ES2354811T3 - Factor inductor del factor nuclear kb. - Google Patents

Abstract

Un ácido nucleico que codifica el polipéptido NFIF (factor inductor del factor nuclear)-14b que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

Description

Campo de la Invención

El factor nuclear B (NFB) comprende una familia de factores de transcripción eucarióticos implicados en la regulación de genes implicados en las respuestas inmunitarias y en otras funciones celulares. En ciertos casos, la activación de NFB conduce a una respuesta inflamatoria que finalmente da como resultado una enfermedad. Por lo tanto, sería deseable desarrollar medios para controlar la inducción de NFB. La presente invención proporciona polipéptidos que están implicados en la inducción de NFB y que se pueden usar para incrementar la expresión o la activación de NFB o para identificar y preparar inhibidores de la expresión o la activación de NFB.

Adelantos Indicados

El factor nuclear B (NFB) comprende una familia de factores de transcripción hallados en casi todas las células eucarióticas. NFB desempeña un papel en la regulación de genes implicados en la inflamación tisular, la proliferación celular, y la diferenciación celular.

Varios estudios han examinado la relación entre enfermedades y la expresión de las proteínas de las subunidades que constituyen NFB o la activación del NFB ya presente en una célula. Li et al. estudió la regulación de NFB mediante la proteína Tax de HTLV-1, lo que demostró que la capacidad de Tax de activar la ruta de NFB desempeña un papel esencial en la transformación celular inducida por HTLV-1 (Li et al., Gene Expr., 7, 4-6, 233-245 (1999)). Lentsch y Ward estudiaron la activación y la regulación de NFB durante la inflamación aguda y describieron la relación entre NFB y las proteínas inhibidoras de la familia IKappaB (Lentsch et al., Clin. Chem. Lab. Med., 37, 3, 205-208 (1999)). Visconti et al. investigó el papel de NFB en la carcinogénesis de tiroides analizando líneas celulares de carcinoma de tiroides. Sus estudios indicaron que la activación del complejo NFB mediante la sobreexpresión de la proteína p65 desempeñó un papel crítico en el proceso de transformación de las células tiroideas (Visconti et al., Oncogene, 15, 16, 1987-1994 (1997)). Mukhopadhyay et al. investigó la expresión de la subunidad p50 del complejo de factor de transcripción NFB en tejidos de carcinoma de pulmón no microcítico, lo que demostró que un 81% de los tejidos de cáncer de pulmón no microcítico recientes expresan niveles de dos a veinte veces mayores de la subunidad p50 que el tejido pulmonar normal (Mukhopadhyay et al., Oncogene, 11,5,999-1003 (1995)). Khaled et al. seleccionó como objetivo la expresión génica de p50 con oligodesoxinucleótidos antisentido modificados con fosforotioato en 3' específicos y fue capaz de reducir la expresión de NFB. Sus resultados demostraron que las moléculas antisentido de p50 podían reducir la expresión de NFB y podían inhibir la respuesta inmunitaria proporcionando un posible tratamiento para los trastornos autoinmunitarios (Khaled et al., Clin. Immunol. Immunopathol., 83, 3, 254-263 (1997)).

Pahl (Oncogene, Vol. 18, Nº 49, 1999, págs. 6853-6866) describe activadores y genes objetivo de los factores de transcripción Rel/NF-kappa B. Además, Mukhopadhyay (J. Biol. Chem., Vol. 274, Nº 23, 1999, págs. 15978-15981) describe una citocina denominada THANK que activa el factor nuclear B.

Sumario de la Invención

De acuerdo con la presente invención, se proporcionan las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el factor inductor del factor nuclear B (NFIF) 14b y 7a. También se incluyen cADNs que codifican NFIF-14b y NFIF-7a y polipéptidos NFIF-14b y NFIF-7a aislados y purificados que inducen NF

B. La presente invención incluye además los vectores de expresión que expresan los polipéptidos NFIF14b y NFIF-7a. Los ejemplos de los vectores de expresión preferidos son los vectores retrovirales, los vectores adenovirales, los vectores adeno-asociados, herpes, los vectores de herpesvirus y los vectores de ADN desnudo. La presente invención también proporciona composiciones que comprenden un polipéptido NFIF-14b o NFIF-7a y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto de la presente invención son las composiciones para disminuir la expresión del gen de NFIF que comprenden un ácido nucleico antisentido. Aún otro aspecto de la presente invención es una composición para disminuir la actividad de un polipéptido NFIF que comprenden un anticuerpo neutralizante que se une a un polipéptido NFIF y que disminuye su actividad.

Aún otra realización de la presente invención es una composición para disminuir la expresión de NFIF en un paciente que comprende una ribozima que corta el ARN que codifica un polipéptido NFIF.

La presente invención proporciona métodos para determinar si un compuesto de ensayo es eficaz para inhibir la actividad de los polipéptidos NFIF-14b que comprenden (A) comparar el nivel de la expresión del gen regulado por NFB en una primera muestra que comprende: (1) NFIF-14b; (2) el gen indicador regulado por NFB; y (3) el compuesto de ensayo con el nivel de expresión del gen en una segunda muestra que comprende (4) NFIF-14b; y (5) el gen indicador regulado por NFB; y (B) determinar si la expresión del gen indicador es menor en la primera muestra respecto de la segunda muestra.

Aún otro aspecto de la presente invención proporciona métodos para determinar si un compuesto de ensayo es eficaz en la inhibición de la actividad de los polipéptidos NFIF-7a que comprende (A) comparar el nivel de la expresión del gen regulado por NFB en una primera muestra que comprende: (1) NFIF-7a; (2) el gen indicador regulado por NFB; y (3) el compuesto de ensayo con el nivel de expresión del gen en una segunda muestra que comprende (4) NFIF-7a; y (5) el gen indicador regulado por NFB; y (B) determinar si la expresión del gen indicador es menor en la primera muestra respecto de la segunda muestra.

Aún otro aspecto de la presente invención proporciona un método para identificar si un compuesto de ensayo puede estimular la actividad de NFIF-14b basado en la expresión de un gen indicador regulado por NFB que comprende (A) comparar el nivel de expresión del gen regulado por NFB en una primera muestra que comprende (1) NFIF-14b; (2) el gen indicador regulado por NFB; y

(3)

el compuesto de ensayo con el nivel de expresión del gen en una segunda muestra que comprende:

(4)

NFIF-14b; y (5) el gen indicador regulado por NFB; y (B) determinar si la expresión del gen indicador es mayor en la primera muestra respecto de la segunda muestra.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un método para identificar si un compuesto de ensayo puede estimular la actividad de NFIF-7a basado en la expresión de un gen indicador regulado por NFB que comprende (A) comparar el nivel de expresión del gen regulado por NFB en una primera muestra que comprende (1) NFIF-7a; (2) el gen indicador regulado por NFB; y (3) el compuesto de ensayo con el nivel de expresión del gen en una segunda muestra que comprende: (4) NFIF-7a; y (5) el gen indicador regulado por NFB; y (B) determinar si la expresión del gen indicador es mayor en dicha primera muestra respecto de la segunda muestra.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un polipéptido NFIF para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento y/o la prevención de una respuesta inflamatoria regulada por NFB. Aún otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un ácido nucleico que codifica un polipéptido NFIF, para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento y/o la prevención de una respuesta inflamatoria regulada por NFB.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un vector recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido NFIF, para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento y/o la prevención de una respuesta inflamatoria regulada por NFB. Aún otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un vector viral recombinante deficiente para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento y/o la prevención de una respuesta regulada por NFB.

Están disponibles dos secuencias que muestran similitudes con los polipéptidos de la presente invención en la biblioteca GenBank de secuencias de ácidos nucleicos. La primera secuencia, que tiene el número de acceso Y08135, codifica un péptido identificado como fosfodiesterasa 3a similar a esfingomielinasa ácida de ratón de tamaño completo. La segunda secuencia, que tiene el número de acceso Y08136, codifica un clon humano parcial (863 pb de las cuales 536 son codificantes) de una secuencia proteica identificada como fosfodiesterasa 3a similar a esfingomielinasa ácida humana. Ambas secuencias fueron presentadas el 17 de septiembre de 1996 por K. Hofmann. Aunque se identificó que ambas secuencias codificaban fosfodiesterasas similares a esfingomielinasa ácida, no ha habido confirmación de este tipo de actividad enzimática. Estas secuencias se pueden haber identificado como fosfodiesterasas similares a esfingomielinasa ácida debido a las similitudes entre las secuencias de 3' de estas proteínas y las secuencias de 3' de los miembros de la familia de esfingomielinasas.

Breve Descripción de los Dibujos

La Figura 1 es la secuencia de aminoácidos de NFIF-14b.

La Figura 2 es la secuencia de aminoácidos de NFIF-7a.

La Figura 3 es la secuencia de cADN de NFIF-14b y NFIF-7a alineadas para su comparación.

La Figura 4 es una representación esquemática de NFIF-14b y NFIF-7a.

La Figura 5 es un gráfico de barras que representa las cuentas de luminómetro por segundo observadas en células HeK 293 a las 48 horas.

La Figura 6 es un gráfico de barras que representa las cuentas de luminómetro por segundo observadas en células Cos-7 a las 48 horas.

La Figura 7 es la secuencia de aminoácidos de una secuencia de 15 residuos usada para preparar anticuerpos dirigidos hacia NFIF.

La Figura 8 es una transferencia de Northern mediante el uso de una sonda de NFIF.

Descripción Detallada de la Invención

La presente invención proporciona polipéptidos que son capaces de inducir NFB, así como compuestos y composiciones que son capaces de inhibir la inducción de NFB.

La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de la proteína factor inductor de NFB (NFIF). Se han identificado dos variantes funcionales de la proteína NFIF. Una variante, NFIF-14b, comprende NFIF de tamaño completo. Se cree que la segunda variante, NFIF-7a, es una variante de corte y empalme de NFIF-14b. Tanto NFIF-14b como NFIF-7a tienen la capacidad de inducir NFB.

NFB comprende una familia de factores de transcripción eucarióticos que regulan los genes implicados en las respuestas inmunitarias y en otras actividades celulares. En ciertas situaciones, puede ser deseable inducir NFB para iniciar o incrementar el grado de la respuesta inmunitaria. En otras situaciones, puede ser deseable reducir o prevenir la inducción de NFB para reducir o prevenir una respuesta inmunitaria regulada por NFB. Por ejemplo, se ha descubierto que NFIF está asociado a una diversidad de patologías asociadas a las respuestas inmunitarias reguladas por NFB, que incluyen la aterosclerosis. Mediante la inhibición de la expresión del gen de NFIF, o mediante la interferencia de otra manera con la actividad de la proteína NFIF, es posible inhibir la inducción de NFB, por lo que se inhiben o se previenen las respuestas inflamatorias reguladas por NFB que dan como resultado aterosclerosis y otras enfermedades.

El descubrimiento del gen que codifica NFIF y la capacidad de preparar proteínas NFIF facilita la identificación y la preparación de compuestos y composiciones que son capaces de inhibir la actividad de las proteínas NFIF y por lo tanto inhibir la inducción de NFB.

La descripción siguiente comienza con una sección de Definiciones, seguida de información antecedente relacionada con NFB. Esta va seguida por una discusión de los polipéptidos NFIF de la presente invención, así como de información sobre el aislamiento del ADN que codifica tales polipéptidos y los métodos para la preparación de variantes de los polipéptidos. Después se discuten los vectores de expresión capaces de expresar los ADNs que codifican los polipéptidos NFIF, lo que incluye información sobre los promotores adecuados para los sistemas de expresión, los métodos para introducir los vectores de expresión en las células hospedadoras adecuadas y los sistemas de vectores virales. Tras esta discusión sobre los polipéptidos NFIF y sus variantes, hay una discusión sobre los usos terapéuticos de los polipéptidos NFIF. Esta discusión va seguida por una descripción de las composiciones útiles en la práctica de la presente invención. Esto va seguido por una discusión que resume las diversas composiciones y compuestos terapéuticos, que incluyen los polipéptidos basados en NFIF, los ácidos nucleicos antisentido, la ribozimas y los anticuerpos. Finalmente, se describen los métodos de la presente invención que usan los compuestos y las composiciones descritas.

Definiciones

El término "NFIF" se usa para designar el "factor inductor de factor nuclear B".

Los términos "inducir" o "inducción", cuando se usan al describir la actividad de NFIF, incluyen dentro de su alcance la capacidad de provocar la expresión de las proteínas de las subunidades que constituyen NFB directamente o indirectamente, así como la capacidad de activar el NFB que ya está presente en una célula. Esta activación puede ser directa o indirecta, y da como resultado que NFB funcione como un factor de transcripción.

Para los fines de la presente descripción, la expresión "secuencia de nucleótidos" se puede usar para designar un polinucleótido o un ácido nucleico. La expresión "secuencia de nucleótidos" cubre el propio material genético, y por lo tanto no se limita a la información relacionada con su secuencia.

Las expresiones "ácido nucleico", "polinucleótido", "oligonucleótido" o "secuencia de nucleótidos" cubre las secuencias de ARN, ADN, gADN o cADN o alternativamente las secuencias híbridas ARN/ADN de más de un nucleótido, en la forma monocatenaria o en la forma bicatenaria, de molécula doble.

Un "ácido nucleico" es un compuesto polimérico que comprende subunidades unidas covalentemente denominadas nucleótidos. El ácido nucleico incluye ácido ribonucleico (ARN) y ácido desoxirribonucleico (ADN), pudiendo ser ambos monocatenarios o bicatenarios. El ADN incluye cADN, ADN genómico, ADN sintético, y ADN semi-sintético. La secuencia de nucleótidos que codifica una proteína se denomina secuencia directa o secuencia codificante.

El término "nucleótido" designa tanto los nucleótidos naturales (A, T, G, C) como los nucleótidos modificados que comprenden al menos una modificación tal como (1) un análogo de purina, (2) un análogo de pirimidina, o (3) un análogo de carbohidrato, y los ejemplos de tales nucleótidos modificados se describen, por ejemplo, en la solicitud PCT Nº WO 95/04064.

Para los fines de la presente invención, se considera que un primer nucleótido es "complementario" a un segundo polinucleótido cuando cada base del primer nucleótido se empareja con la base complementaria del segundo polinucleótido, cuya orientación está invertida. Las bases complementarias son A y T (o A y U), o C y G.

Un ADN "heterólogo" se refiere a ADN que no se encuentra de forma natural en la célula o en un sitio cromosómico de la célula. Preferentemente, el ADN heterólogo incluye un gen ajeno a la célula.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "homólogo", en todas sus formas gramaticales y variaciones ortográficas, se refiere a la relación entre las proteínas que poseen un "origen evolutivo común", lo que incluye las proteínas procedentes de superfamilias (p.ej., la superfamilia de las inmunoglobulinas) y proteínas homólogas procedentes de diferentes especies (p.ej., la cadena ligera de la miosina, etc.) (Reeck et al., Cell, 50:667 (1987)). Estas proteínas (y sus genes codificantes) tienen homología de secuencias, como se refleja por su alto grado de similitud de secuencias.

Por consiguiente, la expresión "similitud de secuencias", en todas sus formas gramaticales, se refiere al grado de identidad o correspondencia entre secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos de proteínas que pueden o no compartir un origen evolutivo común (véase Reeck et al., anteriormente mencionado). Sin embargo, en el uso común y en la presente solicitud, el término "homólogo", cuando se modifica con un adverbio tal como "muy", puede hacer referencia a la similitud de la secuencia y no a un origen evolutivo común.

En una realización específica, dos secuencias de ADN son "sustancialmente homólogas" o "sustancialmente similares" cuando al menos aproximadamente un 50% (preferiblemente al menos aproximadamente un 75%, y más preferiblemente al menos aproximadamente un 90 ó 95%) de los nucleótidos se corresponden entre sí a lo largo de la longitud definida de las secuencias de ADN. Las secuencias que son sustancialmente homólogas pueden identificarse comparando las secuencias usando programas informáticos convencionales disponibles en bancos de datos de secuencias, o en un experimento de hibridación de tipo Southern, por ejemplo, en condiciones rigurosas como las definidas para ese sistema particular. La definición de las condiciones de hibridación apropiadas está dentro del alcance de la técnica. Véase, p.ej., Maniatis et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring, NY (1982); Glover et al., DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II Oligonucleotide Synthesis, MRL Press, Ltd., Oxford, R.U. (1985); Hames y Higgins, Hames BD y Higgins SJ, 1985. Nucleic acid hybridization: a practical approach, Hames and Higgins Ed., IRL Press, Oxford (1985)).

De manera similar, en una realización particular, dos secuencias de ácido nucleico son "sustancialmente homólogas" o "sustancialmente similares" cuando más del 30% de los aminoácidos son idénticos o más de aproximadamente un 60% son similares (funcionalmente idénticos). Preferiblemente, las secuencias similares u homólogas se identifican por alineación usando, por ejemplo, el programa de apilamiento GCG (Genetics Computer Group, Manual del Programa para el Paquete GCG, Versión 7, Madison, Wisconsin).

El "porcentaje de identidad" entre los secuencias de nucleótidos o de aminoácidos, para los fines de la presente invención, se puede determinar comparando dos secuencias alineadas de manera óptima, por medio de una ventana de comparación.

La porción de la secuencia nucleotídica o polipeptídica en la ventana de comparación puede comprender, así, adiciones o deleciones (por ejemplo "huecos") respecto de la secuencia de referencia (que no comprende estas adiciones o estas deleciones) para obtener una alineación óptima de las dos secuencias.

El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que se observa una base de ácido nucleico idéntica o un residuo de aminoácido idéntico para las dos secuencias (de ácido nucleico o péptido) comparadas, y después dividiendo el número de posiciones en las que existe identidad entre las dos bases o residuos de aminoácidos dividido por el número total de posiciones en la ventana de comparación, y después multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencias.

La alineación de secuencias óptima para la comparación se puede conseguir mediante el uso de un ordenador con la ayuda de algoritmos conocidos incluidos en el paquete informático de la empresa WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER GROUP (GCG), 575 Science Doctor, Madison, WISCONSIN.

A modo de ilustración, será posible producir el porcentaje de identidad de secuencias con la ayuda del programa informático BLAST (versiones BLAST 1.4.9 de marzo de 1996, BLAST 2.0.4 de febrero de 1998 y BLAST 2.0.6 de septiembre de 1998), mediante el uso exclusivamente de los parámetros por defecto (Altschul et al, J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990); Altschul et al, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)). Blast busca secuencias similares/homólogas a una secuencia "de búsqueda" de referencia, con la ayuda del algoritmo de Altschul et al. La secuencia de búsqueda y las bases de datos usadas pueden ser de péptidos o de ácidos nucleicos, y es posible cualquier combinación.

La expresión "correspondiente a" se usa en esta memoria para hacer referencia a secuencias similares u homólogas, si la posición exacta de la molécula con la que se mide la homología o la similitud es tanto idéntica como diferente. Una alineación de las secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos puede incluir espacios. De esta manera, la expresión "correspondiente a" se refiere a la similitud de la secuencia y no a la numeración de los residuos de aminoácidos o de las bases nucleotídicas.

Se entenderá que una "variante" de un ácido nucleico según la invención significa un ácido nucleico que difiere en una o más bases respecto del polinucleótido de referencia. Un ácido nucleico variante puede ser de origen natural, tal como una variante alélica que existe de manera natural, o también puede ser una variante no natural obtenida, por ejemplo, mediante técnicas de mutagénesis.

En general, las diferencias entre el ácido nucleico de referencia (en general, de tipo natural) y el ácido nucleico variante son pequeñas, de forma que las secuencias de nucleótidos del ácido nucleico de referencia y del ácido nucleico variante son muy similares y, en muchas regiones, idénticas. Las modificaciones de nucleótidos presentes en un ácido nucleico variante pueden ser silenciosas, lo que significa que no alteran las secuencias de aminoácidos codificadas por dicho ácido nucleico variante.

Sin embargo, los cambios en los nucleótidos de un ácido nucleico variante también pueden dar como resultado sustituciones, adiciones o deleciones en el polipéptido codificado por el ácido nucleico variante con respecto a los polipéptidos codificados por el ácido nucleico de referencia. Además, las modificaciones de nucleótidos en las regiones codificantes pueden producir sustituciones conservativas o no conservativas en la secuencia de aminoácidos del polipéptido.

Preferiblemente, los ácidos nucleicos variantes según la invención codifican polipéptidos que conservan sustancialmente la misma función o actividad biológica del polipéptido del ácido nucleico de referencia, o alternativamente la capacidad de ser reconocido por anticuerpos dirigidos contra los polipéptidos codificados por el ácido nucleico de referencia inicial.

Ciertos ácidos nucleicos variantes codificarán así formas mutadas de los polipéptidos, cuyo estudio sistemático hará posible deducir las relaciones estructura-actividad de las proteínas en cuestión. El conocimiento de estas variantes con respecto a la enfermedad estudiada es esencial, ya que hace posible entender la causa molecular de la patología.

Se entenderá que "fragmento" significa una secuencia de nucleótidos de una longitud reducida respecto del ácido nucleico de referencia y que comprende, a lo largo de la porción común, una secuencia de nucleótidos idéntica al ácido nucleico de referencia. Tal "fragmento" de ácido nucleico según la invención puede estar incluido, cuando sea apropiado, en un polinucleótido mayor del cual es un constituyente. Tales fragmentos comprenden, o alternativamente consisten en, oligonucleótidos cuya longitud oscila de 8, 10, 12, 15, 18, 20 a 25, 30, 40, 50, 70, 80, 100, 200, 500, 1000 o 1500 nucleótidos consecutivos de un ácido nucleico según la invención.

Una "molécula de ácido nucleico" se refiere a la forma polimérica del éster fosfato de los ribonucleósidos (adenosina, guanosina, uridina o citidina; "moléculas de ARN") o de los desoxirribonucleósidos (desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxitimidina o desoxicitidina; "moléculas de ADN") o a cualquiera de sus análogos de fosfoéster, tales como los fosforotioatos y los tioésteres, ya sea en forma monocatenaria o de una hélice bicatenaria. Son posibles las hélices de ADN-ADN, ADNARN y ARN-ARN bicatenarias. La expresión molécula de ácido nucleico y, en particular, molécula de ADN o ARN, se refiere únicamente a la estructura primaria y secundaria de la molécula, y no se limita a ninguna forma terciaria concreta. Por lo tanto, esta expresión comprende el ADN bicatenario encontrado, entre otras, en moléculas de ADN lineales o circulares (por ejemplo, fragmentos de restricción), plásmidos y cromosomas. En la exposición de la estructura de determinadas moléculas de ADN bicatenarias, las secuencias pueden describirse en la presente memoria según el acuerdo normal de proporcionar únicamente la secuencia en la dirección 5' a 3' a lo largo de la cadena no transcrita de ADN (es decir, la cadena que presenta una secuencia homóloga a la del mARN). Una "molécula de ADN recombinante" es una molécula de ADN que se ha sometido a una manipulación mediante biología molecular.

Una molécula de ácido nucleico es "hibridable" con otra molécula de ácido nucleico, tal como cADN, ADN genómico o ARN, cuando una forma monocatenaria de la molécula de ácido nucleico puede hibridar con la otra molécula de ácido nucleico en las condiciones apropiadas de temperatura y de fuerza iónica de la disolución (véase Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2 ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York. (1989)). Las condiciones de temperatura e intensidad iónica determinan la "rigurosidad" de la hibridación. Para un cribado preliminar de ácidos nucleicos homólogos, pueden usarse condiciones de baja rigurosidad que corresponden a una Tm de 55º, p.ej., SSC 5x, SDS al 0,1%, leche al 0,25%, y sin formamida; o formamida al 30%, SSC 5x, SDS al 0,5%. Las condiciones de hibridación de rigurosidad moderada se corresponden con una Tm mayor, por ejemplo, formamida al 40%, con SCC 5x o 6x. Las condiciones de alta rigurosidad en la hibridación corresponden a la Tm más alta, por ejemplo, formamida al 50%, SCC 5x ó 6x. La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque dependiendo de la rigurosidad de la hibridación, son posibles uniones erróneas entre las bases. La rigurosidad apropiada para la hibridación de ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y del grado de complementación, variables muy conocidas en la técnica. Cuanto mayor sea el grado de similitud u homología entre dos secuencias de nucleótidos, mayor será el valor de Tm para los híbridos de los ácidos nucleicos que tienen esas secuencias. La estabilidad relativa (correspondiente a la mayor Tm) de las hibridaciones de ácidos nucleicos disminuye en el siguiente orden: ARN:ARN, ADN:ARN, ADN:ADN. En el caso de híbridos con una longitud superior a 100 nucleótidos, se han obtenido ecuaciones para calcular la Tm (véase Sambrook et al., mencionado anteriormente, 9.50-0.51). Para la hibridación con ácidos nucleicos más cortos, es decir, oligonucleótidos, es más importante la posición de los desacoplamientos, y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (véase Sambrook et al., anteriormente mencionado, 11.7-11.8). Preferiblemente, una longitud mínima para un ácido nucleico hibridable es al menos de aproximadamente 10 nucleótidos; preferiblemente al menos de aproximadamente 15 nucleótidos; y, más preferiblemente, la longitud es al menos de aproximadamente 20 nucleótidos;

En una realización específica, la expresión "condiciones de hibridación habituales" se refiere a una Tm de 55ºC, y utiliza las condiciones expuestas anteriormente. En una realización preferida, la Tm es 60ºC; en una realización más preferida, la Tm es 65ºC.

Se entenderá que las "condiciones de hibridación de rigurosidad elevada" para los fines de la presente invención significan las siguientes condiciones:

1-Competición en membranas y PREHIBRIDACIÓN:

-Mezcla: 40 µl de ADN de esperma de salmón (10 mg/ml)

+ 40 µl de ADN de placenta humana (10 mg/ml)

-Desnaturalizar durante 5 minutos a 96ºC, después sumergir la mezcla en hielo.

-Retirar el SSC 2X y verter 4 ml de mezcla de formamida en el tubo de hibridación que contiene las membranas.

-Añadir la mezcla de los dos ADNs desnaturalizados.

-Incubación a 42ºC durante 5 a 6 horas, con rotación. 2-Competición con la sonda marcada:

-Añadir a la sonda marcada y purificada de 10 a 50 µl de ADN Cot I, dependiendo de la cantidad de repeticiones.

-Desnaturalizar durante 7 a 10 minutos a 95ºC.

-Incubar a 65ºC durante 2 a 5 horas. 3-HIBRIDACIÓN:

-Retirar la mezcla de prehibridación.

-Mezclar 40 µl de ADN de esperma de salmón + 40 µl de ADN de placenta humana; desnaturalizar durante 5 min a 96ºC, después sumergir en hielo.

-Añadir al tubo de hibridación 4 ml de mezcla de formamida, la mezcla de los dos ADNs y la sonda marcada desnaturalizada/Cot I ADN.

-Incubar 15 a 20 horas a 42ºC, con rotación. 4-Lavados y Exposición:

-Un lavado a temperatura ambiente en SSC 2X, para aclarar.

-

Dos veces 5 minutos a temperatura ambiente SSC 2X y 0,1 % de SDS a 65ºC.

-

Dos veces 15 minutos a 65ºC SSC 1X y 0,1 % de SDS a 65ºC.

-Envolver las membranas en plástico de envolver claro y realizar la exposición.

Las condiciones de hibridación descritas anteriormente están adaptadas a la hibridación, en condiciones de rigurosidad elevada, de una molécula de ácido nucleico de longitud variable de 20 nucleótidos a varios cientos de nucleótidos. Por supuesto, las condiciones de hibridación descritas anteriormente se pueden ajustar en función de la longitud del ácido nucleico cuya hibridación se desea, o del tipo de marcaje elegido, según los métodos conocidos para un experto en la técnica. Las condiciones de hibridación adecuadas se pueden ajustar, por ejemplo, según las enseñanzas contenidas en el manual de Hames y Higgins (1985), anteriormente mencionado, o en el manual de F. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989).

Factor Nuclear B

El factor nuclear B (NFB) comprende una familia de factores de transcripción eucarióticos. Los factores de transcripción NFB se identificaron por primera vez como factores que se unían a elementos potenciadores en el gen de la cadena ligera  en linfocitos B murinos. Los estudios posteriores demostraron que NFB se halla en casi todas las células y regula genes implicados en la inflamación tisular, la proliferación celular y la diferenciación celular.

NFB comprende al menos cinco subunidades: p50, p52, p65 (RelA), c-Rel, y RelB que pueden formar homo- y heterodímeros en diversas combinaciones. Las formas activas de NFB son normalmente heterodímeros compuestos de p65 (RelA) y p50.

En la mayoría de las células, NFB existe en forma de un heterodímero inactivo que es secuestrado en el citosol debido a la asociación con una proteína inhibidora I-B. En respuesta a estímulos tales como los estímulos inflamatorios, la proteína I-B se fosforila y se degrada, lo que da como resultado la disociación del complejo I-B-NFB y la translocación de NFB al núcleo. Una vez en el núcleo, NFB reconoce sitios potenciadores específicos que contienen el motivo de unión al ADN de NFB e interacciona con factores de transcripción basales para iniciar la transcripción mediada por la ARN polimerasa II junto con la proteína de unión a la caja TATA. Tal como se mencionó anteriormente, esto da como resultado la transcripción de una amplia diversidad de genes, en particular los genes implicados en las respuestas inmunitarias e inflamatorias.

Tal como se mencionó anteriormente, la presente invención se basa en parte en el descubrimiento de las proteínas de factor inductor del factor nuclear B (NFIF). Estas proteínas están implicadas en la inducción de NFB. El descubrimiento de estas proteínas NFIF proporciona diferentes aproximaciones al tratamiento de afecciones que implican respuestas inflamatorias reguladas por NFB. Las respuestas inflamatorias reguladas por NFB están asociadas a una diversidad de enfermedades que incluyen, pero sin limitación, artritis reumatoide, aterosclerosis, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades virales, gastropatía inducida por NSAIDs, enfermedades neurodegenerativas, scrapie, septicemia, apoptosis, enfermedad de Crohn, enfermedad renal, reestenosis, lesión cerebral/inflamación, enfermedad de Alzheimer, asma, y expresión regulada incorrectamente de citocinas pleiotrópicas. En las situaciones en las que es deseable incrementar la inducción de NFB con el fin de dar como resultado una respuesta inmunitaria incrementada, las proteínas NFIF de la presente invención se pueden introducir o expresar en un paciente para inducir NFB. Si, por otra parte, es deseable inhibir la inducción de NFB para inhibir o prevenir una respuesta inmunitaria, se puede usar la provisión según la presente invención de las secuencias genéticas que codifican las proteínas NFIF y de cómo preparar estas proteínas para identificar compuestos y composiciones que inhiben o evitan la expresión de las proteínas NFIF o que interaccionan con las proteínas NFIF para inhibir o evitar su actividad.

Proteínas de Factor Inductor del Factor Nuclear B (NFIF)

Los polipéptidos y las proteínas descritas en la presente memoria incluyen polipéptidos recombinantes, polipéptidos naturales, o polipéptidos sintéticos, y pueden ser de origen humano, de conejo, o de otros animales.

Los polipéptidos se pueden aislar a partir de fuentes naturales, tales como extractos de placenta, plasma humano, o medios acondicionados de células cultivadas mediante el uso de los procedimientos de purificación conocidos para un experto en la técnica.

De manera alternativa, los polipéptidos de la presente invención se pueden preparar mediante la utilización de técnicas de ADN recombinante, que comprenden combinar un ácido nucleico que codifica el polipéptido del mismo en un vector adecuado, insertar el vector resultante en una célula hospedadora adecuada, recuperar el polipéptido producido por la célula hospedadora resultante, y purificar el polipéptido recuperado.

Los polipéptidos se caracterizan por un único peso molecular reproducible y/o un grupo múltiple de pesos moleculares, propiedades cromatográficas y perfiles de elución, composición y secuencia de aminoácidos, y actividad biológica.

Aislamiento de Secuencias Nucleotídicas que Codifican los Polipéptidos NFIF

Las realizaciones de NFIF-14b y NFIF-7a de la presente invención se pueden preparar mediante una diversidad de métodos adecuados conocidos para los expertos en la técnica. Las enseñanzas sobre biología molecular general, microbiología, y técnicas de ADN recombinante dentro del conocimiento de la técnica se explican completamente en la bibliografía. Véase, p.ej., Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (en la presente memoria "Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, volúmenes I y II (D.N. Glover ed. 1985); F.M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).

Las secuencias de cADN para NFIF-14b y NFIF-7a se presentan en la Figura 3. NFIF-7a es una variante de corte y empalme de NFIF-14b. La expresión "variante de corte y empalme" se refiere a un polipéptido codificado por un mARN producido mediante el procesamiento alternativo del mARN de tamaño completo codificado por un gen o genes que da como resultado un mARN que contiene una o más deleciones respecto del mARN de tamaño completo de los genes. Tal como se muestra en la Figura 4, respecto de NFIF-14b, NFIF-7a tiene una deleción interna de los pares de bases 473 a 739. Dada la información de la descripción en la presente memoria sobre la secuencia de ADN de NFIF-14b y NFIF-7a y los métodos conocidos en la técnica para obtener cADN, las secuencias de nucleótidos que codifican NFIF-14b y NFIF-7a se pueden clonar fácilmente e insertarlas en un vector adecuado para la expresión de estas proteínas in vitro o in vivo. Para una descripción de los métodos relacionados con la clonación de cADN y los vectores de expresión, véase Sambrook et al., 1989, anteriormente mencionado. Un "vector de clonación" es un replicón, por ejemplo un plásmido, un fago o un cósmido, al que se puede unir otro segmento de ADN para conseguir la replicación del segmento fijado. Un "replicón" es cualquier elemento genético (p.ej., plásmido, cromosoma, virus) que funciona como una unidad autónoma de replicación de ADN in vivo, es decir, capaz de replicarse bajo su propio control. Un vector de clonación puede ser capaz de replicarse en un tipo celular y de expresarse en otro ("vector lanzadera"). En las realizaciones preferidas de la presente invención, el vector de clonación es capaz de expresarse en una célula hospedadora y el "vector de expresión" es capaz de expresar NFIF a niveles suficientes para tener efecto sobre una ruta regulada por NFB en la célula.

Un gen que codifica NFIF-14b y NFIF-7a, ya sea ADN genómico o cADN, se puede aislar a partir de una biblioteca genómica humana o una biblioteca de cADN. Una "secuencia codificante" de ADN es una secuencia de ADN bicatenario que se transcribe y se traduce en un polipéptido en una célula in vitro

o in vivo cuando se pone bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Las secuencias codificantes de ADN y las secuencias reguladoras apropiadas se proporcionan preferiblemente en un vector de expresión. Los límites de la secuencia codificante se determinan por un codón de iniciación en el extremo 5' (amino) y un codón de parada de la traducción en el extremo 3' (carboxilo). Una secuencia codificante puede incluir, pero sin limitación, secuencias procarióticas, cADN procedente de mARN eucariótico, secuencias de ADN genómico procedentes de ADN eucariótico (por ejemplo, de mamífero) e incluso secuencias de ADN sintéticas. Si la secuencia codificante se va a usar para la expresión en una célula eucariótica, normalmente se localizará una señal de poliadenilación y una secuencia de terminación de la trascripción en la posición 3', con respecto a la secuencia codificante. Se conocen bien en la técnica los métodos para obtener un gen dada la información de la secuencia de ADN expuesta en la presente memoria. El ADN se puede obtener mediante procedimientos habituales conocidos en la técnica a partir del ADN clonado (p.ej., una "biblioteca" de ADN). Se obtiene preferiblemente a partir de una biblioteca de cADN preparada de tejidos con un nivel elevado de expresión de la proteína. El ADN se puede obtener también mediante la clonación del ADN genómico, o de los fragmentos del mismo, purificados a partir de la célula deseada (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, anteriormente mencionado; Glover, D.M. (ed.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford,

R.U. Vol. I, II) o mediante síntesis química. Los clones obtenidos a partir del ADN genómico pueden contener regiones de ADN reguladoras e intrones, además de las regiones codificantes.

Los métodos para obtener cADN se conocen bien en la técnica. Brevemente, estos métodos incluyen aislar una mezcla de ARN mensajero (mARNs) de células eucarióticas y emplear una serie de reacciones enzimáticas para sintetizar copias de ADN bicatenario (cADNs) complementario a los mARNs aislados. "Reacción en cadena de la polimerasa" (PCR) se refiere a métodos in vitro para amplificar secuencias de ADN específicas mediante el uso de métodos bien conocidos en la técnica.

Independientemente del método usado para obtener el cADN deseado, la mezcla de cADN bicatenario se inserta en los vehículos de clonación mediante cualquiera de muchas técnicas conocidas, dependiendo al menos en parte del vehículo particular utilizado. Se discuten diversos métodos de inserción en Sambrook et al., 1989, anteriormente mencionado, y se conocen bien en la técnica. Un "casete" se refiere a un segmento de ADN que se puede insertar en un vector en uno o más sitios de restricción específicos. El segmento de ADN codifica un polipéptido de interés y el casete y los sitios de restricción están diseñados para asegurar la inserción del casete en el marco de lectura apropiado para la trascripción y la traducción.

Una vez que los segmentos de ADN se insertan en un vehículo de clonación, se usa el vehículo de clonación para transformar un hospedador adecuado. Una célula se ha "transfectado" con ADN exógeno o heterólogo cuando dicho ADN se ha introducido dentro de la célula. Una célula se ha "transformado" con ADN exógeno o heterólogo cuando el ADN utilizado para transfectar la célula ocasiona un cambio fenotípico. El ADN transformante puede integrarse (unido covalentemente) en el ADN cromosómico, constituyendo el genoma de la célula. Estos vehículos de clonación confieren habitualmente un rasgo de resistencia a antibióticos en el hospedador. Tales hospedadores son en general células procarióticas, y solamente unas cuantas células hospedadoras contienen el cADN deseado. Las células hospedadoras transfectadas constituyen una "biblioteca" de genes, que proporciona una muestra representativa de los mARNs presentes en la célula a partir de la cual se aislaron los mARNs.

Dada la información sobre la secuencia de NFIF-14b y NFIF-7a proporcionada en la presente memoria, se puede preparar un oligonucleótido adecuado, sintetizado preferiblemente tal como se discutió anteriormente, y se puede usar para identificar los clones que contienen las secuencias de NFIF. El oligonucleótido incluye preferiblemente al menos alrededor de 18 nucleótidos, y es hibridable a una molécula de ADN genómico, una molécula de cADN, o una molécula de mARN que codifica NFIF. Los oligonucleótidos se pueden marcar, p. ej., con 32P-nucleótidos o con nucleótidos a los que se ha conjugado covalentemente un marcador, tal como biotina.

En una realización, se puede usar un oligonucleótido marcado como sonda para detectar la presencia de un ácido nucleico que codifica NFIF. En otra realización, se pueden usar oligonucleótidos (de los cuales uno o ambos pueden estar marcados) como cebadores de PCR, para la clonación de la longitud completa o de un fragmento de NFIF, o para detectar la presencia de ácidos nucleicos que codifican NFIF. En una realización adicional, un oligonucleótido puede formar una hélice triple con una molécula de ADN de NFIF.

Generalmente, los oligonucleótidos se preparan de manera sintética, preferiblemente en un sintetizador de ácidos nucleicos. Por lo tanto, los oligonucleótidos se pueden preparar con enlaces análogos al fosfoéster que no se dan de forma natural, tales como enlaces tioéster, etc. Para identificar los clones que contienen las secuencias de NFIF, se cultivan células transformadas o transfectadas individuales en forma de colonias en un papel de filtro de nitrocelulosa. Las colonias se lisan y el ADN se une firmemente al papel de filtro mediante calentamiento. El papel de filtro se incuba después con una sonda oligonucleotídica marcada que es complementaria a NFIF. Los fragmentos de ADN que tienen una homología sustancial con NFIF hibridarán con la sonda.

Tal como se discutió anteriormente, las condiciones de temperatura y de fuerza iónica determinan la "rigurosidad" de la hibridación. La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque dependiendo de la rigurosidad de la hibridación, son posibles uniones erróneas entre las bases. La rigurosidad apropiada para la hibridación de ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y del grado de complementación, variables muy conocidas en la técnica.

La sonda hibrida con el cADN para el cual es complementaria. Se puede identificar mediante autorradiografía o mediante reacciones químicas que identifican la presencia de la sonda. Se caracterizan los clones correspondientes para identificar uno o una combinación de clones que contienen toda la información estructural para la proteína deseada. La secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de interés se aísla y se reinserta en un vector de expresión. El vector de expresión pone el gen clonado bajo el control regulador de elementos de control procarióticos o eucarióticos específicos que permiten la expresión eficaz (transcripción y traducción) del ds-cADN. Las secuencias de control de la trascripción y de la traducción son secuencias reguladoras de ADN, tales como, por ejemplo, promotores, potenciadores, y terminadores, que posibilitan la expresión de una secuencia codificante en una célula hospedadora. En las células eucarióticas, las señales de poliadenilación son secuencias de control. Una secuencia codificante está "bajo el control" de secuencias de control de la trascripción y la traducción en una célula, cuando la ARN polimerasa transcribe la secuencia codificante a mARN, que después se corta y empalma (si la secuencia codificante contiene intrones) y se traduce a la proteína codificada por la secuencia codificante.

Se puede llevar a cabo una selección adicional basándose en las propiedades del gen. Por ejemplo, la presencia del gen deseado en un clon se puede detectar mediante ensayos basados en las propiedades físicas, químicas o inmunológicas de su producto proteico expresado. Por ejemplo, se pueden seleccionar clones de cADN o clones de ADN que producen una proteína que tiene propiedades similares o idénticas a las de NFIF con respecto a la migración electroforética, isoelectroenfoque, electroforesis en gel con gradiente de pH, digestión proteolítica, o antigenicidad.

Preparación de Variantes de los Polipéptidos NFIF

La presente invención describe variantes alélicas, variantes mutantes por sustitución, adición y deleción, análogos, y derivados de NFIF y homólogos de otras especies que tienen la misma actividad funcional o una actividad funcional homóloga a NFIF. En las realizaciones preferidas, se utilizan genes que tienen deleciones o sustituciones que incrementan la capacidad de inducir NFB. Se describe la preparación o el aislamiento de variantes de NFIF. Por lo tanto, la presente invención describe variantes de NFIF que son activas funcionalmente, es decir, capaces de exhibir una o más actividades funcionales asociadas a NFIF.

Las variantes de NFIF se pueden producir alterando las secuencias de ácidos nucleicos codificantes mediante sustituciones, adiciones o deleciones que proporcionan moléculas funcionalmente equivalentes. Preferiblemente, se hacen realizaciones de NFIF que tienen una actividad funcional potenciada o incrementada respecto de NFIF-14b o NFIF-7a.

Debido a la degeneración de las secuencias nucleotídicas codificantes, en la práctica de la presente invención se pueden usar otras secuencias de ADN que codifican sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que NFIF, que incluyen una secuencia de aminoácidos que contiene una variante de un solo aminoácido. Éstas incluyen, pero sin limitación, genes alélicos, genes homólogos de otras especies y secuencias de nucleótidos que comprenden todo o partes de NFIF que se han alterado por la sustitución de diferentes codones que codifican el mismo residuo de aminoácido dentro de la secuencia, produciendo de esta manera un cambio silencioso. De manera similar, las variantes de NFIF de la invención incluyen, pero sin limitación, los que contienen, como secuencia de aminoácidos primaria, toda o parte de la secuencia de aminoácidos de una proteína NFIF incluyendo secuencias alteradas en las que residuos dentro de la secuencia se sustituyen por residuos de aminoácidos funcionalmente equivalentes, dando como resultado una sustitución de aminoácidos conservativa. Por ejemplo, uno o más residuos de aminoácidos dentro de la secuencia pueden sustituirse por otro aminoácido de polaridad similar, que actúa como equivalente funcional, dando como resultado una alteración silenciosa. Los sustituyentes para un aminoácido dentro de la secuencia pueden seleccionarse entre otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos que contienen estructuras de anillo aromático son fenilalanina, triptófano y tirosina. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. No es de esperar que estas alteraciones afecten al peso molecular aparente determinado por electroforesis en gel de poliacrilamida o al punto isoeléctrico.

Son sustituciones particularmente preferidas:

-

Arg por Lys y viceversa de tal manera que pueda mantenerse la carga positiva;

-

Asp por Glu y viceversa de tal manera que pueda mantenerse la carga negativa;

-

Thr por Ser de tal manera que pueda mantenerse un -OH libre; y

-

Asn por Gln de tal manera que pueda mantenerse un CONH2 libre.

También pueden introducirse sustituciones de aminoácidos para sustituir un aminoácido por otro con una característica particularmente preferida. Por ejemplo, puede introducirse una Cys como un sitio potencial para puentes disulfuro con otra Cys. Una His puede introducirse como un sitio particularmente "catalítico" (es decir, His puede actuar como un ácido o base y es el aminoácido más común en la catálisis bioquímica). Pro puede introducirse debido a su estructura particularmente plana, que induce giros β en la estructura de la proteína.

Los genes que codifican las variantes de NFIF se pueden producir mediante diversos métodos conocidos en la técnica. Las manipulaciones que tienen como resultado su producción pueden realizarse a nivel génico o a nivel proteico. Por ejemplo, la secuencia del gen de NFIF clonado puede modificarse mediante cualquiera de numerosas estrategias conocidas en la técnica (Sambrook et al., 1989, anteriormente mencionado). La secuencia puede escindirse en sitios apropiados con una o más endonucleasas de restricción, seguido de una modificación enzimática adicional, y si se desea aislarse y unirse in vitro. En la producción del gen que codifica una realización de NFIF, debe tenerse cuidado de asegurarse que el gen modificado permanece dentro del mismo marco de lectura de traducción que el gen de NFIF, sin interrumpirse por señales de parada de la traducción, en la región del gen en la que se codifica la actividad deseada.

Además, la secuencia de ácido nucleico que codifica NFIF se puede mutar in vitro o in vivo, para crear y/o destruir secuencias de la traducción, iniciación y/o terminación, o para crear variaciones en las regiones codificantes y/o formar nuevos sitios para las endonucleasas de restricción o destruir los ya existentes, para facilitar una modificación adicional in vitro. Preferentemente, tales mutaciones potencian la actividad funcional del producto génico mutado de NFIF. Puede usarse cualquier técnica de mutagénesis conocida en la técnica, incluyendo, por ejemplo, la mutagénesis dirigida in vitro (Hutchinson, C., et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551; Zoller y Smith, 1984, DNA 3:479-488; Oliphant et al., 1986, Gene 44:177; Hutchinson et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:710), y el uso de enlazadores "TAB" (Pharmacia), etc. Para la mutagénesis dirigida, se prefieren técnicas de PCR (véase Higuchi, 1989, "Using PCR to Engineer DNA", en PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification. H. Erlich, ed., Stockton Press, Capítulo 6, págs. 61-70).

Polipéptidos Basados en NFIF

Se puede identificar una variante terapéuticamente útil de NFIF mediante una diversidad de métodos, que incluyen los ensayos in vitro que se pueden usar para identificar el nivel de expresión de un gen regulado por NFB o de un gen cuya expresión está regulada por elementos reguladores de NFB en presencia de la variante de NFIF. Un método para identificar los polipéptidos que son capaces de estimular (o inhibir) la inducción de NFB es usar un sistema con un gen indicador. Estos sistemas utilizan vectores de expresión con genes indicadores que incluyen un sitio de clonación en el cual se puede clonar un promotor dado en posición 5' respecto de un "gen indicador" que se puede detectar y cuantificar fácilmente. Un experto en la técnica podría identificar fácilmente y subclonar el promotor para NFB, así como otras secuencias de control en un vector de expresión de genes indicadores disponible comercialmente. El vector de expresión se transfiere a células hospedadoras y las células se exponen a una variante de NFIF (o una molécula supuestamente inhibidora o estimuladora) para determinar el efecto sobre la expresión del producto del gen indicador. En particular, se ensaya la presencia en las células del producto del gen indicador directamente midiendo la cantidad de mARN indicador, la proteína indicadora propiamente dicha o la actividad enzimática de la proteína indicadora. De forma ideal, el gen indicador no se expresa de manera endógena en el tipo celular de interés, y se presta a ensayos selectivos, cuantitativos y rápidos. Hay disponible comercialmente una diversidad de construcciones para ensayos con moléculas indicadoras, y se han desarrollado varios genes indicadores y ensayos, y los expertos en la técnica los pueden preparar fácilmente. Los sistemas más populares para monitorizar la actividad genética en células eucarióticas incluyen la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), βgalactosidasa, luciferasa de luciérnaga, hormona del crecimiento (GH), β-glucuronidasa (GUS), fosfatasa alcalina (AP), proteína fluorescente verde (GFP) y luciferasa de Renilla. Las construcciones para los ensayos con moléculas indicadoras se pueden adquirir de una diversidad de fuentes, que incluyen Promega e Invitrogen.

Tal como se mencionó anteriormente, la actividad del gen indicador se puede detectar analizando el mARN indicador o la proteína indicadora. El mARN indicador se puede detectar mediante análisis de transferencia de northern, ensayos de protección con ribonucleasas o RT-PCR. Aunque estos ensayos son más directos que medir la expresión de la proteína, se han desarrollado muchos ensayos para medir la presencia de la proteína indicadora en vez del mARN presente en una célula. Las proteínas indicadoras se pueden ensayar mediante espectrofotometría o detectando la actividad enzimática. Los niveles de proteína indicadora se pueden medir también con ensayos basados en anticuerpos. En general, los ensayos enzimáticos son muy sensibles y son un método preferido para monitorizar la expresión del gen indicador. Una construcción NFB-gen indicador disponible comercialmente es el vector con gen indicador pNFB-Luc (luciferasa) disponible de Stratagene. Se proporciona un ejemplo de cómo utilizar este sistema indicador para cuantificar la actividad de la proteína NFIF en el Ejemplo 4.

Los experimentos del tipo indicado anteriormente en la presente memoria se pueden utilizar para determinar hasta qué punto se puede tratar una enfermedad dada mediante el uso de las composiciones de la presente invención.

La discusión siguiente se refiere a la manipulación y la expresión del ADN que codifica los polipéptidos de la presente invención.

Vectores de Expresión que Codifican los Polipéptidos NFIF

La secuencia de ADN identificada y aislada se puede insertar en un vector de clonación/expresión (en adelante "vector") para facilitar las modificaciones de la secuencia o la expresión de la proteína. Estos vectores incluyen en general sitios de clonación múltiple, promotores, secuencias que facilitan la replicación en una célula hospedadora y marcadores seleccionables.

Se puede usar cualquier vector adecuado. Se conocen muchos en la técnica. Los ejemplos de los vectores que se pueden usar incluyen, por ejemplo, plásmidos o virus modificados. El vector es compatible en general con una célula hospedadora dada en la que se introduce el vector para facilitar la replicación del vector y la expresión de las proteínas codificadas. La inserción de una secuencia de ADN en un vector dado se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante la ligadura del fragmento de ADN en un vector de clonación que tiene extremos cohesivos complementarios. Sin embargo, si los sitios de restricción complementarios usados para cortar el ADN no están presentes en el vector de clonación, los extremos de las moléculas de ADN pueden modificarse enzimáticamente. Como alternativa, puede producirse cualquier sitio deseado uniendo secuencias de nucleótidos (enlazadores) a los extremos del ADN; los enlazadores ligados pueden comprender oligonucleótidos específicos sintetizados químicamente que codifican secuencias de reconocimiento de las endonucleasas de restricción. Los vectores útiles pueden consistir en segmentos de secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas. Los ejemplos de vectores específicos útiles en la práctica de la presente invención son los bacteriófagos de E. coli, por ejemplo, derivados lambda, o plásmidos, por ejemplo, derivados de pBR322

o derivados del plásmido pUC, p.ej., pmal-c, pFLAG, derivados de SV40 y plásmidos bacterianos conocidos, p.ej., los plásmidos de E. coli col El, pCR1, pMal-C2, pET, pGEX (Smith et al., 1988, Gene 67:31-40), pMB9 y sus derivados, los plásmidos tales como RP4; ADNs de fago, p.ej., los numerosos derivados del fago 1, p.ej., NM989, y otros ADNs de fago, p.ej., ADN monocatenario de fago M13 y filamentoso; vectores de levadura tales como el plásmido 2 µm o los derivados del mismo; vectores útiles en las células eucarióticas, por ejemplo, vectores útiles en las células de insecto, tales como los vectores de baculovirus, vectores útiles en las células de mamífero; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADNs de fago, plásmidos que se han modificado para emplear ADN de fago u otras secuencias de control de la expresión; y similares.

Los ejemplos de vectores de levaduras que se pueden usar según la invención son el vector sin fusión pYES2 (Invitrogen) o el de fusión pYESHisA, B, C (Invitrogen).

Los vectores de baculovirus que se pueden usar en la práctica de la invención incluyen una diversidad de vectores, que incluyen tanto vectores de transferencia sin fusión, por ejemplo, pVL941 (Summers), pVL1393 (Invitrogen), pVL1392 (Summers e Invitrogen), y pBlueBacIII (Invitrogen), como vectores de transferencia de fusión, por ejemplo, pAc700 (Summers), pAc701 y pAc702, pAc360 (Invitrogen), y pBlueBacHisA, B, C (Invitrogen).

Los vectores mamíferos contemplados para el uso en la invención incluyen, por ejemplo, vectores con promotores inducibles, por ejemplo, el promotor de dihidrofolato reductasa (DHFR), p.ej., cualquier vector de expresión con un vector de expresión de DHFR, o un vector de co-amplificación de DHFR/metotrexato, por ejemplo, pED (véase Kaufman, Current Protocols in Molecular Biology, 16.12 (1991)). De manera alternativa, se puede usar un vector de co-amplificación de glutamina sintetasa/metionina sulfoximina, por ejemplo, pEE14 (Celltech). En otra realización, se puede usar un vector que dirige la expresión episómica bajo el control del virus de Epstein Barr (EBV), por ejemplo, pREP4 (Invitrogen), pCEP4 (Invitrogen), pMEP4 (Invitrogen), pREP8 (Invitrogen), pREP9 (Invitrogen), y pEBVHis (Invitrogen). Los vectores de expresión de mamíferos seleccionables para el uso en la invención incluyen pRc/CMV (Invitrogen), pRc/RSV (Invitrogen), pcDNA3 (Invitrogen) y otros. Los vectores de expresión de mamíferos de virus Vaccinia (véase, Kaufman, 1991, anteriormente mencionado) para el uso según la invención incluyen, pero sin limitación, pSC11, pMJ601, y pTKgptF1S.

Se puede usar una diversidad de métodos para confirmar que la secuencia de ADN deseada que codifica NFIF-14b, NFIF-7a, u otra variante de NFIF, se ha clonado en un vector. En general, se usa una

o más de las siguientes aproximaciones: (a) amplificación con PCR del ADN plasmídico deseado o del mARN específico, (b) hibridación del ácido nucleico, (c) presencia o ausencia de funciones de selección del gen marcador, (d) análisis con endonucleasas de restricción adecuadas, y (e) expresión de secuencias insertadas. En la primera estrategia, los ácidos nucleicos se pueden amplificar con PCR para proporcionar la detección del producto amplificado. En la segunda estrategia, la presencia de un gen ajeno insertado en un vector de expresión se puede detectar con la hibridación del ácido nucleico, empleando sondas que comprenden secuencias que son homólogas a un gen marcador insertado. En la tercera estrategia, el sistema recombinante vector/hospedador se puede identificar y seleccionar basándose en la presencia o la ausencia de ciertas funciones "marcadoras para la selección" del gen (p. ej., actividad β-galactosidasa, actividad timidina-quinasa, resistencia a antibióticos, fenotipo de transformación, formación de cuerpos de oclusión en baculovirus, etc.) debidas a la inserción de genes exógenos en el vector. En otro ejemplo, si el ácido nucleico que codifica NFIF se inserta dentro de la secuencia génica del "marcador de selección" del vector, los recombinantes que contengan el inserto de NFIF se pueden identificar por la ausencia de la función génica del marcador de selección. En la cuarta estrategia, los vectores de expresión recombinantes se identifican por la digestión con enzimas de restricción adecuadas. En la quinta estrategia, los vectores de expresión recombinantes se pueden identificar sometiendo a ensayo la actividad, las características bioquímicas o inmunológicas del producto génico expresado por el recombinante, con la condición de que la proteína expresada asuma una conformación funcionalmente activa.

Promotores

La secuencia de nucleótidos que codifica NFIF-14b o NFIF-7a o una variante de NFIF de los mismos se puede insertar en un vector de expresión que contiene los elementos necesarios para la transcripción y la traducción de la secuencia codificante de la proteína insertada. Estos elementos se denominan en este documento "promotor".

Un promotor es una región reguladora del ADN, capaz de unirse a la ARN polimerasa en una célula e iniciar la trascripción de una secuencia codificante posterior (en dirección 3'). Para definir la presente invención, la secuencia promotora se une a su extremo 3' por el sitio de inicio de la trascripción y se extiende aguas arriba (en dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la trascripción con niveles detectables por encima de los niveles basales. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de inicio de la trascripción (definido convenientemente, por ejemplo, por cartografiado con la nucleasa S1), así como dominios de unión de proteínas (secuencias consenso) responsables de la unión de la ARN polimerasa.

Así, el ácido nucleico que codifica los polipéptidos de la invención está asociado de forma operable a un promotor en un vector de expresión de la invención. Tanto las secuencias de cADN como las secuencias genómicas pueden clonarse y expresarse bajo el control de estas secuencias reguladoras. Un vector de expresión preferiblemente también incluye un origen de replicación. Las señales de trascripción y traducción necesarias pueden proporcionarse en un vector de expresión recombinante, o pueden suministrarse por el gen nativo que codifica NFIF y/o sus regiones flanqueantes. Para construir vectores de expresión que contienen un gen que consta de las señales de control de la transcripción/traducción apropiadas y las secuencias codificantes de la proteína, puede usarse cualquiera de los métodos descritos previamente para la inserción de fragmentos de ADN en un vector de clonación. Estos métodos pueden incluir técnicas sintéticas y técnicas de ADN recombinante in vitro y recombinación in vivo (recombinación genética).

La expresión puede controlarse por cualquier elemento promotor/potenciador conocido en la técnica, pero estos elementos reguladores deben ser funcionales en el hospedador seleccionado para la expresión. Los ejemplos de promotores que pueden usarse para controlar la expresión del gen de NFIF incluyen la región promotora temprana de SV40 (Benoist y Chambon, 1981, Nature 290:304-310), el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus del Sarcoma de Rous (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-797), el promotor de timidina quinasa de herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445), las secuencias reguladoras del gen de metalotioneína (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42); vectores de expresión procarióticos, por ejemplo, el promotor de la β-lactamasa (Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731), o el promotor tac (DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25); elementos promotores de la levadura u otros hongos, por ejemplo, el promotor de Gal 4, el promotor de ADC (alcohol deshidrogenasa), el promotor de PGK (fosfoglicerol quinasa), el promotor de la fosfatasa alcalina; y regiones de control de la trascripción de animales, que presentan especificidad de tejidos y se han utilizado en animales transgénicos: la región de control del gen I de la elastasa que es activo en las células acinares pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell, 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); la región de control del gen de la insulina que está activo en las células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature, 315:115-122), la región de control del gen de inmunoglobulina que está activo en las células linfoides (Grosschedl et al., 1984, Cell, 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444), región de control del virus de tumor mamario de ratón que es activo en testículo, mama, células linfoides y mastocitos (Leder et al., 1986, Cell, 45:485-495), región de control del gen de albúmina que es activo en hígado (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel., 1:268-276), la región de control del gen de la alfafetoproteína que está activo en el hígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol., 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science, 235:53-58), región de control del gen de alfa-1-antitripsina que es activo en el hígado (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel., 1:161-171), región de control del gen de beta-globina que es activo en células mieloides (Mogram et al., 1985, Nature, 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell, 46:8994), la región de control del gen de la proteína básica de mielina que está activo en las células oligodendrocíticas del cerebro (Readhead et al., 1987, Cell, 48:703-712), la región de control del gen de la cadena ligera-2 de miosina que está activo en el músculo esquelético (Sani, 1985, Nature, 314:283286) y la región de control del gen de la hormona de liberación gonadotrópica que está activo en el hipotálamo (Mason et al., 1986, Science, 234:1372-1378).

Un promotor preferido usado en las construcciones de los vectores de expresión discutidos más adelante en la presente memoria es el promotor de citomegalovirus (CMV), que es capaz de proporcionar un nivel elevado de expresión en una diversidad de líneas celulares mamíferas.

Introducción de Vectores en Células Hospedadoras

Se pueden introducir vectores en las células hospedadoras mediante cualquier método adecuado, lo que incluye, p.ej., la transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión celular, DEAE dextrano, precipitación con fosfato cálcico, lipofección (fusión de lisosomas), uso de una pistola génica o un transportador de vector de ADN (véase, p.ej., Wu et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:963967; Wu y Wu, 1988, J. Biol. Chem. 263:14621-14624; Hartmut et al., solicitud de patente canadiense nº 2.012.311, presentada el 15 de marzo de 1990), de forma que se generan muchas copias de la secuencia del gen. En un método preferido, las células se transfectan in vitro mediante la utilización de Lipfectamine® disponible de Gibco-BRL. Preferiblemente, el gen clonado está contenido en un plásmido de vector lanzadera que posibilita la expansión en una célula de clonación, p.ej., E. coli, y facilita la purificación para la inserción posterior en una línea celular de expresión apropiada. Por ejemplo, un vector lanzadera, que es un vector que puede replicarse en más de un tipo de organismo, puede prepararse para la replicación tanto en E. coli como en Saccharomyces cerevisiae por medio de la unión de secuencias de un plásmido de E. coli a secuencias del plásmido 2 µm de la levadura.

Sistemas de Células Hospedadoras

Los sistemas de células hospedadoras incluyen sistemas de células hospedadoras de mamífero, sistemas de células hospedadoras de insecto y microorganismos tales como levaduras o bacterias. Dependiendo del sistema de célula hospedadora utilizado, puede usarse cualquiera de varios elementos de la trascripción y la traducción adecuados.

Además, puede elegirse una cepa de células hospedadoras que module la expresión de las secuencias insertadas o que modifique y procese el producto génico en la forma específica deseada. Las diferentes células hospedadoras tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento traduccional y post-traduccional y la modificación de proteínas. Pueden elegirse líneas celulares o sistemas hospedadores apropiados para asegurar la modificación y el procesamiento deseado de la proteína ajena expresada. La expresión en levaduras puede producir un producto biológicamente activo. La expresión en células eucarióticas puede aumentar la probabilidad de plegamiento "natural". Además, la expresión en células de mamífero puede proporcionar una herramienta para reconstituir o constituir la actividad inhibidora de NFIF. Además, diferentes sistemas de expresión de vector/hospedador pueden afectar a las reacciones de procesamiento, tales como escisiones proteolíticas, en una medida diferente. Los vectores de expresión de la invención se pueden usar, como se indicó anteriormente, para transfectar células para el cribado o para realizar ensayos biológicos de moduladores de la actividad de NFIF.

Los ejemplos de células hospedadoras mamíferas aceptables son las células HEK 293 y las células COS-7.

Se puede expresar un NFIF-14b, o NFIF-7a recombinante de la invención o variante de NFIF de manera cromosómica, tras la integración de la secuencia codificante mediante recombinación. A este respecto, puede usarse cualquiera de los diversos sistemas de amplificación para conseguir altos niveles de expresión génica estable (véase Sambrook et al., 1989, anteriormente mencionado).

La célula en la cual se introduce el vector recombinante que comprende el ácido nucleico que codifica NFIF se cultiva en un medio de cultivo celular adecuado en condiciones que posibilitan la expresión de un polipéptido NFIF en la célula.

Una vez establecido un sistema hospedador y las condiciones de crecimiento adecuadas, pueden propagarse y prepararse grandes cantidades de vectores de expresión recombinante. Pueden obtenerse formas solubles de la proteína recogiendo el fluido del cultivo o solubilizando cuerpos de inclusión, por ejemplo, por tratamiento con detergente, y si se desea someter a ultrasonidos o a otros procesos mecánicos, tales como los que se han descrito anteriormente. La proteína solubilizada o soluble se puede aislar empleando diversas técnicas, que incluyen la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), isoelectroenfoque, electroforesis en gel bidimensional, cromatografía (p. ej., de intercambio iónico, de afinidad, de inmunoafinidad, y cromatografía en columna por tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial, inmunoprecipitación o por cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas.

Como se ha descrito anteriormente, un "vector" es cualquier medio para la transferencia de un ácido nucleico de acuerdo con la invención, en una célula hospedadora. Los vectores preferidos son los vectores virales, por ejemplo, retrovirus, virus herpes, adenovirus, y virus adeno-asociados. Así, un gen que codifica una proteína o un fragmento de un dominio del polipéptido se introduce in vivo, ex vivo, o in vitro empleando un vector viral o mediante la introducción directa del ADN. La expresión en tejidos seleccionados como objetivo puede realizarse dirigiendo el vector transgénico a células específicas, tal como con un vector viral o un ligando de receptor, o usando un promotor con especificidad de tejido, o ambas cosas.

La discusión siguiente resume diversos sistemas virales y no virales que se pueden usar para introducir ADN en una célula hospedadora in vivo o in vitro.

Sistemas de Vectores Virales

Los polipéptidos NFIF, así como los ácidos nucleicos antisentido, las ribozimas y los anticuerpos discutidos más adelante en la presente memoria se pueden preparar in vitro o ex vivo, o se pueden diseñar para que se expresen in vivo en un paciente mediante el uso de un sistema de expresión apropiado introducido por medio de un sistema de vector viral.

Los vectores virales habitualmente usados para la selección como objetivo in vivo o ex vivo y los procedimientos de terapia son vectores a base de ADN y vectores retrovirales. Los métodos para la construcción y el uso de vectores virales se conocen en la técnica [véase, p.ej., Miller y Rosman; BioTechniques 7:980-990 (1992)]. Preferiblemente, los vectores virales son deficientes de replicación, es decir, no son capaces de replicarse autónomamente en la célula seleccionada como objetivo. En general, el genoma de los vectores virales deficientes de replicación que se usan en el alcance de la presente invención carece al menos de una región que es necesaria para la replicación del virus en la célula infectada. Estas regiones pueden eliminarse (por completo o en parte), o volverse no funcionales mediante cualquier técnica conocida por los expertos en la técnica. Estas técnicas incluyen la retirada total, la sustitución (por otras secuencias, en particular por el ácido nucleico insertado), la deleción o la adición parcial de una o más bases en una región esencial (para la replicación). Dichas técnicas pueden realizarse in vitro (sobre el ADN aislado) o in situ, usando las técnicas de manipulación genética o por tratamiento con agentes mutagénicos. Preferiblemente, el virus deficiente de replicación conserva las secuencias de su genoma que son necesarias para encapsular las partículas virales.

Los vectores virales de ADN incluyen un virus de ADN atenuado o deficiente, tal como, pero sin limitación, el virus del herpes simple (VHS), el papilomavirus, el virus de Epstein Barr (EBV), el adenovirus, el virus adeno-asociado (AAV), el virus vaccinia y similares. Los virus deficientes, que carecen completamente o casi completamente de los genes virales, son preferidos. Un virus deficiente no es competente para la replicación después de la introducción en una célula, y por lo tanto no conduce a una infección viral productiva. El uso de vectores virales deficientes permite la administración a células en un área específica y localizada, sin problemas de que el vector pueda infectar a otras células. Por lo tanto, puede fijarse como objetivo específicamente un tejido específico. Los ejemplos de vectores particulares incluyen, pero sin limitación, un vector del virus herpes 1 (HSV1) deficiente (Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci. 2:320-330 (1991)), un vector del virus herpes deficiente que carece de un gen de la glicoproteína L (Publicación de Patente RD 371005 A), u otros vectores del virus herpes deficientes (Publicación de Patente Internacional Nº WO 94/21807, publicada el 29 de septiembre de 1994; Publicación de Patente Internacional Nº WO 92/05263, publicada el 2 de abril de 1994); un vector de adenovirus atenuado tal como el vector descrito por Stratford-Perricaudet et al. (J. Clin. Invest. 90:626630 (1992); véase también La Salle et al., Science 259:988-990 (1993)); y un vector del virus adenoasociado deficiente (Samulski et al., J. Virol. 61:3096-3101 (1987); Samulski et al., J. Virol. 63:3822-3828 (1989); Lebkowski et al., Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996 (1988)])

Preferiblemente, para la administración in vivo, se emplea un tratamiento inmunosupresor apropiado junto con el vector viral, p.ej., un vector de adenovirus, para evitar la inmunodesactivación del vector viral y las células transfectadas. Por ejemplo, se pueden administrar citocinas inmunosupresoras, tales como interleucina-12 (IL-12), interferón- (IFN-), o anticuerpo anti-CD4, para bloquear respuestas inmunitarias humorales o celulares hacia los vectores virales. Además, es ventajoso emplear un vector viral que esté modificado genéticamente para expresar una cantidad mínima de antígenos.

Naturalmente, se contempla la administración de un vector que expresará una cantidad terapéuticamente eficaz de NFIF para las aplicaciones de terapia génica. La frase "cantidad terapéuticamente eficaz" se usa en la presente memoria para hacer referencia a una cantidad suficiente para provocar una mejora en una afección clínicamente significativa en el hospedador.

Sistemas de Vectores Adenovirales

En una realización preferida, el vector es un vector adenoviral. Los adenovirus son virus de ADN eucarióticos que pueden modificarse para suministrar de forma eficaz un ácido nucleico de la invención a una diversidad de tipos celulares. Existen diversos serotipos de adenovirus. De estos serotipos, se da preferencia, dentro del alcance de la presente invención, al uso de adenovirus humanos de tipo 2 o de tipo 5 (Ad 2 o Ad 5) o adenovirus de origen animal (véase el documento WO94/26914). Los adenovirus de origen animal que pueden usarse dentro del alcance de la presente invención incluyen adenovirus de origen canino, bovino, murino (ejemplo: Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), bovino, porcino, aviar, y simio (ejemplo: SAV).

Preferiblemente, los vectores adenovirales deficientes de replicación de la invención comprenden las ITRs, una secuencia de encapsulación y el ácido nucleico de interés. Aún más preferiblemente, al menos la región E1 del vector adenoviral no es funcional. La deleción en la región E1 se extiende preferiblemente desde los nucleótidos 455 a 3329 en la secuencia del adenovirus Ad5 (fragmento PvuII-BglII) o 382 a 3446 (fragmento HinfII-Sau3A). También pueden modificarse otras regiones, en particular la región E3 (documento WO95/02697), la región E2 (documento WO94/28938), la región E4 (documentos WO94/28152, WO94/12649 y WO95/02697), o en cualquiera de los genes tardíos L1-L5.

En una realización preferida, el vector adenoviral tiene una deleción en la región E1 (Ad 1.0). Ejemplos de adenovirus con deleción de E1, se describen en el documento de patente EP 185.573. En otra realización preferida, el vector adenoviral tiene una deleción en las regiones E1 y E4 (Ad 3.0). Ejemplos de adenovirus con deleción de E1/E4, se describen en los documentos de patente WO95/02697 y WO96/22378. En aún otra realización preferida, el vector adenoviral tiene una deleción en la región E1 dentro de la cual se inserta la región E4 y la secuencia de ácido nucleico (véase el documento FR94 13355).

Los adenovirus recombinantes deficientes de replicación de acuerdo con la invención pueden prepararse por cualquier método conocido por los especialistas en la técnica (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, documento EP 185.573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particular, pueden prepararse por recombinación homóloga entre un adenovirus y un plásmido que es portador, entre otros, de la secuencia de ADN de interés. La recombinación homóloga se efectúa después de la cotransfección del adenovirus y el plásmido en una línea celular apropiada. La línea celular que se emplea debe preferiblemente (i) ser transformable por dichos elementos, y (ii) contener las secuencias que son capaces de complementar la parte del genoma del adenovirus deficiente de replicación, preferiblemente de forma integrada, para evitar los riesgos de recombinación. Los ejemplos de líneas celulares que se pueden emplear son la línea 293 de células renales embrionarias humanas (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) que contiene la porción izquierda del genoma de un adenovirus Ad5 (12%) integrada en su genoma y las líneas celulares que son capaces de complementar las funciones E1 y E4, tal y como se describe en los documentos de solicitud de patente WO94/26914 y WO95/02697. Los adenovirus recombinantes se recuperan y purifican usando técnicas de biología molecular convencionales, que son bien conocidas para los especialistas en la técnica.

Sistemas de Vectores de Virus Adeno-asociados

Los virus adeno-asociados (AAV) son virus de ADN de tamaño relativamente pequeño que pueden integrarse, de un modo estable y con especificidad del sitio, en el genoma de las células que infectan. Son capaces de infectar un amplio espectro de células sin inducir ningún efecto sobre el crecimiento, la morfología o la diferenciación celular, y no parecen estar implicados en patologías humanas. El genoma de AAV se ha clonado, secuenciado y caracterizado. Incluye aproximadamente 4700 bases y contiene una región repetida terminal invertida (ITR) de aproximadamente 145 bases en cada extremo, que actúa como origen de la replicación para el virus. El resto del genoma está dividido en dos regiones esenciales que son portadoras de las funciones de encapsulación: la parte izquierda del genoma, que contiene el gen rep implicado en la replicación viral y la expresión de los genes virales; y la parte derecha del genoma, que contiene el gen cap que codifica las proteínas de la cápside del virus.

Se ha descrito el uso de vectores obtenidos a partir de los AAV para transferir genes in vitro e in vivo (véanse los documentos WO 91/18088; WO 93/09239; US 4.797.368, US 5.139.941, EP 488 528). Estas publicaciones describen diversas construcciones derivadas de AAV en las que los genes rep y/o cap están delecionados y reemplazados por un gen de interés, y el uso de estas construcciones para transferir el gen de interés in vitro (en células cultivadas) o in vivo (directamente en un organismo). Los AAV recombinantes deficientes de replicación de acuerdo con la invención, pueden preparase cotransfectando un plásmido que contiene la secuencia de ácido nucleico de interés, flanqueada por dos regiones repetidas terminales invertidas (ITR) de AAV, y un plásmido portador de los genes de encapsulación de AAV (genes rep y cap), en una línea celular que está infectada con un virus auxiliar humano (por ejemplo un adenovirus). Los AAV recombinantes que se producen después se purifican mediante técnicas convencionales.

Por lo tanto, se describe un virus recombinante derivado de AAV cuyo genoma abarca una secuencia que codifica un ácido nucleico que codifica NFIF o sus variantes flanqueadas por las ITRs del AAV. La invención también se refiere a un plásmido que comprende una secuencia que codifica un ácido nucleico que codifica NFIF o sus variantes flanqueadas por dos ITRs de un AAV. Dicho plásmido puede usarse como tal para transferir la secuencia de ácido nucleico, con el plásmido, cuando sea apropiado, incorporado en un vector liposómico (pseudo-virus).

Sistemas de Vectores Retrovirales

En otra realización, el gen se puede introducir en un vector retroviral, p. ej., tal y como se describe en el documento de Anderson et al., Patente de EE.UU. Nº. 5.399.346; Mann et al., 1983, Cell 33:153; Temin et al., Patente de Estados Unidos Nº 4.650.764; Temin et al., Patente de Estados Unidos Nº 4.980.289; Markowitz et al., 1988, J. Virol. 62:1120; Temin et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.124.263; documentos EP 453242, EP178220; Bernstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689; Publicación de Patente Internacional Nº WO 95/07358, publicada el 16 de marzo de 1995, por Dougherty et al.; y Kuo et al., 1993, Blood 82:845. Los retrovirus son virus integrantes que infectan a las células en división. El genoma retroviral incluye dos LTR, una secuencia de encapsulación y tres regiones codificantes (gag, pol y env). En los vectores retrovirales recombinantes, los genes gag, pol y env generalmente están delecionados, completamente o parcialmente, y sustituidos por una secuencia de ácido nucleico heteróloga de interés. Estos vectores pueden construirse a partir de diferentes tipos de retrovirus, tales como VIH, MoMuLV ("virus de la leucemia de Moloney murina" MSV ("virus del sarcoma de Moloney murino"), HaSV ("virus del sarcoma de Harvey"); SNV ("virus de la necrosis del bazo"); RSV ("virus del sarcoma de Rous") y el virus Friend. Se describen vectores retrovirales deficientes en el documento WO95/02697.

En general, para construir retrovirus recombinantes que contienen una secuencia de ácido nucleico se construye un plásmido, que contiene las LTRs, la secuencia de encapsulación y la secuencia codificante. Esta estructura artificial se usa para transfectar una línea celular de empaquetamiento, siendo capaz dicha línea celular de suministrar en trans las funciones retrovirales que están deficientes en el plásmido. En general, las líneas celulares de encapsulación son, por lo tanto, capaces de expresar los genes gag, pol y env. Dichas líneas celulares de encapsulación se han descrito en la técnica anterior, en particular la línea celular PA317 (documento US 4.861.719); la línea celular PsiCRIP (documento WO90/02806) y la línea celular GP+envAm-12 (documento WO89/07150). Además, los vectores retrovirales recombinantes pueden contener modificaciones en las LTRs para suprimir la actividad transcripcional así como secuencias de encapsulación extensivas que pueden incluir una parte del gen gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Los vectores retrovirales recombinantes se purifican mediante técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica.

Pueden construirse vectores retrovirales que actúen como partículas infecciosas o para experimentar una única ronda de transfección. En el primer caso, el virus se modifica para conservar todos sus genes, excepto los responsables de las propiedades de transformación oncogénicas y para expresar el gen heterólogo. Se preparan vectores virales no infecciosos para destruir la señal viral de empaquetamiento, pero que conserven los genes estructurales necesarios para empaquetar el virus cointroducido modificado genéticamente para que contenga el gen heterólogo y las señales de empaquetamiento. Por tanto, las partículas virales que se producen no son capaces de producir virus adicionales.

Sistemas No Virales

Se han usado ciertos sistemas no virales en la técnica, y pueden facilitar la introducción del ADN que codifica los polipéptidos NFIF, ácidos nucleicos antisentido, ribozimas y anticuerpos.

Sistemas de Administración Mediante Lipofección

Se puede introducir un vector in vivo mediante lipofección. Durante la pasada década, ha estado aumentando el uso de liposomas para la encapsulación y transfección de ácidos nucleicos in vitro. Pueden usarse lípidos catiónicos sintéticos diseñados para limitar las dificultades y riesgos encontrados con la transfección mediada por liposomas, para preparar liposomas para la transfección in vivo de un gen que codifica un marcador (Felgner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413-7417 (1987); véase Mackey, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8027-8031 (1988); Ulmer et al., Science 259:1745-1748 (1993)). El uso de lípidos catiónicos puede favorecer la encapsulación de ácidos nucleicos cargados negativamente, y también puede favorecer la fusión con membranas celulares cargadas negativamente (Felgner y Ringold, Science 337:387-388 (1989)). Se describen compuestos y composiciones lipídicas particularmente útiles para transferir ácidos nucleicos en las Publicaciones de Patente Internacional WO95/18863 y WO96/17823, y en la Patente de Estados Unidos Nº 5.459.127. El uso de lipofección para introducir genes exógenos en organismos específicos in vivo tiene ciertas ventajas prácticas. El transporte molecular dirigido de liposomas a células específicas representa un área de beneficio. Es evidente que dirigir la transfección a tipos celulares particulares sería particularmente ventajoso en un tejido con heterogeneidad celular, por ejemplo, páncreas, hígado, riñón, y el cerebro. Los lípidos pueden unirse químicamente a otras moléculas para el propósito de dirigirlos (véase Mackey, et al.,

anteriormente mencionado). Los péptidos dirigidos, p.ej., hormonas o neurotransmisores, y las proteínas, por ejemplo, anticuerpos, o las moléculas no peptídicas, podrían acoplarse químicamente a liposomas.

También son útiles otras moléculas para facilitar la transfección de un ácido nucleico in vivo, tal como un oligopéptido catiónico (p.ej., documento de Publicación de Patente Internacional WO95/21931), péptidos obtenidos a partir de proteínas que se unen al ADN (p.ej., documento de Publicación de Patente Internacional WO96/25508), o un polímero catiónico (p.ej., documento de Publicación de Patente Internacional WO95/21931).

Sistemas de Administración de ADN Desnudo

También es posible introducir el vector in vivo como un plásmido desnudo (véanse los documentos de patentes de EE.UU. 5.693.622, 5.589.466 y 5.580.859). Los vectores de ADN desnudos para terapia génica pueden introducirse en las células hospedadoras deseadas por métodos conocidos en la técnica, p.ej., transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión celular, DEAE dextrano, precipitación con fosfato cálcico, el uso de una pistola génica, o el uso de un transportador de vectores de ADN (véase, p.ej., Wu et al., J. Biol. Chem, 267:963-967 (1992); Wu y Wu, J. Biol. Chem., 263:14621-14624 (1988); Hartmut et al., Solicitud de Patente Canadiense Nº 2.012.311, presentada el 15 de marzo de 1990; Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:2726-2730 (1991)). También pueden usarse estrategias de transporte de ADN mediadas por receptores (Curiel et al., Hum. Gene Ther., 3:147-154 (1992); Wu y Wu, J. Biol. Chem., 262:4429-4432 (1987)).

Usos de los Polipéptidos NFIF

Tal como se mencionó anteriormente, en ciertas situaciones es deseable inducir NFB para iniciar o incrementar el alcance de una respuesta inmunitaria. Para inducir NFB, los polipéptidos NFIF de la presente invención se pueden introducir en el cuerpo de un paciente mediante una diversidad de métodos.

Los métodos usados para introducir NFIF en el cuerpo de un paciente incluyen la administración directa de los polipéptidos NFIF purificados o la introducción del ácido nucleico que codifica los polipéptidos NFIF en vectores de expresión que expresan los polipéptidos en el cuerpo del paciente.

En las realizaciones que implican la administración directa de los polipéptidos NFIF, los polipéptidos NFIF se preparan mediante el uso de sistemas de expresión en células hospedadoras tales como los descritos anteriormente. Los polipéptidos se purifican mediante el uso de métodos de purificación convencionales, y después se combinan con una disolución biológicamente compatible adecuada como se describe con detalle más adelante. La disolución que contiene el polipéptido se introduce en el paciente por vía tópica, oral, parenteral, intranasal, subcutánea o intraocular. Una vez en el organismo, el polipéptido es capaz de ejercer su efecto, al inducir NFB y por lo tanto dar como resultado un incremento de la actividad de las rutas reguladas por NFB, que incluyen las respuestas inmunitarias.

En las realizaciones que implican la administración de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos NFIF, se pueden introducir en el cuerpo del paciente sistemas virales o no virales que utilizan vectores de expresión capaces de expresar los polipéptidos NFIF. Se puede usar cualquiera de los sistemas de transfección virales o no virales descritos anteriormente. Los sistemas de vectores virales y no virales se combinan también con una disolución adecuada biológicamente compatible para facilitar su introducción en el cuerpo. Una vez que el vector viral o no viral se introduce en el cuerpo, el ácido nucleico que codifica del polipéptido NFIF se puede integrar en el genoma del hospedador, lo que posibilita la expresión estable a largo plazo de los polipéptidos NFIF que ejercen su efecto como se describió anteriormente. Se puede proporcionar una expresión transitoria mediante sistemas que introducen el ácido nucleico en las células, pero que no lo integran en el genoma.

Los polipéptidos NFIF-14b y NFIF-7a contienen secuencias de señalización, que indican que estos polipéptidos son capaces de expresarse en una célula a la vez que ejercen su efecto en otra célula. Por lo tanto, los polipéptidos NFIF pueden ser expresados por células que después liberan el polipéptido NFIF en la circulación sanguínea o en otro sistema de transporte (linfa, etc.) en donde se transportan a los tejidos en los que ejercen su efecto sobre la inducción de NFB.

La discusión siguiente describe cómo identificar las composiciones y métodos para regular la inducción de NFB basándose en el descubrimiento actual de los polipéptidos NFIF.

Composiciones

La presente invención proporciona composiciones en una disolución biológicamente compatible (biocompatible) que comprenden los polipéptidos, ácidos nucleicos, y vectores de la invención. Una disolución biológicamente compatible es una disolución en la que el polipéptido, ácido nucleico o vector de la invención se mantiene en una forma activa, p.ej., en una forma capaz de llevar a cabo una actividad biológica. Por ejemplo, un polipéptido de la invención podría tener actividad de activación o desactivación de NFB; un anticuerpo (que es por sí mismo un polipéptido) se podría unir a un polipéptido de la invención; un ácido nucleico sería capaz de replicarse, traducirse hasta un mensaje, o hibridar con un ácido nucleico complementario; y un vector sería capaz de transfectar una célula seleccionada como objetivo. En general, tal disolución biológicamente compatible será un tampón acuoso, p.ej., un tampón Tris, fosfato, o HEPES, que contiene iones salinos. Normalmente, la concentración de iones salinos será similar a los niveles fisiológicos. En una realización específica, la disolución biocompatible es una composición farmacéuticamente aceptable. Las disoluciones biológicamente compatibles pueden incluir agentes estabilizantes y conservantes.

Tales composiciones se pueden formular para la administración por vía tópica, oral, parenteral, intranasal, subcutánea e intraocular. Se pretende que la administración parenteral incluya la inyección intravenosa, la inyección intramuscular, la inyección intraarterial o técnicas de infusión. La composición puede administrarse por vía parenteral en formulaciones de dosificación unitarias que contienen vehículos, adyuvantes y portadores convencionales muy conocidos, atóxicos y fisiológicamente aceptables según se desee.

Las preparaciones inyectables estériles preferidas pueden ser una disolución o suspensión en un disolvente o diluyente parenteralmente aceptable atóxico. Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables son solución salina, solución salina tamponada, solución salina isotónica (por ejemplo, fosfato de monosodio o disodio, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio, o mezclas de estas sales), disolución de Ringer, dextrosa, agua, agua estéril, glicerol, etanol y sus combinaciones. De forma conveniente, se emplean 1,3-butanodiol y aceites no volátiles estériles como disolventes o medios de suspensión. Puede emplearse cualquier aceite no volátil suave, incluyendo mono- o diglicéridos sintéticos. También se pueden utilizar ácidos grasos, tales como el ácido oleico, en la preparación de inyectables.

El medio de la composición puede ser también un hidrogel que se prepara a partir de cualquier (homo o hetero) polímero biocompatible o no citotóxico, tal como un polímero de poli(ácido acrílico) hidrófilo que puede actuar como una esponja absorbente para el fármaco. Tales polímeros se han descrito, por ejemplo, en la solicitud WO93/08845. Algunos de ellos, tales como, en particular, los obtenidos a partir de óxido de etileno y/o propileno, están disponibles comercialmente. Un hidrogel se puede depositar directamente sobre la superficie del tejido a tratar, por ejemplo, durante una intervención quirúrgica.

Otra realización preferida de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un virus recombinante deficiente de replicación y poloxámero. Más específicamente, la invención se refiere a una composición que comprende un virus recombinante deficiente de replicación que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido NFIF y poloxámero. Un poloxámero preferido es Poloxamer 407, que está disponible comercialmente (BASF, Parsippany, NJ) y es un poliol atóxico, biocompatible, y es el más preferido. Un poloxámero impregnado con virus recombinantes se puede depositar directamente sobre la superficie del tejido a tratar, por ejemplo durante una intervención quirúrgica. El poloxámero posee básicamente las mismas ventajas que un hidrogel, aunque tiene una viscosidad más baja.

La presente invención se refiere también a composiciones útiles en la fabricación de medicamentos destinados al tratamiento de sujetos afectados por una respuesta inflamatoria regulada por NFH y composiciones útiles en la fabricación de medicamentos destinados a prevenir que los sujetos se vean afectados por una respuesta inflamatoria regulada por NFB. Por lo tanto, la presente invención incluye el uso de un polipéptido NFIF según la invención para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento y/o la prevención de una respuesta inflamatoria regulada por NFB. La presente invención también incluye el uso de un ácido nucleico según la invención, que codifica un polipéptido NFIF, para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento y/o la prevención de una respuesta inflamatoria regulada por NFB. La presente invención también incluye el uso de un vector recombinante según la invención, que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido NFIF, para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento y/o la prevención de una respuesta inflamatoria regulada por NFB. La presente invención también incluye el uso de un vector viral recombinante deficiente según la invención para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento y/o la prevención de una respuesta inflamatoria regulada por NFB.

También se describe en la presente memoria el uso de composiciones que comprenden células modificadas genéticamente ex vivo con un virus recombinante y composiciones que comprenden células que contienen tales virus recombinantes que se implantan en el cuerpo, y facilitan la expresión in vivo prolongada y eficaz de un polipéptido NFIF según la invención.

Compuestos Terapéuticos Basados en NFIF que Inhiben la Activación de NFB

Tal como se explicó anteriormente, en ciertas situaciones, es deseable reducir o inhibir las respuestas inmunitarias reguladas por NFB. Inhibiendo la expresión del gen de NFIF o interfiriendo con la actividad de los polipéptidos NFIF, es posible inhibir la inducción de NFB y por lo tanto inhibir o prevenir respuestas inmunitarias reguladas por NFB que dan como resultado aterosclerosis y otras enfermedades.

Existe una diversidad de compuestos terapéuticos que se pueden usar para inhibir la expresión o la actividad de NFIF. Estos compuestos terapéuticos pueden ser ácidos nucleicos, polipéptidos, péptidos

o moléculas pequeñas no peptídicas. En una realización, se usan ácidos nucleicos antisentido para disminuir la expresión del gen de NFIF inhibiendo el procesamiento (corte y empalme) del transcrito primario de NFIF. En otra realización, se usan ribozimas que pueden escindir el mARN de NFIF, lo que evita la síntesis de NFIF. Los polipéptidos incluyen anticuerpos u otras proteínas de unión que se unen a los polipéptidos NFIF e interfieren con su capacidad de activar la inducción de NFB. Además, los compuestos tales como los inhibidores de moléculas pequeñas que inhiben la expresión del gen de NFIF

o la actividad de los polipéptidos NFIF se pueden identificar en ensayos con genes indicadores tal como se describió anteriormente, y administrarlos a pacientes para inhibir la expresión/actividad de NFIF. Se usan los mismos métodos descritos anteriormente para introducir los polipéptidos NFIF y los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos NFIF en el cuerpo de un paciente para administrar las diversas composiciones anti-NFIF.

Ácidos Nucleicos Antisentido

La inhibición de la expresión génica mediante el uso de ácidos nucleicos antisentido se puede llevar a cabo a nivel traduccional o transcripcional. Los ácidos nucleicos antisentido son preferiblemente fragmentos de ácidos nucleicos capaces de hibridar específicamente con la totalidad o parte de un ácido nucleico que codifica NFIF o con el ARN mensajero correspondiente. Además, se pueden diseñar o identificar ácidos nucleicos antisentido que disminuyen la expresión del gen de NFIF inhibiendo el corte y empalme de su transcrito primario. Conociendo la estructura y la secuencia parcial del gen de NFIF, se pueden diseñar dichos ácidos nucleicos antisentido y analizar su eficacia.

Los ácidos nucleicos antisentido son preferiblemente oligonucleótidos, y pueden consistir completamente en desoxirribonucleótidos, desoxirribonucleótidos modificados, o cierta combinación de ambos. Los ácidos nucleicos antisentido pueden ser oligonucleótidos sintéticos. Los oligonucleótidos se pueden modificar químicamente, si se desea, para mejorar la estabilidad y/o la selectividad. Debido a que los oligonucleótidos son susceptibles a la degradación por las nucleasas intracelulares, las modificaciones pueden incluir, por ejemplo, el uso de un grupo azufre para sustituir el oxígeno libre del enlace fosfodiéster. Esta modificación se denomina enlace de fosforotioato. Los oligonucleótidos antisentido de fosforotioato son hidrosolubles, polianiónicos y resistentes a las nucleasas endógenas. Además, cuando un oligonucleótido antisentido de fosforotioato hibrida con su sitio seleccionado como objetivo, la molécula doble ARN-ADN activa la enzima ribonucleasa (Rnasa) H endógena, que escinde el componente de mARN de la molécula híbrida.

Además, se pueden sintetizar oligonucleótidos antisentido con enlaces fosforoamidita y poliamida (peptídicos). Estas moléculas deberían ser muy resistentes a la degradación por nucleasas.

Además, se pueden añadir grupos químicos al carbono 2' del resto de carbohidrato y al carbono 5 (C-5) de las pirimidinas para incrementar la estabilidad y facilitar la unión del oligonucleótido antisentido a su sitio seleccionado como objetivo. Las modificaciones pueden incluir 2'-desoxi, O-pentoxi, O-propoxi, Ometoxi, fluoro, metoxietioxifosforotioatos, bases modificadas, así como otras modificaciones conocidas por los expertos en la técnica.

Los ácidos nucleicos antisentido pueden ser también secuencias de ADN cuya expresión en la célula produce ARN complementario a todo o parte del mARN de NFIF. Se pueden preparar ácidos nucleicos antisentido mediante la expresión de todo o parte de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de la Figura 3, en la orientación opuesta, tal como se describe en el documento EP 140308. Es adecuada cualquier longitud de secuencia antisentido para la práctica de la invención, con tal de que sea capaz de inhibir o bloquear la expresión de NFIF. Preferiblemente, la secuencia antisentido tiene una longitud de al menos 20 nucleótidos. La preparación y el uso de ácidos nucleicos antisentido, de ADN que codifica ARNs antisentido y el uso de moléculas antisentido oligonucleotídicas y genéticas se describe en el documento WO92/15680.

Una aproximación para determinar el fragmento óptimo de NFIF a usar en un método de tratamiento con ácido nucleico antisentido implica preparar fragmentos aleatorios de cADN de NFIF mediante corte mecánico, tratamiento enzimático, y clonación del fragmento en cualquiera de los sistemas de vectores descritos en la presente memoria. Se usan clones individuales o mezclas de clones para infectar las células que expresan NFIF, y los fragmentos de cADN de NFIF antisentido eficaces se identifican monitorizando la expresión de NFIF a nivel del ARN o de la proteína.

Se pueden usar los sistemas de vectores retrovirales, virales adenoasociados, y adenovirales discutidos anteriormente en la presente memoria para introducir y expresar ácidos nucleicos antisentido en las células. Se pueden introducir oligonucleótidos sintéticos antisentido de una diversidad de formas, que incluyen los métodos discutidos más adelante en la presente memoria.

Ribozimas

Se pueden conseguir reducciones en los niveles del polipéptido NFIF mediante el uso de ribozimas. Las ribozimas son moléculas de ARN catalíticas (enzimas de ARN) que tienen dominios catalíticos y de unión al sustrato distintos. La secuencia de unión al sustrato combina la complementariedad de nucleótidos y, posiblemente, interacciones distintas de los enlaces de hidrógeno con su secuencia objetivo. La porción catalítica escinde el ARN objetivo en un sitio específico. El dominio del sustrato de una ribozima se puede modificar para dirigirlo hacia una secuencia de mARN específica. La ribozima reconoce y después se une a un mARN objetivo por medio del emparejamiento de bases complementarias. Una vez que se ha unido al sitio objetivo correcto, la ribozima actúa enzimáticamente para cortar el mARN objetivo. La escisión del mARN de NFIF mediante una ribozima destruye su capacidad de dirigir la síntesis del polipéptido NFIF. Una vez que la ribozima ha escindido su secuencia objetivo, se libera y se puede unir repetidamente y escindir otros mARNs de NFIF.

Los ejemplos de ribozimas para el uso en la práctica de la presente invención incluyen una diversidad de motivos, por ejemplo, un motivo de cabeza de martillo, motivo de horquilla, un virus de hepatitis delta, intrón del grupo I o un motivo de ARN de RnasaP (en asociación con una secuencia guía de ARN) o el motivo del ARN VS de Neurospora. Los motivos de cabeza de martillo han sido descritos por Rossi et al., 1992, Aids Research and Human Retroviruses, 8, 183. Los motivos de horquilla han sido descritos por Hampel y Tritz, 1989, Biochemistry, 28, 4929, y Hampel et al., 1990, Nucleic Acids Res., 18, 299. El motivo del virus de la hepatitis delta ha sido descrito por Perrotta y Been, 1992, Biochemistry, 31, 16, el motivo de RnasaP ha sido descrito por Guerrier-Takada et al., 1983, Cell, 35, 849, el motivo de la ribozima de ARN VS de Neurospora ha sido descrito por Collins (Saville y Collins, 1990, Cell, 61, 685696; Saville y Collins, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 8826-8830; Collins y Olive, 1993, Biochemistry, 32, 2795-2799), y el motivo de intrón del Grupo I ha sido descrito por Cech et al., patente de EE.UU. nº 4.987.071.

Una aproximación en la preparación de una ribozima es sintetizar químicamente un oligodesoxirribonucleótido con un dominio catalítico de ribozima (~20 nucleótidos) flanqueado por secuencias que hibridan con el mARN de NFIF seleccionado como objetivo tras la transcripción. El oligodesoxirribonucleótido se amplifica utilizando las secuencias de unión al sustrato como cebadores. El producto de la amplificación se clona en un vector de expresión eucariótico.

Las ribozimas que poseen una estructura de cabeza de martillo o de horquilla se preparan fácilmente, ya que estas moléculas de ARN catalítico se pueden expresar dentro de las células a partir de promotores eucarióticos (p.ej., Scanlon et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 10591-5; Kashani-Sabet et al., 1992, Antisense Res. Dev., 2, 3-15; Dropulic et al., 1992, J. Virol., 66, 1432-41; Weerasinghe et al., 1991, J. Virol., 65, 5531-4; Ojwang et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10802-6; Chen et al., 1992, Nucleic Acids Res., 20, 4581-9; Sarver et al., 1990, Science, 247, 12221225)). Una ribozima se puede expresar en las células eucarióticas a partir del vector de ADN apropiado. Si se desea, la actividad de la ribozima se puede aumentar mediante su liberación del transcrito primario por una segunda ribozima (Ohkawa et al., 1992, Nucleic Acids Symp. Ser., 27, 15-6; Taira et al., 1991, Nucleic Acids Res., 19, 5125-30; Ventura et al., 1993, Nucleic Acids Res., 21, 3249-55).

En una aproximación para preparar ribozimas, las ribozimas se expresan a partir de unidades de transcripción insertadas en ADN, ARN, o vectores virales. La transcripción de las secuencias de ribozimas se controlan desde un promotor para una ARN polimerasa I eucariótica (pol I), ARN polimerasa II (pol II), o ARN polimerasa III (pol III). Los transcritos de los promotores de pol II o pol III se expresarán a niveles elevados en todas las células; los niveles de un promotor dado de pol II en un tipo celular dado dependerán de las secuencias reguladoras de los genes cercanos. También se usan los promotores de ARN polimerasa procariótica, con tal de que la enzima ARN polimerasa procariótica se exprese en las células apropiadas (Elroy-Stein y Moss, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 6743-7; Gao y Huang 1993, Nucleic Acids Res., 21, 2867-72; Lieber et al., 1993, Methods Enzymol., 217, 47-66; Zhou et al., 1990, Mol. Cell. Biol., 10, 4529-37). Se ha demostrado que las ribozimas expresadas a partir de estos promotores pueden funcionar en las células mamíferas (Kashani-Sabet et al., 1992, Antisense Res. Dev., 2, 3-15; Ojwang et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10802-6; Chen et al., 1992 Nucleic Acids Res., 20, 4581-9; Yu et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 6340-4; L'Huillier et al., 1992, EMBO J., 11, 4411-8; Lisziewicz et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 8000-4).

En una realización, se inserta una unidad de transcripción que expresa una ribozima que escinde el ARN de NFIF en un vector de ADN plasmídico, un vector retroviral, un vector viral de ADN de adenovirus o un vector de virus adenoasociado. Los vectores recombinantes son preferiblemente plásmidos de ADN o vectores adenovirales. Sin embargo, para este fin se pueden usar otros vectores para células mamíferas que dirigen la expresión del ARN. Los vectores se administran en forma de partículas virales recombinantes. El ADN se puede administrar solo o complejado con diversos vehículos. El ADN, los complejos ADN/vehículo, o las partículas de virus recombinantes se administran localmente en el lugar de tratamiento, tal como se discute más adelante. Preferiblemente, los vectores recombinantes capaces de expresar las ribozimas se administran localmente tal como se describe más adelante, y persisten en las células seleccionadas como objetivo. Una vez expresadas, las ribozimas escinden el mARN de NFIF seleccionado como objetivo.

Las ribozimas se pueden administrar a un paciente mediante una diversidad de métodos. Se pueden añadir directamente a los tejidos seleccionados como objetivo, complejadas con lípidos catiónicos, empaquetadas dentro de liposomas, o se pueden administrar las células seleccionadas como objetivo mediante otros métodos conocidos en la técnica. La administración localizada en los tejidos deseados se puede realizar mediante un catéter, una bomba de infusión o malla, con o sin la incorporación de la ribozima en los biopolímeros, tal como se discute más adelante en la presente memoria. Las vías de administración alternativas incluyen, pero sin limitación, la inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección subcutánea, inhalación de aerosol, administración oral (en forma de comprimido o píldora), tópica, sistémica, ocular, intraperitoneal y/o intratecal. Se proporcionan descripciones más detalladas de la administración de ribozimas en Sullivan et al., documento PCT WO94/02595 y Draper et al., documento PCT WO93/23569.

Anticuerpos

En la presente memoria se describen anticuerpos hacia el polipéptido NFIF. Estos anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales o anticuerpos policlonales. Están incluidos los anticuerpos quiméricos, de cadena simple, y humanizados, así como los fragmentos Fab y los productos de una biblioteca de expresión de Fab, y los fragmentos Fv y los productos de una biblioteca de expresión de Fv.

Se pueden preparar anticuerpos policlonales hacia un fragmento antigénico de un polipéptido NFIF. También se pueden generar anticuerpos hacia la proteína o polipéptido NFIF intacto, o contra un fragmento, derivado o epítopo de la proteína o polipéptido. Se pueden obtener anticuerpos tras la administración de la proteína, polipéptido, fragmento, derivado o epítopo a un animal, mediante el uso de los métodos y procedimientos conocidos en la técnica.

Se pueden preparar anticuerpos monoclonales mediante el uso del método de Mishell, B. B., et al., Selected Methods In Cellular Immunology, (W.H. Freeman, ed.) San Francisco (1980). Brevemente, se usa un polipéptido de la presente invención para inmunizar células de bazo de ratones Balb/C. Las células de bazo inmunizadas se fusionan con células de mieloma. Las células fusionadas que contienen las características de las células de bazo y de mieloma se aíslan mediante el cultivo en medio HAT, un medio que destruye ambas células originarias, pero permite que los productos fusionados sobrevivan y proliferen.

Los anticuerpos monoclonales se pueden "humanizar" para evitar que el hospedador genere una respuesta inmunitaria hacia los anticuerpos. Un "anticuerpo humanizado" es aquel en el que las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) y/u otras porciones de la estructura del dominio variable ligero y/o pesado proceden de una inmunoglobulina no humana, y el resto de las porciones de la molécula proceden de una o más inmunoglobulinas humanas. Los anticuerpos humanizados también incluyen anticuerpos que se caracterizan por una cadena pesada humanizada asociada con una cadena ligera no modificada del donante o aceptor o una cadena ligera quimérica, o viceversa. La humanización de anticuerpos se puede llevar a cabo mediante métodos conocidos en la técnica (véase, p.ej. G.E. Mark y E.A. Padlan, "Capítulo 4. Humanization of Monoclonal Antibodies", The Handbook of Experimental Pharmacology, vol. 113, Springer-Verlag, Nueva York, 1994). Pueden utilizarse animales transgénicos para expresar anticuerpos humanizados.

Los métodos conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos de cadena simple se pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena simple hacia los polipéptidos y las proteínas inmunógenas de la presente invención.

En una realización preferida, se usa un anticuerpo anti-NFIF para unirse e inhibir la actividad de NFIF en un paciente.

Los anticuerpos anti-NFIF son también útiles en ensayos para detectar o cuantificar los niveles de NFIF. En una realización, estos ensayos proporcionan un diagnóstico clínico y una valoración de NFIF en diversas enfermedades, y un método para monitorizar la eficacia del tratamiento. Se proporciona un ejemplo de un anticuerpo anti-NFIF usado para unirse a NFIF e identificar su presencia en los tejidos en el Ejemplo 5. Estos anticuerpos anti-NFIF se pueden usar además para cuantificar NFIF en una muestra de tejido.

Métodos de Tratamiento

La presente invención es útil en los métodos de tratamiento que comprenden la administración a un humano o a otro animal de una cantidad eficaz de una composición de la invención.

Las cantidades eficaces pueden variar, dependiendo de la edad, tipo y gravedad del trastorno que se va a tratar, el peso corporal, la duración deseada del tratamiento, la vía de administración y otros parámetros. El médico u otro profesional médico cualificado determinará las cantidades eficaces. En la mayoría de los casos, se pueden ajustar los niveles de las dosis, de forma que se pueden alcanzar y mantener los niveles deseados de NFIF o de otros compuestos terapéuticos.

Los polipéptidos según la invención se administran en general en dosis de alrededor de 0,01 mg/kg a alrededor de 100 mg/kg, más preferiblemente alrededor de 0,1 mg/kg a alrededor de 50 mg/kg, y aún más preferiblemente alrededor de 1 mg/kg a alrededor de 10 mg/kg de peso corporal por día.

Los anticuerpos neutralizantes se pueden administrar en forma de una inyección rápida solamente, se pueden infundir a lo largo del tiempo o se pueden administrar tanto en forma de una inyección rápida como de una infusión a lo largo del tiempo. Aunque la dosis variará basándose en los parámetros anteriores, y en la capacidad de unión del anticuerpo, se puede administrar una dosis de 0,2 a 0,6 mg/kg en forma de una inyección rápida seguida de un periodo de infusión de 2 a 12 horas. De manera alternativa, se administran inyecciones rápidas múltiples cada dos días o cada tres días o cada cuatro días, según sean necesario. Los niveles de las dosis se pueden ajustar según se determine mediante los niveles de NFIF y/o los niveles de inducción de NFB.

Tal como se discutió anteriormente en la presente memoria, se pueden usar virus recombinantes para introducir tanto el ADN que codifica NFIF como subfragmentos de NFIF, así como ácidos nucleicos antisentido. Los virus recombinantes se formulan en general y se administran en forma de dosis entre alrededor de 104 y alrededor de 1014 ufp. En el caso de los AAVs y adenovirus, se usan preferiblemente dosis de alrededor de 106 a alrededor de 1011 ufp. El término ufp ("unidad formadora de placa") corresponde al poder infeccioso de una suspensión de viriones, y se determina infectando un cultivo celular apropiado y midiendo el número de placas formadas. Las técnicas para determinar el título de ufp de una disolución viral están bien documentadas en el estado de la técnica.

Se pueden administrar ribozimas en cantidades que oscilan de alrededor de 5 a alrededor de 50 mg/kg/día en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los niveles de dosis se pueden ajustar basándose en la eficacia terapéutica medida.

Los niveles apropiados de las moléculas inhibidoras o estimuladoras pueden ser determinados por el personal médico cualificado mediante el uso de los parámetros discutidos anteriormente.

Métodos para Incrementar el Nivel de Actividad del Polipéptido NFIF

Los métodos para incrementar la expresión o la actividad del polipéptido NFIF incluyen, pero sin limitación, la administración de una composición que comprende el polipéptido NFIF, la administración de una composición que comprende un vector de expresión que codifica el polipéptido NFIF, la administración de una composición que comprende una molécula estimuladora que estimula la actividad del polipéptido NFIF y la administración de una molécula estimuladora que incrementa la expresión del gen de NFIF.

Métodos que Utilizan Polipéptidos NFIF

En una realización, el nivel de actividad de NFIF se incrementa por medio de la administración de una composición que comprende el polipéptido NFIF. Esta composición se puede administrar de una manera conveniente, tal como mediante vía oral, tópica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal o intradérmica. La composición se puede administrar directamente o se puede encapsular (p.ej. en un sistema lipídico, en microesferas de aminoácidos, o en dendrímeros globulares). El polipéptido puede estar unido, en ciertos casos, a otro polímero tal como albúmina de suero o polivinil pirrolidona.

Métodos que Utilizan Vectores que Expresan NFIF

En otra realización, el nivel de NFIF se incrementa por medio del uso de la terapia génica, es decir, por medio de la administración de una composición que comprende un ácido nucleico que codifica y dirige la expresión del polipéptido NFIF. En esta realización, el polipéptido NFIF se clona en un vector de expresión apropiado. Los sistemas de vectores y promotores posibles se discutieron anteriormente de manera exhaustiva. El vector de expresión se transfiere al tejido seleccionado como objetivo mediante el uso de uno de los sistemas de administración con vectores discutidos anteriormente. Esta transferencia se lleva a cabo ex vivo en un procedimiento en el que el ácido nucleico se transfiere a las células en el laboratorio y las células modificadas se administran después al ser humano o a otro animal, o in vivo en un procedimiento en el que el ácido nucleico se transfiere directamente a las células del ser humano o de otro animal. En las realizaciones preferidas, se usa un sistema de vector adenoviral para administrar el vector de expresión. Si se desea, se utiliza un promotor específico del tejido en el vector de expresión tal como se describió anteriormente.

Los vectores no virales se pueden transferir a las células mediante el uso de cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, que incluyen la coprecipitación con fosfato cálcico, lipofección (liposomas aniónicos y catiónicos sintéticos), administración de genes mediada por receptores, inyección de ADN desnudo, electroporación y biobalística o aceleración de partículas.

Métodos que Utilizan una Molécula Estimuladora que Estimula la Actividad de NFIF

En otra realización, la actividad de NFIF se estimula mediante moléculas estimuladoras que incrementan la actividad de NFIF o que incrementan su reconocimiento apropiado por parte de los sitios de unión celulares. Estas moléculas estimuladoras se pueden introducir mediante los mismos métodos discutidos anteriormente para la administración de los polipéptidos.

Métodos que Utilizan una Molécula Estimuladora que Incrementa la Expresión del Gen de NFIF

En otra realización, se incrementa el nivel de NFIF por medio del uso de compuestos de bajo peso molecular, que pueden estimular la expresión de NFIF a nivel de la transcripción, traducción, o post-traducción. Estos compuestos se pueden administrar mediante los mismos métodos discutidos anteriormente para la administración de los polipéptidos.

Métodos para Tratar o Prevenir una Respuesta Inflamatoria Regulada por NFB

Los métodos de tratamiento en los que la presente invención es útil incluyen el tratamiento o la prevención de respuestas inflamatorias reguladas por NFB que incluyen, pero sin limitación, artritis reumatoide, aterosclerosis, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades virales, gastropatía inducida por NSAIDs, enfermedades neurodegenerativas, scrapie, septicemia, apoptosis, enfermedad de Crohn, enfermedad renal, reestenosis, lesión cerebral/inflamación, enfermedad de Alzheimer, asma, y expresión regulada inadecuadamente de citocinas pleiotrópicas.

Estos métodos incluyen, pero sin limitación, la administración de una composición que comprende un ácido nucleico antisentido, la administración de una composición que comprende una proteína de unión intracelular tal como un anticuerpo, la administración de una molécula inhibidora que inhibe la actividad de NFIF, por ejemplo, una composición que comprende un vector de expresión que codifica un subfragmento de NFIF o una molécula de bajo peso molecular, que incluye la administración de un compuesto de bajo peso molecular que inhibe la expresión de NFIF a nivel de la transcripción, traducción o post-traducción, la administración de una ribozima que escinde el mARN que codifica NFIF, la administración de un medicamento fabricado mediante el uso de un polipéptido NFIF, la administración de un medicamento fabricado mediante el uso de un ácido nucleico que codifica un polipéptido NFIF, la administración de un medicamento fabricado mediante el uso de un vector recombinante que incluye un ácido nucleico que codifica un polipéptido NFIF y la administración de un medicamento fabricado mediante el uso de un vector viral recombinante deficiente que incluye un ácido nucleico que codifica un polipéptido NFIF.

Métodos para Disminuir los Niveles de Actividad del Polipéptido NFIF

Los métodos para disminuir la expresión del polipéptido NFIF para disminuir la inducción de NFB incluyen, pero sin limitación, la administración de una composición que comprende un ácido nucleico antisentido, la administración de una composición que comprende una proteína de unión intracelular tal como un anticuerpo, la administración de una molécula inhibidora que inhibe la actividad de NFIF, por ejemplo, una composición que comprende un vector de expresión que codifica un subfragmento de NFIF o una molécula de bajo peso molecular, que incluye la administración de un compuesto de bajo peso molecular que inhibe la expresión de NFIF a nivel de la transcripción, traducción

o post-traducción, y la administración de una ribozima que escinde el mARN que codifica NFIF.

Métodos que Utilizan Ácidos Nucleicos Antisentido

En una realización, se usa una composición que comprende un ácido nucleico antisentido para inhibir o bloquear la expresión de NFIF. En una realización preferida, el ácido nucleico codifica moléculas de ARN antisentido. En esta realización, el ácido nucleico se une de forma operable a señales que permiten la expresión de la secuencia de ácido nucleico y se introduce en una célula mediante la utilización, preferiblemente, de construcciones de vectores recombinantes, que expresarán el ácido nucleico antisentido una vez que el vector se introduzca en la célula. Los ejemplos de vectores adecuados incluyen los plásmidos, adenovirus, virus adeno-asociados, retrovirus, y virus herpes. Preferiblemente, el vector es un adenovirus. Lo más preferiblemente, el vector es un adenovirus deficiente de replicación que comprende una deleción en las regiones E1 y/o E3 del virus.

En otra realización, se sintetiza el ácido nucleico antisentido y se puede modificar químicamente para resistir la degradación por las nucleasas intracelulares, tal como se discutió anteriormente. Los oligonucleótidos antisentido sintéticos se pueden introducir en una célula mediante el uso de liposomas. La captación celular ocurre cuando un oligonucleótido antisentido está encapsulado dentro de un liposoma. Con un sistema de administración eficaz, se pueden usar concentraciones bajas atóxicas de la molécula antisentido para inhibir la traducción del mARN seleccionado como objetivo. Además, los liposomas que están conjugados a sitios de unión específica a células dirigen al oligonucleótido antisentido hacia un tejido particular.

Métodos que Utilizan Anticuerpos Neutralizantes y Otras Proteínas de Unión

En otra realización, la expresión de NFIF se inhibe o se bloquea mediante la expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de unión intracelular que es capaz de interaccionar de forma selectiva con NFIF. Los documentos WO 94/29446 y WO 94/02610 describen la transfección celular con genes que codifican una proteína de unión intracelular. Una proteína de unión intracelular incluye cualquier proteína capaz de interaccionar, o de unirse, selectivamente con NFIF en la célula en la que se expresa, y de neutralizar la función del NFIF unido. Preferiblemente, la proteína de unión intracelular es un anticuerpo neutralizante o un fragmento de un anticuerpo neutralizante. Más preferiblemente, la proteína de unión intracelular es un anticuerpo de cadena simple.

El documento WO 94/02610 describe la preparación de anticuerpos y la identificación del ácido nucleico que codifica un anticuerpo particular. Mediante el uso de NFIF o de un fragmento del mismo, se prepara un anticuerpo monoclonal específico mediante métodos conocidos para los expertos en la técnica. Se prepara posteriormente un vector que comprende el ácido nucleico que codifica una proteína de unión intracelular, o una porción de la misma, y que es capaz de expresarse en una célula hospedadora para el uso en el método descrito en la presente memoria.

De manera alternativa, la actividad de NFIF se puede bloquear mediante la administración de un anticuerpo neutralizante en la circulación. Tal anticuerpo neutralizante se puede administrar directamente en forma de una proteína, o se puede expresar a partir de un vector (con una señal secretora).

Métodos que Utilizan una Molécula Inhibidora que Evita la Expresión del Gen de NFIF

En otra realización, las moléculas inhibidoras, que incluyen compuestos de bajo peso molecular, son capaces de inhibir la expresión de NFIF a nivel de la transcripción, traducción o post-traducción. Para identificar tales moléculas inhibidoras se pueden usar los sistemas de genes indicadores descritos anteriormente. Estas moléculas inhibidoras se pueden combinar con un vehículo farmacéuticamente aceptable y administrarlas mediante el uso de métodos convencionales conocidos en la técnica.

Métodos que Utilizan Ribozimas

Las ribozimas se pueden administrar a las células mediante encapsulación en liposomas, mediante iontoforesis, mediante la incorporación en hidrogeles, ciclodextrinas, nanocápsulas biodegradables, y microesferas bioadhesivas o mediante cualquiera de una diversidad de otros métodos discutidos anteriormente. La ribozima se puede administrar a un tejido seleccionado como objetivo mediante inyección directa o mediante el uso de un catéter, bomba de infusión o malla. Las vías alternativas de administración incluyen la inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección subcutánea, inhalación de aerosoles, administración oral (en forma de comprimidos o píldoras), tópica, sistémica, ocular, intraperitoneal y/o intratecal.

En las realizaciones preferidas, se clona a una secuencia que codifica una ribozima en un vector de expresión de ADN. La transcripción de la secuencia de la ribozima se controla desde un promotor de ARN polimerasa II (pol II), o ARN polimerasa III (pol III) eucariótica. El vector de expresión se puede incorporar en una diversidad de vectores que incluyen los vectores de ADN virales tales como los vectores de adenovirus o de virus adenoasociados discutidos anteriormente.

En una realización preferida de la invención, se inserta una unidad de transcripción que expresa una ribozima que escinde el ARN de NFIF en un vector viral de ADN de adenovirus. El vector se administra en forma de partículas virales recombinantes, y se administra localmente en el sitio de tratamiento, por medio del uso de un catéter, malla o bomba de infusión.

Ejemplos

Ejemplo 1 -Método para Clonar NFIF-14b y NFIF-7a

Para aislar el ADN que codifica NFIF-14b y NFIF-7a, se preparó una biblioteca de cADN a partir de ARN total de células musculares lisas (SMC) vasculares humanas mediante el uso de un equipo de síntesis de bibliotecas de cADN Marathon™ de Clontech. El equipo de síntesis de cADN también incluye una biblioteca de control de ADN de placenta humana. Las bibliotecas son lineales y amplificables mediante PCR.

Los genes de NFIF-14b y NFIF-7a se obtuvieron mediante PCR llevada a cabo con las bibliotecas de cADN de SMC vascular humano y de placenta humana de Marathon.

Para llevar a cabo las reacciones de PCR, se usaron componentes de PCR estándar [tampón 10X de Perkin Elmer y Polimerasa Taq Gold], y la reacción se llevó a cabo como sigue. Las mezclas de reacción se calentaron a 94ºC durante 10 minutos, después se sometieron a ciclos térmicos 10 veces con una etapa de desnaturalización de 94ºC durante 30 segundos, una etapa de renaturalización de 65ºC durante 30 segundos, y una etapa de extensión de 72ºC durante 1,5 minutos. Después de estos diez ciclos, la reacción se sometió a ciclos térmicos 30 veces con una etapa de desnaturalización de 94ºC durante 30 segundos, una etapa de renaturalización de 46ºC durante 30 segundos, y una etapa de extensión de 72ºC durante 1,5 minutos. Después de estos 30 ciclos, las reacciones se incubaron a 72ºC durante 7 minutos y se almacenaron a 4ºC. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un termociclador Perkin Elmer 9600.

El producto de PCR de cada PCR se ligó en pCR2.1 (Invitrogen) y se transformó en DH5α-E. coli. Los clones se escogieron y se cultivaron en 5 ml de LB-amp; después se aislaron y se digirieron los plásmidos con EcoRI para comprobar el tamaño del inserto liberado. Cinco clones de quince proporcionaron bandas de un tamaño de 1,2-1,3 Kb, indicativas del gen seleccionado como objetivo, y se secuenciaron.

Los supuestos clones de NFIF se identificaron basándose en un marco de lectura abierto, y en la alineación de secuencias de la secuencia respecto de una secuencia predicha de 5'. Se eligieron los clones nºs 14b y 7a para su caracterización posterior.

Se cultivaron preparaciones de plásmidos grandes a partir de las reservas en glicerol originales del clon 7 y 14, y se aislaron mediante el uso de un equipo MaxiPrep de Qiagen.

Ejemplo 2 -Subclonación del clon 7a y 14b en un vector de expresión eucariótico

Los clones 14b y 7a se subclonaron posteriormente en el vector plasmídico pcDNA3.1mychis disponible de Invitrogen. Este vector de expresión incluye un promotor fuerte para la expresión a nivel elevado en células mamíferas, y un marcador seleccionable para generar líneas celulares estables. Una etiqueta de fusión en posición C-terminal en el vector ofrece una secuencia de polihistidina para la purificación rápida y un epítopo myc para una detección cómoda con un anticuerpo anti-myc.

Las reacciones de PCR se llevaron a cabo mediante el uso de los cebadores de PCR

5'hasm - 5'-tccaccatggcgctggtgcgcgcactc-3' (SEQ ID NO.: 6) y

fushasm3' - 3'-ctggatatcgtaattgtgctttatataaagctg-5' (SEQ ID NO.: 7) y la construcción pCR2.1 para cada clon de tamaño completo como molde. Las condiciones de PCR mediante el uso de 475 pg de pCR2.1 clon 7a o 500 pg de pCR2.1 clon 14b fueron las siguientes: las mezclas de reacción se calentaron a 95ºC durante 10 minutos, después se sometieron a ciclos térmicos 30 veces con una etapa de desnaturalización de 95ºC durante 30 segundos, una etapa de renaturalización de 52ºC durante 30 segundos, y después una etapa de extensión de 72ºC durante 1,5 minutos. Después de estos 30 ciclos, las reacciones se incubaron a 72ºC durante 7 minutos, y se almacenaron a 4ºC.

El producto de la PCR se ligó en pCR2.1 y el inserto de ADN se secuenció mediante la utilización de un equipo Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction y un secuenciador de ADN ABI Prism 377 de Perkin Elmer Applied Biosystems. La secuenciación demostró que el cebador de PCR eliminó el codón de parada natural (TAG) e introdujo un sitio EcoRV.

Las construcciones positivas de NFIF-14b y -7a se digirieron con EcoRI y EcoRV y se subclonaron en pcDNA3.1 mychis (Invitrogen) cortado con EcoRI y EcoRV. Esto dio como resultado que la etiqueta myc se fusionara al extremo 3' de los cADNs de NFIF. Estas construcciones se denominaron pcDNA3.1mychasm7a y pcDNA3.1hasm14bmyc.

Ejemplo 3 -Preparación de Variantes de Deleción de NFTF

Se prepararon mutantes de deleción de NFIF-14b y NFIF-7a mediante reacciones de PCR mediante el uso de los plásmidos pcDNA3.1mychasm7a y pcDNA3.1hasm14bmyc descritos anteriormente. Se usaron dos grupos de cebadores de PCR para preparar los mutantes de deleción:

hasm313mut + hasm3'mut:

5' gctccaccatgatatggacaggggatag 3' (SEQ ID NO.: 8)

5' gccactgtgctggatatcgtaattaac 3' (SEQ ID NO.: 9)

hasm396mut + hasm3'mut:

5' gctccaccatgacaaccaccatccagagtc 3' (SEQ ID NO.: 10)

5' gccactgtgctggatatcgtaattaac 3' (SEQ ID NO.: 9)

El par de cebadores hasm313+hasm3'mut produjo una secuencia idéntica de los cADNs de los clones de tamaño completo de 14b o 7a, pero en un marco de lectura abierto iniciado en dirección 3' en el pb 313 (ATG). (La numeración es desde el ATG del clon de tamaño completo). La secuencia Kozak consenso se incluyó en el cebador directo para optimizar la traducción.

El par de cebadores hasm396+hasm3'mut produjo una secuencia idéntica de los cADNs de tamaño completo pero en un marco de lectura abierto iniciado en dirección 3' en el pb 394 (ATG).

Los productos de PCR se ligaron en pCR2.1 y se secuenció el inserto de ADN. Cada mutante de deleción se cortó con EcoRI/EcoRV y se subclonó en pcDNA3.1mychis cortado con EcoRI y EcoRV. Los clones de deleción de NFIF-14b con la secuencia correcta se denominaron pcDNAmychis 14-313 y pcDNAmychis 14-396. Los clones de deleción de NFIF-7a con la secuencia correcta se denominaron pcDNAmychis 7-313, y pcDNAmychis 7-396.

El análisis de los clones anteriores mediante el uso de transcripción/traducción in vitro incorporando [35S metionina] en la reacción [equipo TnT Quick Coupled Transcription Translation de Promega nº L1170] produjo bandas de los tamaños esperados (NFIF 14b=51 kDa; NFIF 14-313=40 kDa; NFIF 14-396=37 kDa; NFIF 7a=41 kDa; NFIF 7-313=30 kDa; y NFIF 7-396=27 kDa) para los marcos de lectura abiertos acortados. La facilidad de la traducción fue importante de determinar antes de estudiar la actividad funcional y de determinar qué dominios eran importantes para la actividad.

Ejemplo 4 - Método para transfectar células con NFIF-14b o NFIF-7a para producir líneas celulares estables que contienen los plásmidos

Para preparar líneas celulares estables que contienen NFIF-14b, NFIF-7a y los mutantes de deleción, se sembraron en placas Falcon de 6 pocillos 2 x 105 células HEK293 o COS-7, las construcciones de cADN de NFIF finalizadas pcDNAmychis7, pcDNAmychis7-313, pcDNAmychis7-396; pcDNAmychis14, pcDNAmychis14-313, pcDNAmychis14-396 (0,8 ug) junto con el vector de Stratagene pNFB-gen indicador de Luc (0,1 ug) y el vector de Clontech EGFP (0,1 ug), se transfectaron mediante el uso de 6 ul de Lipofectamina y 200 ul de Optimem en las placas de 6 pocillos (con 800 ul de Optimem reciente/pocillo). La transfección se incubó durante 4 hr a 37ºC y después las placas se rellenaron con medio completo (3 ml).

A las 24, 48 y 72 horas tras la transfección se hicieron lisados mediante el uso de 200 ul de una disolución Tampón de Lisis Indicador 1X (E397A-Promega). Los lisados se incubaron durante 20 minutos en hielo, se agitaron en vórtex, después se centrifugaron a 12.000 rpm durante 5 minutos. El

sobrenadante se usó para determinar la actividad de luciferasa siguiendo las instrucciones del equipo de pNFB-gen indicador de luc de Stratagene.

Para preparar líneas celulares estables, se dividieron duplicados los cultivos de 48 hr anteriores a una proporción 1:100 en medios de cultivo completos junto con G418 para la selección de las células que incorporaban los plásmidos en su ADN. Se aislaron los clones de una única célula y se transfirieron a placas de cultivo de 48 pocillos para cultivarlas. Los clones se eligieron según su actividad en el ensayo con indicador de luciferasa de NFB.

Se midió la actividad de luciferasa de los lisados celulares de todas las líneas células infectadas de forma transitoria. Se añadieron 20 µl de lisado a una placa blanca de 96 pocillos de fondo redondo Serocluster de Costar (nº 3789). Se añadieron 100 µl de reactivo de luciferasa (Promega E1501) directamente antes de leer la muestra en un lector 1450 Microbeta Walko Jet.

El análisis de los resultados a las 24 horas, 48 horas, 72 horas identificó que las 48 horas era el momento más óptimo para determinar la actividad. El control positivo para el ensayo fue una estimulación con factor de necrosis tumoral (α) (TNFα) de 24 horas de las células un día posttransfección con el vector pcDNA3.1mychis. En las células HEK293, las transfecciones transitorias con cADNs de pcDNAmychis 7, pcDNAmychis14 de tamaños completos demostraron un recuento en el luminómetro por segundo a ~3,1 veces y ~2,1 veces respectivamente, por encima del vector solo (Figura 5) y en las células COS-7 (Figura 6) el clon de tamaño completo pcDNAmychis 7 proporcionó una señal de 2,4 veces y el pcDNAmychis14 de 2,3 veces mayor en el recuento en el luminómetro por segundo por encima del vector solo.

Los mutantes de deleción (pcDNAmychis 7-313, pcDNAmychis 7-396, pcDNAmychis 14-313 y pcDNAmychis 14-396) mostraron una actividad reducida. Los ensayos llevados a cabo en días alternos mediante el uso del intervalo de 48 horas proporcionaron variabilidad en las respuestas, oscilando entre un incremento de 2-5 veces para el clon 7 (tamaño completo) y 2-4 veces para el clon 14.

Ejemplo 5 -Identificación de Tejidos que Expresan o que Contienen Proteínas NFIF

Para determinar qué tejidos humanos expresan las proteínas NFIF, se analizó una transferencia de Northern prefabricada de Clontech (Human 12 Lane nº 7780-1) con sondas marcadas con p32 realizadas con cebadores aleatorios preparadas a partir de NFIF. Los resultados se pueden observar en la Figura 8. Tal como ilustra la Figura 8, la expresión de NFIF es evidente en particular en el músculo esquelético, riñón, hígado y tejido placentario.

Para determinar si la proteína NFIF estaba asociada a patologías que incluyen la aterosclerosis que implican inflamación, y para identificar los tejidos que se pueden tratar mediante el uso de los métodos descritos en la presente memoria, se llevó a cabo un estudio inmunocitoquímico mediante el uso de un anticuerpo monoclonal de conejo denominado 99-06 dirigido contra un antígeno peptídico (SKGANASNPGPFGDV) (SEQ ID NO.: 5) derivado de los residuos 65 a 79 de la proteína NFIF. El péptido se sintetizó en una escala de 0,25 mmoles mediante el uso de la metodología en fase sólida con un esquema de protección con FMOC (9-fluorenilmetiloxicarbonilo) junto con la química de activación mediante HOBT/HBTU (Fields et al., Peptide Research, 4:95-101 (1991)). Se usó un sintetizador de péptidos Applied Biosystems 433 que funcionaba con un ciclo de acoplamiento Fast-Moc de Applied Biosystems para la síntesis del péptido.

El péptido se escindió durante 1,5 horas a temperatura ambiente mediante el uso de un reactivo de escisión de un 82,5% de ácido trifluoroacético (TFA), 5% de fenol, 5% de H2O, 5% de tioanisol, y 2,5% de etanoditiol (King et al., Intl. J. Peptide and Protein Research, 36, 255-266 (1990)). Tras la escisión, el péptido se precipitó con éter terc-butílico; se lavó, después se secó durante 1 hora a vacío. El péptido se solubilizó después en 0,1% de TFA/agua y se purificó mediante el uso de HPLC en fase inversa en C18. Se alcanzó un nivel de pureza de >95% para el péptido, junto con datos correctos de pesos moleculares mediante MALDI-TOF.

Se conjugaron 10-30 mg de péptido purificado a hemocianina de lapa californiana mediante el uso de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC). La preparación se dializó exhaustivamente con PBS a 4ºC. La preparación de hapteno/vehículo se mezcló 1:1 con adyuvante completo de Freund y se usó para inyectarla en conejos para la producción de antisueros contra el péptido. Se usó el péptido de 15 residuos para preparar anticuerpos anti-NFIF en conejos mediante el uso de métodos habituales conocidos en la técnica. Se inmunizaron conejos mediante inyección subcutánea con una emulsión de antígeno/adyuvante completo de Freund (50% de disolución de antígeno/50% de adyuvante completo de Freund). Se usó el adyuvante completo de Freund (CFA) para la inmunización inicial debido a que este adyuvante se ha usado con mucho éxito en la producción de respuestas de anticuerpos hacia una amplia diversidad de antígenos proteicos y peptídicos, y la incidencia de reacciones adversas es mínima o inexistente. El calendario de inyecciones descrito más adelante se ha optimizado para el uso con el adyuvante de Freund. El área de inyección se afeitó para permitir la estimación visual de cualquier reacción a la emulsión. Antes de la inyección, los sitios de inyección se limpiaron con una disolución de limpieza de Nolvasan diluida. Los sitios de inyección estaban en la espalda, comenzando entre los omóplatos. Los sitios de inyección se separaron ampliamente y se mantuvieron cerca de la línea media para reducir la posibilidad de que el animal se rascara en los sitios de inyección. En general, se inyectaron 100 µl que contenían 20 µg de antígeno en 5 sitios subcutáneos por conejo para un total de 100 µg/conejo. Posteriormente, se administraron inyecciones de refuerzo a intervalos de 4 semanas con una emulsión de antígeno/adyuvante incompleto de Freund. Después de seis semanas, se recogieron 530 mls de sangre para determinar el título del anticuerpo. Si el título del anticuerpo no fue suficiente, se administraron inyecciones de refuerzo adicionales a intervalos semanales y se recogieron muestras de sangre cada 2-4 semanas. Antes de cada inyección de antígeno, se estudió el estado de los sitios de inyección previos en busca de reacciones adversas. Los animales que dieron una respuesta de anticuerpos positiva se mantuvieron y se reforzaron, y se les extrajo sangre periódicamente para generar una gran reserva de antisueros.

Se llevaron a cabo experimentos de titulación de anticuerpos con el anticuerpo 99-06 para establecer las concentraciones que producían una señal de fondo mínima y una detección máxima de la señal. Un estudio de diluciones en serie demostró que la proporción más alta de señal respecto de ruido era a una dilución de 1:500 y 1:1.000, y los portaobjetos incubados con estas concentraciones de anticuerpo fueron analizados por los patólogos. El anticuerpo 99-06 se usó como anticuerpo primario, y el sistema de detección principal consistió en un equipo Vector ABC-AP (AK5002) con un equipo de sustrato Vector Red que produjo un depósito rojo-fucsia (SK-5100). Los tejidos también se tiñeron con un anticuerpo de control positivo (CD31) dirigido contra el antígeno leucocitario humano (Stockinger et al., J. Immunol., 145(11):3889-97 (1990)) para asegurar que los antígenos del tejido estaban conservados y eran accesibles para el análisis inmunocitoquímico. Además de las muestras de arterias coronarias, los tejidos adicionales que se tiñeron y se sometieron a formación de imágenes durante la fase II de este estudio fueron bazo normal, timo, y nódulo linfático. La tinción se llevó a cabo en el bazo, el timo y el nódulo linfático para ayudar a la identificación de los subgrupos inflamatorios de células que expresaban esta proteína.

Dentro del bazo, timo y nódulo linfático, el anticuerpo 99-06 mostró una tinción positiva intensa dentro de los linfocitos de la vaina linfática periarterial, cordón de Billroth, linfocitos tímicos corticales, células de los centros germinales del nódulo linfático, y dentro del endotelio vascular y del músculo liso. Otros tipos celulares que se tiñeron positivamente de forma moderada a intensa con este anticuerpo incluyeron las células de Schwann y los cardiomiocitos. La señal fue predominantemente nuclear en los tipos celulares examinados, excepto por la granularidad citoplásmica que se observó dentro de las células musculares lisas, y en los macrófagos que estaban llenos de restos celulares en regiones de placas u trombos en formación.

Dentro de las arterias coronarias normales, el anticuerpo fue en gran medida negativo en el endotelio de la túnica íntima excepto por células ocasionales que mostraban una señal nuclear, y células musculares lisas mioíntimas que mostraban señales nucleares débiles. Dentro de la túnica media, el anticuerpo fue moderadamente positivo uniformemente dentro de las células musculares lisas. En la adventicia, el endotelio, el músculo liso vascular y las células inflamatorias fueron moderadamente positivas para la tinción. Las láminas elásticas internas y externas fueron negativas para la tinción.

Dentro de las muestras de aterosclerosis mínima, el endotelio mostró solamente señales débiles ocasionales incluso en las que recubrían el ateroma. Dentro del ateroma superficial, las células musculares lisas mioíntimas mostraron solamente señales débiles. En las regiones más profundas del ateroma, las formas fibroblásticas en proliferación y los macrófagos espumosos mostraron un nivel incrementado de tinción. En ciertas muestras que mostraron placas que contenían colesterol y áreas de calcificación, las células musculares lisas y los histiocitos espumosos que rodeaban las placas cargadas de colesterol y de material calcificado mostraron niveles incrementados de tinción.

5

10

15

20

25

30

En las muestras de aterosclerosis moderada, el endotelio, tanto en la túnica íntima como en las áreas de neovascularización, mostró una tinción incrementada con el anticuerpo 99-06. Las células inflamatorias marginadas a lo largo o subyacentes al endotelio fueron intensamente positivas a la tinción. El endotelio que tapizaba los vasos nuevos fue moderadamente a intensamente positivo para la tinción, y en ciertas áreas, los miofibroblastos subendoteliales fueron menos positivos que el endotelio asociado. En general, las formas fibroblásticas de las células mioíntimas fueron mucho menos positivas que las formas en proliferación o histiocíticas de las células musculares lisas. Además, los macrófagos asociados a colesterol, calcificación, o macrófagos espumosos dentro las placas mostraron un nivel incrementado de tinción. El músculo liso de la túnica media fue moderadamente positivo de manera bastante uniforme dentro de todas las muestras en las que el medio estaba intacto, y el músculo liso dentro de los vasos adventicios fue positivo de manera similar.

En los casos de aterosclerosis grave, gran parte del endotelio que tapizaba la túnica íntima estaba desnuda, o el endotelio residual era débilmente a moderadamente positivo para la tinción. El infiltrado inflamatorio asociado a las placas mostró una tinción positiva muy intensa dentro de los macrófagos y los linfocitos, lo que incluyó las regiones de neovascularización. También se observó una tinción incrementada dentro de los macrófagos y de los linfocitos adyacentes o que rodeaban las calcificaciones y el colesterol y dentro de las áreas de trombos en formación. El endotelio que tapizaba los nuevos vasos fue intensamente positivo en estas áreas. De nuevo se observó una intensidad de señal incrementada dentro de las formas histiocíticas y en proliferación en comparación con las formas fibroblásticas de las células musculares lisas. En estos casos, las células inflamatorias tales como un subgrupo de linfocitos, células plasmáticas y macrófagos dentro de la adventicia fueron también intensamente positivas para la tinción.

En las áreas en una etapa tardía de la aterosclerosis grave con una inflamación mínima y placas inactivas, hubo mucha menos tinción. En estas muestras, el endotelio fue positivo menos intensamente para la tinción, aunque los linfocitos y macrófagos residuales que rodeaban el material calcificado mostraron una tinción positiva.

Material Biológico Útil en la Práctica de la Invención

Se ha realizado un depósito de factor inductor de NFB humano 7a (NFIF-7a) clonado a partir de una biblioteca de cADN de células musculares lisas vasculares humanas subclonada en un vector plasmídico pCR2.1, y un depósito de factor inductor de NFB humano 14b (NFIF-146) clonado a partir de una biblioteca de cADN de células musculares lisas vasculares humanas subclonada en un vector plasmídico pCR2.1 en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, tal como se indica a continuación.

Cepa/plásmido

ATCC Nº Fecha de depósito

Factor inductor de NfB humano 14B

clonado a partir de una biblioteca de cADN

de células musculares lisas vasculares

humanas subclonada en el vector pCR2.1:

NFIF14B

PTA-1596 29 de marzo, 2000

Factor inductor de NfB humano 7A clonado a partir de una biblioteca de cADN de células musculares lisas vasculares humanas subclonada en el vector pCR2.1: NFIF7A PTA-1597 29 de marzo, 2000

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Aventis Pharmaceuticals Inc

<120> FACTOR INDUCTOR DEL FACTOR B

<130> 40/604/P/EP

<140> 01920925.3 (PCT/US01/10719)

<141> 31-03-2000

<160> 10

<170> PatentIn Ver. 2.0

<210> 1

<211> 453

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

imagen1

35

imagen1

36

imagen1

<210> 2

<211> 364

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

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37

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38

imagen1

<210> 3

<211> 1362

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 3

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39

imagen1

<210> 4

<211> 1095

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 4

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40

imagen1

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

imagen1

<210> 6

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Basada en NFIF-14b y NFIF-7a pero con la secuencia Kozak 5' a ATG

<400> 6 tccaccatgg cgctggtgcg cgcactc 27

<210> 7

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Basada en NFIF-14b y NFIF-7a pero con un sitio ECORV añadido en el extremo

<400> 7 gtcgaaatat atttcgtgtt aatgctatag gtc 33

<210> 8

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Basada en NFIF-14b y NFIF-7a pero con la secuencia Kozak 5' a ATG

<400> 8 gctccaccat gatatggaca ggggatag 28

<210> 9

41

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificia: Basada en NFIF-14b y NFIF-7a pero con un sitio ECORV añadido en el extremo

<400> 9 gccactgtgc tggatatcgt aattaac 27

<210> 10

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Basada en NFIF-14b y NFIF-7a pero con la secuencia Kozak 5' a ATG

<400> 10 gctccaccat gacaaccacc atccagagtc 30

42

Claims (32)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un ácido nucleico que codifica el polipéptido NFIF (factor inductor del factor nuclear)-14b que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

2. 2.

   Un ácido nucleico que codifica el polipéptido NFIF (factor inductor del factor nuclear)-7a que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

3. 3.

   El ácido nucleico de la reivindicación 1, en el que dicho ácido nucleico es un cADN.

4. 4.

   El ácido nucleico de la reivindicación 2, en el que dicho ácido nucleico es un cADN.

5. 5.

   Un polipéptido NFIF (factor inductor del factor nuclear)-14b aislado y purificado que induce NFB y que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

6. 6.

   Un polipéptido NFIF (factor inductor del factor nuclear)-7a aislado y purificado que induce NFB y que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

7. 7.

   Un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de la reivindicación 1 unido de manera operable a una secuencia de control.

8. 8.

   El vector de expresión de la reivindicación 7, en el que dicho vector de expresión se selecciona del grupo que consiste en vectores retrovirales, vectores adenovirales, vectores de virus adeno-asociados, vectores herpesvirales, y vectores de ADN desnudo.

9. 9.

   Un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de la reivindicación 2 unido de manera operable a una secuencia de control.

10. 10.

    El vector de expresión de la reivindicación 9, en el que dicho vector de expresión se selecciona del grupo que consiste en vectores retrovirales, vectores adenovirales, vectores de virus adeno-asociados, vectores herpesvirales, y vectores de ADN desnudo.

11. 11.

    Una composición que comprende un polipéptido NFIF (factor inductor del factor nuclear)-14b en el que dicho polipéptido induce NFB y comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

12. 12.

    Una composición que comprende un polipéptido NFIF (factor inductor del factor nuclear)-7a en el que dicho polipéptido induce NFB y comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

13. 13.

    Una composición que comprende un ácido nucleico antisentido complementario a un ácido nucleico que codifica un polipéptido NFIF (factor inductor del factor nuclear)-14b y/o NFIF-7a seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y 2.

14. 14.

    Una composición que comprende un anticuerpo neutralizante que se une al polipéptido NFIF (factor inductor del factor nuclear)-14b y/o NFIF-7a seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y 2 y que disminuye su actividad.

15. 15.

    Una composición que comprende una ribozima que corta el ARN que codifica un polipéptido NFIF (factor inductor del factor nuclear)-14b y/o NFIF-7a seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y 2.

16. 16.

    Un método para determinar si un compuesto de ensayo es eficaz en la inhibición de la actividad de NFIF (factor inductor del factor nuclear)-14b basado en la expresión de un gen indicador regulado por NFKB que comprende:

    43

    (A)

    comparar el nivel de expresión del gen regulado por NFB en una primera muestra que comprende: (1) una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 1; (2) dicho gen indicador regulado por NFB; y (3) dicho compuesto de ensayo con el nivel de expresión del gen indicador regulado por NFB en una segunda muestra que comprende (4) una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 1; y (5) dicho gen indicador regulado por NFB; y

    (B)

    determinar si la expresión de dicho gen indicador regulado por NFB es menor en dicha primera muestra respecto de dicha segunda muestra.

17. 17. Un método para determinar si un compuesto de ensayo es eficaz en la inhibición de la actividad de NFIF (factor inductor del factor nuclear)-7a basado en la expresión de un gen indicador regulado por NFB que comprende:

    (A)

    comparar el nivel de expresión del gen regulado por NFB en una primera muestra que comprende: (1) una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 2; (2) dicho gen indicador regulado por NFB; y (3) dicho compuesto de ensayo con el nivel de expresión del gen indicador regulado por NFB en una segunda muestra que comprende: (4) una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 2; y (5) dicho gen indicador regulado por NFB; y

    (B)

    determinar si la expresión de dicho gen indicador regulado por NFB es menor en dicha primera muestra respecto de dicha segunda muestra.

18. 18. Un método para identificar si un compuesto de ensayo puede estimular la actividad de NFIF (factor inductor del factor nuclear)-14b basado en la expresión de un gen indicador regulado por NFB que comprende:

    (A)

    comparar el nivel de expresión del gen regulado por NFB en una primera muestra que comprende (1) una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 1; (2) dicho gen indicador regulado por NFB; y (3) dicho compuesto de ensayo con el nivel de expresión del gen indicador regulado por NFB en una segunda muestra que comprende: (4) una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 1; y (5) dicho gen indicador regulado por NFB; y

    (B)

    determinar si la expresión de dicho gen indicador regulado por NFB es mayor en dicha primera muestra respecto de dicha segunda muestra.

19. 19. Un método para identificar compuestos que estimulan la actividad de NFIF (factor inductor del factor nuclear)-7a basado en la expresión de un gen indicador regulado por NFB que comprende:

    (A)

    comparar el nivel de expresión del gen regulado por NFB en una primera muestra que comprende: (1) una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 2; (2) dicho gen indicador regulado por NFB; y (3) dicho compuesto de ensayo con el nivel de expresión del gen indicador regulado por NFB en una segunda muestra que comprende: (4) una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 2; y (5) dicho gen indicador regulado por NFB; y

    (B)

    determinar si la expresión de dicho gen indicador regulado por NFB es mayor en dicha primera muestra respecto de dicha segunda muestra.

20. 20.

    El uso de un polipéptido NFIF (factor inductor del factor nuclear) aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento y/o la prevención de una respuesta inflamatoria regulada por NFB.

21. 21.

    El uso de un ácido nucleico que codifica un polipéptido NFIF (factor inductor del factor nuclear) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento y/o la prevención de una respuesta inflamatoria regulada por NFB.

22. 22.

    El uso de un vector recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido NFIF (factor inductor del factor nuclear) que comprende una secuencia

    44

    de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento y/o la prevención de una respuesta inflamatoria regulada por NFB.

23. 23.

    El uso de un vector viral recombinante deficiente que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido NFIF (factor inductor del factor nuclear) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento y/o la prevención de una respuesta inflamatoria regulada por NFB.

24. 24.

    El uso de un polipéptido NFIF (factor inductor del factor nuclear) aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento y/o la prevención de una respuesta inflamatoria regulada por NFB.

25. 25.

    El uso de un ácido nucleico que codifica un polipéptido NFIF (factor inductor del factor nuclear) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento y/o la prevención de una respuesta inflamatoria regulada por NFB.

26. 26.

    El uso de un vector recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido NFIF (factor inductor del factor nuclear) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento y/o la prevención de una respuesta inflamatoria regulada por NFB.

27. 27.

    El uso de un vector viral recombinante deficiente que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido NFIF (factor inductor del factor nuclear) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento y/o la prevención de una respuesta inflamatoria regulada por NFB.

28. 28. Una célula cultivada que comprende el vector de la reivindicación 8 ó 10.

29. 29.

    Una célula cultivada transfectada con el vector de la reivindicación 8 ó 10, en la que la célula expresa dicho polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ó 2.

30. 30.

    Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una secuencia de ácido nucleico expresable aislada que codifica una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ó 2, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

31. 31.

    Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un vector recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico expresable que codifica una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ó 2, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

32. 32.

    Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un vector viral recombinante deficiente que comprende una secuencia de ácido nucleico expresable que codifica una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ó 2, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.