ES2331790T3 - Plantas resistentes a los insectos y metodos para la produccion de las mismas. - Google Patents
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Abstract
Una secuencia de DNA que comprende una región codificante que codifica una proteína Cry1Ab modificada que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:
Description
Plantas resistentes a los insectos y métodos
para la producción de las mismas.
La presente invención se refiere a una secuencia
de DNA que codifica una proteína Cry1Ab modificada que tiene
actividad insecticida. La invención se refiere adicionalmente a un
método para producir plantas resistentes a los insectos por
introducción en el genoma de las plantas de un DNA extraño que
comprende dicha secuencia codificante cry1Ab modificada. La
invención se refiere adicionalmente a plantas o partes de las mismas
que comprenden en su genoma la secuencia codificante cry1Ab
modificada de la presente invención.
La bacteria Gram-positiva del
suelo Bacillus thuringiensis es bien conocida por su
producción de proteínas o delta-endotoxinas, que
son tóxicas para una diversidad de larvas de lepidópteros,
coleópteros, y dípteros. Se ha demostrado que diferentes cepas de
B. thuringiensis producen diferentes proteínas insecticidas
cristalinas, que son específicamente tóxicas para ciertas especies
de insectos (revisado por Höfte y Whiteley, 1989; Schnepf et
al., 1998).
La toxicidad específica de las toxinas
insecticidas producidas por B. thuringiensis para insectos
diana y su carencia de toxicidad para plantas y otros organismos ha
hecho que composiciones que comprenden diferentes cepas de Bt sean
el producto de elección para el control biológico de plagas
agrícolas de insectos. Varios de los genes que codifican las
proteínas cristalinas han sido clonados y sus secuencias de DNA han
sido determinadas (Höfte y Whiteley, 1989; Crickmore et al.,
1995). Esto ha conducido a la modificación por ingeniería genética
de genes modificados que codifican delta-endotoxinas
y al desarrollo de plantas que expresan estos genes de
delta-endotoxina que las hacen resistentes a los
insectos.
La familia de genes cry1 codifica las
proteínas cristalinas CryI que son fundamentalmente activas contra
plagas de lepidópteros. La forma de pro-toxina de
las delta-endotoxinas CryI está constituida por una
parte de pro-toxina C-terminal que
no es tóxica y se cree es importante para la formación del cristal
(Arvidson et al., 1989). La mitad amino de la protoxina
comprende el segmento de toxina activo de la proteína CryI. Se han
identificado ulteriormente diferentes dominios en la toxina activa
que están implicados en distintos aspectos del efecto de toxicidad
(Grochulski et al., 1995). Sin embargo, estas funciones
parecen ser dependientes de la delta-endotoxina
examinada.
Se han realizado esfuerzos significativos en la
modificación de los genes cry1 a fin de mejorar los niveles
de expresión en plantas reteniendo al mismo tiempo al menos su
toxicidad para los insectos diana. La modificación de los genes
cryIAb y cryIAc para eliminar las señales supuestas de
poliadenilación en las plantas y los motivos de inestabilidad (sin
alterar las secuencias de aminoácidos codificadas) dio como
resultado una resistencia incrementada de las plantas transformadas
con estas secuencias (van der Salm et al., 1994).
Modificaciones del gen cry1Ab han sido descritas en los documentos
US 6320100, US 6180774 y US 6114608. US 5500365 describe el modo en
que la modificación en la región 240 de la región codificante de a,
gen cry1Ab a fin de eliminar señales supuestas de plantas
tiene una
importancia significativa para aumentar los niveles de expresión y con ello la toxicidad de la toxina Cry en las plantas.
importancia significativa para aumentar los niveles de expresión y con ello la toxicidad de la toxina Cry en las plantas.
La presente invención se refiere a una nueva
proteína CryIAb modificada y secuencias de DNA que codifican esta
proteína que pueden utilizarse para modificar por ingeniería
genética la resistencia a los insectos en las plantas. De modo más
particular, se encontró que esta secuencia modificada, a pesar de
tener una región nativa 240, asegura una expresión suficientemente
alta en las células de las plantas para conferir resistencia a los
insectos a la planta o tejido de la planta en que se expresa.
La presente invención se refiere a una secuencia
codificante cryIAb modificada, que codifica la (sic) en donde la
proteína CryIAb modificada de SEQ ID NO: 1, que es una proteína
insecticida en la cual la secuencia de DNA que codifica la
secuencia CryIAb modificada comprende la secuencia de SEQ ID NO:
2.
La invención se refiere adicionalmente a genes
quiméricos que comprenden la secuencia de DNA cryIAb modificada de
la presente invención bajo el control de un promotor expresable en
plantas.
La invención se refiere adicionalmente a
vectores recombinantes que comprenden los genes quiméricos de la
invención y a la producción de plantas transgénicas utilizando estos
vectores recombinantes.
La invención se refiere adicionalmente a plantas
y células, semillas o tejidos de las mismas, que comprenden en su
genoma un DNA extraño que comprende la secuencia de DNA cryIAb
modificada de la presente invención bajo el control de un promotor
expresable en plantas, a fin de proteger dichas plantas contra
insectos lepidópteros. La invención se refiere también a un método
para modificar por ingeniería genética la resistencia de las plantas
a los insectos, a fin de proteger dichas plantas contra insectos
lepidópteros por introducción mediante transformación, en el genoma
de la planta, de un DNA extraño que comprende la secuencia
codificante cry1Ab modificada de la presente invención bajo el
control de un promotor expresable en plantas.
De acuerdo con una realización particular de la
presente invención, la secuencia codificante Cry1Ab modificada es
particularmente adecuada para modificar por ingeniería genética la
resistencia a los insectos en cosechas agrícolas tales como maíz y
algodón. De modo muy particular, la expresión de la proteína Cry1Ab
modificada confiere resistencia a las plagas de lepidópteros de
estas plantas. De modo más particular, estas plagas incluyen, pero
sin carácter limitante, plagas importantes de lepidópteros del maíz,
el algodón y el arroz, tales como Ostrinia nubilalis
(perforador del maíz europeo o ECB), Sesamia nonagrioides
(perforador Mediterráneo del tallo), Sesamia inferens
(perforador rosa del tallo), Helicoverpa zea (oruga de las
mazorcas del maíz, oruga de las cápsulas del algodón),
Helicoverpa armigera (oruga del algodón americano),
Heliothis virescens (oruga de los brotes del tabaco),
Scirpophaga incertulas (perforador amarillo de los tallos) y
Cnaphalocrocis medinalis (doblador de las hojas del arroz).
Se proporciona también en esta memoria el uso del gen quimérico
anterior para obtener plantas resistentes a los insectos.
El término "gen" como se utiliza en esta
memoria hace referencia a cualquier secuencia de DNA que comprende
varios fragmentos de DNA enlazados operativamente tales como una
región promotora, una región 5' no traducida (la 5'UTR), una región
codificante, y una región 3' no traducida (3'UTR) que comprende un
sitio de poliadenilación. Un gen puede incluir fragmentos
adicionales de DNA tales como, por ejemplo, intrones. Si bien se
requieren una región promotora y una región codificante en un gen
utilizado para transformación de plantas en la presente invención,
la 3'UTR que comprende un sitio de poliadenilación no precisa estar
presente en el gen transferido propiamente dicho, sino que puede
recuperarse en la secuencia de DNA de la planta aguas arriba después
de la inserción de un gen que no contenga una 3'UTR que comprenda
un sitio de poliadenilación.
El término "quimérico", cuando se refiere a
un gen o secuencia de DNA, se utiliza para hacer referencia al
hecho de que el gen o la secuencia de DNA comprende al menos dos
fragmentos de DNA funcionalmente relevantes (tales como promotor,
5'UTR, región codificante, 3'UTR, intrón) que no están asociados
naturalmente uno con otro y/o proceden, por ejemplo, de fuentes
diferentes. "Extraño", haciendo referencia a un gen o secuencia
de DNA con respecto a una especie de planta se utiliza para indicar
que el gen o la secuencia de DNA no se encuentra naturalmente en
dicha planta, o no se encuentra naturalmente en dicho locus genético
en dicha planta. El término "DNA extraño" se utilizará en esta
memoria para hacer referencia a una secuencia de DNA que se ha
incorporado en el genoma de una planta como resultado de
transformación.
Un genoma de una planta, tejido de planta o
célula de planta, como se utiliza en esta memoria, hace referencia
a cualquier material genético en la planta, tejido de la planta o
célula de la planta, e incluye el genoma tanto nuclear como
plastídico y mitocondrial.
Un "fragmento" o "truncación" de una
molécula de DNA o secuencia de proteína como se utiliza en esta
memoria, hace referencia a una porción de la secuencia original de
DNA o proteína (ácido nucleico o aminoácido) a que se hace
referencia, o a una versión sintética de la misma (tal como una
secuencia que está adaptada para expresión óptima en plantas), que
puede variar en longitud, pero que es suficiente para asegurar que
la proteína (codificada) es una toxina de insecto. Una
"variante" de una secuencia se utiliza en esta memoria para
indicar una molécula de DNA o proteína cuya secuencia (ácido
nucleico o aminoácido) es esencialmente idéntica a la secuencia a
la que se refiere el término. Secuencias que son "esencialmente
idénticas" significa que cuando se alinean dos secuencias, el
porcentaje de identidad de secuencia, es decir el número de
posiciones con nucleótidos o aminoácidos idénticos dividido por el
número de nucleótidos o aminoácidos en la secuencia más corta, es
mayor que 70%, preferiblemente mayor que 85%, más preferiblemente
mayor que 90%, y de modo especialmente preferible mayor que 95%,
siendo muy preferiblemente entre 96 y 100%. La alineación de dos
secuencias de nucleótidos se efectúa por el algoritmo descrito por
Wilbur y Lipmann (1983) utilizando un tamaño de ventana de 20
nucleótidos, una longitud de palabra de 4 nucleótidos, y una
penalidad por laguna de 4.
Un "promotor expresable en plantas", como
se utiliza en esta memoria, hace referencia a un promotor que
asegura la expresión de una secuencia codificante a la que está
enlazado el mismo en una célula de planta. Ejemplos de tales
promotores son bien conocidos en la técnica. Un promotor expresable
en plantas puede ser un promotor constitutivo. Ejemplos de
promotores que dirigen expresión constitutiva en plantas se conocen
en la técnica e incluyen el promotor 35S del Virus del Mosaico de
la Coliflor, el promotor nopalina-sintasa (NOS), el
promotor ubi (Christensen et al. 1992), el promotor del gen
GOS2 del arroz (de Pater et al., 1992). Alternativamente, un
promotor expresable en plantas puede ser un promotor específico de
tejido, es decir, un promotor que dirige un nivel de expresión
mayor de una secuencia codificante (como puede medirse por ensayos
convencionales de RNA) en algunos tejidos de la planta, v.g. en los
tejidos verdes (tal como el promotor de la carboxilasa PEP) que en
otros tejidos de la planta. Alternativamente, un promotor expresable
en plantas puede ser un promotor inducible por lesión. Un promotor
"inducible por lesión" o un promotor que dirige un patrón de
expresión que es inducible por lesión como se utiliza en esta
memoria, significa que después de una lesión en la planta, sea
mecánicamente o por alimentación de los insectos, la expresión de la
secuencia codificante bajo el control del promotor se incrementa
significativamente. Ejemplos de promotores inducibles por lesión
incluyen el gen inhibidor de proteinasa de la patata y el tomate
(pin1 y pin2) (Johnson et al., 1989) y el promotor del gen
inhibidor de la proteinasa del maíz (MPI) (Cordero et al.
1994).
El "promotor TR2'" como se utiliza en esta
memoria, se refiere a cualquier promotor que comprenda la parte
funcional TR2' (o manopina-sintasa, abreviada como
mas) del elemento promotor dual TR1'-TR2' de
Agrobacterium (Velten et al. 1984; Langridge et
al. 1989). Así, éste puede comprender el elemento TR2' solo o en
combinación con la totalidad o parte del elemento divergente TR1'
(Guevara-García et al., 1998) u otros
elementos (reguladores), con inclusión pero sin carácter limitante
de regiones intensificadoras, intrones y análogos, con tal que se
retengan sustancialmente las características de inducción de lesión
en las monocotiledóneas, particularmente en el maíz, de acuerdo con
la presente invención. En una realización preferida de esta
invención, la transcripción se dirige desde la región promotora
TR2' (y la secuencia codificante se encuentra por tanto aguas abajo
de la secuencia promotora TR2'), incluso si se utiliza el promotor
dual TR1'-TR2' (o cualquier parte del mismo que
retenga el elemento promotor Tor2').
"Insecticida" se utiliza en esta memoria
para significar tóxico para los insectos que son plagas de las
cosechas. De modo más particular, en el contexto de la presente
invención, insectos diana son las plagas tales como, pero sin
carácter limitante, plagas importantes de lepidópteros, tales como
Ostrinia nubilalis (perforador del maíz europeo o ECB),
Sesamia nonagrioides (perforador Mediterráneo del tallo),
Helicoverpa zea (oruga de las mazorcas del maíz, oruga de
las cápsulas del algodón), Helicoverpa armigera (oruga del
algodón americano), y Heliothis virescens (oruga de los
brotes del tabaco).
En una realización preferida de la presente
invención, el DNA codificante de una proteína insecticida cristalina
(ICP) es una secuencia de DNA cry1Ab modificada que codifica una
ICP que corresponde a la secuencia de SEQ ID NO: 1, en donde la
secuencia codificante cry1Ab modificada comprende la secuencia de
SEQ ID NO: 2. La secuencia de DNA utilizada para transformación de
plantas, particularmente maíz, algodón o arroz, de acuerdo con la
presente invención, puede comprender también otros elementos además
de una región codificante que codifica la proteína Cry1Ab
modificada de la invención, tal como una región codificante que
codifica un péptido de tránsito, una región codificante que
codifica una proteína marcadora seleccionable o una proteína que
confiere resistencia a un
herbicida.
herbicida.
En una realización preferida de la invención, la
proteína Cry1Ab modificada es tóxica para plagas importantes de
lepidópteros de cosechas tales como maíz, algodón y arroz. Las
plantas de la presente invención, comprendiendo la anterior un DNA
extraño en su genoma que comprende el DNA arriba indicado que
codifica una proteína Cry1Ab modificada se protegen contra estas
plagas por expresión de una cantidad controladora de esta proteína.
Por controladora se entiende una cantidad tóxica (letal) o
combativa (subletal). Al mismo tiempo, las plantas deben ser
morfológicamente normales y pueden cultivarse de la manera usual
para consumo y/o producción de productos. Adicionalmente, dichas
plantas deberían obviar sustancialmente la necesidad de insecticidas
químicos o biológicos (para los insectos direccionados por la
proteína Cry1Ab modificada).
El nivel de expresión de una ICP en material de
plantas puede determinarse de varias maneras descritas en la
técnica, por ejemplo por cuantificación del mRNA codificante de la
proteína insecticida producida en el tejido utilizando iniciadores
específicos (tales como los descritos por Cornelissen &
Vandewiele, 1989) o detección específica directa de la cantidad de
proteína insecticida producida, v.g., por métodos de detección
inmunológicos. Más particularmente, de acuerdo con la presente
invención el nivel de expresión de una proteína Cry1Ab modificada
se representa como el porcentaje de proteína insecticida soluble
como se determina por ELISA inmunoespecífico como se describe en
esta memoria referido a la cantidad total de proteína soluble (como
se determina, v.g., por análisis Bradford (Bradford, 1976)). Un
ELISA preferido en la presente invención es un ELISA sándwich
(Clark et al., 1986).
Pueden utilizarse diferentes ensayos para medir
el efecto insecticida o la eficacia de la expresión de ICP en la
planta. De acuerdo con la presente invención, los insectos diana son
las plagas principales de lepidópteros de cosechas agrícolas tales
como maíz, algodón y arroz, más particularmente el Perforador del
Maíz Europeo (ECB) y Sesamia nonagrioides (SMG) en el maíz,
la oruga de las cápsulas del algodón (CBW) y la oruga de los brotes
del tabaco (TBW) en el algodón, así como el perforador amarillo de
los tallos, el perforador rosa de los tallos y el doblador de las
hojas del arroz en el arroz. La toxicidad de una ICP producida en
una planta de maíz en el caso de ECB puede ensayarse in
vitro por testado de la proteína extraída de la planta en
bioensayos de alimentación con larvas de ECB o por registro de la
mortalidad de las larvas distribuidas sobre material de hojas de
plantas transformadas en una cápsula Petri (ambos ensayos tal como
se describen por Jansens et al., 1997), o en plantas
aisladas en probetas individuales. En el caso del perforador del
maíz europeo de la primera camada en campo (ECB1), la infestación
se evalúa basándose en las tasas de deterioro de las hojas
(Guthrie, 1989) mientras que la evaluación del número total de
túneles en los tallos por planta y la longitud de los túneles en
los tallos son indicativas del deterioro de alimentación en los
tallos de la segunda camada (ECB2).
La eficacia de la ICP producida en las plantas
de algodón transformadas con un gen cry1Ab modificado puede medirse
análogamente utilizando ensayos in vitro y/o in
vivo. La toxicidad del tejido de planta transformado para las
larvas CBW puede medirse por alimentación de las larvas CBW en
cuadros (flores sin abrir), hojas o yemas terminales y ensayo del
peso de las larvas supervivientes. En el campo, las plantas se
infestan artificialmente con larvas CBW recién nacidas y evaluando
el deterioro de las hojas, yemas terminales, flores sin abrir,
flores blancas y cápsulas a intervalos regulares (como se describe
en esta memoria). Se comprenderá que pueden desarrollarse ensayos
similares para cualquier insecto diana o no diana a fin de
determinar la eficacia de la ICP producida en la planta contra
dicho insecto.
Las plantas de la presente invención comprenden
también opcionalmente en su genoma un gen que codifica resistencia
a los herbicidas. Más particularmente, el gen de resistencia a los
herbicidas es el gen bar o el gen pat, que confiere a la planta
tolerancia al glufosinato, es decir que las plantas son tolerantes
al herbicida Liberty^{TM}. La tolerancia a Liberty^{TM} puede
testarse de diferentes maneras. Por ejemplo, la tolerancia puede
testarse por aplicación de una pulverización de Liberty^{TM}. Los
tratamientos de pulverización deben realizarse entre las etapas V2
y V6 de la planta para resultados óptimos (las etapas del maíz son
como se determina en `How a Corn Plant Develops, Special Report No.
48, Iowa State University of Science and Technology, Cooperative
Extension Service, Ames, Iowa, Reprinted June 1993; véase también el
sitio de la web en:
\underbar{http://www.extension.iastate.edu/-pages/hancock/agriculture/corn/corn\_}
\underbar{develop/CornGrowth-Stages.html:}). Las plantas tolerantes se caracterizan por el hecho de que una pulverización de las plantas con al menos 200 gramos de ingrediente activo/hectárea (g.i.a./ha), preferiblemente 400 g.i.a./ha, y posiblemente hasta 1600 g.i.a./ha (cuatro veces la tasa normal en campo), no destruye las plantas. Una aplicación esparcida a voleo debería aplicarse a una tasa de 28-34 oz (794-964 g) de Liberty^{TM} + 3 lb (1,36 kg) de sulfato de amonio por acre (1 acre = 0,405 Ha). Lo mejor es aplicar a razón de un volumen de 20 galones de agua por acre (76 l/ha) utilizando una tobera de tipo ventilador aplastada teniendo cuidado para no dirigir las aplicaciones de pulverización directamente al verticilo de las plantas, a fin de evitar el quemado de las hojas por el agente tensioactivo. El efecto de herbicida debe aparecer en el transcurso de 48 horas y ser claramente visible en el transcurso de 5-7 días.
\underbar{develop/CornGrowth-Stages.html:}). Las plantas tolerantes se caracterizan por el hecho de que una pulverización de las plantas con al menos 200 gramos de ingrediente activo/hectárea (g.i.a./ha), preferiblemente 400 g.i.a./ha, y posiblemente hasta 1600 g.i.a./ha (cuatro veces la tasa normal en campo), no destruye las plantas. Una aplicación esparcida a voleo debería aplicarse a una tasa de 28-34 oz (794-964 g) de Liberty^{TM} + 3 lb (1,36 kg) de sulfato de amonio por acre (1 acre = 0,405 Ha). Lo mejor es aplicar a razón de un volumen de 20 galones de agua por acre (76 l/ha) utilizando una tobera de tipo ventilador aplastada teniendo cuidado para no dirigir las aplicaciones de pulverización directamente al verticilo de las plantas, a fin de evitar el quemado de las hojas por el agente tensioactivo. El efecto de herbicida debe aparecer en el transcurso de 48 horas y ser claramente visible en el transcurso de 5-7 días.
Ejemplos de otros genes de resistencia a los
herbicidas son los genes que codifican resistencia a fenmedifam
(tal como el gen pmph, US 5347047; US 5543306), los genes que
codifican resistencia a glifosato (tales como los genes EPSPS, US
5510471), genes que codifican resistencia a bromoxinil (tal como se
describe en US 4810648), genes que codifican resistencia a
sulfonilurea (tal como se describen en EPA 0 360 750), genes que
codifican resistencia al herbicida dalapón (tal como se describen
en WO 99/27116), y genes que codifican resistencia a cianamida (tal
como se describen en WO 98/48023 y WO 98/56238), y genes que
codifican resistencia a los inhibidores de
glutamina-sintetasa, tales como PPT (tal como se
describen en EP-A-0 242 236,
EP-A-0 242 246, y
EP-A-0 257 542).
La introducción de un DNA extraño en una célula
de planta puede realizarse por métodos convencionales de
transformación descritos en la técnica. Tales métodos incluyen,
pero sin carácter limitante, transformación mediada por
Agrobacterium (US 6074877, Hiei et al., 1997),
bombardeo con microproyectiles (como ha sido descrito, por ejemplo,
por Chen et al., 1994; Casas et al., 1995; Christou,
1997, Finer et al., 1999, Vasil et al., 1999),
absorción directa de DNA en protoplastos (como se describe, por
ejemplo, por De Block et al., 1989; Poulsen, 1996, Datta
et al., 1999), electroporación (D'Halluin et al.,
1992, US 5641665; Bates, 1995), o introducción de DNA mediada por
triquitas de silicio (Dunwell, 1999) u otros métodos como han sido
revisados en general por Potrykus (1990), Sawahel et al.,
(1995), Komari et al. (1998), Bogorad (2000) y Newell
(2000).
Los ejemplos siguientes describen el desarrollo
de una secuencia de DNA que codifica una proteína Cry1Ab modificada,
la construcción de genes quiméricos que comprenden esta secuencia
para expresión en plantas, y plantas resistentes a los insectos
obtenidas con ellos. A no ser que se indique otra cosa en los
ejemplos, todas las técnicas de DNA recombinante se llevan a cabo
de acuerdo con protocolos estándar como se describen en Sambrook y
Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª Edición,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY en los volúmenes 1 y 2 de
Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology,
Current Protocols, USA y en los volúmenes I y II de Brown (1998)
Molecular Biology LabFax, Second Edition, Academic Press (Reino
Unido). Materiales y métodos estándar para trabajo molecular con
plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) por
R.D.D. Croy, publicado conjuntamente por BIOS Scientific
Publications Ltd (Reino Unido) y Blackwell Scientific Publications,
Reino Unido. Materiales y métodos estándar para reacciones en cadena
de polimerasa pueden encontrarse en Dieffenbach y Dveksler (1995)
PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, y en McPherson et al. (2000) PCR - Basics: From
Background to Bench, First Edition, Springer Verlag,
Alemania.
Alemania.
A lo largo de la descripción y los ejemplos, se
hace referencia a las secuencias siguientes representadas en el
listado de secuencias:
SEQ ID NO: 1: Proteína Cry1Ab modificada
SEQ ID NO: 2: Secuencia de DNA que codifica una
proteína Cry1Ab modificada
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de DNA de Cry1Ab modificada
utilizada en esta memoria codifica parte de la proteína Cry1Ab5
descrita por Höfte et al. (1986) correspondiente a los
aminoácidos 1 a 616, que tiene una inserción de un codón alanina
(GCT) 3' del codón inicial ATG (AlaAsp 2 ... Asp 616). La secuencia
proteínica de la proteína Cry1Ab modificada se proporciona en SEQ
ID NO: 1. La secuencia del DNA codificante de dicha proteína Cry1Ab
modificada se proporciona en SEQ ID NO: 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Para transformación de maíz con
Agrobacterium, se desarrollaron constructos en los cuales la
secuencia codificante de cry1Ab se puso bajo el control de
diferentes promotores: promotor 35S (Odell et al. 1985), el
promotor ubi (Christensen et al., 1992), el promotor del gen
GOS2 del arroz (de Pater et al., 1992) con el conductor
cab22 de petunia (Harpster et al. 1988), la secuencia
conductora 5' del gen GOS2 del arroz, que contiene el segundo exón,
el primer intrón y el primer exón del transcrito GOS (de Pater et
al., 1992), o una región promotora TR2' (Velten et al.,
1984); todos los constructos incluían el gen
35S-bar. La transformación mediada por
Agrobacterium se realizó por co-cultivo de
callo de tipo I derivado de embriones inmaduros con la cepa C58CI
(pTiEHA101) (pTTS35) (cepa C58CIRifR de Agrobacterium curada
para pTiC58 que albergaba el plásmido Ti no oncogénico pTiEHA101
(Hood et al., 1986) y los plásmidos de la tabla siguiente que
contiene los genes de interés situados entre los bordes del
T-DNA). La transformación de protoplastos se realizó
por transfección mediada por PEG de protoplastos preparados a
partir de cultivos de suspensión derivados de embriones
Pa91xH99xHE89 Z15. El DNA utilizado para la transfección era un
fragmento purificado de los plásmidos incluidos en la tabla
siguiente que contienen los genes de interés entre los bordes del
T-DNA.
Las plántulas regeneradas se seleccionaron
basándose en la tolerancia a Liberty y/o la medida de los niveles
de proteína PAT por ELISA (Clark et al., 1986).
\vskip1.000000\baselineskip
Los transformantes de Agrobacterium se
comprobaron respecto a la presencia de la secuencia vectora en el
borde izquierdo del T-DNA. Los análisis por
transferencia Southern se realizaron con material de hojas de los
transformantes primarios (T0).
\vskip1.000000\baselineskip
Los eventos se analizaron en el invernadero
respecto a la expresión de Cry1Ab por detección de los niveles de
proteína Cry1Ab soluble modificada en diferentes tejidos por un
ELISA sándwich de Cry1Ab con una fracción policondensada de IgG de
un antisuero policlonal de conejo contra Cry1Ab como primer
anticuerpo y un anticuerpo monoclonal contra Cry1Ab como segundo
anticuerpo.
Los niveles de expresión de la proteína Cry1Ab
modificada en diferentes tejidos de plantas de verticilo precoz
transformadas con el constructo p35S-cry1Ab se
proporcionan en la Tabla 1. Se encontró que la expresión en las
diferentes plantas de la progenie de un evento obtenido con el
evento p35S-cry1Ab era constitutiva y superior a
0,5% por término medio.
Los niveles de expresión de la proteína Cry1Ab
en diferentes tejidos en hojas precoces de las etapas V, R1 y
R4-5, granos de la etapa R4-5 y en
polen para las plantas transformadas con los constructos
p35S-cry1Ab,
pGos-cab-cry1Ab,
pGos-gos-cry1Ab y
pTR2-cry1Ab se proporcionan en la Tabla 2. Los
resultados se presentan como valores medios de muestras de hojas y
granos tomadas de 5 plantas y como promedios de muestras de polen
tomadas de 3 plantas (desviación estándar entre paréntesis). La
expresión de ICP para la única planta p35S-cry1Ab
es superior a 0,1% de proteína soluble total. Las plantas
pGos-cab-cry1Ab exhibían
aproximadamente 0,01-0,06% de expresión de Cry1Ab
en las hojas. Los eventos obtenidos con los constructos
pGos-cos-cry1Ab demostraban una
expresión fuerte (0,2-0,6% de proteína) en el tejido
de las hojas. La expresión basal de proteína en las hojas de las
plantas transformadas con la secuencia de DNA cry1Ab modificada bajo
control del promotor TR2' inducible por lesión
(pTR2'-cry1Ab) era baja a indetectable.
\vskip1.000000\baselineskip
En un estudio realizado en invernadero, la
expresión de la proteína Cry1Ab modificada se determinó en muestras
de hojas de plantas en la etapa V3, y, cuando estaban disponibles,
hojas y polen de plantas en la etapa R1, y hojas, tallo y polen de
plantas en el momento de la recolección, para eventos obtenidos con
los diferentes constructos. De nuevo, las plantas con los
constructos pGos-gos-cry1Ab exhibían
una expresión alta de Cry1Ab en las hojas (> 0,2% de proteína
soluble total) (con indiferencia del método de transformación
utilizado). Para estas plantas, se encontraron también niveles de
expresión altos en el tallo (0,8% de proteína soluble total o más
como promedio). Los eventos obtenidos a partir de la transformación
con los constructos pTR2'-cry1Ab mostraban una
expresión baja (0,02% de proteína soluble total o menos como
promedio) o indetectable de la proteína Cry1Ab en todos los
tejidos
testados.
testados.
Para los eventos obtenidos con el constructo
pTR2'-cry1Ab, se realizaron estudios en el
invernadero a fin de determinar la expresión de la proteína Cry1Ab
después de lesión mecánica. Se tomaron muestras de las hojas antes
de la lesión, y 18 h después de la lesión mecánica, y se midieron
los niveles de la proteína Cry1Ab por ELISA (Tabla 3). Se cortaron
partes de las hojas deterioradas y se incubaron durante 18 horas en
una cápsula Petri sobre papel de filtro humedecido con medio
Murashige y Skoog (MS) (Plant Molecular Biology Labfax (1993) por
R.D.D. Croy, publicado conjuntamente por BIOS Scientific
Publications Ltd (Reino Unido) y Blackwell Scientific Publications,
Reino Unido) a la temperatura ambiente, y se midió luego el nivel de
la proteína Cry1Ab utilizando un ensayo ELISA sándwich. Se cortaron
de las plantas partes de hojas de control sin lesionar (de tamaño
similar a las partes de las hojas lesionadas) y se pusieron
inmediatamente en hielo seco para análisis de proteínas.
La expresión de la proteína Cry1Ab estaba
ausente o se encontraba próxima al límite de detección en hojas,
tallo y granos de los diferentes eventos pTR2' testados. No se
encontró expresión alguna por encima de los niveles de ruido de
fondo (como los encontrados en las plantas de control sin
transformar) en las hojas y el polen en la etapa de la planta de
verticilo y de desprendimiento de polen. Se observó una expresión
constitutiva en las raíces. Cuando las hojas se lesionan
mecánicamente, se induce la expresión de la proteína Cry1Ab
modificada y aumenta hasta 0,02-0,1% en las hojas
de la etapa V4.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron pruebas de la eficacia contra ECB
en el invernadero y en dos lugares diferentes en el campo. Al mismo
tiempo, se evaluaron las plantas respecto a efectos de fitotoxicidad
de los constructos introducidos. La Tabla 4 muestra los resultados
de la eficacia testada para ECB. En el invernadero, la eficacia
contra ECB se determina por medida de la longitud de los túneles en
cm por tallo para 10 plantas y se expresa como la longitud media
(desviación estándar entre paréntesis) de los túneles para el número
máximo de túneles por planta. En el campo, la eficacia contra ECB
se expresa como el valor medio de 3 valores obtenidos para
diferentes grupos de 10 plantas.
\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
El evento p35S-cry1Ab
proporcionó un control absoluto de ECB, tanto en invernadero como en
las pruebas en campo en lugares diferentes, que estaba
correlacionado con la expresión de dosis alta (como se ha descrito
arriba). Análogamente, los eventos
pGos-gos-cry1Ab y
PGos-cab-cry1Ab exhibían un control
satisfactorio de ECB en todos los lugares testados. El evento
pUbi-cry1Ab no exhibía un control satisfactorio de
ECB.
No se observó fitotoxicidad alguna para ninguno
de los eventos p35S-cry1Ab o
pGos-cab-cry1Ab. Las semillas
autopolinizadas de los eventos
pGos-gos-cry1Ab exhibían segregación
en el campo de plantas verdes normales y plantas amarillentas
atrofiadas, cuyas hojas inferiores estaban moribundas, lo que
sugiere cierto impacto sobre la eficiencia agronómica.
Catorce eventos obtenidos con el constructo
pTR2'-cry1Ab se evaluaron respecto a eficacia contra
ECB en el invernadero y en pruebas de campo (Tabla 5). Cuatro de
los cinco eventos de una sola copia (indicados con un asterisco)
dieron un control total de ECB2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
No se observó penalización alguna sobre la
eficiencia agronómica para las plantas después de la segunda
autopolinización (mazorca a surco) de los diferentes eventos TR2'
en ninguno de los lugares testados.
\vskip1.000000\baselineskip
Cinco plantas de maíz de verticilo medio
obtenidas con el constructo pTR2'-cry1Ab se
infestaron cada una con masas de dos huevos. Se registró el
deterioro al cabo de 14 días y se contó el número de larvas. Las
tasas de deterioro se promediaron para las cinco plantas. Plantas
B73 no transformadas se infestaron análogamente como controles. Los
resultados se muestran en la Tabla 6.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se produjo un constructo para la expresión del
gen cry1Ab modificado en el algodón. El constructo pTSVH0203
contiene la secuencia codificante de cry1Ab modificada (que codifica
parte de la proteína Cry1Ab descrita por Höfte et al., 1986
que tiene una inserción de un codón alanina (GCT) 3' del codón
inicial ATG) bajo control de los promotores constitutivos 35S
(Odell et al., 1985), enlazada a la secuencia conductora del
gen EI del tapete de Oryza sativa (WO 92/13956) con el
terminador 3'ocs (fragmento que contiene señales de poliadenilación
de la región 3' no traducida del gen de
octopina-sintasa procedente del
TL-DNA de pTiAch5, De Greve et al., 1983).
El constructo comprende adicionalmente la secuencia codificante
bar (la secuencia codificante de
fosfinotricina-acetil-transferasa de
Streptomyces hygroscopicus; Thompson et al., 1987)
bajo control del promotor 35S.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Este constructo se utilizó para transformación
de algodón. Los eventos obtenidos se sometieron a análisis
molecular para confirmar la presencia del transgén.
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión de la proteína Cry1Ab modificada se
determinó en muestras de hojas, yemas terminales, flores sin abrir,
flores y cápsulas utilizando ELISA (Tabla 7). Los resultados
representan el porcentaje de proteína Cry1Ab en el contenido total
de proteína como valor medio de muestras tomadas de 9 plantas. El
momento en el que se tomaron las muestras se representa como días
después de la plantación (entre paréntesis).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Se dejó que se alimentaran larvas CBW sobre
flores sin abrir, hojas y yemas terminales obtenidas de hojas en el
campo. Se determinó el peso de las larvas supervivientes para los
diferentes eventos (Tabla 8). Se utilizaron como control muestras
de dos plantas no transgénicas y de una sola planta que comprendía
un gen de resistencia a los herbicidas (evento LL25).
En el campo, se infestaron artificialmente
plantas con larvas CBW recién nacidas. Se evaluó el deterioro de
las hojas, yemas terminales, flores sin abrir, flor blanca y
cápsulas y se realizaron recuentos cada 8 días en los meses de
agosto y septiembre. Se obtuvo un valor medio para las cinco fechas
de las observaciones. El análisis estadístico indicó que se
encontraban diferencias significativas en la severidad media de las
lesiones de las yemas terminales, flores blancas y cápsulas.
Asimismo, el número medio de flores sin abrir lesionadas y cápsulas
lesionadas era mayor para los controles que para los eventos Cry1Ab;
el número medio de larvas en las flores sin abrir se había reducido
también significativamente en comparación con los controles.
\vskip1.000000\baselineskip
Se produjo un constructo para la expresión del
gen cry1Ab modificado en el arroz. El constructo contiene la
secuencia codificante de cry1Ab modificada (que codifica parte de la
proteína Cry1Ab5 descrita por Höfte et al., 1986, teniendo
una inserción de un codón alanina (GCT) 3' del codón inicial ATG)
bajo el control del promotor con la secuencia conductora 5' del gen
GOS2 del arroz, que contiene el segundo exón, el primer intrón y el
primer exón del transcrito de GOS (de Pater et al., 1992).
Este constructo se utilizó para transformación de arroz. Los
eventos obtenidos se sometieron a análisis molecular para confirmar
la presencia del transgén.
Se testaron plantas de 25 eventos diferentes
respecto a control del doblador de las hojas del arroz, el
perforador amarillo del tallo, y el perforador rosa del tallo por
recuento del número de larvas supervivientes. El deterioro de las
plantas se evaluó como daño a las hojas (para el doblador de las
hojas) o el número de "corazones muertos" dividido por el
número de retoños en la etapa de prefloración (perforador amarillo
del tallo y perforador rosa del tallo) o el número de mazorcas
blancas dividido por el número de retoños en la etapa de floración
(perforador amarillo del tallo). Sólo para dos eventos se
encontraron plantas en las cuales algunas (5-7 de
25) de las larvas sobrevivían. Todas las plantas de todos los
restantes eventos arrojaron 90-100% de larvas
muertas. Mientras que las plantas de control estaban o bien
totalmente secas o presentaban muchas hojas dobladas cuando se
infestaron con el doblador de las hojas del arroz, ninguna de las
plantas de los eventos cry1Ab exhibía un daño importante.
Análogamente, no se detectaron corazones muertos o mazorcas blancas
para las plantas de los eventos Cry1Ab, infestadas con el
perforador amarillo del tallo o el perforador rosa del tallo.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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Bacillus thuringiensis
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<211> 1854
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial: Secuencia codificante
de la proteína modificada de Bacillus thuringiensis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
Claims (10)
1. Una secuencia de DNA que comprende una
región codificante que codifica una proteína Cry1Ab modificada que
comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2.
2. Un gen quimérico que comprende la secuencia
de DNA de la reivindicación 1 bajo control de un promotor
expresable en plantas.
3. Un vector recombinante que comprende el gen
quimérico de la reivindicación 2.
4. Una célula de planta transgénica que
comprende el gen quimérico de la reivindicación 2.
5. Una planta transgénica que comprende la
célula de planta de la reivindicación 4.
6. La planta transgénica de la reivindicación
5, que se selecciona de maíz, algodón, o arroz.
7. Una semilla de la planta de la
reivindicación 6, que comprende la secuencia de DNA de SEQ ID NO:
2.
8. Un método para modificar por ingeniería
genética la resistencia a los insectos en una planta, a fin de
proteger dicha planta contra plagas de insectos lepidópteros, que
comprende introducir por transformación en el genoma de dicha
planta el gen quimérico de la reivindicación 2.
9. El método de la reivindicación 8, en el
cual dichas plagas de insectos se seleccionan del grupo del
Perforador del Maíz Europeo, Sesamia nonagrioides, la oruga
de las cápsulas del algodón, la oruga de los brotes del tabaco, el
perforador amarillo de los tallos, el perforador rosa de los tallos,
y el doblador de las hojas del arroz.
10. Uso del gen quimérico de la reivindicación
2 para obtener plantas resistentes a los insectos.
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