ES2332258A1 - Peptidos lineales antimicrobianos con aminoacidos de la serie d. - Google Patents
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Abstract
Péptidos lineales antimicrobianos con aminoácidos de la serie D. La presente invención se refiere a nuevos péptidos lineales que presentan actividad antimicrobiana. Dichos péptidos están formados por 11 residuos de aminoácidos, y contienen al menos un aminoácido de la serie D. La invención describe la síntesis y la utilización de los mencionados péptidos como agentes antimicrobianos frente a bacterias patógenas de vegetales y/o humanos y/o animales. También se refiere a composiciones que comprenden una cantidad efectiva de dichos péptidos y al menos un agente auxiliar, y al uso de dichas composiciones para tratar enfermedades infecciosas en plantas, humanos y animales causadas por bacterias patógenas.
Description
Péptidos lineales antimicrobianos con
aminoácidos de la serie D.
La presente invención se refiere a péptidos
lineales que incluyen al menos un aminoácido de la serie D, que
presentan propiedades antimicrobianas, y que son particularmente
eficaces frente a microorganismos patógenos de plantas y/o humanos
y/o animales.
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Las enfermedades de origen microbiano continúan
siendo responsables de pérdidas de gran importancia económica en
los procesos productivos y en la salud humana y/o animal. Las
bacterias fitopatógenas son responsables de pérdidas de gran
importancia económica en agricultura. Entre ellas se destacan, por
ejemplo, las bacteriosis causadas por las bacterias Erwinia
amylovora, Pseudomonas syringae, y Xanthomonas
vesicatoria.
Por otra parte, un gran número de bacterias son
responsables de enfermedades infecciosas en humanos y animales.
Entre ellas se destacan, por ejemplo, las causadas por las
bacterias Escherichia coli, Staphylococcus aureus,
Salmonella typhimurium, y Listeria monocytogenes.
El uso de antibióticos, tanto en protección
vegetal, como en clínica o veterinaria, está limitado por la
aparición de cepas resistentes de los patógenos causantes de
enfermedades. Por ello, es necesario el desarrollo de nuevos
antimicrobianos que puedan evitar la resistencia en las bacterias.
Además, para su uso en agricultura deben ser poco persistentes en
el medio ambiente.
En los ultimas años se ha intensificado la
investigación sobre la aplicación de péptidos antimicrobianos
naturales, presentes en plantas y animales, como alternativa a los
antibióticos convencionales.
Por ejemplo, la cecropina A es un péptido lineal
formado por 37 aminoácidos que se encuentra en la hemolinfa de la
mariposa Hyalophora cecropia. Dicho péptido presenta una
potente actividad lítica contra bacterias
Gram-positivas y
Gram-negativas.
Se ha observado que los péptidos de origen
natural habitualmente tienen secuencias largas de aminoácidos,
presentan una baja biodisponibilidad, y son susceptibles a la
degradación por proteasas o son tóxicos. Por lodo ello, juntamente
con el elevado coste de producción debido a su longitud
considerable, existen dificultades para su empleo en protección
vegetal, clínica, o veterinaria.
Se ha descrito la preparación de péptidos con
secuencias más cortas, que contienen la combinación de fragmentos
de péptidos de origen natural. También se han desarrollado nuevos
agentes antimicrobianos por introducción de modificaciones en
péptidos de origen natural o derivados de ellos.
Por ejemplo, en Ali et al., Mol.
Plant-Microbe Interact., 2000, 13,
847-859 se describe un undecapéptido formado por
fragmentos de los péptidos de origen natural cecropina A y
melitina, que es activo frente a algunas bacterias patógenas de las
plantas como son Erwinia carotovora subsp. carotovora,
y Erwinia carotovora subsp. atroseptica.
Por ejemplo en el articulo de Badosa et
al., A library of linear undeca-peptides with
antibacterial activity against phytopathogenic bacteria,
Peptides, 2007, 28, 2276-2285, se describen
undecapéptidos con propiedades antimicrobianas frente a las
bacterias fitopatógenas E. amylovora, X. vesicatoria,
y P. syringae.
Por ejemplo en el articulo de Friedrich et
al, Antibacterial Action of Structurally Diverse Cationic
Peptides on Gram-Positive Bacteria.
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2000, 44:
2086-2092, se describen péptidos de 12 a 26
aminoácidos con propiedades antimicrobianas frente a bacterias
patógenas de humanos y animales como Staphylococcus aureus,
Listeria monocytogenes o Streptococcus pyogenes.
A pesar de dichos desarrollos, subsiste la
necesidad de disponer de nuevos compuestos antimicrobianos que sean
activos frente a bacterias patógenas, y que además posean
características adicionales apropiadas, como por ejemplo espectro de
acción amplio, toxicidad baja y estabilidad frente a proteasas.
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El objeto de la presente invención es
proporcionar péptidos lineales que presentan propiedades
antimicrobianas.
También forma parte del objeto de la invención
dichos péptidos para uso como medicamento.
Forma también parte del objeto de la invención
la utilización de dichos péptidos como agentes antimicrobianos.
También forma parte del objeto de la invención
la utilización de dichos péptidos para la preparación de una
composición antimicrobiana.
También es objeto de la invención una
composición antimicrobiana que comprende los péptidos de la
invención y un agente auxiliar.
Forma parte también del objeto de la invención
un método para prevenir yin tratar enfermedades infecciosas en
plantas causadas por bacterias.
También forma parte del objeta de la invención
la utilización de dichos péptidos para preparar un medicamento para
tratar enfermedades infecciosas en humanos y animales causadas por
bacterias.
Los autores de la presente invención han
desarrollado nuevos péptidos que resultan de fácil preparación y que
presentan una elevada eficacia para inhibir el crecimiento de
bacterias patógenas tanto para plantas como para humanos o animales.
Además dichos péptidos presentan grados variables de estabilidad
frente a proteasas y de toxicidad.
El objeto de la presente invención es
proporcionar péptidos lineales que responden a la fórmula (I):
(I)KKLFKKILKYL
en donde al menos uno de los
aminoácidos es de la serie D, y en donde el aminoácido leucina del
extremo C-terminal está en forma de grupo carboxilo
o
carboxamida.
En una realización preferida, los péptidos de la
invención tienen el aminoácido leucina del extremo
C-terminal en forma de carboxamida, y se pueden
representar mediante la fórmula:
(I)KKLFKKILKYL-NH_{2}
en donde al menos uno de los restos
de aminoácidos es de la serie
D.
En la fórmula (I) los aminoácidos se representan
mediante una única letra de acuerdo con la Comisión para la
Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB, según se
describe en el libro Biochemical Nomenclature and Related Documents,
2nd edition, Portland Press, 1992, Londres [ISBN
1-85578-005-4] y que
es bien conocida por el experto en la materia.
Según dicha nomenclatura, la letra K representa
el aminoácido L-lisina, la letra L el aminoácido
L-leucina, la letra I el aminoácido
L-isoleucina, la letra Y el aminoácido
L-tirosina y la letra F el aminoácido
L-fenilalanina.
En esta descripción, los aminoácidos de la serie
D se representan en letra minúscula, negrita y subrayada: la letra
k representa el aminoácido D-lisina,
la letra I el aminoácido D-leucina, la
letra i el aminoácido D-isoleucina, la
letra y el aminoácido D-tirosina y la
letra f el aminoácido
D-fenilalanina.
Siguiendo la nomenclatura de la IUPAC, los
péptidos de esta descripción se representan con el extremo
N-terminal en la parte izquierda de la fórmula y
con el extremo C-terminal en la parte derecha de la
misma.
Entre los péptidos de la invención resultan
preferidos aquéllos definidos por la fórmula (I) que incluyen un
residuo de aminoácido de la serie D en cualquiera de las posiciones
1 a 8.
De acuerdo con la nomenclatura de la IUPAC, la
numeración de las posiciones de los aminoácidos se inicia en el
extremo N-terminal, tal como se puede ver a
continuación:
K^{1}K^{2}L^{3}F^{4}K^{5}K^{6}I^{7}L^{8}K^{9}Y^{10}L^{11}
\newpage
Resultan especialmente preferidos los péptidos
seleccionados entre el grupo formado por los péptidos que Figuran
en la Tabla 1;
Más especialmente preferido es el péptido
definido por la fórmula KKL f KKILKYL (SEQ_ID_NO: 6,
BP143).
También resultan preferidos aquéllos definidos
por la fórmula (I) que incluyen entre cinco y once aminoácidos de
la serie D consecutivos.
Dichos aminoácidos de la serie D pueden estar
colocados en cualquier posición en la secuencia de aminoácidos. Por
ejemplo pueden estar colocados consecutivos, o alternados, o
siguiendo ningún orden particular.
Resultan especialmente preferidos los péptidos
seleccionados entre el grupo formado por los péptidos que figuran
en la Tabla II:
Aún más especialmente preferidos resultan los
péptidos seleccionados entre el grupo formado por los péptidos
definidos por las fórmulas kklfkkilkyl (SEQ_ID_NO: 16,
BP153) y KKLF kkilkyl (SEQ_ID_NO: 21, BP158).
También resultan preferidos aquellos péptidos
definidos por la fórmula (I) que incluyen dos o tres aminoácidos de
la serie D.
Resultan especialmente preferidos los péptidos
seleccionados entre el grupo formado por los péptidos que figuran
en la Tabla III:
Aún más especialmente preferidos resultan los
péptidos seleccionados entre el grupo formado por los péptidos
definidos por las fórmulas KKLFKKI Ik YL
(SEQ_ID_NO: 13, BP150) y
KK I FK k IL k YL (SEQ_ID NO:
14, BP151).
Como ya se ha indicado anteriormente resultan
preferidos aquellos péptidos que tienen un grupo carboxamido en el
grupo C-terminal.
Los péptidos descritos en la invención están
formados por 11 aminoácidos que los hace apropiados para ser
preparados empleando los procedimientos habituales de síntesis de
péptidos en fase sólida, como por ejemplo los descritos por R.B.
Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 1963, 85:
2149-2154.
Entre ellos se puede mencionar el que emplea
como soporte sólido la resina 4-metilbencidrilamina
(MBHA) funcionalizada con grupos amino. Sobre dicho soporte sólido
se llevan a cabo las reacciones sucesivas de acoplamiento entre los
diferentes aminoácidos que integran el péptido.
Dicho procedimiento es bien conocido por el
experto en la materia y se encuentra descrito, por ejemplo, en S.A.
Kates, F. Albericio Eds., Solid-Phase Synthesis. A
practical guide, Marcel Dekker, New York, 2000 [ISBN:
0-8247-0359-6], o
en K. Burguess Eds., Solid-Phase Organic Synthesis,
Wiley. John & Sons. New York, 1999 [ISBN: 0471318256].
Cuando se emplea la resina MBHA como soporte
sólido, habitualmente se incorpora a dicha resina un espaciador
bifuncional sensible al medio ácido, que permite el desanclaje en
condiciones suaves del péptido una vez sintetizada.
Por ejemplo un espaciador bifuncional apropiado
es el Fmoc-Rink-Linker (número CAS:
145469-56-3) comercializado por la
empresa Iris Biotech (Alemania).
Dicho espaciador, una vez se ha unido a través
de su grupo carboxílico al grupo amino de la resina MBHA, y se ha
eliminado el grupo protector Fmoc, presenta un grupo amino libre
que permite el anclaje de un aminoácido que tenga un grupo
carboxílico libre.
En el mercado se puede adquirir la resina
Fmoc-Rink-MBHA en la empresa Iris
Biotech, que ya tiene incorporado el espaciador mencionado.
También se puede emplear el ácido
4-hidroximetilfenoxiacético (HMPA) como espaciador
unido a una resina, comercializado por ejemplo por la compañía
Novabiochern.
Un procedimiento para la preparación de los
péptidos de la invención puede ser por ejemplo el que se describe a
continuación.
En dicho procedimiento se utiliza la química del
grupo Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonilo) como
protector del grupo \alpha-amino de los
aminoácidos que se emplean para preparar los péptidos de la
invención.
Para la protección de la cadena lateral de la
lisina (Lys) se ha empleado el grupo terc-butiloxicarbonilo
(Boc). Para la protección de la cadena lateral de la tirosina (Tyr)
se ha empleado el grupo terc-butilo
(t-Bu).
En la primera etapa se procede a la eliminación
del grupo protector Fmoc, presente en el grupo amino del espaciador
bifuncional. A continuación se procede al anclaje del aminoácido
leucina, que también tiene el grupo \alpha-amino
protegido por el grupo Fmoc.
Antes de proceder al nuevo acoplamiento se
elimina el grupo protector Fmoc de la leucina anclada en la
resina.
El ciclo de
acoplamiento-desprotección se repite hasta completar
la estructura del péptido.
La incorporación de los dos últimos aminoácidos
del péptido se realiza habitualmente mediante 2 o 3 acoplamientos
sucesivos con el fin de completar la reacción de acoplamiento del
aminoácido con el péptido anclado en la resina.
La escisión del péptido del soporte sólido se
realiza en condiciones ácidas, al mismo tiempo que se eliminan los
grupos protectores de las cadenas laterales de los aminoácidos que
forman el péptido.
El empleo del
Fmoc-Rink-Linker (número CAS:
145469-56-3) comercializado por la
empresa Iris Biotech (Alemania) en la síntesis de las péptidos
conduce a la formación de un grupo carboxamido en el extremo
C-terminal de los péptidos.
Al emplear como espaciador el HMPA, la escisión
del péptido de la resina conduce a obtener el extremo
C-terminal en forma de grupo carboxílico. Se ha
observado que los péptidos que tienen un grupo carboxílico en el
extremo C-terminal en lugar de un grupo carboxamido
también presentan actividad antimicrobiana.
Tras un proceso convencional de aislamiento, los
péptidos de la invención se obtienen con una buena pureza,
habitualmente superior al 80%, determinada por HPLC, en forma de
sólidos pulverulentos, y se pueden caracterizar por espectrometría
de masas (ESI-MS).
Sorprendentemente se ha comprobado que los
péptidos de la invención presentan una actividad antimicrobiana
frente a bacterias patógenas de plantas y/o humanos y/o animales,
que es particularmente efectiva frente a bacterias patógenas de las
plantas como son las bacterias Erwinia amylovora,
Xanthomonas vesicatoria, y Pseudomonas syringae, y
que además es posible modular la citotoxicidad frente a células
eucariotas y la estabilidad frente a proteasas.
Forma parte del objeto de la invención los
péptidos de la invención para uso como medicamento.
Forma parte del objeto de la invención la
utilización de los péptidos de la invención coma agentes
antimicrobianos.
También forma parte del objeto de la invención
la utilización de los péptidos de la invención para la preparación
de una composición antimicrobiana.
Forma parte también del objeto de la invención
la utilización de los péptidos de la invención para preparar un
medicamento para tratar enfermedades infecciosas en animales y
humanos.
Los péptidos de la invención presentan
diferentes grados de citotoxicidad y diferentes grados de
estabilidad a la degradación enzimálica, de modo que se pueden
combinar varios de los péptidos de la invención en una composición
antimicrobiana para modular la citotoxicidad y la degradación frente
a proteasas.
Preferiblemente los péptidos de la invención se
utilizan como agentes antimicrobianos frente a bacterias patógenas
de las plantas.
Preferiblemente las bacterias fitopatógenas se
seleccionan entre el grupo formado por Erwinia amylovora,
Xanthomonas vesicatoria, y Pseudomonas syringae.
Entre los péptidos de la invención que resultan
ser preferidos para ser utilizados como agentes antimicrobianos
frente a bacterias patógenas de las plantas, se encuentran los
péptidos preferidos indicados anteriormente en este mismo
apartado.
Las bacterias mencionadas resultan ser
indicadores apropiados para determinar la actividad antimicrobiana
de compuestos que son susceptibles de ser empleados para combatir
infecciones y enfermedades causadas por bacterias en plantas.
Erwinia amylovora es una bacteria
Gram-negativa que causa la enfermedad conocida como
fuego bacteriano que afecta a las plantas de la familia de las
rosáceas, entre las que se encuentran árboles frutales de gran
importancia económica como son el manzano y el peral, y plantas
ornamentales como el serbal, el espino de fuego, y el mostajo. En
Europa está catalogada como una bacteria de cuarentena en
agricultura. El fuego bacteriano puede afectar a prácticamente todos
los órganos de la planta y con frecuencia implica la muerte de los
árboles o arbustos enfermos. Actualmente no hay métodos efectivos
para el control del fuego bacteriano y es necesario combinar
distintas medidas encaminadas a eliminar o reducir el inóculo.
Xanthomonas vesicatoria es una bacteria
Gram-negativa que provoca la enfermedad denominada
mancha bacteriana en plantas de la familia de las solanáceas que
tienen una gran importancia económica como son el tomate y el
pimiento. Esta enfermedad afecta a hojas, tallos y frutos
provocando su marchitez o muerte.
Pseudomonas syringae es una bacteria
Gram-negativa que causa un gran numero de
enfermedades denominadas necrosis bacterianas en plantas de cultivos
hortícolas y leñosos como frutales. La patogenicidad de P.
syringae reside en muchos casas en su actividad nucleadora del
hielo (INA+) que potencia los daños por helada. y la producción de
diversas fitotoxinas como las siringomicinas.
Preferiblemente las plantas que se pueden tratar
con los péptidos de la invención se seleccionan entre el grupo
formado por árboles frutales, plantas hortícolas, y plantas
ornamentales.
Entre los árboles frutales se pueden mencionar
los de pepita (manzano, peral), y hueso (melocotonero,
albaricoquero, ciruelo, cerezo) y el platanero.
Entre las plantas hortícolas se encuentran las
solanáceas (tomate, pimiento, patata) y cucurbitáceas (melón,
sandía).
Ejemplos de plantas ornamentales son serbal,
clavel, espino albar y mostajo.
Los péptidos de la invención también se pueden
emplear coma agentes antimierobianos frente a bacterias patógenas
de humanos y animales.
Escherichia coli y Salmonella sp.
son enterobacterias Gram-negativas, que ocasionan
típicamente toxiinfeciones alimentarias y causan gastroenteritis,
que se combaten con diversos antibióticos y tienen una gran
incidencia en la alimentación humana y animal.
Listeria monocytogenes es una bacteria
Gram-positiva que produce infecciones en diversos
órganos en peces, aves y mamíferos. En humanos afecta a
profesionales que trabajan con animales y también se transmite por
alimentos, sobre todo leche, derivados lácteos, productos cárnicos
crudos o fermentados, y productos vegetales frescos. Se combate con
diversos antibióticos.
Starphylococcus aureus es una bacteria
Gram-positiva que vive en la superficie de la piel
de animales, en especial mamíferos, y causa infecciones tanto en la
piel como en mucosas y otros órganos, que se tratan con diversos
antibióticos, aunque es frecuentemente resistente a antibióticos
convencionales, siendo diversas cepas multiresistentes responsables
de infecciones nosocomiales. Producen diversas toxinas muy activas
en mamíferos.
Con los péptidos de la invención se pueden
tratar tanto los animales o humanos, como los alimentos o
materiales destinados a estar en contacto con éstos.
\vskip1.000000\baselineskip
También forma parte del objeto de la invención
una composición antimicrobiana que comprende
- a)
- una cantidad efectiva de al menos un péptido lineal de la invención, y
- b)
- un agente auxiliar.
El péptido lineal de la invención responde a la
fórmula (I):
(I)KKLFKKILKYL
en donde al menos uno de los
aminoácidos es de la serie
D.
Entre los péptidos de la invención que resultan
ser preferidos para formar parte de dichas composiciones
antimicrobianas, se encuentran los péptidos mencionados coma
preferidas en el apartado anterior denominado Péptidos.
Las composiciones antimicrobianas de la
invención presentan buenas propiedades antimicrobianas frente a
bacterias patógenas de las plantas y/o de los humanos y/o de los
animales. Preferiblemente las composiciones antimicrobianas de la
invención son composiciones fitosanitarias que se emplean frente a
bacterias patógenas de plantas.
Habitualmente, en las composiciones
antimicrobianas se combinan varios principios activos para obtener
una mayor eficacia o un espectro más amplio de actuación. En este
caso, las composiciones antimicrobianas de la invención también
pueden comprender la combinación de varios péptidos de la invención
o bien la combinación de éstos con otros agentes antibacterianos
para conseguir una mayor eficacia antimicrobiana.
En el caso de composiciones fitosanitarias los
péptidos de la invención también se pueden combinar con agentes
antifúngicos, y así desplegar una acción antimicrobiana más
amplia.
La cantidad de péptido que forma parte de la
composición fitosanitaria puede ser variable en función de factores
tales como el tipo de planta, la concentración de las bacterias
patógenas en la planta, la extensión de la enfermedad, etc. La
concentración efectiva del péptido se puede determinar y ajustar
fácilmente mediante métodos de rutina bien conocidos por el experto
en la materia. Habitualmente la concentración efectiva del péptido
se encuentra comprendida entre 0.01 y 0,5 g/l, preferiblemente
entre 0,02 y 0,3 g/l, y aún más preferiblemente entre 0.05 y
0,2 g/l.
0,2 g/l.
El agente auxiliar que acompaña los péptidos de
la invención en dichas composiciones antimicrobianas puede tener
varias funciones, como por ejemplo, facilitar la dosificación del
péptido, proporcionar un producto fácilmente manipulable, mejorar el
mojado de las plantas con la composición antimicrobiana.
Dicho agente auxiliar puede ser seleccionado
entre el grupo formado por disolventes, diluyentes, cargas inertes,
agentes tensioactivos humectantes, agentes tamponantes, agentes
dispersantes, agentes antiapelmazantes, lubricantes, filtros de la
radiación ultravioleta, y/o mezclas de los mismos.
Preferiblemente el agente auxiliar se selecciona
entre el grupo formado por disolventes, tensioactivos, agentes
tamponantes, filtros de la radiación ultravioleta y/o sus
mezclas.
Más preferiblemente el disolvente es agua.
Las composiciones fitosanitarias pueden
presentarse en forma líquida o en forma sólida. Por ejemplo, en el
caso de formulaciones líquidas, la composición de la invención
puede presentarse en forma de una composición diluida lista para ser
empleada, o bien en forma de una composición concentrada, que
requiere su dilución antes de ser usada, habitualmente con
agua.
En el caso de composiciones fitosanitarias
líquidas acuosas, la presencia de agentes tensioactivos humectantes
facilita el mojado de las plantas cuando se pulverizan con dicha
composición.
Una ventaja de los péptidos de la invención es
que se pueden disolver en agua con facilidad, y se pueden formular
generalmente como disoluciones acuosas sin necesidad de emplear
disolventes orgánicos adicionales.
Las composiciones fitosanitarias en forma sólida
pueden ser en forma de gránulos, o polvos, en las que los péptidos
de la invención se mezclan con cargas inertes finamente divididas
como, por ejemplo, caolín, tierra de diatomeas, dolomita, carbonato
cálcico, o talco. También pueden presentarse en forma de polvos o
gránulos dispersables, que comprenden un agente humectante para
facilitar la dispersión de los mismos en el líquido.
Las composiciones antimicrobianas de la
invención también se pueden emplear como composiciones
farmacéuticas para hacer frente a bacterias patógenas en humanos y
en animales.
Dichas composiciones farmacéuticas se pueden
formular en formas sólidas tales como granulados, tabletas,
cápsulas, grageas y supositorios, en formas semisólidas tales como
pomadas, o geles, o en formas líquidas tales como disoluciones
inyectables, emulsiones o suspensiones.
Dependiendo de la formulación se pueden utilizar
excipientes apropiados bien conocidos por el experto en la materia,
como los que se describen en el libro de R.C. Rowe y col.
"Handbook of Pharmaceutical Excipients", 4ª edición.
Pharmaceutical Press, Londres, 2003 [ISBN:
0-85359-472-9].
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con
la invención se pueden administrar por las vías oral, parenteral o
rectal, o se pueden utilizar por vía tópica.
Las composiciones útiles por vía oral son, por
ejemplo, los granulados, los comprimidos, las cápsulas o las
grageas. Son composiciones útiles por vía parenteral, por ejemplo,
las emulsiones acuosas, las suspensiones o las disoluciones. Se
pueden aplicar por vía tópica las pomadas, las emulsiones y
suspensiones acuosas u oleosas así como los pulverizadores.
También forma parte del objeto de la invención
un método para prevenir y/o tratar infecciones y enfermedades en
plantas causadas por bacterias que comprende poner en contacto la
planta con una composición antimicrobiana que incluye los péptidos
de la invención.
\newpage
En el método de la invención la composición
antimicrobiana se puede aplicar de forma preventiva a las plantas
para evitar la aparición de enfermedades infecciosas causadas por
bacterias. El tratamiento preventivo tiene su base en que los
péptidos de la invención inhiben el crecimiento de bacterias
patógenas de las plantas.
Entre los péptidos de la invención que resultan
ser preferidos para formar parte de dichas composiciones
antimicrobianas, se encuentran los péptidos mencionados como
preferidos en el apartado anterior denominado Péptidos.
En el método de la invención, la composición
antimicrobiana también se puede emplear para tratar enfermedades
infecciosas una vez se ha detectado su presencia en las plantas, ya
que los péptidos de la invención inhiben el crecimiento de las
bacterias causantes de dichas enfermedades infecciosas.
En esta descripción la expresión "enfermedad
infecciosa" se refiere a la invasión y destrucción de un órgano,
por ejemplo, hojas, flores, o frutos, por parte de los
microorganismos patógenos. Por tanto, se trata de un proceso
localizado. En cambio, el término enfermedad se refiere a un proceso
que afecta a la planta, dando lugar a linos determinados
síntomas.
Preferiblemente el método de la invención se
emplea para tratar enfermedades infecciosas provocadas por
bacterias patógenas de las plantas seleccionadas entre el grupo
formado por Erwinia amylovora, Xanthomonas
vesicatoria, y Pseudomonas syringae.
Preferiblemente las plantas que se pueden tratar
con los péptidos de la invención se seleccionan entre el grupo
formado por árboles frutales, plantas hortícolas, y plantas
ornamentales.
En el método de la invención, la composición se
puede poner en contacto con las partes de las plantas seleccionadas
entre el grupo formado por semillas, raíces, tallos, hojas, o
frutos, o con el suelo o cualquier medio de crecimiento que rodee
las raíces de las plantas.
En el método de la invención, la composición
antimicrobiana se puede poner en contacto con la planta por
cualquier técnica convencional, entre las que destacan, la
pulverización, la inmersión o el riego.
Por ejemplo se puede preparar una disolución
acuosa de los péptidos de la invención y proceder a la
pulverización de las partes de las plantas afectadas o susceptibles
de ser afectadas. Si se trata de los Frutos de un árbol frutal, por
ejemplo, también se puede realizar el tratamiento de los mismos por
pulverización o por inmersión antes de su cosecha o en
post-cosecha.
El tratamiento de las raíces puede llevarse a
cabo por ejemplo empleando una composición sólida en la que los
péptidos se encuentran dispersos en tina carga inerte, o por
pulverización con la mencionada disolución acuosa, o mediante su
aplicación por riego.
También forma parte del objeto de la invención
un método para tratar enfermedades infecciosas en animales y
humanos causadas por bacterias que comprende la administración de
una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de la
invención.
Preferiblemente el método de la invención se
emplea para tratar enfermedades infecciosas provocadas por
bacterias patógenas de las animales y humanos seleccionadas entre
el grupo formado par Escherichia coli, Slaphylococcus
aureus, Salmonella typhimurin, y Listeria
monocytogenes.
La composición antimicrobiana se puede aplicar
para tratar infecciones y enfermedades causadas por bacterias, ya
que dichos péptidos inhiben el crecimiento de bacterias patógenas
de animales y humanos.
En el método de la invención, la composición
antimicrobiana también se puede emplear para tratar dichas
enfermedades una vez se ha detectado su presencia, ya que los
péptidos de la invención inhiben el crecimiento de las bacterias
causantes de dichas infecciones y enfermedades.
En esta descripción la expresión "enfermedad
infecciosa" se refiere a la invasión y destrucción de un órgano,
por ejemplo, piel, pulmones, sistema gastrointestinal,
genitourinario, etc., por parte de los microorganismos
patógenos.
En el método de la invención, la composición
conteniendo una disolución acuosa de los péptidos de la invención
se puede administrar por vía oral o por vía parenteral.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad antimicrobiana de los péptidos de
la invención frente a bacterias patógenas para plantas se ha
evaluado mediante la determinación de la concentración mínima de
péptido necesaria para inhibir el crecimiento de los
microorganismos. Habitualmente dicha concentración se denomina
concentración mínima inhibitoria (CMI).
\newpage
Este tipo de ensayos es habitual en
microbiología y es bien conocido por el experto en la materia. Una
descripción de la metodología empleada se encuentra por ejemplo en
VI.J. Pelezar Jr, E.C.S. Chan. N.R. Krieg. Microbiology: Concepts
and Applications. New York: McGraw-Hill, 1997.
Para evaluar dicho efecto antimicrobiano de los
péptidos de la invención se emplearon las siguientes cepas de
bacterias patógenas: Erwinia amylovora PMV6076 (INRA, Angers,
Francia), Xanthomonas vesicatoria 2133-2
(IVIA, Valencia, España), Pseudomonas syringae pv.
syringae EPS94 (INTEA, Universitat de Girona, España),
Escherichia coli ATCC11775 (American Type Culture Colection),
Listeria monocytogenes ATCC 15313, Sthaphylococcus
aureus ATCC 9144, y Salmonella typhimurium LT2 ATCC
15277.
Se ha comprobado que las composiciones que
comprenden los péptidos de la invención disueltos en agua a
concentraciones comprendidas entre 0,8 y 7,5 \muM son efectivas
para inhibir el crecimiento de bacterias como Erwinia
amylovora, Xanthomonas vesicatoria, y/o Pseudomonas
syringae.
Estos resultados demuestran la eficacia de la
actividad antimicrobiana de los péptidos de la invención, ya que en
Avrahami et al. Biochemistry, 2001, 40,
12591-12603, se describe que una concentración
inhibitoria mínima inferior a 50 \muM es considerada coma
significativa.
Los péptidos de la invención presentan una
actividad antimicrobiana igual o superior a la del péptido descrito
en el articulo de Badosa et al., y además se puede modular su
citotoxicidad frente a células eucariotas y su estabilidad frente a
proteasas.
Entre los péptidos de la invención se encuentran
péptidos activos preferentemente frente a patógenos de plantas como
por ejemplo: BP141, BP142, BP144: y también de amplio espectro como
por ejemplo: BP147, BP153, BP154, BP160, BP161.
La actividad hemolítica de los péptidos es un
indicador de la toxicidad en células eucariotas, y una
característica que generalmente se determina para aquellos
compuestos que pueden llegar a entrar en contacto con el cuerpo
humano. Este seria el caso si frutas u hortalizas tratadas con los
péptidos de la invención contuvieran restos de los mismos y fuesen
consumidos por las personas, o al ser manipulados por operarios
durante su aplicación o preparación.
La mencionada actividad hemolítica se ha
evaluado mediante la determinación de la liberación de hemoglobina
que se produce al poner en contacto una solución de dichos péptidos
en tampón de TRIS con suspensiones de eritrocitos al 5% en
volumen/volumen procedentes de sangre humana fresca. El resultado de
dicha determinación se expresa como el porcentaje de hemólisis que
se produce para una concentración conocida de péptido. Una
descripción de la metodología empleada para la determinación de la
actividad hemolítica se encuentra en Oren et al.
Biochemistry. 2000, 39, 6103-6114, yen Raguse et
al, J. Am. Chem. Soc., 2002, 124,
12774-12785.
Se ha comprobado que la gran mayoría de los
péptidos de la invención presentan una actividad hemolítica
significativa a una concentración que puede llegar a ser varios
órdenes de magnitud superior a la concentración a la que son activos
para inhibir el crecimiento de bacterias patógenas.
La estabilidad de los péptidos a la degradación
por proteasas es una característica que permite evaluar que los
péptidos se encuentren inalterados en la planta o en el cuerpo
humano o en el cuerpo de los animales durante un tiempo de vida
medio razonable. Los péptidos pueden ser degradados tanto por
proteasas como por microorganismos.
La estabilidad de los péptidos a la degradación
por proteasas se ha evaluado mediante el tratamiento de soluciones
de los péptidos en tampón TRIS con Proteinasa K
(Sigma-Aldrich), y la monitorización de su
degradación por HPLC a diferentes intervalos de tiempo. La
degradación se expresa como el porcentaje de péptido degradado
después de 45 minutos calculados a partir de la disminución del área
del pico del péptido nativo por HPLC. Una descripción de la
metodología empleada para la determinación de la estabilidad a
proteasas se encuentra en Rozek et al, Biochemistry, 2003,
42, 14130-14138.
Se ha comprobado que algunos péptidos de la
invención son mucho más estables a la degradación por proteasas que
el péptido descrito por Badosa et al.
\newpage
En la Tabla IV se presentan la citotoxicidad
(H_{250}, hemólisis a 250 \muM) y la degradación frente a
proteasas a los 45 minutos de algunos de los péptidos de la
invención para poner de manifiesto que es posible modular dichas
propiedades con dichos péptidos solos o en combinación:
Se puede observar que la actividad hemolítica no
está directamente relacionada con el número de aminoácidos de la
serie D que figuran en un determinado péptido.
Así, se pueden encontrar péptidos con una baja
actividad hemolítica que tienen o bien un único aminoácido de la
serie D (BP142) o bien varios (BP151). Análogamente, se pueden
encontrar péptidos con una actividad hemolítica considerable que
tienen e bien un único aminoácido de la serie D (BP147) o bien
varios (BP161).
También se puede observar que la degradación
frente a proteasas tampoco está relacionada con el número de
aminoácidos de la serie D que figuran en un determinado
péptido.
De esta forma se pueden encontrar péptidos con
una baja degradación que tienen o bien un único aminoácido de la
serie D (BP141) o bien varios (BP161). Análogamente, se pueden
encontrar péptidos que sufren una degradación considerable que
tienen o bien un único aminoácido de la serie D (BP145) o bien
varios (BP154).
\vskip1.000000\baselineskip
Así pues, con los péptidos antimicrobianos de la
invención se dispone de compuestos antimicrobianos frente a
bacterias patógenas de plantas y/o humanos y/o animales, cuya
citotoxicidad frente a células eucariotas y degradación frente a las
proteasas se puede modular tal como se muestra en la Tabla V:
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación, a los efectos de completar de
forma suficiente la anterior descripción, se exponen los siguientes
ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
En los ejemplos que siguen se emplean las
siguientes abreviaciones: BHI, Brain Heart infusion; Boc:
terc-butiloxi-
carbonilo; t-Bu: terc-butilo; CMI: concentración mínima inhibitoria; DIEA: N,N-diisopropiletilamina; DMF: N,N-dimetilformamida; EDTA, ácido etilendiaminotetracético; ESI-MS: espectrometría de masas con ionización por electropulverización: Fmoc: 9-fluorenilmetoxicarbonilo; HBTU: hexafluorofosfato de N-óxido de N-[(1H-benzotriazol-1-il)(dimetilamino)metilen]-N-metilmetanaminio; HOBt: 1-hidroxibenzotriazol; HPLC: cromatografía líquida de alta resolución: LB: Luria Bertani: MBHA: 4-metilbencidrilamina; NMP: N-metilpirrolidona: TFA: ácido trifluoroacético; TIS: triisopropilsilano; TRIS: tris(hidroximetil)aminometano; TSB: Trypticase Soy Broth: VV: ultravioleta.
carbonilo; t-Bu: terc-butilo; CMI: concentración mínima inhibitoria; DIEA: N,N-diisopropiletilamina; DMF: N,N-dimetilformamida; EDTA, ácido etilendiaminotetracético; ESI-MS: espectrometría de masas con ionización por electropulverización: Fmoc: 9-fluorenilmetoxicarbonilo; HBTU: hexafluorofosfato de N-óxido de N-[(1H-benzotriazol-1-il)(dimetilamino)metilen]-N-metilmetanaminio; HOBt: 1-hidroxibenzotriazol; HPLC: cromatografía líquida de alta resolución: LB: Luria Bertani: MBHA: 4-metilbencidrilamina; NMP: N-metilpirrolidona: TFA: ácido trifluoroacético; TIS: triisopropilsilano; TRIS: tris(hidroximetil)aminometano; TSB: Trypticase Soy Broth: VV: ultravioleta.
Los productos
Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Phe-OH,
Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Tyr(tBu)-OH,
Fmoc-D-Lys(Boe)-OH,
Fmoc-D-Phe-OH,
Fmoc-D-Leu-OH,
Fmoc-D-Ile-OH,
Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH,
la resina Fmoc-Rink-MBHA
funcionalizada con grupos amino, HOBt y HBTU, se obtuvieron de Iris
Biotech. Los productos ácido trifluoroacético,
N-metilpirrolidona, y TIS se obtuvieron de Aldrich.
Los productos piperidina y DIEA se obtuvieron de Fluka.
Las siguientes indicaciones sabre el
procedimiento para la preparación de los péptidos son de carácter
general:
- -
- Se emplearon aminoácidos que tienen el grupo \alpha-amino protegido con el grupo Fmoc.
- -
- Para la protección de la cadena lateral de la lisina se empleó el grupo terc-butiloxicarbonilo (Boc). Para la protección de la cadena lateral de la tirosina se empleó el grupo terc-butilo (t-Bu).
- -
- Las reacciones se llevaron a cabo en jeringas de 2 ml que tenían incorporado un Filtro microporoso de polipropileno.
- -
- Todas las transformaciones y lavados se llevaron a cabo a 25ºC, a no ser que se indique lo contrario.
- -
- El análisis por HPLC se llevó a cabo con un flujo de 1.0 ml/min empleando una columna de fase reversa Kromasil (4.6 \times 40 mm: tamaño de partículas de 3,5 \mum). Se emplearon gradientes lineales con TFA acuoso al 0.1% y TFA en acetonitrilo al 0,1%, con una relación comprendida entre 0.98:0,02 y 0.98:0.1 durante un periodo de tiempo de 7 minutos con detección UV a una longitud de onda de 220 nm.
- -
- Los espectros ESI-MS fueron adquiridos empleando un instrumento Esquire 6000 ESI ion Trap LC/MS (Bruker Daltonics), operando en el modo positivo de iones (ES+).
- -
- Todas las relaciones entre los disolventes son volumen/volumen, a no ser que se especifique otro tipo de proporción.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
I
En una jeringa de 2 ml de capacidad, equipada
con un filtro microporoso en la parte inferior, se colocaron 30 mg
de resina Fmoc-Rink-MBHA con una
funcionalización de 0.66 mmol/g, equivalentes a 19,8 \mumoles de
grupos amino, y se llenó la jeringa con disolvente para
hinchar-lavar la resina de acuerdo con la siguiente
secuencia: CH_{2}Cl_{2} (1 \times 20 min) y DMF (1 \times 20
min). La expresión CH_{2}Cl_{2} (1 \times 20 min) se refiere
a que se realizó 1 lavado de 20 minutos con cloruro de metileno.
Después de cada etapa de lavado se eliminó el disolvente mediante
un filtrador de vacío múltiple (Vac Man Laboratory Vacuum Manifold
de Promega Distribuidora).
Después de hinchar-lavar la
resina, ésta se trató con una mezcla de piperidina y DMF (3:7, 1
\times 2 min y 1 \times 10 min) para eliminar el grupo Fmoc
presente en el grupo amino del espaciador bifuncional, y, a
continuación, se lavó con DMF (6 \times 1 min).
Seguidamente la resina se trató con 28 mg de
Fmoc-Leu-OH (79 \mumoles), 28 mg
de HBTU (75 \mumoles), 11 mg de HOBt (79 \mumoles) y 27 \mul
de DIEA (154 \mumoles) en 0,1 ml de DMF. Después de 1 h se lavó
la resina con DMF (6 \times 1 min) y se comprobó que el test de
ninhidrina era negativo (Kaiser et al, Anal. Biochem., 1970,
34, 595-598).
La eliminación del grupo Fmoc y los lavados
subsiguientes se realiza- ron como ya se ha descrito
anteriormente.
El ciclo de
acoplamiento-desprotección se repitió para los
siguientes cuatro aminoácidos protegidos con el grupo
N^{\alpha}-Fmoc:
Fmoc-Tyr(tBu)-OH,
Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-Leu-OH y
Fmoc-Ile-OH. En cada etapa se
procedió al lavado con DMF (6 \times 1 min).
A partir del quinto aminoácido incorporado,
tanta la eliminación del grupo Fmoc, los ciclos
acoplamiento-desprotección como los correspondientes
lavados se realizaron de la misma manera substituyendo en estos
casos la DMF por NMP. Los seis últimos aminoácidos se incorporaron
protegidos con el grupo N^{\alpha}-Fmoc:
Fmoc-Lys(Boc)-OH,
Fmoc-D-Phe-OH y
Fmoc-Leu-OH. Para la incorporación
de los dos últimos aminoácidos se realizaron 2-3
acoplamientos sucesivos para obtener un test de ninhidrina
negativo.
Después de eliminar el grupo Fmoc del último
aminoácido acoplado, como ya se ha descrito anteriormente, se lavó
la resina con NMP (6 \times 1 min) y CH_{2}Cl_{2} (6 \times
1 min), y se obtuvo el péptido lineal unido a la resina,
Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-D-Phe-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ile-Leu-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Leu-Rink-MBHA.
A continuación se escindió el péptido de la resina mediante un
tratamiento con 1 ml de una mezcla de TFA, agua y T1S (95:2,5:2,5)
durante 2 horas. Se recogieron los filtrados en un vial mediante
una presión positiva de nitrógeno. La resina se lavó con una mezcla
de TFA, agua y TIS (95:2,5:2,5, 2 \times 0,5 ml). Los filtrados
se combinaron y se evaporaron casi a sequedad bajo una corriente de
nitrógeno hasta obtener un aceite. Dicho aceite se precipitó con
éter dietílico, se centrifugó, y el éter se decantó. Este proceso se
repitió 3 o 4 veces. Finalmente, el producto sólido obtenido se
disolvió en agua, y se liofilizó.
Se obtuvo un sólido pulverulento que tenia una
pureza superior al 80% analizada por HPLC (tiempo de retención 6,28
minutos), y su estructura se confirmó por
FSI-MS.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos 2 a
24
Siguiendo un procedimiento análogo al descrito
en el Ejemplo 1 se prepararon los péptidos de la invención que se
muestran en la Tabla VI:
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los péptidos de la Tabla VI tienen un
grupo carboxamida en el grupo C-terminal.
\newpage
Ejemplo
25
El efecto antimicrobiano de los péptidos de la
invención se determinó frente a cepas de bacterias fitopatógenas y
cepas patógenas de importancia en clínica humana. Las cepas
fitopatógenas corresponden a: Erwinia amylovora PMV6076
(IN-RA, Angers, Francia), Xanthomonas
vesicatoria 2133-2 (IVIA, Valencia, España), y
Pseudomonas syringae pv. syringae EPS94 (INTEA,
Universitat de Girona, España). Las cepas patógenas de clínica
humana corresponden a: Escherichia coli ATCC11775 (American
Type Culture Collection), Listeria monocytogenes ATCC15313,
Staphylococcus aureus ATCC 9144 y Salmonella
typhimurium LT2 ATCC 15277.
Todas las bacterias se conservaron a una
temperatura de -80ºC en medio Luria-Bertani (LB)
complementado con glicerina al 20% en volumen/volumen.
Las suspensiones de las bacterias E.
amylovora PMV6076 y P. syringae pv. syringae
EPS94 se obtuvieron después de un crecimiento de 24 horas a 25ºC en
agar LB. X. vesicatoria 2133-2 se obtuvo
después de la incubación durante 48 horas a 25ºC en agar LB. En
cuanto a las cepas de E. coli ATCC 1 1775, S. aureus
ATCC 9144 y S. typhimurium LT2 ATCC 15277 se obtuvieron
después de un crecimiento de 24 horas a 37ºC en agar LB y L.
monocytogenes ATCC 15313 se obtuvo después de la incubación
durante 24 horas a 37ºC en medio Brain Heart Infusion (BHI). En
todos los casos se resuspendieron en agua estéril para obtener una
suspensión ajustada a una absorbancia de 0.2 a 600 nm, que
correspondía aproximadamente a 10^{8} unidades formadoras de
colonias/ml.
Para determinar la concentración inhibitoria
mínima (CIM), los péptidos se solubilizaron en agua estéril
milli-Q hasta una concentración final de 1000 \mum
y se esterilizaron a través de un filtro de 0,22 \mum de
poro.
Se realizaron diluciones de los péptidos de la
invención para obtener soluciones a las concentraciones 500: 250:
125: 100: 75: 62.5: 50: 31,2: 25: 16.5; 12,5 y 8 \muM.
Se mezclaron 20 \mul de cada dilución con 20
\mul de la suspensión del indicador bacteriano correspondiente, y
160 \mul de medio líquido correspondiente (Trypticase Soy Broth
(TSB), para las bacterias fitopatógenas X. vesicatoria. E.
amylovora y P. syringae: LB para E. coli, S.
aureus y S. thyphimurium y BHI para L.
monocytogenes), hasta un volumen total de 200 \mul en cada
pocillo de una microplaca. Así las concentraciones efectivas a las
que se sometían las suspensiones de bacterias fueron 50: 25: 12.5:
10: 7,5: 6.25; 5: 3.12: 2,5: 1,65: 1.25 y 0,8 \muM.
Se llevaron a cabo tres réplicas para cada cepa,
concentración y péptido en ensayo.
Los controles positivos contenían agua en lugar
de péptido, y los controles negativos contenían los péptidos sin la
suspensión bacteriana.
El crecimiento microbiano se determinó
automáticamente mediante la medida de la densidad óptica a 600 nm
empleando el Microbiology Analyser Bioscreen C (Labsystems).
Las microplacas se incubaron a 25ºC para E.
amylovora, P. syringae y X. vesicatoria y a 37ºC
para L. monocytogenes, S. thyphimurium, S.
aureus y E. coli durante 48 horas con una agitación de
10 segundos antes de la medida de la absorbancia cada hora. Cada
experimento se realizó dos veces.
Como CMI se tomó la concentración de péptido más
baja a la que no se producía crecimiento bacteriano al final del
experimento.
En la Tabla VII se presenta el rango de
concentraciones entre las que se encuentra la CMI, expresada en
\muM, después de 48 h de incubación a 25ºC, para diferentes
péptidos de la invención frente a las bacterias Xanthomonas
vesicatoria (X v.), Pseaudomonas syringae (P.,s.) y
Erwinia amylovora (E.a.).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede comprobar que los péptidos de la
invención presentan una buena eficacia para inhibir el crecimiento
de las bacterias Xanthomonas vesicatoria, Pseudomonas
syringae, y/o Erwinia amylovora, siendo muchos de ellos
más activos que el péptido ya conocido, cuyos resultados se
presentan en la primera fila de la tabla anterior bajo la
denominación de Ejemplo comparativo y referencia BP100.
\newpage
En la Tabla VIII se presenta el rango de
concentraciones entre las que se encuentra la CMI, expresada en
\muM, después de 48 h de incubación a 25ºC, para diferentes
péptidos de la invención frente a las bacterias patógenas para
humanos y/o animales Escherichia coli (E.c.),
Staphylococcus aureus (S.a.), Salmonella typhimurium
(.S.t.), y Lysteria monocytogenes (L.m):
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se puede comprobar que los péptidos de la
invención presentan una buena eficacia para inhibir el crecimiento
de las bacterias Escherichia coli, Staphylocpccus
aureus, Salmonella typhimurim, y Lysteria
monocytogenes, siendo muchos de ellos más activos que el
péptido ya conocido, cuyos resultados se presentan en la primera
fila de la tabla anterior bajo la denominación de Ejemplo
comparativo y referencia BP100.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
26
La actividad hemolítica de los péptidos de la
invención se evaluó mediante la determinación de la liberación de
hemoglobina que se produce al poner en contacto una solución de los
péptidos con una suspensión de eritrocitos al 5% en volumen
procedentes de sangre humana fresca.
La sangre se recogió asépticamente empleando un
sistema Vacutainer K2E (Belliver, Gran Bretaña) con EDTA, y se
almacenó a 4ºC durante un período inferior a 2 horas.
La sangre se centrifugó a 6.000 g durante 5
minutos para separar los eritrocitos. Éstos se lavaron tres veces
con tampón TRIS (10 mM TRIS, 150 mM NaCl, pH 7,2), y se
suspendieron en tampón TRIS hasta obtener una suspensión que
contenía un 10% en volumen de eritrocitos.
Los péptidos se solubilizaron en tampón TRIS
hasta una concentración final de 500 \muM.
Se emplearon tres réplicas para cada péptido y
concentración.
Se mezclaron 65 \mul de la suspensión de
eritrocitos al 10% en volumen con 65 \mul de la solución de
péptido en cada pocillo de una placa de 96 pocillos
Micro-Amp (Applied Biosystems. EE.UU.) (5% en
volumen de eritrocitos), y se incubó la mezcla durante 1 h a 37ºC
bajo agitación. De este modo las suspensiones de eritrocitos se
sometieron a una concentración de péptido de 250 \muM.
A continuación se centrifugaron las placas a
3.500 g durante 10 minutos, y se transfirieron alicuotas de 80
\mul del sobrenadante a microplacas de 100 pocillos (Bioscreen),
que se diluyeron con 80 \mul de agua milli-Q.
El grado de hemólisis se determinó a partir de
la absorbancia a 540 nm con un lector de placas Bioscreen.
El control positivo de hemólisis completa se
determinó en una solución de tampón TRIS que contenía melitina 200
\muM (Sigma-Aldrich, España).
\vskip1.000000\baselineskip
El porcentaje de hemólisis (H) se determinó
empleando la ecuación:
H =
100x[(Op-Ob)/(Om-Ob)]
donde Op es la densidad óptica
medida para una concentración de péptido determinada, Ob es la
densidad óptica de la solución tampón, y Om es la densidad óptica
para el control positivo con
melitina.
\vskip1.000000\baselineskip
En la Tabla IX se presentan los resultados de
actividad hemolítica, expresada como el porcentaje de hemólisis
calculado según la ecuación anterior, para una concentración de
péptidos de la invención correspondiente a 250 \muM. En dicha
Tabla se incluye el resultado obtenido con el péptido descrito por
Badosa et al, como Ejemplo comparativo y referencia
BP100.
\vskip1.000000\baselineskip
En todos los casos se observa que la
concentración en la que se llegaría a producir una hemólisis
significativa puede llegar a ser varios órdenes de magnitud
superior a la concentración en la que los péptidos de la invención
presentan actividad antimicrobiana.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
27
La estabilidad de los péptidos de la invención a
la degradación por proteasas se determinó mediante un ensayo de
digestión del péptido por Proteinasa K
(Sigma-Aldrich Corporation, Madrid, España).
Se empleó una disolución de 50 \mug/ml de
péptido y de 1 \mug/ml de Proteinasa K en tampón TRIS 100 mM a pH
7,6, a temperatura ambiente.
El progreso de la hidrólisis del péptido se
determinó cromatográficamente a tiempos comprendidos entre 5
minutos y 1 hora. Para ello se empleó una columna C_{18} de fase
reversa (Kromasil, 4.6 \times 40 mm: 3.5 \mum de tamaño de
partícula), y gradientes lineales de TFA acuoso al 0,1% y TFA en
acetonitrilo al 0,1% desde 0,98:0.02 a 0:1 durante 7 min realizando
la detección mediante absorbancia en el ultravioleta a 220 nm.
En la Tabla X se presentan los resultados de
estabilidad a la degradación por proteasas de algunos de los
péptidos de la invención.
La estabilidad se expresa como el porcentaje de
degradación de cada péptido a los 45 minutos. En dicha Tabla se
incluye coma Ejemplo comparativo y referencia BP 100 el resultado
correspondiente al péptido descrito en Badosa et al.
Se puede observar que es posible modular la
degradación por proteasas de los péptidos antimicrobianos de la
invención, de modo que se puede ajustar dicha degradación en
función de las necesidades de la aplicación.
\newpage
- \bullet
- Artificial sequence: Secuencia artificial
- \bullet
- Linear peptides containing D-amino acids: Péptidos lineales conteniendo aminoácidos de la serie D
- \bullet
- PatentIn version 3.3: PatentIn versión 3.3
- \bullet
- PEPTIDE: Péptido
- \bullet
- Residue: Residuo
- \bullet
- Residues 2 to 11 are D-amino acids: los residuos 2 a 11 son aminoácidos de la serie D
- \bullet
- Residues 3 to 11 are D-amino acids: los residuos 3 a 11 son aminoácidos de la serie D
- \bullet
- Residues 4 to 11 are D-amino acids: los residuos 4 a 11 son aminoácidos de la serie D
- \bullet
- Residues 5 to 11 are D-amino acids: los residuos 5 a 11 son aminoácidos de la serie D
- \bullet
- Residues 6 to 11 are D-amino acids: los residuos 6 a 11 son aminoácidos de la serie D
- \bullet
- Residues 7 to 11 are D-amino acids: los residuos 7 a 11 son aminoácidos de la serie D
- \bullet
- Residues 8 to 11 are D-amino acids: los residuos 8 a 11 son aminoácidos de la serie D
- \bullet
- SEQUENCE LISTING: Listado de secuencias
- \bullet
- University of Girona: Universidad de Girona
<110> university of Girona
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Linear peptides containing
D-amino acids
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P09032310
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Linear peptide containing
D-amino acids
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residue 10 =
D-Tyr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Linear peptide containing
D-amino acids
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residue 11 =
D-Leu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Linear peptide containing
D-amino acids
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residue 9 =
D-Lys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Linear peptide containing
D-amino acids
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residue 8 =
D-Leu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Linear peptide containing
D-amino acids
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residue 5 =
D-Lys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Linear peptide containing
D-amino acids
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residue 4 =
D-Phe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Linear peptide containing
D-amino acids
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residue 3 =
D-Leu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Linear peptide containing
D-amino acids
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residue 2 =
D-Lys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Linear peptide containing
D-amino acids
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residue 6 =
D-Lys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Linear peptide containing
D-amino acids
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residue 1 =
D-Lys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Linear peptide containing
D-amino acids
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residue 7 =
D-Ile
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Linear peptide containing
D-amino acids
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residue 3 = D-Leu;
Residue 9 = D-Lys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Linear peptide containing
D-amino acids
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residue 8 = D-Leu;
Residue 9 = D-Lys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Linear peptide containing
D-amino acids
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residue 3 = D-Leu;
Residue 6 = D-Lys; Residue 9 =
D-Lys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Linear peptide containing
D-amino acids
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residue 7 = D-Ile;
Residue 8 = D-Leu; Residue 9 =
D-Lys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Linear peptide containing
D-amino acids
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> All residues in the sequence are
D-amino acids
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Linear peptide containing
D-amino acids
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residue 1 = D-Lys;
Residue 2 = D-Lys; Residue 4 =
D-Phe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Linear peptide containing
D-amino acids
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residues 8 to 11 are
D-amino acids
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Linear peptide containing
D-amino acids
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residues 7 to 11 are
D-amino acids
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Linear peptide containing
D-amino acids
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residues 6 to 11 are
D-amino acids
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Linear peptide containing
D-amino acids
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residues 5 to 11 are
D-amino acids
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Linear peptide containing
D-amino acids
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residues 4 to 11 are
D-amino acids
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Linear peptide containing
D-amino acids
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residues 3 to 11 are
D-amino acids
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Linear peptide containing
D-amino acids
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Residues 2 to 11 are
D-amino acids
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\hskip1cm
Claims (20)
1. Péptidos lineales antimicrobianos que
responden a la fórmula (I):
(I)KKLFKKILKYL
caracterizados porque al
menos uno de los aminoácidos es de la serie D, y en donde el
aminoácido leurina del extremo C-terminal está en
forma de grupo carboxilo o
carboxamida,
2. Péptidos según la reivindicación 1,
caracterizados porque incluyen un residuo de aminoácido de
la serie D en cualquiera de las posiciones 1 a 8.
3. Péptidos según la reivindicación 2
seleccionados entre el grupo formado por los péptidos definidos por
las secuencias SEQ_ID_NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, y 10.
4. Péptido según la reivindicación 3,
caracterizado por la SEQ_ID_NO: 6.
5. Péptidos según la reivindicación 1,
caracterizados porque incluyen entre cinco y once
aminoácidos de la serie D consecutivos.
6. Péptidos según la reivindicación 5
seleccionados entre el grupo formado por los péptidos definidos por
las secuencias SEQ_ID_NO: 16, 19, 20, 21, 22, 23 y 24.
7. Péptidos según la reivindicación 6
seleccionados entre el grupo formado por los péptidos definidos por
las secuencias SEQ_ID_NO: 16 y 21.
8. Péptidos según la reivindicación 1,
caracterizados porque incluyen dos o tres aminoácidos de la
serie D.
9. Péptidos según la reivindicación 8
seleccionados entre el grupo formado por los péptidos definidos por
las secuencias SEQ_ID_NO: 12, 13, 14, 15 y 17.
10. Péptidos según la reivindicación 9
seleccionados entre el grupo formado por los péptidos definidos por
las secuencias SEQ_ID_NO: 13 y 14.
11. Péptidos según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizados porque el grupo
C-terminal es un grupo carboxamida.
12. Péptidos según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 para uso como medicamento.
13. Utilización de las péptidos de cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 11 como agentes antimicrobianos.
14. Utilización de los péptidos de cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 11 para la preparación de un medicamento
para tratar enfermedades infecciosas en animales y humanos.
15. Utilización según la reivindicación 13 como
agentes antimicrobianos frente a bacterias patógenas de las
plantas.
16. Utilización según la reivindicación 13 como
agentes antimicrobianos frente a bacterias patógenas de animales y
humanos.
17. Utilización de las péptidos de cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 11 para preparar un medicamento para tratar
enfermedades infecciosas en humanos y animales causadas por
bacterias.
18. Utilización de los péptidos de cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 11 para la preparación de una composición
antimicrobiana.
19. Composición antimicrobiana
caracterizada porque comprende
- a)
- una cantidad efectiva de al menos un péptido lineal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, y
- b)
- un agente auxiliar.
20. Método para tratar enfermedades infecciosas
en plantas causadas por bacterias caracterizado porque
comprende poner en contacto la planta con una composición
antimicrobiana según la reivindicación 19.
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|---|---|---|---|
| ES200930538A ES2332258B2 (es) | 2009-07-30 | 2009-07-30 | Peptidos lineales antimicrobianos con aminoacidos de la serie d. |
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|---|---|---|---|---|
| US5585353A (en) * | 1990-02-02 | 1996-12-17 | The Rockefeller University | Antibiotic peptides containing D-amino acids |
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-
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5585353A (en) * | 1990-02-02 | 1996-12-17 | The Rockefeller University | Antibiotic peptides containing D-amino acids |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
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|---|---|---|---|
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