ES2335211T3 - Separacion de polipeptidos comprendiendo un aminoacido racemizado. - Google Patents
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Abstract
Método para separar las dos formas de un polipéptido que tiene una única racemización de aminoácido, donde las dos formas de un polipéptido que tiene una única racemización de aminoácido son A(X) y A(X*), donde X es un L-aminoácido, A(X) es un polipéptido que comprende el aminoácido X, X* es el D-isómero de X, A(X*) es un polipéptido que comprende el aminoácido X* pero por el contrario idéntico a A(X), dicho método caracterizado por el hecho de ser un proceso de cromatografía de intercambio de iones comprendiendo la elución mediante el aumento de la concentración de sal a un pH que es no mayor de 1 unidad de pH de una pKa de X bajo las condiciones de elución.
Description
Separación de polipéptidos comprendiendo un
aminoácido racemizado.
La presente invención se refiere al campo de
purificación de proteína. En particular, la invención se refiere a
un método para separar polipéptidos donde un aminoácido es
racemizado.
Los polipéptidos están siendo usados cada vez
más como medicamentos para el tratamiento de enfermedades en todas
las principales áreas de terapia. El tratamiento de la diabetes por
administración crónica de insulina ha sido practicada durante más de
80 años, y usos terapéuticos de polipéptidos en trastornos del
crecimiento y cáncer también han sido practicados durante muchos
años.
Procesos económicos para la producción a gran
escala de polipéptidos con una pureza suficientemente alta para usos
terapéuticos son cruciales para que las terapias adicionales basadas
en polipéptidos alcancen el mercado masivo y para que las terapias
existentes se vuelvan mucho más usadas.
Los polipéptidos para aplicaciones terapéuticas
deben ser altamente purificados para ser eficaces y para
proporcionar la certeza de no provocar eventos adversos al
administrarse a pacientes. Varias fases de tratamiento usadas en la
síntesis y purificación de polipéptidos son conocidas por causar la
racemización de uno o más residuos de aminoácidos en el polipéptido
objetivo. Normalmente, estas condiciones son pH extremos y
temperaturas altas, p. ej. valores de pH encima de pH 12 (Senderoff
et al. J. Pharm. Sci. 87, 183-189 (1998)).
Las variantes de polipéptidos que tienen un residuo de aminoácido
racemizado son capaces de separación e identificación por técnicas
analíticas del estado de la técnica. Estas variantes son indeseables
en polipéptidos para uso terapéutico debido a preocupaciones de
toxicidad y porque éstas pueden tener actividad diferente que el
polipéptido deseado. No obstante, es un desafío serio el hecho de
separar
estos polipéptidos cercanamente relacionados en la escala preparatoria, es decir, durante la producción industrial.
estos polipéptidos cercanamente relacionados en la escala preparatoria, es decir, durante la producción industrial.
La purificación de un polipéptido de una mezcla
es una fase que es normalmente usada varias veces durante el proceso
de fabricación global para un polipéptido terapéutico. La
cromatografía de intercambio de iones es frecuentemente aplicada en
las fases de separación temprana y en bruto, mientras que la
cromatografía en fase líquida de alta presión de fase inversa
(RP-HPLC) es el método preferido para la separación
industrial de alta resolución de polipéptidos relacionados en las
fases de purificación finales. RP-HPLC ha
demostrado ser versátil para la purificación a gran escala de muchos
polipéptidos pero el proceso es relativamente caro y tiene capacidad
limitada.
Stueber W. et al. (Int. J. Peptide
Protein Res., 22, 277-283 (1983)) expone la
purificación del péptido de insulina bovina
B_{20-30} por cromatografía de intercambio de
iones usando una elución de gradiente con acetato amónico y
Senderoff et al. (J. Pharm. Sci., 87, 183-186
(1998)) expone la purificación de GLP-1 por
cromatografía de intercambio de cationes.
Hemos descubierto sorprendentemente un proceso
de intercambio de iones que puede separar los dos polipéptidos
variando el resultado cuando la racemización de un residuo de
aminoácido ha tomado posición. El método es capaz de operación a
gran escala y proporciona una fase de purificación económica con
alta capacidad.
Figura 1. Cromatograma de AU_{280} versus
tiempo (min) de una separación. Pico nº. 1 es la variante
D-his, D-His^{7}
Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7-37)},
Pico nº. 2 es
Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7-37)}.
Figura 2. Cromatograma de AU_{280} versus
tiempo (min) de una separación. Tanto
D-His^{7}Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}E(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7.37)}
como
Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7-37)}
eluye el pico en su mayor parte. La variante D-His
es altamente concentrada en el borde delantero del pico principal y
puede ser separada con pérdida baja de rendimiento por
fraccionamiento o corte del pico.
Figura 3. Cromatograma de AU_{215} versus
volumen (ml) de una separación. Pico nº. 1 contiene la variante
L-His de Exendina-4, Pico nº. 2
contiene la variante D-His de
Exendina-4.
La siguiente es una definición detallada de los
términos usados en la especificación.
El término "tampón" como se utiliza en este
caso se refiere a un compuesto químico que reduce la tendencia del
pH de una solución tal como soluciones cromatográficas a cambiar con
el tiempo como ocurriría en caso contrario. Los tampones incluyen
los ejemplos siguientes no limitativos: acetato sódico, carbonato
sódico, citrato sódico, glicil-glicina, glicina,
histidina, lisina, fosfato sódico, borato,
tris-hidroximetil-aminometano,
etanolamina y sus mezclas derivadas.
El término "modificador orgánico" como se
utiliza en este caso se refiere a un mineral orgánico que se añade a
soluciones cromatográficas. Modificadores orgánicos pueden ser
alcoholes monohídricos, alcoholes polihídricos al igual que nitritos
y cetonas. Ejemplos no limitativos de modificadores orgánicos son
metanol, etanol, 1-propanol,
2-propanol, t-butanol, hexilenglicol
(4-metil-2,4-pentanodiol),
neopentil alcohol (2,2-dimetol-1,3-
propanodiol), acetonitrilo, acetona y úrea.
El término "polipéptido" como se utiliza en
este caso significa un compuesto compuesto por al menos cinco
aminoácidos constituyentes conectados por enlaces peptídicos. Los
aminoácidos constituyentes pueden ser del grupo de los aminoácidos
codificados por el código genético y pueden ser aminoácidos
naturales que no son codificados por el código genético, al igual
que los aminoácidos sintéticos. Aminoácidos naturales que no son
codificados por el código genético son p. ej. hidroxiprolina,
\gamma-carboxiglutamato, ornitina, fosfoserina,
D-alanina y D-glutamina. Aminoácidos
sintéticos comprenden aminoácidos fabricados por síntesis química,
es decir D-isómeros de los aminoácidos codificados
por el código genético tal como D-alanina y
D-leucina, Aib (ácido
\alpha-aminoisobutírico), Abu (ácido
\alpha-aminobutirico), Tle
(terc-butilglicina), y
\beta-alanina. Un polipéptido puede comprender una
única cadena peptídica o puede comprender más de una cadena
peptídica, tal como p. ej. insulina humana donde dos cadenas son
conectadas por enlaces disulfuro.
El término "péptido tipo glucagón" como se
utiliza en este caso se refiere a las exendinas y péptidos homólogos
además del glucagón que son derivados del gen de preproglucagón, es
decir péptido 1 de tipo glucagón (GLP-1), péptido 2
de tipo glucagón (GLP-2), y oxintomodulina (OXM) al
igual que análogos y derivados de los mismos. Los péptidos derivados
del gen de preproglucagón son glucagón, péptido 1 de tipo glucagón
(GLP-1), péptido 2 de tipo glucagón
(GLP-2) y oxintomodulina (OXM). Las exendinas que se
encuentran en el monstruo de Gila son homologas a
GLP-1 y también ejercen un efecto insulinotrópico.
Ejemplos de exendinas son exendina-4 y
exendina-3.
Los péptidos de tipo glucagón tienen las
secuencias siguientes (SEC ID Nos. 1-6):
El término "análogo" como se utiliza en
este caso en referencia a un péptido significa un péptido modificado
donde uno o más residuos de aminoácidos del péptido han sido
sustituidos por otros residuos de aminoácidos y/o donde uno o más
residuos de aminoácidos han sido delecionados del péptido y/o donde
uno o más residuos de aminoácidos han sido delecionados del péptido
y/o donde uno o más residuos de aminoácidos han sido añadidos al
péptido. Esta adición o eliminación de residuos de aminoácidos puede
tener lugar en el N-terminal del péptido y/o en el
C-terminal del péptido. Dos sistemas diferentes y
simples son frecuentemente usados para describir los análogos: por
ejemplo
Arg^{34}-GLP-1(7-37)
o
K34R-GLP-1(7-37)
designa un análogo de GLP-1 donde la lisina que se
origina de forma natural en la posición 34 ha sido sustituida con
arginina (abreviatura estándar de una sola letra para aminoácidos
usados según la nomenclatura de IUPAC-IUB).
El término "derivado" como se utiliza en
este caso en relación con un péptido parental significa una proteína
parental químicamente modificada o un derivado análogo, donde al
menos un sustituyente no está presente en la proteína parental o un
análogo de la misma, es decir una proteína parental que ha sido
modificada de forma covalente. Modificaciones típicas son amidas,
carbohidratos, grupos alquilo, grupos acilo, ésteres, PEGilaciones y
similares. Un ejemplo de un derivado de
GLP-1(7-37) es Arg^{34},
Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil)))-GLP-1(7-37).
El término "un fragmento del mismo" como se
utiliza en este caso en relación con un péptido significa cualquier
fragmento del péptido que tiene al menos el 20% de los aminoácidos
del péptido parental. Así, para albúmina de suero humano un
fragmento comprenderá al menos 117 aminoácidos puesto que la
albúmina de suero humano tiene 585 aminoácidos. En una forma de
realización el fragmento tiene al menos el 35% de los aminoácidos
del péptido parental. En otra forma de realización el fragmento
tiene al menos el 50% de los aminoácidos del péptido parental. En
otra forma de realización el fragmento tiene al menos el 75% de los
aminoácidos del péptido parental.
El término "variante" como se utiliza en
este caso en relación con un péptido significa un péptido modificado
es decir un análogo del péptido parental, un derivado del péptido
parental o un derivado de un análogo del péptido parental.
El término "péptido GLP-1"
como se utiliza en este caso significa
GLP-1(7-37), un análogo de
GLP-1(7-37), un derivado de
GLP-1(7-37) o un derivado de
un análogo de
GLP-1(7-37).
El término "péptido GLP-2"
como se utiliza en este caso significa
GLP-2(1-33), un análogo de
GLP-2, un derivado de GLP
2(1-33) o un derivado de un análogo de
GLP-2(1-33).
El término "péptido de
exendina-4" como se utiliza en este caso
significa exendina-4(1-39),
un análogo de exendina-4, un derivado de
exendina-4 o un derivado de un análogo de
exendina-4.
El término "compuesto de
exendina-4 estable" como se utiliza en este caso
significa una
exendina-4(1-39) químicamente
modificada, es decir un análogo o un derivado que muestra una
semivida de eliminación del plasma in vivo de al menos 10
horas en el hombre, según está determinado por el método siguiente.
El método para determinación de la semivida de eliminación del
plasma de un compuesto de exendina-4 en el hombre
es: el compuesto es disuelto en un tampón isotónico, pH 7.4, PBS o
cualquier otro tampón adecuado. La dosis es inyectada
periféricamente, preferiblemente en el músculo abdominal o muslo
superior. Se toman muestras de sangre para determinar de compuesto
activo a intervalos frecuentes, y durante una duración suficiente
para cubrir la parte de eliminación terminal (p. ej. Predosis, 1, 2,
3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 24 (día 2), 36 (día 2), 48 (día 3), 60
(día 3), 72 (día 4) y 84 (día 4) horas post dosis). La determinación
de la concentración del compuesto activo es realizada como se
describe en Wilken et al., Diabetologia 43(51): A143,
2000. Los parámetros farmacocinéticos derivados se calculan a partir
de los datos de concentración-tiempo para cada
sujeto individual usando métodos no compartimentales, usando el
software comercialmente disponible WinNonlin versión 2.1 (Pharsight,
Cary, NC, USA). La constante de nivel de eliminación terminal se
estima por regresión loglineal en la parte loglineal terminal de la
curva de concentración-tiempo, y se usa para
calcular la semivida de eliminación. El término "péptido tipo
glucagón protegido con DPP-IV" como se utiliza en
este caso significa un péptido de tipo glucagón que es químicamente
modificado en comparación con el péptido natural para volverse dicho
péptido de tipo glucagón más resistente a la dipeptidil
aminopeptidasa-4 peptidasa
(DPP-IV)
del plasma.
del plasma.
El término "compuesto de
exendina-4 inmunomodulado" como se utiliza en
este caso significa un péptido de exendina-4 que es
un análogo o un derivado de
exendina-4(1-39) que tiene
una respuesta inmunitaria reducida en seres humanos en comparación
con exendina-4(1-39). El
método para evaluación de la respuesta inmunitaria es medir la
concentración de anticuerpos reactivos al compuesto de
exendina-4 después de 4 semanas de tratamiento del
paciente.
El término "péptido de insulina" como se
utiliza en este caso significa un péptido que es bien insulina
humana o una insulina humana químicamente modificada, tal como un
análogo o un derivado.
El término "insulina humana" como se
utiliza en este caso significa la hormona humana cuya estructura y
propiedades son conocidas. La insulina humana tiene dos cadenas
polipeptídicas que se conectan por puentes de disulfuro entre
residuos de cisteína, es decir la A-cadena y la
B-cadena. La A-cadena es un péptido
de 21 aminoácidos y la B-cadena es un péptido de 30
aminoácidos, las dos cadenas que se conectan por tres puentes
disulfuro: una entre las cisteínas en posición 6 y 11 de la
A-cadena, la segunda entre la cisteína en posición 7
de la A-cadena y la cisteína en posición 7 de la
B-cadena, y la tercera entre la cisteína en posición
20 de la A-cadena y la cisteína en posición 19 de la
B-cadena.
El término "producto polipeptídico" como se
utiliza en este caso significa el producto de péptido purificado que
debe ser usado para la producción de una composición farmacéutica.
Así, el producto polipeptídico es normalmente obtenido como el
producto de la fase de purificación final, de secado o de
acondicionamiento. El producto puede ser cristales, precipitado,
solución o suspensión. El producto polipeptídico es también conocido
en la técnica como la sustancia del medicamento, es decir el
ingrediente activo farmacéutico.
El término "punto isoeléctrico" como se
utiliza en este caso significa el valor de pH donde la carga neta
global de una macromolécula tal como un polipéptido es cero. En
polipéptidos pueden haber muchos grupos cargados, y en el punto
isoeléctrico la suma de todas estas cargas es cero. A un pH encima
del punto isoeléctrico la carga neta global del polipéptido será
negativa, mientras que a valores de pH debajo del punto isoeléctrico
la carga neta global del polipéptido será positiva.
El término "farmacéuticamente aceptable"
como se utiliza en este caso significa adecuado para aplicaciones
farmacéuticas normales, es decir que no dan lugar a eventos adversos
en pacientes etc.
El término "excipiente" como se utiliza en
este caso significa los compuestos químicos que son normalmente
añadidos a composiciones farmacéuticas, p. ej. tampones, agentes de
tonicidad, conservantes y similares.
El término "cantidad eficaz" como se
utiliza en este caso significa una dosificación que es suficiente
para ser eficaz para el tratamiento del paciente comparado con
ningún tratamiento.
El término "composición farmacéutica" como
se utiliza en este caso significa un producto que comprende un
compuesto activo o un derivado de sal junto con excipientes
farmacéuticos tal como tampón, conservante, y opcionalmente un
modificador de tonicidad y/o un estabilizador. Así una composición
farmacéutica es también conocida en la técnica como una fórmula
farmacéutica.
El término "tratamiento de una enfermedad"
como se utiliza en este caso significa el tratamiento y cuidado de
un paciente que ha desarrollado la enfermedad, condición o
trastorno. El propósito del tratamiento es combatir la enfermedad,
condición o trastorno. El tratamiento incluye la administración de
los compuestos activos para eliminar o controlar la enfermedad,
condición o trastorno al igual que para aliviar los síntomas o
complicaciones asociados a la enfermedad, condición o trastorno.
En un primer aspecto la presente invención se
refiere a un método para separar dos polipéptidos que tienen una
racemización de un único aminoácido, A(X) y A(X*),
donde
X es un L-aminoácido,
A(X) es un polipéptido que comprende el
aminoácido X,
X* es el D-isómero de X,
A(X*) es un polipéptido que comprende el
aminoácido X* pero por el contrario idéntico a A(X), dicho
método caracterizado por ser un proceso de cromatografía de
intercambio de iones que comprende la elución mediante el aumento de
la concentración de sal a un pH que es no superior a aproximadamente
1 unidad de pH de una pKa de X bajo las condiciones de elución.
El polipéptido objetivo y la impureza que
comprende un residuo de aminoácido racemizado son eluidos y
separados por una fase isocrática, asintótica o de aumento lineal en
la concentración de sal del eluyente, o en combinaciones de estas.
La pKa de X puede ser evaluada por valores de pKa tabulados para
residuos de aminoácidos (ver p. ej. Creighton T.E., "Proteins.
Structures and Molecular Properties" página 6, 2ª ed. W.H.
Freeman and Company, N.Y (1993)). La pKa de X puede también ser
evaluada por algoritmos implementados por ordenador conocidos en la
técnica que tienen en cuenta los efectos de residuos de aminoácidos
colindantes en la pKa de X. Otra posibilidad de determinar la pKa de
X es realizar estudios de RMN de la proteína donde se incorpora X.
Es conocido que valores de pKa pueden ser influidos por la
composición de la solución, p. ej. la presencia de un modificador
orgánico puede cambiar la pKa de un residuo de aminoácido.
La cromatografía de intercambio de iones es un
proceso de separación ampliamente aplicado donde la separación es
conseguida basándose en cargas soportadas por moléculas de soluto.
En cromatografía de intercambio de iones el principio de separación
más importante es interacciones iónicas entre la fase estacionaria y
las moléculas solubles que son separadas.
En el modo normal de cromatografía de
intercambio de iones un ciclo completo comprende
a) equilibrado con un tampón de equilibrado para
llevar la columna a un estado donde se prepara para un ciclo,
b) aplicación de la muestra que lleva el
producto,
c) una fase de lavado opcional donde la fase
estacionaria cromatográfica con el producto unido es lavada,
d) elución cuando la concentración de sal
aumentada provoca el decrecimiento de la afinidad del producto hacia
la fase estacionaria de la cromatografía y el producto deja la
columna en el eluato de la columna cromatográfica, y
e) una regeneración opcional donde se intenta
despojar la fase estacionaria cromatográfica de las impurezas
restantes usando una solución de regeneración.
Durante la fase de elución (d) la separación de
diferentes polipéptidos es obtenida recolectando el eluato de la
columna en varios pools. Mediante la recogida apropiada de estos
pools, p. ej. por medición de la AU_{280} (es decir, la
absorbencia a 280 nm) o la conductividad, cada uno de estos pools
contienen predominantemente ciertos polipéptidos. Así, separación se
consigue recolectando estos pools o la parte del eluyente que
contiene predominantemente el polipéptido deseado.
La solución de equilibrado y la muestra para
aplicación pueden contener o no el modificador orgánico. El
modificador orgánico podría ser pero no está limitado a cualquier
alcohol alifático monohídrico (metanol, etanol, propanoles y
butanoles) o un alcohol polihídrico tal como hexilenglicol o alcohol
neopentílico. Componentes de sal para cualquier sección de la
purificación cromatográfica puede ser cualquier sal incluyendo pero
sin limitarse a: NaCl, KCl, NH_{4}Cl, CaCl_{2}, acetato sódico,
acetato potásico, acetato amónico etc. cualquier componente de
tampón puede ser usado incluyendo pero sin limitarse a: tampones
cítricos, tampones de fosfato, tampones de borato, tampones de
carbonato, tampones de acetato, tampones de amonio, tampones de
glicina, tampones de tris-hidroximetil amino metano,
tampones de ácido
4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfónico
etc. Una gama amplia de resinas para cambiar iones cromatográficas
son aplicables, incluyendo pero sin limitarse a Mono Q (Amersham
Biosciences), Source 15Q o 30Q (Amersham Biosciences), Poros 20HQ o
50HQ (Perspective Biosystems), Toyopearl Q650S (Toso Haas) y
otros.
En una forma de realización de la presente
invención el método es para separar dichos polipéptidos en la escala
preparatoria.
En otra forma de realización de la presente
invención la elución se realiza a un pH que es sustancialmente el
mismo que el pH usado para la unión. No obstante, también es posible
realizar la unión, es decir aplicación de la muestra, a la columna a
un pH que no es el mismo que el pH usado para la elución. La unión a
un pH que es diferente del pH usado para la elución implica por
tanto que se realice un ajuste del pH en la columna.
En otra forma de realización de la presente
invención la elución de los polipéptidos se realiza a un pH que es
no mayor de aproximadamente 0.75 unidades de pH de una pKa de X bajo
las condiciones de elución. En otra forma de realización de la
presente invención la elución de los polipéptidos se realiza a un pH
que es no mayor de aproximadamente 1.0 unidades de pH de una pKa de
X bajo las condiciones de elución. En otra forma de realización de
la presente invención la elución de los polipéptidos se realiza a un
pH que es no mayor de aproximadamente 0.5 unidades de pH de una pKa
de X bajo las condiciones de elución. En otra forma de realización
de la presente invención la elución de los polipéptidos se realiza a
un pH que es no mayor de aproximadamente 0.25 unidades de pH de una
pKa de X bajo las condiciones de elución.
En una forma de realización de la presente
invención la elución se realiza a un pH que es superior al punto
isoeléctrico de dichos polipéptidos. En otra forma de realización de
la presente invención la elución se realiza a un pH que es inferior
al punto isoeléctrico de dichos polipéptidos.
En otra forma de realización de la presente
invención el polipéptido tiene un peso molecular inferior a
aproximadamente 10 kDa.
En otra forma de realización de la presente
invención el polipéptido tiene un peso molecular inferior a
aproximadamente 8 kDa.
En otra forma de realización de la presente
invención el polipéptido tiene un peso molecular en la gama de
aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 10 kDa.
En otra forma de realización de la presente
invención el eluyente comprende un modificador orgánico.
En otra forma de realización de la presente
invención el eluyente comprende un modificador orgánico en una
concentración suficiente para mantener dichos polipéptidos
solubles.
En otra forma de realización de la presente
invención el modificador orgánico es etanol.
En otra forma de realización de la presente
invención el modificador orgánico es 2-propanol.
En otra forma de realización de la presente
invención el modificador orgánico es acetonitrilo.
En otra forma de realización de la presente
invención el modificador orgánico es seleccionado del grupo que
consiste en metanol, 1-propanol y hexilenglicol.
En otra forma de realización de la presente
invención el modificador orgánico es alcohol neopentílico.
En otra forma de realización de la presente
invención la concentración del modificador orgánico es de
aproximadamente el 10% hasta aproximadamente el 80%, tal como de
aproximadamente el 20% hasta aproximadamente el 70%, o de
aproximadamente el 30% hasta aproximadamente el 65%.
En otra forma de realización de la presente
invención la sal es seleccionada del grupo que consiste en cloruro
sódico, sulfato sódico, acetato sódico, cloruro potásico, sulfato
potásico, y acetato potásico.
En otra forma de realización de la presente
invención X es el N-terminal o el residuo de
aminoácido C-terminal.
En otra forma de realización de la presente
invención X es L-histidina.
En otra forma de realización de la presente
invención X es un análogo de aminoácido de histidina.
En otra forma de realización de la presente
invención X es seleccionado del grupo que consiste en
desamino-histidina,
2-amino-histidina,
\beta-hidroxi- histidina, homohistidina,
\alpha-fluorometil-histidina y
\alpha-metil-histidina.
En otra forma de realización de la presente
invención X es el residuo de aminoácido
N-terminal.
En otra forma de realización de la presente
invención X es L-fenilalanina.
En otra forma de realización de la presente
invención X es L-lisina.
En otra forma de realización de la presente
invención X es L-arginina.
En otra forma de realización de la presente
invención X es ácido L-aspártico.
En otra forma de realización de la presente
invención X es L-aspargina
En otra forma de realización de la presente
invención X es ácido L-glutámico.
En otra forma de realización de la presente
invención X es L-glutamina.
En otra forma de realización de la presente
invención X es ácido
L-\gamma-carboxiglutámico.
En otra forma de realización de la presente
invención el polipéptido es un péptido de tipo glucagón.
En otra forma de realización de la presente
invención el polipéptido es glucagón, un análogo de glucagón, un
derivado de glucagón o un derivado de un análogo de glucagón.
En otra forma de realización de la presente
invención el péptido de tipo glucagón es GLP-1, un
análogo de GLP-1, un derivado de
GLP-1 o un derivado de un análogo de
GLP-1.
En otra forma de realización de la presente
invención el análogo de GLP-1 es seleccionado del
grupo que consiste en
Arg^{34}-GLP-1(7-37),
Gly^{8}-GLP-1(7-36)-amida,
Gly^{8}-GLP-1(7-37),
Val^{8}GLP-1(7-36)-amida,
Val^{8}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Asp^{22}-GLP-1(7-36)-amida,
Val^{8}Asp^{22}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Glu^{22}-GLP-1(7-36)-amida,
Val^{8}Glu^{22}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Lys^{22}-GLP-1(7-36)-amida,
Val^{8}Lys^{22}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Lys^{22}-GLP-1(7-36)-amida,
Val^{8}Lys^{22}-GLP-1(7-37),
Val^{8}
His^{22}-GLP-1(7-36)-amida, Val^{8}His^{22}-GLP-1(7-37), Val^{8}Trp^{19}Glu^{22}-GLP-1(7-37), Val^{8}Glu^{22}Val^{25}-GLP-1(7-37), Val^{8}
Tyr^{16}Glu^{22}-GLP-1(7-37), Val^{8}Trp^{18}Glu^{22}-GLP-1(7-37), Val^{8}Leu^{16}Glu^{22}-GLP-1(7-37), Val^{8}Tyr^{18}Glu^{22}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Glu^{22}His^{37}-GLP-1(7-37), Val^{8}Glu^{22}Ile^{33}-GLP-1(7-37), Val^{8}Trp^{16}Glu^{22}Val^{25}Ile^{33}-GLP-1(7-37), Val^{8}Trp^{16}Glu^{22}Ile^{33}-GLP-1(7-37), Val^{8}Trp^{16}Glu^{22}Val^{25}Ile^{33}-GLP-1(7-37), Val^{8}Trp^{16}Glu^{22}Val^{25}-GLP-1(7-37), análogos y derivados de cualquiera de estos.
His^{22}-GLP-1(7-36)-amida, Val^{8}His^{22}-GLP-1(7-37), Val^{8}Trp^{19}Glu^{22}-GLP-1(7-37), Val^{8}Glu^{22}Val^{25}-GLP-1(7-37), Val^{8}
Tyr^{16}Glu^{22}-GLP-1(7-37), Val^{8}Trp^{18}Glu^{22}-GLP-1(7-37), Val^{8}Leu^{16}Glu^{22}-GLP-1(7-37), Val^{8}Tyr^{18}Glu^{22}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Glu^{22}His^{37}-GLP-1(7-37), Val^{8}Glu^{22}Ile^{33}-GLP-1(7-37), Val^{8}Trp^{16}Glu^{22}Val^{25}Ile^{33}-GLP-1(7-37), Val^{8}Trp^{16}Glu^{22}Ile^{33}-GLP-1(7-37), Val^{8}Trp^{16}Glu^{22}Val^{25}Ile^{33}-GLP-1(7-37), Val^{8}Trp^{16}Glu^{22}Val^{25}-GLP-1(7-37), análogos y derivados de cualquiera de estos.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra forma de realización de la presente
invención el derivado de GLP-1 o un derivado de un
análogo de GLP-1 tiene un residuo de lisina, tal
como una lisina, donde un sustituyente lipofílico se fija
opcionalmente por medio de un separador al grupo epsilon amino de
dicha lisina.
En otra forma de realización de la presente
invención el sustituyente lipofílico tiene de 8 a 40 átomos de
carbono, preferiblemente de 8 a 24 átomos de carbono, p. ej. 12 a 18
átomos de carbono.
En otra forma de realización de la presente
invención el separador está presente y se selecciona de un
aminoácido, p. ej. beta-Ala, L-Glu,
o aminobutiroilo.
En otra forma de realización de la presente
invención el péptido de tipo glucagón es un péptido de tipo glucagón
protegido con DPPIV.
En otra forma de realización de la presente
invención el péptido de tipo glucagón es un péptido de tipo glucagón
estable en plasma.
En otra forma de realización de la presente
invención el péptido de tipo glucagón es un derivado de un análogo
de GLP-1 que es
Arg^{34}Lys^{26}(N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil)))-GLP-1(7-37).
En otra forma de realización de la presente
invención el péptido de tipo glucagón es un péptido de
GLP-1 que tiene de 22 a 40 residuos de aminoácidos,
preferible de 26 a 36 residuos de aminoácidos, incluso más
preferible de 29 a 33 residuos de aminoácidos.
En una forma de realización de la presente
invención el péptido de tipo glucagón es GLP-2, un
análogo GLP-2, un derivado de GLP-2
o un derivado de un análogo de GLP-2.
En otra forma de realización de la presente
invención el derivado de GLP-2 o un derivado de un
análogo de GLP-2 tiene un residuo de lisina, tal
como una lisina, donde un sustituyente lipofílico opcionalmente por
medio de un separador se fija al grupo epsilon amino de dicha
lisina.
En otra forma de realización de la presente
invención el sustituyente lipofílico tiene de 8 a 40 átomos de
carbono, preferiblemente de 8 a 24 átomos de carbono, p. ej. 12 a 18
átomos de carbono.
En otra forma de realización de la presente
invención el separador está presente y se selecciona de un
aminoácido, p. ej. beta-Ala, L-Glu,
aminobutiroilo.
En otra forma de realización de la presente
invención el péptido de tipo glucagón tiene de 27 a 39 residuos de
aminoácidos, preferible de 29 a 37 residuos de aminoácidos, incluso
más preferible de 31 a 35 residuos de aminoácidos.
En otra forma de realización de la invención el
péptido de tipo glucagón es
Lys^{17}Arg^{30}-GLP-2(1-33)
o
Arg^{30}Lys^{17}N^{\varepsilon}(\beta-Ala(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-2(1-33).
En otra forma de realización de la presente
invención el péptido de tipo glucagón es
Gly^{2}-GLP-2(1-33).
En una forma de realización de la presente
invención el péptido de tipo glucagón es exendina-4,
un análogo de exendina-4, un derivado de
exendina-4, o un derivado de un análogo de
exendina-4.
En otra forma de realización de la presente
invención el péptido de tipo glucagón es
exendina-4.
En otra forma de realización de la presente
invención el derivado de exendina-4 o derivado de un
análogo de exendina-4 es un péptido acilado o un
péptido pegilado.
En otra forma de realización de la presente
invención el péptido de tipo glucagón es un compuesto de
exendina-4 estable.
En otra forma de realización de la presente
invención el péptido de tipo glucagón es un compuesto de
exendina-4 protegido con DPP-IV.
En otra forma de realización de la presente
invención el péptido de tipo glucagón es un compuesto de
exendina-4 inmunomodulado.
En otra forma de realización de la presente
invención el derivado de exendina-4 o derivado de un
análogo de exendina-4 tiene un residuo de lisina,
tal como una lisina, donde un sustituyente lipofílico se fija
opcionalmente por medio de un separador al grupo epsilon amino de
dicha lisina.
En otra forma de realización de la presente
invención el sustituyente lipofílico tiene de 8 a 40 átomos de
carbono, preferiblemente de 8 a 24 átomos de carbono, p. ej. 12 a 18
átomos de carbono.
En otra forma de realización de la presente
invención el separador está presente y se selecciona de un
aminoácido, p. ej. beta-Ala, L-Glu,
o aminobutiroilo.
En otra forma de realización de la presente
invención el péptido de tipo glucagón es un péptido de
exendina-4 que tiene de 30 a 48 residuos de
aminoácidos, de 33 a 45 residuos de aminoácidos, preferible de 35 a
43 residuos de aminoácidos, incluso más preferible de 37 a 41
residuos de aminoácidos.
En una forma de realización de la invención el
péptido de GLP-2 se selecciona de la lista que
consiste en:
K30R-GLP-2(1-33);
S5K-GLP-2(1-33);
S7K-GLP-2(1-33);
D8K-GLP-2(1-33);
E9K-GLP-2(1-33);
M10K-GLP-2(1-33);
N11
K-GLP-2(1-33);
T12K-GLP-2(1-33);
I113K-GLP-2(1-33);
L14K-GLP-2(1-33);
D15K-GLP-2(1-33);
N16K-GLP-2(1-33);
L17K-GLP-2(1-33);
A18K-GLP-2(1-33);
D21K-GLP-2(1-33);
N24K-GLP-2(1-33);
Q28K-GLP-2(1-33);
S5K/K30R-GLP-2(1-33);
S7K/K30R GLP-2(1-33);
D8K/K30R-GLP-2(1-33);
E9K/K30R-GLP-2(1-33);
M10K/K30R-GLP-2(1-33); N11K/K30R-GLP-2(1-33); T12K/K30R-GLP-2(1-33); I13K/K30R-GLP-2(1-33);
L14K/K30R-GLP-2(1-33); D15K/K30R-GLP-2(1-33); N16K/K30R-GLP2(1-33); L17K/K30R-GLP-2(1-33);
A18K/K30R-GLP-2(1-33); D21K/K30R-GLP-2(1-33); N24K/K30R-GLP-2(1-33); Q28K/K30R-GLP-2(1-33);
K30R/D33K-GLP-2(1-33); D3E/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/S5K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/S7K/K30R/
D33E-GLP-2(1-33); D3E/D8K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/E9K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/M10K/K30R/
D33E-GLP-2(1-33); D3E/N11K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/T12K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/113K/
K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/L14K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/D15K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/
N16K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/L17K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/A18K/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/D21K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/N24K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/Q28K/K30R/D33E-GLP-
2(1-33); y derivados de los mismos.
M10K/K30R-GLP-2(1-33); N11K/K30R-GLP-2(1-33); T12K/K30R-GLP-2(1-33); I13K/K30R-GLP-2(1-33);
L14K/K30R-GLP-2(1-33); D15K/K30R-GLP-2(1-33); N16K/K30R-GLP2(1-33); L17K/K30R-GLP-2(1-33);
A18K/K30R-GLP-2(1-33); D21K/K30R-GLP-2(1-33); N24K/K30R-GLP-2(1-33); Q28K/K30R-GLP-2(1-33);
K30R/D33K-GLP-2(1-33); D3E/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/S5K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/S7K/K30R/
D33E-GLP-2(1-33); D3E/D8K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/E9K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/M10K/K30R/
D33E-GLP-2(1-33); D3E/N11K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/T12K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/113K/
K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/L14K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/D15K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/
N16K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/L17K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/A18K/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/D21K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/N24K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/Q28K/K30R/D33E-GLP-
2(1-33); y derivados de los mismos.
\vskip1.000000\baselineskip
En una forma de realización de la invención el
derivado de GLP-2 es seleccionado del grupo que
consiste en
S5K(3-(hexadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
S7K(3-(hexadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
D8K(3-(hexadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
E9K(3-(hexadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
M10K(3-(hexadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
N11K(3-(hexadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
T12K(3-(hexadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
H3K(3-(hexadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
L14K(3-(hexadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
D15K(3-(hexadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
N16K(3-(hexadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(octanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(nonanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(decanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(undecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(dodecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(tridecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(tetradecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(pentadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(hexadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(heptadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(octadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(nonadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(eicosanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(octanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(nonanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(decanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(undecanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(dodecanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(tridecanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(tetradecanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(pentadecanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(hexadecanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(heptadecanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(octadecanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(nonadecanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(eicosanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(octanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(nonanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(decanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(undecanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(dodecanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(tridecanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(tetradecanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(pentadecanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(hexadecanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(heptadecanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(octadecanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(nonadecanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(eicosanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
A18K(3-(hexadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
D21K(3-(hexadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
N24K(3-(hexadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
Q28K(3-(hexadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
S5K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
S7K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
D8K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
E9K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
M10K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
N11
K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
T12K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
I13K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
L14K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
D15K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
N16K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(octanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(nonanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(decanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(undecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(dodecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(tridecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(tetradecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(pentadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(heptadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(octadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(nonadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(eicosanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(octanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(nonanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(decanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(undecanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(dodecanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(tridecanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(tetradecanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(pentadecanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(hexadecanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(heptadecanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(octadecanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(nonadecanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(eicosanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(octanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(nonanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(decanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(undecanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(dodecanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(tridecanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(tetradecanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(pentadecanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(hexadecanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(heptadecanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(octadecanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(nonadecanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(eicosanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
A18K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
D21
K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
N24K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
Q28K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
D3E/S5K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/S7K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/D8K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/E9K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/M10K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/N11
K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/T12K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/l13K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L14K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/D15K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/N16K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(octanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(nonanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(decanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(undecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(dodecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(tridecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(tetradecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(pentadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(heptadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(octadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(nonadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(eicosanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-carboxi-4-(octanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-carboxi-4-(nonanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-carboxi-4-(decanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-carboxi-4-(undecanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-carboxi-4-(dodecanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-carboxi-4-(tridecanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-carboxi-4-(tetradecanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-carboxi-4-(pentadecanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-carboxi-4-(hexadecanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-carboxi-4-(heptadecanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-carboxi-4-(octadecanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-carboxi-4-(nonadecanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-carboxi-4-(eicosanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(octanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(nonanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(decanoi)amino)butar?oil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(undecanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(dodecanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(tridecanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(tetradecanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(pentadecanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(hexadecanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(heptadecanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(octadecanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(nonadecanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(eicosanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/A18K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/D21
K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/N24K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
y
D3E/Q28K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33).
\vskip1.000000\baselineskip
Métodos para la preparación de
GLP-2, análogos de los mismos al igual que derivados
de GLP-2 pueden ser encontrados en p. ej. WO
99/43361 y WO 00/55119.
En otra forma de realización de la invención el
péptido de tipo glucagón es un análogo insulinotrópico de exendina
4(1-39), p. ej.
Ser^{2}Asp^{3}-exendina-4(1-39)
donde los residuos de aminoácidos en posición 2 y 3 han sido
sustituidos con serina y ácido aspártico, respectivamente (este
análogo particular también es conocido en la técnica como
exendina-3).
En otra forma de realización de la invención el
péptido de tipo glucagón es un derivado de
exendina-4 donde el sustituyente introducido se
selecciona de amidas, carbohidratos, grupos alquilo, ésteres y
sustituyentes lipofílicos. Un ejemplo de unos derivados
insulinotrópicos de
exendina-4(1-39) y análogos
de los mismos es
Tyr^{31}-exendina-4(1-31)-amida.
En otra forma de realización de la invención el
péptido de tipo glucagón es un compuesto de
exendina-4 estable. En otra forma de realización de
la invención el péptido de tipo glucagón es un compuesto de
exendina-4 protegido con DPP-IV. En
otra forma de realización de la invención el péptido de tipo
glucagón es un compuesto de exendina-4
inmunomodulado.
Métodos para la preparación de
exendina-4, análogos de los mismos al igual que
derivados de exendina-4 pueden ser encontrados en p.
ej. WO 99/43708, WO 00/41546 y WO 00/55119.
El péptido parental de tipo glucagón puede ser
producido por síntesis de péptidos, p. ej. síntesis de péptidos de
fase sólida usando química Fmoc o Boc u otras técnicas bien
establecidas. El péptido parental de tipo glucagón puede también ser
producido por un método que comprende el cultivo de una célula
huésped que contiene una secuencia de ADN que codifica el
polipéptido y capaz de expresar el polipéptido en un medio nutritivo
adecuado bajo condiciones que permiten la expresión del péptido,
después de lo cual el péptido resultante es recuperado del
cultivo.
El medio usado para el cultivo de las células
puede ser cualquier medio convencional adecuado para dejar crecer
las células huéspedes, tal como medios mínimos o complejos que
contienen suplementos apropiados. Medios adecuados son disponibles
de proveedores comerciales o pueden ser preparados según recetas
publicadas (p. ej. en catálogos de la Colección Americana de
Cultivos Tipo). El péptido producido por las células puede luego ser
recuperado del medio de cultivo por procedimientos convencionales
incluyendo la separación de las células huéspedes del medio por
centrifugado o filtración, precipitación de los componentes
proteínicos del sobrenadante o filtrado mediante una sal, p. ej.
sulfato de amonio, purificación por una variedad de procedimientos
cromatográficos, p. ej. cromatografía de intercambio de iones,
cromatografía de filtración en gel, cromatografía de afinidad, o
similar, dependiendo del tipo de péptido en cuestión.
La secuencia de ADN que codifica el péptido
parental puede de manera adecuada ser de origen genómico o ADNc, por
ejemplo obtenido preparando una biblioteca genómica o de ADNc y
seleccionando secuencias de ADN que codifican para todo o parte del
péptido por hibridación usando sondas de oligonucleótidos sintéticas
conforme a técnicas estándar (ver, por ejemplo, Sambrook, J,
Fritsch, EF y Maniatis, T, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989). La secuencia
de ADN que codifica el péptido puede también ser preparada
sintéticamente por métodos estándar establecidos, p. ej. el método
de fosfoamidita descrito por Beaucage y Caruthers, Tetrahedron
Letters 22 (1981), 1859-1869, o el método descrito
por Matthes et al., EMBO Journal 3 (1984),
801-805. La secuencia de ADN puede también ser
preparada por reacción en cadena de polimerasa usando cebadores
específicos, por ejemplo como se describe en US 4,683,202 o Saiki
et al., Science 239 (1988), 487-491.
La secuencia de ADN puede ser insertada en
cualquier vector que puede convenientemente ser sometido a
procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector
frecuentemente dependerá de la célula huésped en la que debe ser
introducido. Así, el vector puede ser un vector de replicación
autónoma, es decir un vector que existe como una entidad
extracromosómica, cuya replicación es independiente de la
replicación cromosómica, p. ej. un plásmido. De forma alternativa,
el vector puede ser uno que, introducido en una célula huésped, es
integrado en el genoma de la célula huésped y replicado con
el(los) cromosoma(s) en que ha sido integrado.
El vector es preferiblemente un vector de
expresión donde la secuencia de ADN que codifica el péptido es
operativamente enlazado a segmentos adicionales requeridos para la
transcripción del ADN, tal como un promotor. El promotor puede ser
cualquier secuencia de ADN que muestre actividad transcripcional en
la célula huésped de elección y puede ser derivado de genes que
codifican proteínas bien homologas o heterólogas a la célula
huésped. Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la
transcripción del ADN que codifica el péptido de la invención en una
variedad de células huéspedes son bien conocidos en la técnica, cf.
por ejemplo Sambrook et al., supra.
La secuencia de ADN que codifica el péptido
puede también, si fuera necesario, ser operativamente conectada a un
terminador adecuado, señales de poliadenilación, secuencias
potenciadoras transcripcionales, y secuencias potenciadoras
traduccionales. El vector recombinante de la invención puede además
comprender una secuencia de ADN que permite que el vector se
replique en la célula huésped en cuestión.
El vector puede también comprender un marcador
seleccionable, p. ej. un gen cuyo producto complementa un defecto en
la célula huésped o uno que confiere resistencia a un medicamento,
p. ej. ampicilina, canamicina, tetracidina, cloranfenicol,
neomicina, higromicina o metotrexato.
Para dirigir un péptido parental de la presente
invención en la vía secretora de las células huéspedes, una
secuencia señal secretora (también conocida como una secuencia
líder, secuencia prepro o secuencia pre) puede ser proporcionada en
el vector recombinante. La secuencia señal secretora se une a la
secuencia de ADN que codifica el péptido en el marco de lectura
correcto. Secuencias señal secretoras son comúnmente situadas en 5'
a la secuencia de ADN que codifica el péptido. La secuencia señal
secretora puede ser aquella normalmente asociada con el péptido o
puede ser de un gen que codifica otra proteína segregada.
Los procedimientos usados para enlazar
secuencias de ADN que codifican para el presente péptido, el
promotor y opcionalmente el terminador y/o secuencia señal
secretora, respectivamente, y para insertarlas en vectores adecuados
conteniendo la información necesaria para la replicación, son
conocidos por expertos en la técnica (cf., por ejemplo, Sambrook
et al., supra).
La célula huésped en la que se introduce la
secuencia de ADN o el vector recombinante puede ser cualquier célula
que sea capaz de producir el péptido presente e incluye bacterias,
levadura, hongos y células eucarióticas superiores. Ejemplos de
células huéspedes adecuadas bien conocidas y usadas en la técnica
son, sin limitación, E. coli, Saccharomyces cerevisiae, o
líneas celulares mamíferas BHK o CHO.
Composiciones farmacéuticas que contienen un
péptido de tipo glucagón purificado según la presente invención
normalmente contienen diferentes excipientes farmacéuticos, tales
como conservantes, agentes isotónicos y surfactantes. La preparación
de composiciones farmacéuticas es bien conocida por el experto en la
materia. Para conveniencia se hace referencia a Remington: The
Science and Practice of Pharmacy, 19ª edición, 1995.
Composiciones farmacéuticas que contienen un
péptido de tipo glucagón purificado según la presente invención
pueden ser administradas parenteralmente a pacientes en necesidad de
este tratamiento. La administración parenteral puede ser realizada
por inyección subcutánea, inyección intramuscular, o inyección
intravenosa mediante una jeringa, opcionalmente una jeringa tipo
pluma. De forma alternativa la administración puede ser realizada
por infusión, p. ej. usando una bomba de infusión.
La presente invención se ilustra con mayor
detalle por los ejemplos siguientes que, no obstante, no están
destinados para ser interpretados como limitando el alcance de
protección. Las características descritas en la descripción
precedente y en los ejemplos siguientes pueden, tanto separadamente
como en cualquier combinación de los mismos, ser materiales para
realizar la invención en formas diversas de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)}
fue expresado en levadura (S. Cerevisiae) por tecnología
recombinante convencional como se describe en otro lugar (WO
98/08871).
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)} en el
caldo de fermentación fue luego purificado por cromatografía en fase
inversa convencional y posteriormente precipitado al pH isoeléctrico
del péptido, es decir a pH 5.4. El precipitado fue aislado por
centrifugado. Después de otra fase de purificación de
RP-LC y precipitación isoeléctrica, el péptido
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)} fue
acilado como se describe en WO 00/55119 para dar el derivado de
GLP-1
Arg^{34}Lys^{28}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7-37)}.
Una mezcla de 0,5 g/l de
Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1(7-37)
a pH 8.0 fue preparada. La pureza del polipéptido fue aprox. 90%
(aprox. 5% de variante D-His,
D-His^{7}Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1(7-37,
donde la histidina en posición 7, es decir el
N-terminal del péptido fue racemizado a un residuo
de D-histidina, y 5% de otras impurezas). La mezcla
es purificada usando cromatografía de intercambio de aniones.
0.005 volumen de columna (CV) de la mezcla fue
aplicado a una columna de intercambio de aniones de 1 ml Mono Q
(Amersham Biosciences) equilibrada con 10 CV de 20 mM de
Tris-hidroximetil amino-metano, 63%
(p/p) etanol, pH 8.0. La columna fue lavada con 3 CV de solución de
equilibrado, y la elución fue realizada con dos gradientes de sal
lineales, el primer gradiente de 0-20 mM de NaCl, 20
mM de Tris-hidroximetil
amino-metano, 63% (p/p) etanol, pH 8.0 sobre 20 CV,
seguido del segundo gradiente de 20-50 mM de NaCl,
20 mM de Tris-hidroximetil
amino-metano, 63% (p/p) etanol, pH 8.0 sobre 10 CV.
El flujo fue 40 CV/h y la temperatura 25ºC en todo el
experimento.
Durante el experimento el eluyente de la columna
fue fraccionado y cada una de las fracciones fueron analizadas para
el contenido de
D-His^{7}Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7-37)}
y
Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7.37)},
respectivamente.
Los datos mostraron que la variante
D-His del péptido eluyó antes que el
Arg^{34}Lys^{27}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7-37)},
y las dos formas del péptido pudieron ser así separadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Una mezcla de 2.0 g/l
(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7-37)}
a pH 8 fue preparada como se describe en el ejemplo 1.
0.6 CV de la mezcla fue aplicada a una columna
de intercambiado de aniones de 4.7 ml Poros 20HQ (Perseptive
Biosystems) equilibrada con 5 CV de 20 mM de
Tris-hidroximetil amino-metano, 63%
(p/p) etanol, pH 8.0. La columna fue lavada con 6 CV de solución de
equilibrado, y la elución fue realizada con dos gradientes de sal
lineales, el primer gradiente de 0-50 mM de NaCl, 20
mM de Tris-hidroximetil
amino-metano, 63% (p/p) etanol, pH 8.0 sobre 12 CV,
seguido del segundo gradiente de 50-80 mM de NaCl,
20 mM de Tris-hidroximetil
amino-metano, 63% (p/p) etanol, pH 8.0 sobre 20 CV.
El flujo fue 90 CV/h y la temperatura 40ºC en todo el
experimento.
Durante el experimento el eluyente de la columna
fue fraccionado y cada una de las fracciones fueron analizadas para
el contenido de
D-His^{7}Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoyl))GLP-1_{(7.37)}
y
Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7-37)},
respectivamente.
Los datos mostraron que la variante
D-His del péptido eluyó antes que el
Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7-37)},
y las dos formas del péptido pudieron así ser separadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Una mezcla de 0.5 g/l de
Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7-37)}
a pH 8.0 es preparada como se describe en el ejemplo 1.
0.1 CV de la mezcla se aplica a una columna de
intercambio de aniones de 1 ml Mono Q (Amersham Biosciences)
equilibrada con 10 CV 20 mM de Tris-hidroximetil
amino-metano, 63% (p/p) etanol, pH 8.0. La columna
es lavada con 3 CV de solución de equilibrado, y la elución se
realiza con dos gradientes de sal lineales, el primer gradiente de
0-20 mM de NaCl, 20 mM de HEPES, 63% (p/p) etanol,
pH 8.0 sobre 20 CV, seguido del segundo gradiente de
20-50 mM de NaCl, 20 mM de HEPES, 63% (p/p) etanol,
pH 8.0 sobre 10 CV. El flujo es 20 CV/h y la temperatura 25ºC en
todo el experimento.
Durante el experimento el eluyente de la columna
es fraccionado y cada una de las fracciones se analizan para el
contenido de
D-His^{7}Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7.37)}
y
Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7-37)},
respectivamente.
Los datos muestran que la variante
D-His del péptido eluyó antes que el
Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))
GLP-1_{(7-37)}, y las dos formas
del péptido pudieron así ser separadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Una mezcla de 0,5 g/l de
Arg^{34}Lys^{26}N\beta(\gamma-Glu(N^{\alpha}-exadecanoil))GLP-1_{(7-37)}
a pH 8.0 es preparada como se describe en el ejemplo 1.
0.1 CV de la mezcla se aplica a una columna de
intercambio de aniones de 1 ml Mono Q (Amersham Biosciences)
equilibrada con 10 CV de 20 mM Tris-hidroximetil
amino-metano, 63% (p/p) etanol, pH 8.0. La columna
se lava con 3 CV solución de equilibrado, y la elución se realiza
con dos gradientes sal lineales, el primer gradiente de
0-20 mM de NaCl, 20 mM de
Tris-hidroximetil amino-metano, 63%
(p/p) etanol, pH 8.0 sobre 20 CV, seguido del segundo gradiente de
20-50 mM de NaCl, 20 mM
Tris-hidroximetil amino-metano, 63%
(p/p) etanol, pH 8.0 sobre 10 CV. El flujo es 80 CV/h y la
temperatura 25ºC en todo el experimento.
Durante el experimento el eluyente de la columna
es fraccionado y cada una de las fracciones se analiza para el
contenido de
D-His^{7}Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7-37)}
y
Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))
GLP-1_{(7-37)}, respectivamente.
GLP-1_{(7-37)}, respectivamente.
Los datos muestran que la variante
D-His del péptido eluyó antes que el
Arg_{34}Lys_{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))
GLP-1_{(7-37)}, y las dos formas
del péptido pudieron así ser separadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Una mezcla de 0.5 g/l de
Arg_{34}Lys_{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7-37)},
a pH 8.0 es preparada como se describe en el ejemplo 1.
0.1 CV de la mezcla se aplica a una columna de
intercambio de aniones de 1 ml Mono Q (Amersham Biosciences)
equilibrada con 10 CV de 20 mM de Tris-hidroximetil
amino-metano, 63% (p/p) etanol, pH 8.0. La columna
se lava con 3 CV de solución de equilibrado, y la elución fue
realizada con dos gradientes de sal lineales, el primer gradiente de
0-20 mM de acetato sódico, 20 mM de
Tris-hidroximetil amino-metano, 63%
(p/p) etanol, pH 8.0 sobre 20 CV, seguido de un segundo gradiente de
20-50 mM de CH_{3}COOH, 20 mM de
Tris-hidroximetil amino-metano, 63%
(p/p) etanol, pH 8.0 sobre 10 CV. El flujo es 40 CV/h y la
temperatura 25ºC en todo el experimento.
Durante el experimento el eluyente de la columna
es fraccionado y cada una de las fracciones se analiza para el
contenido de
D-His^{7}Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7-37)}
y
Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))
GLP-1_{(7-37)}, respectivamente.
GLP-1_{(7-37)}, respectivamente.
Los datos muestran que la variante
D-His del péptido eluyó antes que el
Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))
GLP-1_{(7-37)}, y las dos formas del péptido pudieron así ser separadas.
GLP-1_{(7-37)}, y las dos formas del péptido pudieron así ser separadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Una mezcla de 0,5 g/l de
Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7-37)}
a pH 8.0 fue preparada como se describe en el ejemplo 1.
0.1 CV de la mezcla fue aplicada a una columna
de intercambio de aniones de 1 ml Mono Q (Amersham Biosciences)
equilibrada con 10 CV de 20 mM de Tris-hidroximetil
amino-metano, 63% (p/p) etanol, pH 8.0. La columna
fue lavada con 3 CV de solución de equilibrado, y la elución fue
realizada con dos gradientes de sal lineales, el primer gradiente de
0-10 mM de Na_{2}SO_{4}, 20 mM
Tris-hidroximetil amino-metano, 63%
(p/p) etanol, pH 8.0 sobre 20 CV, seguido del segundo gradiente de
10-25 mM de Na_{2}SO_{4}, 20 mM de
Tris-hidroximetil amino-metano, 63%
(p/p) etanol, pH 8.0 sobre 10 CV. El flujo fue 40 CV/h y la
temperatura 25ºC en todo el experimento.
\newpage
Durante el experimento el eluyente de la columna
fue fraccionado y cada una de las fracciones fueron analizadas para
el contenido de
D-His^{7}Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7-37)}
y
Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7-37)},
respectivamente.
Los datos mostraron que la variante
D-His del péptido eluyó antes que el
Arg_{34}Lys_{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7-37)},
y las dos formas del péptido pudieron así ser separadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Una mezcla de 2.0 g/l
(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7-37)}
a pH 8 fue preparada como se describe en el ejemplo 1. La muestra
fue posteriormente adicionada con aproximadamente un tercer
D-His^{7}Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7-37)}.
0.015 volumen de columna (CV) de la mezcla fue
aplicado a una columna de intercambio de aniones de 1 ml Mono Q
(Amersham Biosciences) equilibrada con 5 CV de 20 mM de
Tris-hidroximetil amino-metano, 63%
(p/p) etanol, pH 8.0. La elución fue realizada con dos gradientes de
sal lineales, el primer gradiente de 0-20 mM de
NaCl, 20 mM de Tris-hidroximetil
amino-metano, 63% (p/p) etanol, pH 8.0 sobre 12 CV,
seguido del segundo gradiente de 20-50 mM de NaCl,
20 mM de Tris-hidroximetil
amino-metano, 63% (p/p) etanol, pH 8.0 sobre 8 CV.
El flujo fue 48 CV/h y la temperatura 25ºC en todo el experimento.
El cromatograma se muestra en la figura 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Una mezcla de 4.5 g/l de
(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7-37)}
a pH 8 fue preparada como se describe en el ejemplo 1.
0.7 CV de la mezcla fue aplicada a una columna
de intercambio de aniones de 152 ml Source 30Q (Amersham
Biosciences) equilibrada con 6 CV de 20 mM de
Tris-hidroximetil amino-metano, 63%
(p/p) etanol, pH 8.0 La columna fue lavada con 2 CV de solución de
equilibrado, y la elución fue realizada con dos gradientes de sal
lineales, el primer gradiente de 0-23 mM de NaCl, 20
mM de Tris-hidroximetil
amino-metano, 63% (p/p) etanol, pH 8.0 sobre 12 CV,
seguido del segundo gradiente de 23-30 mM de NaCl,
20 mM de Tris-hidroximetil
amino-metano, 63% (p/p) etanol, pH 8.0 sobre 20 CV.
El flujo fue 20 CV/h y la temperatura 25ºC en todo el
experimento.
Durante el experimento el eluyente de la columna
fue fraccionado y cada una de las fracciones fueron analizadas para
el contenido de
D-His^{7}Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7-37)}
y
Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7-37)},
respectivamente.
Los datos mostraron que su variante
D-His del péptido eluyó antes que el
Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7-37)},
y las dos formas del péptido pudieron así ser separadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Una mezcla de 5.0 g/l de
(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7-37)}
a pH 8 fue preparada como se describe en el ejemplo 1.
0.6 CV de la mezcla fue aplicada a una columna
de intercambio de aniones de 11.8 ml Source 30Q (Amersham
Biosciences) equilibrada con 5 CV de 20 mM de
Tris-hidroximetil amirio-metano, 63%
(p/p) etanol, pH 7.5. La columna fue lavada con 1 CV de solución de
equilibrado, y la elución fue realizada con dos gradientes de sal
lineales, el primer gradiente de 0-20 mM de NaCl, 20
mM de Tris-hidroximetil
amino-metano, 63% (p/p) etanol, pH 7.5 sobre 12 CV,
seguido del segundo gradiente de 20-40 mM de NaCl,
20 mM de Tris-hidroximetil
amino-metano, 63% (p/p) etanol, pH 7.5 sobre 20 CV.
El flujo fue 20 CV/h y la temperatura 25ºC en todo el
experimento.
Durante el experimento el eluyente de la columna
fue fraccionado y cada una de las fracciones fueron analizadas para
el contenido de
D-His^{7}Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7-37)}
y
Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7-37)},
respectivamente.
Los datos mostraron que la variante
D-His del péptido eluyó antes que el
Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7-37)},
y las dos formas del péptido pudieron así ser separadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Una mezcla de 5.0 g/l de
(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7-37)},
a pH 8 fue preparada como se describe en el ejemplo 1.
\newpage
0.6 CV de la mezcla fue aplicada a una columna
de intercambio de aniones de 11.8 ml Source 30Q (Amersham
Biosciences) equilibrada con 5 CV 20 mM de
Tris-hidroximetil amino-metano, 63%
(p/p) etanol, pH 7.0. La columna fue lavada con 1 CV de solución de
equilibrado, y la elución fue realizada con dos gradientes de sal
lineales, el primer gradiente de 0-15 mM de NaCl, 20
mM Tris-hidroximetil amino-metano,
63% (p/p) etanol, pH 7.0 sobre 12 CV, seguido del segundo gradiente
de 15-40 mM de NaCl, 20 mM de
Tris-hidroximetil amino-metano, 63%
(p/p) etanol, pH 7.0 sobre 20 CV. El flujo fue 20 CV/h y la
temperatura 25ºC en todo el experimento.
Durante el experimento el eluyente de la columna
fue fraccionado y cada una de las fracciones fueron analizadas para
el contenido de
D-His^{7}Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7-37)}
y
Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil)))GLP-1_{(7-37)},
respectivamente.
Los datos mostraron que su variante
D-His del péptido eluyó antes que el
Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7-37)},
y las dos formas del péptido pudieron así ser separadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Una mezcla de 5.0 g/l de
(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7-37)}
a pH 8 fue preparada como se describe en el ejemplo 1.
0.6 CV de la mezcla fue aplicada a una columna
de intercambio de aniones de 11.8 ml Source 30Q (Amersham
Biosciences) equilibrada con 5 CV de 20 mM de
Tris-hidroximetil amino-metano, 63%
(p/p) etanol, pH 8.5. La columna fue lavada con 1 CV de solución de
equilibrado, y la elución fue realizada con dos gradientes de sal
lineales, el primer gradiente de 0-20 mM de NaCl, 20
mM Tris-hidroximetil amino-metano,
63% (p/p) etanol, pH 8.5 sobre 12 CV, seguido del segundo gradiente
de 20-40 mM de NaCl. 20 mM de
Tris-hidroximetil amino-metano, 63%
(p/p) etanol, pH 8.5 sobre 20 CV. El flujo fue 20 CV/h y la
temperatura 25ºC en todo el experimento.
Durante el experimento el eluyente de la columna
fue fraccionado y cada una de las fracciones fueron analizadas para
el contenido de
D-His^{7}Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7.37)}
y
Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(3.37)},
respectivamente. Los datos mostraron que la variante
D-His del péptido eluyó antes que el
Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7-37)},
y las dos formas del péptido pudieron así ser separadas.
\vskip1.000000\baselineskip
L-His^{1}-Exendina-4
y
D-His^{1}-Exendina-4
fue preparado por síntesis de fase sólida. Una mezcla de los dos fue
preparada disolviendo los péptidos en 10 mM de
Tris-hidroximetil amino-metano a pH
9.2 a una concentración de 1 g/l.
1 CV de esta mezcla fue cargada a una columna de
intercambio de aniones de 1 ml Mono-Q (Amersham
Biosciences) equilibrada con 10 CV 10 mM de
Tris-hidroximetil amino-metano, 63%
(p/p) etanol, pH 7.0. La columna fue lavada con 1 CV 10 mM
Tris-hidroximetil amino-metano, 63%
(p/p) etanol, pH 7.0, y la elución fue realizada isocráticamente con
10 mM de Tris-hidroximetil
amino-metano, 63% (p/p) etanol, pH 7.0 sobre 20 CV.
El flujo fue 138 CV/h y la temperatura fue 25ºC en todo el
experimento.
La elución (figura 3) muestra que la forma
L-His de Exendina-4 eluyó antes que
la forma D-His de Exendina 4, y las dos formas del
péptido podrían así ser separadas.
\vskip1.000000\baselineskip
L17K,
K30R-GLP2_{(1-33)} fue expresado
en levadura (S. Cerevisiae) por tecnología convencional
recombinante de una manera similar a como se describe en WO 98/08871
para péptidos de GLP-1. L17K,
K30R-GLP2_{(1-33)} en el caldo de
fermentación fue luego purificado por intercambio de aniones
convencional y cromatografía en fase inversa y posteriormente
precipitado al pH isoeléctrico del péptido, es decir a pH 4. El
precipitado fue aislado por centrifugado.
D-His-L17K,
K30R-GLP2_{(1-33)} fue preparado
por síntesis de fase sólida.
Una mezcla de los dos fue preparada disolviendo
los péptidos en 10 mM de Tris-hidroximetil
amino-metano a pH 9.2 a una concentración de 1
g/L.
1 CV de esta mezcla fue cargada a una columna de
intercambio de aniones de 1 ml Mono-Q (Amersham
Biosciences) equilibrada con 5 CV 20 mM de
Tris-hidroximetil amino-metano, 63%
(p/p) etanol, pH 7.0. La columna fue lavada con 1 CV 20 mM de
Tris-hidroximetil amino-metano, 63%
(p/p) etanol, pH 7.0, y la elución fue como un gradiente sobre 20 CV
de 0 a 63 mM de NaCl en 20 mM de Tris-hidroximetil
amino-metano, 63% (p/p) etanol, a pH 7.0. El flujo
fue 138 CV/h y la temperatura fue 25ºC en todo el experimento.
La elución mostró que la forma
D-His de L17K,
K30R-GLP2_{(1-33)} eluyó antes que
la forma L-his de L17K,
K30R-GLP2_{(1-33)}, y las dos
formas del péptido pudieron así ser separadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citada por el
solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información
del lector. No forma parte del documento de patente europea. La
misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin
embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u
omisiones.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
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comprenden un aminoácido racemizado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
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<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Versión de patentIn 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Monstruo de Gila
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (39)..(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Serina en la posición 39 es
amidada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Monstruo de Gila
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (39)..(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Serina en la posición 39 es
amidada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Constructo sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (44)..(44)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Lisina en la posición 44 es
amidada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
Claims (54)
1. Método para separar las dos formas de un
polipéptido que tiene una única racemización de aminoácido, donde
las dos formas de un polipéptido que tiene una única racemización de
aminoácido son A(X) y A(X*), donde
X es un L-aminoácido,
A(X) es un polipéptido que comprende el
aminoácido X,
X* es el D-isómero de X,
A(X*) es un polipéptido que comprende el
aminoácido X* pero por el contrario idéntico a A(X), dicho
método caracterizado por el hecho de ser un proceso de
cromatografía de intercambio de iones comprendiendo la elución
mediante el aumento de la concentración de sal a un pH que es no
mayor de 1 unidad de pH de una pKa de X bajo las condiciones de
elución.
2. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde dicho método es para separar
dichos polipéptidos en la escala preparatoria.
3. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde la elución se realiza a un pH
que es sustancialmente el mismo que el pH usado para la unión.
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde la unión de los polipéptidos se
realiza a un pH que es no mayor de aproximadamente 0.5 unidades de
pH de una pKa de X bajo las condiciones de elución.
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde dicha elución se realiza a un pH
que es superior al punto isoeléctrico de dichos polipéptidos.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde dicho polipéptido tiene un peso
molecular inferior a aproximadamente 10 kDa.
7. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde el eluyente comprende un
modificador orgánico.
8. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde el eluyente comprende un
modificador orgánico en una concentración suficiente para mantener
dichos polipéptidos solubles.
9. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 7-8, donde dicho modificador
orgánico es etanol.
10. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 7-8, donde dicho modificador
orgánico es 2-propanol.
11. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 7-8, donde dicho modificador
orgánico es acetonitrilo.
12. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 7-8, donde dicho modificador
orgánico es seleccionado del grupo que consiste en metanol,
1-propanol y hexilenglicol.
13. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 7-12, donde la concentración de
dicho modificador orgánico es de aproximadamente el 10% a
aproximadamente el 80%, tal como de aproximadamente el 20% a
aproximadamente el 70%, o de aproximadamente el 30% a
aproximadamente el 65%.
14. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde dicha sal es seleccionada del
grupo que consiste en cloruro sódico, sulfato de sodio, acetato
sódico, cloruro potásico, sulfato potásico, y acetato potásico.
15. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde X es el residuo de aminoácido
N-terminal o el C-terminal.
16. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde X es
L-histidina.
17. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-15, donde X es un análogo de
aminoácido de histidina.
18. Método según la reivindicación 17, donde X
es seleccionado del grupo que consiste en
desamino-histidina,
2-amino-histidina,
\beta-hidroxi-histidina,
homohistidina,
\alpha-fluorometil-histidina y
\alpha-metil-histidina.
19. Método según la reivindicación 17 o 18,
donde X es el residuo de aminoácido N-terminal.
20. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-15, donde X es
L-fenilalanina.
21. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde dicho polipéptido es un péptido
de tipo glucagón.
22. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde dicho polipéptido es glucagón,
un análogo de glucagón, un derivado de glucagón o un derivado de un
análogo de glucagón.
23. Método según la reivindicación 21, donde
dicho polipéptido es GLP-1, un análogo de
GLP-1, un derivado de GLP-1 o un
derivado de un análogo de GLP-1.
24. Método según la reivindicación 23, donde
dicho análogo de GLP-1 es seleccionado del grupo que
consiste en
Arg^{34}-GLP-1(7-37),
Gly^{8}-GLP-1(7-36)-amida,
Gly^{8}-GLP-1(7-37),
Val^{8}-GLP-1(7-36)-amida,
Val^{8}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Asp^{22}-GLP-1(7-36)-amida,
Val^{8}Asp^{22}-GLP-1(7-37),
Val^{8}-Glu^{22}-GLP-1(7-36)-amida,
Val^{8}Glu^{22}-GLP-
1(7-37), Val^{8}Lys^{22}-GLP-1(7-36)-amida, Val^{8}Lys^{22}-GLP-1(7-37), Val^{8}Arg^{22}-GLP-1(7-36)-amida, Val^{8}Arg^{22}-GLP-1(7-37), Val^{8}His^{22}-GLP-1(7-36)-amida, Val^{8}His^{22}-GLP-1(7-37), Val^{8}Trp^{19}Glu^{22}-GLP-1(7-37), Val^{8}Glu^{22}Val^{25}-GLP-1(7-37), Val^{8}Tyr^{16}Glu^{22}-GLP-1(7-37), Val^{8}Trp^{16}Glu^{22}-GLP-1(7-37), Val^{8}Leu^{16}Glu^{22}-GLP-1(7-37), Val^{8}Tyr^{18}Glu^{22}-GLP-1(7-37), Val^{8}Glu^{22}His^{37}-GLP-1(7-37), Val^{8}Glu^{22}Ile^{33}-GLP-1(7-37), Val^{8}Trp^{16}Glu^{22}Val^{25}Ile^{33}-GLP-1(7-37), Val^{8}Trp^{16}
Glu^{22}Ile^{33}-GLP-1(7-37), Val^{8}Glu^{22}Val^{25}Ile^{33}-GLP-1(7-37), Val^{8}Trp^{16}Glu^{22}Val^{25}-GLP-1(7-37), análogos y derivados de cualquiera de estos.
1(7-37), Val^{8}Lys^{22}-GLP-1(7-36)-amida, Val^{8}Lys^{22}-GLP-1(7-37), Val^{8}Arg^{22}-GLP-1(7-36)-amida, Val^{8}Arg^{22}-GLP-1(7-37), Val^{8}His^{22}-GLP-1(7-36)-amida, Val^{8}His^{22}-GLP-1(7-37), Val^{8}Trp^{19}Glu^{22}-GLP-1(7-37), Val^{8}Glu^{22}Val^{25}-GLP-1(7-37), Val^{8}Tyr^{16}Glu^{22}-GLP-1(7-37), Val^{8}Trp^{16}Glu^{22}-GLP-1(7-37), Val^{8}Leu^{16}Glu^{22}-GLP-1(7-37), Val^{8}Tyr^{18}Glu^{22}-GLP-1(7-37), Val^{8}Glu^{22}His^{37}-GLP-1(7-37), Val^{8}Glu^{22}Ile^{33}-GLP-1(7-37), Val^{8}Trp^{16}Glu^{22}Val^{25}Ile^{33}-GLP-1(7-37), Val^{8}Trp^{16}
Glu^{22}Ile^{33}-GLP-1(7-37), Val^{8}Glu^{22}Val^{25}Ile^{33}-GLP-1(7-37), Val^{8}Trp^{16}Glu^{22}Val^{25}-GLP-1(7-37), análogos y derivados de cualquiera de estos.
\vskip1.000000\baselineskip
25. Método según la reivindicación 23, donde
dicho derivado de GLP-1 o un derivado de un análogo
de GLP-1 tiene un residuo de lisina, tal como una
lisina, donde un sustituyente lipofílico se fija opcionalmente por
medio de un separador al grupo epsilon amino de dicha lisina.
26. Método según la reivindicación 25, donde
dicho sustituyente lipofílico tiene de 8 a 40 átomos de carbono,
preferiblemente de 8 a 24 átomos de carbono, p. ej. 12 a 18 átomos
de carbono.
27. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 25-26, donde dicho separador está
presente y se selecciona de un aminoácido, p. ej.
beta-Ala, L-Glu, o
aminobutiroilo.
28. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 21-27, donde dicho péptido de tipo
glucagón es un péptido tipo glucagón protegido con DPPIV.
29. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 21-28, donde dicho péptido de tipo
glucagón es un péptido de tipo glucagón estable en plasma.
30. Método según la reivindicación 23, donde
dicho derivado de un análogo de GLP-1 es Arg^{34},
Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil)))-GLP-1(7-37).
31. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 22-30, donde dicho péptido de tipo
glucagón tiene de 22 a 40 residuos de aminoácidos, preferible de 26
a 36 residuos de aminoácidos, incluso más preferible de 29 a 33
residuos de aminoácidos.
32. Método según la reivindicación 21, donde
dicho péptido de tipo glucagón es GLP-2, un análogo
de GLP-2, un derivado de GLP-2 o un
derivado de un análogo de GLP-2.
33. Método según la reivindicación 32, donde
dicho derivado de GLP-2 o un derivado de un análogo
de GLP-2 tiene un residuo de lisina, tal como una
lisina, donde un sustituyente lipofílico se fija opcionalmente por
medio de un separador al grupo epsilon amino de dicha lisina.
34. Método según la reivindicación 33, donde
dicho sustituyente lipofílico tiene de 8 a 40 átomos de carbono,
preferiblemente de 8 a 24 átomos de carbono, p. ej. 12 a 18 átomos
de carbono.
35. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 33-34, donde dicho separador está
presente y se selecciona de un aminoácido, p. ej.
beta-Ala, L-Glu, aminobutiroilo.
36. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 32-35, donde dicho péptido de tipo
glucagón tiene de 27 a 39 residuos de aminoácidos, preferible de 29
a 37 residuos de aminoácidos, incluso más preferible de 31 a 35
residuos de aminoácidos.
37. Método según las reivindicaciones 21 o 32,
donde dicho péptido de tipo glucagón es
Lys^{17}Arg^{30}-GLP-2(1-33)
o
Arg^{30}Lys^{17}N^{\varepsilon}(\beta-Ala(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-2(1-33).
38. Método según las reivindicaciones 21 o 32,
donde dicho péptido de tipo glucagón es
Gly^{2}-GLP-2(1-33).
39. Método según la reivindicación 21, donde
dicho péptido de tipo glucagón es exendina-4, un
análogo de exendina-4, un derivado de
exendina-4, o un derivado de un análogo de
exendina-4.
40. Método según la reivindicación 39, donde
dicho péptido de tipo glucagón es exendina-4.
41. Método según la reivindicación 39, donde
dicho péptido de tipo glucagón es ZP10, es decir HGEGTFTSDLSK
QMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK-NH2.
QMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK-NH2.
42. Método según la reivindicación 39, donde
dicho derivado de exendina-4 o derivado de un
análogo de exendina-4 es un péptido adiado o un
péptido pegilado.
43. Método según la reivindicación 39, donde
dicho derivado de exendina-4 o derivado de un
análogo de exendina-4 tiene un residuo de lisina,
tal como una lisina, donde un sustituyente lipofílico opcionalmente
por medio de un separador se fija al grupo epsilon amino de dicha
lisina.
44. Método según la reivindicación 43, donde
dicho sustituyente lipofílico tiene de 8 a 40 átomos de carbono,
preferiblemente de 8 a 24 átomos de carbono, p. ej. 12 a 18 átomos
de carbono.
45. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 43-44, donde dicho separador está
presente y se selecciona de un aminoácido, p. ej.
beta-Ala, L-Glu, o
aminobutiroilo.
46. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-20, donde dicho polipéptido es un
péptido de insulina.
47. Método según la reivindicación 46, donde
dicho péptido de insulina es insulina humana, un análogo de insulina
humana, un derivado de insulina humana o un derivado de un análogo
de insulina humana.
48. Método según la reivindicación 47, donde
dicho péptido de insulina es insulina humana.
49. Método según la reivindicación 47, donde
dicho análogo de insulina humana es seleccionado del grupo que
consiste en Asp^{B28}-insulina humana,
Lys^{B28}Pro^{B29}-insulina humana,
Lys^{B3}Glu^{B29}-insulina humana,
Gly^{A21}Arg^{B31}
Arg^{B32}-insulina humana, y des(B30) insulina humana.
Arg^{B32}-insulina humana, y des(B30) insulina humana.
50. Método según la reivindicación 47, donde
dicho derivado de insulina humana o dicho derivado de un análogo de
insulina humana tiene un residuo de lisina, tal como una lisina,
donde un sustituyente lipofílico opcionalmente por medio de un
separador se fija al grupo epsilon amino de dicha lisina.
51. Método según la reivindicación 50, donde
dicho sustituyente lipofílico tiene de 8 a 40 átomos de carbono,
preferiblemente de 8 a 24, por ejemplo 12-18.
52. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 50-51, donde dicho separador está
presente y se selecciona de un aminoácido, por ejemplo.
beta-Ala, L-Glu, aminobutiroilo.
53. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 50-52, donde dicho derivado de un
análogo de insulina humana es N^{\varepsilon
B29}-Tetradecanoil des(B30) insulina humana
o N^{\varepsilon
B29}-litocoloil-\gamma-glutamil
des(B30) insulina humana.
54. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 46-53, donde X es
L-fenilalanina en la posición 1 en la
B-cadena del péptido de insulina.
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