ES2242183T3 - Proteinas de fusion entre secuencias de aminoacidos antigenas y beta-2-microglobulina. - Google Patents

Abstract

SE PRESENTA UNA PROTEINA DE FUSION HIBRIDA QUE COMPRENDE UNA PRIMERA SECUENCIA DE AMINOACIDO ANTIGENICA FUNDIDA A UNA SEGUNDA SECUENCIA DE AMINOACIDO SUBSTANCIALMENTE HOMOLOGA CON B2M O UN FRAGMENTO DEL MISMO.

Description

Proteínas de fusión entre secuencias de aminoácidos antígenas y beta-2-microglobulina.

La invención se refiere a nuevas proteínas de fusión de beta-2-microglobulina híbridas. También se refiere a ácido nucleico (ADN o ARN) que codifica todo o parte de tales proteínas, y a su preparación. Composiciones farmacéuticas que contienen tales proteínas de fusión son útiles como componentes de vacunas profilácticas y como inmuno-terapéuticos para el tratamiento post-exposición de infección y malignidad vírica.

Las respuestas inmunes tienen dos componentes principales, humoral y mediado por células. La primera comprende anticuerpos, producidos por B-linfocitos, que se unen a antígenos específicos y que sirven para un cierto número de funciones importantes tales como neutralización de virus, fijación de complemento y formación de complejo inmune. La producción de anticuerpos depende de células T auxiliares, que median en el reconocimiento específico para el antígeno de epítopes péptidos mostrados por moléculas de Complejo de Histocompatibilidad Principal (MHC) de Clase II en la superficie de células que presentan antígeno.

La segunda arma del sistema inmune implica células T efectoras, en particular linfocitos T citotóxicos (CTLs) que pueden reconocer y destruir células infectadas o transformadas. Tales respuestas son particularmente importantes en la defensa contra, y la inmunidad de, infecciones víricas, aunque también están implicados en respuestas del hospedante contra ciertos tumores. Las respuestas de los CTL también son específicas para el antígeno, implicando subgrupos de células T CD8 positivas. El reconocimiento inmune es mediado por el receptor de células T que reconoce el antígeno péptido mostrado en las moléculas de MHC Clase I.

Las moléculas de MHC Clase I se expresan ubicuamente y consisten en dos cadenas de polipéptidos. La primera es una cadena alfa de aproximadamente 45 kDa que comprende 3 dominios. Dos de estos dominios se unen a péptidos derivados del tratamiento de proteínas sintetizadas endógenamente, tales como componentes víricos, y los presentan al receptor de células T. Estos dos dominios se enlazan a una región de anclaje de extensión de membrana simple por un tercer dominio de tipo inmunoglobulina. El segundo componente es beta-2 microglobulina (B2M), una proteína de 100 aminoácidos que puede existir libre en el suero así como parte de MHC Clase I. Las dos cadenas se asocian normalmente en el ER, junto con péptidos producidos por degradación de proteínas endógenas para formar un complejo ternario que se presenta en la superficie celular. Aunque pueden formarse complejos binarios carentes de péptido, éstos son inestables y se recirculan o degradan normalmente (Ljungren et al. Nature 346, 476- (1990).

Los datos cristalográficos revelan que el péptido antígeno se une a una ranura entre los dos primeros dominios de la subunidad alfa, cuya base está formada de cadenas de lámina beta y las paredes de dos hélices alfa (Bjorkman et al. Nature 329, 506-512 (1987)). La naturaleza de las cadenas secundarias en esta región de la cadena alfa es crítica para determinar la selectividad de péptido de la molécula, y de aquí la capacidad de diferentes alelos de MHC Clase I para responder a epítopes particulares (Bjorkman et al. Nature 329, 512-518 (1987)). Aunque es la subunidad alfa la que se une al péptido, la B2M juega un papel esencial para permitir la unión, presumiblemente estabilizando el complejo ternario (Vitiello et al. Science 250, 1423-1426 (1990); Rock et al. PNAS 88, 310-304 (1991)). Aunque alguna subunidad alfa libre puede alcanzar la superficie celular en ausencia de B2M, y puede unirse y presentar péptido, es considerablemente menos eficaz que en presencia de B2M (Bix y Raulet. Exp. Med. 176, 829-834
(1992).

Aunque la vía normal de presentación de antígeno por MHC Clase I implica la degradación de proteínas sintetizadas endógenamente, es posible conseguir presentación de antígeno por adición de altas concentraciones de péptido a células que presentan antígeno (APC) in vitro. El uso de péptidos como inmunógenos tiene un cierto número de ventajas potenciales, de las que las más significativas son que evita el uso de partículas víricas inactivadas o atenuadas, y que pueden sintetizarse químicamente péptidos pequeños, evitando el requisito de vías de producción biológicas. La presentación más eficaz se obtiene con péptidos de 9-11 residuos de longitud, que se corresponde con la longitud de la ranura si están en conformación extendida.

Sin embargo, hay problemas principales asociados con este método de obtención de una respuesta de CTL. Aunque tal uso de péptidos es adecuado para demostrar respuestas inmunes tales como dentrucción in vitro mediada por células T, no es un procedimiento eficaz y no ofrece una vía práctica a la inmunización in vivo. Pueden inducirse respuestas de CTL por inmunización con ciertos pequeños fragmentos de péptidos, pero tales péptidos pueden obtener malas respuestas de anticuerpos. Además, en una población engendrada fuera individuos de diferentes haplotipos de MHC Clase I y Clase II responderán a diferentes epítopes péptidos; pueden requerirse muchos péptidos para cebar todos los haplotipos posibles.

Buena parte de la evidencia disponible indica también que la inmunización con proteínas completas no da lugar a respuesta de CTL. Tales respuestas de CTL que se han inducido requieren la presencia de coadyuvantes fuertes o vector vivo que no se han autorizado para su uso en seres humanos. Por ejemplo, el HIV recombinante gp 160 presentado en ISCOMs, pro no en FCA, FIA o solución salina tamponada, inducía actividad de CTL específica para la envoltura de HIV-1 en ratones BALB/c. Se tiene la impresión generalmente de que es improbable que sea próxima la aprobación para el uso de ISCOMs en seres humanos. Virus de vacunas recombinantes que expresan la región V3 del gp 160 de envoltura de HIV inducen también respuestas de CTL específicas a la región V3, pero la inmunización con vacunas ha planteado preocupaciones acerca de la seguridad para pacientes inmunocomprometidos y acerca de la eficacia. Una forma más simple y más eficaz para inducir respuestas de CTL es por tanto un objtivo importante, y se ha buscado activamente durante un cierto número de años aunque con sólo un éxito limitado.

Se ha mostrado que el intercambio de cadenas de B2M en MHC Clase I tiene lugar en presencia de B2M libre (Hayfil y Strominger, PNAS USA 76(11) 5834-5838 (1979)), y que la unión de péptidos exógenos a estas moléculas tiene lugar por asociación y reasociación de cadenas ligeras de B2M (Rock et al., PNAS USA 87 7517-7521 (1990); Kozlowski et al. Nature 349, 74-77 (1991)). La presentación de péptido añadido exógenamente puede hacerse por tanto más eficaz por adición de B2M. El uso de B2M exógena de esta manera para aumentar respuestas inmunes contra péptidos in vivo se describe en el documento WO-A-91/16924.

Sin embargo, hay un cierto número de problemas con este método. El uso de una mezcla, aunque es una herramienta conveniente para uso in vitro, es menos apropiado para administración in vivo, debido a los problemas de polifarmacia para registro de productos.

Además, a pesar de que la secuencia de ADN de B2M es conocida, no ha sido posible producir eficazmente B2M recombinante. La B2M para uso en el aumento de respuestas inmunes necesitaría por tanto purificarse de fuentes naturales tales como suero u orina. No sólo esto es difícil y caro, sino que debe examinarse un cierto número de contaminantes en productos de la sangre antes de ser aceptable para su uso en vacunas.

A pesar del hecho de que se han mostrado esenciales para la unión y presentación del péptido interacciones entre el término C del péptido y la subunidad alfa, la presente invención ha encontrado que péptidos fusionados al término N de B2M son aún capaces de unirse a la ranura en la subunidad alfa. Esta unión se consigue sin sacrificar la capacidad del complejo ternario para unirse y accionar al receptor de células T.

Según el primer aspecto de la invención, se proporciona una proteína de fusión híbrida que comprende una primera secuencia de aminoácidos antígena fusionada directa o indirectamente al término N de una segunda secuencia de aminoácidos al menos 60% homóloga con B2M o una secuencia que retenga al menos el 60% de sus residuos, caracterizada porque la primera secuencia de aminoácidos antígena corresponde a una secuencia derivada de, o asociada con, un tumor o un agente etiológico, distinta de la secuencia señal de E. coli OmpA MKKTAIAIAVALAGFATVAQA.

Preferiblemente, la primera secuencia antígena está fusionada a la secuencia de B2M mediante una secuencia enlazadora corta, para extenderse sobre la separación entre el péptido y la B2M con disrupción mínima de la conformación de la cadena ligera.

El uso de fusiones de B2M ofrece ventajas considerables. El complejo binario entre la subunidad alfa y la fusión de B2M se estabiliza con relación al complejo ternario correspondiente, prolongando la capacidad del péptido para estimular al receptor de células T, aumentando por ello la actividad eficaz del péptido. Se evitan los problemas de polifarmacia, simplificando el desarrollo del compuesto. Este método tiene también un cierto número de ventajas de registro de productos minimizando el número de proteínas presentes en la vacuna, y puede conformarse más estrechamente a líneas de guía en calidad y seguridad. Finalmente, sólo se requiere una vía de producción de GMP simple. Estas últimas consideraciones son particularmente importantes poque pueden requerirse epítopes múltiples para producir una vacuna eficaz contra el fondo de diversidad de MHC. Una ventaja final es que, puesto que el péptido se entrega eficazmente al MHC, puede obviarse el requisito de coadyuvantes.

La expresión "sustancialmente homóloga", cuando se describe la relación de una secuencia de aminoácidos con una proteína natural, significa que la secuencia de aminoácidos puede ser idéntica a la proteína natural o puede ser una forma eficaz aunque truncada o modificada de la proteína natural. En términos prácticos, sin embargo, muchos análogos tendrán un alto grado de homología con la molécula prototipo si ha de conservarse sustancialmente la actividad biológica. Se comprenderá que la naturaleza de los cambios de la molécula prototipo es más importante que la cantidad de ellos. Como guía, no obstante, en el nivel de aminoácidos, puede ser que al menos el 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o incluso 99% de los residuos sean los mismos que la molécula prototipo; en el nivel de ácidos nucleicos, el ácido nucleico que codifica un análogo puede hibridarse por ejemplo bajo condiciones rigurosas (tales como a aproximadamente 35ºC a 65ºC en una solución de sal aproximadamente 0,9 molar) con el ácido nucleico que codifica la molécula prototipo, o lo haría así salvo por la degeneración del código genético.

Los fragmentos de B2M de uso en esta invención conservan la capacidad para aumentar respuestas inmunes a los péptidos a los que se fusionan. Preferibledmente, se conservan al menos el 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o incluso 99% de los residuos.

Las proteínas sustancialmente homólogas a B2M incluyen B2M de origen natural y B2M modificada, una variante encontrada en relación con una variedad de tipos de cáncer y trastornos del sistema inmune.

La primera secuencia antígena corresponde a una secuencia derivada de, o asociada con, un agente etiológico o un tumor. El agente etiológico puede ser un microorganismo tal como un virus, bacteria, hongo o parásito. El virus puede ser: un retrovirus, tal como HIV-1, HIV-2, HTLV-I, HTLV-II, HTLV-III, SIV, BIV, LAV, ELAV, CIAV, virus de leucemia de ratón, virus de leucemia de ratón de Moloney y virus de leucemia de felino; un ortomixovirus, tal como influenza A o B; un paramixovirus, tales como virus de parainfluenza, paperas, sarampión, RSV y virus de Sendai; un papovavirus, tal como HPV; un arenavirus, tal como LCMV de seres humanos o ratones; un hepadnavirus, tal como virus de Hepatitis B; un virus de herpes, tal como HSV, VZV, CMV o EBV. El antígeno asociado con, o derivado de, tumor puede ser por ejemplo un antígeno de tumor humano proteínico, tal como un antígeno asociado con melanoma, o un antígeno asociado con tumor epitelial tal como carcinoma de pecho o colon.

La secuencia antígena puede derivarse también de una bacteria, tal como del género Neisseria, Campyobacter, Bordetella, Listeria, Mycobacteria o Leishmania, o un parásito, tal como del género Trypanosoma, Schizosoma, Plasmodium, especialmente P. falciparum, o de un hongo, tal como del género Candida, Aspergillus, Cryptococcus, Histoplasma o Blastomyces.

Las secuencias antígenas preferidas corresponden a epítopes de CTL de un retrovirus, un paramixovirus, un arenavirus o un virus hepadna, o una célula de tumor humano. Los ejemplos incluyen epítopes de:

1) gp 120 de HIV (particularmente HIV-1),

2) p24 de HIV (particularmente HIV-1),

3) gpI, gpII y gpIII de VZV,

4) nucleoproteína de LCMV,

5) nucleoproteína del virus de la influenza,

6) proteínas L1 y L2 de HPV,

7) virus de papiloma humano E5 y E7,

8) antígenos de CSP o RESA de malaria,

9) p6 de micobacteria,

10) antígeno asociado con tumor epitelial GA 733-2,

11) secuencia de repetición de MUC-1 de antígeno asociado con tumor epitelial,

12) antígenos de melanoma MZ2-E,

13) antígeno asociado con melanoma p97,

Las secuencias antígenas particularmente preferidas se derivan del tercer dominio variable de una proteína de envoltura de un lentivirus. Esta región de lentivirus, conocida como el lazo V3 o lazo GPGR se encuentra entre los aminoácidos 300 y 330 de gp 120 de HIV-1 y en posiciones análogas de otros lentivirus. El lazo V3 es, para HIV-1 al menos, el principal epítope neutralizante del virus (Putney et al 1986 Science 234, 1392; Rusche et al 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 3198; Palker et al 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85 1932; y Goudsmit et al., 1988 AIDS 2 157). La porción antígena de elección puede constituir la totalidad del lazo V3 cuando se deriva de cepas diferentes. Sin embargo, pueden ser útiles copias múltiples de una secuencia conservada del lazo V3 para conferir inmunidad contra más de un aislado de un virus (tal como HIV-1).

Las proteínas de fusión de B2M según la invención pueden fabricarse en principio por cualquier método conveniente, incluyendo acoplamiento entre sí de residuos de aminoácidos sucesivos, o por el acoplamiento químico de dos o más cadenas de oligo o polipéptidos o de proteínas existentes (por ejemplo, naturales). Aunque pueden sintetizarse en principio proteínas total o parcialmente por medios químicos, la vía de elección será traducción ribosómica, preferiblemente in vivo, de una secuencia de ácidos nucleicos correspondiente.

Según un segundo aspecto de la invención, por tanto, se proporciona un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión como se ha descrito antes. Ambos ADN y ARN están dentro del alcance de la invención. El ADN puede ser sintetizado químicamente y/o recombinante.

El ADN recombinante según la invención puede estar en forma de un vector. El vector puede ser, por ejemplo, un plásimido, cósmido o fago. Los vectores incluyen frecuentemente uno o más marcadores seleccionables para permitir la selección de células transformadas (o transfectadas: los términos se usan intercambiablemente en esta memoria descriptiva) con ellos y, preferiblemente, para permitir la selección de células que albergan vectores que incorporan ADN heterólogo. Están generalmente presentes señales que inician y de terminación de la traducción apropiadas. Adicionalmente, si el vector se pretende para expresión, se incluyen secuencias reguladoras de la transcripción suficientes para conducir la expresión. Son útiles como vectores de clonación vectores que no incluyen secuencias reguladoras. Según un tercer aspecto de la invención, se proporciona un vector que incluye ácido nucleico como se ha descrito antes. Ha de entenderse que el término "vector" se usa en esta memoria descriptiva en un sentido funcional y no ha de considerarse como estando limitado necesariamente a una molécula de ácido nucleico simple.

Los vectores de expresión según la invención contienen habitualmente un promotor. La naturaleza del promotor dependerá de la célula de expresión hospedante propuesta. Para levadura, PGK es un promotor preferido, pero puede usarse cualquier otro promotor adecuado si es necesario o deseable. Los ejemplos incluyen GAPD, GAL1-10, PHO5, ADH1, CYC1, secuencia Ty delta, PYK y promotores híbridos fabricados a partir de componentes de más de un promotor (tales como los listados). Para células de insectos, un promotor preferido es el promotor de polihedrina de virus de polihedrosis nuclear de Autographica californica (AcNPV). Los expertos en la técnica serán capaces de determinar otros promotores apropiados adaptados para expresión en éstas u otras células. Pueden usarse vectores que no incluyen promotores como vectores de clonación , en lugar de vectores de expresión.

Los vectores de clonación pueden introducirse en E. coli o cualesquiera otros hospedantes adecuados que faciliten su manipulación. Los vectores de expresión pueden adaptarse para expresión procariota en células bacterianas, tales como E. coli. Sin embargo, como preferencia, se adaptan los vectores para expresión en una célula eucariota microbiana, tal como una levadura (incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris) u una célula eucariota superior tal como linajes celulares de insectos tales como Spodoptera frugiperda SF9, o células de mamífero incluyendo células de ovario de hámster chino (CHO), linajes celulares de mieloma de ratón tales como P3X63-Ag8.653, células COS, células HeLa, células BHK, linajes celulares de melanoma tales como el linaje celular de Bowes, células L de ratón, linales celulares de hepatoma humano tales como Hep G2, fibroblastos de ratón y células NIH 3T3 de ratón. El funcionamiento de la invención no depende ni está limitado a ninguna cepa particular de microorganismo o tipo de célula: los adecuados para su uso con la invención serán evidentes para los expertos en la técnica, siguiendo la enseñanza de esta memoria descriptiva. Según un cuarto aspecto de la invención, se proporciona una célula hospedante transfectada o transformada con el ADN descrito antes.

A pesar de ser conocida la secuencia de ADN de B2M, no ha sido posible hasta ahora producir eficazmente B2M recombinante. Se producen rendimientos extremadamente bajos por expresión en células de mamíferos, y la proteína se pliega incorrectamente tras la expresión en E. coli. Ni hay levaduras hospedantes universalmente para este propósito. Las técnicas estándares para obtener la expresión de B2M en quizás la levadura usada más extensamente para tales fines, es decir, S. cerevisiae, produjeron muy malos rendimienos.

El sistema de expresión de Pichia pastoris es muy conocido, y tiene ventajas particulares en su facilidad de cambio de escala para producción a gran escala. Se ha obtenido un alto nivel de expresión para un cierto número de proteínas en ese hospedante, pero, igualmente, algunas han demostrado dificultad de producción. No hay una correlación obvia entre las propiedades de un polipépido particular y su capacidad para ser expresado altamente en el sistema Pichia.

Como contraste con el bajo nivel de expresión de B2M en S. cerevisiae, pueden obtenerse rendimientos razonables de las proteínas de fusión de esta invención en el sistema Pichia.

Por tanto, la invención incluye un método para producir proteínas de fusión de la invención cultivando una levadura metilotrópica que alberga un vector de expresión que comprende ADN que codifica la proteína de fusión pertinente, y recuperando la proteína de fusión expresada.

Las cepas de levadura metilotrópica incluyen Pichia, en particular P. pastoris, Hansenula, Candida y Torulopsis. Se prefiere actualmente el uso de Pichia pastoris.

El ADN recombinante que codifica las proteínas de fusión de la invención puede incorporarse en un vector de expresión de levadura para expresión en levadura metilotrópica según la invención. Tales vectores contienen usualmente un promotor. AOX es un promotor preferido, pero puede usarse si es necesario o deseable cualquier otro promotor adecuado. Los ejemplos incluyen GAPD, GAL1-10, PHO5, ADH1, PGK, CYC1, secuencia Ty delta, PYK y promotores híbridos fabricados a partir de componentes de más de un promotor (tales como los listados).

Para obtener secreción de la proteína de fusión de las células de levadura después de la expresión, el vector de expresión incluye preferiblemente una secuencia líder de secreción fusionada a la secuencia de B2M de la proteína de fusión híbrida. Después de la secreción, la secuencia líder se divide automáticamente de la proteína B2M por

\hbox{enzima(s)}

producida(s) naturalmente durante el cultivo de las células de levadura transformadas. Tales técnicas de secreción son muy conocidas. Las líderes de secreción conocidas en la técnica incluyen el factor alfa, Pho1, HSA y Suc2. Si la división no es 100% precisa, la producción final de la proteína de fusión puede contaminarse con una fusión de B2M/híbrido de epítope con parte de la secuencia del factor de secreción, indicando una separación incompleta de la líder de factor de secreción. Aunque la proteína híbrida de la invención puede separarse del contaminante por métodos de purificación estándares, por ejemplo los basados en pesos moleculares diferentes, sería deseable evitar la dificultad si es posible.

Aparece que la líder Pho1 se divide en general correctamente de las proteínas de fusión híbridas de la invención, y es por tanto el factor de secreción preferido actualmente para su uso según la invención.

Las proteínas de fusión de B2M del primer aspecto son útiles como vacunas. Éstas podrían usarse antes de la exposición como agentes profilácticos, o después de la exposición como agentes inmunoterapéuticos para aumentar la liquidación de infección vírica. Tales proteínas de fusión se administrarían por vías convencionales, i.v., i.m. o s.c., aunque puede preferirse la vía s.c.

Según un quinto aspecto de la invención, se proporciona una formulación farmacéutica o veterinaria que comprende una proteína de fusión de B2M como se ha descrito antes y un excipiente aceptable farmacéutica o veterinariamente. Una o más proteínas de fusión del primer aspecto pueden estar presentes en asociación con uno o más excipientes aceptables farmacéutica o veterinariamente no tóxicos, tales como solución salina fisiológica estéril o PBS estéril, y/o diluyentes y/o coadyuvantes y, si se desea, otros ingredientes activos. La esterilidad es generalmente esencial para vacunas administrables parenteralmente. También pueden estar presentes uno o más coadyuvantes apropiados. Los ejemplos de coadyuvantes adecuados incluyen compuestos péptidos de muramilo tales como dipéptido de muramilo prototipo, hidróxido de aluminio y saponina. Puede considerarse también la coadministración con citoquinas, por ejemplo IFN\gamma puede potenciar la respuesta inmune induciendo la expresión de MHC Clase I.

Puede preferirse que, cuando se usan como vacunas profilácticas, los agentes de B2M se usen en combinación con vacunas subunitarias diseñadas para inducir buenas respuestas de anticuerpos neutralizantes. Sin embargo, esto puede no ser necesario porque hay alguna evidencia de que las respestas de CTL solas pueden proteger contra infección.

Según un sexto aspecto de la invención, se proporciona una proteína de fuión de B2M que comprende una primera secuencia de aminoácidos antígena fusionada directa o indirectamente al término N de una segunda secuencia de aminoácidos homóloga al menos un 60% a beta-2-microglobulina (B2M) o una secuencia que conserve al menos el 60% de sus residuos, caracterizada porque la primera secuencia de aminoácidos antígena corresponde a una secuencia derivada de, o asociada con, un tumor o agente etiológico, para su uso como una vacuna profiláctica o inmunoterapéutica. Según un séptimo aspecto de la invención, se proporciona también el uso de una proteína de fusión de B2M de la invención en la preparación de una vacuna profiláctica o inmunoterapéutica.

La invención proporciona también un procedimiento para preparar una formulación farmacéutica o veterinaria de la invención, cuyo procedimiento comprende mezclar una proteína de fusión de B2M de la invención y un excipiente aceptable farmacéutica o veterinariamente.

El ingrediente activo puede administrarse parenteralmente en un medio estéril. Dependiendo del vehículo y la concentración usados, el fármaco puede suspenderse o disolverse en el vehículo. Ventajosamente, pueden disolverse en el vehículo coadyuvantes tales como agentes anestésico local, de conservación y de tamponación.

Pueden ser útiles antígenos en partículas producidos según la invención en la preparación de vacunas, por ejemplo vacunas inmunoterapéuticas, que forman un aspecto adicional de la invención.

El siguiente Ejemplo ilustra la invención:

La Figura 1 muestra el vector de expresión de levadura pSW6, en el que se clona el gen de B2M según el ejemplo 2.

La Figura 2 muestra el vector de expresión de Pichia pHILD1 usado como punto de partida en el ejemplo 3 para la construcción del vector de expresión para expresión de alto nivel de B2M en P. pastoris, usando la secuencia líder de factor alfa.

La Figura 3 muestra el vector intermedio pLHD4 usado en el ejemplo 3 en la construcción del vector de expresión de factor alfa de P. pastoris/B2M.

La Figura 4 muestra el vector de expresión de factor alfa de P. pastoris/B2M pLH15 preparado según el ejemplo 3.

La Figura 5 muestra el vector de expresión de Pichia pHILS1 usado como punto de partida en el ejemplo 4 para la construcción del vector de expresión para expresión de alto nivel de B2M en P. pastoris, usando la secuencia líder de Pho1, y las manipulaciones que conducen al vector de expresión de Pho1 de P. pastoris/B2M pLH46 preparado según el ejemplo 4.

La Figura 6 muestra la secuencia de la fusión Pho1/B2M incluida en pLH46 (Figura 5), en la que la secuencia subrayada representa el lugar de clonación, las letras cursivas representan la secuencia señal de Pho 1 y las letras negritas son idénticas a la secuencia del gen de B2M.

La Figura 7 muestra el resultado del ensayo descrito en el Ejemplo 9.

Ejemplo 1 Aislamiento del gen de B2M y preparación para clonar

Se purificó ARN de células sanguíneas humanas usando el método de isotiocianato guanidinio (RNAzol B®, Biogenesys). Este ARN se usó como plantilla para síntesis de cADN de primera cadena con el uso de cebadores oligo dT usando el método de Maniatis (en Molecular Cloning, 1989).

El cADN se multiplicó después en reacciones PCR usando el cebador (5'-GACAAGCTTGGATAAAAGAATCC-
GCGTACTCCAAAG-3') SEQ ID 1 para añadir un lugar de restricción de HindIII y una secuencia adaptadora que codifica los últimos 5 aminoácidos del factor de acoplamiento alfa de S. cedrevisiae en el extremo 5' del gen, y (5'-CATAGGATCCTTATTACATGTCTCCGATCCCACTT-3') SEQ ID 2, que añadió un codón de terminación y un lugar de BamH1 en el extremo 3' del gen. Los productos de PCR se generaron en 30 ciclos de desnaturalización a 97ºC durante 1 min, reasociación a 60ºC durante 1 min y alargamiento a 72ºC durante 30 segundos. Las reacciones se realizaron en MgCl_{2} 1 mM, KCl 50 mM, Tris 10 mM pH 3 usando 50 ng de cebador en un volumen de 50 \mul. La secuencia del gen se muestra en la Figura 2. Después de multiplicación por PCR, se digirió el ADN con HindIII y BamHI y se ligó en M13mp19 tratado con fosfatasa intestinal de becerro HindIII y BamHI. Se determinó después la secuencia de los clones de M13 para identificar aislados que no tenían diferencia con la secuencia publicada usando el cebador universal (5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3') SEQ ID 3. Se purificó después el ADN de uno de estos clones y se subclonó en el vector de expresión de S. cerevisiae pSW6 (véase Ejemplo 2).

Ejemplo 2 Clonación del gen de beta-2 microglobulina en el vector de expresión de S. cerevisiae pSW6

Se diseñó un vector de expresión para permitir la secreción de B2 microglobulina en el medio extracelular después de la expresión en S. cerevisiae. La secreción ayuda a la purificación y análisis rápido de B2M. Las señales de secreción del factor alfa de tipo acoplamiento de levadura se usaron para dirigir la exportación de la proteína de B2 microglobulina.

El vector de expresión de levadura pSW6 (Figura 1) se basa en el círculo de 2 micrómetros de S. cerevisiae. (El pSW6 está depositado en la cepa BJ2168 de S. cerevisiae en la National Collection of Industrial and Marine Bacteria Limited, 23 St. Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Reino Unido, con el Nº de Admisión NCIMB 40326). El pSW6 es un vector lanzadera capaz de replicación en E. coli y S. cerevisiae y contiene un origen de replicación de ADN para ambos organismos, el gen de leu2 (un marcador seleccionable para mantenimiento de plásmido en el hospedante levadura) y el lugar de resistencia a ampicilina para selección de mantenimiento de plásmido en E. coli. (La secuencia de ADN para el vector se describe en el documento WO-A-09125). La capacidad de pasar este vector a través de E. coli facilita en gran medida su manipulación genética y la facilidad de purificación. El pSW6 contiene un gen pre-pro-péptido de factor alfa fusionado enmarcado a un gen que codifica factor de crecimiento epidérmico humano (EGF). La expresión de esta fusión está bajo el control de un promotor regulado por galactosa eficaz que contiene secuencias de ADN híbrido del GAL 1-10 de S. cerevisiae y promotores de fosfoglicerato quinasa (PGK). La transcripción del gen de EGF se termina en este vector por el terminador de PGK de levadura natural. El gen de EGF en pSW6 puede separarse por digestión con endonucleasas de restricción HindIII y BamHI. Esto separa ADN que codifica EGF y 5 aminoácidos del término C del pro-péptido de factor alfa. Los genes a insertar en el vector de expresión pSW6 deben tener por tanto la composición general: lugar de HindIII-adaptador de factor alfa-gen-lugar de BamHI. El gen de B2M preparado en el Ejemplo 1 tiene esta composición general.

Después de digestión con endonucleasas HindIII y BamHI, el vector pSW6 contiene el gen de factor alfa menos los codones para los últimos cinco residuos de aminoácidos. El gen de B2M preparado como en el Ejemplo 1 se clonó después en el vector pSW6. El vector resultante se transformó después en la cepa hospedante BJ2168 usando el método de Ito et al J. Bacteriol. (1983) 153 163-168.

Ejemplo 3 Construcción de vector de expresión de Pichia pastoris de factor alfa/B2M

Los vectores de expresión usados para este trabajo se derivaron del vector de expresión de Phillips Petroleum pHILD1.

El vectos de expresión de Pichia pHILD1 (Figura 2) es un vector lanzadera capaz de propagación en E. coli (por facilidad de manipulación genética) y en la levadura metilotrófica Pichia pastoris. El pHILD1 puede obtenerse bajo licencia de la Phillips Petroleum Company, Bartlesville Oklahoma, EE.UU. El vector comprende secuencias derivadas del vector de E. coli pBR322 y secuencias derivadas del genoma de Pichia pastoris. Los aspectos esenciales son la región 5' del gen de AOX de Pichia que incluye el promotor AOX regulable para transcripción de alto nivel, la región 3' del gen de AOX que contiene la secuencia terminadora transcripcional de alcohol oxidasa; se incluye una región adicional de la parte 3' del gen de -AOX que, junto con la región de AOX 5', se requiere para integración dirigida por el lugar de la cassette de expresión en el genoma del hospedante. El gen de histidinol deshidrogenasa de P. pastoris HIS4 se lleva y usa para complementar el gen HIS 4 defectuoso en cepas del hospedante Pichia. Se lleva el gen de resistencia a ampicilina para permitir la selección en los hospedantes E. coli usados durante la manipulación genética.

El vector pHILD1 se manipuló para permitir la expresión del gen de B2M bajo el control de la señal de secreción de factor alfa. El pHILD1 no lleva ninguna secuencia que codifique señales de secreción para permitir la exportación de proteínas heterólogas. Para incluir tal señal, se manipuló el vector por adición de secuencias del líder de factor alfa de S. cerevisiae. El vector se diseñó adicionalmente para proporcionar un contexto de promotor más óptimo y para separar lugares de restricción de Hind III indeseables que pueden interferir con la clonación del gen de B2M, se introdujo después un lugar de Bam HI 3' hacia el Hind III restante para permitir la clonación del gen de B2M en un lugar de restricción de HindIII-BamHI y para incluir una cassette de resistencia a canamicina que permite la selección de integrantes multicopia en cepas hospedantes de Pichia. Las fases de las manipulaciones se muestran seguidamente.

1) Inclusión de señales de secreción de factor alfa

Las secuencias de factor alfa se clonaron en el vector pHILD1 a partir del vector de expresión pSW6 de S. cerevisiae (Figura 1) (véase el ejemplo 2 para tener detalles). Las secuencias de factor alfa se aislaron de pSW6 en un fragmento de ADN de BgI II-BamHI de unos 430 pb; este fragmento contiene las secuencias de factor alfa fusionadas a un gen sintético de factor de crecimiento epidérmico humano (EGF). Los extremos sobresalientes de este fragmento de ADN se llenaron primero usando fragmento de Klenow de polimerasa I de ADN de E. coli junto con los desoxinucleósido trifosfatos requeridos según metodología estándar.El fragmento de extremo enrasado se clonó después en el vector pHILD1 que se había tratado con Eco RI y hecho después de extremos romos como antes. Se comprobó la integridad del plásmido resultante pLH001 mediante una combinación de digestón con restricción y análisis de secuencia de ADN. El cebador usado para análisis de la secuencia fue (5'-GCATTCTGACATCCTCT-3'), SEQ ID 4. Se confirmó la secuencia de la fusión de factor alfa.

2) Mutagénesis para optimizar el vector para expresión de B2M

Para separar lugares de restricción de Hind III no deseados, optimizar la región de promotor e introducir un lugar de Bam H1 a partir del vector pLHOO1, se clonaron fragmentos pertinentes en el bacteriófago M13 para mutagénesis dirigida por el lugar. Los fragmentos clonados, los cebadores usados para mutagénesis y los cebadores usados para determinación de secuencia se detallan después. Además, se modificó un cassette de resistencia a canamicina para introducción en el vector de expresión final a fin de permitir selección para integrantes multicopia cuando se introduce el vector en cepas hospedantes de Pichia.

Un fragmento de SacI-SacI de 1220 pb se aisló de pLH001 y se clonó en M13 mp19. Esta construcción de M13 se usó después para mutagénesis en la que se separó un lugar de HindIII usando el cebador oligonucleótido (5'-CGTTAAAATCAACAACTTGTCAATTG-GAACC-3'), SEQ ID 5, y los mutantes se identificaron por análisis de secuencia con el cebador de determinación de secuencia (5'-GGAAATCTCACAGATCT-3'), SEQ ID 6. Este fragmento se modificó adicionalmente por mutagénesis de supresión para optimizar la región líder no traducida 5' que precede al promotor AOX, que es ahora idéntico al encontrado en la líder no traducida 5' natural del gen de AOX1 en el genoma de Pichia. Se prefiere para expresión máxima tener el contexto correcto alrededor de la líder no traducida 5'. El cebador de mutagénesis usado para esta etapa fue (5'-GAAGGAAATCTCATCGTTTCGAATA-3'), SEQ ID 7. El mutante se identificó por análisis de secuencia con el cebador de determinación de secuencia (5'-GCTAATGCGG-AGGATGC-3'), SEQ ID 8.

Dos lugares de HindIII adicionales se separaron del fragmento de SacI-XbaI de 770 pb de pLH001 por mutagénesis. El fragmento de SacI-XbaI de pLH001 se clonó primero en M13 mp18 y se separó uno de los lugares de Hind III usando el cebador (5'-CCGGCATTACAACTTATCGATAAGCTTGCAC-3'), SEQ ID 9. La identidad de este mutante se confirmó por análisis de secuencia usando el cebador de determinación de secuencia (5'-GCGCATTGTTAGATTTC-3'), SEQ ID 10. Se separó un segundo lugar de HindIII de este fragmento recién mutagenizado usando el cebador de mutagénesis (5'-CTTATCGATCAACTTGCACAAACG-3'), SEQ ID 11. Se identificó el mutante correcto por análisis de secuencia usando el cebador de determinación de secuencia SEDQ ID 9 (véase antes).

Antes de volver a montar, se introdujo un lugar de BamHI en el fragmento de SacI-XbaI suprimido de HindIII para permitir la clonación subsiguiente del gen de B2M del ejemplo 1 en un fragmento de HindIII-BamHI. El cebador de mutagénesis usado para introducir el lugar de BamH1 fue (5'-GTCATGTCTAAGGCGGATCCTTATTAAC-3'), SEQ ID 12. La identidad del mutante se identificó usando el cebador de determinación de secuencia (5'-GCATTCTGACATCCTCT-3'), SEQ ID 13.

3) Modificación de la cassette de resistencia a canamicina

Se compró una cassette de resistencia a canamicina de Pharmacia Biosystems Limited, Davy Avenue. Knowhill, Milton Keynes, MK5 8PH. Gran Bretaña. Esta cassette se suministró como un fragmento de EcoRI por Pharmacia y éste se clonó en M13 mp19 como un fragmento de EcoR1. El HindIII interno se suprimió usando el cebador de mutagénesis (5'-GAGAATGGCAACAACTTATGCATT-3'), SEQ ID 14. Se confirmó la mutación usando el cebador de determinación de secuencia (5'-CCAACATCAATACAACC-3'), SEQ ID 15.

4) Remontaje de vector de expresión

El vector se reconstruyó de una manera por etapas usando el vector pHILD1 de Phillips Petroleum como cadena principal para la clonación.

Para reconstruir el vector de expresión incluyendo los fragmentos mutagenizados, el fragmento de SacI-XbaI de unos 770 pb modificado se ligó primero en vector pHILD1 tratado con SacI-XbaI. Se confirmó después la integridad de la construcción recombinante por análisis de restricción y análisis de la secuencia de ADN usando el cebador de determinación de secuencia oligonucleótido (5'-GCGCATTGTTAGATTTC-3'), SEQ ID 16, y se denominó a la construcción vector intermedio 1. El fragmento de SacI-SacI modificado se clonó a continuación en el vector intermedio 1 que se había tratado con SacI y fosfatasa intestinal de becerro. La construcción resultante, denominada vector intermedio 2, se confirmó de nuevo por análisis de restricción y análisis de la secuencia de ADN con los cebadores oligonucleótidos (5'-GGAAATCTCATAGATCT-3'), SEQ ID 17, para leer a través del lugar de HindIII suprimido y (5'-GCTAATGCGGAGGATGC-3'), SEQ ID 18, para leer a través de la región líder no traducida 5' optimizada. El vector intermedio 2 es un homólogo de pHILD1 que carece de los lugares de HindIII no deseados, tiene una región no traducida 5' optimizada, contiene secuencias que codifican las señales de secreción de factor alfa de S. cerevisiae, seguidas por el lugar de HindIII restante y que tiene un lugar de BamHI 3' hacia el lugar de HindIII para permitir la clonación del gen de B2M.

Un fragmento de Hinc11 de 1.200 pb que contenía la cassette de canamicina mutagenizada se separó del vector de mutagénesis M13 mp19 (usado para separar el lugar de Hind III del gen de resistencia a canamicina) y se clonó en el lugar de Nae 1 único del vector intermedio 2.El vector se volvió a denominar pLHD4. La integridad de pLHD4 se confirmó por análisis de restricción. Un mapa de pLHD4 se muestra en la Figura 3. El pLHD4 contiene el gen de EGF humano fusionado a la señal de secreción de S. cerevisiae.

5) Construcción del vector de expresión de Pichia de B2M

El vector de expresión final para expresión de B2 microglobulina se construyó clonando el fragmento de Hind III-Bam HI del ejemplo 2 en pLHD4. (Este fragmento de Hind III-Bam HI de 320 pb contiene el gen de B2M fusionado al extremo 3' de una secuencia que codifica los 5 aminoácidos del factor alfa de levadura que precede al lugar de división de KEX2 requerido para liberación del péptido maduro tras la secreción desde el hospedante Pichia).

El fragmento de Hind III-Bam H1 se obtuvo por digestión con restricción del vector de expresión de S. cerevisiae pSW6 B2M. Este fragmento se purificó en un gel de agarosa de baja temperatura de fusión del 1,5% y se ligó después a Hind III-Bam H1, y pLHD4 tratado con fosfatasa intestinal de becerro. El recombinante resultante se denominó pLH15. El vector se muestra en la Figura 4. (En este momento, el gen de resistencia a canamicina era defectuoso, debido a una supresión de bases entonces desconocida, que tuvo lugar durante la mutagénesis para suprimir el lugar de Hind III interno. Un fragmento de Sac I-Xba I de unas 2.070 pb se separó de la construcción resultante y se clonó en el vector de expresión pHILD4, confiriendo así resistencia a canamicina). La integridad de la construcción se confirmó por análisis de restricción y análisis de determinación de secuencia usando el cebador de determinación de secuencia (5'-GCATTCTGACATCCTCT-3'), SEQ ID 19.

Ejemplo 4 Construcción de vector de expresión de Pichia pastoris de Pho1/B2M

Los vectores de expresión usados para este trabajo se derivaron del vector de expresión de Phillips Petroleum pHILS1 (Figura 5).

El vector de expresión de partida para manipulación fue el vector lanzadera de Pichia pastoris pHILS1 (obtenible bajo licencia de Phillips Petroleum) capaz de propagación en E. coli (por facilidad de manipulación genética) y en la levadura metilotrópica Pichia pastoris. Contiene la secuencia líder de Pho 1 del gen de fosfatasa ácida de Pichia pastoris. Contiene también secuencias del vector de E. coli pBR322 y secuencias derivadas del genoma de Pichia pastoris. Los aspectos esenciales son la región 5' del gen de AOX que incluye el promotor AOX regulable con metanol para transcripción de alto nivel, la región 3' del gen de AOX que contiene la secuencia terminadora transcripcional de alcohol oxidasa, una región adicional de la región 3' que, junto con la región de AOX 5', se requiere para integración dirigida por el lugar en la cassette de expresión en el cromosoma. El gen de histidinol deshidrogenasa de Pichia HIS4 se lleva y usa para complementar la copia defectuosa del gen his4 defectuoso en el genoma del hospedante. Se lleva el gen de resistencia a ampicilina para permitir la selección en el hospedante E. coli usado durante la manipulación genética.

El vector pHILS1 se manipuló para permitir la expresión del gen de B2M bajo el control de la señal de secreción de Pho 1:

El gen que codifica B2M se clonó en el vector pHILSI del vector de expresión de S. cerevisiae pSW6 que contiene el gen como un fragmento de HindIII-BamHI (Ejemplo 2). El extremo sobresaliente del fragmento de ADN en el lugar de HindIII se llenó primero para crear un extremo romo usando el fragmento de Klenow de polimerasa I de ADN junto con los trifosfatos de desoxinucleótidos requeridos según una metodología estándar. El vector pHILSI se restringió con las endonucleasas de restricción EcoR1 y Bam H1. El extremo sobresaliente del fragmento de ADN y el lugar de EcoRI se llenaron como se ha descrito antes para crear un extremo romo. El gen de B2M, como un lugar de BamHI de extremo romo se clonó en el vector tratado con BamHI de extremo romo. La integridad del vector resultante, vector intermedio 3, se confirmó por análisis de restricción.

El fragmento de HindIII-BamHI del vector de expresión pSW6 contiene el gen de B2M fusionado en el extremo 3' hacia los últimos 5 aminoácidos del factor alfa de levadura que precede al lugar de división de KEX2 requerido para liberacióndel péptido maduro tras secreción del hospedante Pichia pastoris cuando se usa la secuencia del factor alfa. Esta secuencia y unas pocas bases en el lugar de clonación se suprimieron para permitir la fusión directa de la secuencia líder de Pho 1 y el gen de B2M. La secuencia suprimida es (5'-CGAGAATTAGCTTGGATAAAAGA-3'), SEQ ID 20.

\newpage

Un fragmento de SacI-BamHI de unos 1.150 pb (SstI) se aisló del vector intermedio 3 y se clonó en el vector M13mp18. Este fragmento contiene 700 pb de la secuencia del promotor AOX 5', la secuencia señal de Pho1 y el gen de B2M. La construcción M13 se usó después para mutagénesis a fin de suprimir la secuencia que interviene entre la secuencia de Pho1 y el gen de B2M. El cebador oligonucleótido usado para mutagénesis fue (5'-GGAGTACGCTGGATAGCGAAGACAGATTG-3'), SEQ ID 21. Los mutantes se identificaron por análisis de secuencia usando el cebador de determinación de secuencia (5'-CCATTCTCTGCTGGATG-3'), SEQ ID 22. La secuencia de Pho1/B2M se muestra en la Figura 6, SEQ ID 23.

El vector se reconstruyó usando el vector de expresión pLH15 (Ejemplo 3(5)) como cadena principal para la clonación. El vector se restringió con las endonucleasas de restricción (Sst) SacI y BamHI para liberar un fragmento de unos 1.150 pb que contenía un fragmento de 700 pb de la secuencia del promotor AOX 5' y la secuencia señal de factor alfa fusionados al gen de B2M, que se sustituyó después por el fragmento de (Sst) SacI-BamHI mutagenizado que contenía un fragmento de 700 pb de la secuencia del promotor AOX 5', la secuencia señal de Pho1 fusionada al gen de B2M. El recombinante resultante se denominó pLH46. El vector se muestra en la Figura 6. La integridad de la construcción se confirmó por análisis de restricción usando el cebador de determinación de secuencia (5'-GCATTCTGACATCCTCT-3'), SEQ ID 24.

Ejemplo 5 Construcción de vectores pGC633 que contienen la secuencia de ADN del epítope del virus de Sendai

El vector de expresión pGC633 contiene el gen que codifica B2M fusionado en el extremo 5' al epítope de virus de Sendai (Kast et al Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 2283-2287 (1991)) mediante un enlazador corto. La secuencia epítope/enlazador péptido fusionada a la secuencia de B2M es FAPGNYPALGGGGG, SEQ ID 25. Los aminoácidos subrayados constituyen la secuencia enlazadora, diseñada para extenderse sobre el espacio entre el péptido y la B2M con disrupción mínima a la conformación de la cadena ligera.

El vector de expresión pLH46 (Ejemplo 3) se restringió con las endocucleasas de restricción SacI (SstI) y BamHI para liberar un fragmento de unos 1.150 pb que contenía un fragmento de 700 pb de la secuencia del promotor AOX 5', la secuencia señal de Pho1 fusionada al gen de B2M. Este fragmento se clonó en M13mp18 que se había restringido con SacI (SstI) y BamHI. Se usó después para mutagénesis la construcción de M13 a fin de insertar la secuencia que codifica el péptido de Sendai. El cebador oligonucleótido usado para mutagénesis fue (5'-GGAGTACGCTGGATACCACCACCACCACCCAAAGCTGGGTAGTTACCTGGAGCGAAAGCGAAGZCAGATT-3'), SEQ ID 26. Los mutantes se identificaron por analisis de secuencia usando el cebador de determinación de secuencia (5'-CCATTCTCTG-
CTGGATG-3'), SEQ ID 27.

Se reconstruyó el vector usando el vector de expresión pLH46 (Ejemplo 3) como cadena principal para la clonación. El vector se restringió con las endocucleasas de restricción SacI (SstI) y BamHI para liberar un fragmento de unos 1.150 pb que contenía un fragmento de 700 pb de la secuencia del promotor AOX 5', la secuencia señal de Pho1 fusionada al gen de B2M, y se sustituyó por el fragmento mutagenizado. Se confirmó la integridad de la construcción por análisis de restricción y análisis de determinación de secuencia usando el cebador de determinación de secuencia (5'-GCATTCTGACATCCTCT-3'), SEQ ID 28.

Ejemplo 6 Construcción de vectores pGC638 que contienen la secuencia de ADN del epítope del virus de la influenza A

El vector de expresión pGC638 contiene el gen que codifica B2M fusionado en el extremo 5' al epítope del virus de la influenza (Current Biology, 3, Nº 12 1993).. La secuencia epítope/enlazador péptido fusionada a la secuencia de B2M es GILGFVFTLGGGGGGSSS, SEQ ID 29. Los aminoácidos subrayados constituyen la secuencia enlazadora, diseñada para extenderse sobre el espacio entre el péptido y la B2M con disrupción mínima a la conformación de la cadena ligera.

El vector de expresión pLH46 (Ejemplo 3) se restringió con las endocucleasas de restricción SacI (SstI) y BamHI para liberar un fragmento de unos 1.150 pb que contenía un fragmento de 700 pb de la secuencia del promotor AOX 5', la secuencia señal de Pho1 fusionada al gen de B2M. Este fragmento se clonó en M13mp18 que se había restringido con SacI (SstI) y BamHI. Se usó después para mutagénesis la construcción de M13 para insertar la secuencia que codifica el péptido de Sendai. El cebador oligonucleótido usado para mutagénesis fue (5'-GGAGTACGCTGGATAGAA-
GAACCACCACCGACCACCACCACCACCACCCAAAGTGAAAACGAAACCCAAAATACCAGCGAAGACAG-
ATT-3'), SEQ ID 30. Los mutantes se identificaron por análisis de secuencia usando el cebador de determinación de secuencia (5'-CCATTCTCTGCTGGATG-3'), SEQ ID 27.

Se reconstruyó el vector usando el vector de expresión pLH46 (Ejemplo 2) como cadena principal para la clonación. El vector se restringió con las endonucleasas de restricción SacI (SstI) y BamHI para liberar un fragmento de unos 1.150 pb que contenía un fragmento de 700 pb de la secuencia del promotor AOX 5', la secuencia señal de Pho1 fusionada al gen de B2M, y se sustituyó por el fragmento mutagenizado. Se confirmó la integridad de la construcción por análisis de restricción y análisis de determinación de secuencia usando el cebador de determinación de secuencia (5'-GCATTCTGACATCCTCT-3'), SEQ ID 31.

Ejemplo 7 Construcción de cepas de expresión de Pichia

Se linealizó ADN de cada uno de los plásmidos pGC633 y pGC638 (Ejemplos 4 y 5) cortando con la endonucleasa de restricción Sac I. Esto fue para permitir que se integrase la cassette de expresión mediante recombinación homóloga de secuencias en la cassette de expresión y el cromosoma del hospedante. En cada caso, se transformó después el plásmido linealizado en cepa GS115 de P. pastoris (NRRL Y-1585) que tiene el genotipo his 4. El uso de esta cepa no es crítico para utilizarla en esta preparación o en la invención en general. Puede usarse cualquier cepa adecuada, tal como, por ejemplo, las cepas SMD1163 y KM71, que tienen los genotipos his4, prB1, pep4 e his4, aox1::SARG4. Las cepas GS115 y KM71 se describen en la patente de Phillips número AU-B-63882/86 (Modificación genómica selectiva para el lugar de levadura del género Pichia).

Los plásmidos se linealizaron con SacI y se usaron para transformar la cepa hospedante. La cepa de levadura GS115 se desarrolló durante la noche en 200 ml de YEPD a 30ºC en un sacudidor orbital. Se cosecharon los cultivos con A600 entre 1,3 y 1,5 por centrifugación a 3.000 rpm durante 5 min, se lavaron en agua estéril enfriada con hielo, se recentrifugaron y se resuspendieron en 8 ml de sorbitol 1 M enfriado con hielo. Se añadieron 40 \mul de células a 1 \mug de ADN linealizado en una cubeta de electroporación de 0,2 cm enfriada con hielo. Después de 5 min en hielo, se pulsaron las células usando la unidad impulsadora de genes BioRad a 25 \muF, 1,5 kv y 400 ohmios. Se añadió a la cubeta 1 ml de sorbitol 1 M enfriado con hielo. Se pusieron en placas de agarosa 400 \mul de esto y se dejó crecer durante 2-4 días a 30ºC.

Todos los medios de levadura y tampones de transformación fueron como se describe en el apéndice.

Se recogieron transformantes junto con la capa superpuesta de agarosa que se había desarrollado, se transfirieron a un tubo de centrífuga de 50 ml y se resuspendieron en tampón de fosfato sódico 50 mM pH 6. Después de un mezclado y agitación adecuados para separar las células de la agarosa, se diluyeron y pusieron en placas de agar YEPD que contenían el antibiótico G418 en concentraciones entre 0 y 2.000 \mug/ml. Sólo las células en las que se habían integrado en el cromosoma del hospedante varias copias de la cassette de expresión serían capaces de crecer en altos niveles de antibiótico en virtud de las varias copias del gen de resistencia a canamicina que llevarían. Tales células se consideran deseables porque llevarán también varias copias del gen de B2M. El trabajo previo ha mostrado que tales integrantes multicopias son altos productores en condiciones en las que se expresa el gen extraño (Clare, J.J., Rayment, F.B., Ballantine, S.P., Sreekrishna, K. y Romanos, M.A., BIO/TECHNOLOGY, 9, 455-460, 1991). Las placas se incubaron a 30ºC durante 5-7 días. Se recogieron después colonias que tenían lugar en placas que contenían altas concentraciones del antibiótico y se estriaron sobre placas de agar MD reciente. Se obtuvieron colonias simples después de 3-4 días de crecimiento a 30ºC.

Ejemplo 8 Expresión de proteínas de fusión de Sendai/B2M e Influenza/B2M híbridas en P. pastoris

En experimentos separados, se usaron colonias simples de cepas transformadas que albergaban pGC633 y (separadamente) pGC638 para inocular 5 ml de medio BMGC y se desarrollaron los cultivos durante la noche a 30ºC en un sacudidor orbital. Este cultivo nocturno de 5 ml se usó después para inocular matraces de sacudidas tabicados de 2 l que contenían 50 ml del medio BMGC. Después de 24 h de crecimiento a 30ºC en un incubdor orbital, se cosecharon células por centrifugación a 3.000 rpm durante 5 min y se resuspendieron en 50 ml del medio BMGC. Esto induce la expresión genética a partir del promotor AOX1. Se realizó la inducción por crecimiento en el medio que contenía metanol a 30ºC durante 48 horas. Después de 24 horas, se añadieron al matraz 250 \mul de metanol estéril para sustituir la pérdida por evaporación.

Después de 48 horas, se recogió el sobrenadante de cultivo por centrifugación a 3.000 rpm durante 5 min. Se usó el sobrenadante para análisis adicional. Se estimó por SDS-PAGE que los niveles de producción de cepas con la secuencia líder de factor alfa eran del orden de 150 mg/l.

Ejemplo 9 Inducción de linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos para Sendai NP por el producto de Sendai/B2M híbrido del Ejemplo 7 (pGC633)

Se inmunizaron subcutáneamente ratones C57BL/6 (H-2^{b}) con 50, 10, 2 o 0,4 \mug de la proteína de fusión de Sendai NP-B2M híbrida expresada por pGC633 según el ejemplo 7, o 50 \mug de B2M más 20 ng del epítope de Sendai NP (FAPGNYPAL)- parte de SEQ ID 9. Después de 6 días, se separaron los bazos de dos ratones por grupo y una suspensión de células simples preparada que se reestimuló in vitro con el péptido de Sendai NP. Después de 24 horas, se añadió 2% de una preparación de IL2. Después de 7 días de reestimulación in vitro, se ensayó la capacidad de estas células efectoras para lisar células objetivo de péptido de Sendai NP-EL4 (H-2^{b}) pulsado. Las relaciones de células efectoras (E) a objetivo (T) fueron 100:1, 33,3:1, 11,1:1 y 3,7:1. Los resultados de este ensayo se registraron como % de lisis no específica, que se calcula sustrayendo la lisis de objetivos no pulsados con péptido de la obtenida usando objetivos pulsados con péptido.

Los resultados se representan en la Figura 7. Se vio una lisis específica del péptido del 24,4% con una relación ET de 100:1 tras la inmunización con 50 \mug de la proteína de fusión. Todas las dosis de inmunización de la proteína de fusión dieron respuestas similares a las obtenidas inmujnizando con una mezcla de B2M y péptido de Sendai NP.

Recetas de medios

BMGC

Cantidades por litro:

	Tampón de fosfato sódico 1 M, pH 6	100 ml
	Casaminoácidos (100 g/l)	100 ml
	Base de nitrógeno de levadura (13,4 g/l)	100 ml
	Biotina (0,5 g/l)	2 ml
	Glicerol	10 ml

Esterilizar con filtro

BMMC

Como antes, pero sustituir glicerol por 5 ml de metanol

YEPD

	Extracto de levadura	10 g/l
	Peptona	20 g/l
	Glucosa	10 g/l

Para medio sólido, añadir 15 g/l de agar.

Autoclave a 121ºC 15 min.

Claims (22)

1. Una proteína de fusión de B2M que comprende una primera secuencia de aminoácidos antígena fusionada directa o indirectamente al término N de una segunda secuencia de aminoácidos al menos 60% homóloga a beta-2-microglobulina (B2M) o una secuencia que retenga al menos el 60% de sus residuos, caracterizada porque la primera secuencia de aminoácidos antígena corresponde a una secuencia derivada de, o asociada con, un tumor o un agente etiológico, de uso como vacuna profiláctica o inmunoterapéutica.

2. Una proteína de fusión según la reivindicación 1ª, en la que la segunda secuencia de aminoácidos es la de B2M de origen natural.

3. Una proteína de fusión según la reivindicación 1ª, en la que el agente etiológico es un microorganismo tal como un virus, bacteria, hongo o parásito.

4. Una proteína de fusión según la reivindicación 3ª, en la que el virus es un retrovirus, tal como HIV-1, HIV-2, HTLV-I, HTLV-II, HTLV-III, SIV, BIV, LAV, ELAV, CIAV, virus de leucemia de ratón, virus de leucemia de ratón de Moloney y virus de leucemia de felino; un ortomixovirus, tal como influenza A o B; un paramixovirus, tales como virus de parainfluenza, paperas, sarampión, RSV y virus de Sendai; un papovavirus, tal como HPV; un arenavirus, tal como LCMV de seres humanos o ratones; un hepadnavirus, tal como virus de Hepatitis B; un virus de herpes, tal como HSV, VZV, CMV o EBV.

5. Una proteína de fusión según la reivindicación 3ª, en la que la secuencia antígena se deriva de una bacteria, tal como del género Neisseria, Campyobacter, Bordetella, Listeria, Mycobacteria o Leishmania, o un parásito, tal como del género Trypanosoma, Schizosoma, Plasmodium, especialmente P. falciparum, o de un hongo, tal como del género Candida, Aspergillus, Cryptococcus, Histoplasma o Blastomyces.

6. Una proteína de fusión según la reivindicación 1ª, en la que la secuencia antígena es un antígeno de tumor humano proteímico, tal como un antígeno asociado con melanoma, o un antígeno asociado con tumor epitelial tal como de carcinoma de pecho o colon.

7. Una proteína de fusión según la reivindicación 3ª, en la que la secuencia antígena es un epítope de:

1) gp 120 de HIV (particularmente HIV-1),

2) 24 de HIV (particularmente HIV-1),

3) gpI, gpII y gpIII de VZV,

4) nucleoproteína de LCMV,

5) nucleoproteína del virus de la influenza,

6) proteínas L1 y L2 de HPV,

7) virus de papiloma humano E5 y E7,

8) antígenos de CSP o RESA de malaria,

9) p6 de micobacteria,

10) antígeno asociado con tumor epitelial GA 733-2,

11) secuencia de repetición de MUC-1 de antígeno asociado con tumor epitelial,

12) antígenos de melanoma MZ2-E,

13) antígeno asociado con melanoma p97.

8. Una proteína de fusión según la reivindicación 3ª, en la que la secuencia antígena es un epítope del tercer dominio variable de una proteína de envoltura de un lentivirus.

9. Una proteína de fusión según alguna de las reivindicaciones precedentes, en la que la secuencia antígena está fusionada a la B2M mediante una secuencia enlazadora.

10. El uso de una proteína de fusión de B2M según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª-9ª, en la preparación de una vacuna profiláctica o inmunoterapéutica.

11. Una proteína de fusión híbrida que comprende una primera secuencia de aminoácidos antígena fusionada directa o indirectamente al término N de una segunda secuencia de aminoácidos al menos 60% homóloga a beta-2-microglobulina (B2M) o una secuencia que retenga al menos el 60% de sus residuos, caracterizada porque la primera secuencia de aminoácidos antígena corresponde a una secuencia derivada de, o asociada con, un tumor o un agente etiológico, distinta de la secuencia señal de E. coli OmpA, MKKTAIAIAVALAGFATVAQA.

12. Una proteína de fusión según la reivindicación 11ª, en la que la proteína de fusión es como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 2ª a 9ª.

13. Un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 9ª o 11ª a 12ª.

14. Un vector que incluye ácido nucleico según la reivindicación 13ª.

15. Una célula hospedante que lleva un vector según la reivindicación 14ª.

16. Una célula hospedante según la reivindicación 15ª, en la que la célula hospedante es E. coli.

17. Una célula hospedante según la reivindicación 15ª, en la que la célula hospedante es una célula de levadura tal como Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris.

18. Células hospedantes según la reivindicación 15ª, en las que la célula hospedante es una célula de insecto tal como Spodoptera frugiperda SF9, o células de mamífero incluyendo células de ovario de hámster chino (CHO), linajes celulares de mieloma de ratón tales como P3X63-Ag8.653, células COS, células HeLa, células BHK, linajes celulares de melanoma tales como el linaje celular de Bowes, células L de ratón, linales celulares de hepatoma humano tales como Hep G2, fibroblastos de ratón y células NIH 3T3 de ratón.

19. Una formulación farmacéutica o veterinaria que comprende una proteína de fusión de B2M según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 9ª o 11ª a 12ª y un excipiente aceptable farmacéutica o veterinariamente.

20. Una formulación farmacéutica o veterinaria según la reivindicación 19ª, que comprende además una vacuna subunitaria diseñada para inducir buenas respuestas de anticuerpos neutralizantes.

21. Un método para producir una proteína de fusión de B2M según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 9ª o 11ª a 12ª, cultivando una levadura metilotrópica que alberga un vector de expresión que comprende ADN que codifica la proteína de fusión pertinente, y recuperando la proteína de fusión expresada.

22. Un método según la reivindicación 21ª, en el que la levadura es Pichia pastoris.