ES2287482T3 - Expresion inducible por lesion de plantas. - Google Patents

Abstract

Una planta monocotiledónea resistente a los insectos que comprende, integrado de manera estable en su genoma, un gen quimérico que comprende una secuencia de DNA que codifica una proteína insecticida bajo control de una región promotora que comprende el promotor TR2'' del gen de manopina-sintasa de Agrobacterium tumefaciens.

Description

Expresión inducible por lesión en plantas.

Campo de la invención

La invención concierne a un método para producir plantas en el cual la expresión de una proteína insecticida está regulada por un promotor inducido por lesión que induce expresión local, preferentemente el promotor TR2' inducible por lesión, a los genes quiméricos utilizados en este método y las plantas obtenidas por el mismo, y a los procesos para obtener resistencia a los insectos que se alimentan de las plantas mediante la expresión localizada de una proteína insecticida inducida por la lesión de las plantas causadas por dicha alimentación de los insectos.

Técnica anterior

Los intentos de mayor éxito para obtener plantas que son resistentes a los ataques por insectos se han obtenido por expresión de alto nivel de toxinas insecticidas y se consideran dependientes de dicha expresión (Estruch et al., 1997; Witowsky & Siegfried, 1997). Con referencia particular a las toxinas Bt, que según se ha encontrado son expresadas deficientemente en plantas como proteínas de longitud total, los esfuerzos se han centrado en el incremento de la expresión de estas toxinas en plantas mediante el uso de promotores constitutivos fuertes y por modificación de los genes codificantes de las mismas (Vaeck et al., 1987; Barton et al., 1987). Más recientemente se ha sugerido una regulación espacial de la expresión de la proteína insecticida en aquellos tejidos que son susceptibles al ataque o que son desencadenados por la alimentación del insecto como fuentes posibles para lograr un manejo ventajoso de la resistencia (Peferoen & Van Rie, 1997). Una de las condiciones principales para lograr la aprobación reglamentaria de plantas transgénicas resistentes a los insectos es la disponibilidad de una estrategia de control de la resistencia a los insectos. La estrategia más preferida actualmente es la combinación de un 100% de toxicidad de las plantas transgénicas para la o las plagas diana, obtenida con una expresión de dosis alta de una toxina específica y esto durante el ciclo de vida completo de la plaga, con el uso de refugios de plantas no transgénicas, que permiten el mantenimiento de la población de la plaga diana (De Maagd et al. 1999). Con el fin de poder cumplir con dicha estrategia, se ha alentado adicionalmente el uso de promotores constitutivos fuertes en la modificación por ingeniería genética de plantas resistentes a los insectos.

La expresión inducible de resistencia a los insectos se ha examinado primariamente para los genes del inhibidor de proteinasa de patata (pin1 y pin2) que forman parte del sistema de defensa natural en plantas mediante lesión que aseguran la generación de una señal sistémica en todas las plantas (Green y Ryan, 1972; Hilder et al. 1987). La introducción del gen pin2 en el arroz dio como resultado un nivel alto de apilamiento sistémico de la proteína en plantas de arroz que mostraron una mayor resistencia a las principales plagas (Duan et al., 1996). Breitler et al. (2001) describen el uso de la región C1 del gen del inhibidor de proteinasa del maíz (MPI) para dirigir la expresión inducible por lesión de la secuencia codificante cry1B en el arroz y se encontró que los primeros transformantes protegían de forma eficaz el arroz contra el ataque del barrenador, descubriéndose que la expresión inducida por lesión era tanto local como sistémica.

En un experimento de laboratorio a pequeña escala, las hojas de col transgénica transformadas con el gen cry1Ab3 puesto bajo el control del promotor inducible vspB de la soja eran tan tóxicas para la polilla diamante como las transformadas con el mismo gen bajo el control del promotor 35S, pero no se demostró susceptibilidad de inducción por lesión (Jin et al., 2000).

El promotor TR2' del gen de la manopina-sintasa de Agrobacterium tumefaciens, considerado originalmente como director de la expresión constitutiva (Velten et al. 1984; Vaeck et al. 1987), se ha utilizado para dirigir la expresión inducible por lesión de un gen Cry1 Ab nativo en el tomate, que conducía a una expresión relativamente baja y ofrecían un control sólo moderado de los insectos (Reynaerts & Jansens, 1994). Aunque se ha sugerido una posible aplicación general para la expresión de proteínas Bt (Peferoen, 1997), parecen existir discrepancias entre los informes sobre el patrón de expresión del promotor TR2' en tabaco y otras dicotiledóneas (Ni et al. 1995). En general, se prefiere el uso de promotores de monocotiledóneas para lograr una expresión óptima de genes en monocotiledóneas (Shimamoto, 1994) y se ha encontrado que algunos promotores tienen diferentes elementos de acción en cis en monocotiledóneas y dicotiledóneas (Luan et al. 1992). La contribución de diferentes elementos del promotor TR2' sobre su actividad se investigó en protoplastos de maíz (Fox et al., 1992), pero no ha habido informe alguno acerca del patrón de expresión del promotor TR2' en una planta monocotiledónea. Aún más, se encontró que el mutante de deleción más fuerte es 20 veces menos activo que el promotor 35S de CaMV (Fox et al., 1992).

Los promotores de la manopina-sintasa de Agrobacterium han sido caracterizados como promotores constitutivos, específicos de la raíz y específicos de tejidos, por ejemplo, véanse las patentes de EEUU 6291745, 6320100 y 63133378. En la patente de EEUU 5641664, se cree que diversos promotores constitutivos y específicos de órganos y tejidos utilizados para dirigir la expresión de genes en plantas dicotiledóneas transformadas serán adecuados también para uso en monocotiledóneas transformadas. Como parte de una lista general de promotores constitutivos extraños adecuados para transformar células vegetales en esta patente se mencionan los promotores TR1' y TR2' que dirigen la expresión de los genes 1' y 2', respectivamente, del T-DNA de Agrobacterium, y se considera que son promotores inducidos por lesión. Esta patente no presenta planta monocotiledónea alguna transformada con el promotor TR2' o TR1', ni se hace sugerencia alguna de que estos promotores sean promotores inducidos por lesión en plantas monocotiledóneas o sean de utilidad para la expresión de una proteína insecticida en una planta monocotile-
dónea.

La presente invención describe la manera en que se puede utilizar el promotor TR2' para dirigir una expresión inducida por lesión de una proteína insecticida en plantas monocotiledóneas para obtener resistencia a los insectos. Dicha expresión inducible por lesión del promotor TR2' conduce a un incremento fuerte pero localizado de la expresión de la proteína insecticida. El efecto supuesto sobre el vigor y crecimiento de las plantas, observado con un nivel alto de expresión de algunas proteínas Bt, particularmente después de endogamia repetida (tal como se describe en WO 00/26378 para Cry2Ab), probablemente se verá reducido ya que la expresión limitada de la proteína debería minimizar cualquier carga sobre funciones importantes para mantener las calidades agronómicas de la cosecha modificada por ingeniería genética. Esto constituye también un factor importante cuando se considera el apilamiento de diferentes características (o diferentes proteínas Bt). Dado que los niveles de expresión de dosis altas se logran después del contacto con la plaga diana, dichas plantas deberían cumplir con las estrategias actuales de IRM. Además, la combinación de la especificidad de la toxina de insecto producida con un patrón de expresión espacial y temporalmente limitado (a saber en tejidos susceptibles a lesión, después de la lesión) reducirá probablemente la exposición de los organismos distintos de la diana, lo cual puede considerarse como una ventaja con respecto a la producción constitutiva de la toxina por las plantas. Por consiguiente, presenta interés un sistema eficaz de expresión regulada que asegure una resistencia eficaz a los insectos de las cosechas principales tales como maíz y arroz, desde un punto de vista regulador y agronómico.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un método para obtener una expresión inducida por lesión de una proteína insecticida en una planta monocotiledónea, comprendiendo dicho método la introducción en el genoma de la planta de un DNA extraño que es un gen quimérico que comprende una secuencia de DNA codificante de la proteína insecticida bajo el control de una región promotora que comprende el promotor TR2'. De acuerdo con una realización particular de la invención, la proteína insecticida es una toxina de Bacillus thuringiensis. En una realización preferida de la presente invención, la proteína insecticida es una proteína insecticida activa contra las plagas de plantas monocotiledóneas, y con más preferencia la proteína insecticida puede ser una proteína Cry1Ab, Cry1F, Cry2Ae, Cry9C o Cry2Ab o un fragmento insecticida o mutante de las mismas.

Por lo tanto, una realización preferida de la presente invención se refiere a un método para obtener resistencia a los insectos, preferentemente una resistencia de dosis alta a los insectos, en plantas, células vegetales o tejidos vegetales, más particularmente en monocotiledóneas, en especial gramíneas, particularmente, plantas, células vegetales o tejidos vegetales de maíz, mediante la provisión en las plantas, células o tejidos vegetales de un DNA extraño que comprende una secuencia de DNA codificante de una proteína insecticida bajo el control de una región promotora que comprende el promotor TR2'. De acuerdo con la presente invención el promotor TR2' se utiliza para incrementar la expresión de la proteína insecticida después de una lesión, por ejemplo debida a la ingesta de alimento por los insectos. Por consiguiente, de acuerdo con una realización particular de la invención, la expresión de la proteína insecticida en plantas monocotiledóneas, medida preferentemente en el invernadero por un ensayo ELISA, es baja (a saber, menor que 0,005% de proteína soluble total (valor medio de múltiples mediciones tomadas de varias, preferentemente al menos 3, particularmente al menos 5, plantas del mismo suceso de transformación) en hojas, en ausencia de lesión o infestación y aumenta, preferentemente al menos al doble, con más preferencia entre 5 y 100 veces, en los tejidos lesionados o infestados, particularmente hojas, dentro de las 24 horas.

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, se utiliza un gen quimérico que comprende una secuencia de DNA codificante de una proteína insecticida bajo el control del promotor TR2' inducible por lesión para conferir resistencia a los insectos en plantas monocotiledóneas, en especial en gramíneas, más particularmente en maíz, por dirección de la expresión local de la proteína insecticida al sitio de ingesta de alimento por los insectos. En otra realización de esta invención, el promotor TR2' en las plantas y procesos arriba indicados es una región promotora que comprende un fragmento de SEQ ID NO:1 que abarca desde una posición de nucleótido comprendida entre las posiciones de los nucleótidos 1 y 336 hasta la posición del nucleótido 483, una región promotora que comprende la secuencia de los nucleótidos 96 a 483 de SEQ ID NO:1, o una región promotora que comprende la secuencia de SEQ ID NO:1. En una realización particular de la invención, la expresión (medida en el invernadero) es baja o no detectable (menor que 0,005% de proteína soluble total (valor medio de múltiples mediciones tomadas de varias, preferentemente al menos 3, particularmente al menos 5, plantas del mismo suceso)) en hojas de plantas no lesionadas, no infectadas y, después de infección, se inducen niveles incrementados de proteína insecticida (al menos al doble, preferentemente al menos de 5 a 100 veces o más) localmente en los tejidos infectados, dentro de las 18 horas. De acuerdo con este aspecto de la invención, se proporcionan plantas, más particularmente plantas monocotiledóneas, que son resistentes a los insectos debido a la presencia en su genoma de un DNA extraño que comprende una secuencia de DNA codificante de una proteína insecticida, bajo el control del promotor TR2' que asegura la expresión en tejidos lesionados. De acuerdo con una realización de la invención, la expresión de una proteína insecticida en las plantas es tal que, en ausencia de lesión de la planta (por ejemplo, cuando se cultiva en el invernadero) la proteína insecticida es expresada a niveles bajos o no detectables (a saber, menores que 0,005% de proteína soluble total (valor medio de múltiples mediciones tomadas de varias, preferentemente al menos 3, particularmente al menos 5, plantas del mismo suceso) en hojas, tallo, semillas y polen, preferentemente al menos en hojas y polen, particularmente al menos en hojas y, después de la ingesta de alimento por los insectos, aumenta en el tejido lesionado, preferentemente en las hojas, hasta un nivel que es suficiente para matar la plaga que se está alimentando, preferentemente hasta una concentración de al menos 0,01% de proteína soluble total.

De acuerdo con una realización preferida de la invención, el promotor TR2' se utiliza en plantas monocotiledóneas para conferir resistencia a los insectos por dirección de la expresión inducible por lesión de una proteína insecticida que es una toxina Bt. Ejemplos de tales secuencias de DNA codificantes de toxinas Bt son bien conocidos en la técnica y se describen en esta memoria.

De acuerdo con una realización de la presente invención, el uso del promotor TR2' en maíz para dirigir la expresión inducible por lesión de una toxina Bt es particularmente adecuado para modificar por ingeniería genética la resistencia del maíz contra el barrenador del maíz europeo (ECB), basado en una expresión de dosis alta local de la toxina en la planta después de la alimentación por los insectos diana. Las plantas o partes de plantas (células o tejidos) de la presente invención, que comprenden en su genoma un DNA extraño que comprende una secuencia de DNA codificante de una proteína insecticida bajo el control del promotor TR2' producen, después de la lesión, niveles de la proteína insecticida que son tóxicos para las larvas de ECB, incluyendo particularmente larvas ECB de la cuarta etapa entre mudas, como puede determinarse por los ensayos de eficacia contra los insectos que se describen en esta memoria. Preferentemente, se obtienen tasas de mortalidad de larvas de ECB de la cuarta etapa entre mudas de al menos 97%, preferentemente al menos 99%, con más preferencia de 100%.

La presente invención se refiere además a plantas monocotiledóneas que son resistentes a los insectos al tiempo que expresan niveles basales muy bajos de proteína insecticida en las hojas no lesionadas de la planta. De acuerdo con un aspecto particular de esta invención, se obtienen plantas monocotiledóneas, más particularmente de maíz, que combinan una resistencia eficiente a los insectos con características agronómicas óptimas, sin afectar al rendimiento agronómico debido a la expresión de la proteína insecticida, como puede ser comprobado mediante evaluación del fenotipo, la segregación, el brote, el vigor y las calificaciones agronómicas de la planta.

De acuerdo con otro aspecto de esta invención, se obtienen plantas monocotiledóneas, particularmente plantas de maíz, que son resistentes a los insectos y particularmente adecuadas para asociación con otras características (por ejemplo otros tipos de resistencia a los insectos, resistencia a herbicidas o características agronómicas).

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporcionan plantas monocotiledóneas, particularmente plantas de maíz, que son resistentes a una o varias plagas diana, pero para las cuales la producción de la proteína insecticida es desde baja hasta indetectable en hojas y polen, particularmente en las hojas, en ausencia de lesión, lo cual limita la exposición de los organismos distintos de la diana a la proteína insecticida.

De acuerdo con la presente invención, las plantas con las características descritas previamente se obtienen por introducción en el genoma de la planta de una secuencia de DNA codificante de una proteína insecticida bajo el control del promotor TR2', que se ha demostrado actúa como promotor inducible por lesión en plantas monocotiledóneas, más particularmente en plantas de maíz.

Descripción detallada

El término "gen", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a cualquier secuencia de DNA que comprende varios fragmentos de DNA ligados operativamente tales como una región promotora, una región no traducida 5' (la UTR5'), una región codificante (que puede codificar o no una proteína) y una región no traducida 3' (UTR3') que comprende un sitio de poliadenilación. Por lo general, en las células vegetales la UTR5', la región codificante y la UTR3' se transcriben en un ARN cuya región codificante, en el caso de un gen codificante de una proteína, se traduce en una proteína. Un gen puede incluir fragmentos de DNA adicionales, tales como por ejemplo intrones. Aunque en un gen utilizado para la transformación en la presente invención se requiere una región promotora, no es necesaria la presencia de la UTR3' que comprende un sitio de poliadenilación en el propio gen transferido, sino que puede encontrarse en las secuencias de DNA situadas aguas arriba en la planta después de la inserción de un gen que no contiene una UTR3' que comprende un sitio de poliadenilación. De manera similar, una secuencia codificante de esta invención puede insertarse en el genoma vegetal aguas debajo de un promotor vegetal existente de tal modo que la expresión de la proteína insecticida de la invención se produce a partir de dicho gen quimérico reconstituido en la planta (por ejemplo, como en los experimentos de marcación con promotores).

El término "quimérico" con referencia a un gen o secuencia de DNA se refiere a un gen o una secuencia de DNA que comprende al menos dos fragmentos de DNA funcionalmente importantes (tales como un promotor, una UTR5', una región codificante, una UTR3', un intrón) que no están asociados naturalmente entre sí y/o que son originarios, por ejemplo, de fuentes diferentes. El término "extraño" con referencia a un gen o a una secuencia de DNA con respecto a una especie vegetal se utiliza para indicar que dicho gen o dicha secuencia de DNA no está naturalmente presente en dicha especie vegetal o que no se encuentra naturalmente en dicho locus genético en dicha especie vegetal. El término "ADN extraño" se utilizará en esta memoria para hacer referencia a una secuencia de DNA que se ha incorporado en el genoma de una planta como resultado de una transformación en dicha planta o en un progenitor de la misma.

Un genoma de una planta, tejido vegetal o célula vegetal, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a cualquier material genético de la planta, tejido vegetal o célula vegetal e incluye el genoma nuclear y el de plástidos y mitocondrias.

Un "fragmento" o "truncación" de una molécula de DNA o de una secuencia proteínica, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una porción de la secuencia del DNA o la proteína original (secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos) de referencia o a una versión sintética de la misma (tal como una secuencia adaptada para expresión óptima en plantas), que puede variar en longitud pero cuyo tamaño mínimo es suficiente para asegurar que la proteína (codificada) sea biológicamente activa, no siendo crítico el tamaño máximo. El término "variante" o "mutante" de una secuencia se utiliza en esta memoria para indicar una molécula de DNA o proteína cuya secuencia (de ácido nucleico o de aminoácidos) es esencialmente idéntica a la secuencia a la cual hace referencia dicho término.

Las secuencias son "esencialmente idénticas" cuando al alinear dos secuencias, el porcentaje de identidad de secuencia, a saber el número de posiciones con nucleótidos o aminoácidos idénticos dividido por el número de nucleótidos o aminoácidos en la secuencia más corta de las dos, es mayor que 70%, preferentemente mayor que 85%, con más preferencia mayor que 90%, de modo especialmente preferible mayor que 95%, y muy preferentemente está comprendido entre 96 y 100%. La alineación de dos secuencias de nucleótidos se lleva a cabo utilizando el algoritmo descrito por Wilbur y Lipmann (1983) utilizando un tamaño de ventana de 20 nucleótidos, una longitud de palabra de 4 nucleótidos y una penalidad por laguna de 4.

El término "insecticida" se utiliza en esta memoria para indicar que es tóxico para los insectos que son plagas de cosechas. Más particularmente, en el contexto de la presente invención los insectos diana son las plagas de plantas monocotiledóneas, más particularmente del maíz, tales como, pero sin carácter limitante, plagas de lepidópteros importantes, tales como Ostrinia nubilalis (barrenador del maíz europeo o ECB), Sesamia nonagrioides (barrenador del tallo del Mediterráneo) y Helicoverpa zea (oruga de las mazorcas del maíz), y plagas de coleópteros importantes, tales como los insectos que son especies de Diabrotica, particularmente Diabrotica virgifera virgifera y Diabrotica undecimpunctata howardi (gusano de la raíz del maíz).

Una "proteína insecticida" o "toxina", tal como se utiliza en esta memoria, de entenderse como una proteína, un polipéptido o un péptido que es tóxico para los insectos. Ejemplos de una proteína insecticida de este tipo son las toxinas Cry de Bt, mutantes o fragmentos insecticidas de las mismas (tales como los revisados por Höfte y Whiteley, 1989, en Crickmore et al. (1998) y descritos en WO 00/26378, WO 97/40162 y US 6.023.013), más particularmente la proteína Cry2Ae (WO 02/057664) o un fragmento insecticida de la misma, la proteína Cry2Ab o un fragmento insecticida de la misma, la proteína Cry9C o fragmentos o mutantes de la misma (por ejemplo, como se describe en WO94/24264 o WO99/00407), la proteína Cry1F o un fragmento insecticida de la misma y la proteína Cry1Ab o un fragmento insecticida de la misma, así como las toxinas 149B1 combinadas (de aproximadamente 14 y 44 kilodalton) o fragmentos insecticidas de las mismas, y la proteína Cry3Bb y fragmentos o mutantes insecticidas de la misma como se describen en las patentes de EEUU 6.548.291, 6.063.597 y 6.501.009. Otras proteínas insecticidas son por ejemplo las proteínas VIPs, particularmente VIP3A, más particularmente VIP3Aa, VIP3Ab y VIP3Ac o fragmentos insecticidas de las mismas (Estruch et al., 1996, WO 96/10083, patentes de EEUU 6.429.360, 5.877.012) o las proteínas codificadas por las secuencias mis, war y sup (WO98/18932, WO99/57282), y las toxinas aisladas de Xhenorabdus y Photorabdus spp., tales como las producidas por Photorabdus luminescens (Forst et al., 1997). Otras proteínas insecticidas incluyen, pero sin carácter limitante, los inhibidores I y II de proteinazas de la patata, el inhibidor de proteinazas del garbanzo, el inhibidor de la cisteína-proteinasa de la soja (Zhao et al., 1996) o las cistatinas, tales como las aisladas de arroz y maíz (Irie et al., 1996), colesterol-oxidasas, quitinasas y lectinas. Una proteína insecticida puede ser una protoxina (a saber, el producto primario de la traducción de un gen de longitud total codificante de una proteína insecticida). También se incluyen equivalentes y variantes, derivados, truncaciones o híbridos de cualquiera de las proteínas mencionadas que poseen actividad insecticida. Una toxina Bt, o proteína Bt, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una proteína insecticida definida previamente que se deriva directa o indirectamente (por ejemplo, modificada para mejorar la expresión en plantas o la toxicidad para los insectos) de una proteína producida naturalmente por Bacillus thuringiensis y que comprende una secuencia que es esencialmente idéntica al fragmento tóxico de una toxina Bt producida naturalmente, o al menos un dominio de la misma. La toxina Bt o proteína Bt, tal como se utiliza en esta memoria, puede ser una proteína cristalina, o una parte insecticida de la misma, o puede ser una proteína no cristalina tal como una proteína secretada o una proteína producida principalmente durante la fase vegetativa de una cepa de Bt o puede ser un mutante insecticida o una parte del mismo. Un "ADN codificante de una proteína insecticida", tal como se utiliza en esta memoria, incluye una secuencia de DNA truncada, modificada, sintética o natural, codificante de una proteína insecticida.

En una realización particular de la presente invención, el DNA codificante de una proteína insecticida es una secuencia de DNA codificante de una toxina Bt, con más preferencia una secuencia de DNA modificada para incrementar la expresión de la proteína insecticida en plantas. De acuerdo con una realización particular de la presente invención, la secuencia de DNA codificante de una proteína insecticida es una secuencia de DNA de cry1Ab modificada codificante de al menos parte de la proteína Cry1Ab5 descrita por Höfte et al. (1986), preferentemente una secuencia de DNA codificante de una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos desde una posición de aminoácido entre las posiciones de aminoácidos 1-28 hasta una posición de aminoácido entre las posiciones de aminoácidos 607-725 de la misma, con más preferencia que comprende los aminoácidos 1-616. Muy preferentemente, la proteína Cry1Ab modificada codificada contiene una inserción de un codón alanina (GCT) detrás del codón de inicio ATG (AlaAsp2...Asp616).

El nivel de expresión de una proteína insecticida en un material vegetal puede determinarse de numerosas maneras descritas en la técnica, por cuantificación del mRNA codificante de la proteína insecticida producida en el tejido utilizando cebadores específicos (tales como los descritos por Cornelissen & Vandewiele, 1989) o por detección específica directa de la cantidad de proteína insecticida producida, por ejemplo, mediante métodos de detección inmunológicos. Más particularmente, de acuerdo con la presente invención el nivel de expresión de la proteína insecticida se expresa como el porcentaje de proteína insecticida soluble determinado por un ELISA inmunoespecífico como se describe en esta memoria, con relación a la cantidad total de proteína soluble (determinada, por ejemplo, mediante el análisis Bradford (Bradford, 1976)). Un ELISA preferido en la presente invención es un ELISA de tipo sándwich (Clark et al., 1986).

Un promotor "inducible por lesión" o un promotor que dirige un patrón de expresión que es inducible por lesión, tal como se utiliza en esta memoria, significa que, al menos en las hojas, la expresión de la secuencia codificante bajo control del promotor aumenta significativamente después de la lesión, a saber, aumenta al menos al doble, preferentemente 5 veces, con más preferencia entre 20 y 100 veces. El término "lesión", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere ya sea a lesión mecánica o perforación de al menos la epidermis de la planta o la capa celular externa por cualquier tipo de ingesta de alimento por los insectos; y la lesión, tal como se utiliza en esta memoria, puede ser simulada también por el corte de una hoja con un instrumento cortante, tal como un bisturí. Preferentemente, de acuerdo con la presente invención, la expresión inducible por lesión de una proteína insecticida, preferentemente una proteína insecticida de Bt, en una planta significa que la expresión basal (a saber, en ausencia de lesión, medida preferentemente en el invernadero) de la proteína en las hojas de la planta en la etapa V4 es baja, muy preferentemente inferior al 0,005% del contenido de proteína soluble total (valor medio de mediciones tomadas de varias plantas de un suceso de transformación), y aumenta después de la lesión, preferentemente hasta un nivel superior al 0,01% de proteína soluble total, con más preferencia hasta un nivel de 0,04% a 0,5% del contenido de proteína soluble total o mayor, como se mide utilizando una parte de hoja que se desprendió después de la lesión y posterior incubación in vitro durante varias horas, p.ej., entre aproximadamente 12 y aproximadamente 60 horas, con preferencia entre aproximadamente 18 y aproximadamente 20 horas. Las mediciones efectuadas utilizando un ensayo in vitro con hojas cortadas (en dicho ensayo, la hoja o parte de la misma se incuba in vitro (por ejemplo, en una caja de Petri sobre papel de filtro húmedo) en invernadero o cámara de crecimiento a la temperatura ambiente durante varias horas, con preferencia entre aproximadamente 12 y 60 horas, con más preferencia entre aproximadamente 18 y 20 horas, después de la lesión (para reflejar mejor las condiciones después de la ingesta de alimento por los insectos) darán por regla general una mayor inducción de la expresión que las mediciones efectuadas después de la lesión in planta sin incubación in vitro de la hoja desprendida o una parte de la misma. Los niveles de proteína inducidos por lesión son por regla general menores (pero todavía significativamente mayores que los niveles basales no inducidos) cuando se miden alrededor de 12 a 60 horas, con más preferencia alrededor de 18 a 20 horas después de la lesión ocasionada en la hoja de la planta sin cortar la parte de hoja para la incubación in vitro. Para cualquiera de las mediciones de la concentración de proteínas insecticidas en los tejidos vegetales, preferentemente hojas, después de la lesión, y para medir el incremento de expresión como se describe en esta memoria, se prefiere utilizar el ensayo de tejido desprendido, preferentemente hoja, con incubación in vitro, dado que esto refleja probablemente mejor la concentración real inducida en el tejido después de la ingesta de alimento por los insectos (las hojas de control son frescas, no lesionadas y no se someten a incubación in vitro alguna para reflejar mejor la concentración real en los tejidos vegetales). Los niveles de expresión basales o básicos de un promotor inducido por lesión, tales como se utilizan en esta memoria, se miden preferentemente sobre material foliar recién cortado, no lesionado previamente, tomado de plantas cultivadas en invernadero. De acuerdo con una realización particular de la invención, la expresión de la proteína insecticida al menos en las hojas lesionadas aumenta hasta un 0,1% del contenido de proteína soluble total en el sitio de la lesión. Se cree que el porcentaje de proteína insecticida por proteína soluble total de acuerdo con la invención que es realmente ingerido por un insecto después de la ingesta de alimento por los insectos es mayor que el porcentaje medido en la planta o parte de la misma, debido a la expresión localizada y al hecho que sólo el tejido inducido (lesionado) será ingerido por el insecto. Además, para la medición de la concentración de proteínas se corta una determinada cantidad mínima de tejido vegetal (por lo general se cortan aproximadamente 2-3 mm alrededor de la lesión en el caso de las hojas), para llevar a cabo el análisis del contenido de la proteína insecticida, por lo cual se considera que la presencia de células no lesionadas disminuye el porcentaje de proteína insecticida por proteína soluble total extraída de la muestra.

Como se observa por regla general en los experimentos de transformación de este tipo, se obtiene una gama de diferentes sucesos de transformación vegetales después de la transformación, y se prefiere utilizar un procedimiento de selección con el fin de seleccionar las mejores plantas para su posterior desarrollo (a saber, para el cruzamiento en líneas de plantas adecuadas adaptadas a una determinada región). En dicho procedimiento de selección, se seleccionan las plantas que presentan niveles de proteína bajos o no detectables en el tejido vegetal, preferentemente en hojas y polen, con más preferencia en las hojas, y que después de inducción por lesión muestran un incremento de al menos 5 veces en la expresión en las hojas.

Un "invernadero", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un entorno de crecimiento relativamente estable para las plantas, que protege las mismas de las condiciones normales de campo, con poca o ninguna infestación por insectos, conejos, aves u otros animales o factores externos (tales como viento o tormentas) que pueden dañar una planta de cosecha en el campo. Un invernadero típico está construido en su mayor parte de materiales transparentes, tales como vidrio o plástico, con el fin de permitir que la luz natural llegue a las plantas, y puede tener regulación de luz, medio de crecimiento (tierra o medio artificial), suministro de agua y nutrientes y/o control de temperatura. Un invernadero, tal como se utiliza en esta memoria, incluye también salas o cámaras sin luz natural, siempre que se provea una fuente de luz y un medio de crecimiento a fin de establecer las condiciones de crecimiento normales de las plantas. Como tal, un invernadero es el sitio más adecuado para medir los niveles de expresión basales o básicos en las hojas para los constructos inducibles por lesión de esta invención (en un estado no inducido), a efectos comparativos.

Si bien pueden encontrarse valores de expresión basales o básicos similares de proteína insecticida en las hojas de las plantas en un campo, se espera que la infestación por insectos o el deterioro mecánico, por ejemplo, por vehículos, conejos o aves, de dichas plantas en el campo incrementará el nivel de expresión por inducción del promotor inducible por lesión de esta invención, y por ende no se medirá por regla general un nivel basal real en todas las plantas de un campo.

Una expresión de "dosis alta", o una resistencia a los insectos de "dosis alta", tal como se utiliza en esta memoria con referencia a una planta, preferentemente una planta monocotiledónea de acuerdo con esta invención, se refiere a una concentración de la proteína insecticida en una planta (medida por ELISA como porcentaje de proteína soluble total, donde dichas proteína soluble total se mide después de la extracción de las proteínas solubles en una tampón de extracción (por ejemplo, el tampón de extracción que se describe en Jansens et al., 1997) utilizando el análisis Bradford (Bio-Rad, Richmond, CA; Bradford, 1976)) que mata los insectos diana en una etapa del desarrollo que es significativamente menos susceptible, preferentemente entre 25 y 100 veces menos susceptible a la toxina que la primera etapa larvaria del insecto y puede esperarse por consiguiente una represión total del insecto diana; muy preferentemente, una resistencia de dosis alta a los insectos consiste en la obtención de al menos 97 por ciento, preferentemente al menos 99 por ciento, y muy preferentemente 100 por ciento de mortalidad para la cuarta larvaria etapa entre mudas (para los insectos que tienen 5 etapas larvarias entre mudas) o para la última etapa larvaria entre mudas (para los insectos que tienen 4 etapas larvarias entre mudas o menos) de un insecto diana, medida entre 10 y 14 días después de la infestación por insectos de dicha planta en bioensayos estándar para los insectos, preferentemente bioensayos con plantas enteras, de una planta que presenta expresión de dosis alta o resistencia de dosis alta a los insectos. La existencia de una especie de insecto diana (a saber, una especie de insecto que puede causar daños importantes desde un punto de vista comercial a una especie o variedad vegetal, y que es por regla general un insecto para el cual se desarrolla una planta transgénica) para el cual la planta transformada de acuerdo con esta invención proporciona una resistencia de dosis alta a los insectos es suficiente para que se considere que la planta presenta una expresión de "dosis alta" de acuerdo con esta invención. En esta invención se incluyen también células vegetales o tejidos vegetales, particularmente células vegetales o tejidos vegetales de maíz, ya sea contenidos en la planta o presentes en un cultivo in vitro, transformados con el gen quimérico inducido por lesión de la invención, que presentan una resistencia de dosis alta a los insectos como se ha descrito arriba determinada con bioensayos con insectos.

Una dosis alta con referencia al control de ECB en el maíz, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a la producción de proteína insecticida por la planta en la etapa media del verticilo ("mid whorl") en una cantidad que es tóxica para las larvas de ECB en la etapa L4 (European Corn Borer. Ecology and Management. 1996. North Central Regional Extension Publication No. 327. Universidad del Estado de Iowa, Ames, Iowa) según se puede determinar por ensayos de toxicidad con infestación artificial descritos en esta memoria, en los cuales se obtiene una mortalidad de al menos 90%, preferentemente al menos 97, con más preferencia al menos 99%, muy preferentemente 100% de las larvas L4 de ECB en una prueba realizada 14 días, preferentemente 10 días después de la infestación de las plantas con larvas L4. Inesperadamente, se obtiene una expresión de dosis alta de la proteína insecticida en las plantas de maíz de la invención utilizando el promotor TR2' para dirigir la expresión inducida por lesión, aun cuando la expresión es baja o indetectable por protocolos ELISA sensibles en el estado no inducido y la expresión sólo es inducida después de la ingesta de alimento por los insectos. Como suele suceder en los experimentos de transformación de plantas, algunas de las plantas obtenidas después de la transformación no serán adecuadas para desarrollo ulterior, y será necesario seleccionar líneas de plantas adecuadas con una baja expresión basal o básica y una expresión de dosis alta inducida por lesión entre los sucesos de transformación obtenidos, y preferentemente dicha línea de plantas contiene un solo DNA codificante de una proteína insecticida. Por lo general se obtienen líneas de plantas comercialmente aceptables de entre más de cien, preferentemente de entre varios centenares de plantas iniciales transformadas.

De acuerdo con la presente invención, la expresión "inducible por lesión" se caracteriza preferentemente además por el hecho que el efecto del promotor es local, a saber, está confinado esencialmente a aquellas células o tejidos que están afectados directamente por la lesión o que rodean inmediatamente al tejido lesionado. Esto se opone a un efecto sistémico, que asegura directa o indirectamente (a través de una cascada de reacciones) un efecto generalizado, más particularmente la expresión generalizada de las proteínas implicadas en los mecanismos de defensa naturales de la planta. Preferentemente, la expresión de la proteína insecticida en los tejidos no dañados de la planta no comprende por término medio más de 0,01% de la concentración de proteína soluble total, con más preferencia no más de 0,005% de la proteína soluble total (valor medio de mediciones múltiples tomadas de varias, preferentemente al menos 3, particularmente al menos 5, plantas de un suceso de transformación), medida por ELISA (véase arriba) en plantas cultivadas en invernadero. En una realización preferida de esta invención, la actividad del promotor inducible por lesión en las hojas, particularmente hojas de maíz, se localiza en la región de la lesión, y no será detectada (utilizando ensayos ELISA) en una región de la planta, particularmente la hoja, alejada más de 10 cm, particularmente más de 2 cm, del sitio de la lesión (por ejemplo, no lo será en una hoja ubicada por encima o por debajo de la hoja lesionada en la misma planta, ni en la misma hoja a más de 10 cm, preferentemente más de 2 cm, del sitio de la lesión en la hoja). Esto limita de manera eficaz la expresión en la planta, particularmente en las hojas, preferentemente hojas de maíz, a aquellos lugares en que es necesaria la expresión (a saber, los sitios donde los insectos se alimentan o al menos perforan el tejido foliar en un intento de alimentarse) y por ende minimiza el estrés que podría ser ocasionado en la planta por la expresión constitutiva de nivel alto. En particular, cuando se acumulan o apilan varios genes codificantes de diferentes proteínas (por ejemplo, diferentes proteínas de control de insectos) en una planta, se cree que la expresión inducida por lesión de uno o más de los genes introducidos es beneficiosa.

En otra realización, la expresión inducida por lesión de una proteína insecticida de acuerdo con esta invención se caracteriza por una rápida inducción de la expresión, que aumenta desde un nivel basal o básico y alcanza un nivel más alto de proteína (al menos el doble de la cantidad en los controles, preferentemente al menos 5 a 100 veces mayor que la cantidad en los controles) en aproximadamente 18 a 24 horas, preferentemente a las 18, 20 ó 24 horas, después de producida la lesión utilizando un ensayo en el cual se lesiona una parte de la hoja, se corta dicha parte de la hoja y se incuba in vitro durante dicho período de tiempo (el nivel basal o básico se mide en partes de la hoja recién cortadas y no lesionadas previamente que no se incuban in vitro).

El "promotor TR2'", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a cualquier promotor que comprende la parte funcional de TR2' (o manopina-sintasa, abreviada como mas) del elemento promotor dual TR1'-TR2' de Agrobacterium (Velten et al. 1984; Langridge et al.1989). Así pues, el mismo puede comprender el elemento TR2' ya sea solo o en combinación con el elemento TR1' divergente (Guevara-García et al., 1998) u otros elementos (reguladores), que incluyen, pero sin carácter limitante, regiones potenciadoras, intrones y análogos, siempre que se retengan sustancialmente las características del promotor de inducción de lesión de acuerdo con la presente invención. En una realización preferida de esta invención, la transcripción está dirigida desde la región del promotor TR2' (y por lo tanto la secuencia codificante está ligada operativamente y se encuentra aguas debajo de la secuencia del promotor TR2'), incluso si se utiliza el promotor dual TR1'-TR2' (o cualquier parte del mismo que retenga el elemento promotor TR2'). Más particularmente, el promotor TR2', tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una región promotora que comprende un fragmento de SEQ ID NO: 1 que abarca desde una posición de nucleótido comprendida entre las posiciones de nucleótidos 1 y 336 a la posición de nucleótido 483, comprendiendo preferentemente la secuencia de nucleótidos 96 a 483 de SEQ ID NO: 1, comprendiendo con más preferencia SEQ ID NO: 1 o un equivalente funcional de la misma, a saber, una modificación de la misma capaz de dirigir la expresión inducida por lesión en plantas, más particularmente en plantas monocotiledóneas. Dichos equivalentes funcionales incluyen secuencias que son esencialmente idénticas a una secuencia de nucleótidos que comprende al menos los nucleótidos 328 a 483 (que comprende el elemento promotor TR2', Velten et al., 1984) de la SEQ ID NO: 1. Dichas secuencias pueden aislarse de diferentes cepas de Agrobacterium. Como alternativa, dichos equivalentes funcionales corresponden a secuencias que pueden amplificarse utilizando cebadores de oligonucleótidos que comprenden al menos aproximadamente 25, con preferencia al menos aproximadamente 50 o hasta 100 nucleótidos consecutivos de los nucleótidos 328 a 483 de SEQ ID NO: 1 en una reacción en cadena de la polimerasa. Equivalentes funcionales del promotor TR2' se pueden obtener también por sustitución, adición o deleción de nucleótidos de la secuencia de SEQ ID NO: 1 e incluyen promotores híbridos que comprenden la parte funcional TR2' de la SEQ ID NO: 1. Dichas secuencias promotoras pueden sintetizarse en parte o por completo.

Las plantas de la presente invención se protegen contra plagas de insectos por la expresión inducible por lesión de una cantidad controladora de proteína insecticida. El término controladora significa una cantidad tóxica (letal) o combativa (sub-letal). Preferentemente, después de la inducción, se produce una dosis alta (definida previamente en esta memoria). Al mismo tiempo, las plantas deben ser morfológicamente normales y se pueden cultivar de la manera habitual para el consumo y/o la producción de productos. Además, dichas plantas deberían obviar sustancialmente la necesidad de insecticidas químicos o biológicas (para los insectos diana de la proteína insecticida).

Se pueden emplear diferentes ensayos para medir el efecto de la expresión de la proteína insecticida en la planta. Más particularmente, la toxicidad de la proteína insecticida producida en una planta de maíz contra Ostrinia nubilalis o ECB (denominada también eficacia de ECB en esta memoria) se puede evaluar in vitro mediante pruebas de la proteína extraída de la planta en bioensayos de alimentación con larvas de ECB o por registro de la mortalidad de las larvas distribuidas sobre material foliar de plantas transformadas en cajas de Petri (ambos ensayos han sido descritos por Jansens et al., 1997). En el campo, la infestación por larvas de ECB de la primera progenie (ECB1) se evalúa basándose en las tasas de lesión de las hojas (Guthrie, 1989) mientras que la evaluación del número total de túneles en los tallos por planta y de la longitud de los túneles en los tallos son indicativas de los daños por alimentación en el tallo ocasionados por la segunda generación de ECB (ECB2) (véase, por ejemplo, Jansens et al., 1997 para el análisis de la longitud de los túneles en los tallos). Las plantas de la presente invención comprenden también opcionalmente en su genoma un gen codificante de resistencia a los herbicidas. Más particularmente, el gen de resistencia a los herbicidas es el gen bar o el gen pat, que confiere a la planta tolerancia al glufosinato, es decir que las plantas son tolerantes al herbicida Liberty^{TM}. La tolerancia a Liberty^{TM} puede comprobarse de diferentes maneras. Por ejemplo, la tolerancia se puede probar por la aplicación de rociado con Liberty^{TM}. Los tratamientos de rociado deben realizarse cuando las plantas se encuentran entre las etapas V2 y V6 para obtener los resultados óptimos. Las plantas tolerantes se caracterizan por el hecho que el rociado de las plantas con al menos 200 gramos de ingrediente activo/hectárea (g.i.a./ha), preferentemente 400 g.i.a./ha, y posiblemente hasta 1600 g.i.a./ha (4 veces la dosis normal de campo), no mata las plantas. Debería efectuarse una aplicación a voleo a una tasa de 28-34 oz (1,96-2,38 kg de Liberty^{TM} + 31b de sulfato de amonio por acre (1 acre = 0,405 ha). El óptimo consiste en aplicar un volumen de 20 galones de agua por acre (187 l/ha) utilizando una tobera plana de tipo abanico, con la precaución de no dirigir las aplicaciones de rociado directamente al verticilo de las plantas a fin de evitar que el agente tensioactivo queme las hojas. El efecto herbicida debería aparecer dentro de las 48 horas y ser claramente visible dentro de 5-7 días. Ejemplos de otros genes de resistencia a herbicidas son los genes codificantes de resistencia a fenmedifam (tales como el gen pmph, patente de EEUU 5.347.047; patente de EEUU 5.543.306), los genes codificantes de resistencia a glifosato (tales como los genes EPSPS, patente de EEUU 5.510.471), los genes codificantes de resistencia a bromoxinilo (tales como se describen en la patente de EEUU 4.810.648), los genes codificantes de resistencia a sulfonilurea (tales como se describen en
EPA 0 360 750), los genes codificantes de resistencia al herbicida dalapón (tales como se describen en WO 99/27116), y los genes codificantes de resistencia a cianamida (tales como se describen en WO 98/48023 y WO 98/56238) y los genes codificantes de resistencia a los inhibidores de glutamina-sintasa, tales como PPT (tales como se describen en EP-A-0 242 236, EP-A-0 242 246, EP-A-0 257 542).

De acuerdo con una realización preferida de la invención, el gen quimérico que comprende un DNA codificante de una proteína insecticida bajo control del promotor TR2' se puede introducir en una planta (de forma simultánea o consecutiva) en combinación con otros genes quiméricos, a fin de obtener diferentes características en la planta (a lo que se hace referencia también como "apilamiento"). De manera similar, la planta de la invención que contiene un gen quimérico que comprende un DNA codificante de una proteína insecticida bajo control del promotor TR2', es particularmente adecuada para combinación con otras características. Dichas otras características incluyen, pero sin carácter limitante, características tales como las codificadas por genes quiméricos que confieren resistencia a los insectos, resistencia a herbicidas, tolerancia al estrés o a la sequía, o características que modifican otras cualidades agronómicas de la planta. Dicha característica puede abarcar también la síntesis de un producto que será recuperado de la planta.

La introducción de un DNA extraño o un gen quimérico en el genoma de una planta, célula o tejido se puede efectuar de diferentes maneras y no es crítica para la presente invención. Se ha logrado una transformación genética exitosa de monocotiledóneas utilizando numerosos métodos que incluyen la transformación mediada por Agrobacterium (descrita, p.ej. para el maíz en la patente de EEUU 6.074.877 o la patente de EEUU 6.140.553), el bombardeo con microproyectiles (descrito, p.ej., por Chen et al., 1994), la absorción directa de DNA en protoplastos (descrita, p.ej., por Data et al. 1999; Poulsen, 1996) y la electroporación (D'Halluin et al., 1992).

Los ejemplos no limitantes siguientes describen la construcción de genes quiméricos que comprenden una secuencia de DNA codificante de una proteína insecticida bajo control del promotor TR2', para expresión en plantas, y plantas resistentes a los insectos obtenidas con ellos. A menos que se indique lo contrario en los ejemplos, todas las técnicas de DNA recombinante se llevan a cabo de acuerdo con protocolos estándar como se describe en Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, EEUU y en los Volúmenes I y II de Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Segunda edición, Academic Press (Reino Unido). Los materiales y métodos estándar para el trabajo molecular en plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D. Croy, publicado conjuntamente por BIOS Scientific Publications Ltd (Reino Unido) y Blackwell Scientific Publications, Reino Unido. Los materiales y métodos estándar para las reacciones en cadena de la polimerasa se pueden consultar en Dieffenbach y Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, y en McPherson et al. (2000) PCR - Basics: From Background to Bench, Primera edición, Springer Verlag, Alemania.

A lo largo de la descripción y los ejemplos, se hace referencia a las secuencias siguientes representadas en el listado de secuencias:

SEQ ID NO:1 : secuencia de nucleótidos de una realización preferida del promotor TR2'

SEQ ID NO:2 : secuencia de pTSVH0212

SEQ ID NO:3 : secuencia de una secuencia codificante de cry1Ab modificada

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Ejemplos Ejemplo 1 Generación de sucesos con un gen extraño bajo control del promotor TR2' a) Desarrollo de los sucesos

Para la evaluación de la expresión inducida por lesión de una secuencia de DNA codificante de un gen insecticida, se obtuvo un constructo que comprendía una región promotora que comprendía el promotor TR2' (Velten et al. 1984) que dirige la expresión de una proteína cry1Ab modificada. Se utilizó el plásmido pTSVH0212 que contiene los genes diana ubicados entre los bordes de T-DNA (denominado también "TR2'-Cry1Ab") para transformación mediada por Agrobacterium (WO 98/37212).

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La estructura del constructo PTSVH0212 se muestra en la tabla 1. Para las plantas de control con expresión constitutiva de la proteína insecticida, se realizaron transformaciones con constructos que comprendían una secuencia de DNA codificante de la proteína Cry1Ab modificada bajo el control del promotor 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor (Franck et al. 1980)(denominado 35S-cry1Ab), o el promotor del gen GOS2 del arroz (de Pater et al., 1992) con el conductor cab22 de la petunia (Harpster et al. 1988)(también denominado "Gos/cab-cry1Ab") o la secuencia conductora 5' del gen GOS2 del arroz, que contiene el segundo exón, el primer intrón y el primer exón del transcrito GOS (de Pater et al., 1992)(denominado "Gos/gos-cry1Ab"). Todos los constructos incluían el gen 35S-bar.

TABLA 1 Posiciones de nucleótidos de los elementos genéticos en pTSVH0212 (TR2'-cry1Ab)

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Se seleccionaron plántulas regeneradas basándose en la tolerancia a Liberty.

b) Evaluación de los sucesos

Se comprobaron los transformantes de Agrobacterium, en cuanto a la presencia de la secuencia vectora en el borde izquierdo del T-DNA. Se llevaron a cabo análisis de transferencia Southern con material foliar de los transformantes primarios (T0).

Ejemplo 2 Expresión inducida por lesión de una proteína insecticida i) Expresión basal de la proteína insecticida

Se determinó el nivel de expresión basal de la proteína insecticida Cry1Ab modificada mediante un ELISA sándwich de Cry1Ab con una fracción de IgG policondensada de un antisuero policlonal de conejo contra Cry1Ab como primer anticuerpo y un anticuerpo monoclonal contra Cry1Ab como segundo anticuerpo, después de la extracción de la proteína soluble utilizando el método de extracción y el tampón descritos en Jansens et al., 1997. Se obtuvieron muestras de hojas de plantas en la etapa V3, polen y hojas de plantas en la etapa R1 y hojas, tallo y polen de la cosecha tomadas de plantas en invernadero (las etapas del maíz son las definidas en "How a Corn Plant Develops", Informe Especial Nº 48, Universidad de Ciencia y Tecnología del Estado de Iowa, Servicio de Extensión Cooperativa, Ames, Iowa, Reimpreso en junio de 1993; véase también el sitio de internet que contiene la información relevante
en:

\underline{http://www.extension.iastate.edu/pages/hancock/agriculture/corn/corn\_develop/CornGrowthStages.html:}). A efectos comparativos, se tomaron muestras de plantas transformadas con los constructos Gos/gos-cry1Ab.

En la tabla 2 se proporcionan los resultados como porcentaje de proteína Cry1Ab detectada por proteína soluble total (medido utilizando el ensayo de Bradford (Bio-Rad, Richmond, CA; Bradford, 1976)). El valor medio representa el promedio de 5 muestras tomadas de diferentes líneas de plantas de un suceso de transformación.

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TABLA 2 Expresión de la proteína Cry1Ab en diferentes tejidos de plantas transformadas con los constructos TR2'-cry1Ab y Gos/gos-cry1Ab

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En las plantas obtenidas por transformación con el constructo TR2'-cry1Ab, se encontró que los valores medios para la expresión basal de la proteína cry1Ab modificada en invernadero se encontraban por debajo del límite de detección (0,001% ó 0,000% de proteína soluble total) en todas las muestras de hoja tomadas de plantas en la etapa V3, en la etapa R1 o en el momento de la cosecha. Se encontró que la expresión basal media de la proteína insecticida en el tallo representaba aproximadamente un 0,01% del contenido de proteína soluble total para la mayoría de las plantas en el momento de la cosecha. En las plantas obtenidas con el constructo Gos/gos-cry1Ab, la expresión de la proteína Cry1Ab era superior al 0,2% en todas las muestras de hoja y hasta mayor que 1% en algunas de las muestras de tallo tomadas en el momento de la cosecha.

ii) Expresión inducida por lesión de la proteína insecticida

Se llevaron a cabo estudios en invernadero para determinar la expresión de la proteína insecticida Cry1Ab después de deterioro mecánico en plantas no transformadas, plantas transformadas con el constructo TR2'-cry1Ab y plantas transformadas con el constructo Gos/cab-cry1Ab. Se lesionaron hojas y raíces efectuando cortes en las mismas. Las lesión se realizaron sobre hojas completamente expandidas, se efectuaron cortes perpendiculares separados por 1 mm con un bisturí sobre la hoja sin dañar la nervadura central. Se tomaron muestras de las hojas antes y 18 h después del deterioro mecánico. Los niveles de proteína Cry1Ab se midieron por ELISA (Tabla 3) en las partes de hoja cortadas (las partes de hoja se cortaron entre 2 y 3 mm alrededor de la lesión) que se incubaron durante 18 horas en una cámara de crecimiento a 20ºC colocadas en una caja de Petri sobre un papel de filtro humedecido con medio de Murashige y Skoog (medio MS, véase Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D. Croy, publicado conjuntamente por BIOS Scientific Publications Ltd (Reino Unido) y Blackwell Scientific Publications, Reino Unido, para composición); se cortaron de plantas trozos de hojas de control de tamaño similar y se pusieron inmediatamente en hielo seco para la medición de proteína (sin incubación in vitro). Los valores medios representan los promedios de 5 plantas por suceso de transformación.

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Nuevamente, la expresión de la proteína Cry1Ab estaba ausente o se hallaba alrededor del límite de detección en hojas, tallo y granos de los diferentes sucesos TR2'-cry1Ab sometidos a test. No se encontró expresión significativa alguna en hojas y polen en plantas en la etapa V4 ni en la etapa de floración de la planta. Se observó expresión constitutiva de aproximadamente 0,02-0,03% de la proteína soluble total en las raíces de estas plantas. Cuando las hojas se lesionan mecánicamente, se induce la expresión de la proteína Cry1Ab y aumenta hasta un 0,05-0,1%. Los sucesos 35S-cry1Ab mostraron una expresión constitutiva de la proteína Cry1Ab de aproximadamente 0,5% en las hojas de plantas V3, independientemente de la lesión. Durante la floración y la recolección se midieron niveles de expresión de aproximadamente 0,1-0,2% antes y después de la lesión.

Un ensayo similar, en el que la lesión se produjo in planta (sin incubación in vitro de una parte de hoja cortada), sobre plantas cultivadas en invernadero, dio como resultado valores de expresión más bajos, pero aún con un incremento marcado en la expresión después de la lesión. En este ensayo, se pusieron larvas de ECB de la segunda etapa entre mudas en jaulas tipo clip sobre cinco plantas de maíz de WI602-0402 en la etapa VT. Sesenta horas después, se tomaron muestras del área lesionada de las hojas en la jaula-clip, de hojas situadas 2 cm o 10 cm por encima y por debajo de la jaula-clip, y de una hoja por encima y por debajo de la hoja con la jaula clip. Se tomaron también muestras de hoja al comienzo del experimento. Se corrió un ELISA Cry1Ab con las muestras y se calcularon la media (en negrita) y la desviación estándar. Los resultados se muestran a continuación en la tabla 4.

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TABLA 4 Concentración de Cry1Ab en plantas TR2'-Cry1Ab (lesión por ingesta de alimento por los insectos)

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En otro ensayo, se lesionaron cinco plantas en la etapa VT de los sucesos WI604-1602 y WI606-1206 con un bisturí en invernadero. Cuarenta horas después, se tomaron muestras de cada planta del área de hoja lesionada (por regla general entre 2 y 3 mm alrededor del sitio de la lesión), de la misma hoja 2 cm y 10 cm hacia arriba y abajo con respecto al área lesionada y de una hoja por encima y por debajo de la hoja lesionada. Se tomaron también muestras de hoja al comienzo del experimento.

Se corrió un ELISA Cry1Ab con las muestras, y se calcularon la media (en negrita) y la desviación estándar.

Los resultados se muestran a continuación en la tabla 5.

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TABLA 5 Concentración de Cry1Ab en las líneas de plantas TR2'-Cry1Ab (lesión con bisturí)

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Las mediciones en pruebas de campo adicionales confirmaron los bajos niveles de expresión basales de la proteína Cry1Ab en las plantas (usando material foliar fresco tomado de las plantas, no incubadas in vitro): en una prueba de campo con 5 líneas de plantas endogámicas por suceso que comprenden el constructo pTR2'-Cry1Ab, entre 0,001 y 0,003% de proteína soluble total de las hojas era proteína Cry1Ab (una media de 5 plantas por suceso (desviación estándar promedio entre 0,001 y 0,004%)) en el campo. Además, en otra prueba de campo se demostró que se encuentra más proteína Cry1Ab en plantas de maíz infestadas artificialmente con larvas de ECB en el campo que en las plantas no infestadas con insectos. Los niveles de expresión para Cry1Ab hallados en esta prueba (8 plantas) eran como promedio entre 0,001 y 0,002% de proteína soluble total en la hoja vegetativa, entre 0,003 y 0,046% de proteína soluble total en la hoja R1, y entre 0,009 y 0,017% de proteína soluble total en hoja R5-6 (usando material foliar fresco tomado de las plantas, no incubadas in vitro). Como era de esperar, la infestación por insectos en el campo proporcionó una mayor concentración de proteína Cry1Ab en algunas plantas (las muestras se tomaron aleatoriamente de las plantas).

Ejemplo 3 Resistencia a los insectos de las plantas con expresión inducible por lesión a) Eficacia contra una infestación controlada con larvas de ECB en el cuarto etapa entre mudas

Se pusieron plantas de maíz en la etapa media del verticilo en un cilindro de plexiglás y se infestaron con 10 ó 15 larvas en la cuarta etapa entre mudas del barrenador del maíz europeo. Después de 10 días se disecaron las plantas y se calculó el porcentaje de supervivencia de las larvas por planta. Los resultados se muestran en la tabla 6.

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TABLA 6 Eficacia contra las larvas de ECB en la cuarta etapa entre mudas

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Se encontró que la eficacia de la represión de las larvas de ECB en la cuarta etapa entre mudas en la infestación controlada era 100% para todas las plantas TR2'-cry1Ab evaluadas. Las plantas de control mostraron como promedio un máximo de 50% de mortalidad. Dado que se considera que las larvas de ECB en la cuarta etapa entre mudas son entre 25 y 100 veces menos susceptibles a la proteína cry1Ab modificada que las larvas de la primera etapa entre mudas, el nivel de proteína producido en las plantas TR2'-cry1Ab puede ser considerado como una "dosis alta", aun cuando se observa por regla general que los valores de expresión medidos en dichas plantas después de la inducción por lesión son todavía relativamente bajos.

b) Eficacia contra ECB

Se evaluaron catorce sucesos respecto a eficacia contra ECB en invernadero y en pruebas de campo (Tabla 7). Los resultados se muestran como longitud media de los túneles (con el valor de la desviación estándar indicado entre paréntesis) con respecto a la longitud máxima de los túneles para cada planta (promedio(d.e.)/longitud máx/pl). En el invernadero, la longitud media de los túneles se obtuvo de mediciones en 10 plantas. En el campo, la eficacia contra ECB se expresa como el promedio de 3 valores obtenidos para diferentes grupos de 10 plantas. Cuatro de los cinco sucesos de una sola copia (indicados con un asterisco) proporcionaron un control total de ECB2, determinado como una longitud media de túnel menor que 3,5 cm.

TABLA 7 Eficacia contra ECB en invernadero y en pruebas de campo

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No se observaron desventajas en cuanto al rendimiento agronómico de las plantas después de la segunda autopolinización (mazorca a surco) de los diferentes sucesos TR2' en cualquiera de los sitios evaluados.

c) Eficacia contra Sesamia nonagrioides

Se infestaron cinco plantas de maíz en la etapa media del verticilo que comprendían el constructo TR2'-cry1Ab con 2 masas de huevos. Los daños fueron evaluados después de 14 días y se efectuó un recuento del número de larvas. Se promediaron las tasas de daño (expresadas como altura de la planta y longitud de los túneles por planta en cm) para las cinco plantas. Los resultados se muestran en la tabla 8.

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TABLA 8

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Los resultados indican que tiene lugar también una represión satisfactoria del barrenador del tallo del Mediterráneo en las plantas TR2'-cry1Ab evaluadas.

Ejemplo 4 Análisis comparativo

Se lleva a cabo el análisis de la expresión utilizando el promotor MPI (descrito por Breitler et al., 2001, como un promotor inducido por lesión) en plantas de maíz con la misma secuencia codificante de Cry1Ab utilizada anteriormente para comparar los niveles basales (no inducidos) y la inducción por lesión en el campo. Las plantas de maíz que expresan la porción de proteína insecticida Cry1Ab bajo el control de este promotor MPI muestran una media de nivel de expresión basal de al menos aproximadamente 0,04% de proteína Cry1Ab por proteína soluble total en las hojas en las pruebas en invernadero. Asimismo, en las pruebas iniciales en invernadero utilizando los sucesos 2 MPI-Cry1Ab, se observa cierta variación en los niveles de expresión después de la lesión, pero en estos sucesos no se observa un incremento inducido por lesión de la expresión de la proteína Cry1Ab (media) de al menos 5 veces con respecto al nivel basal (medio) (después de lesión mecánica), cuando se mide la concentración tanto en material vegetal recién recogido de estas plantas como en partes de hoja desprendidas que son incubadas in vitro (en ambos casos, la concentración se mide en muestras diferentes a las 21 horas y 42 horas después de la lesión). Por tanto, existe sólo una débil inducción, o ninguna, de la expresión de la proteína Cry1Ab (en comparación con el nivel de expresión basal de la proteína) en estos ensayos con el promotor MPI.

Asimismo, en análisis comparativos, se compara el rendimiento en el campo de las plantas de la invención, utilizando el promotor TR2', con plantas de maíz disponibles comercialmente que expresan una porción de la proteína Cry1Ab. En estos ensayos, se utilizaron plantas de maíz obtenidas de los sucesos MON810 y Bt11 (para descripción detallada, véanse las solicitudes publicadas USDA de estos sucesos de maíz ya aprobados), que emplean un promotor 35S para obtener niveles de expresión constitutivos altos y que se sabe proporcionan una resistencia de dosis alta a los insectos.

En una prueba de campo, la longitud promedio de los túneles (en cm por tallo, medida después de partir el tallo como se describe en Jansens et al. (1997)) para infestación artificial con el barrenador del maíz europeo es 0, 0, 0,04, 0 y 0,21 cm, respectivamente, para 5 sucesos diferentes de Cry1Ab-TR2' en el maíz, en tanto que la longitud promedio de túneles para MON810 en el maíz es 0,3 y para Bt11 en el maíz es 0,13 (en líneas de maíz de control no transformadas, se observan longitudes de túnel de 12,2 a 39,92 cm en la misma prueba).

Por tanto, el análisis comparativo del promotor TR2' inducido por lesión en el maíz muestra que la expresión de una proteína insecticida bajo el control del promotor TR2' en el maíz proporciona un nivel alto de resistencia a los insectos, comparable al que se puede obtener con los sucesos disponibles comercialmente que contienen promotores constitutivos.

En otra prueba de campo, la longitud promedio de los túneles (en cm por tallo, medida después de partir el tallo como se describe en Jansens et al. (1997)) para una infestación artificial con el barrenador del maíz del Sudoeste es 0,53; 0,68; 0,3; 0,64 y 0,6 cm, respectivamente, para los 5 sucesos diferentes de Cry1Ab-TR2' en maíz, en tanto que la longitud media para MON810 en el maíz es de 0,43 y para Bt11 en el maíz es de 0,15 (en líneas de maíz de control no transformadas se encuentran longitudes de túnel entre 32 y 39,6 cm en la misma prueba, y en algunos casos no había planta alguna en pie, por rotura del tallo debida a los túneles).

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<120> Expresión inducible por lesión en plantas

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<130> WINEXP WO1

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<150> US 10/137325

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<151> 2002-05-03

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<160> 3

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<170> PatentIn version 3.2

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<210> 1

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<211> 483

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<212> DNA

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<213> Agrobacterium tumefaciens

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<400> 1

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13

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<210> 2

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<211> 13199

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Secuencia del plásmido pTSVH0212

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<220>

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<221> características diversas

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<222> (1)..(25)

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<223> Secuencia del borde izquierdo de TL-DNA de pTiB6S3

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<220>

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<221> señal poliA

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<222> (56)..(316)

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<223> Fragmento que contiene señales de poliadenilación de la región no traducida 3' del gen de la nopalina-sintasa del DNA-T de pTiT37 de pTiT37

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<220>

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<221> características diversas

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<222> (336)..(887)

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<223> Secuencia codificante de la fosfinotricin-acetiltransferasa de Streptomyces hygroscopicus

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<220>

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<221> promotor

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<222> (888)..(1720)

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<223> Región promotora del transcrito 35S del virus del mosaico de la coliflor (P35S)

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<220>

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<221> promotor

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<222> (1770)..(2252)

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<223> Fragmento promotor TR2' derivado del T-DNA derecho de la cepa de Agrobacterium ACH5 de tipo octopina

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<220>

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<221> características diversas

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<222> (2261)..(4114)

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<223> parte codificante de la secuencia de la proteína Cry1Ab5 (cry1Ab modificada)

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<220>

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<221> señal poliA

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<222> (4128)..(4422)

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<223> Fragmento que contiene señales de poliadenilación de la región 3' no traducida del gen de octopina-sintasa del TL-DNA de pTiAch5

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<220>

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<221> características diversas

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<222> (4470)..(4446)

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<223> Secuencia del borde izquierdo de TL-DNA de pTiB6S3

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<400> 2

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14

15

16

17

18

19

20

21

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<210> 3

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<211> 1854

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> secuencia codificante de la proteína cry1Ab modificada

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<400> 3

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22

23

Claims (28)

1. Una planta monocotiledónea resistente a los insectos que comprende, integrado de manera estable en su genoma, un gen quimérico que comprende una secuencia de DNA que codifica una proteína insecticida bajo control de una región promotora que comprende el promotor TR2' del gen de manopina-sintasa de Agrobacterium tumefaciens.

2. La planta de la reivindicación 1, en donde dicha planta expresa una dosis alta de dicha proteína insecticida.

3. La planta de la reivindicación 1 ó 2, en donde dicha planta es una planta de maíz y en donde dicha planta de maíz mata al menos 97% de las larvas del barrenador del maíz europeo de la cuarta etapa entre mudas en un bio-ensayo de 10 días.

4. La planta de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha proteína insecticida es una toxina de Bacillus thuringiensis.

5. La planta de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho promotor TR2' es una región promotora que comprende un fragmento de SEQ ID NO: 1 que abarca desde una posición de nucleótido comprendida entre las posiciones de nucleótido 1 y 336 hasta la posición del nucleótido 483.

6. La planta de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho promotor TR2' comprende la secuencia de nucleótidos 96 a 483 de SEQ ID NO: 1.

7. La planta de la reivindicación 6, en donde dicho promotor TR2' comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1.

8. Un método para obtener expresión inducida por lesión de una toxina insecticida en una planta monocotiledónea, comprendiendo dicho método introducir en la planta un gen quimérico que comprende:

a)

una secuencia de DNA que codifica una proteína insecticida, enlazada operativamente a

b)

una región promotora expresable en la planta que comprende el promotor TR2'.

9. El método de la reivindicación 8, en donde dicho promotor TR2' es una región promotora que comprende un fragmento de SEQ ID NO: 1 que abarca desde una posición de nucleótido entre las posiciones de nucleótido 1 y 336 hasta la posición del nucleótido 483.

10. El método de la reivindicación 9, en donde dicho promotor TR2' comprende la secuencia de nucleótidos 96 a 483 de SEQ ID NO: 1.

11. El método de la reivindicación 10, en donde dicho promotor TR2' comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en donde dicha planta monocotiledónea expresa una dosis alta de dicha proteína insecticida.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en donde dicha planta monocotiledónea es maíz y en donde dicha planta de maíz mata al menos 97% de las larvas del barrenador del maíz europeo de la cuarta etapa entre mudas en un bio-ensayo de 10 días.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, en donde dicha planta monocotiledónea es maíz, y en donde dicha expresión inducida por lesión se caracteriza por un nivel de expresión basal medio de la proteína insecticida en las hojas de dicha planta de 0,005 por ciento de proteína soluble total o menos en plantas cultivadas en invernadero.

15. Un método para producir una planta monocotiledónea resistente a los insectos, comprendiendo dicho método introducir en el genoma de dicha planta un gen quimérico que comprende:

a)

una secuencia de DNA que codifica una proteína insecticida, enlazada operativamente a

b)

una región promotora expresable en la planta que comprende el promotor TR2'.

16. El método de la reivindicación 15, en donde dicho promotor TR2' es una región promotora que comprende un fragmento de SEQ ID NO: 1 que abarca desde una posición de nucleótido comprendida entre las posiciones de los nucleótidos 1 y 336 hasta la posición del nucleótido 483.

17. El método de la reivindicación 16, en donde dicho promotor TR2' comprende la secuencia de nucleótidos 96 a 483 de SEQ ID NO: 1.

18. El método de la reivindicación 17, en donde dicho promotor TR2' comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1.

19. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en donde dicha planta monocotiledónea expresa una dosis alta de dicha proteína insecticida.

20. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, en donde dicha planta monocotiledónea es maíz, y en donde dicha planta monocotiledónea mata al menos 97% de las larvas del barrenador del maíz europeo de la cuarta etapa entre mudas en un bioensayo de 10 días.

21. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, en donde dicha planta monocotiledónea es maíz, y en donde dicha expresión inducida por lesión se caracteriza por un nivel de expresión basal medio de la proteína insecticida en las hojas de dicha planta de 0,005 por ciento de proteína soluble total o menos en plantas cultivadas en invernadero.

22. El método de la reivindicación 8, en donde el nivel medio de expresión en las hojas de dicha planta en el invernadero, en ausencia de lesión, es 0,005 por ciento de proteína soluble total o menos, y después de lesión dicho nivel medio de expresión aumenta al menos 5 veces.

23. El método de la reivindicación 22, en donde dicha planta monocotiledónea es maíz y en donde dicha planta de maíz mata al menos 97% de las larvas del barrenador del maíz europeo de la cuarta etapa entre mudas en un bioensayo de planta entera de 10 días.

24. El método de la reivindicación 22 ó 23, en donde dicha planta es maíz y en donde dicha expresión basal de 0,005 por ciento o menos se mide en hojas de la etapa V4.

25. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, en donde dicha proteína insecticida es una proteína Bt.

26. El método de la reivindicación 25, en donde dicha proteína Bt se selecciona del grupo de Cry1Ab, Cry1F, Cry2Ae, Cry9C y Cry2Ab y fragmentos insecticidas de las mismas.

27. La planta de la reivindicación 1, en donde dicha proteína es la proteína codificada por SEQ ID NO: 3.

28. La planta de la reivindicación 4, en donde dicha proteína Bt se selecciona del grupo de Cry1Ab, Cry1F, Cry2Ae y Cry2A y fragmentos insecticidas de las mismas.