especificidad de
proteasas específicas para ubiquitina de Saccharomyces
cerevisiae permite la separación precisa de ubiquitina de
cualquier péptido con la excepción de los que empiezan por prolina.
La proteasa específica para ubiquitina de otras especies tales como
Unp de ratón y su homólogo humano, Unph, son capaces de producir
una escisión eficaz incluso delante de prolina (Gilchrist CA et
al. 1997, J. Biol. Chem. 272:32280-32285). Así,
se puede generar virtualmente cualquier extremo N deseado mediante
la separación de un péptido ubiquitina fusionado con precisión
cuando se combina in vitro o se co-expresa
con proteasas específicas para ubiquitina. Las proteasas específicas
para ubiquitina están descritas en los documentos de EE.UU.
5.212.058; 5.683.904; 5.391.490 y 5.494.818.
En la presente invención, se puede utilizar
cualquier caspasa 4, caspasa 5 o ubiquitina proteasa ya sea natural
o producida por medios artificiales, con tal que produzcan
polipéptidos activos que induzcan la producción de
IFN-\gamma en células inmunocompetentes,
independientemente de sus estructuras, fuentes y orígenes.
En células humanas, los polipéptidos formados
por expresión de genes se pueden procesar por enzimas
intracelulares. Las enzimas intracelulares escinden las proteínas
precursoras, tales como Pro-IL-18,
dando su forma activa. Los polipéptidos que se incorporan
satisfactoriamente en productos farmacéuticos tendrán que recibir
procesamiento similar al procesamiento que reciben los polipéptidos
en las células humanas. En las células humanas existen
habitualmente polipéptidos en forma de un precursor y carecen de
actividad biológica. Se sabe que la mayoría de las citoquinas,
entre ellas el polipéptido IL-18, son producidas
habitualmente como precursores que carecen de actividad biológica,
y después son procesadas por enzimas intracelulares que las
convierten en los polipéptidos activos.
El precursor de IL-18 que se ha
mencionado ya en la presente invención existe, por ejemplo, en
células que producen inherentemente el polipéptido, en células
hospedantes mamíferas, y en un sistema bacteriano, tal como E.
coli, transformado por introducción de un ADN, por ejemplo, un
ADN con la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO:2, que contiene una
región que codifica el polipéptido. Utilizando dichas células
hospedantes mamíferas y bacterianas, el precursor de
IL-18 puede ser co-expresado con
proteasas para generar IL-18 activa.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere a métodos para
la activación in vitro de un polipéptido precursor, tal como
el precursor de IL-18, que comprende poner en
contacto el polipéptido precursor con una enzima activadora.
La presente invención se refiere a un método
para la activación in vitro del precursor de
IL-18 humana que comprende poner en contacto el
precursor de IL-18 humana con caspasa 4 o caspasa
5.
El precursor de IL-18 se activa
in vitro por escisión con la enzima activadora que reconoce
un segmento de activación de proteasa específico que comprende la
secuencia de aminoácidos XEYD, en la que X se
selecciona de un grupo de aminoácidos formado por W, L, F, Y, I, V,
D ó E; e Y se selecciona de un grupo de aminoácidos formado
por H, I, A, T, S, P ó E.
El precursor de IL-18 se puede
activar in vitro por escisión del enlace peptídico entre el
ácido aspártico 36 y la tirosina 37 en SEQ ID NO:1 con caspasa 4 o
caspasa 5 para producir un polipéptido activo que induce la
producción de IFN-\gamma en células
inmunocompetentes.
Genéricamente, la caspasa 4 o la caspasa 5 se
puede obtener a partir de células, que la producen inherentemente,
y transformantes obtenidos por aplicación de la tecnología del ADN
recombinante. Ejemplos de dichas células son las que se
establecieron a partir de células mamíferas y humanas tales como las
células epiteliales, células endoteliales, células intersticiales,
células cartilaginosas, monocitos, granulocitos, linfocitos, y
líneas celulares establecidas de las anteriores. Ejemplos de los
transformantes incluyen microorganismos y células animales
transformados obtenidos introduciendo un ADN que codifica caspasa 5
en microorganismos y células animales. Caspasa 4 o caspasa 5 se
prepara cultivando estos transformantes en medios convencionales de
cultivo utilizados en este campo, ya sea tratándolos con
ultrasonido en forma de cultivos intactos o después de separarlos
de los cultivos o remojando los transformantes en disolventes
hipotónicos, aplicando al residuo celular resultante o a mezclas
que contienen sobrenadantes del cultivo y residuo celular las
siguientes técnicas convencionales utilizadas para purificar
enzimas en este campo; intercambio de sal, diálisis, filtración,
concentración, sedimentación separadora, cromatografía de
intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel,
cromatografía de adsorción, cromatografía isoeléctrica,
cromatografía hidrófoba, cromatografía en fase reversa,
cromatografía de afinidad, electroforesis en gel y electroenfoque.
Se pueden utilizar dos o más de estos métodos de purificación de
forma combinada. El ADN que codifica caspasa 4 (Fig. 5) (SEQ ID
NO:5) y caspasa 5 (Fig. 7) (SEQ ID NO:7) y los transformantes que
producen caspasa 4 y caspasa 5 son conocidos en la técnica. Por
ejemplo, las enzimas pueden ser producidas en forma activa en E.
coli por expresión de péptidos truncados en el extremo
N-terminal que carecen de la región pro, como se ha
descrito (Munday NA et al., 1996, J. Biol. Chem
26:15870-76).
Las células que producen el polipéptido
precursor, tales como Pro-IL-18,
inherentemente o las que fueron transformadas para producir el
precursor se cultivan en un medio de cultivo nutritivo. Los medios
de cultivo preferidos incluyen los medios de cultivo bien conocidos
en la técnica, tales como medio Luria-Bertani u otro
medio rico para cultivar E. coli que comprende triptona y
extracto de levadura.
Caspasa 4 o caspasa 5, obtenida utilizando el
método anterior, se deja que coexista en los cultivos resultantes o
se añade a las mezclas resultantes o residuo celular después de
lisar las células proliferadas, separadas o no separadas de los
cultivos. La cantidad de caspasa 4 o caspasa 5 requerida es menor
que la cantidad equimolar del precursor. La caspasa 4 o caspasa 5
se pone en contacto con el precursor a temperaturas y pH que
permiten que la caspasa 4 o caspasa 5 actúe sobre el precursor,
habitualmente, se deja reaccionar la caspasa 4 o caspasa 5 con el
precursor hasta que se forma la cantidad deseada de polipéptido
activo a partir del material precursor a temperaturas de
aproximadamente 4º a 40ºC y pH de aproximadamente 6 a 9. La
temperatura preferida es aproximadamente 25ºC y el pH preferido es
aproximadamente 7,2. Así, pueden obtenerse mezclas de reacción que
contienen el polipéptido activo.
La actividad de caspasa 4 o caspasa 5 puede ser
analizada y expresada por unidades de actividad de acuerdo con los
\mug de polipéptido procesado producidos por \mug de caspasa 4 o
caspasa 5 por minuto.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere además a
métodos para la activación in vivo de un polipéptido
precursor, tal como un precursor de IL-18, que
comprende co-expresar la proteína con una proteasa
activadora. También se describen métodos para la activación in
vivo de IL-18, que comprenden la
co-expresión bicistrónica de polipéptidos, tales
como IL-18, con proteasas, tales como caspasa 4,
también conocida como ICE_{REL}II, caspasa 5, también conocida
como ICE_{REL}III, y ubiquitina.
En una realización preferida, la caspasa 4
humana, también conocida como ICE_{REL}II, se
co-expresa bicistrónicamente con
Pro-IL-18 humano para permitir el
procesamiento in vivo de
Pro-IL-18 en IL-18
activa.
En otra realización preferida, la caspasa 4
humana truncada (SEQ ID NO. 4), se co-expresa
bicistrónicamente con Pro-IL-18
humana para permitir el procesamiento in vivo de
Pro-IL-18 (SEQ ID NO:1) en
IL-18 activa (SEQ ID NO:3).
En otra realización preferida, la caspasa 5
humana, también conocida como ICE_{REL}III, se
co-expresa bicistrónicamente con
Pro-IL-18 humano para permitir el
procesamiento in vivo de
Pro-IL-18 en IL-18
activa (SEQ ID NO:3).
La ubiquitina proteasa 1 (Ubp-1)
se puede co-expresar bicistrónicamente con
ubiquitina-IL-18
(Ubp-IL-18) para el procesamiento
in vivo de UB-IL-18 en
IL-18 activa, por ejemplo (SEQ ID NO:9) en
IL-18 activa (SEQ ID NO. 3).
La caspasa 5 humana truncada (SEQ ID NO. 5), se
puede co-expresar bicistrónicamente con
Pro-IL-18 humano para permitir el
procesamiento in vivo de
Pro-IL-18 (SEQ ID NO:1) en
IL-18 activa (SEQ ID NO:3).
Un ADN que codifica caspasa 4 o caspasa 5 y un
ADN que codifica un precursor del polipéptido son introducidos
ambos en una célula hospedante bacteriana o mamífera apropiada para
transformarla. En este caso, la caspasa 4 o caspasa 5, formada por
la expresión del ADN, actúa sobre un precursor del polipéptido,
formado por la expresión del ADN en el mismo transformante, para
formar un polipéptido activo (Figuras 11 y 15). Las células
hospedantes preferidas son líneas celulares epidérmicas,
intersticiales, neuroblásticas o hematopoyéticas, que proceden de
seres humanos, monos, ratones y hámsteres y se utilizan
convencionalmente como hospedantes, tales como las células 3T3,
incluidas las células 3T3-Swiss albino (ATCC CCL
92), células C1271 (ATCC CRL 1616), células CHO, incluidas las
células CHO-K1 (ATCC CCL 61), células
CV-1 (ATCC CCL 70), células COS, incluidas las
células COS-1 (ATCC CCL 1650), células HeLa (ATCC
CCL 2), células MOP, entre ellas las células MOP-8
(ATCC CRL 1709) y mutantes de las mismas. Las células hospedantes
más preferidas son E. coli. El método más preferido para
introducir ADN que codifica caspasa 4 o caspasa 5 y un ADN que
codifica un precursor del polipéptido en E. coli es la
transformación química con cloruro de rubidio, que es bien conocida
en la técnica. Los métodos para introducir un ADN codificante de
caspasa 4 o caspasa 5 y un ADN codificante de un precursor del
polipéptido en células hospedantes mamíferas incluyen el método
convencional de DEAE-dextrano, el método del ácido
fosfórico-calcio, electroporación, lipofección,
microinyección, y el método de infección vírica utilizando
retrovirus, adenovirus, herpesvirus y vaccinia virus. En este caso,
los vectores tales como pCD, pcDL-SR\alpha, pKY4,
pCDM8, pCEV4, pME18S y pSV2-gpt, incluidos los
promotores, intensificadores, orígenes de replicación, sitios de
terminación, secuencias de corte y empalme, secuencias de
poliadenilación y/o marcadores de selección apropiados, pueden ser
utilizados siguiendo las técnicas clásicas descritas en Ausubel FM
et al., 1994 Current Protocols in Molecular Biology, New
York: Greene Publishing Assoc. y Wiley Interscience. Los clones que
producían un polipéptido activado, según se observó por detección
inmunológica, fueron seleccionados eligiendo el clon deseado a
partir de transformantes después del cultivo en medios de cultivo
nutritivos. Pueden obtenerse cultivos que contienen el polipéptido
activo pueden ser obtenidos cultivando el transformante clonado con
cultivo nutritivo convencional utilizado en este campo. En cuando a
las células que producen inherentemente un precursor del
polipéptido y las demás células que fueron transformadas para
producir el polipéptido, pueden producir el precursor junto con
enzimas activadoras, que activan el polipéptido, tales como caspasa
4, caspasa 5 y ubiquitina. Las tecnologías de ADN recombinante
utilizando células hospedantes mamíferas están descritas
detalladamente en Glutzman, Cell, 23:175 (1981) Mullingan,
PNAS78:2072 (1981). Las tecnologías de ADN recombinante utilizando
células hospedantes bacterianas están descritas en Protein
Expression: A Practical Approach, compiladores S.J. Higgins y B.D.
Hames, 1999, New York, Oxford University Press.
Si bien las mezclas de reacción y los cultivos
resultantes que contienen un polipéptido IL-18
activo pueden ser utilizados intactos como un inductor de
IFN-\gamma, en una realización preferida, las
células contenidas en los cultivos se rompen por ultrasonidos, por
enzimas de lisis de células y/o tensioactivos, y seguidamente se
separa el polipéptido de las células resultantes y el residuo
celular por filtración, centrifugación, etc., siguiendo
procedimientos industriales clásicos descritos en Protein
Purification: Principles and Practice, compilador Cantor, C.R.
1993, New York, Springer-Verlag. El polipéptido
libre de células y residuo celular puede ser purificado por métodos
convencionales de purificación utilizados para purificar sustancias
biológicamente activas en este campo, por ejemplo, intercambio de
sal, diálisis, filtración, concentración, sedimentación separadora,
cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en
gel, cromatografía de adsorción, cromatografía isoeléctrica,
cromatografía hidrófoba, cromatografía de fase inversa,
cromatografía de afinidad, electroforesis en gel y electroenfoque.
Si es necesario, se pueden utilizar combinadamente dos o más de
estos métodos de purificación. El polipéptido purificado resultante
puede concentrarse y liofilizarse formando un producto líquido o
sólido que cumpla con sus usos finales.
Las cajas de expresión bicistrónicas de la
presente invención son vectores versátiles que se pueden utilizar
para el procesamiento in vivo de prácticamente cualquier
péptido que contenga los sitios apropiados de reconocimiento para
la escisión por caspasa 4/caspasa 5 o ubiquitinasa, que se han
descrito previamente (Tobias, J.W. et al., Journal of
Biological Chemistry, 1991. 266(18): p.12021.12028;
Talanian, R.V. et al., Journal of Biological
Chemistry, 1997. 272(15): p.9677-9682).
La expresión bicistrónica ofrece ventajas sobre otras estrategias
de co-expresión ya que ambos genes están vinculados
a la misma unidad de transcripción, garantizando la expresión
concordante de ambos genes a lo largo del tiempo. Esto contrasta con
los sistemas plasmídicos dobles en los que un plásmido puede ser
perdido a lo largo del tiempo, o con los sistemas promotores dobles
de un solo plásmido, en los que la expresión puede variar con cada
promotor y de un experimento a otro. En particular, los sistemas de
expresión bicistrónicos descritos aquí se ajustan idealmente a la
activación in vivo de enzimas, citoquinas, factores de
crecimiento y otras proteínas activables proteolíticamente,
permitiendo con ello la producción a gran escala de tales proteínas
a partir de células en un solo paso y eliminando la necesidad de un
paso de activación in vitro separado.
Las proteasas activadoras, caspasa 4 (Ala105 a
Asn377) o caspasa 5 (Ile146 a Asn418), se subclonaron como fusiones
6-His N-terminales inmediatamente
después de la secuencia de Pro-IL-18
con el fin de generar una fusión transcripcional de los dos genes.
Se sitúa una secuencia terminadora de T7 curso abajo de la secuencia
de caspasa 4 para la terminación traduccional de la unidad de
transcripción bicistrónica. También se añadió una pequeña región
intergénica que incluía una secuencia de
Shine-Dalgarno defectuosa para permitir una
iniciación tan sólo mínima de la traducción a partir de la
secuencia de caspasa 4 (Figuras 10 y 14). Otras regiones reguladoras
incluyen una secuencia operadora lac de 25 pares de bases
localizada inmediatamente curso abajo de la región promotora de 17
pares de bases que está unida por el represor lac codificado por una
copia del gen lac-I localizada en el
plásmido, suprimiendo por ello la transcripción basal en ausencia de
ARN polimerasa de T7. Los plásmidos resultantes designados
ProIL18/Casp4 y ProIL18/Casp5 se transfectaron después separadamente
en la cepa de E. coli BL21 (DE3) que contiene una copia
cromosómica inducible del gen de polimerasa de T7.
La transcripción de la caja bicistrónica está
bajo la dirección del promotor de T7, que está controlado por la
proteína ARN polimerasa de fago T7, codificada a partir de una copia
lisógena del gen de ARN polimerasa de T7. Esta copia cromosómica de
polimerasa de T7 está por sí misma bajo el control del promotor
lacUV5, inducible por la adición de
isopropil-1-tio-b-D-galactopiranósido.
La inducción conduce a la transcripción y traducción coordinadas de
Pro-IL-18 e
His-caspasa-4 o
His-caspasa-5. Caspasa 4 o caspasa 5
traducida nacientemente es autoprocesada formando una especie
activa, que inicia la activación proteolítica de
ProIL-18. Tanto el precursor de
IL-18 traducido como la IL-18
activada post-traduccionalmente son principalmente
solubles en el interior de E. coli. La IL-18
activa madura que contiene una tirosina N-terminal
es purificada directamente a partir de los lisados celulares
bacterianos después de la inducción por métodos cromatográficos
convencionales. La escisión para formar IL-18
madura con caspasa 4 es completa en 4 horas a 37ºC o en 18 horas a
29ºC (Figura 11) y la escisión para formar IL-18
madura con caspasa 5 es completa en 18 horas a 29ºC (Figura 15).
Se puede utilizar una caspasa 4 truncada, como
se indica en la FIG. 4 (SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:5), o caspasa 5
truncada, como se indica en la FIG. 5 (SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7).
La truncación de caspasa 4 y caspasa 5 está descrita en Munday,
N.A., et al., 1995, J. Biol. Chemistry, 270,
15870-15876.
Se describe además un método para crear un
polipéptido activo por co-expresión de una proteasa
específica para ubiquitina con una fusión ubiquitina
IL-18 N-terminal (precursor) que se
convierte en la IL-18 activa por la actividad
hidrolasa c-terminal de ubiquitina. Una proteína
ubiquitina de 76 aminoácidos que contiene una tirosina
N-terminal auténtica se fusiona al extremo N maduro
de Il-18 humana y se co-expresa con
una proteasa específica para ubiquitina en E. coli, por
ejemplo como se indica en SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:11. La ubiquitina
es una proteína de 76 restos, altamente conservada, encontrada en
células eucarióticas que funciona para marcar proteínas para
degradación (Baker, R.T., Current Opinion in Biotechnology, 1996.
7(5): p. 541-6). La ubiquitina se escinde
específicamente de proteínas por la acción de proteasas específicas
para ubiquitina que se expresan endógenamente en células
eucarióticas pero que están ausentes en bacterias. La
co-expresión de proteínas fusionadas a ubiquitina
con proteasa específica para ubiquitina en E. coli también
conduce a la separación eficiente de ubiquitina (Baker, R.T. et
al., Journal of Biological Chemistry, 1992. 267(32): p.
23364-75) (Figura 20). Además, la mayoría de estas
enzimas desubiquitinizantes son capaces de escindir delante de
prácticamente cualquier aminoácido a excepción de la prolina. Así,
la escisión de ubiquitina a partir de IL-18 madura
es posible a pesar de la presencia del resto de tirosina aromático
grande en la posición P1'.
La co-expresión de
Ubiquitina-IL-18
(Ub-IL-18) y
Ubiquitina-proteasa-1(Ubp-1)
(Tobias, J.W. et al., Journal of Biological
Chemistry, 1991. 266(18): p.12021.12028) se lleva a cabo
a través de la expresión bicistrónica de los dos genes bajo el
control del promotor de T7 inducible. IL-18 madura
es expresada como una fusión N-terminal con el
péptido ubiquitina de 76 aminoácidos evolutivamente conservado. El
ADNc de Ub-IL-18 se subclona bajo
el control del promotor de ARN polimerasa de T7 dentro del vector
pET28a. Subsiguientemente, el ADNc que codifica la proteasa
específica para ubiquitina de longitud completa se subclona curso
abajo delante de la secuencia terminadora de T7 (Figura 19). Ambos
ADNc de Ub-IL-18 y de la proteasa
específica para ubiquitina se transcriben en un solo transcrito de
mRNA a partir del cual se traducen separadamente las proteínas
Ub-IL-18 y proteasa específica para
ubiquitina.
Como se ha descrito anteriormente, el
polipéptido IL-18 humano activo, obtenido por los
presentes métodos tiene una actividad de inducir la producción de
IFN-\gamma como sustancia biológicamente activa
útil, estimula la producción de IFNg a partir de células
KG-1 (línea celular mielomonocítica humana) (Figura
21) y PBMC humanas purificadas (Figura 22).
Los Ejemplos siguientes explican adicionalmente
pero no limitan la presente invención:
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
El precursor de IL-18 humano fue
expresado como una fusión marcada con seis histidinas
N-terminales en E. coli. El plásmido de
expresión, ProEx-hIL18, derivaba de un vector,
pPROEX-1 (Life Technologies) que contenía el
promotor de Trc e IacIq para la expresión inducible con
isopropil-1-tio-\beta-D-galactopiranósido
(IPTG). Con el fin de construir el vector de expresión
recombinante, se multiplicó por PCR un fragmento de ADN que
contenía el gen entero del precursor de caspasa 5 a partir de un
clon de ADNc, añadiendo una cola 5' con el sitio de reconocimiento
para la endonucleasa de restricción Nde I y una cola 3' con
el sitio de reconocimiento para la endonucleasa de restricción
Bam HI. El producto multiplicado se subclonó entre estos dos
sitios de restricción en pPROEX-, generando así una fusión
N-terminal en marco, estando presente la secuencia
codificante de seis histidinas en el
vector.
vector.
El plásmido resultante se expresó en células
hospedantes de DH10B tras la inducción con IPTG 1 mM durante 5
horas a 37ºC. Se recogió la proteína recombinante a partir de
sedimentos celulares obtenidos después de centrifugar los cultivos
inducidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se suspendieron 1,5 g de células E. coli
que expresaban pro-IL-18 como se
describe en el Ejemplo 1 en 3,6 litros de tampón C de lisis (Tris
HCl 50 mM, BME 10 mM, NaCl 0,5 M, 5% de glicerol, 1 \mug/ml de
pepstatina A, 1 \mug/ml de leupepsina, AEBSF 0,4 mM), se lisaron
por dos pases a través de Microfluidics a 840 kg/cm^{2}, se
centrifugaron a 28.000 g y se recogieron 3,7 l de sobrenadante. Al
sobrenadante, se añadieron 600 ml de NiNTA agarosa preequilibrada
con tampón C que contenía imidazol 5 mM (tampón D), y la suspensión
se incubó durante una hora para capturar
pro-IL-18. La suspensión se
centrifugó a baja velocidad (3.000 rpm), el sobrenadante se
decantó, y la suspensión se cargó en una columna. La columna se lavó
con tampón D y se eluyó pro-IL-18
con imidazol 300 mM en tampón C. El material reunido se dializó en
tampón E (HEPES 25 mM, BME 10 mM, pH 8,0) y se aplicó a una columna
DEAE ToyoPearl 650M equilibrada con el mismo tampón. La columna se
eluyó con un gradiente lineal de NaCl 0 a 0,5 M en tampón E. El
material reunido contenía 650 mg de
pro-IL-18 con pureza superior al
90%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
También se expresó caspasa 4 humana como una
fusión marcada con seis histidinas N-terminales en
E. coli. El plásmido de expresión,
pET16b-caspasa 4, derivaba de un vector pET16b
(Novagen) que contenía el promotor de fago T7. El vector
recombinante se construyó por multiplicación por PCR del dominio
activo de caspasa 4 (aminoácidos Ile146 a Asn418) que incorpora una
secuencia codificante de seis histidinas en el extremo N y
añadiendo una cola con los sitios para las endonucleasas de
restricción Nco I y Xho I. El producto PCR resultante
se subclonó después entre estos dos sitios de restricción para
generar el vector de fusión de seis histidinas
N-terminal- caspasa 4.
El plásmido resultante se transformó en la cepa
de E. coli BL21 DE3 lisógena que contenía una copia
cromosómica de ARN polimerasa de T7 bajo el control del promotor
lacUV5 que permitía la expresión inducible de caspasa 4 después de
inducción con IPTG 1 mM. La proteína activa se purificó a partir de
los sedimentos celulares aislados después de la inducción a 37ºC
durante 3 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Cuando se lisan las células de E. coli
que expresan la caspasa 4 humana marcada con
hexa-his en el extremo N-terminal,
descrita en el Ejemplo 2, se puede detectar actividad de caspasa 4
en el sobrenadante del material lisado. Cuando la proteína es
capturada sobre perlas de agarosa NiNTA a partir del sobrenadante,
se recuperan tanto p10 como p20. Esto indica que se activa el
dominio de proteasa de caspasa 4 durante el cultivo celular
mediante autoescisión en el nexo de unión de p10 y p20 y permanece
como un heterodímero soluble no covalente. Con esta información, se
puede purificar el heterodímero p20/p10 marcado con
hexa-His. El proceso completo se lleva a cabo a 4ºC
para evitar cualquier descomposición adicional de la molécula.
Se suspendieron aproximadamente 400 g de
sedimento celular de E. coli húmedo en 1,6 l de tampón de
lisis que contenía HEPES 25 mM, 0,1% de CHAPS, NaCl 500 mM,
beta-mercaptoetanol (BME) 10 mM a pH 7,4, y 10% de
glicerol (tampón A) y se lisaron por dos pases a través de
Microfluidics a 840 kg/cm^{2}. El lisado se centrifugó a 30.000 g
durante una hora y el sobrenadante del lisado (1,7 l) se recogió. Al
sobrenadante del lisado, se añadió agarosa NiNTA, 150 ml, que se
había pre-equilibrado con tampón de lisis que
contenía imidazol 5 mM, la suspensión se ajustó a pH 8 con NaOH 2 N
y se absorbió por lotes caspasa 4 durante una hora. Se cargó agarosa
NiNTA en la columna, se lavó con imidazol 5 M y 25 mM en tampón A
secuencialmente para separar impurezas, y se eluyó caspasa 5 con
imidazol 300 mM en tampón A. La proteína se dializó contra tampón B
(HEPES 25 mM, 0,1% de CHAPS, 10% de glicerol, BME 10 mM, pH 8,0) y
se aplicó a una columna DEAE ToyoPearl 650M preequilibrada con el
mismo tampón. Se eluyó caspasa 4 a partir de la columna con NaCl
100 mM en el mismo tampón. Se reunieron las fracciones que
presentaban la máxima actividad específica de caspasa 4 utilizando
un substrato peptídico fluorescente, LEED-AMC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
La Pro-IL-18
purificada como se ha descrito en el Ejemplo 2 se incubó con caspasa
4 a una razón 1:500 p/p durante 3 horas a temperatura ambiente. La
reacción de escisión del prodominio se completó en más del 90% de
acuerdo con el análisis SDS-PAGE. A la mezcla de
reacción, se añadieron 140 ml de agarosa NiNTA en tampón D, y ésta
se incubó durante una hora, y se vertió en un embudo de vidrio
sinterizado para recuperar el material no unido que contenía
principalmente IL-18 madura. Pequeñas cantidades del
pro-IL-18 restante, prodominio,
caspasa 4 y otras impurezas se unieron a agarosa NINTA. La solución
no unida se ajustó a DTT 25 mM, se incubó durante una hora para
completar la reacción de reducción, se ajustó el pH de la solución a
6 por adición de ácido fosfórico 2 M y se concentró a 86 ml
utilizando una membrana YM10. La muestra concentrada se aplicó a
una columna Superdex 75 equilibrada con fosfato sódico 10 mM, pH
6,0, que contenía NaCl 0,1 M. Las fracciones reunidas contenían 560
mg de IL-18
madura.
madura.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
También se puede producir activación de
IL-18 in vivo a través de la expresión
simultánea del precursor de IL-18 humano y caspasa
4. Pro-IL-18 es
co-expresado bicistrónicamente en E. coli a
partir de un solo transcrito de caspasa 4 humana dentro del
plásmido de expresión,
pET28-Pro-IL-18/Casp4
(Figuras 5 y 6). El gen de
pro-IL-18 humano es subclonado en
pET28a (Novagen) bajo el control del promotor de T7 que incluye una
secuencia de Shine-Dalgarno eficiente para la
iniciación óptima de la traducción a partir de la secuencia de
Pro-IL-18 (Figura 8). El gen de
caspasa 4 (Ile146 a Asn418) fue subclonado inmediatamente después de
la secuencia Pro-IL-18 que incluía
una secuencia de Shine-Dalgarno defectuosa,
permitiendo una mínima iniciación de la traducción a partir de la
secuencia de caspasa 4. Se incluyó una secuencia terminadora de T7
para la terminación traduccional después de la unidad de
transcripción bicistrónica. La construcción resultante se
transfectó después en un hospedante BL21(DE3) que contenía
una copia cromosómica inducible del gen de polimerasa de T7. La
inducción de esta construcción en este hospedante con IPTG 1 mM dio
como resultado la transcripción y la traducción coordinadas de
pro-IL-18 y
pro-caspasa 4. La pro-caspasa 4
traducida nacientemente se autoprocesa convirtiéndose en una
especie activa que inicia la activación proteolítica de
pro-IL-18. La Figura 8 muestra un
curso de tiempo de activación de IL-18 a lo largo de
18 horas a 29ºC después de inducción con IPTG 1 mM (0 a 18
horas).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
La activación in vivo de caspasa 4 está
descrita en Munday, N.A., et al., 1995, J. Biol. Chemistry,
270, 15870-15876. La expresión de una forma truncada
de caspasa 4 que empieza en Ala 59, que carece de la
pro-región en E. coli, conduce a
autoactivación por escisión en las subunidades P10 y P20, que se
conectan formando un heterodímero enzimático activo. La demora en
la activación de caspasa 4 se traduce en una demora en la escisión
y activación de Pro-IL-18 a
IL-18 madura (Figura 9). Esto permite la acumulación
del Pro-IL-18 más estable antes de
su escisión a IL-18 madura, que es menos estable en
las células.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Se suspendieron 66 mg de células E. coli
que expresan IL-18 como se ha descrito en el Ejemplo
6 en 130 ml de HEPES 0,1 M pH 7,5 que contiene EDTA 1 mM y DTT 10
mM (todo el proceso se realizó a 4ºC y en presencia de DTT 10 mM
excepto el último paso para mantener SH libre) y se lisaron a 1.050
kg/cm^{2} por dos pases utilizando Microfluidics. El lisado (230
ml) se centrifugó a 34.000 xg durante 30 minutos. El sobrenadante
(200 ml) se diluyó a 1 l con HEPES 25 mM pH 7,0 y se hizo fluir a
través de dos columnas en tándem, ToyoPearl SP 650M y ToyoPearl
DEAE 650M. Muchas de las impurezas derivadas de las células de E.
coli se unieron a las columnas. El material eluido se ajustó a
pH 0,5 con bistris-propano 25 mM, se diluyó a 2 l y
se aplicó a una columna Source 15Q equilibrada con
bistris-propano HCl 25 mM pH 9,5. La columna se
eluyó con un gradiente lineal de 0 a 0,5 M de NaCl en el mismo
tampón. Las fracciones que contenían IL-18 fueron
identificadas utilizando RP-HPLC Vydac C4 y se
reunieron (250 ml). Los materiales reunidos se concentraron a 50 ml
utilizando membrana YM10 y se aplicaron a una columna Superdex 75
que se había equilibrado previamente con NaPO4 10 mM pH 6,0 que
contenía EDTA 1 mM y NaCl 0,15 mM (sin DTT para uso in
vivo).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
También se expresó caspasa 5 truncada humana
como una fusión marcada con Hexa-histidina
N-terminal en E. coli. El plásmido de
expresión, pET16b-caspasa 5 truncada, derivaba de un
vector pET16b (Novagen) que contenía el promotor de fago T7. El
vector recombinante fue construido por multiplicación PCR del
dominio activo de caspasa 5 truncada (aminoácidos Ile146 a Asn418)
que incorporaba una secuencia codificante de 6 histidinas en el
extremo N-terminal y añadiendo una cola con los
sitios para las endonucleasas de restricción Nco I y
Xho I. Después, el producto PCR resultante se subclonó entre
estos dos sitios de restricción para generar el vector de fusión
Hexa-histidina
N-terminal-caspasa 5 truncada.
El plásmido resultante se transformó en la cepa
de E. coli BL21 DE3 lisógena que contenía una copia
cromosómica de ARN polimerasa de T7 bajo el control del promotor
lacUV5 que permitía la expresión inducible de caspasa 5 truncada
después de la inducción con IPTG 1 mM. La proteína activa fue
purificada a partir de sedimento celular aislado después de la
inducción a 37ºC durante 3 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
Cuando se lisan células de E. coli que
expresan la caspasa 5 truncada humana marcada con
Hexa-his en el extremo N-terminal,
descrita en el Ejemplo 9, se puede detectar actividad de caspasa 5
truncada en el sobrenadante del lisado. Cuando la proteína es
capturada sobre perlas de agarosa NiNTA a partir del sobrenadante,
se recuperan tanto p10 como p20. Esto indica que el dominio de
proteasa de la caspasa 5 truncada es activado durante el cultivo
celular mediante autoescisión en el nexo de unión de p10 y p20 y
permanece como un heterodímero soluble no covalente. Con esta
información, se puede purificar el heterodímero p20/p10 marcado
hexa-His. Todo el proceso se lleva a cabo a 4ºC
para evitar cualquier descomposición adicional de la molécula.
Se suspendieron aproximadamente 400 g de
sedimento celular de E. coli húmedo en 1,6 l de tampón de
lisis que contenía HEPES 25 mM, 0,1% de CHAPS, NaCl 500 mM,
beta-mercaptoetanol (BME) 10 mM a pH 7,4, y 10% de
glicerol (tampón A) y se lisaron por dos pases a través de
Microfluidics a 840 kg/cm^{2}. El lisado se centrifugó a 30.000 g
durante una hora y el sobrenadante del lisado, 1,7 l, se recogió. Al
sobrenadante del lisado, se añadió agarosa NiNTA, 150 ml, que se
había preequilibrado con tampón de lisis que contenía imidazol 5 mM,
la suspensión se ajustó a pH 8 con NaOH 2 N y se absorbió por lotes
caspasa 5 durante una hora. Se cargó agarosa NiNTA en la columna,
se lavó con imidazol 5 M y 25 mM en tampón A secuencialmente para
separar impurezas, y la caspasa 5 eluyó con imidazol 300 mM en
tampón A. La proteína se dializó contra tampón B (HEPES 25 mM, 0,1%
de CHAPS, 10% de glicerol, BME 10 mM, pH 8,0) y se aplicó a una
columna DEAE ToyoPearl 650M preequilibrada con el mismo tampón. La
caspasa 5 truncada se eluyó de la columna con NaCl 100 mM en el
mismo tampón. Se reunieron las fracciones que presentan la máxima
actividad específica de caspasa 5 truncada utilizando substrato
peptídico fluorescente,
LEED-AMC.
LEED-AMC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
El Pro-IL-18
preparado y purificado como se ha descrito en los Ejemplos 1 y 2 se
incubó con caspasa 5 truncada en una relación 1:500 p/p durante 3
horas a temperatura ambiente. La reacción de escisión del prodominio
fue completa en más del 90% según el análisis
SDS-PAGE. A la mezcla de reacción, se añadieron 140
ml de agarosa NiNTA en tampón D, ésta se incubó durante una hora y
se vertió en un embudo de vidrio sinterizado para recuperar el
material no unido que contenía principalmente IL-18
madura. Pequeñas cantidades del
pro-IL-18 restante, prodominio,
caspasa 5 truncada y otras impurezas quedaron unidas a agarosa
NINTA. La solución no unida se ajustó a DTT 25 mM, se incubó
durante una hora para completar la reacción de reducción, se ajustó
el pH de la solución a 6 por adición de ácido fosfórico 2 M y se
concentró a 86 ml utilizando membrana YM10. La muestra concentrada
se aplicó a una columna Superdex 75 equilibrada con fosfato sódico
10 mM pH 6,0 que contenía NaCl 0,1 M. Las fracciones reunidas
contenían 560 mg de IL-18 madura.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
12
También se puede conseguir la activación de
IL-18 in vivo mediante la expresión
simultánea del precursor de IL-18 humano y caspasa
5 truncada. Se co-expresó bicistrónicamente
Pro-IL-18 en E. coli a partir
de un solo transcrito con caspasa 5 truncada humana dentro del
plásmido de expresión, pET28-ProIL18/Casp5 (Figura
9). El gen de pro-IL-18 humano se
subclona en pET28a (Novagen) bajo el control del promotor de T7 que
incluye una secuencia de Shine-Dalgarno eficiente
para la iniciación óptima de la traducción a partir de la secuencia
de Pro-IL-18 (Figura 10). El gen de
caspasa 5 truncada (Ile146 a Asn418) se subclonó inmediatamente
después de la secuencia de
Pro-IL-18 que incluía una secuencia
de Shine-Dalgarno defectuosa, que permitía una
mínima iniciación de la traducción a partir de la secuencia de
caspasa 5 truncada. Se incluyó una secuencia terminadora de T7 para
la terminación traduccional después de la unidad de transcripción
bicistrónica. Después, la construcción resultante se transfectó en
un hospedante BL21(DE3) que contenía una copia cromosómica
inducible del gen de polimerasa de T7. La inducción de esta
construcción en este hospedante con IPTG 1 mM dio como resultado la
transcripción y la traducción coordinadas de
pro-IL-18 y
pro-caspasa 5. Pro-caspasa 5
traducida nacientemente se autoprocesa formando una especie activa
que inicia la activación proteolítica de
pro-IL-18.
\newpage
Ejemplo
13
Se suspendieron 66 g de células E. coli
que expresaban IL-18 como se ha descrito en el
Ejemplo 12 en 130 ml de HEPES 0,1 M pH 7,5 que contenía EDTA 1 mM y
DTT 10 mM (todo el proceso se realizó a 4ºC y en presencia de DTT
10 mM excepto el último paso para mantener SH libre) y se lisaron a
1.050 kg/cm^{2} por dos pases utilizando Microfluidics. El lisado
(230 ml) se centrifugó a 34.000 g durante 30 minutos. El
sobrenadante (200 ml) se diluyó a 1 l con HEPES 25 mM pH 7,0 y se
hizo fluir a través de dos columnas en tándem, ToyoPearl SP 650M y
ToyoPearl DEAE 650M. Muchas de las impurezas derivadas de las
células de E. coli se unieron a las columnas. El material
eluido se ajustó a pH 9,5 con bistris-propano 25 mM,
se diluyó a 2 l y se aplicó a una columna Source 15Q equilibrada
con bistris-propano HCl 25 mM pH 9,5. La columna se
eluyó con un gradiente lineal de NaCl 0 a 0,5 M en el mismo tampón.
Las fracciones que contenían IL-18 se identificaron
utilizando RP-HPLC Vydac C4 y se reunieron (250
ml). Las fracciones reunidas se concentraron a 50 ml utilizando la
membrana YM10 y se aplicaron a una columna Superdex 75 que se
preequilibró con NaPO4 10 mM pH 6,0 que contenía EDTA 1 mM y NaCl
0,15 M (sin DTT para uso in vivo).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
14
La secuencia codificante de ubiquitina de 76
aminoácidos se fusiona en marco con el principio de
IL-18 humana madura mediante ligación de extremos
romos tal que el primer codón de tirosina de la
IL-18 madura va inmediatamente seguido del codón de
glicina 76 de ubiquitina. La fusión génica se subclona después en un
vector pET bajo el control del promotor de T7 que incluye una
secuencia de Shine-Dalgarno eficiente para
iniciación óptima de la traducción a partir de la secuencia génica
de ubiquitina-IL-18. El gen
Ubp-1 de longitud completa se subclona
inmediatamente después de IL-18 que incluye una
secuencia de Shine-Dalgarno defectuosa para
traducción mínima de Ubp-1. La Fig. 11 muestra la
secuencia de la caja de expresión de
UbIL-18/Ubp-1 dentro de pET28. La
Fig. 13 muestra la secuencia anotada de
UbIL-18/Ubp-1 dentro de pET28. La
numeración corresponde a la posición dentro de pET28.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
15
La construcción del Ejemplo 14 se transfectó
después en un hospedante BL21(DE3). La inducción con IPTG 1
mM dio como resultado la transcripción y la traducción coordinadas
de ubiquitina-IL-18 y
Ubp-1. La acción enzimática de
Ubp-1 condujo al procesamiento eficiente de
Ub-IL-18 a IL-18
activa madura que después se puede purificar directamente a partir
de lisados de E. coli por métodos convencionales. La Figura
16 ilustra el curso de tiempo de la expresión y el procesamiento de
IL-18 a 30ºC y 37ºC después de inducción con IPTG 1
mM. La flecha superior indica la parte de
UB-IL-18 no procesada en la Calle 1.
La flecha inferior indica la porción de IL-18
procesada en la Calle 3 (detección por transferencia Western
utilizando antisueros
anti-IL-18).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
16
Se suspendieron 66 g de células E. coli
que expresan IL-18 como se describe en el Ejemplo 15
en 130 ml de HEPES 0,1 M pH 7,5 que contiene EDTA 1 mM y DTT 10 mM
(todo el proceso se efectúa a 4ºC y en presencia de DTT 10 mM
excepto el último paso para mantener SH libre) y se lisaron a 1.050
kg/cm^{2} (103.421 kPa) por dos pases utilizando Microfluidics.
El lisado (230 ml) se centrifugó a 34.000 xg durante 30 minutos. El
sobrenadante (200 ml) se diluyó a 1 l con HEPES 25 mM pH 7,0 y se
pasó a través de dos columnas en tándem, ToyoPearl SP 650M y
ToyoPearl DEAE 650M. Muchas de las impurezas derivadas de las
células de E. coli se unieron a las columnas. El material
eluido se ajustó a pH 9,5, con bistris-propano 25
mM, se diluyó a 2 l y se aplicó a una columna Source 15Q
equilibrada con bistris-propano HCl 25 mM pH 9,5. La
columna se eluyó con un gradiente lineal de NaCl de 0 a 0,5 M en el
mismo tampón. Las fracciones que contenían IL-18 se
identificaron utilizando RP-HPLC Vydac C4 y se
reunieron (250 ml). El material reunido se concentró a 50 ml
utilizando una membrana YM10 y se aplicó a una columna Superdex 75
que se había preequilibrado con NaPO4 10 mM pH 6,0 que contenía
EDTA 1 mM y NaCl 0,15 M (sin DTT para uso in vivo).
<110> SMITHKLINE BEECHAM CORPORATION
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROCEDIMIENTO DE PREPARACIÓN DE UN
POLIPÉPTIDO IL-8 FISIOLÓGICAMENTE ACTIVO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P51137
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> A SER ASIGNADO
\vskip0.400000\baselineskip
<141> con la presente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/211.832
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
15-06-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/224.128
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
10-08-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/264.923
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
30-01-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 193
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 582
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 157
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 282
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 849
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 282
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 849
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1743
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1464
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 233
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 702
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3419
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
Claims (3)
1. Un procedimiento de producción de un
polipéptido IL-18 humano activo a partir de un
polipéptido precursor de IL-18 humana, que
comprende:
- (i)
- Co-expresar bicistrónicamente la caspasa 4 o la caspasa 5 con el polipéptido precursor de IL-18 humana usando un vector de expresión bicistrónica que comprende una secuencia que codifica el precursor de IL-18 humana seguido de una secuencia que codifica la caspasa 4 o la caspasa 5 separado por una región intergénica que incluye una secuencia Shine-Delgarno; y
- (ii)
- Purificar el polipéptido activo.
2. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que el polipéptido IL-18 humano activo es un
polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID
NO:3.
3. Un procedimiento según la reivindicación 1 o
reivindicación 2, en el que la caspasa 4 tiene la secuencia de
aminoácidos de la SEQ ID NO:4 o la caspasa 5 tiene la secuencia de
aminoácidos de la SEQ ID NO:6.
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US21183200P | 2000-06-15 | 2000-06-15 | |
| US211832P | 2000-06-15 | ||
| US22412800P | 2000-08-10 | 2000-08-10 | |
| US224128P | 2000-08-10 | ||
| US26492301P | 2001-01-20 | 2001-01-20 | |
| US264923P | 2001-01-20 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2329875T3 true ES2329875T3 (es) | 2009-12-02 |
Family
ID=27395664
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES01958830T Expired - Lifetime ES2329875T3 (es) | 2000-06-15 | 2001-06-11 | Procedimiento de preparacion de un polipeptido il-18 fisiologicamente activo. |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7186528B2 (es) |
| EP (1) | EP1292697B1 (es) |
| JP (1) | JP5121109B2 (es) |
| KR (1) | KR20030022144A (es) |
| CN (1) | CN100390281C (es) |
| AR (1) | AR033979A1 (es) |
| AT (1) | ATE437234T1 (es) |
| AU (2) | AU2001280442B2 (es) |
| BR (1) | BR0111692A (es) |
| CA (1) | CA2412730C (es) |
| CZ (1) | CZ20024085A3 (es) |
| DE (1) | DE60139316D1 (es) |
| DK (1) | DK1292697T3 (es) |
| ES (1) | ES2329875T3 (es) |
| HU (1) | HUP0501002A3 (es) |
| IL (2) | IL153422A0 (es) |
| MX (1) | MXPA02012292A (es) |
| MY (1) | MY136526A (es) |
| NO (1) | NO330682B1 (es) |
| NZ (1) | NZ522845A (es) |
| PL (2) | PL366134A1 (es) |
| PT (1) | PT1292697E (es) |
| SI (1) | SI1292697T1 (es) |
| WO (1) | WO2001098455A2 (es) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL356836A1 (en) * | 2000-02-10 | 2004-07-12 | Abbott Laboratories | Antibodies that bind human interleukin-18 and methods of making and using |
| TW200510454A (en) | 2003-04-15 | 2005-03-16 | Smithkline Beecham Corp | Conjugates comprising human IL-18 and substitution mutants thereof |
| CA2535799A1 (en) | 2003-08-15 | 2005-03-03 | University Of Florida | Identification of porphyromonas gingivalis virulence polynucleotides for diagnosis, treatment, and monitoring of periodontal diseases |
| US7968684B2 (en) | 2003-11-12 | 2011-06-28 | Abbott Laboratories | IL-18 binding proteins |
| MXPA06005837A (es) * | 2003-11-24 | 2007-01-26 | Novo Nordisk As | Proteinas de fusion y metodos de desdoblamiento de tales proteinas. |
| PL1793859T3 (pl) * | 2004-08-20 | 2009-08-31 | Smithkline Beecham Corp | Leczenie zapalenia śluzówki jamy ustnej i jelit przez podawanie ludzkiej IL-18 |
| WO2008033499A2 (en) | 2006-09-14 | 2008-03-20 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Modulation of regulatory t cells by human il-18 |
| AR065803A1 (es) * | 2007-03-23 | 2009-07-01 | Smithkline Beecham Corp | Uso de un polipeptido de il- 18 humana y un anticuerpo anti- cd para preparar unmedicamento |
| KR101940430B1 (ko) | 2014-08-07 | 2019-01-18 | 가꼬우호우징 효고 이카다이가쿠 | Il-18과 분자 표적 항체를 병용하는 암 치료약 |
| JP2019023165A (ja) * | 2015-12-11 | 2019-02-14 | 国立大学法人京都大学 | インターロイキン−１８活性阻害剤 |
| US20190070262A1 (en) | 2017-09-06 | 2019-03-07 | Yale University | Interleukin-18 variants and methods of use |
| KR20200080749A (ko) * | 2018-12-27 | 2020-07-07 | 주식회사 폴루스 | N-말단의 메티오닌이 절단된 목적 단백질 발현용 유전자 발현 카세트 및 이를 이용하여 n-말단의 메티오닌이 절단된 목적 단백질을 생산하는 방법 |
| JP2025508823A (ja) | 2022-02-23 | 2025-04-10 | ブライト ピーク セラピューティクス エージー | 免疫抗原特異的ｉｌ－１８免疫サイトカイン及びその使用 |
Family Cites Families (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5985863A (en) * | 1996-09-12 | 1999-11-16 | Vertex Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for decreasing IGIF and IFN-γ production by administering an ICE inhibitor |
| US6204261B1 (en) * | 1995-12-20 | 2001-03-20 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Inhibitors of interleukin-1β Converting enzyme inhibitors |
| US5192324A (en) | 1982-02-18 | 1993-03-09 | Howmedica Inc. | Bone prosthesis with porous coating |
| ATE247708T1 (de) * | 1986-10-02 | 2003-09-15 | Massachusetts Inst Technology | Verfahren zur regulierung der metabolischen stabilität von proteinen |
| US5212058A (en) | 1990-05-09 | 1993-05-18 | Massachusetts Institute Of Technology | Nucleic acid encoding ubiquitin-specific proteases |
| ATE121454T1 (de) | 1990-05-09 | 1995-05-15 | Massachusetts Inst Technology | Ubiquitinspezifische protease. |
| US5914254A (en) | 1993-08-02 | 1999-06-22 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Expression of fusion polypeptides transported out of the cytoplasm without leader sequences |
| US6110701A (en) | 1994-04-08 | 2000-08-29 | Merck Frosst Canada & Co. | DNA encoding precursor of interleukin-1β converting enzyme--related cysteine proteinase II (ICErel -II) |
| US5552536A (en) | 1994-04-08 | 1996-09-03 | Merck Frosst Canada, Inc. | DNA encoding precursor of interleukin-1 beta converting enzyme - related cysteine proteinase III (ice rel-III) |
| DE69519454T2 (de) | 1994-07-14 | 2001-05-03 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo, Okayama | Protein, das Interferon-Gamma Herstellung induziert und monoklonaler Antikörper dagegen |
| JP2724987B2 (ja) | 1994-11-15 | 1998-03-09 | 株式会社林原生物化学研究所 | インターフェロン−γの産生を誘導するポリペプチド |
| TW581771B (en) | 1994-11-15 | 2004-04-01 | Hayashibara Biochem Lab | Recombinant production of a polypeptide for inducing interferon-gamma production, and monoclonal antibody against the polypeptide |
| US6074050A (en) | 1997-12-03 | 2000-06-13 | Hewlett-Packard Company | Method and apparatus for venting an ink container |
| CA2238885A1 (en) | 1995-12-29 | 1997-07-10 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acids encoding interferon gamma inducing factor-2 |
| JPH1080270A (ja) * | 1996-07-19 | 1998-03-31 | Hayashibara Biochem Lab Inc | ポリペプチドをプロセッシングする酵素 |
| JP4010606B2 (ja) * | 1996-07-25 | 2007-11-21 | 株式会社林原生物化学研究所 | ポリペプチドの製造方法 |
| TW515843B (en) | 1996-07-25 | 2003-01-01 | Hayashibara Biochem Lab | Process for producing an active polypeptide inducing interferon-γ production |
| US6054487A (en) | 1997-03-18 | 2000-04-25 | Basf Aktiengesellschaft | Methods and compositions for modulating responsiveness to corticosteroids |
| WO1999037793A1 (en) * | 1998-01-23 | 1999-07-29 | Novo Nordisk A/S | Process for making desired polypeptides in yeast |
-
2001
- 2001-06-11 PL PL01366134A patent/PL366134A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2001-06-11 DE DE60139316T patent/DE60139316D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-11 NZ NZ522845A patent/NZ522845A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-06-11 US US10/311,491 patent/US7186528B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-11 IL IL15342201A patent/IL153422A0/xx active IP Right Grant
- 2001-06-11 DK DK01958830T patent/DK1292697T3/da active
- 2001-06-11 CZ CZ20024085A patent/CZ20024085A3/cs unknown
- 2001-06-11 PL PL387774A patent/PL208592B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2001-06-11 PT PT01958830T patent/PT1292697E/pt unknown
- 2001-06-11 JP JP2002504604A patent/JP5121109B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-11 MX MXPA02012292A patent/MXPA02012292A/es active IP Right Grant
- 2001-06-11 AT AT01958830T patent/ATE437234T1/de active
- 2001-06-11 KR KR1020027016834A patent/KR20030022144A/ko not_active Ceased
- 2001-06-11 BR BR0111692-4A patent/BR0111692A/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-06-11 WO PCT/US2001/018804 patent/WO2001098455A2/en not_active Ceased
- 2001-06-11 AU AU2001280442A patent/AU2001280442B2/en not_active Ceased
- 2001-06-11 CN CNB018112781A patent/CN100390281C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-06-11 AU AU8044201A patent/AU8044201A/xx active Pending
- 2001-06-11 HU HU0501002A patent/HUP0501002A3/hu unknown
- 2001-06-11 ES ES01958830T patent/ES2329875T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-11 EP EP01958830A patent/EP1292697B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-11 SI SI200130942T patent/SI1292697T1/sl unknown
- 2001-06-11 CA CA2412730A patent/CA2412730C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-13 AR ARP010102818A patent/AR033979A1/es active IP Right Grant
- 2001-06-14 MY MYPI20012804A patent/MY136526A/en unknown
-
2002
- 2002-12-12 IL IL153422A patent/IL153422A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-12-13 NO NO20026002A patent/NO330682B1/no not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-04-11 US US11/402,187 patent/US7442526B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU781342B2 (en) | Preparation of biologically active molecules | |
| US7875709B2 (en) | Nucleic acids encoding interleukin-18 mutants | |
| AU2017225787A1 (en) | T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof | |
| NZ239895A (en) | Polypeptides with protease activity for interleukin 1beta and their production and use | |
| US7442526B2 (en) | Method for preparing a physiologically active IL-18 polypeptide | |
| AU2001280442A1 (en) | Method for preparing a physiologically active IL-18 polypeptide | |
| NO323623B1 (no) | Isolert og renset TNF-<alfa>-omdannende enzym (TACE)-polypeptid med evnen til a omdanne TNF-<alfa> fra formen pa 26 kD til formen pa 17 kD, isolerte og rensede antistoffer, fremgangsmate for pavisning av den TACE-inhiberende aktivitet til et molekyl, isolert nukleinsyre, ekspresjonsvektor, vertcelle, fremgangsmate for fremstilling av et TNF-<alfa>-omdannende enzym (TACE)- polypeptid, anvendelse av TNF-<alfa>-omdannende enzym (TACE)- polypeptid for fremstilling av et medikament for behandling av tumorer, inflammasjon eller fertilitetsforstyrrelser. | |
| US20100099142A1 (en) | Processing of Peptides and Proteins | |
| CN117801123A (zh) | 沃索利肽可溶性中间体、中间体制备方法及沃索利肽的制备方法 | |
| HK1055138B (en) | Method for preparing a physiologically active il-18 polypeptide | |
| ZA200209955B (en) | Method for preparing a physiologically-18-polypeptide. | |
| CN116254283A (zh) | 一种单次跨膜蛋白的跨膜域的制备方法 | |
| CN112522242A (zh) | 寨卡病毒丝氨酸蛋白酶在去除重组蛋白亲合标签中的应用 | |
| JP4010606B2 (ja) | ポリペプチドの製造方法 | |
| CN115960244B (zh) | 重组α-1,3-半乳糖基转移酶及其制备方法和应用 | |
| KR102009709B1 (ko) | 융합 폴리펩타이드를 이용하여 인간 부갑상선 호르몬 1-84를 생산하는 방법 | |
| KR100266753B1 (ko) | 인간 알파 s1 카제인 유전자로 형질전환된 대장균 |