ES2331441T3

ES2331441T3 - Dna que codifica dp-75 y un proceso para su uso.

Info

Publication number: ES2331441T3
Application number: ES97927980T
Authority: ES
Inventors: David Duhl
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1996-06-05
Filing date: 1997-06-04
Publication date: 2010-01-04
Anticipated expiration: 2017-06-04
Also published as: EP0938553B1; ATE438717T1; EP0938553A1; JP2011172588A; JP2007289186A; AU3230797A; JP2000513571A; DE69739524D1; US6300484B1; JP2010017191A; WO1997046680A1

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNA NUEVA SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO QUE HIBRIDA CON SEQ ID NO : 6 O FRAGMENTOS DE DICHA SEQ BAJO CONDICIONES SEVERAS O A FRAGMENTOS DE DICHA NUEVA SECUENCIA. LA PRESENTE INVENCION TAMBIEN INCLUYE ENSAYOS DIAGNOSTICOS, VECTORES DE EXPRESION, SECUENCIAS DE CONTROL, MOLECULAS ANTISENTIDO, RIBOSOMAS Y CELULAS HUESPED DESTINADAS A EXPRESAR EL POLIPEPTIDO CODIFICADO POR DICHA SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO. LA INVENCION ADEMAS INCLUYE REIVINDICACIONES DE DICHA SECUENCIA POLIPEPTIDICA CODIFICADA POR DICHAS SECUENCIAS DE ACIDO NUCLEICO.

Description

DNA que codifica DP-75 y un proceso para su uso.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la biología molecular. Más específicamente, la presente invención se refiere a una secuencia de DNA y a la proteína correspondiente.

Fundamento de la invención

Una familia de proteínas que se unen a GTP y proteínas relacionadas ha estado implicada en la tumorigenicidad de células hiperproliferantes. Estas proteínas incluyen ras, dbl, ect2, lbc, ost, y TIM. Véanse, respectivamente, Boguski and McCormick, Nature 366: 643-654 (1993), Ron et al., EMBO J. 7: 2465-2473 (1988); Miki et al., Nature 362: 462-465 (1993); Toksoz et al., Oncogene 9(2): 641-628 (1994); Horii et al., EMBO J 13(20): 4776 (1994); Chan et al., Oncogene 9(4): 1057-1063 (1994). También está incluida en esta familia la proteína Tiam-1-4786. Esta proteína ha demostrado modular el potencial invasivo de una célula. Véase Habets et al., Célula 77: 537-549 (1994); Habets et al., Oncogene 10(7): 1371-1376 (1995); y Gaston et al., Nature 375: 338-340 (1995). Tiam-1 también ha sido identificada como un miembro del una familia de estimuladores de la disociación de GDP (abreviadamente GDS por la expresión inglesa Guanine Dinucleotide Stimulators) [GDP = guanine dinucleotide phosphate]. Estas proteínas activan GTPasas similares a Rho y similares a Rac. Véase también Hillier et al., EMBL sequence database zb53605.rl Soares fetal lung NbHL 19W Homo Sapiens cDNA clone 307281.

Sumario

La presente invención es un nuevo polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridarse con la secuencia DP-75 de la SEQ ID NO:6 o su complemento a 32ºC en presencia de formamida al 50%, en donde dicho polinucleótido no es el polinucleótido que tiene la secuencia siguiente: gttctagagc gagaattcag tgtccagagt ttaacatctg ttgtcagtga ggagtgtttt tatgaaacag agagccacgg aaaatcatag tatgattcaa tccagatatg ggttaaattc ctcattttac ttttaaactg gtggtaaagt ggaaattgca. La invención también incluye valoraciones de diagnóstico, vectores de expresión, secuencias de control, moléculas antisentido, ribozimas, y células hospedantes para expresar el polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico. La presente invención también incluye reivindicaciones dirigidas al polipéptido codificado por las secuencias de ácidos nucleicos, en donde dicho polipéptido exhibe al menos 20% de la actividad biológica del polipéptido codificado por la SEQ ID NO:6.

La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden al menos 15 a 40 unidades monómeras (meros) de oligonucleótidos antisentido capaces de hibridarse con la SEQ ID NO:6 a 32ºC en presencia de formamida al 50% y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La invención también proporciona:

- Un método para detectar células hiperproliferantes en una muestra que comprende:

(a): proporcionar un sonda de polinucleótido que comprende una secuencia capaz de hibridarse con la SEQ ID NO: 6 a 32ºC en presencia de formamida al 50%;

(b): poner en contacto la sonda con los polinucleótidos de la célula de muestra bajo condiciones que permitan la formación de híbridos del polinucleótido; y

(c): detectar los híbridos.

- Una composición que comprende el polipéptido antes descrito y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

- Un proceso para producir el polipéptido antes descrito que comprende:

(a): proporcionar la célula hospedante antes descrita; y

(b): cultivar dicha célula hospedante bajo condiciones que inducen la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico.

- Un vector antisentido que comprende (i) un polinucleótido antisentido que comprende una secuencia capaz de hibridarse con la SEQ ID NO:6 a 32ºC en presencia formamida al 50%; y (ii) un polinucleótido que comprende una secuencia capaz de iniciar la transcripción de dicho polinucleótido antisentido.

- Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia capaz de hibridarse con la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 1 a 32ºC en presencia de formamida al 50%, en donde dicho polinucleótido es además capaz de escindir mRNA que codifica un polipéptido codificado por la SEQ ID NO: 6. o que varía de la secuencia del polipéptido codificado por la SEQ ID NO: 6 en menos de 20 aminoácidos.

- Un vector de ribozima que comprende:

(i): una secuencia del polinucleótido de ribozima capaz de hibridarse con la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 1 a 32ºC en presencia de formamida al 50%; y

(ii): un polinucleótido que comprende a secuencia capaz de iniciar la transcripción de dicho polinucleótido de ribozima,

en donde dicho polinucleótido es además capaz de escindir dicho polinucleótido de (i).

- Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz del polinucleótido descrito anteriormente y un agente capaz de aumentar la absorción del polinucleótido.

- Un anticuerpo aislado que se une específicamente al polipéptido descrito anteriormente.

- Uso de:

el vector antisentido antes descrito, el vector de ribozima o el anticuerpo en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de tumores.

- Un método para detectar polipéptidos de DP-75 en una muestra que comprende:

(a): proporcionar el anticuerpo antes descrito;

(b): poner en contacto dicho anticuerpo con la muestra en condiciones que permitan la formación de complejos anticuerpo/antígeno; y

(c): detectar los complejos.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra los resultados de un ensayo de transferencia de mancha, en donde DP-75 se hibridó con RNA procedente de tejido tanto canceroso como normal. La fuente de tejido canceroso incluyó material renal, del tiroides, de mama, de colon, y de la uretra.

La Figura 2 muestra los resultados de un ensayo de transferencia de mancha, en donde DP-75 se hibridó con RNA procedente tanto de tejido canceroso como normal. La fuente de tejido canceroso incluyó tejido de pulmón, nariz, estómago, esófago, hígado, linfoma, útero, vejiga, recto, y cerebro.

Descripción detallada de la invención

La práctica de la presente invención empleará, a no ser que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología y tecnología de DNA recombinante que están dentro del conocimiento de los expertos en la técnica. Dichas técnicas están completamente explicadas en la literatura científica. Véase, por ejemplo, Sambrook, et al ., MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL, SECOND EDITION (1989); DNA CLONING, VOLUMES I AND II (D.N. Glover ed. 1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M. J. Gait ed, 1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (B.D: Hames & S. J. Higgins eds. 1984); TRANSCRIPTION AND TRANSLATION (BD. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); ANIMAL CELL CULTURE (RI. Freshney ed. 1986); IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES (IRL. Press, 1986); B. Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING (1984); las series, METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (J.H. Miller and M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Methods in Enzymology Vol. 154 and Vol. 155 (Wu and Grossman, and Wu, eds., respectivamente), Mayer and Walker, eds. (1987), IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, London), Scopes, (1987), PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE, Second Edition (Springer-Wring, N.Y.), HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, VOLUMES I-IV (D.M. Weir and C. C. Blackwell eds 1986); and VACCINES (R. W. Ellis, ed., 1992, Butterworth-Heinemann, London).

En la presente memoria se usan las abreviaturas estándares para nucleótidos y aminoácidos.

Definiciones

"Homología" se refiere al grado de similitud entre x e y. La correspondencia entre la secuencia de una forma y otra puede ser determinada por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, las homologías pueden determinarse por una comparación directa de la información de secuencia del polinucleótido. Típicamente, dos secuencias, ya sean polinucleótido o polipéptido, son homólogas si las secuencias exhiben al menos 45% de identidad de secuencias; más típicamente, 50% de identidad de secuencias; más típicamente, 55% de identidad de secuencias; más típicamente, 60% identidad de secuencias; más típicamente, 65% de identidad de secuencias; incluso más típicamente, 70% de identidad de secuencias. Usualmente, dos secuencias son homólogas si las secuencias exhiben al menos 75% de identidad de secuencias; más usualmente, 80% de identidad de secuencias; incluso más usualmente, 85% de identidad de secuencias; incluso más usualmente, 90% de identidad de secuencias; e incluso más usualmente, 95% de identidad de secuencias.

Alternativamente, la homología puede ser determinada por hibridación de los polinucleótidos en condiciones que forman dúplex estables entre regiones homólogas. Los dúplex estables son aquellos, por ejemplo, que podrían resistir la digestión con nucleasa(s) específica(s) monocatenaria(s), tales como S_{1}. Dichas dúplex pueden ser analizadas por diversos métodos, tales como determinación del tamaño de los fragmentos digeridos.

"Hibridación" se refiere a la asociación de dos secuencias de ácidos nucleicos una con la otra mediante enlace por puentes de hidrógeno. Típicamente, una secuencia estará fijada en un soporte sólido y la otra estará libre en solución. Luego, las dos secuencias se pondrán en contacto una con la otra en condiciones que favorezcan la unión por puentes de hidrógeno. Los factores que afectan esta unión incluyen: el tipo y volumen del disolvente; la temperatura de reacción; el tiempo de hibridación; la agitación; los agentes que bloquean la unión no específica de la secuencia de la fase líquida al soporte sólido (reactivo de Denhardt o BLOTTO); la concentración de las secuencias; el uso de compuestos para aumentar la velocidad de asociación de las secuencias (sulfato de dextrano o polietilenglicol); y la rigurosidad de las condiciones de lavado que siguen a la hibridación. Véase Sambrook, et al ., MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL, SECOND EDITION (1989), Volumen 2, capítulo 9, páginas 9.47 a
9.57.

"Rigurosidad" se refiere a las condiciones en una reacción de hibridación que favorecen la asociación de secuencias muy similares sobre secuencias que difieren. Por ejemplo, la combinación de temperatura y concentración de sal se debe elegir que sea de aproximadamente 12º a 20ºC por debajo de la calculada del híbrido en estudio. La temperatura y las condiciones de la sal pueden ser determinadas empíricamente en experimentos preliminares en los que se hibridan muestras de DNA genómico inmovilizadas en filtros con la secuencia de interés y lavando luego bajo condiciones de rigurosidades diferentes. Véase Sambrook, et al., antes citado en la página 9.50.

Las variables a considerar cuando se realice, por ejemplo, una transferencia Southern son: (1) la complejidad del DNA que se transfiere y (2) la homología entre la sonda y las secuencias que se detectan. La cantidad total del (de los) los fragmento(s) a estudiar puede variar en un orden de magnitud de 10, desde 0,1 a 1 \mug para un producto de digestión de plásmido o de fago hasta 10^{-9} a 10^{-8} \mug para un gen de una sola copia en un genoma eucariótico altamente complejo. Para los polinucleótidos de complejidad inferior, sustancialmente más cortos, pueden ser usados hibridación, y tiempos de exposición más cortos, una cantidad más pequeña de polinucleótidos de partida, y menor actividad específica de las sondas. Por ejemplo, puede detectarse un gen de levadura de una sola copia con un tiempo de exposición de solamente 1 hora partiendo de 1 \mug de DNA de levadura, transferencia durante dos horas e hibridación durante 4 a 8 horas con una sonda de 10^{8} cpm/\mug. Para un gen de mamífero de una sola copia el enfoque conservador empezaría con 10 \mug de DNA, transferencia durante una noche, e hibridación durante una noche en presencia de sulfato de dextrano al 10% usando una sonda de más de 10^{8} cpm/\mug, que da como resultado un tiempo de exposición de \sim24 horas.

Varios factores pueden afectar a la temperatura de fusión (Tm) de un híbrido DNA-DNA entre la sonda y el fragmento de interés, y en consecuencia, las condiciones apropiadas para la hibridación y el lavado. En muchos casos la sonda no es 100% homóloga con el fragmento. Otras variables comúnmente encontradas incluyen la longitud y el contenido total de G+C de las secuencias hibridantes y la fuerza iónica y el contenido de formamida del tampón de hibridación. Los efectos de todos estos factores pueden ser representados de modo aproximado para la sencilla ecuación siguiente:

Tm = 81 + 16,6(log10C_{i}) + 0,4(%G + C)]-0,6(% de formamida) - 600/n-1,5(% de desapareamiento).

Donde C_{i} es la concentración de sal (iones monovalentes) y n es la longitud del híbrido en pares de bases (ligeramente modificada por Meinkoth y Wahl, (1984) Anal. Biochem. 138: 267-284).

Al diseñar un experimento de hibridación pueden ser convenientemente alterados algunos factores que afectan a los ácidos nucleicos. La temperatura de la hibridación y los lavados y la concentración de sal durante los lavados son los más sencillos de ajustar. A medida que aumenta la temperatura de la hibridación (es decir, la rigurosidad), llega a ser menos probable que ocurra la hibridación entre cadenas que no son homólogas y como resultado disminuye la señal de fondo. Si la sonda radiomarcada no es completamente homóloga con el fragmento inmovilizado (como sucede frecuentemente en el caso de una familia de genes y en experimentos de hibridación entre especies), la temperatura de hibridación debe ser reducida, y aumentará la señal de fondo. La temperatura de los lavados afecta a la intensidad de la banda de hibridación y al grado de la señal de fondo de una manera similar. La rigurosidad de los lavados también se aumenta con concentraciones decrecientes de sal.

En general, las temperaturas de hibridación convenientes en presencia de formamida al 50% son 42ºC para una sonda que es 95% a 100% homóloga al fragmento diana, 37ºC para una sonda que es 90% a 95% homóloga, y 32ºC una sonda que es 85% a 90% homóloga. Para homologías inferiores, el contenido de formamida debe ser disminuido y la temperatura ajustarse consiguientemente, usando la ecuación anterior. Si la homología entre la sonda y el fragmento no es conocida, el enfoque más sencillo es empezar con tanto hibridación como condiciones de lavado que no sean rigurosas. Si se observan bandas no específicas o una alta señal de fondo después de la auto-radiografía, el filtro puede ser lavado con alta rigurosidad y re-expuesto. Si el tiempo requerido para la exposición hace que este método no sea práctico, deben ensayarse en paralelo diversas hibridaciones y/o rigurosidades de lavado.

Los polipéptidos y los polinucleótidos naturales de DP-75 se refieren a las proteínas y ácidos nucleicos respectivamente que se presentan en la naturaleza. La secuencia de aminoácidos de los polipéptidos naturales comprenderá una secuencia que varía ligeramente; típicamente, menos que en 10-20 aminoácidos codificadas en las SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO:1.

Un "vector" o "plásmido" es una secuencia de ácido nucleico a la cual está unido otro segmento de polinucleótido, de modo que lleva a cabo la replicación y/o la expresión de segmento unido.

"PCR" se refiere a la técnica de reacción en cadena de la polimerasa como se describe en el trabajo de Saiki, et al., Nature 324:163 (1986); y Scharf et al., Science (1986) 233:1076-1078; y en las patentes de EE.UU. Nº 4.683.195; y EE.UU. 4.683.202.

"Secuencia de control" se refiere a secuencias de polinucleótidos que facilitan la expresión de secuencias codificadoras a las que están unidas. La naturaleza de dichas de control secuencias difiere dependiendo de organismo hospedante; en eucariotas, generalmente, dichas secuencias de control incluyen, por ejemplo, promotores y secuencias terminadoras de la transcripción. La expresión "secuencias de control" está destinada a incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es facilitar la expresión, tal como, por ejemplo, las reacciones implicadas en la transcripción y la traducción. La secuencia de control también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias delanteras (líderes) y secuencias de compañeros de fusión.

"Unido operativamente" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes así descritos se encuentran en una relación que les permite funcionar en su manera pretendida. Una secuencia de control está "unida operativamente" a una secuencia codificadora de modo que se consigue la expresión de la secuencia codificadora en condiciones compatibles con las secuencias de control.

Las expresiones "polinucleótido" o "secuencia de ácido nucleico" tal como se usan en la presente memoria se refiere a un polímero de nucleótidos de cualquier longitud, preferiblemente desoxirribonucleótidos; y se usan intercambiablemente en la presente memoria con las expresiones "oligonucleótido" y "oligómero". Las expresiones se refieren sólo a la estructura primaria de la molécula. Por tanto, esta expresión incluye DNA monocatenario y bicatenario, así como polinucleótidos antisentido. También incluye tipos conocidos de modificaciones, por ejemplo, la presencia de marcadores que son conocidos en la técnica, tales como metilación, "huecos" de extremos, sustitución de uno o más de los nucleótidos que se presentan en la naturaleza con un análogo, modificaciones internucleótidos tales como, por ejemplo, reemplazamiento con ciertos tipos de enlaces no cargados (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) o enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), introducción de restos colgantes, tales como, por ejemplo, proteínas (incluyendo nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, poli-L-lisina, etc.), intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), quelantes (por ejemplo, metales, especies radioactivas, boro, restos oxidantes, etc.), agentes alquilantes (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anómeros etc.).

Por "genómica" se quiere significar una colección o genoteca de moléculas de DNA que corresponden a la secuencia encontrada en el DNA cromosómico en oposición a mRNA empalmado. Por "cDNA" se quiere significar una secuencia de DNA que se hibrida a una cadena de mRNA complementario.

Tal como se usa en la presente memoria, x es "heterólogo" con respecto a y si x no está asociado naturalmente con y de manera idéntica; es decir, x no está asociado con y en la naturaleza o x no está asociado con y del mismo modo que se encuentra en la naturaleza.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "proteína" o "polipéptido" se refiere a un polímero de aminoácidos y no se refiere a una longitud específica del producto; por tanto, los péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas, y poliproteínas, así como los fragmentos de estos, están incluidos dentro de esta definición. Este término tampoco se refiere a, o excluye, las modificaciones pos-expresión de la proteína, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. Están incluidos dentro de esta definición, por ejemplo, las proteínas que contiene uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), proteínas con enlaces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto como las que se presentan en la naturaleza como las que no se presentan.

Una secuencia de polipéptido o proteína o aminoácido secuencia "derivada de" o "codificada por" una secuencia de ácido nucleico designada se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la de un polipéptido codificado en la secuencia, o una de sus porciones, en donde la porción consiste en al menos 3-5 aminoácidos consecutivos, y más preferiblemente al menos 8-10 aminoácidos, e incluso más preferiblemente al menos 11-15 aminoácidos, o que es inmunológicamente identificable con un polipéptido codificado en la secuencia. Esta terminología también incluye un polipéptido expresado por una secuencia diseñada de ácido nucleico.

"Células hospedantes recombinantes", "células hospedantes""células""cultivos de células" y otros dichos términos, por ejemplo, microorganismos, células de insectos, y células de mamífero, que pueden ser, o haber sido, usadas como recipientes para un vector recombinante u otro DNA de transferencia, e incluyen la progenie de la célula original que ha sido transformada. Ha de entenderse que la progenie de una célula parental puede no ser necesariamente idéntica en morfología o en complemento de DNA genómico o total a la célula parental original, debido a una mutación natural, accidental o deliberada.

"Línea celular" se refiere a una población de células capaces de crecimiento prolongado o continuo y división in vitro. Frecuentemente, las líneas celulares son poblaciones clonales derivadas de una sola célula progenitora. Se sabe además en la técnica que pueden ocurrir cambios espontáneos o inducidos en el cariotipo durante la conservación o transferencia de dichas poblaciones clonales. Por lo tanto, las células derivadas de la línea celular referida pueden no ser precisamente idénticas a las células ancestrales o cultivos, y se hace referencia a la línea celular para incluir dichas variantes. La expresión "líneas celulares" también incluye células inmortalizadas.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "microorganismo" incluye especies microbianas procariotas y eucariotas, tales como bacterias y hongos, incluyendo estos últimos levaduras y hongos filamentosos.

"Transformación", como se usa en la presente memoria, se refiere a la inserción of un polinucleótido exógeno en una célula hospedante, independientemente del método usado para la inserción, por ejemplo, la absorción directa, mediada por partículas, transducción, factor de apareamiento o electroporación. El polinucleótido exógeno puede ser mantenido como un vector no integrado, por ejemplo, un plásmido o alternativamente, puede ser integrado en el genoma del hospedante. Ejemplos de transducción mediada por partículas se muestran en las patentes de EE.UU 4.945.050 y 5.149.655.

"Purificado" y "aislado" significan, cuando se ha ce referencia a un polipéptido o secuencia de nucleótidos, que la molécula indicada está presente en ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas del mismo tipo. El término "purificado" como se usa en la presente memoria preferiblemente significa al menos 75% en peso, más preferiblemente al menos 85% en peso, más preferiblemente todavía al menos 95% en peso, y más preferiblemente al menos 98% en peso, de macromoléculas biológicas del mismo tipo presentes (pero pueden estar presentes agua, tampones, y otras pequeñas moléculas, especialmente moléculas que tienen un peso molecular menor que 1000).

"Cantidad supresora del crecimiento" de oligonucleótido antisentido de DP-75, por ejemplo, se refiere a una cantidad de un agente terapéutico para tratar, mejorar o impedir el cáncer. La cantidad es suficiente para exhibir efecto terapéutico o preventivo detectable. El efecto puede incluir, por ejemplo, reducción en el crecimiento de células anormales, tales como células cancerosas; muerte de células cancerosas; o reducción en presencia de antígenos o marcadores de cáncer. Los efectos terapéuticos también incluyen la reducción de manifestaciones o síntomas en pacientes. La cantidad eficaz precisa para un sujeto dependerá de tamaño del sujeto y su salud, la naturaleza y extensión de su estado cardiovascular, y los tratamientos terapéuticos o combinaciones de tratamientos terapéuticos seleccionados para la administración. Por tanto, no es útil especificar de antemano una cantidad exacta. Sin embargo, la cantidad eficaz para una situación dada puede ser determinada por experimentación habitual y está dentro del buen juicio del médico clínico.

La expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a compuestos y composiciones que pueden ser administradas a mamíferos sin una toxicidad indebida. Las sales farmacéuticamente aceptables ilustrativas incluyen sales con ácidos minerales, tales como hidrocloruros, hidrobromuros, fosfatos, sulfatos, y similares, y las sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares.

Método general

DP-75 es una nueva secuencia de DNA y aminoácidos que tiene homología de secuencia con otras secuencias que han sido identificadas en ciertos cánceres. Por ejemplo, la presente secuencia de ácido nucleico DP-75 es parcialmente homóloga a una secuencia de ácido nucleico identificada como Tiam-1, véase Habets et al., Cell 77:537-749 (1994), y Habets et al., Oncogene 10:1371-1375 (1995). La sobreexpresión de las formas de longitud complete o truncada de Tiam-1 aumenta el potencial metastásico de las células de linfoma en ratones. Tiam-1 es un miembro de la familia de los estimuladores de la disociación de GDP que son proteínas que activan GTPasas similares a Rho y similares a Rac. Las GDS así como Rho y Rac tienen potencial oncógeno.

Para valorar la capacidad de DP-75 para inducir la invasividad celular, puede seguirse el método de Habets et al., Cell 77:537-749 (1994). Por ejemplo, las células pueden ser transformadas con DP-75 y los clones pueden ser administrados a animales experimentales, es decir, ratones atímicos. Véase las páginas 537 y 538 del trabajo de Habets et al.

Se considera que la secuencia de DNA de DP-75, o su complemento, serán útiles en ensayos de diagnóstico, vectores de expresión, secuencias de control, moléculas antisentido, ribozimas, y células hospedantes para expresar el polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico. La secuencia de aminoácidos de DP-75 puede ser usada en una valoración para escrutar inhibidores (preferiblemente moléculas pequeñas) de la capacidad de DP-75 para facilitar el intercambio GDP-GTP. Véase Michiels et al., Nature, 375:338-3411(1995) para una valoración apropiada. Por ejemplo, esta valoración podría implicar el uso de la proteína DP-75 que podría ser incubada con Rho o Rac junto con la cual se cargó con GDP tritiado. DP-75 debe liberar GDP a menos que un compuesto inhiba dicha liberación. Esta inhibición podría ser medida de la misma manera que en el trabajo de Michiels et al.

Se ha encontrado que DP-75 es expresada en el corazón normal, el cerebro, y en la musculatura del esqueleto, como se muestra más adelante. El tamaño del mensaje (RNA) fue mayoritariamente 3 Kb para tejido del cerebro, y pareció que era 6 Kb en el tejido del corazón y de la musculatura del esqueleto. Una mirada más completa a los tejidos de las diferentes regiones del cerebro muestra que el polo occipital, el lóbulo frontal, el lóbulo temporal y el putamen contenían un mensaje de 3 Kb, pero que el cerebelo contenía un mensaje de 7,7 Kb. Por consiguiente, parece que puede haber versiones diferencialmente empalmadas de DP-75 en diversos tejidos del cuerpo.

DP-75 tiene algo de homología con Tiam-1, una proteína implicada como modulador de la invasividad de las células tumorales. Tiam-1 es un estimulador de la disociación de los GDP (GDS). Es una proteína citosólica que afecta a la invasividad de las células T de linfomas y comparte dominios (homólogo Dbl y homóloga Pleckstrin) con proteínas que modulan la actividad de las proteínas similares a Rho y similares a Rac. Dichas proteínas Dichas proteínas similares a Rho y similares a Rac han estado implicadas en las vías de transducción de señales que regulan las estructuras del citoesqueleto (esqueleto celular). Además, las GDS modulan la actividad de pequeñas moléculas de GTPasa que son importantes en la señalización celular, la regulación, la secreción, el tamaño, la forma, la adhesión, la motilidad y el crecimiento, entre otras actividades.

Una molécula que es un paradigma para estas pequeñas GTPasas es Ras, que ha sido estudiada extensivamente y tipifica una superfamilia de proteínas relacionadas, tales como las subfamilias rac, rho y rab. Véase Boguski y McCormick, (1993), Nature, 366:643-654. Véase también Fanti et al., Annu. Rev. Biochem. (1993) 62:453-481 para información sobre señalización por el receptor de las tirosina-quinasas, tal como p21ras.

El ras activado se ha encontrado en el 20% de los cánceres, y el 100% de los cánceres pancreáticos. Ras está unido normalmente a GTP como molécula inactiva, sin embargo, puede ser activada cuando el GTP es escindido para forma GDP. Estos factores de intercambio contienen típicamente los dominios homólogos Dbl y de Pleckstrin que son útiles en escindir el GTP a GDP. Se cree que DP 75 puede ser importante en todas aquellas zonas en las que estas moléculas reguladoras hayan mostrado utilidad.

Como se ha indicado antes, estas GDS están implicadas en diversos cánceres y se cree que DP-75 puede ser útil para diagnosticar células cancerosas. Se pueden usar muchas técnicas para diagnosticar tanto muestras de tejidos como personas que poseen tejido tumoral que contiene DP-75. Por ejemplo, la transcripción inversa y la amplificación por PCR del RNA de una muestra de tumor para identificar las presencia de secuencias de mRNA de DP-75 (véase Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL, SECOND EDITION (1989), capítulo 14 o Gaugler et al., J. Exp. Med. (1994) 179:921-930). También pueden utilizarse técnicas inmunohisquímicas o ensayos ELISA para identificar tumores que expresan DP-75. Por ejemplo, la proteína DP-75 puede ser expresada recombinantemente y luego pueden prepararse anticuerpos monoclonales de acuerdo con métodos que son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los métodos mostrados en la patente europea 174.204, y en el trabajo de Kohler y Milstein, Nature (1975) 256:495-497, Fong et al., J. Immnun. Meth. (1984) 70:83-90, y las patentes GB 2.086.937, 2.113.715, EP 57.107, 62.409, EP 118.893, EP 124.301 y EP 131.878 son adecuados para la presente invención. Los anticuerpos monoclonales anti-DP-75 pueden usarse luego en ensayos estándares citados anteriormente o en otros ensayos que son conocidos por los expertos en la técnica.

Los anticuerpos monoclonales también se pueden usar terapéuticamente. Los anticuerpos monoclonales anti-DP-75 pueden ser administrados por medios conocidos en la técnica. Preferiblemente, los anticuerpos se administran por vía parenteral o subcutánea, más preferiblemente, se administran por vía intravenosa. Los anticuerpos monoclonales pueden ser administrados en combinación con otros agentes diseñados para promover la actividad de los anticuerpos o para tratar el estado subyacente que implica las células que expresan DP-75.

Adicionalmente, pueden realizarse ensayos con DNA ramificados para detectar DNA de DP-75 como se muestra en la patente de EE.UU. 5.124.246 y 4.868.105. Las moléculas de sonda para ácidos nucleicos de DP-75 para ensayar el DNA ramificado tienen preferiblemente una longitud de 10 a 50 bases, más preferiblemente, un longitud entre 15 y 40 bases, más preferiblemente, una longitud entre 20 y 30 bases.

La ribozimas pueden ser diseñadas para actuar sobre la secuencia de DP-75 secuencia identificada en la SEQ ID NO:6 o sus fragmentos. Por ejemplo, Kashani-Cabet y Scanlon revisaron el estado de la técnica en Cancer Gene Therapy, (1995) 2:213-223. Los autores analizan la bioquímica de las ribozimas con forma de cabeza de martillo y de horquilla y estudian su papel o función en la terapia génica, VIH y cáncer.

Una ribozima puede ser diseñada para actuar sobre la secuencia de DP-75 cortándola en sitios particulares. Por ejemplo, la Fig. 1 del texto de Kashani-Cabet muestra la estructura de una ribozima de forma cabeza de martillo y las instrucciones para diseñar estas ribozimas contra cualquier gen. Por consiguiente, de acuerdo con la Fig. 1 del texto de Kashani-Cabet, muestra que tiene tres hélices, y una estructura de bucle de tallo, así como la zona de unión. Los autores citados describen además métodos para la administración intracelular de una ribozima de interés, usando técnicas tales como suministro de ribozima "desnuda", liposomas, y modificaciones químicas para la ribozima.

Kashani-Cabet también analizan ribozimas en forma de horquilla que tiene cuatro regiones helicoidales y dos estructuras de bucle. Los autores establecen que hay secuencias de nucleótidos esenciales en algunas de estas estructuras. Adicionalmente, la expresión de ribozimas celulares puede ser útil para proporcionar las ribozimas a su sustrato, sin su degradación.

Para obtener la expresión celular, el gen de la ribozima se clonó en un vector disponible y se transfectó en las células elegidas. Pueden elegirse diferentes vectores basándose en la célula diana que se ha de infectar. Por ejemplo, las células respiratorias pueden ser dianizadas por un vector constituido por un virus adeno o adeno asociado (AAV). En estos vectores pueden insertarse promotores adecuados para asegurar la expresión regulable. (Véase Kashani-Cabet en la página 216).

Se pueden desarrollar moléculas antisentido basándose en la secuencia de DP-75 mostrada en la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:6. Véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nº 5.491.133 y 5.271.941

Las secuencias de RNA antisentido se han descrito como inhibidores biológicos, que se presentan en la naturaleza, de la expresión de genes tanto en procariotas (Mizuno, T., Chou, M-Y, e Inouye, M. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, (1966-1970)) como eucariotas (Heywood, S. M. Nucleic Acids Res., 14, 6771-6772 (1986) y estas secuencias funcionan presumiblemente hibridándose con las secuencias de mRNA complementario, dando como resultados que la hibridación detiene la traducción (Paterson, B. M., Roberts, B. E., y Kuff E. L., (1977) Proc. Natl.. Acad. Sci. USA, 74, 4370-4374.

Los oligodesoxinucleótidos antisentido son secuencias cortas de nucleótidos formuladas para ser complementarias de un gen o RNA mensajero específico. A través de la unión de estos oligómeros a una secuencia de DNA o mRNA diana pueden ser selectivamente bloqueadas la transcripción o la traducción del gen y puede ser detenido el proceso morboso generado por dicho gen. La localización citoplásmica del mRNA proporciona una diana que se considera fácilmente accesible a los oligodesoxinucleótidos antisentido que entran en la célula; por tanto mucho del trabajo de campo se ha enfocado al RNA como diana.

Usualmente, el uso de oligodesoxinucleótidos antisentido proporciona una herramienta útil para explorar la regulación de la expresión de genes in vitro y en cultivo de tejidos (Rothenberg, M. et al, (1989) J. Natl. Cancer Inst., 81:1539-1544).

La terapia con oligonucleótidos antisentidos es la administración de oligonucleótidos que se unen un polinucleótido localizado dentro de las células. Estos oligonucleótidos son generalmente exógenos, pero pueden ser expresados endógenamente. El término "antisentido" se refiere al hecho de que dichos oligonucleótidos son complementarios a sus dianas intracelulares, por ejemplo, DP-75. Véase, por ejemplo, Jack Cohen, OLIGODEOXYNUCLEOTIDES, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, 1989; y Synthesis 1:1-5 (1988).

Los oligonucleótidos antisentido de la presente invención incluyen derivados tales como S-oligonucleótidos (derivados de fosforotioato o S-oligos, véase, Jack Cohen, supra) que exhiben una acción inhibidora mejorada del crecimiento de células cancerosas. Estos oligonucleótidos antisentido pueden ser RNA o DNA que son complementarios al genoma de DP-75 y se hibridan establemente con el mismo o el mRNA correspondiente. El uso de de un oligonucleótido complementario a esta región permite la hibridación selectiva con el mRNA de DP-75 y no con otros mRNA.

Preferiblemente, los oligonucleótidos antisentido de DP-75 son un fragmento de 15 a 40 meros de la molécula de DNA antisentido que se hibrida con el mRNA de DP-75. Alternativamente, el oligonucleótido antisentido de DP-75 es un oligonucleótido de 20 a 30 meros que es complementario con una región de DP-75. Se describen en la presente memoria composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad eficaz de al menos uno de los oligonucleótidos antisentido de DP-75, descritos en la presente memoria, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Puede utilizarse un solo oligonucleótido antisentido de DP-75. Además pueden utilizarse dos oligonucleótidos antisentido de DP-75 que sean complementarios a las regiones adyacentes de DP-75.

La administración de dos oligonucleótidos antisentido de DP-75 que sean complementarios a las regiones adyacentes del genoma de DP-75 o un mRNA correspondiente puede permitir una inhibición más eficaz de la transcripción genómica de DP 75 o la traducción del mRNA, dando como resultado una inhibición más eficaz del crecimiento de las células cancerosas. Preferiblemente, el oligonucleótido antisentido de DP-75 se administra conjuntamente con una agente que mejora la absorción por las células de la molécula antisentido. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido de DP-75 puede ser combinado con un compuesto catiónico lipófilo que puede estar en la forma de liposomas.

El uso de liposomas para introducir nucleótidos en células se enseña, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. Nº 4.897.355 y 4.394.448. Véanse también las patentes de EE.UU. 4.235.871, 4.231.877, 4.224.179, 4.753.788, 4.673.567, 4.247.411, 4.814.270 para métodos generales de preparar liposomas que comprenden materiales biológicos. Alternativamente, el oligonucleótido antisentido de DP-75 puede ser combinado con un vehículo lipófilo, tal como uno cualquiera de cierto número de esteroles que incluyen colesterol, colato y ácido desoxicólico. Un esterol preferido es el colesterol. Además, el oligonucleótido antisentido de DP-75 puede estar conjugado con un péptido que es ingerido por las células. Ejemplos de péptidos útiles incluyen hormonas peptídicas, antígenos o anticuerpos, y toxinas peptídicas. Eligiendo un péptido que sea absorbido selectivamente por las células neoplásticas puede efectuarse una administración específica del agente antisentido.

El oligonucleótido antisentido de DP-75 puede ser unido covalentemente vía el grupo 5'H por formación de un derivado de aminoalquilo activado. El péptido de elección puede ser unido covalentemente luego al oligonucleótido antisentido de DP-75 activado vía un reactivo hetero-bifuncional de amino y sulfhidrilo. Este último se une a un residuo de cisteína presente en el péptido. Por exposición de las células al oligonucleótido antisentido de DP-75 unido al péptido, el agente antisentido de peptidilo es sometido a endocitosis y el oligonucleótido antisentido de DP-75 se une al mRNA de DP-75 diana inhibiendo la traducción. Véase la publicación de solicitud de patente PCT PCT/US89/02363.1

Los oligonucleótidos antisentido de DP-75 y las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser administrados por cualquier medio para conseguir el fin pretendido. Por ejemplo, la administración de los compuestos antisentido u otros compuestos de la presente invención puede ser por las vías parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o transdérmica.

La dosis administrada será dependiente de la edad, salud, y peso del paciente receptor, la clase de tratamiento concurrente, si lo hay, la frecuencia del tratamiento, y la naturaleza del efecto deseado. Las composiciones dentro del alcance de esta invención incluyen todas las composiciones en donde el oligonucleótido antisentido de DP-75 está contenido en una cantidad de que es eficaz para conseguir la inhibición de la proliferación y/o estimular la diferenciación de las células cancerosas objetos.

Aunque varían las necesidades individuales, la determinación de los intervalos óptimos de cantidades eficaces de cada componente está dentro de la experiencia de la técnica. Típicamente, el oligonucleótido antisentido de DP-75 puede ser administrado a mamíferos, por ejemplo, seres humanos, a una dosis de 0,005 a 1 mg/kg de peso corporal/día, o una cantidad equivalente de una de sus sales farmacéuticamente aceptables, del mamífero que se somete a tratamiento.

Además de administrar los oligonucleótidos antisentido de DP-75 en forma de material en bruto en solución, los oligonucleótidos antisentido de DP-75 pueden ser administrados como parte de una preparación farmacéutica que con-
tiene vehículos farmacéuticamente aceptables que comprenden excipientes y sustancias auxiliares que facilitan el pro-
cesamiento del oligonucleótido antisentido de DP-75 en las preparaciones que pueden ser usados farmacéuticamente.

Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los oligonucleótidos antisentido de DP-75 en una forma soluble en agua, por ejemplo, sales solubles en agua. Además pueden administrarse suspensiones de los compuestos activos en forma de suspensiones oleosas inyectables apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo, aceite de sésamo, o ésteres de aceites grasos sintéticos, por ejemplo, oleato de etilo o triglicéridos. Las suspensiones inyectables acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión e incluyen, por ejemplo, carboximetil-celulosa de sodio, sorbitol, y/o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores.

Los oligonucleótidos antisentido de la presente invención pueden prepararse de acuerdo con cualquiera de los métodos que son bien conocidos por los expertos ordinarios en la técnica. Preferiblemente, los oligonucleótidos antisentido se preparan por síntesis en fase sólida. Véase, el trabajo de Goodchild, J., Bioconjugate Chemistry, 1:165-157 (1990), para una revisión de la síntesis química de oligonucleótidos. Alternativamente, los oligonucleótidos antisentido pueden ser obtenidos en cierto número de compañías que están especializadas en la síntesis usual de oligonucleótidos.

Una limitación que utiliza oligonucleótidos como agentes terapéuticos es la rápida degradación del oligonucleótido en la sangre y dentro de las células por la acción de las nucleasas. Dichas enzimas hidrolizan los enlaces fosfodiéster que unen los nucleótidos dentro de una cadena de DNA o RNA, escindiendo por tanto la molécula en fragmentos más pequeños. En el pasado se ha conseguido algún progreso en el desarrollo de análogos de oligonucleótidos que son resistentes a la degradación por nucleasas, pero el uso de dichos derivados para bloquear la expresión de genes específicamente dianizados ha tenido un éxito limitado. Véanse, por ejemplo, Ts'o et al., Patente de EE.UU. Nº 4.469.863 expedida el 4 de septiembre de 1984; Miller et al., Patente de EE.UU. Nº 4.507.433 expedida el 26 de Marzo de 1985;y Miller et al., Patente de EE.UU. Nº 4.511.713 expedida el 16 de abril de 1985.

El trabajo descrito en cada una de las tres patentes antes mencionada implica el uso de oligonucleótidos en los cuales ha sido modificada la totalidad de los grupos fosfatos a la forma de fosfonatos de metilo. La Patente de EE.UU. Nº 5.491.133 muestra que los oligonucleótidos modificados en sólo el enlace 3'-más internucleotídico están marcadamente protegidos de la degradación dentro de la sangre y de las células. Además, dichos derivados tienen propiedades de hibridación normal y forman sustratos con los mRNA que son reconocidos y escindidos por la RNasaH, impidiendo con ello la expresión del gen dianizado. La consecución de esta inhibición de la expresión de genes seleccionados por oligonucleótidos que son resistentes a la degradación, y, por tanto, más eficaces cuando se usan terapéuticamente, es otro objetivo de esta invención.

Puede ser útil administrar las moléculas de ácidos nucleicos antes descritas, es decir, las moléculas de ribozima o antisentido, en un método de terapia de genes. Por consiguiente, serán útiles los vectores y técnicas descritos anteriormente. Los siguientes sistemas de expresión describen elementos vectores, promotores y reguladores que son útiles aplicaciones de terapia de genes para la administración de los polinucleótidos anteriores.

Los vectores y sistemas de expresión útiles para la presente invención incluyen sistemas virales y no virales. Ejemplos de sistemas de administración virales incluyen retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociados (AAV), virus sindbis y virus herpes. En un aspecto de la presente invención, el vector viral es capaz de integrar la secuencia anterior de ácido nucleico en el genoma de la célula hospedante para una expresión a largo plazo.

Ejemplos de vectores que pueden integrarse de esta manera son retrovirus y AAV. Un retrovirus preferido es el virus de la leucemia murina. Sin embargo, puede ser preferido evitar la integración en el genoma de la célula hospedante. Los vectores no virales incluyen DNA desnudo y DNA formulado con lípidos catiónicos o liposomas.

Los vectores retrovirales se producen manipulando genéticamente retrovirus. Los vectores retrovirales son eficaces para la integración en el genoma de la célula hospedante, como sea explicado antes. Sin embargo, ellos son los únicos que infectan a las células en división. Los vectores retrovirales contienen RNA y una vez entra en la célula, es sometido a transcripción inversa en DNA e integrado establemente en el genoma de la célula hospedante.

El genoma del retrovirus de tipo silvestre contiene tres genes: los genes gag, pol, and env, que están flanqueados por grandes secuencias repetitivas terminales (abreviadamente en lo sucesivo secuencias LTR por la expresión inglesa long terminal repeat). El gen gag codifica las proteínas de la nucleocápsida, el gen pol codifica las enzimas virales incluyendo la transcriptasa inversa y la integrasa, el gen env codifica las glicoproteínas virales de la envolvente. Las secuencias LTR 5' y 3' sirven para promover la transcripción y la poliadenilación de los viriones de RNA. Adyacentes a la secuencias 5' LTR están las secuencias necesarias para la transcripción inversa del genoma (el sitio de unión del cebador (o iniciador) de RNA) y para la encapsulación eficaz del RNA viral en partículas (el sitio Pi). Véase Mulligan, R.C., en: Experimental Manipulation of Gene Expression, M. Inouye (Ed). 155-173 (1983); Mann, R. et al ., Cell, (1983) 33:153-159; Cone, RD and R. C. Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), (1984) 81:6349-6353.

También, son ventajosos los AAV porque se replican con un alto valor del título, se integran eficazmente, no son patógenos para los seres humanos, son estables, fáciles de purificar, e infectan a células que no se dividen. Un vector de AAV se construye insertando la secuencia de ácido nucleico, bajo el control de un promotor/potenciador adecuado, entre las LTR del AAV, que son las únicas secuencias requeridas en cis para la replicación del AAV. Esta construcción de DNA se transfecta en una línea celular humana adecuada en presencia de otro plásmido que expresa Rep y CAP, las regiones codificadoras del AAV necesarias para la replicación. En un tiempo de post-transfección adecuado, las células se infectan con un virus coadyuvante, tal como Adenovirus o Virus Herpes Simplex. Después de la infección, las partículas del vector se cosechan de estas células. Las partículas de AAV se purifican a partir de Adenovirus o Virus Herpes contaminantes por protocolo estándares.

El Adenovirus es ventajoso porque infecta una amplia variedad de células, infecta células que no se dividen, produce un título elevado, su biología está bien entendida, y puede aceptar grandes inserciones. La expresión de los genes de adenovirus es controlada por una cascada de genes. Por ejemplo, el orden de expresión de los genes es "temprano inmediato", "temprano", síntesis de DNA, y genes tardíos o estructurales. Estos genes se expresan en secuencia. El gen maestro que primero se expresa es E1A. Una realización preferida implicaría reemplazar el gen E1A con la secuencia de ácido nucleico de interés y transfectar este vector en células que constitutivamente producen EIA, tal como las células 293 que son públicamente asequibles. El vector contiene todos los genes necesarios para la producción de viriones y la línea celular proporciona la proteína E1A que falta.

Un sistema no viral que puede usarse es el sistema T7/T7. Aquí una pequeña secuencia promotora reconocida por la polimerasa del virus bacteriano T7 se coloca en un vector situado hacia el extremo 5' de la secuencia de ácido nucleico de interés. El vector puede insertarse luego en las células y la polimerasa de T7 puede ser añadida para obtener la transcripción de genes. Alternativamente, puede obtenerse un vector que contiene las siguientes secuencias, la secuencia promotora de T7, el gen de la polimerasa de T7, otra copia de la secuencia promotora de T7, y las secuencias de ácidos nucleicos anteriores. En esta realización el vector se transforma en las células y requiere simplemente para la iniciación una pequeña cantidad de polimerasa de T7. A continuación, el vector dirige la fabricación de su propia polimerasa.

Adicionalmente será útil producir la proteína DP-75 a partir de la secuencia de ácido nucleico presentemente descrita para ser usada en la valoración en un ensayo para inhibidores o, por ejemplo, para la preparación de anticuerpos monoclonales. DP-75 puede ser producido por un microorganismo procariota o una célula eucariota que ha sido transformada con una secuencia de ácido nucleico de DP-75 natural o modificada. La secuencia de ácido nucleico de DP-75 útil en la presente invención codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos de la DP-75 natural.

Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico o proteína DP-75 será homóloga a las secuencias parciales enumeradas más adelante. Preferiblemente, la secuencia anterior tendrá una homología mayor que 95% con la SEQ ID NO:6 o uno de sus fragmentos, más preferiblemente tendrá una homología mayor que 98%, más preferiblemente mayor que 99%. Identidad sustancial significa que las secuencias son idénticas o difieren en una o más alteraciones (deleción, adiciones, sustituciones) que no afectan adversamente a la actividad de la proteína. Es preferible que las secuencias de proteínas sean homólogas en los mismos porcentajes antes indicados.

La estructura química precisa de la secuencia de DP-75 depende de cierto número de factores. Como están presentes grupos carboxilos y amino ionizables en la molécula, puede obtenerse una proteína particular en forma de sal ácida o básica o en forma neutra. Dichas preparaciones que retienen su actividad cuando se colocan en condiciones ambientales aceptables están incluidas en la definición de proteínas en la presente memoria. Además, la secuencia primaria de aminoácidos de la proteína puede ser aumentada por derivatización usando restos de azúcar (glicosilación) o por otras moléculas suplementarias tales como lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares. Ciertos aspectos de dicho aumento se consiguen por sistemas de tratamiento posteriores a la traducción de los hospedantes productores; otras de dichas modificaciones pueden ser introducidas in vitro. En cualquier caso, dichas modificaciones están incluidas en la definición de proteína en la presente memoria siempre que no se destruya la actividad de la proteína. Se espera que dichas modificaciones puedan afectar cualitativa o cuantitativamente y a la actividad, ya sea aumentando o disminuyendo la actividad de la proteína en los diversos ensayos. Además, los residuos de aminoácidos individuales de la cadena pueden ser modificados por oxidación, reducción o derivatización, y la proteína puede ser escindida para obtener fragmentos que retienen actividad. Dichas alteraciones que no destruyen la actividad no aparta la secuencia de la proteína de la definición de DP-75 en la presente memoria.

Finalmente, las modificaciones de la estructura primaria propiamente dicha por deleción, adición o alteración de los aminoácidos incorporados en la secuencia durante la traducción, pueden hacerse sin destruir la actividad de la proteína. Por ejemplo, la mutagénesis específica de sitio puede facilitar cambios específicos en la estructura del DNA para efectuar un cambio en la estructura del polipéptido. Véase Mark et al., Patente de EE.UU. Nº 4.959.314, y Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL, SECOND EDITION (1989), Volumen 2, capítulo 15.

La secuencia de aminoácidos de las proteínas DP-75 puede ser dividida en cuatro categorías generales: mutantes, fragmentos, fusiones, y la proteína codificada por la secuencia listada en SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:1, o sus fragmentos y otros homólogos encontrados en otros organismos. Las proteínas DP-75 naturales son las que se presentan en la naturaleza. La secuencia de aminoácidos de los polipéptidos naturales comprenderá una secuencia que varía ligeramente; típicamente, en menos de 10-20 aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO:1.

Una secuencia que codifica una proteína DP-75 natural puede ser modificada fácilmente para codificar otras clases de proteínas DP-75. Por ejemplo, pueden construirse mutantes hacienda sustituciones conservadoras de aminoácidos. Los siguientes son ejemplos de sustituciones conservadoras: Gly <-> Ala; Val <-> Lau; Asp <-> Glu; Lys <-> Arg; Asn <-> Gin; y Phe <-> Trp <-> Tyr. Un subconjunto de mutantes, llamado muteínas, es un grupo de polipéptidos con cisteínas que participan con enlaces no disulfuro sustituidas con un aminoácido neutro, generalmente, con serinas. Estos mutantes pueden ser estables en un amplio intervalo de temperaturas mayor que el de las proteínas DP-75 naturales. La secuencia codificadora de los mutantes puede contener también deleciones o inserciones de aminoácidos comparadas con las proteínas DP-75 naturales. La secuencia codificadora de los mutantes puede ser construida por mutagénesis in vitro de las secuencias codificadoras de polipéptidos de DP-75.

Los fragmentos son deleciones de aminoácidos amino y/o carboxi terminales de proteínas DP-75 mutantes o naturales. El número de aminoácidos que están truncados no es crítico siempre y cuando el fragmento polipeptídico exhiba la homología de secuencias deseada, y la actividad inmunológica o biológica. Los de fragmentos de polipéptidos de significación inmunológica comprenden; por ejemplo, al menos un epítopo compartido por una proteína DP-75. Tales proteínas DP-75 pueden tener solamente una longitud de 5-15 aminoácidos. Ejemplos de secuencias de aminoácidos de fragmentos incluyen los aminoácidos números 1-8 (aa1 hasta aa8) de SEQ ID NO:7; aa2 hasta aa9 de SEQ ID NO:7; aa3 hasta aa10 de SEQ ID NO:7; aa4 hasta aa11 de SEQ ID NO:7; aa5 hasta aa12 de SEQ 1D NO:7; aa6 hasta aa13 de SEQ ID NO:7; aa7 hasta aa14 de SEQ ID NO:7; aa8 hasta aa15 de SEQ ID NO:7; aa9 hasta aa16 de SEQ ID NO:7; aa10 hasta aa17 de SEQ ID NO:7; aa11 hasta aa18 de SEQ ID NO:7; aa12 hasta aa19 de SEQ ID NO:7; aa13 hasta aa20 de SEQ ID NO:7; aa14 hasta aa21 de SEQ ID NO:7; aa15 hasta aa22 de SEQ ID NO:7; aa16 hasta aa23 de SEQ ID NO:7; aa17 hasta aa24 de SEQ ID NO:7; aa18 hasta aa25 de SEQ ID NO:7; aa19 hasta aa26 de SEQ ID NO:7; aa20 hasta aa27 de SEQ ID NO:7; aa21 hasta aa28 de SEQ ID NO:7; aa22 hasta aa29 de SEQ ID NO:7; aa23 hasta as30 de SEQ ID NO:7; aa24 hasta aa31 de SEQ ID NO:7; aa25 hasta aa32 de SEQ ID NO:7; aa26 hasta aa33 de SEQ ID NO:7; aa27 hasta aa34 de SEQ ID NO:7; aa28 hasta aa35 de SEQ ID NO:7; aa29 hasta aa36 de SEQ ID NO:7; aa30 hasta aa37 de SEQ ID NO:7; aa31 hasta aa38 de SEQ ID NO:7; aa32 hasta aa39 de SEQ ID NO:7; aa33 hasta aa40 de SEQ ID NO:7; aa34 hasta aa41 de SEQ ID NO:7; aa35 hasta aa42 de SEQ ID NO:7; aa36 hasta aa43 de SEQ ID NO:7; aa37 hasta aa44 de SEQ ID NO:7; aa38 hasta aa45 de SEQ ID NO:7; aa39 hasta aa46 de SEQ ID NO:7; aa40 hasta aa47 de SEQ ID NO:7; aa41 hasta aa48 de SEQ ID NO:7; aa42 hasta aa49 de SEQ ID NO:7; aa43 hasta aa50 de SEQ ID NO:7; aa44 hasta aa51 de SEQ ID NO:7; aa45 hasta aa52 de SEQ ID NO:7; aa46 hasta aa53 de SEQ ID NO:7; aa47 hasta aa54 de SEQ ID NO:7; aa48 hasta aa55 de SEQ ID NQ:7; aa49 hasta aa56 de SEQ ID NO:7; aa50 hasta aa57 de SEQ ID NO:7; aa51 hasta aa58 de SEQ ID NO:7; aa52 hasta aa59 de SEQ ID NO:7; aa53 hasta aa60 de SEQ ID NO:7; aa54 hasta aa61 de SEQ ID NO:7; aa55 hasta aa62 de SEQ ID NO:7; aa56 hasta aa63 de SEQ ID NO:7; aa57 hasta aa64 de SEQ ID NO:7; aa58 hasta aa65 de SEQ ID NO:7; aa59 hasta aa66 de SEQ ID NO:7; aa60 hasta aa67 de SEQ ID NO:7; aa61 hasta aa68 de SEQ ID NO:7; aa62 hasta aa69 de SEQ ID NO:7; aa63 hasta aa74 de SEQ ID NO:7; aa64 hasta aa71 de SEQ ID NO:7; aa65 hasta aa72 de SEQ ID NO:7; aa66 hasta aa73 de SEQ ID NO:7; aa67 hasta aa74 de SEQ ID NO:7; aa68 hasta aa75 de SEQ ID NO:7; aa69 hasta aa76 de SEQ ID NO:7; aa70 hasta aa77 de SEQ ID NO:7; aa71 hasta aa78 de SEQ ID NO:7; aa72 hasta aa79 de SEQ ID NO:7; aa73 hasta aa80 de SEQ ID NO:7; aa74 hasta aa81 de SEQ ID NO:7; aa75 hasta aa82 de SEQ ID NO:7; aa76 hasta aa83 de SEQ ID NO:7;. aa77 hasta aa84 de SEQ ID NO:7; aa78 hasta aa85 de SEQ ID NO:7; aa79 hasta aa86 de SEQ ID NO:7; aa80 hasta aa87 de SEQ ID NO:7; aa81 hasta aa88 de SEQ ID NO:7; aa82 hasta aa89 de SEQ ID NO:7; aa83 hasta aa90 de SEQ ID NO:7; aa84 hasta aa91 de SEQ ID NO:7; aa85 hasta aa92 de SEQ ID NO:7; aa86 hasta aa93 de SEQ ID NO:7; aa87 hasta aa94 de SEQ ID NO:7; aa88 hasta aa95 de SEQ ID NO:7; aa89 hasta aa96 de SEQ ID NO:7; aa90 hasta aa97 de SEQ ID NO:7; aa91 hasta aa98 de SEQ ID NO:7; aa92 hasta aa99 de SEQ ID NO:7; aa93 hasta aa100 de SEQ ID NO:7; 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La secuencia codificadora de los fragmentos puede ser construida fácilmente escindiendo los nucleótidos no deseados de las secuencias que codifican la proteína DP-75 mutante o natural.

Las fusiones son proteínas DP-75 fragmentarias, mutantes o naturales con aminoácidos adicionales en uno o en ambos de sus extremos. La secuencia de aminoácidos adicionales no es necesariamente homóloga con la secuencia encontrada en los polipéptidos naturales del receptor hipotalámico. Los residuos de aminoácidos adicionales pueden facilitar, por ejemplo, la expresión, detección o actividad del polipéptido. La secuencia de aminoácidos adicionales también puede usarse como enlazador para construir multímeros de proteínas DP-75. Todos los polipéptidos de fusión exhiben la homología de secuencia y la actividad inmunológica o biológica deseada.

Como se ha mencionado previamente, la DP-75 recombinante puede ser producida por microorganismos procariotas o células eucariotas. Los sistemas celulares preferidos incluyen células de E. coli, mamíferos, baculovirus, y levaduras. Preferiblemente, DP-75 se produce transformando un microorganismo procariota con DNA para producir una proteína que posea actividad de DP-75 natural. Las bacterias son microorganismos procariotas que pueden producir DP-75 y E. coli es especialmente preferida. La DP-75 recombinante sintética también puede ser preparada en eucariotas, tales como células de levadura o humanas. Véase Sambrook, et al ., MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL, SECOND EDITION (1989), Volumen 3, para la expresión bacteriana, véase el capítulo 17, para la expresión en mamíferos, véase el capítulo 16 los cuales se incorporan en la presente memoria como referencia.

El DNA de DP-75 puede ser incorporado en un vector de expresión bacteriano que contiene todas las secuencias de control necesarias para expresar polipéptidos de DP-75. Las secuencias de control son conocidas en la técnica e incluyen: un sitio de unión a ribosoma, un promotor regulado (es decir, trp, trp-lac, \lambdap_{1}, y T7); opcionalmente una secuencia de operador, un codón de iniciación (ATG) y un codón de parada; un potenciador, etc. También es preferible incluir un origen de replicación para facilitar la replicación del plásmido dentro de las bacterias.

Los vectores apropiados y los plásmidos están disponibles públicamente y pueden ser empleados para contener DNA de DP-75. Pueden ser ligados, en un enlace operativo, a las secuencias de control anteriores y ser insertados en el vector usando enzimas y técnicas de ligación corrientemente disponibles. Adicionalmente, la secuencia de DNA de DP-75 puede insertarse en dirección 3' de una secuencia que proporciona la secreción en el espacio periplásmico, tal como la secuencia phoA.

Se conocen en la técnica una variedad de hospedantes bacterianos para la expresión y están disponibles en The American Type Culture Collection (ATCC). Los hospedantes bacterianos adecuados para expresar DP-75 incluyen, sin limitación: Campylobacter, Bacillus, Escherichia, Lactobacillus, Pseudomonas, Staphylococcus y Streptococcus. Un microorganismo transformado típico útil en la presente invención es E. coli K-12, la cepa MM294 (depositada en The American Type Culture Collection el 4 de agosto de 1983, por Cetus Corporación bajo las disposiciones del Tratado de Budapest y con el número de acceso Nº 39.405).

Los métodos de introducir DNA de DP-75 en hospedantes bacterianos son conocidos en la técnica, y típicamente incluyen tratar las bacterias con CaCl_{2} u otros agentes, tales como cationes divalentes y DMSO. El DNA desnudo o plasmídico también puede introducirse en las células bacterianas por electroporación o infección viral. Los métodos de transformación usualmente varían con la especie bacteriana que ha de ser transformada. Véase por ejemplo, (Masson et al., (1989) FEMS Microbial. Lett. 60:273; Palva et al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; Publicaciones de EP 036259 y 063953; PCT WO 84/04541, Bacillus), (Miller et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:856; Wang et al., (1990) J. Bacteriol. 172:949, Campylobacter), (Cohen et al., (1973) Proc. Natl. Acad. Sci., 69:2110; Dower et al., (1988) Nucleic Acids Res. 16:6127; Kushner (1978) ``An improved method for transformation of Escherichia coli with ColE1-derived plasmids in Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (eds. H.W. Boyer and S. Nicosia); Mandel et al., (1970) J. Mol. Biol. 53:159; Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949:318; Escherichia), (Chassy et al., (1987) FEMS Microbial. Lett, 44:173 Lactobacillus); (Fiedler et al., (1988) Anal. Biochem. 170:38, Pseudomonas); (Augustin et al., (1990) FEMS Microbiol. Lett. 66:203, Staphylococcus), (Barany et al., (1980) Bacteriol. 144:698; Harlander (1987) "Transformation of Streptococcus lactic by electroporation" en Streptococcal Genetics (ed. J. Ferretti and R. Curtiss III); Perry et al., (1981) Infec. Immun. 32:1295; Powell et al., (1988) Appl. Environ. Microbial. 54:655; Somkuti et al., (1987) Proc. 4th Eyr. Cong. Biotechnology 1:412, Streptococcus).

Procesos ilustrativos del crecimiento, cosecha, rotura o extracción del polipéptido de DP-75 de las células se describen sustancialmente en las Patentes de EE.UU. Nº. 4.604.377, 4.738.927, 4.656.132, 4.569.790, 4.748.234, 4.530.787, 4.572.298, 5.248.769 y 5.162.507.

DP-75 puede ser expresado en una variedad de otros sistemas de expresión; por ejemplo, preferiblemente sistemas de expresión en mamíferos o baculovirus, así como sistemas de expresión en levaduras.

Los sistemas de expresión en mamíferos son conocidos en la técnica. Un promotor de mamíferos es cualquier secuencia de DNA capaz de fijar o unir RNA polimerasa de mamífero e iniciar la transcripción en dirección 3' de una secuencia codificadora (por ejemplo, un gen estructural) en mRNA. Un promotor tendrá una región iniciadora de la transcripción, que está usualmente colocada próxima al extremo 5' de la secuencia codificadora, y una caja TATA, usualmente localizada 25-30 pares de bases (pb) hacia el extremo 5' del sitio de iniciación de la transcripción. Se cree que la caja TATA dirige la RNA polimerasa II a comenzar la síntesis de RNA en el sitio correcto. Un promotor de mamíferos también contendrá un elemento promotor en dirección 5', usualmente localizado 100 a 200 pb hacia el extremo 5' de la caja TATA. Un elemento promotor en dirección 5' determina la velocidad a la que se inicia la transcripción y puede actuar en cualquier orientación, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed. 1989).

La presencia de un elemento potenciador (potenciador), combinado con los elementos promotores descritos antes, aumentará usualmente los niveles de expresión. Un potenciador es una secuencia de DNA reguladora que estimula la transcripción hasta 1000 veces cuando esta unidad a promotores homólogos o heterólogos, comenzando la síntesis el sitio de iniciación del RNA normal. Los potenciadores también son activos cuando están colocados hacia el extremo 5' o hacia el extremo 3' desde el sitio de iniciación de la transcripción, en orientación normal o invertida, o a una distancia de más de 1000 nucleótidos desde el promotor, Maniatis et al., Science 236:1237 (1989); Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 2nd ed (1989). Los elementos potenciadores derivados de virus pueden ser particularmente útiles, debido a que usualmente tienen una gama más amplia de hospedantes. Ejemplos incluyen el potenciador del gen temprano de SV40, Dijkema et al ., (1985) EMBO J. 4:761, y los potenciadores/promotores derivados de la repetición terminal larga (LTR) del virus de sarcoma de Rous, Gorman et al., (1902) Proc. Natl. Acad. Sci. 79:6777, y de citomegalovirus humanos, Boshart et al., (1985) Cell, 41:5221. Adicionalmente, algunos potenciadores son regulables y solamente llegan a ser activos en presencia de un inductor, tal como una hormona o ion metálico, Sassorte-Corsi et al., (1986) Trends Genet. 2:215; Maniatis et al., (1987) Science, 236:1237.

Una molécula de proteína puede ser expresada intracelularmente en células de mamíferos. Una secuencia promotora puede ser enlazada directamente a una molécula de DNA, en cuyo caso el primer aminoácido en el extremo N de la proteína recombinante será siempre una metionina, que esta codificado por el codón de iniciación ATG. Si se desea, la metionina N-terminal puede ser escindida desde la proteína por incubación in vitro con bromuro de cianógeno.

Alternativamente, las proteínas extrañas también pueden ser secretadas desde la célula en el medio de crecimiento creando moléculas de DNA quiméricas que codifican una proteína de fusión constituida por una secuencia líder que proporciona la secreción de la proteína extraña en células de mamíferos. Preferiblemente, hay sitios de procesamiento codificados entre el fragmento delantera o líder y el gen extraño que pueden ser escindidos bien sea in vivo o bien sea in vitro. El fragmento de la secuencia líder usualmente codifica un péptido de señal constituido por aminoácidos hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína desde la célula. El líder tripartito de adenovirus es un ejemplo de una secuencia líder que proporciona la secreción de una proteína extraña en células de mamíferos.

Usualmente, las secuencias de transcripción, terminación y poliadenilación reconocidas por células de mamíferos son regiones reguladoras situadas en 3' respecto al codón de parada de la traducción y por tanto, junto con los elementos del promotor, flanquean la secuencia codificadora. El extremo 3' del mRNA maduro se forma y por escisión posterior a la traducción y poliadenilación, Birnstiel et al., (1985) Cell, 41:349; Proudfoot and Whitelaw (1988) "Termination and 3' end processing of eukaryotic RNA. In Transcription and splicing" (ed. B.D. Hames and D.M. Glover); Proudfoot (1989) Trends Biochem. Sci. 14:105. Estas secuencias dirigen la transcripción de un mRNA que puede ser traducido en el polipéptido codificado por el DNA. Ejemplos de señales de terminador de la transcripción/
poliadenilación incluyen las derivadas de SV40, Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual.

Algunos genes pueden ser expresados más eficazmente cuando están presentes intrones. Sin embargo, diversos cDNA, se han expresado eficazmente, a partir de vectores que carecen de señales de empalme (también denominadas sitios donadores y aceptores de empalme), véase, por ejemplo, Gething and Sambrook (1981) Nature 293:620. Los intrones son secuencias intercaladas no codificadoras dentro de una secuencia codificadora que contienen sitios donadores y aceptores de empalme. Se eliminan en el empalme después de la poliadenilación de los transcritos primarios, Nevins (1983) Annu. Rev. Biochem. 52:441; Green (1986) Annu. Rev. Genet. 20:671; Padgett et al., (1986) Annu. Rev. Biochem. 55:1119; Kramer and Maniatis (1988) "RNA splicing", In Transcription and splicing (ed. B.D. Hames and D.M. Glover).

Usualmente, los componentes antes descritos, que comprenden un promotor, una señal de poliadenilación, y una secuencia de terminación de la transcripción se colocan juntos en construcciones para expresión. Los potenciadores, los intrones con sitios funcionales aceptores y donadores de empalme, y las secuencias líderes también puedan estar incluidos en una construcción de expresión, si se desea. Los sistemas de replicación en mamíferos incluyen los derivados de virus animales, que requieren para replicarse factores de acción trans. Por ejemplo, los plásmidos que contienen el sistema de replicación de papovavirus, tales como SV44, Gluzman (1981) Cell, 23:175, o poliomavirus, se replican en un número de copias extremadamente alto en presencia del antígeno viral T apropiado. Ejemplos adicionales de replicones de mamíferos incluyen los derivados de papilomavirus de bovino y el virus de Epstein-Barr. Adicionalmente, el replicón puede tener dos sistemas de replicación, permitiendo por tanto ser mantenido, por ejemplo, en células de mamífero para la expresión y en un hospedante procariota para clonación y amplificación. Ejemplos de dichos vectores lanzaderas de mamíferos-bacterias incluyen pMT2, Kaufman et al., (1989) Mol. Cell. Biol. 9:946, y pHEBO, Shimizu et al., (1986) Mol. Cell. Biol. 6:1074.

El método de transformación usado depende del hospedante que se ha de transformar. Los métodos para la introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamíferos son conocidos en la técnica e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación de (de los) polinucleótido(s) en liposomas, y micro-inyección directa del DNA en los núcleos.

Las líneas de células de mamíferos disponibles como hospedantes para expresión son conocidas en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles en The American Type Culture Collection (ATCC), que incluyen, pero sin limitación, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de hámster bebé (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma humano hepatocelular (por ejemplo, Hep G2), y cierto número de otras líneas celulares.

La secuencia de ácido nucleico DP-75 también puede ser insertada en un vector de expresión de insectos adecuado, y se une operativamente a los elementos de control dentro del vector. La construcción del vector emplea métodos que son conocidos en la técnica.

Generalmente, los componentes del sistema de expresión incluyen un vector de transferencia, usualmente un plásmido bacteriano, que contiene tanto un fragmento del genoma de baculovirus, como un sitio de restricción conveniente para la inserción del gen o genes heterólogo(s) que han de expresarse; un baculovirus de tipo natural con una secuencia homóloga al fragmento específico de baculovirus en el vector de transferencia (esto permite la recombinación homóloga del gen heterólogo en el genoma del baculovirus); y células de insectos como hospedantes apropiadas y medio de crecimiento.

Después de insertar la secuencia de DNA de DP-75 en el vector de transferencia, el vector y el genoma viral de tipo natural se transfectan en una célula hospedante de insecto en donde se dejan recombinar el vector y el genoma viral. El virus recombinante empaquetado se expresa y se identifican y purifican las placas recombinantes. Los materiales y métodos para sistemas de expresión de baculovirus/células de insectos están comercialmente disponibles en forma de kit, entre otras compañías, en Invitrogen, San Diego CA (kit "MaxBac"). Estas técnicas generalmente son conocidas por expertos en la técnica y están completamente descritas en el trabajo de Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin Nº. 1555 (1987) (en lo sucesivo citado como "Summers and Smith").

Antes de insertar la secuencia de DNA que codifica la proteína en el genoma del baculovirus, los componentes antes descritos, que comprenden un promotor, una secuencia líder (si se desea), una secuencia codificadora de interés, y una secuencia de terminación de la transcripción, se ensamblan usualmente en una construcción intermedia (vector de transferencia).

Usualmente, el vector de transferencia más comúnmente usado para introducir genes extraños en AcNPV es pAc373. También se han diseñado muchos otros vectores conocidos por los expertos en la técnica. Estos incluyen, por ejemplo, pVL985 (que altera el codón de iniciación de polihedrina de ATG a ATT, y que introduce un sitio de clonación BamHI 32 pares de bases hacia el extremo 3' desde ATT; véase Luckow and Summers, Virology (1989) 17:31. El plásmido usualmente contiene también la señal de poliadenilación de polihedrina (Miller et al., (1988) Ann. Rev. Microbiol, 42:177) y un gen procariota de resistencia a ampicilina (amp) y el origen de replicación para la selección y propagación en E. coli.

Los vectores de transferencia de baculovirus contienen usualmente un promotor de baculovirus. Un promotor tendrá una región de iniciación de la transcripción que está colocada usualmente próxima al extremo 5' de la secuencia codificadora. Esta región de iniciación de la transcripción incluye usualmente un sitio de unión de RNA-polimerasa y un sitio de iniciación de la transcripción. Un vector de transferencia de baculovirus también puede tener un segundo dominio denominado un potenciador, que, si está presente, está usualmente distante del gen estructural. La expresión puede ser regulada o constitutiva.

Los genes estructurales, abundantemente transcritos en momentos tardíos en un ciclo de infección viral, proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Ejemplos incluyen secuencias derivadas del gen que codifica la proteína viral polihedrina, Friesen et al., (1986) "The Regulation of Baculovirus Gene Expression" en: The Molecular Biology of Baculoviruses (ed. Walter Doerfler); nº de publicación de la EPO 127839 y 155476; y el gen que codifica la proteína p10, Vlak et al., (1988), J. Gen. Virol. 69:765.

El DNA que codifica secuencias señal adecuadas puede ser derivado de genes para proteínas secretadas de insectos o baculovirus, tales como el gen de polihedrina de baculovirus (Carbonell et al., (1988) Gene, 73:409). Alternativamente, puesto que las señales para las modificaciones posteriores a la traducción en células de mamíferos (tales como la escisión del péptido señal, escisión proteolítica, y fosforilación) parecen ser reconocidas por células de insectos, y las señales requeridas para la secreción y acumulación nuclear también parecen ser conservadas entre las células de invertebrados, las secuencias líder de origen no insectos, también pueden usarse para proporcionar secreción en insectos, tales como las derivadas de genes que codifican \alpha-interferón humano, Maeda et al., (1985), Nature 315:592; el péptido liberador de gastrina humana, Lebacq-Verheyden et al., (1988), Molec. Cell. Biol. 8:3129; IL-2 humano, Smith et al., (1985) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 82:8404; IL-3 de ratón, (Miyajima et al ., (1987) Gene 58:273; y glucocerebrosidasa humana, Martin et al., (1988) DNA 7:99.

Después de la inserción de la secuencia de DNA y/o el gen que codifica el precursor del producto de expresión de la proteína, un célula de insecto hospedante se co-transforma con el DNA heterólogo del vector de transferencia y el DNA genómico del baculovirus de tipo natural -usualmente por co-transfección. Los métodos para introducir DNA heterólogo en el sitio deseado en el virus baculovirus se conocen en la técnica. (Véase Summers and Smith; Ju et al., (1987); Smith et al., Mol. Cell. Biol. (1983) 3:2156; y Luckow and Summers (1989)). Por ejemplo, la inserción puede ser en un gen, tal como el gen de polihedrina, por recombinación doble cruzada homóloga; la inserción también puede ser en una enzima de restricción manipulada ingenierilmente en el gen de baculovirus deseado. Miller et al., (1989), Bioassays 4:91.

El vector de expresión de baculovirus recientemente formado se empaqueta subsiguientemente en un baculovirus recombinante infeccioso. Los métodos para identificar virus recombinantes se describen en "Current Protocols in Microbiology" Vol. 2 (Ausubel et al., eds) en 16.8 (Supp. 10, 1990); Summers and Smith; Miller et al., (1989).

Los vectores de expresión recombinantes de baculovirus recientemente formados se han desarrollado para la infección en diversas células de insectos. Por ejemplo, los baculovirus recombinantes se han desarrollado para, entre otras: Aedes aegypti, Autographs californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda, y Trichoplusia ni (PCT Nº de Pub. WO 89/046699; Carbonell et al., (1985) J. Virol. 56:153; Wright (1986) Nature 321:718; Smith et al., (1983) Mol. Cell. Biol. 3:2156; y véase generalmente, Fraser, et al., (1989) In Vitro Cell. Dev. Biol. 25:225).

Los sistemas de expresión en levadura también son conocidos por los expertos ordinarios en la técnica. Dichos sistemas pueden ser usados aunque son menos preferidos en la presente invención. Para una revisión general de la expression en levadura, véase Barr et al., (eds.), Yeast Genetic Engineering, Butterworths, London (1989).

La proteína DP-75 puede ser purificada después de la expresión en un sistema de célula hospedante mediante una secuencia de etapas de recuperación y purificación. Por ejemplo, la DP-75 expresada en forma de una proteína soluble en E. coli puede ser liberada rompiendo las células bacterianas en un microfluidizador y ser recuperadas por precipitación en sulfato amónico al 30%. La proteína DP-75 puede ser redisuelta luego en un tampón y purificada por una variedad de etapas incluyendo, por ejemplo, cromatografía de cambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño molecular, cromatografía con hidroxiapatito, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de quelación de metales, HPLC de fase inversa, cromatografía de afinidad, y precipitaciones adicionales con sulfato de amonio. Estos métodos son muy conocidos por los expertos en la técnica.

La proteína DP-75 puede ser usada en una valoración de inhibidores y para preparar anticuerpos dirigidos contra DP-75. La proteína DP-75 también puede ser útil como un factor que favorece el crecimiento de células cancerosas en cultivos. La proteína DP-75 puede ser combinada con el vehículo farmacéuticamente aceptable antes citado para uso con la molécula antisentido de DP-75.

La presente invención se ilustrará a continuación con referencia a los siguientes ejemplos que exponen realizaciones particularmente ventajosas. Sin embargo, debe advertirse que estas realizaciones son ilustrativas y de ningún modo han de entenderse como restrictivas de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Aislamiento de la SEQ ID NO:1 (DP-75)

La secuencia parcial de ácido nucleico para DP-75 se expone a continuación como la SEQ ID NO:1 en forma de una molécula monocatenaria.

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1

Se aisló DP-75 de cDNA hipotalámico construyendo sondas de ácido nucleico como sigue. Los primeros 19 nucleótidos (AAGGCCTTTG TTGGGTGCC) proceden del oligo DO-3 degenerado (AAGGCCTTTGYTGGNYNCC) y el complemento de los últimos 22 nucleótidos (CCCCGGGGATCAACATTGGGTT) procede de oligo DO-14 degenerado (CCCCGGGGATVADVADDGGRTT). La secuencia AGGCCT de DO-3 comprende un sitio de restricción StuI y la secuencia CCCGGG de DO-14 comprende un pequeño sitio de restricción SmaI. La reacción en cadena de la polimerasa PCR se llevó a cabo en cDNA hipotalámico y se clonaron y secuenciaron los productos resultantes.

Una colección de tejidos humanos se escrutó en cuanto a la presencia de DP-75. Kits de transferencias Northern se adquirieron a Clontech Laboratories Inc., 4030 Fabian Way, Palo Alto, CA. Una mancha de transferencia contenía aproximadamente 2 microgramos de RNA de poli A^{+} por pista de ocho tejidos humanos diferentes. El RNA se hizo correr en un gel de agarosa al 1,2% con formaldehído desnaturalizante, se transfirió a una membrana de nilón modificada en carga por transferencia Northern, y se fijó por irradiación con UV. Las pistas 1-8 contenían RNA de corazón, cerebro, placenta, pulmón, hígado, musculatura del esqueleto, riñón y páncreas. Están indicadas las bandas del marcador del tamaño del RNA. Una segunda mancha de transferencia contenía 2 microgramo de RNA de poli A^{+} por pista de ocho diferentes secciones del cerebro. La transferencia se realizó como antes. Las secciones de cerebro fueron cerebelo humano, córtex cerebral, médula, cordón espinal, polo occipital, lóbulo frontal, lóbulo temporal y putamen. Se encontró que la DP-75 se expresaba en corazón normal, cerebro y musculatura del esqueleto. El tamaño del mensaje (RNA) fue mayoritariamente 3 Kb por cerebro, y pareció ser 6 Kb en corazón y musculatura del esqueleto. Una mirada más completa a las regiones del cerebro mostró que el córtex cerebral, el polo occipital, el lóbulo frontal, el lóbulo temporal y el putamen contenían un mensaje de 3 Kb, pero que el cerebelo contenía un mensaje de 7,7 Kb. Por consiguiente, parece que puede haber versiones diferencialmente empalmadas de DP-75 en diversas regiones del cuerpo.

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Ejemplo 2 Utilización de la SEQ ID NO:1 para diagnosticar cáncer

En una valoración por transferencia de puntos, la DP-75 se hibridó a RNA de tejido tanto normal como canceroso. La fuente de tejido canceroso incluyó renal, de tiroides, mama, colon, uretra, pulmón, nariz, estómago, esófago, hígado, linfoma, útero, vejiga, recto y cerebro.

Los kits de transferencia fueron adquiridos a BioChain Institute, Inc., San Leandro, California, USA. El tampón de hibridación ExpressHyb^{TM} adquirido a Clontech, Palo Alto, California, USA, se usó para la transferencia a 68ºC con DP-75 (SEQ ID NO: 1) a 1x10^{6} cpm/ml durante 2 horas.

En una de cuatro muestras de tiroides, los niveles de mRNA (DP-75) de la SEQ ID NO:1 fueron más elevados en las muestras de cáncer que en las normales. Véase la Figura 1.

En dos de cuatro muestras de colon, los niveles de mRNA (DP-75) de la SEQ ID NO:1 fueron más elevados en las muestras de cáncer que en las normales. Véase la Figura 1.

En una de dos muestras de uretra, los niveles de mRNA (DP-75) de la SEQ ID NO:1 fueron más elevados en las muestras de cáncer que en las normales. Véase la Figura 1.

En una de cuatro muestras de mama, los niveles de mRNA (DP-75) de la SEQ ID NO:1 fueron más elevados en las muestras de cáncer que en las normales. Véase la Figura 1.

En una de cuatro muestras renales, los niveles de mRNA (DP-75) de la SEQ ID NO:1 fueron más elevados en las muestras de cáncer que en las normales. Véase la Figura 1.

En todos los otros tipos de tejidos analizados, los niveles de mRNA (DP-75) SEQ ID NO:1 fueron iguales o superiores en las muestras de tejidos normales que en las muestras de tejidos cancerosos.

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Ejemplo 3 Aislamiento de la SEQ ID NO:6

La SEQ ID NO:6 se aisló de una colección del córtex frontal utilizando un vector fago, y se adquirió a Stratagene, La Jolla, California, USA. La colección se sondó con la SEQ ID NO:1, que se generó por un marcador cebado al azar con un recuento radioactivo final de aproximadamente 1x10^{6} cpm/ml. La sonda se marcó de acuerdo con las instrucciones del fabricante con un kit de marcaje de DNA RediPrime^{TM} adquirido a Amersham, Arlington Heights, Illinois, USA.

La colección de fagos se propagó y luego se cultivó en placas sobre veinte placas de acuerdo con las instrucciones del fabricante con 3,0-5,0 x 10^{5} calvas/placa. Las calvas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Cada membrana se incubó con la sonda de la SEQ ID NO:1 durante 2 horas a 65ºC en solución de hibridación ExpressHyb^{TM} adquirida a Clontech, Palo Alto, California, USA. Los filtros se lavaron de acuerdo con las instrucciones de Clontech. La película se expuso a las membranas para identificar las supuestas placas positivas que contenían el polinucleótido DP-75 deseado.

Se realizó una segunda ronda de cultivos en placas e hibridación para identificar una sola calva positiva. Las calvas positivas de la primera ronda se propagaron y cultivaron en placas de medio de agar-agar de acuerdo con las instrucciones proporcionadas Stratagene. Las calvas se transfirieron a filtros. Estos filtros se incubaron con la sonda de la SEQ ID NO:1. La sonda y las condiciones de hibridación fueron las mismas que se han descrito antes. Se identificaron y propagaron las calvas positivas.

De acuerdo con las instrucciones proporcionadas por Stratagene, se rescató un plásmido BlueScript del vector fago. Se secuenció la inserción EcoRl del plásmido. La secuencia del polinucleótido se muestra en la SEQ ID NO:6.

Pueden aislarse otras secuencias que codifican el polipéptido DP-75 usando una extensión de cebador y técnicas de PCR para generar genotecas. Estas técnicas emplean cebadores que comprenden la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:6 o sus mutantes, fusiones o fragmentos.

Una vez que se han generado las genotecas, puede ser identificados otros polinucleótidos de DP-75 a partir de la genoteca usando sondas que comprenden una secuencia de la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:6 o sus mutantes, fusiones o fragmentos.

Los polipéptidos, polinucleótidos o anticuerpos de DP-75 pueden ser administrados oralmente, tópicamente o por medios parenterales, incluyendo inyección subcutánea e inyección intramuscular, implantación de formulaciones de liberación prolongada, inyección intravenosa, administración intranasal y similares. Cuando se usan para tratar tumores puede ser ventajosa aplicar los polinucleótidos o anticuerpos DP-75, por ejemplo, directamente al sitio, por ejemplo, durante la cirugía para eliminar la masa del tumor. Por consiguiente, los polipéptidos, polinucleótidos o anticuerpos DP-75 pueden ser administrados en forma de una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones pueden ser soluciones acuosas, emulsiones, cremas, ungüentos, suspensiones, geles, suspensiones de liposomas y similares.

Los excipientes adecuados incluyen agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa, y soluciones de etanol, glucosa, sacarosa, dextrano, manosa, manitol, sorbitol, polietilenglicol (PEG), fosfato, acetato, gelatina, colágeno, Carbopol®, aceites vegetable y similares. Se pueden incluir adicionalmente conservantes adecuados, estabilizantes, antioxidantes, antimicrobianos y soluciones tampón, por ejemplo, BHA, BHT, ácido cítrico, ácido ascórbico, tetraciclina y similares. Las bases para cremas o pomadas útiles en la formulación incluyen lanolina, Silvadenc® (Marion), Aquaphor® (Duke Laboratories) y similares. Otras formulaciones tópicas incluyen aerosoles, vendas medicadas, y otros apósitos de vendajes. Alternativamente, las formulaciones pueden incorporar o encapsular los polipéptidos, polinucleótidos o anticuerpos de DP-75 en una matriz o membrana de un polímero adecuado, proporcionando de este modo un dispositivo de liberación prolongada adecuado para la implantación cerca del sitio que ha de ser tratado localmente. Otros dispositivos incluyen catéteres y dispositivos de implantación permanente, tales como la minibomba Alzet®. La preparaciones oftálmicas pueden ser formuladas usando vehículos comercialmente disponibles, tales como Sortai-care® (Allergan), Neodecadron® (Merck, Sharp & Dohme), Lacrilube®, y similares o pueden emplear preparaciones tópicas, tales como las descritas en la patente de EE.UU. Nº 5.124.155.

Además se puede proporcionar un polipéptido, polinucleótido o anticuerpo de DP-75 en forma sólida, especialmente en forma de un polvo liofilizado. La formulaciones liofilizadas contiene típicamente agentes estabilizantes y de voluminosidad, por ejemplo seroalbúmina humana, sacarosa, manitol, y similares. Un descripción a fondo de los excipientes farmacéuticamente aceptables está disponible en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co.).

La cantidad de polipéptido, polinucleótido o anticuerpo de DP-75 requerida para tratar cualquier trastorno particular variará naturalmente con la naturaleza y gravedad del trastorno, la edad y estado del sujeto, y otros factores fácilmente determinados por los expertos ordinarios en la técnica. La dosis apropiada puede ser determinada por un experto ordinario en la técnica siguiendo los métodos expuestos en los ejemplos.

La presente invención se ha descrito con referencia a realizaciones específicas. Sin embargo, esta solicitud está destinada a cubrir los cambios y sustituciones que puedan ser realizados por los expertos ordinarios en la técnica sin apartarse del espíritu y alcance de las reivindicaciones anexas.

Información de depósito

El siguiente material se depositó en The American Type Culture Collection:

Nombre	Fecha del depósito	N^{o} de entrada

Escherichia coli INV\alpha F' DP 75	25 de abril 1996	98030

Los materiales anteriores han sido depositados en The American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, bajo el número de entrada indicado. Este depósito se mantendrá de acuerdo con los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional de los Depósitos de Microorganismos para los fines del procedimiento de Patentes. Los depósitos serán mantenidos durante un periodo de 30 años después de la concesión de la patente, o durante la vida legal de la patente, el plazo que sea mayor. Tras la concesión de la patente, los depósitos serán asequibles al público en ATCC sin restricción.

Estos depósitos se proporcionan simplemente por conveniencia para conocimiento de los expertos en la técnica, y no son el reconocimiento de que se requiere un depósito de acuerdo con la norma 35 U.S.C. \NAK112. Las secuencias de polinucleótidos contenidas dentro de los materiales depositados, así como las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos codificados por ellos, sirven como control en el caso de conflicto con la descripción escrita de las secuencias en la presente memoria. Para fabricar, usar o vender los materiales depositados debe solicitarse una licencia, pero la presente memoria no concede dicha licencia.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE: CHIRON CORPORATION

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevo DNA y procedimiento para su uso

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 7

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(iv): DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

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(A): DESTINATARIO: Chiron Corporation

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(B): CALLE: P.O. Box 8097

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(C): CIUDAD: Emeryville

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(D): ESTADO: California

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(E): PAÍS: Estados Unidos de América

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(F): CÓDIGO POSTAL: 94662-8097

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(v): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: disquete flexible

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(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): PROGRAMA: PatentIn Release Nº 1.0, Versión Nº 1.25

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(vi): DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:

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(A): NÚMERO DE LA SOLICITUD:

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN:

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(viii): APODERADO/INFORMACIÓN DEL AGENTE:

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(A): NOMBRE: Chung, Ling-Fong

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(B): NÚMERO DE REGISTO: 36.482

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(C): REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: 1203.001

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(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: (510) 601-2704

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(B): TELEFAX: 15101 655-3542

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 355 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE CADENA: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

2

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 19 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE CADENA: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGGCCTTTG TTGGGTGCC

\hfill

19

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 19 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGGCCTTTG YTGGNYNCC

\hfill

19

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(E): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(F): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCCGGGGAT CAACATTGGG TT

\hfill

22

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(G): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(H): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCCGGGGAT VADVADDGGR TT

\hfill

22

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:6:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2869 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(I): TIPO DE CADENA: sencilla

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(J): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

3

4

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 626 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

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(K): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(L): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7

5

6

Claims

1. Un polinucleótido aislado que comprende a secuencia de ácido nucleico capaz de hibridarse con la SEQ ID NO: 6 o su complemento a 32ºC en presencia de formamida al 50%, en donde dicho polinucleótido no es el polinucleótido que tiene la secuencia de ácido nucleico:

7

2. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1, que comprende un fragmento de la secuencia de SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 1 de una longitud entre 15 y 40 pares de bases.

3. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1, en donde la secuencia de ácido nucleico exhibe al menos 98% de homología con la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 1.

4. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1, en donde la secuencia de ácido nucleico exhibe al menos 99% de homología con la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 1.

5. El polinucleótido aislado de la reivindicación 4, que comprende la secuencia monocatenaria 5' a 3' de ácido nucleico:

8

6. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1, en donde dicho polinucleótido tiene: (a) una longitud de entre 10 y 50 bases; (b) una longitud de entre 15 y 40 bases; o (c) una longitud de entre 20 y 30 bases.

7. Un vector de expresión aislado que comprende: (1) una secuencia de control y (2) un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; en donde dicha secuencia de control está unida operativamente a dicho polinucleótido.

8. Una célula hospedante que comprende un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 7, en donde:

(a): la secuencia de control es heteróloga para dicho polinucleótido y dicha secuencia de control está unida operativamente a dicho polinucleótido; o

(b): la secuencia de control es heteróloga para dicha célula hospedante y dicha secuencia de control está unida operativamente a dicho polinucleótido.

9. La célula hospedante de la reivindicación 8, en donde dicha célula es una bacteria, una célula de levadura, una célula de mamífero o una célula de insecto.

10. La célula hospedante de la reivindicación 9, en donde la célula se selecciona de ovario de hámster chino, células HeLa, células de riñón de hámster recién nacido, células de riñón de mono, células de carcinoma hepatocelular, Campylobacter, Bacillus, Escherichia, Lactobacillus, Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus, Aedes egypt, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda, y Trichoplusia ni.

11. Un método para detectar células hiperproliferantes en una muestra, que comprende:

(a): proporcionar una sonda de polinucleótido que comprende una secuencia capaz de hibridarse con la SEQ ID NO: 6 a 32ºC en presencia de formamida al 50%;

(b): poner en contacto la sonda con los polinucleótidos de la célula de muestra en condiciones que permitan la formación de híbridos de polinucleótidos; y

(c): detectar los híbridos.

12. El método de la reivindicación 11, en donde la sonda tiene una longitud de entre 10 y 50 bases.

13. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que está codificada por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridarse con la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 1 a 32ºC en presencia de formamida al 50%, en donde dicho polipéptido exhibe al menos 20% de la actividad biológica del polipéptido codificado por la SEQ ID NO: 6.

14. El polipéptido de la reivindicación 13, en donde dicho polipéptido está codificado por el polinucleótido de la SEQ ID NO: 6 o varía de secuencia del polipéptido codificado por la SEQ ID NO: 6 en menos de 20 aminoácidos.

15. El polipéptido de la reivindicación 13 o 14 o uno de sus fragmentos o fusión, en donde dicho polipéptido exhibe un epítopo inmunológico del polipéptido codificado por el polinucleótido de la SEQ ID NO: 6.

16. El polipéptido de la reivindicación 13, en donde la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido exhibe al menos 98% de homología con la SEQ ID NO: 7.

17. El polipéptido de la reivindicación 13, en donde la secuencia de aminoácidos es ocho aminoácidos contigua de la SEQ ID NO: 7.

18. Una composición que comprende el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

19. Un anticuerpo aislado que específicamente se une a un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17.

20. El anticuerpo aislado de la reivindicación 19, en donde dicho anticuerpo se une específicamente a un epítopo de un polipéptido que exhibe al menos 98% de homología con la SEQ ID NO: 7.

21. Un proceso para producir un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, que comprende:

(a): proporcionar una célula hospedante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10; y

(b): cultivar dicha célula hospedante en condiciones que induzcan la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico.

22. Un vector antisentido que comprende. (i) un polinucleótido antisentido que comprende una secuencia capaz de hibridarse con la SEQ ID NO:6 a 32ºC en presencia de formamida al 50%; y (ii) un polinucleótido que comprende una secuencia capaz de iniciar la transcripción de dicho polinucleótido antisentido.

23. El vector antisentido de la reivindicación 22, que comprende además un origen de la replicación.

24. El vector antisentido de la reivindicación 22, que comprende además un polinucleótido capaz de facilitar la integración del vector en un genoma.

25. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia capaz de hibridarse con la SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 1 a 32ºC en presencia de formamida al 50%, en donde dicho polinucleótido es además capaz de escindir el mRNA que codifica un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 14.

26. Un de vector ribozima que comprende:

(i): una secuencia de polinucleótido de ribozima capaz de hibridarse con la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO:1 a 32ºC en presencia de formamida al 50%; y

(ii): un polinucleótido que comprende una secuencia capaz de iniciar la transcripción de dicho polinucleótido de ribozima,

27. El vector antisentido de la reivindicación 22 o el vector de ribozima de la reivindicación 26, en donde dichas secuencias para iniciar la transcripción se derivan de un retrovirus, un adenovirus, o un virus adeno-asociado.

28. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un agente capaz de potenciar la absorción del polinucleótido.

29. La composición farmacéutica de la reivindicación 28, que comprende además una sal soluble en agua.

30. La composición farmacéutica de la reivindicación 28, que comprende además un ácido grado.

31. La composición farmacéutica de la reivindicación 28, en donde dicho ácido graso es aceite de sésamo.

32. La composición farmacéutica de la reivindicación 28, que comprende además un éster de ácido graso sintético.

33. La composición farmacéutica de la reivindicación 28, en donde dicho éster de ácido graso se selecciona del grupo que consiste en oleato de etilo y triglicéridos.

34. La composición farmacéutica de la reivindicación 28, que comprende además una sustancia para aumentar la viscosidad de la composición.

35. La composición farmacéutica de la reivindicación 34, en donde dicha sustancia se selecciona de carboximetil-celulosa de sodio, sorbitol, y dextrano.

36. Uso de:

(a): un vector antisentido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24 o 27;

(b): un vector de ribozima de acuerdo con la reivindicación 26 o 27; o

(c): un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 19 o 20; en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de tumores.

37. Un método para detectar polipéptidos en una muestra in vitro, que comprende:

(a): proporcionar un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 19 o 20;

(b): poner en contacto dicho anticuerpo con la muestra en condiciones que permitan la formación complejos anticuerpo/antígeno; y

(c): detectar los complejos.