ES2400809T3 - Secuencias de nucleótidos que codifican proteínas insecticidas - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido que codifica una proteína insecticida que comprende la secuencia de aminoácidos como sepresenta en la SEC ID Nº: 2 desde la posición del aminoácido a la posición del aminoácido 600.

Description

Secuencias de nucleótidos que codifican proteínas insecticidas

Antecedentes de la invención

La presente invención proporciona nuevas secuencias codificantes para su uso en plantas. Las secuencias codificantes codifican una proteína insecticida quimérica, tóxica para una amplia diversidad de plagas de especies de lepidópteros, en cultivos.

Desde hace tiempo se han usado formulaciones comerciales de aislados de origen natural de B. thuringiensis para el control biológico de plagas de insectos en la agricultura. Las esporas y los cristales de Bt obtenidos de la fermentación de la especie Bacillus thuringiensis se concentran y se formulan para aplicación foliar de acuerdo con las prácticas agrícolas convencionales.

Se conocen miembros de la familia de las proteínas cristal Cry1 que presentan bioactividad contra larvas de insectos lepidópteros y que son útiles como agentes para el control de plagas de insectos lepidópteros. La forma precursora de las δ-endotoxinas de Cry1 consiste en dos segmentos aproximadamente del mismo tamaño. La parte carboxiterminal de la proteína precursora, o segmento pro-toxina, estabiliza la formación del cristal y no presenta actividad insecticida. La mitad amino-terminal de la proteína precursora comprende el segmento toxina de la proteína Cry1 y, basándose en el alineamiento de secuencias conservadas o sustancialmente conservadas dentro de los miembros de la familia Cry1, puede subdividirse adicionalmente en tres dominios estructurales. Estos tres subdominios se basan en un modelo estructural cristalográfico tridimensional de una δ-endotoxina de Cry1A en la cual los tres subdominios se denominan Dominio I, Dominio lI y Dominio lIl, respectivamente, según se mide desde el extremo amino del segmento toxina de la proteína. El Dominio I comprende aproximadamente el primer tercio del segmento toxina activo y se ha observado que es esencial para la formación de canales (Thompson y col., 1995). Los Dominios lI y Dominio lIl comprenden aproximadamente los segmentos central y carboxi-terminal, respectivamente, de la parte de toxina activa. Ambos Dominios lI y lIl se han implicado en la unión a receptores y en la especificidad por especies de insecto, dependiendo del insecto y de la δ-endotoxina que se esté examinando (Thompson y col., 1995).

La probabilidad de crear arbitrariamente una proteína quimérica con propiedades mejoradas a partir de la reagrupación de las estructuras dominio de las numerosas proteínas de cristal insecticidas nativas conocidas en la técnica es remota. Esto se debe a la naturaleza compleja de la estructura, al plegamiento, a la oligomerización y a la activación de la proteína, incluyendo el procesamiento proteolítico correcto del precursor quimérico, si se expresa en dicha forma, para liberar un segmento toxina insecticida. Únicamente seleccionando cuidadosamente las regiones diana específicas dentro de cada proteína parental para la inclusión en una estructura quimérica pueden construirse toxinas insecticidas funcionales que presenten una actividad insecticida mejorada en comparación con las proteínas parentales a partir de las cuales derivan las quimeras. La experiencia ha demostrado que el reensamblaje de los dominios toxina, es decir, el ensamblaje de una toxina quimérica que consiste en el dominio I, II y III de cualquiera de dos o más toxinas que son diferentes entre sí, da como resultado la construcción de una proteína que presenta una formación cristalina defectuosa y/o la ausencia completa de cualquier actividad insecticida detectable dirigida a una especie de insecto plaga diana preferida. En algunos casos, una toxina quimérica presentará buenas propiedades para la formación de cristales, aun presentando actividad insecticida no detectable. Solo se formulan quimeras insecticidas eficaces por ensayo y error, e incluso después, no es seguro que el experto en la materia de con una quimera que presente actividad insecticida que sea equivalente a, o en comparación mejor que, cualquier proteína de toxina parental individual a partir de la cual pueden haber derivado los constituyentes de la quimera.

La bibliografía describe ejemplos de la construcción o el ensamblaje de proteínas quiméricas a partir de dos o más precursores de proteínas de cristal insecticidas de Bt, aunque no todas presentaban propiedades insecticidas o de formación de cristales que fuesen equivalentes a, o en comparación mejor que, las proteínas precursoras a partir de las cuales derivaban las quimeras. (Bosch y col. (WO95/06730); Thompson y col. (WO95/30753); Thompson y col. (WO95/30752); Malvar y col. (WO98/22595); Gilroy y col. (Patente de Estados Unidos Nº 5.128.130); Gilroy (Patente de Estados Unidos Nº 5.055.294); Lee y col. (1992) Gene 267: 3115-3121; Honee y col. (1991) Mol. Microbiol. 5 : 2799-2806; Schnepf y col. (1990) J. Biol. Chem. 265: 20923-20930; Perlak y col. (1990) Bio/rechnol. 8: 939-9943; Perlak y col. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 313-321).

Se ha demostrado que la expresión de δ-endotoxinas de B. thuringiensis en plantas de maíz transgénicas es un medio eficaz para controlar plagas de insectos importantes desde el punto de vista agrícola (Perlak y col. 1990; 1993). Los cultivos transgénicos que expresan δ-endotoxinas de B. thuringiensis permiten a los agricultores reducir significativamente el tiempo y los costes asociados con las aplicaciones de insecticidas químicos aplicados por vía tópica. El uso de transgenes que codifiquen δ-endotoxinas de B. thuringiensis es particularmente ventajoso. Las plantas de cultivo que expresan δ-endotoxinas de B. thuringiensis en áreas con una fuerte presión de insectos presentan rendimientos mejorados que son mejores que, o de otra manera, similares a los de variedades de plantas comerciales no transgénicas similares. Sin embargo, se espera que los insectos puedan desarrollar resistencia a las δ-endotoxinas de B. thuringiensis expresadas en plantas transgénicas. Di dicha resistencia llegase a dispersarse, limitaría claramente el valor comercial del germoplasma que contiene los genes que codifican dichas δ-endotoxinas

de B. thuringiensis. Un posible manera de aumentar la eficacia de los insecticidas transgénicos contra plagas diana y reducir al mismo tiempo el desarrollo de plagas resistentes a insecticidas sería garantizar que los cultivos transgénicos expresasen altos niveles de δ-endotoxinas de B. thuringiensis. (McGaughey and Whalon 1993; Roush 1994). Además, teniendo un banco de genes insecticidas que fuesen eficaces contra grupos de plagas de insectos y que manifestasen sus efectos a través de diferentes modos de acción se podría proteger contra cualquier desarrollo de resistencia. La expresión en una planta de dos o más composiciones insecticidas tóxicas contra la misma especie de insecto, expresándose cada insecticida a niveles lo suficientemente altos como para retrasar eficazmente la aparición de la resistencia, sería otra manera de conseguir el control del desarrollo de la resistencia. Son ejemplos de dichos insecticidas útiles en dichas combinaciones los que incluyen, pero sin limitación, toxinas de Bt, proteínas insecticidas de Xenorhabdus sp. de Photorhabdus sp., proteínas y/o permuteínas de patatina desalergenizadas y desglucoxiladas, lectinas de plantas y similares. Ha sido difícil conseguir la co-expresión de múltiples proteínas activas desde el punto de vista insecticida en la misma planta, y/o altos niveles de expresión de estas proteínas insecticidas sin producir efectos morfológicos no deseables a las plantas.

De las más de doscientas cincuenta proteínas insecticidas individuales que se han identificado procedentes de la especie Bacillus thuringiensis, tan solo se han ensayado unas cuantas para la expresión en plantas. Diversas Cry1’s, Cry3’s, Cry2Aa y Cry2Ab, toxinas binarias Cry33/34 y Cry23/37 y una Cry9 se han expresado con éxito en plantas. Las proteínas Cry1 representan la clase de proteínas más grande que se haya expresado en plantas, pero ninguna se ha expresado a altos niveles. Ha sido necesario dirigir la Cry2Ab al cloroplasto para impedir efectos citotóxicos no deseables. La mayoría de acres plantados con plantas recombinantes expresan las proteínas Cry1A. La probabilidad de la aparición de resistencia a proteínas Cry1A por especies de plagas de insectos diana es sustancialmente mayor de la que sería si también se expresase un alelo con tratamiento de resistencia junto con el alelo cry1 o si el alelo cry1 se expresase a altos niveles. Por tanto es deseable desarrollar genes toxina alternativos para la expresión en plantas como complementos y sustitutos de los que actualmente se están usando en la primera y segunda generación de plantas transgénicas resistentes a insectos.

Sumario de la invención

La invención proporciona un polinucleótido que codifica una proteína insecticida que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEC ID Nº: 2 desde la posición 10 de aminoácido a la posición 600 de aminoácido. Dicho polinucleótido es adecuado para la expresión en plantas y codifica una proteína insecticida que presenta propiedades inhibidoras de insectos lepidópteros. La SEC ID Nº: 1 es un ejemplo de dichas secuencias de nucleótidos que consiste en un gen cry1A. 105 y codifica una proteína Cry1A. 105 inhibidora de insectos. La SEC ID Nº: 1 es similar a la SEC ID Nº: 3, codificando ambas una proteína Cry1A. 105. Se prefiere la SEC ID Nº: 1 para su uso en células de plantas dicotiledóneas, mientras que se prefiere la SEC ID Nº: 3 para su uso en células de plantas monocotiledóneas. La SEC ID Nº: 3 codifica la SEC ID Nº: 4 y es idéntica, en cuanto a la secuencia de aminoácidos, a la SEC ID Nº: 2.

La invención también proporciona una proteína insecticida que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEC ID Nº: 2 desde la posición del aminoácido 10 a la posición del aminoácido 600 que presenta actividad inhibidora dirigida contra especies de insectos lepidópteros. Las proteínas insecticidas anteriores, que contienen al menos la proteína toxina Cry1A.105, también se denominan, en lo sucesivo en el presente documento, proteínas Cry1A.105 insecticidas. La proteína precursora de longitud completa consiste en aproximadamente 1177 aminoácidos como se expone en la SEC ID Nº: 2. Se pretende incluir dentro del alcance de la invención cualquier composición que consista en una cantidad eficaz desde el punto de vista insecticida de la proteína Cry1A.105 insecticida.

La invención también proporciona un casete de expresión para su uso en la expresión de una proteína insecticida como se expone en la SEC ID Nº: 2 en una célula huésped. El casete de expresión contiene preferentemente un promotor funcional en la célula huésped deseada que está unido a, y regula la expresión de, una secuencia de nucleótidos que codifica un segmento insecticida de una proteína Cry1A.105. En el presente documento se proporcionan casetes de expresión ejemplares como se expone en la SEC ID Nº: 5 y SEC ID Nº: 7, destinados para su uso en una célula de una planta dicotiledónea o en una célula de una planta monocotiledónea respectivamente. El promotor y la secuencia codificante están unidos operativamente y funcionan juntos en la célula huésped. El casete de expresión puede destinarse para su uso en cualquier célula huésped, pero preferentemente para su uso en una célula bacteriana, una célula fúngica, una célula de mamífero o una célula vegetal. Preferentemente, las células bacterianas se seleccionan del grupo que consiste en una célula de especies de Bacillus, una célula de especies de Enterobacteriacae, una célula de especies de Pseudomonas, una célula de especies de Clostridium, una célula de especies de Rhizobium y una célula de especies de Agrobacterium. Si la célula huésped es una célula vegetal, es preferible que esta célula se seleccione de una célula de una especie de planta de cultivo, preferentemente una célula de planta dicotiledónea o una célula de planta monocotiledónea. Son ejemplos de células de plantas dicotiledóneas la alfalfa, manzana, albaricoque, espárrago, judía, baya, mora, arándano, colza, zanahoria, coliflor, apio, cereza, garbanzo, tilo, algodón, alubia, arándano agrio, pepino, cucurbitácea, berenjena, árbol frutal, uva, limón, lechuga, lino, melón, mostaza, árbol de frutos secos, quimbombo, naranja, guisante, melocotón, cacahuete, pera, ciruela, patata, soja, calabaza, fresa, remolacha azucarera, girasol, batata, tabaco, tomate, nabo y hortalizas. Son ejemplos de células de plantas monocotiledóneas el maíz, trigo, avena, arroz, sorgo, mijo, trigo negro, centeno, grama (festuca, timothy, bromo, vergel, San Agustín, Bermuda, agróstide) y cebada. Los

casetes de expresión destinados para su uso en una célula vegetal contienen típicamente secuencias unidas operativamente que regulan los niveles y la eficacia de la expresión de una sustancia deseada, tal como la proteína insecticida Cry1A.105. Dichas secuencias pueden ser una secuencia potenciadora de la expresión, una secuencia líder no traducida, una secuencia intrónica, una secuencia que codifica un péptido que se dirige al cloroplasto y una secuencia poliadenilación y terminación de la transcripción.

El casete de expresión se incorpora preferentemente en un vector para su uso en la estabilización de la conservación de la secuencia codificante de Cry1A.105 dentro de la célula huésped. Un vector puede ser cualquier cantidad de estructuras conocidas en la técnica, pero típicamente es un plásmido o un replicón en el que el casete de expresión se construye o se inserta antes de la incorporación en la célula huésped. Un vector está destinado a incluirse, pero sin limitación, en un plásmido, un cósmido, un bácmido, un fagémido, un YAC (cromosoma artificial de levadura), un BAC (cromosoma artificial bacteriano), un vector suicida, una secuencia de inserción, un transposón o incluso en una secuencia de nucleótidos lineal a la que se une el casete de expresión o en la que se inserta el casete de expresión.

Las plantas transgénicas resistentes a plagas de insectos lepidópteros constituyen una realización de la presente invención. Dichas plantas contienen una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cry1A.105 insecticida como se expone en la SEC ID Nº: 2 desde al menos la posición del aminoácido 10 a aproximadamente la posición del aminoácido 600. La planta transgénica es eficaz en el control de plagas de insectos lepidópteros producidas por insectos tales como enrolladores foliares, gusanos cortadores, gusanos cogolleros, barrenadores, orugas de bolsón y cualquier consumidor de forraje. Las plagas preferidas son el gusano cogollero, el barrenador europeo del maíz, el gusano de la mazorca del maíz (gusano de la cápsula del algodón) y el barrenador sudoccidental del maíz.

La presente invención pretende incluir la progenie y semillas o frutos o productos cosechados de las plantas transgénicas de la presente invención, siempre que la secuencia de nucleótidos de la presente invención que codifica un segmento insecticida de Cry1A.105 se conserve dentro del genoma heredable y/o plastídico de las células de la planta, su progenie, semillas y similares.

La presente invención también proporciona uno o más procedimientos para el control de plagas de insectos lepidópteros de una planta proporcionando en la dieta de un insecto plaga una composición que contenga una cantidad eficaz desde el punto de vista insecticida de una proteína insecticida Cry1A.105. Una composición de este tipo serían las células vegetales que se han formado o que descienden de una célula vegetal transformada con una secuencia de ácido nucleico que codifica un segmento insecticida de una secuencia de aminoácidos de Cry1A.105 como se expone en la SEC ID Nº: 2. Una planta transgénica generada a partir de una célula vegetal transformada para contener un casete de expresión, ilustrado como se expone en la SEC ID Nº: 5 y SEC ID Nº: 7, que contiene una secuencia de codifica una secuencia de aminoácidos insecticida Cry1A. 105, sería un medio para proporcionar una composición insecticida en la dieta de un insecto. Otro medio sería producir una cantidad eficaz desde el punto de vista insecticida de una proteína Cry1A. 105 en una célula bacteriana o fúngica y proporcionar la célula bacteriana o la célula fúngica o una cantidad purificada de la proteína Cry1A.105 en la dieta de uno o más insectos plaga diana susceptibles a la proteína Cry1A. 105.

Siendo obvias las diversas ventajas y características de la presente invención, la naturaleza de la invención puede entenderse más claramente por referencia a la siguiente descripción detallada, a los ejemplos y a las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de las secuencias

La SEC ID Nº: 1 es una secuencia sintética para la expresión de una proteína insecticida Cry1A.105, preferentemente en una célula de una planta dicotiledónea.

La SEC ID Nº: 2 es una proteína Cry1A.105 codificada a partir de la secuencia de nucleótidos como se expone en la SEC ID Nº: 1.

La SEC ID Nº: 3 es una secuencia sintética para la expresión de una proteína insecticida Cry1A.105, preferentemente en una célula de una planta monocotiledónea.

La SEC ID Nº: 4 es una proteína Cry1A.105 codificada a partir de la secuencia de nucleótidos como se expone en la SEC ID Nº: 3.

La SEC ID Nº: 5 representa una secuencia de nucleótidos que consiste en un casete de expresión que actúa en una célula vegetal, y preferentemente en una célula de una planta dicotiledónea, para expresar una proteína insecticida Cry1A.105.

La SEC ID Nº: 6 representa una proteína insecticida Cry1A.105 codificada por un segmento dentro del casete de expresión como se expone en la SEC ID Nº: 5.

La SEC ID Nº:7 representa una secuencia de nucleótidos que consiste en un casete de expresión que actúa en una célula vegetal, y preferentemente en una célula de una planta monocotiledónea, para expresar una proteína

insecticida Cry1A.105.

La SEC ID Nº: 8 representa una proteína insecticida Cry1A.105 codificada por un segmento dentro del casete de expresión como se expone en la SEC ID Nº: 7.

Descripción detallada de la invención

De acuerdo con la presente invención, los autores de la invención han construido secuencias de nucleótidos que codifican una nueva proteína insecticida, identificada en el presente documento como una proteína Cry1A.105. Se ha identificado que la secuencia de aminoácidos de Cry1A. 105, expuesta en la SEC ID Nº: 2, presenta propiedades que proporcionan ventajas sobre las proteínas insecticidas de Bt de origen natural que son tóxicas a especies de insectos lepidópteros. En particular, la proteína Cry1A.105 puede expresarse a altos niveles en plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas sin que la mayoría de los sucesos transgénicos presenten efectos fitotóxicos como resultado de los niveles aumentados de la expresión en comparación con los efectos observados cuando las proteínas Cry1 de origen natural se expresan en plantas. Además, la proteína Cry1A.105 forma cristales estables cuando se expresa en Bacillus thuringiensis, probablemente debido al efecto estabilizante del segmento protoxina de Cry1Ac unido al resto toxina de la proteína quimérica Cry1A. 105. Además, la proteína insecticida Cry1A.105 presenta un intervalo de bioactividad insecticida dirigido contra especies de lepidópteros no observado con otras proteínas Cry1 de origen natural hasta ahora identificadas. Por lo tanto, la expresión de la proteína Cry1A. 105 en plantas transgénicas produce cantidades aumentadas de sucesos transgénicos morfológicamente normales que expresan niveles más altos de un análogo de una toxina Cry1 que presenta un amplio espectro de control de insectos plaga lepidópteros para cualquier suceso que se seleccione para el desarrollo comercial. Dichos sucesos deben dar como resultado la ventaja de retrasar la aparición de resistencia contra el análogo de la toxina Cry1A y cuando se combinan con una segunda toxina que es tóxica para una o más de las especies de insectos plaga contra la cual el análogo de Cry1A es también tóxico y que ejerce su modo de acción de una manera que es diferente de la del análogo de Cry1A, cualquier probabilidad de desarrollo de resistencia contra cualquier toxina se espera que sea extremadamente remota.

Los inventores han construido al menos dos secuencias de nucleótidos diferentes para su uso en plantas, codificando cada secuencia de nucleótidos la misma proteína insecticida Cry1A.105. Aproximadamente los dos primeros tercios (o extremo amino) de la parte insecticida de la proteína Cry1A.105 consisten en las secuencias de aminoácidos derivadas de una secuencia de aminoácidos de Cry1Ab. Esta secuencia está unida al extremo carboxilo de la parte toxina y una parte del dominio protoxina de una secuencia de aminoácidos derivada de una proteína insecticida Cry1 obtenida de una cepa de Bt aizawai Ecogen EG6346 (Chambers y col., 1991, J. Bacteriol.

173: 3966-3976). El segmento toxina de Cry1A.105 se une después a un segmento que es sustancialmente una secuencia peptídica de la protoxina de Cry1Ac. Los autores de la invención demuestran que esta construcción proporciona una secuencia de aminoácidos única que presenta propiedades insecticidas sorprendentemente mejoradas cuando se compara con las propiedades mostradas por la proteína a partir de la cual deriva la quimera. Adicionalmente, la proteína precursora de Cry1A.105 presenta excelentes propiedades de formación de cristal y se disuelve y se procesa eficazmente a la forma toxina activa en el intestino de plagas de insectos lepidópteros diana específicos.

Las secuencias de nucleótidos representadas en el presente documento se han construido usando los procedimientos expuestos en las Patentes de Estados Unidos Nº 5,500,365 y 5,689.052, evitando en particular determinadas secuencias inímicas en la secuencia codificante que se ha observado que son problemáticas para la expresión de secuencias de genes heterólogos en células vegetales. El segmento que codifica la parte toxina de la proteína Cry1A. 105 consiste en los nucleótidos como se expone en las SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 3 desde aproximadamente la posición 1 hasta aproximadamente la posición 1830, más o menos. La secuencia como se indica en la SEC ID Nº: 1 se construyó para su uso en especies de plantas dicotiledóneas, y en particular, en plantas de algodón. La secuencia como se indica en la SEC ID Nº: 3 se construyó para la expresión en plantas monocotiledóneas, y en particular, en especies de plantas de mazorca o maíz.

Las secuencias de nucleótidos de la presente invención presentan entre sí una identidad global de aproximadamente 94,3% y son idénticas desde aproximadamente la posición del nucleótido 1330 hasta aproximadamente la posición del nucleótido 3534. El segmento de cada una de estas secuencias de nucleótidos que codifica la parte toxina de la proteína Cry1A.105 presenta, desde aproximadamente la posición del nucleótido 1 a aproximadamente la posición del nucleótido 1830, una identidad entre sí de aproximadamente 88,9%. El segmento de estas secuencias de nucleótidos que codifica las dos primeras estructuras dominio de la proteína Cry1A.105 es sustancialmente más diverso y solo presenta una identidad entre sí de aproximadamente 84,7%.

Los autores de la invención han construido sucesos de plantas transgénicas usando estas secuencias.

La SEC ID Nº: 1 se introdujo en un vector plasmídico que contenía un casete de expresión que consistía en una secuencia promotora potenciada del Virus del Mosaico de Escrofularia (eFMV, enhanced Figwort Mosaic Virus) unida operativamente a una secuencia líder no traducida Hsp70 de Petunia hybrida (Ph.Hsp70, a.k.a., DnaK), una secuencia codificante peptídica que se dirige al cloroplasto de la subunidad pequeña de la ribulosa bis fosfato carboxilasa de Arabidopsis thaliana y una secuencia de poliadenilación y terminación de la transcripción del gen de

la subunidad pequeña de la ribulosa bis fosfato carboxilasa E9 de Pisum sativum. La secuencia codificante de CrylA.105 como se expone en la SEC ID Nº: 1 se insertó en este casete de expresión en fase con e inmediatamente adyacente a la secuencia codificante del extremo 3' de la secuencia codificante del péptido diana y cadena arriba de la secuencia de terminación E9. La secuencia de nucleótidos del casete de expresión resultante se expone en la SEC ID Nº: 5. Se escindió un segmento del vector que contenía el casete de expresión Cry1A.105 unido a un segundo casete de expresión que contenía un marcador de GUS que podía expresarse en plantas y se usó para generar sucesos de algodón transgénicos usando procesos biolísticos. Los sucesos transgénicos se ensayaron en un bioensayo para determinar la actividad insecticida contra varias especies diferentes de plagas de lepidópteros y se determinó que presentaban propiedades de control de insectos significativamente mejores que las de las plantas de algodón resistentes a insectos previamente existentes que sólo contenían Cry1Ac o una combinación de las proteínas Cry1Ac y Cry2Ab. Además, algunos de los sucesos de algodón transgénicos de Cry1A.105 presentaron niveles de acumulación de la proteína Cry1A.105 que superaban de 10 a 20 partes por millón durante el periodo de cultivo, incluso en las cápsulas del algodón, y sin presentar ningún efecto fitotóxico en la planta o en los tejidos reproductores. Esto difiere de otras proteínas Cry1 que se han ensayado previamente, que generalmente sólo fueron capaces de presentar niveles de acumulación inferiores a aproximadamente 10 partes por millón, dirigidas o no a cloroplastos. Cuando otras proteínas de tipo Cry1 se ensayaron en algodón se observaron efectos fitotóxicos, especialmente cuando los niveles de acumulación de Cry1 alcanzaban o superaban aproximadamente 10 ppm.

La SEC ID Nº: 3 se introdujo en un vector plasmídico que contenía un casete de expresión que consistía en una secuencia promotora potenciada del Virus del Mosaico de la Coliflor (eCaMV) unida operativamente a una secuencia líder no traducida del gen de la proteína de unión principal de la clorofila a/b de Triticum aestivum y una secuencia intrónica de actina de Oryza sativa, y una secuencia de poliadenilación y terminación de la transcripción del gen hsp17 de Triticum aestivum. La secuencia codificante de Cry1A.105 como se expone en la SEC ID Nº: 3 se insertó en este casete de expresión inmediatamente adyacente a y en dirección 3' de la secuencia intrónica y cadena arriba de la secuencia de terminación. La secuencia de nucleótidos del casete expresión resultante se expone en la SEC ID Nº: 7. El vector también contiene un marcador de selección del herbicida glifosato que se usó para seleccionar sucesos transformados con el casete de expresión de CrylA.105. Los sucesos del maíz seleccionados después de la transformación con el casete de expresión de Cry1A.105 se ensayaron en bioensayos contra diversas especies de plagas de lepidópteros y se determinó que presentaban un amplio intervalo de actividad insecticida que no era frecuente con sucesos transformados con otras proteínas insecticidas de Bt tal como Cry1Ab. Las actividades del gusano cogollero y del gusano cortador negro presentadas por sucesos que expresaban niveles insecticidas de Cry1A.105 junto con la actividad insecticida de Cry1A.105 dirigida al gusano de la mazorca del maíz y al barrenador del maíz equivalente o mayor que la de los sucesos que expresan Cry1Ab, proporcionan un espectro más amplio de actividad insecticida para sucesos de Cry1A.105.

Las secuencias de nucleótidos de la presente invención son ejemplares. Otras secuencias de nucleótidos pueden expresar un fragmento de la proteína insecticida Cry1A.105 en una célula vegetal, y además pueden diseñarse otras secuencias de nucleótidos que se expresen bien en otros tipos de células huésped. Sin limitar el alcance de la divulgación, se pretende que una secuencia de nucleótidos, para su uso en la expresión de un fragmento insecticida de CrylA.105, presente al menos aproximadamente una identidad de secuencia de nucleótidos del 85%, o al menos aproximadamente del 90%, o al menos aproximadamente del 95%, o al menos del 99% o más, con las secuencias de nucleótidos ilustradas en el presente documento. Otras secuencias de nucleótidos destinadas para la expresión de un fragmento insecticida de Cry1A.105 en una célula huésped que no sea una célula vegetal pueden tener cualquier porcentaje de identidad o de similitud con las secuencias de nucleótidos ilustradas. Las secuencias de nucleótidos pueden variar debido a la redundancia del código genético, y por tanto es posible sintetizar cualquier cantidad de secuencias de ácido nucleico que codifiquen cualquier parte de la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº: 2 y se pretende que todas estas secuencias estén dentro del alcance de la presente invención.

La secuencia de ácido nucleico ejemplificada en el presente documento y expresada en el maíz consiste únicamente en una secuencia codificante de la proteína precursora Cry1A.105, mientras que la secuencia expresada en el algodón consiste en una secuencia codificante de la proteína precursora Cry1A.105 dirigida al cloroplasto. Se ha demostrado que la expresión de proteínas Cry1 en plantas es problemática. No se sabe si cualquier proteína Cry1 particular se expresará bien en cualquier planta particular, y por eso se requiere experimentación por ensayo y error. Algunas proteínas Cry1 expresadas en maíz producirán efectos fitotóxicos, y por eso a veces el direccionamiento de la proteína al cloroplasto alivia dichos efectos. Se observan similares circunstancias con la expresión de las proteínas Cry1 en las plantas de algodón. Los ejemplos del presente documento no pretenden demostrar que la expresión de Cry1A.105 sólo es posible en maíz si se localizan en el espacio citoplásmico, y de manera similar, no pretende demostrar que la expresión de Cry1A.105 sólo es posible en algodón si se localizada en el plastidio. Los ejemplos pretenden demostrar que cualquier procedimiento de localización de la proteína funciona con esta proteína para conseguir plantas morfológicamente normales que presenten altos niveles de expresión y acumulación de la proteína Cry1A.105, y que presente niveles de resistencia comerciales frente a una amplia diversidad de plagas de plantas de insectos lepidópteros en los géneros seleccionados de los grupos que consisten en Anticarsia, Pseudoplusia, Rachiplusia, Helicoverpa, Heliothis, Spodoptera, Epinotia y Armigera. Se cree que cualquier secuencia codificante peptídica que se dirija al plastidio funcionaría eficazmente para dirigir la proteína Cry1A.105 precursora al plastidio/cloroplasto.

En la técnica se conocen secuencias líder no traducidas, secuencias intrónicas y de poliadenilación y terminación de la transcripción en dirección 3' y el experto en la técnica entenderá que en determinadas circunstancias, la expresión puede potenciarse o estabilizarse incorporando estas secuencias en los casetes de expresión. En la técnica se conocen diversas secuencias de este tipo y están presenten incluirse dentro del alcance de la presente divulgación. De manera similar, los promotores que funcionan para conseguir la expresión regulada de una secuencia unida se conocen en la técnica y también están destinados a incluirse dentro del alcance de la presente divulgación. Los promotores pueden seleccionarse para su uso para dirigir la expresión de una secuencia unida en cualquier cantidad de combinaciones de parámetros, incluyendo pero sin limitación, el control de expresión temporal, control de expresión específico espacial o tisular y control de la cantidad de un producto génico particular que se desea que se acumule dentro de una célula o tejido de una planta en particular.

La proteína precursora de longitud completa, que consiste en el resto de aminoácido 1 hasta aproximadamente el resto 3534, presenta excelentes propiedades de formación de cristales y es bien tolerada por las especies de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. La proteína precursora también presenta excelente estabilidad cuando se encuentra en forma cristalina y también presenta una excelente solubilidad a pH alcalino, en particular a un pH alcalino dentro de un intervalo de aproximadamente 8,0 aproximadamente 12,0, o de aproximadamente 8,5 a aproximadamente 11,5, o de aproximadamente pH 9,0 a aproximadamente pH 11,0.

La proteína de la presente invención puede purificarse y usarse en solitario en una cantidad eficaz desde el punto de vista insecticida en cualquier cantidad de composiciones destinadas para su uso como un agente para el control de plagas de lepidópteros o puede combinarse en una cantidad eficaz desde el punto de vista insecticida con cualquiera de otros agentes pesticidas que son diferentes de la proteína Cry1A.105. Dichos otros agentes pesticidas que se pretenden incluir, pero sin limitación, con otro proteína Cry de Bt u otras composiciones insecticidas tanto tóxicas como no tóxicas contra una especie de lepidóptero incluyen insecticidas químicos, agentes fungicidas o fungistáticos, antibióticos, agentes antibacterianos, agentes bacteriostáticos y agentes nematicidas o nematostáticos. Dichas combinaciones pesticidas que incluyen una Cry1A.105 junto con cualquier cantidad de otros agentes pesticidas pueden producirse por una célula transgénica o formularse usando agentes pesticidas purificados

o sustancialmente purificados en una composición pesticida en una forma que consiste en un polvo, un material granular, una suspensión oleaginosa, una suspensión acuosa, una mezcla de emulsión de aceite y agua o un polvo humectable y después proporcionarse en un transportador aceptable desde el punto de vista agrícola para aplicaciones foliares. Las composiciones también pueden formularse en un tratamiento para semillas, junto con una Cry1A.105 en la composición destinada para la inclusión en el tratamiento de semillas, o como una composición aplicada a una semilla que deriva de una planta transgénica transformada para expresar cantidades eficaces desde el punto de vista insecticida de una Cry1A.105, de tal manera que la composición para el tratamiento de semillas que contiene los agentes pesticidas se proporcione a un lepidóptero plaga diana junto con células de una planta desarrollada a partir de la semilla que produce cantidades eficaces desde el punto de vista pesticida de una proteína Cry1A.105. Una combinación de propiedades insecticidas cada una tóxica para la misma especie de insecto y que aún manifestase sus efectos de toxicidad a través de diferentes modos de acción sería una combinación particularmente útil de agentes pesticidas para el control de especies de lepidópteros o para retrasar la aparición de resistencia contra cualquier agente pesticida individual de otra manera eficaz contra una especie de lepidóptero particular. Una combinación ejemplar de dichas proteínas sería una proteína Cry1A.105 de la presente invención, es decir, una primera proteína insecticida, acoplada al menos con una segunda proteína insecticida diferente de la primera. Dichas proteínas insecticidas diferentes incluyen, pero sin limitación, otras proteínas cristalinas de Bt contra lepidópteros (otras Cry1’s, Cry2’s, Cry5’s, Cry9’s), proteínas VIP, proteínas insecticidas de lepidópteros denominadas proteínas TIC, y proteínas insecticidas producidas por especies de bacterias de Xenorhabdus y Photorhabdus. Proporcionando en la dieta de un insecto plaga una combinación de una o más proteínas insecticidas junto con un agente diseñado para conseguir la supresión de genes mediada por ARNbc de uno o más genes esenciales para la supervivencia del insecto es una combinación particularmente útil de agentes pesticidas para el control de especies de lepidópteros o para retrasar la aparición de resistencia contra cualquier agente pesticida individual de otra manera eficaz contra una especie de lepidóptero particular.

Las plantas transformadas con las secuencias de nucleótidos de la presente invención se proporcionan como otra realización de la presente invención. En la técnica se conocen procedimientos para introducir de manera estable ADN en las células vegetales, y se incluye pero sin limitación, infiltración al vacío, transformación mediada por Agrobacterium o Rhizobium, electroporación y diversos procedimientos balísticos. El ADN introducido en las plantas generalmente se dirige para la inserción en el cromosoma nuclear, aunque también puede conseguirse la inserción en el ADN de cloroplastos o plastidios. El ADN introducido en las plantas está generalmente unido a, o asociado con, una secuencia que proporciona un medio para identificar o seleccionar la célula o las células que se han transformado de manera estable con el ADN de interés, incluyendo pero sin limitación, marcadores de lectura tales como genes que emiten fluorescencia o luz y genes que codifican pigmentos o enzimas que, en presencia del sustrato apropiado, otorgan una característica colorimétrica a la célula o células transformadas, o incluyendo marcadores de selección que permitan una selección positiva de las células y tejidos transformados, proporcionando una mayor ventaja a las células transformadas y esencialmente haciendo que las células o tejidos no transformados no se vuelvan estáticos o se mueran. Dichos marcadores de selección incluyen, pero sin limitación, genes que codifican a las enzimas basta, bar, resistencia a metotrexato, neomicín fosfotransferasa, enzimas EPSPS insensibles a glifosato, enzimas glifosato oxidorreductasa (GOX), phnO de E. coli o su equivalente y similares.

Los vectores y otros tipos de secuencias diseñados para conservar, manipular y/o conducir las secuencias de nucleótidos ilustradas cuando se están manipulando en el laboratorio o para la introducción en una célula huésped también se incluyen dentro del alcance de la invención y pretende incluir, pero sin limitación, fagos, plásmidos, bácmidos, yácmidos, cósmidos y similares.

Las plantas transformadas también se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Las plantas transformadas que contienen una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un fragmento insecticida de una proteína Cry1A.105 son específicamente adecuadas para la presente divulgación. Tanto las plantas monocotiledóneas como las dicotiledóneas se contemplan dentro del alcance de la presente invención. Se pretende incluir, pero sin limitación, las siguientes monocotiledóneas maíz, trigo, avena, arroz, sorgo, mijo, trigo negro, centeno, grama (festuca, timothy, bromo, vergel, San Agustín, Bermuda, agróstide) y cebada y las plantas dicotiledóneas que se pretende incluir son al menos alfalfa, manzana, albaricoque, espárrago, judía, baya, mora, arándano, colza, zanahoria, coliflor, apio, cereza, garbanzo, tilo, algodón, alubia, arándano agrio, pepino, cucurbitácea, berenjena, árbol frutal, uva, limón, lechuga, lino, melón, mostaza, árbol de frutos secos, quimbombo, naranja, guisante, melocotón, cacahuete, pera, ciruela, patata, soja, calabaza, fresa, remolacha azucarera, girasol, batata, tabaco, tomate, nabo y hortalizas. Los productos de estas plantas, así como semillas y tejidos producidos a partir de estas plantas, se incluyen específicamente dentro de la presente invención, siempre que la semilla, el tejido

o el producto contenga un transgén que codifique un fragmento insecticida de una proteína Cry1A.105.

La proteína Cry1A.105 puede usarse para inmunizar animales para producir anticuerpos específicos para epítopes de Cry1A.105. Pueden usarse anticuerpos específicos de Cry1A.105 para detectar la presencia de Cry1A.105 en una muestra biológica. En la técnica se conocen procedimientos para detectar la unión de un anticuerpo a un antígeno. La detección de la unión de un anticuerpo a un epítope de Cry1A.105 en una muestra biológica constituye una prueba de diagnóstico para detectar la presencia de la proteína en la muestra.

También pueden detectarse secuencias de nucleótidos que codifiquen un fragmento insecticida de Cry1A.105. Para unirse a una secuencia diana pueden usarse sondas de nucleótidos sintéticas, es decir, una secuencia de nucleótidos que codifique un fragmento insecticida de CrylA.105. En la técnica se conocen procedimientos para detectar la unión de una sonda a una secuencia diana. La detección de la unión de una sonda a la secuencia codificante Cry1A.105 diana constituye una prueba de diagnóstico para detectar la presencia de la secuencia codificante en la muestra.

También pueden usarse cebadores de nucleótidos sintéticos en reacciones de amplificación térmica para producir un amplicón a partir de una muestra biológica que se sospecha que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento insecticida de una proteína Cry1A.105. La presencia de un amplicón producido en dicha reacción de amplificación térmica constituye una prueba de diagnóstico par detectar la presencia de la secuencia de nucleótidos en la muestra. Son secuencias particularmente útiles como sondas, que constituyen una prueba de diagnóstico para detectar la presencia de las secuencias codificantes de Cry1A.105 de la presente invención en una muestra biológica, las que se corresponden con o las que son perfectamente complementarias con (1) la posición de nucleótidos 1401-1420 como se indica en la SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 3 o (2) la posición de nucleótidos 1821-1840 como se indica en la SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 3. Estas secuencias se corresponden con (1) los 20 nucleótidos que abarcan la secuencia que codifica la unión entre el Dominio II y Dominio de los segmentos de diferentes proteínas insecticidas usadas para la construcción de la parte insecticida de las proteínas de la presente invención y (2) los 20 nucleótidos que abarcan la secuencia que codifica la unión entre el Dominio III y el segmento que codifica la protoxina de los diferentes segmentos codificantes de la proteína usados para la construcción de la secuencia codificante de la proteína pre-pro-toxina Cry1Ab.105. Las secuencias de nucleótidos que se corresponden con, o son complementarias a, cualquiera de estos segmentos de ADN (1401-1420 o 1821-1840) pueden usarse como sondas para detectar la presencia de estas secuencias codificantes en muestras biológicas. La detección de dicha unión constituye una prueba de diagnóstico para detectar la presencia de dichas secuencias codificantes en una muestra biológica. El experto en la materia reconocerá otras secuencias que flanquean ambos lados de estos segmentos de ADN que pueden usarse como cebadores para amplificar distintos segmentos de amplicón dimensionados a partir de dichas muestras biológicas y dichos amplicones constituyen una prueba de diagnóstico para detectar la presencia de dichas secuencias codificantes en la muestra. Por ejemplo, podría usarse una primera secuencia codificante, que correspondería a la secuencia de nucleótidos indicada en la SEC ID Nº: 1 desde la posición 1201 a la 1220, como un cebador directo en una reacción de amplificación térmica con una segunda secuencia cebadora que correspondería al complemento inverso de la secuencia de nucleótidos como se indica en la SEC ID Nº: 1 desde la posición 1581 a la 1600. Cuando dichos cebadores se usan juntos en una reacción de amplificación térmica con una muestra biológica que contiene la SEC ID Nº: 1 producirían la síntesis de un amplicón correspondiente a la SEC ID Nº: 1 desde la posición del nucleótido 1201 a la 1600, es decir, un amplicón de 400 nucleótidos, que contendría el segmento de 20 nucleótidos desde la posición del nucleótido 1401 al 1420 como se indica en la SEC ID Nº: 1 y por lo tanto constituiría una prueba de diagnóstico para detectar la presencia de la secuencia codificante de Cry1A.105 en dicha muestra.

Ejemplos

Ejemplo 1.

Este ejemplo ilustra secuencias de nucleótidos sintéticas que codifican una proteína Cry1A.105 insecticida.

Se construyó una secuencia de nucleótidos como se indica en la SEC ID Nº: 1 que codificaba una proteína insecticida Cry1A.105 para uso en plantas dicotiledóneas. La traducción de la secuencia de aminoácidos se indica en la SEC ID Nº: 2. El segmento que codifica la toxina consiste en los nucleótidos desde aproximadamente la posición 1 a aproximadamente la posición 1830, más o menos.

Se construyó una secuencia de nucleótidos como se indica en la SEC ID Nº: 3 que codificaba una secuencia de aminoácidos Cry1A.105 para la expresión en plantas monocotiledóneas. La traducción de la secuencia de aminoácidos se indica en la SEC ID Nº: 4. El segmento que codifica la toxina consiste en los nucleótidos desde aproximadamente la posición 1 a aproximadamente la posición 1830, más o menos.

Las secuencias de nucleótidos como se indica en la SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 3 son sustancialmente equivalentes entre sí. La SEC ID Nº: 1 y la SEC ID Nº: 3 presentan una identidad global de aproximadamente el 94.3%. Las dos secuencias codificantes son idénticas desde aproximadamente la posición del nucleótido 1330 hasta la posición del nucleótido 3534. La parte de cada secuencia que codifica la toxina consiste en desde aproximadamente el la posición del nucleótido 1 hasta la posición del nucleótido 1830, y estos segmentos presentan entre sí una identidad de aproximadamente el 88,9%. Las diferencias sustanciales entre las dos secuencias se encuentran dentro de aproximadamente la posición de nucleótido 1 a aproximadamente posición de nucleótido 1329, o aproximadamente los dos primeros tercios del segmento que codifica la parte toxina de la proteína Cry1A.105. A lo largo de este segmento, las dos secuencias presentan una identidad de aproximadamente el 84,7%.

Una cepa de E. coli (TOP10, Invitrogen, Inc.) transformada con un plásmido denominado pMON70522 que contenía un marcador de selección de la beta-lactamasa y una secuencia como se indica en la SEC ID Nº: 3 que codificaba una Cry1A.105 se depositó el 31 de agosto del 2005 en la Agriculture Research Culture Collection (NRRL) internacional Depository Authority at 1815 North University Street, en Peoria, Illinois 61604 Estados Unidos, de acuerdo con el Tratado de Budapest sobre el Internacional Recognition of the Deposito of Microorganisms para los fines de los procedimientos de las Patentes y se denominó NRRL B-30873.

Ejemplo 2.

Este ejemplo ilustra plantas de algodón transgénicas que expresan una proteína Cry1A.105.

Semillas de algodón Delta y Pineland DP50 se esterilizaron en la superficie y germinaron durante una noche. Se aislaron explantes del meristemo y se quitaron las hojas primarias mediante microdisección. Los explantes diseccionados se colocaron en un medio de direccionamiento de tal manera que los meristemos se orientaron perpendiculares a la dirección de la administración de las partículas. El vector de transformación, pMON47740, comprendía un casete de expresión que tenía una secuencia de nucleótidos indicada en la SEC ID Nº: 9. Un fragmento de KpnI que contenía un gen marcador de GUS (beta-glucuronidasa) bajo el control de un promotor e35S y una secuencia codificante de Cry1A.105 dirigida al cloroplasto bajo el control de un promotor eFMV se escindió de este plásmido y se aisló mediante HPLC y se usó para la transformación con proyectil de los explantes del meristemo del algodón. El ADN purificado, que contenía tanto el casete de expresión de Cry1A.105 como el marcador de GUS, se precipitó sobre perlas de oro microscópicas y se revistió con una capa de estaño sobre una lámina Mylar. El ADN se aceleró dentro del tejido meristemático por suministro de partículas con descarga eléctrica al vacío parcial. Después del bombardeo, los explantes se des-direccionaron sobre un medio sin hormonas sin agente selectivo. Los tejidos foliares de las plántulas regeneradas se muestrearon y se sometieron a ensayo para detectar la expresión del marcador de GUS. Las plantas transgénicas que presentaban un alto nivel de expresión de GUS se enviaron al invernadero para posteriores exploraciones. Estas plantas se sometieron de nuevo a ensayo para detectar la expresión de GUS y las partes negativas de las plantas se podaron. Este ciclo de muestreo y de poda de tejidos negativos a GUS se repitió hasta que todos los sectores de cada planta fueron positivos para el marcador de GUS. Después, las plantas se conservaron en condiciones convencionales de invernadero hasta la recogida de la semilla.

Los tejidos obtenidos de plantas de algodón transgénicas F1, positivas a GUS, se sometieron a ensayo en bioensayos para detectar la actividad insecticida contra el gusano de las cápsulas de algodón (CBW, cotton bollworm) y el gusano cogollero (FAW, fall armyworm). Previamente las plantas de algodón isogénicas generadas que expresaban niveles insecticidas de Cry1Ac o una combinación de Cry1Ac y Cry2Ab se usaron como controles positivos y como control negativo se usó una isolínea no transgénica.

Como un medio para determinar la actividad insecticida de las plantas de algodón transgénicas se usaron ensayos con CBW en cuadrados. (Adamczyck y col., (2001) J. Econ. Entomol. 94: 284-290; Kranthi y col (2005) Current Science 89: 291-298). Se recogieron cuadrados de tejido foliar (del tamaño de una cabeza de cerilla o mayor) y se colocaron individualmente en pocillos de ensayo. Cada cuadrado se infestó con una sola larva de CBW del tercer estadio. Cinco días después de la infestación se registró el número de insectos supervivientes.

También se usaron ensayos con CBW en cápsulas para determinar la actividad insecticida del tejido de la cápsula recogido de plantas transgénicas. Se recogieron 8 cápsulas verdes duras (post-floración) de cada suceso y se colocaron en cubetas individuales y se infestaron con larvas de CBW del tercer estadio. Cinco días después de la infestación se registró el número de insectos supervivientes

Se realizaron ensayos foliares para determinar la actividad insecticida del tejido foliar transgénico contra FAW. Se extrajeron hojas nuevas de los extremos de las plantas de algodón. Se recogieron 2 perforaciones foliares, cada una con un diámetro de aproximadamente 1,9 cm (3/4”) y se colocaron en cada uno de los 16 pocillos de ensayo individuales. Cada pocillo se infestó con una sola larva de FAW del segundo o tercer estadio. Cinco días después de la infestación se registró el número de insectos supervivientes.

Los resultados de los bioensayos se muestran en la Tabla 1. Los resultados demuestran que los sucesos de algodón transgénico que expresan Cty1A.105 presentan una mayor actividad insecticida en comparación con los sucesos transgénicos que expresan Cry1Ac o una combinación de Cry1Ac y Cry2Ab contra FAW y CBW.

Tabla 1. Resultados de los bioensayos de FAW y CBW usando el tejido de la planta de algodón transgénica.

Planta

FAW (% de supervivencia) (tejido foliar) CBW (% de supervivencia) (Tejido en forma de cuadrado) CBW (% de supervivencia) (Tejido de cápsula)

Cry1Ac/Cv2Ab

74,5 32,0 35,8

Cry1Ac

92,7 35,5 35,8

Isolina

99,6 96,8 54

17238

10,9 9,4 25

17567

0 12,5 12,5

17774

1,6 1,2 0

17875

3,1 4,2 0

18026

1,6 18,8 12,5

18122

7,8 22,9 0

En ensayos similares también se realizaron ensayos con el gusano del tabaco y el gusano de la mazorca del maíz. En cada caso, las plantas que expresaban Cry1A.105 también presentaron actividad insecticida contra estas plagas.

Ejemplo 3.

Este ejemplo ilustra plantas de maíz transgénicas que expresan una proteína Cry1A.105.

Se regeneraron plantas de maíz transgénicas de células transformadas con el vector pMON40232. Este vector contiene un casete de expresión que tiene una secuencia de nucleótidos como se indica en la SEC ID Nº: 7 que contiene, en unión operativa, un promotor 35S del CAMV potenciado, una secuencia líder CAB de trigo, un intrón de la actina 1 del arroz, una secuencia codificante Cry1A.105 y una secuencia de poliadenilación y terminación de la transcripción en dirección 3’ del gen hsp17 del trigo. Se colocó una secuencia de nucleótidos que codificaba una secuencia de direccionamiento al cloroplasto de la EPSPS de Arabidopsis thaliana (At.EPSES-CTP2) cadena abajo de y en fase con la secuencia codificante Cry1A.105. Para su uso en la selección de sucesos transgénicos, el vector pMON40232 contenía un gen recombinante que codificaba una EPSPS (5-enolpiruvil-shikimato-3-fosfato-sintasa) que no es sensible al herbicida glifosato. A los sucesos transgénicos que surgieron de tejido transformado con pMON40232 se les denominó LAJ 105. Los sucesos transgénicos se exploraron para detectar la ausencia de cualquier estructura del vector, para detectar la presencia de una sola secuencia simple insertada y para detectar la integridad del casete de expresión que contenía la secuencia de nucleótidos que codificaba la proteína Cry1A.105.

Se realizaron bioensayos con sucesos que cumplían las limitaciones de la exploración del suceso. En el bioensayo, las plantas de maíz transgénicas LAJ105 se compararon con un control negativo isogénico LH198 y con una variedad MON810 como un control positivo que expresaba la parte insecticida de una proteína Cry1Ab. Se obtuvieron cinco discos foliares, cada uno de un centímetro de diámetro, de cada uno de los diez sucesos transgénicos de Cry1A.105 individuales y de los controles. Los discos foliares se colocaron en pocillos cargados con agar para conservar turgente el material vegetal. Después, los discos se sometieron a alimentación de larvas neonatas de FAW, gusano cortador negro (BCW, black cutworm), barrenador europeo del maíz (ECB, European corn borer), gusano de la mazorca del maíz (CEW, corn ear worm) y barrenador sudoccidental del maíz (SWCB, Southwester corn borer). A cada pocillo se aplicó, una sola larva neonata de FAW, una sola larva de CEW, dos larvas neonatas de BCW, dos larvas neonatas de SWCB y cuatro larvas neonatas de ECB. Después de cuatro días se evaluaron los daños producidos por la alimentación usando una escala clasificadora de daño foliar (LDR, leaf damage rating) de 0 - 11, indicando 0 que no se observaban daños debidos a la alimentación, indicando 11 que los insectos devoraron al menos el 50% del disco e indicando cada punto de la escala entre 0 y 11 un aumento del 5% en el daño observado debido a la alimentación en el disco foliar sometido a observación.

Los resultados del bioensayo indicaron que los sucesos que expresaban la proteína Cry1A.105 presentaban una mayor actividad insecticida contra FAW, ECB y CEW en comparación con los valores LDR presentados por el control Cry1Ab contra la misma larva plaguicida. Los valores LDR para estas tres plagas sobre los sucesos Cry1A.105 fueron menores que 1 mientras que el control Cry1Ab presentó valores LDR que variaban de aproximadamente 8 a

10. El valor LDR estaba regularmente entre 1 y 2 tanto para el suceso de CrylA.105 como para el control Cry1Ab cuando se ensayó para detectar la actividad contra SWCB, indicando que la proteína Cry1A.105 no era más tóxica para SWCB de lo que lo era Cry1Ab. Los resultados de este bioensayo refuerzan los resultados previos que indicaban que Cry1Ab era ineficaz en el control de BCW. Los sucesos Cry1A.105 no fueron más eficaces contra BCW de lo que lo fueron con el control Cry1Ab. Por tanto, a los niveles de expresión de la proteína Cry1A.105 en plantas, estas plantas serían eficaces en el control de otras plagas de plantas de géneros de lepidópteros incluyendo, pero sin limitación, las de los géneros Anticarsia, Pseudoplusia, Rachiplusia, Heliothis, Helicoverpa, Spodoptera, Epinotia y Armigera.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Monsanto Technology LLC Bogdanova, Natalia N. Corbin, David R. Malvar, Thomas M. Perlak, Frederick J. Roberts, James K. Romano, Charles P.

<120> SECUENCIAS DE NUCLEÓTIDOS QUE CODIFICAN PROTEÍNAS INSECTICIDAS

<130> 38-21 (52905) A

<150> 60/713.144

<151>

<160> 8

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 3534

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos sintética que codifica la secuencia de aminoácidos de Cry1A.105

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(3534)

<400> 1

<210> 2

<211> 1177 5 <212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Construcción sintética 10

<400> 2

<210> 3

<211> 3534 5 <212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos sintética que codifica la secuencia de aminoácidos de Cry1A.105 10

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(3534)

15 <400> 3

<210> 4

<211> 1177 5 <212> PRT

<213> artificial

<220>

<223>

Construcción sintética 10

<400> 4

<210> 5

<211> 5480

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> casete de expresión que codifica la secuencia de aminoácidos de Cry1A.105

<220>

<221> promotor

<222> (1)..(981)

<223>

promotor e35S del FMV 5

<220>

<221> Región no traducida 5' (5'UTR)

<222> (985)..(1080)

10 <220>

<221> transit_péptido

<222> (1090)..(1263)

<223> secuencia peptídica dirigida al cloroplasto

15 <220>

<221> CDS

<222> (1267)..(4797)

<223> secuencia codificante de Cry1A.105

20 <220>

<221> terminador

<222> (4833)..(5480)

<223> Secuencia de poliadenilación y terminación de la transcripción de rbcS E9 de Ps (Pisum sativum)

25 <400> 5

<210> 6

<211> 1176 5 <212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Construcción sintética 10

<400> 6

<210> 7

<211> 4990 5 <212> ADN

<213> artificial

<220>

<223>

Casete de expresión que codifica la secuencia de aminoácidos de Cry1A.105 10

<220>

<221> promotor

<222> (1)..(614)

<223>

promotor e35s del CAMV 15

<220>

<221> Región no traducida 5' (5’UTR)

<222> (650)..(710)

<220>

<221> Intrón

<222> (727)..(1206)

<223>

intrón de actina del arroz RACT1 5

<220>

<221> CDS

<222> (1216)..(4752)

<223>

secuencia codificante de Cry1A.105 10

<220>

<221> terminador

<222> (4781)..(4990)

<223>

Secuencia poliadenlación y terminación de la transcripción de Hsp17 de Ta (Triticum aestivum) 15

<400> 7

<210> 8

<211> 1177 5 <212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Construcción sintética 10

<400> 8

Claims (23)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un polinucleótido que codifica una proteína insecticida que comprende la secuencia de aminoácidos como se presenta en la SEC ID Nº: 2 desde la posición del aminoácido 10 a la posición del aminoácido 600.

2. 2.

   El polinucleótido de la reivindicación 1, seleccionado de la SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 3, preferentemente el polinucleótido está destinado para su uso en la expresión de dicha proteína insecticida en una planta de cultivo.

3. 3.

   El polinucleótido de la reivindicación 2, en el que dicha planta de cultivo está seleccionada de una planta de cultivo monocotiledónea y una planta de cultivo dicotiledónea, preferentemente

   (i)

   dicha planta monocotiledónea está seleccionada de maíz, trigo, avena, arroz, sorgo, mijo, trigo negro, centeno, grama (festuca, timothy, bromo, vergel, San Agustín, Bermuda, agróstide) y cebada, o

   (ii)

   dicha planta dicotiledónea está seleccionada de alfalfa, manzana, albaricoque, espárrago, judía, baya, mora, arándano, colza, zanahoria, coliflor, apio, cereza, garbanzo, tilo, algodón, alubia, arándano agrio, pepino, cucurbitácea, berenjena, árbol frutal, uva, limón, lechuga, lino, melón, mostaza, árbol de frutos secos, quimbombo, naranja, guisante, melocotón, cacahuete, pera, ciruela, patata, soja, calabaza, fresa, remolacha azucarera, girasol, batata, tabaco, tomate, nabo y hortalizas.

4. 4.

   El polinucleótido de la reivindicación 1, que codifica una proteína insecticida que presenta una secuencia de aminoácidos como se presenta en la SEC ID Nº: 2 desde aminoácido 1 al aminoácido 612.

5. 5.

   El polinucleótido de la reivindicación 1, que codifica la proteína insecticida como se presenta en la SEC ID Nº: 2 desde el aminoácido 1 al aminoácido 610.

6. 6.

   Una proteína insecticida que comprende la secuencia de aminoácidos como se presenta en la SEC ID Nº: 2 desde la posición del aminoácido 10 a la posición del aminoácido 600.

7. 7.

   La proteína insecticida de la reivindicación 6, que es una proteína insecticida híbrida que comprende un segmento de aminoácidos que comprende al menos 500 aminoácidos contiguos seleccionados del segmento de aminoácidos como se presenta en la SEC ID Nº: 2 desde la posición del aminoácido 10 a la posición del aminoácido 600.

8. 8.

   Una composición que comprende una cantidad eficaz desde el punto de vista insecticida de la proteína de la reivindicación 6.

9. 9.

   La composición de la reivindicación 8, que comprende una cantidad eficaz desde el punto de vista insecticida de dicha proteína insecticida, en la que dicha composición está seleccionada de una célula vegetal, una célula bacteriana, una célula fúngica, un coloide, una emulsión, un revestimiento para semillas, un cebo y un polvo.

10. 10.

    La composición de la reivindicación 9, en la que dicha proteína insecticida está presente en una cantidad de 5⋅10-5 a 0,02 % en moles (de 0,5 a 200 partes por millón (ppm)), preferentemente

    (i)

    dicha proteína insecticida está presente en una cantidad de 5⋅10-5 - 2⋅10-3 % en moles (de 0,5 a 20 ppm), o

    (ii)

    dicha composición es una célula vegetal o un grupo de células vegetales, más preferentemente el polinucleótido que codifica la cantidad eficaz desde el punto de vista insecticida de dicha proteína insecticida esté presente en una cantidad que puede detectarse usando una sonda que es o es complementaria a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID Nº: 1 desde la posición del nucleótido 1401 a la 1420 y la SEC ID Nº: 1 desde la posición del nucleótido 1821 a la 1840, o

    dicha cantidad eficaz desde el punto de vista insecticida de dicha proteína es suficiente para controlar una plaga de plantas de géneros de lepidópteros cuando se proporciona en la dieta de dicha plaga, seleccionándose dicha plaga de Anticarsia, Pseudoplusia, Rachiplusia, Heliothis, Helicoverpa, Spodoptera, Epinotia y Armigera.

11. 11.

    Un casete de expresión para su uso en la expresión de una proteína insecticida que tiene la secuencia de aminoácidos como se presenta en la SEC ID Nº: 2 en una célula huésped, en el que dicho casete de expresión comprende, en unión operativa, una secuencia promotora funcional en dicha célula huésped y un polinucleótido que codifica dicha proteína.

12. 12.

    El casete de expresión de la reivindicación 11 en el que dicha célula huésped está seleccionada de una célula bacteriana, una célula fúngica, una célula de mamífero y una célula vegetal, preferentemente

    (a)

    dicha célula bacteriana está seleccionada de una célula de especies de Bacillus, una célula de especies de Enterobacteriacae, una célula de especies de Pseudomonas, una célula de especies de Clostridium, una célula de especies de Rhizobium y una célula de especies de Agrobacterium; y

    (b)

    dicha célula vegetal está seleccionada de una planta dicotiledónea y una planta monocotiledónea, seleccionándose adicionalmente dicha planta dicotiledónea de alfalfa, manzana, albaricoque, espárrago, judía, baya, mora, arándano, colza, zanahoria, coliflor, apio, cereza, garbanzo, tilo, algodón, alubia, arándano agrio, pepino, cucurbitácea, berenjena, árbol frutal, uva, limón, lechuga, lino, melón, mostaza, árbol de frutos secos, quimbombo, naranja, guisante, melocotón, cacahuete, pera, ciruela, patata, soja, calabaza, fresa, remolacha

    azucarera, girasol, batata, tabaco, tomate, nabo y hortalizas, y seleccionándose dicha planta monocotiledónea adicionalmente de maíz, trigo, avena, arroz, sorgo, mijo, trigo negro, centeno, grama (festuca, timothy, bromo, vergel, San Agustín, Bermuda, agróstide) y cebada

13. 13.

    El casete de expresión de la reivindicación 11, en el que dicha célula huésped es una célula vegetal y dicho casete de expresión comprende adicionalmente, en unión operativa, un polinucleótido seleccionado de una secuencia potenciadora de expresión, una secuencia líder no traducida, una secuencia intrónica, una secuencia que codifica un péptido que se dirige al cloroplasto y una secuencia de poliadenilación y terminación de la transcripción, comprendiendo preferentemente dicho casete de expresión un polinucleótido que codifica una proteína insecticida.

14. 14.

    Un vector que comprende el casete de expresión de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13.

15. 15.

    Una planta transgénica o una célula vegetal resistente a una infestación por insectos lepidópteros que comprende un polinucleótido que codifica una proteína que presenta la secuencia aminoácidos como se presenta en la SEC ID Nº: 2 desde la posición del aminoácido 10 a la posición del aminoácido 600, en el que dicha proteína presenta actividad insecticida cuando se expresa en dicha planta o en célula vegetal.

16. 16.

    La planta transgénica o célula vegetal de la reivindicación 15, en la que dicha planta transgénica está seleccionada de una planta dicotiledónea y una planta monocotiledónea, seleccionándose adicionalmente dicha planta dicotiledónea entre alfalfa, manzana, albaricoque, espárrago, judía, baya, mora, arándano, colza, zanahoria, coliflor, apio, cereza, garbanzo, tilo, algodón, alubia, arándano agrio, pepino, cucurbitácea, berenjena, árbol frutal, uva, limón, lechuga, lino, melón, mostaza, árbol de frutos secos, quimbombo, naranja, guisante, melocotón, cacahuete, pera, ciruela, patata, soja, calabaza, fresa, remolacha azucarera, girasol, batata, tabaco, tomate, nabo y hortalizas, y seleccionándose dicha planta monocotiledónea adicionalmente de maíz, trigo, avena, arroz, sorgo, mijo, trigo negro, centeno, grama (festuca, timothy, bromo, vergel, San Agustín, Bermuda, agróstide) y cebada

17. 17.

    La planta transgénica o célula vegetal de la reivindicación 16 resistente a una infestación por insectos lepidópteros, en la que dicho insecto lepidóptero está seleccionada de un enrollador foliar, un gusano cortador, un gusano cogollero, un barrenador, una oruga de bolsón y un consumidor de forraje, preferentemente dicho insecto lepidóptero se selecciona adicionalmente de un gusano cogollero, un barrenador europeo del maíz, un gusano de la mazorca del maíz o un gusano de la cápsula del algodón, y un barrenador sudoccidental del maíz.

18. 18.

    La descendencia o la semilla de la planta transgénica o célula vegetal de la reivindicación 17, en la que dicha descendencia o semilla comprende dicho polinucleótido.

19. 19.

    Un procedimiento para controlar una infestación por insectos lepidópteros de una planta proporcionado en la dieta del insecto una o más células vegetales transformadas con un ácido nucleico que comprende, en unión operativa, un promotor funcional de planta y un polinucleótido que codifica una proteína que presente la secuencia de aminoácidos como se presenta en la SEC ID Nº: 2 desde la posición del aminoácido 10 a la posición del aminoácido 600 que presente actividad insecticida contra lepidópteros.

20. 20.

    Un procedimiento para proteger un cultivo en un campo contra una infestación por insectos lepidópteros que comprende cultivar una planta de cultivo transgénica que comprende una cantidad eficaz desde el punto de vista insecticida de un agente insecticida de la proteína Cry1A.105 en la dieta del insecto lepidóptero para inhibir la supervivencia del insecto en dicha planta de cultivo transgénica, en el que dicho agente insecticida comprende una secuencia de aminoácidos desde la posición del aminoácido 10 a la posición del aminoácido 600 como se presenta en la SEC ID Nº: 2.

21. 21.

    El procedimiento de la reivindicación 20, en el que

    (i)

    dicha planta de cultivo transgénica comprende adicionalmente un agente insecticida adicional tóxico para la misma especie de insecto que la Cry1A.105 y está seleccionado de una toxina de Bacillus, una toxina de Xenorhabdus, una toxina de Photorhabdus y un ARNbc específico para la supresión de uno o más genes esenciales en dichas especies de insectos; y/o

    (ii)

    el rendimiento de dicho cultivo se mejora en comparación con el rendimiento de un cultivo isogénico que carece de dicho agente o agentes insecticidas.

22. 22.

    Un procedimiento para retrasar la aparición de la resistencia de una especie de lepidóptero que comprende proporcionar una primera proteína insecticida Cry1A.105 al menos con una segunda proteína insecticida diferente de la primera, en la que dicha segunda proteína insecticida está seleccionada del grupo de proteínas que consiste en una toxina Cry1, una Cry2, una Cry5, una Cry9 y una proteína VIP.

23. 23.

    El procedimiento de la reivindicación 21, en el que dicho agente insecticida adicional, que es una toxina de Bacillus, está seleccionado del grupo de proteínas que consisten en una toxina Cry1, una Cry2, una Cry5, una Cry9 y una VIP.