ES2333181T3 - Metodo para la deteccion de una intolerancia ligera a la glucosa o hiposecrecion de insulina. - Google Patents

Metodo para la deteccion de una intolerancia ligera a la glucosa o hiposecrecion de insulina. Download PDF

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Abstract

Método para la eliminación de glucosa en una muestra, caracterizado porque se utilizan simultáneamente ATPhexocinasa y ADP-hexocinasa para la reacción de eliminación de glucosa en la muestra.

Description

Método para la detección de una intolerancia ligera a la glucosa o hiposecreción de insulina.
Antecedentes de la invención
Un objetivo final del tratamiento diabético consiste en prevenir la aparición de complicaciones diabéticas e inhibir el desarrollo de las mismas. Según ponen de manifiesto los ensayos clínicos para la consecución de este objetivo, es importante descubrir cualquier anomalía y comenzar el tratamiento de la misma en la fase más precoz posible [p.ej., Diabetes Research and Clinical Practice, 28, 103 (1995)].
Además, se considera efectivo como procedimiento preventivo más avanzado, encontrar personas con prediabetes o en las fases previas de la diabetes, o personas con alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa o con defecto secretor de insulina que no se encuentran actualmente en el estadio prediabético pero que presentan una alta probabilidad de desarrollar diabetes o prediabetes a corto plazo, y administrarles tratamiento o recomendarles ejercicio y dietas adecuadas. Se han llevado a cabo ensayos clínicos destinados a demostrar este hecho científicamente [p.ej., Diabetes Care, 21, 1720 (1998)]. Por consiguiente, la detección de las personas con prediabetes tendrá importancia en la prevención de la diabetes mellitus, así como de las complicaciones relacionadas con ésta. Asimismo, se considera que poder diagnosticar a personas con alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa o con defecto secretor de insulina, que no se encuentran actualmente en el estadio prediabético pero que presentan una alta probabilidad de desarrollar diabetes o prediabetes a corto plazo, resulta de vital importancia a fin de prevenir la diabetes mellitus de forma precoz.
Un ejemplo del procedimiento diagnóstico de la diabetes mellitus consiste en una prueba de tolerancia oral a la glucosa. Tras una sobrecarga oral de glucosa de 75 gramos, se define como tolerancia normal a la glucosa (NGT) a un grupo de personas que presentan un nivel de glucosa en sangre en ayunas inferior a 110 mg/dL y con un nivel de glucosa en sangre 2 horas después de la sobrecarga, inferior a 140 mg/dL. Además, se define como glucemia anormal en ayunas (IFG) a un grupo de personas que presentan un nivel de glucosa en sangre en ayunas no inferior a 110 mg/dL pero inferior a 126 mg/dL y con un nivel de glucosa en sangre, 2 horas después de la sobrecarga, inferior a 140 mg/dL; y se define como alteraciones de la tolerancia a la glucosa (IGT) a un grupo de personas que presentan un nivel de glucosa en sangre en ayunas inferior a 126 mg/dL y con un nivel de glucosa en sangre, 2 horas después de la sobrecarga, no inferior a 140 mg/dL pero inferior a 200 mg/dL; y ambos grupos IFG e IGT se definen como de tipo límite. Se define como diabetes mellitus a un grupo de personas que presentan un nivel de glucosa en sangre en ayunas no inferior a 126 mg/dL o con un nivel de glucosa en sangre, 2 horas después de la sobrecarga, no inferior a 200 mg/dL.
Las directrices de la Sociedad Japonesa de la Diabetes (Japan Diabetes Society) determinan que entre las personas definidas como NGT sobre la base exclusivamente del nivel de glucosa en sangre en ayunas y del nivel de glucosa en sangre 2 horas después de la sobrecarga, aquellas que presenten niveles de glucosa en sangre, 1 hora después de la sobrecarga, de 180 mg/dL o superiores, corren un mayor riesgo de desarrollar diabetes, de forma que deberían tratarse como casos de tipo límite.
El término "alteraciones de la tolerancia a la glucosa" o "intolerancia a la glucosa" se refiere a la afección marcada por un aumento del nivel de glucosa en sangre causado por una absorción insuficiente de la glucosa en sangre hacia los tejidos periféricos, tales como los músculos esqueléticos, el hígado y los adipocitos tras la entrada de la glucosa en la sangre a través de las comidas. Además, el término "alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa" se refiere a que el incremento es ligeramente superior al que se produce en las personas sanas.
La insulina es una hormona secretada por las células beta del páncreas que actúa en los músculos esqueléticos, en el hígado y en el tejido adiposo a fin de disminuir el nivel de glucosa en sangre. El término "defecto secretor de insulina" se refiere a la afección marcada por una secreción de insulina insuficiente para absorber una cantidad suficiente de la glucosa en sangre hacia los tejidos periféricos, tales como los músculos esqueléticos, el hígado y los adipocitos tras la entrada de la glucosa en la sangre a través de las comidas o de cualquier otro modo. Dentro del defecto secretor de insulina, la afección marcada por una secreción de insulina insuficiente para absorber una cantidad suficiente de la glucosa en sangre hacia los tejidos periféricos justo después de la entrada de la glucosa en la sangre se denomina "secreción precoz alterada de insulina". Según las directrices de la Sociedad Japonesa de la Diabetes, el término "secreción precoz alterada de insulina" se refiere a la afección en la que el índice insulinógeno I.I es inferior a 0,4. El índice insulinógeno I.I se define como \DeltaIRI (30-0)/\DeltaPG (30-0), fórmula en la que \DeltaIRI (30-0) se refiere a la diferencia entre los niveles de insulina en sangre 30 minutos después de la sobrecarga de glucosa y antes de la sobrecarga de glucosa; y \DeltaPG (30-0) se refiere a la diferencia entre los niveles de glucosa en sangre 30 minutos después de la sobrecarga de glucosa y antes de la sobrecarga de glucosa.
Las pruebas analíticas para evaluar los niveles de glucosa y los niveles de insulina en sangre son procedimientos invasivos que precisan la extracción de sangre más de una vez en un corto período, infligiendo un dolor considerable a los pacientes. Por consiguiente, se necesita una prueba analítica sencilla, menos invasiva, que pueda resolver estas desventajas, preferentemente una prueba analítica no invasiva.
Por otra parte, se ha considerado que la determinación cuantitativa de mioinositol en una muestra biológica resulta útil en el diagnóstico de la diabetes mellitus, habiéndose documentado los siguientes informes.
(a) En la diabetes mellitus, se observó un incremento en el nivel de mioinositol en orina [Larner J. et al., New Eng. J. Med., 323, 373-378 (1990)].
(b) No se encontraron diferencias entre los tipos NGT y límite con respecto al nivel de mioinositol en orina [Susumu Suzuki, Diabetes Care, Vol. 17, No. 12 (1994) 1465-1468].
(c) El tipo límite (IFG; IGT) y la diabetes mellitus mostraron un nivel de mioinositol en orina superior al correspondiente al tipo NGT (JP 2001-190299 A).
Los informes (a) y (b) anteriores muestran los resultados obtenidos determinando los niveles de mioinositol en orina mediante CG/EM. Sin embargo, los datos plantean problemas de reproducibilidad y fiabilidad, debido a su variación entre los distintos examinadores. Por otra parte, en el informe (c), los resultados resultan más precisos y fiables que los obtenidos mediante CG/EM, puesto que se han obtenido determinando el nivel de mioinositol en orina con un reactivo para el análisis de mioinositol de alta sensibilidad que utiliza una enzima. De este modo, ha sido posible realizar la detección del grupo con prediabetes.
No obstante, el reactivo para el análisis de mioinositol utilizado en el informe (c) plantea problemas, tales como: (i) un insuficiente nivel inferior de detección, debido al estrecho intervalo de medición y a la necesidad de diluir una muestra para la determinación de diversos niveles de mioinositol en orina; y (ii) una insuficiente capacidad para evitar los efectos de las sustancias coexistentes en la orina, en particular de la glucosa. Por consiguiente, no ha sido posible conseguir la detección de alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa y del defecto secretor de insulina, que caen dentro de la NGT.
Se ha indicado por Kouzuma y otros, Clinica Chimica Acta 312 (2001) 143-151, un método de ciclización enzimática para la determinación cuantitativa de mioinositol en muestras biológicas.
El documento EP 1 008 657 A2 da a conocer un método y un reactivo para la determinación cuantitativa de 1,5-anhidroglucitol.
Además, si se evalúa que un paciente tiene NGT basándose exclusivamente en los niveles en sangre antes de una sobrecarga oral de glucosa de 75 g y transcurridas 2 horas desde la sobrecarga de glucosa, tal juicio no refleja el cambio en el nivel en sangre de las 0 a las 2 horas. Por ejemplo, incluso las personas (con alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa y defecto secretor de insulina) que mantienen un nivel de glucosa en sangre más alto justo desde la sobrecarga de glucosa y que, por tanto, presentan una alta probabilidad de desarrollar diabetes o prediabetes a corto plazo, se clasifican prácticamente como NGT. Según se emplea en el presente documento, el término "alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa" se clasifica dentro del grupo NGT, pero se refiere a una ligera disminución en la tolerancia a la glucosa caracterizada por, según los resultados obtenidos tras una prueba de sobrecarga y la consiguiente toma de cuatro muestras de sangre en ayunas, a los 30 minutos, transcurrida 1 hora y transcurridas 2 horas desde la sobrecarga, (i) una oxihiperglucemia, es decir, niveles de glucosa en sangre muy elevados (180 mg/dL o superiores) transcurridos 30 minutos y 1 hora desde la sobrecarga, (ii) un nivel de glucosa en sangre superior al de las personas sanas transcurridas 2 horas desde la sobrecarga, aunque el nivel en sangre es inferior a 140 mg/dL (p.ej., no inferior a 120 mg/dL), (iii) un alto \SigmaPG (p.ej., 530 mg/dL o superior), es decir, el total de los niveles de glucosa en sangre justo antes de la sobrecarga oral de glucosa de 75 g y transcurridos 30, 60 y 120 minutos desde la sobrecarga de glucosa. Por consiguiente, no se puede esperar, a la vista de cuanto se da a conocer en los documentos públicos (a)-(c), que resulte posible identificar el grupo de personas que presenta una alta probabilidad de desarrollar diabetes o prediabetes a corto plazo, por ejemplo, las personas con alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa, mediante la determinación de los niveles de mioinositol.
En este sentido, la tecnología convencional no contempla ningún procedimiento para la detección de alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa y del defecto secretor de insulina en personas que mantienen un nivel de glucosa en sangre más alto justo después de la sobrecarga de glucosa y que, por tanto, presentan una alta probabilidad de desarrollar diabetes o prediabetes a corto plazo.
Características de la invención
La presente invención pretende dar a conocer un procedimiento analítico para la determinación sencilla de las alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa y/o del defecto secretor de insulina con buena reproducibilidad.
Para alcanzar este objetivo, los presentes inventores consideraron que la búsqueda de cualquier marcador para la determinación eficaz de las alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa y/o del defecto secretor de insulina resultaba ventajosa. Como resultado de esfuerzos concentrados, mientras que convencionalmente se considera que el mioinositol resulta útil para la detección de resistencia a la insulina y prediabetes (tipo límite y diabetes mellitus), los presentes inventores descubrieron inesperadamente que el mioinositol también representa un marcador útil para detectar de forma eficaz las alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa o el defecto secretor de insulina.
Como muestra se utilizan suero sanguíneo, plasma u orina procedentes del cuerpo humano, o un extracto homogeneizado de tejido vivo. Preferentemente se utiliza orina, dado que se puede obtener de forma no invasiva.
Los presentes inventores continuaron desarrollando una prueba analítica para la determinación cuantitativa con alta sensibilidad de mioinositol y una composición para la prueba analítica, a fin de conseguir una prueba analítica sencilla y económica para la determinación cuantitativa de mioinositol con alto grado de exactitud (JP 06-61278 B). Esta prueba analítica enzimática, que no precisa de ningún tratamiento preliminar, abrió por primera vez el camino hacia la obtención de datos fiables del mioinositol. Tal desarrollo de la prueba analítica para la determinación cuantitativa con alta sensibilidad y la composición para la determinación cuantitativa permitieron lograr el primer éxito al dar a conocer el procedimiento de la presente invención para el examen de alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa y/o del defecto secretor de insulina.
Además, tras la administración de una cantidad determinada de glucosa a un paciente, se obtuvieron muestras de orina del paciente de forma no invasiva en unos tiempos determinados y, posteriormente, se determinaron los niveles de mioinositol de las mismas mediante el reactivo para el análisis de mioinositol, según lo descrito anteriormente. La determinación reveló que no sólo las personas con prediabetes (de tipo límite, IFG, IGT) y las personas con diabetes mellitus, sino también las personas que prácticamente muestran alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa, a pesar de pertenecer al grupo NGT, así como las personas que prácticamente muestran una disminución de la secreción precoz de insulina, a pesar de pertenecer al grupo NGT, presentan niveles superiores a los valores característicos predeterminados de las personas sanas. Por consiguiente, se ha descubierto que el reactivo analítico de la presente invención permite no sólo la distinción entre NGT y no NGT con alteraciones avanzadas de la tolerancia a la glucosa (tipo límite, IFG, IGT, diabetes), sino también la distinción sencilla, con alta reproducibilidad y eficiente entre las personas que en la práctica muestran alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa, a pesar de pertenecer al grupo NGT, así como las personas que en la práctica muestran una disminución de la secreción precoz de insulina, a pesar de pertenecer al grupo NGT, y las personas sanas.
Además, la concentración de mioinositol presente en una muestra puede ser muy baja y algunas de las mioinositol deshidrogenasas utilizadas pueden reaccionar débilmente con la glucosa. Así pues, puede ser necesario eliminar la glucosa antes de la prueba. Entre los procedimientos para la eliminación de la glucosa se incluye uno que aprovecha la extremada estabilidad química del mioinositol y otro que modifica la glucosa con ayuda de una enzima como catalizador. Los procedimientos que aprovechan la estabilidad química incluyen, por ejemplo, uno consistente en calentar una muestra en presencia de HCl 6N de forma que se consiga la descomposición ácida de los azúcares, sin que se descomponga el mioinositol, y recuperar el mioinositol que queda en el producto descompuesto; y uno consistente en tratar una muestra con un agente reductor, tal como el borohidruro de sodio, a fin de reducir los azúcares con grupos carbonílicos o grupos formílicos, tales como la glucosa, excepto el mioinositol, y modificándolos para conseguir compuestos no reactivos con la mioinositol hidrogenasa, es decir, una enzima para el análisis cuantitativo del mioinositol. El procedimiento que modifica la glucosa con ayuda de una enzima como catalizador incluye uno que convierte la glucosa presente en una muestra en ácido glucónico por acción de la glucosa oxidasa (EC1,1,3,4) y uno que convierte la glucosa presente en una muestra en glucosa-6-fosfato por acción de la hexocinasa (EC2,7,1,1).
Se conocen varias mejoras a estos procedimientos de conversión. En relación con el procedimiento de conversión de la glucosa en ácido glucónico por acción de la glucosa oxidasa, por ejemplo, se conoce un procedimiento para eliminar el peróxido de hidrógeno producido mediante una catalasa tras la reacción con la glucosa oxidasa (JP 63-185397 A).
Además, en relación con el procedimiento de conversión de la glucosa en glucosa-6-fosfato por acción de la hexocinasa, se conocen procedimientos para convertir la glucosa en fructosa-1,6-bifosfato por acción de la fosfohexosa isomerasa y la 6-fosfofructocinasa a fin de evitar que la glucosa-6-fosfato se convierta nuevamente en glucosa mediante una reacción de equilibrio (JP 05-76397 A); para llevar a cabo la reacción con glucosa-6-fosfato deshidrogenasa en presencia de una coenzima oxidada (JP 01-320998 A, JP 03-27299 A); y para llevar a cabo la reacción con piruvato cinasa en presencia de difosfato de adenosina a fin de evitar el descenso de nivel de trifosfato de adenosina a medida que se elimina la glucosa, manteniendo de esta forma constante dicho nivel de trifosfato de adenosina (JP 02-104298 A).
No obstante, cuando se elimina la glucosa mediante hexocinasa, la reacción enzimática produce una gran cantidad de ADP en la solución de reacción, de forma que no se puede ignorar el efecto del mismo sobre la reacción enzimática. Así pues, es preferible convertir el ADP resultante en un compuesto que no afecte a la reacción.
Así pues, los presentes inventores han considerado un procedimiento eficaz que utiliza un agente eliminador de ADP cuya función consiste en convertir el ADP generado en la solución de reacción, como consecuencia de la reacción enzimática, en un compuesto que no afecte a la reacción.
Como agente eliminador de ADP se pueden utilizar cualesquiera enzimas capaces de convertir el ADP en un compuesto que no afecte a la reacción. Entre estas, son preferibles las enzimas que catalizan la conversión de ADP a AMP. Las cinasas también se denominan fosfocinasas o fosfotransferasas. Entre los ejemplos de las cinasas que catalizan la conversión de ADP a AMP se encuentran la pirofosfato-glicerol transferasa, la 6-fosofofructocinasa, la acetato cinasa y la ADP-hexocinasa.
Como resultado de profundas investigaciones, los presentes inventores han descubierto que la 6-fosofofructocinasa y la ADP-hexocinasa se utilizan preferentemente como agentes eliminadores de ADP en la presente invención.
Cuando se utiliza 6-fosofofructocinasa como agente eliminador de ADP en la reacción de eliminación de la glucosa presente en una muestra, se produce ADP junto con la conversión de glucosa en glucosa-6-fosfato utilizando ATP-hexocinasa en presencia de ATP y se hace reaccionar simultáneamente con 6-fosofofructocinasa de modo que se realice la conversión de ADP a AMP junto con la conversión de la fructosa-6-fosfato añadida previamente en fructosa-1,6-bifosfato.
Cuando se utiliza ADP-hexocinasa como agente eliminador de ADP en la reacción de eliminación de la glucosa presente en una muestra, se produce ADP junto con la conversión de glucosa en glucosa-6-fosfato utilizando ATP-hexocinasa en presencia de ATP, que se puede convertir en AMP.
Además, es preferible realizar dicha reacción en presencia de sales. Entre los ejemplos de las sales se incluyen: sales de magnesio, tales como cloruro de magnesio y acetato de magnesio; y sales de potasio, tales como cloruro de potasio y sulfato de potasio. La concentración de las sales utilizadas se encuentra, sin limitación, preferentemente entre aproximadamente 1 y 100 mM.
Cualquiera de estos compuestos producidos mediante la modificación enzimática no reaccionan con la mioinositol deshidrogenasa, una enzima para la determinación cuantitativa de mioinositol. Los presentes inventores han descubierto que resulta más preferible eliminar la glucosa previamente siguiendo estos procedimientos.
Además, los presentes inventores han descubierto que el mioinositol se puede determinar de forma más precisa cuando se utilizan simultáneamente dos tipos de cinasas, ATP-hexocinasa y ADP-hexocinasa, debido a que se reduce la influencia de los azúcares presentes en una muestra. Además, los presentes inventores han descubierto que el intervalo de determinación del mioinositol puede extenderse aproximadamente 10 veces ajustando el nivel de tio-NAD hasta una concentración final de 0,1 mM o, más preferentemente, entre 2 y 10 mM. Así pues, los presentes inventores han completado un sistema analítico altamente sensible.
El término "valor característico" se refiere a un valor determinado sobre la base de un promedio de los niveles de mioinositol en las muestras de orina de personas sanas seleccionadas entre el grupo de NGT; desviación típica; y curva de eficacia diagnóstica ROC (Response Operating Characteristic). Cuando se utilizan muestras de orina, el incremento en la excreción de mioinositol urinario entre antes de la sobrecarga de glucosa y en un momento predeterminado tras la sobrecarga de glucosa se encuentra comprendido en 0 y 20 \mug/mg de creatinina; o entre 5 y 15 \mug/mg creatinina; o, más preferentemente, entre 8 y 12 \mug/mg creatinina. Además, el valor característico puede cambiar si se realiza en el futuro un examen a gran escala y se lleva a cabo la determinación en personas sanas seleccionadas clínicamente. Asimismo, el valor característico puede cambiar dependiendo de la raza, sexo y edad de las poblaciones seleccionadas.
Breve descripción de los dibujos
En la figura 1 se muestran los resultados del estudio de los niveles de tio-NAD según el Ejemplo de referencia 1.
En la figura 2 se muestran los resultados de la prueba de estabilidad de los reactivos para el análisis de mioinositol según el Ejemplo de referencia 2.
En la figura 3 se muestran los efectos de la ADP-hexocinasa según el Ejemplo de referencia 3.
En la figura 4 se muestra la curva de calibración de los niveles de mioinositol según el Ejemplo de referencia 4.
En la figura 5 se muestra la relación entre el nivel de mioinositol y \SigmaPG según el Ejemplo de referencia 1.
En la figura 6 se muestra la relación entre el nivel de inositol y el índice insulinógeno según el Ejemplo de referencia 2.
En la figura 7 se muestra la relación entre cada grupo y \SigmaPG según el Ejemplo de referencia 3.
En la figura 8 se muestra la relación entre cada grupo y el índice insulinógeno según el Ejemplo de referencia 4.
En la figura 9 se muestra la relación entre cada grupo y el nivel de mioinositol según el Ejemplo de referencia 5.
En la figura 10 se muestra la relación entre cada grupo y el nivel de mioinositol según el Ejemplo de referencia 6.
En la figura 11 se muestra la correlación entre los niveles de mioinositol en orina en la prueba de tolerancia a la glucosa y en la prueba de tolerancia a los alimentos según el Ejemplo 7.
En la figura 12 se muestra la relación en cada grupo entre \Delta mioinositol en la prueba de tolerancia a la glucosa y \Delta mioinositol en la prueba de tolerancia a los alimentos según el Ejemplo 8.
En la figura 13 se muestra la relación en las personas con glucosa en orina negativa entre el nivel de mioinositol en orina en la prueba de tolerancia a los alimentos y las alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa según el Ejemplo 9.
Mejor forma de llevar a cabo la invención
A continuación se describirá de forma más detallada la presente invención y sus realizaciones preferentes.
Según la presente invención, la detección de alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa y del defecto secretor de insulina se lleva a cabo determinando las cantidades de mioinositol excretadas en la orina de un paciente antes de la sobrecarga de glucosa y en un momento predeterminado tras la sobrecarga de glucosa mediante el reactivo de la presente invención; y realizando una comparación de una cantidad creciente o una tasa creciente de mioinositol entre antes y después de la sobrecarga de glucosa, estando definido por adelantado el valor característico de las personas sanas.
La cantidad creciente se calcula como una diferencia entre el contenido de mioinositol en un momento predeterminado tras la sobrecarga de glucosa y el contenido de mioinositol antes de la sobrecarga de glucosa, y la tasa creciente se calcula como una relación entre el contenido de mioinositol en un momento predeterminado tras la sobrecarga de glucosa y el contenido de mioinositol antes de la sobrecarga de glucosa.
Para la concentración de mioinositol se puede utilizar un valor realmente determinado, o puede utilizarse un valor relativo con respecto a un índice estándar apropiado para compensar la dilución de la orina con agua potable. Preferentemente, el índice es un nivel de creatinina en orina. Los pacientes incluyen a todas las personas, además de todos aquellos de quienes se sospeche que puedan padecer enfermedades relacionadas con el estilo de vida, tales como la diabetes.
Puede utilizarse cualquier cantidad de sobrecarga de glucosa y cualquier tipo de método de sobrecarga de glucosa No obstante, es preferible la administración oral de una solución acuosa de 75 g de glucosa, como la que se utiliza en una prueba típica de sobrecarga de glucosa o durante una ingesta de alimentos.
Se pueden recoger muestras de orina antes de la sobrecarga de glucosa y en cualquier momento hasta transcurridas 6 horas desde la sobrecarga de glucosa, preferentemente entre 30 minutos y 3 horas después de la sobrecarga de glucosa. El período de recogida de orina se selecciona adecuadamente entre 30 minutos y 3 horas.
En los casos en los que se utiliza la orina como muestra, ésta se recoge mediante un procedimiento no invasivo, de forma que no hay necesidad de seleccionar un procedimiento, momento y lugar de muestreo. Por ejemplo, el paciente puede preparar fácilmente una muestra de ese tipo en su propia casa, en la oficina, en el colegio o en lugares similares, y la muestra de orina recogida se puede transportar directamente o en forma de un papel de filtro sumergido en orina o de cualquier otra forma adecuada, eliminándose de este modo la necesidad de acudir a instituciones médicas o similares. Así pues, la presente invención da a conocer un destacado procedimiento en el que, cuando se impregna un papel de filtro o similar con orina, la muestra entregada se extrae mediante un procedimiento adecuado y se utiliza en la sencilla y rápida prueba analítica de la presente invención, tras lo cual se remiten los resultados inmediatamente al paciente.
En particular, se pueden controlar los niveles de mioinositol en orina según resulte necesario, mientras que el paciente continúa con su vida cotidiana como de costumbre, sin sobrecarga de glucosa. Por ejemplo, es posible conocer el grado de alteración de la tolerancia a la glucosa o el grado de defecto secretor de insulina sirviéndose del nivel máximo de mioinositol o de la diferencia entre el nivel máximo de mioinositol y el nivel mínimo de mioinositol en un día. Además, el control de los niveles de mioinositol en orina, según resulte necesario, permite que el paciente reconsidere el contenido de su dieta y controle la cantidad de ejercicio necesario para prevenir la diabetes o su avance, al tiempo que disfruta de una vida normal.
Entre los procedimientos para el seguimiento de los niveles de mioinositol en orina se incluyen cualesquiera tipos de procedimientos capaces de detectar el mioinositol, por ejemplo, un procedimiento que utiliza un papel reactivo en el que está fijada una enzima que actúa sobre el mioinositol, y un procedimiento para la detección electroquímica del mioinositol con ayuda de un electrodo como detector, sobre el que está fijada una enzima que actúa sobre el mioinositol.
En el procedimiento del papel reactivo, por ejemplo, se genera peróxido de hidrógeno por acción de una oxidasa y se hace reaccionar con peroxidasa para generar oxígeno activo, y a continuación el oxígeno activo provoca la oxidación de un cromógeno para conseguir coloración, cuya intensidad se puede observar. Entre los cromógenos se pueden citar, sin limitación, el yoduro de potasio, la tetrametilbenzidina, la N-(3-sulfopropil)-3,3',5,5'-tetrametilbenzidina de sodio, la 4-aminoantipirina, y la O-tolidina.
Para la detección mediante un detector, por ejemplo, cuando se utiliza oxidasa, se puede medir directamente el peróxido de hidrógeno generado con ayuda de un electrodo; o se puede medir la corriente de oxidorreducción obtenida mediante un portador electrónico tal como un derivado de ferrocenos o un derivado de quinonas, o se puede medir la magnitud de la corriente eléctrica. De igual forma, cuando se utiliza deshidrogenasa, se puede medir directamente la coenzima reducida con ayuda de un electrodo; o se puede medir la corriente de oxidorreducción obtenida mediante un portador electrónico o la magnitud de la corriente eléctrica. En el documento "Biosensor and Quantitative Assay of Substrate Using the Same (Application No. JP 09-263492)" (Biosensor y análisis cuantitativo de sustratos utilizando el mismo (Solicitud nº JP 09-263492)) y similares se incluyen ejemplos.
Además, por ejemplo, se puede llevar a cabo el seguimiento diario de los niveles de mioinositol en orina de forma más sencilla incorporando el detector citado anteriormente directamente en un retrete o similares, o en un dispositivo unido al mismo. Un dispositivo de este tipo puede contar con funciones adicionales de memorización de las mediciones y de conexión con una terminal de un procesador de información. De este modo, aun cuando el paciente se encuentre en una ubicación lejana, un médico o una institución médica puede estar en contacto con el paciente a través de un medio eléctrico con el propósito de gestionar los datos vitales, prestar asesoramiento médico y examinar el grado de alteración de la tolerancia a la glucosa y el grado de defecto secretor de insulina, lo que se traducirá en una revisión del contenido de la dieta, en el control de la cantidad de ejercicio físico, en la mejora de la calidad de vida y en la prestación de tratamiento médico.
En el caso de que se realice la determinación cuantitativa de la glucosa y del mioinositol presentes en una muestra a fin de detectar alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa y/o defecto secretor de insulina, esta determinación cuantitativa del mioinositol se efectúa, preferentemente, mediante el procedimiento de la presente invención, mientras que la glucosa se puede determinar cuantitativamente con ayuda de cualesquiera procedimientos convencionales.
Además, se puede realizar una gestión más precisa combinando los resultados de la determinación con la observación practicada por un médico. Además, dado que es posible determinar el riesgo de desarrollar diabetes detectando el estado previo a la diabetes, es decir, la prediabetes, y también detectando a las personas con alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa o con defecto secretor de insulina que no se encuentran actualmente en el estadio prediabético, pero que presentan una alta probabilidad de desarrollar diabetes o prediabetes a corto plazo, aunque sea imposible conseguir dicho descubrimiento mediante un marcador convencional, por ejemplo, este riesgo puede servir como elemento de examen para seguros de vida, o similares.
Para determinar cuantitativamente el mioinositol presente en una muestra, se añaden entre 1 y 500 \muL de la muestra a la composición para la determinación cuantitativa de mioinositol de forma que se produzca una reacción a 37ºC y a continuación se pueden determinar de forma directa o indirecta las cantidades de una coenzima cambiadas durante varios minutos o varias decenas de minutos entre dos puntos de tiempo desde que comienza la reacción, por ejemplo 1 minuto entre 3 minutos y 4 minutos tras el comienzo de la reacción, o durante 5 minutos entre 3 minutos y 8 minutos. En este caso, el contenido de mioinositol presente en la muestra se puede determinar realizando una comparación con los cambios en la absorbancia que se miden para concentraciones conocidas de mioinositol.
La composición (reactivo) para la determinación cuantitativa debe contener, como mínimo, una enzima que actúe sobre el mioinositol y, preferentemente, contiene además una coenzima.
Además, se puede añadir al presente reactivo, según resulte apropiado, un tensioactivo tal como el éter octilfenílico de polioxietileno (OP-10).
Además, el presente reactivo se utiliza en forma de un producto líquido, de un producto liofilizado o de un producto congelado.
Para determinar cuantitativamente el mioinositol presente en una muestra, se puede utilizar cualquier tipo de procedimiento que se sirva de una enzima para determinar cuantitativamente el mioinositol. La enzima que se puede utilizar en la presente invención, que es capaz de determinar cuantitativamente el mioinositol, incluye cualquier enzima que actúe, como mínimo, sobre el mioinositol. No obstante, entre esas, es preferente la mioinositol deshidrogenasa, siendo la más preferente la mioinositol deshidrogenasa derivada de la especie Flavobacterium 671 (FERM BP-7323, abreviada en lo sucesivo como F.sp.671). Además, preferentemente, la mioinositol deshidrogenasa que se debe utilizar tiene una contaminación lo más baja posible, o inexistente, de sustancias que afecten negativamente a las coenzimas, tales como el tio-NAD y NADH presente en el reactivo, por ejemplo, sustancias cuya actividad descompone las coenzimas, tales como la NADH oxidasa.
La cepa F.sp.671 se encuentra depositada a nivel internacional con el número de depósito FERM BP-7323 (fecha de depósito: 12 de octubre de 2000) en el Instituto Nacional de Biociencias y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial, Ministerio de Comercio e Industria Internacional, ubicado en 1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japón (actualmente: Depositario del Organismo Internacional de Patentes, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, Agencia Administrativa Independiente, ubicado en el Centro 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japón).
Para la detección del mioinositol, se puede utilizar cualquier tipo de procedimiento capaz de detectar el mioinositol. Entre estos procedimientos se incluyen: un procedimiento que utiliza un reactivo de coloración bajo luz visible, por ejemplo, normalmente una coloración amarilla con tio-NAD, una coloración azul con azul de nitrotetrazolio (NBT), o coloración roja con cloruro de 2-(4-yodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-fenil-2H-tetrazolio (INT); un procedimiento de luminiscencia; un procedimiento de fluorescencia; un procedimiento que comprende la detección de un cambio eléctrico; y una combinación de estos procedimientos con técnicas de amplificación.
Además, utilizando un dispositivo compacto que pueda incorporar cualquiera de los procedimientos anteriores, se puede llevar a cabo la determinación del mioinositol en orina de forma no invasiva sin restricción de tiempo ni de lugar.
La prueba analítica para la determinación de la actividad de la mioinositol deshidrogenasa es la siguiente:
(1) Prueba analítica de actividad Composición de la solución de reacción
Tampón Tris 100 mM (pH 8,5)
Mioinositol 20 mM (Sigma Co., Ltd.)
Dinucleótido de nicotinamida y adenina 2 mM (NAD) (Oriental Yeast Co., Ltd.)
Diaforasa 5 U/mL (Asahi Kasei Corporation)
Azul de nitrotetrazolio al 0,025% (NBT; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
Triton-X100 al 1,5% (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
Se añade un mL de la anterior solución de reacción a un pequeño tubo de ensayo. Tras ello, se incuba la solución de reacción a 37ºC durante 5 minutos, se añaden a la misma 20 \mul de una solución enzimática diluida B veces y se mezcla para comenzar la reacción. Una vez que la reacción ha transcurrido exactamente durante 5 minutos, se añaden 2 mL de HCl 0,1 N y se mezcla para detener la reacción. Se mide la absorbancia a 550 nm a fin de obtener A1. Además, se utiliza la misma solución de reacción, sin el mioinositol, para llevar a cabo una medición similar y obtener la absorbancia A0. Se puede calcular la actividad enzimática a partir de la siguiente ecuación.
U/mL=[(A1-A0)/18,3] x [1/5] x [3,02/0,02] x B
Los números de la ecuación tienen los siguientes significados.
18,3:
Coeficiente de absorción molar del NTB
5:
Tiempo de reacción
3,02:
Volumen total de solución de reacción
0,02:
Volumen de solución enzimática
B:
Factor de dilución de la solución enzimática
Las propiedades de la mioinositol deshidrogenasa derivada de la cepa F.sp.671 son las siguientes:
(2) Acción enzimática
Esta enzima produce inososa y una coenzima reducida en presencia, como mínimo, de mioinositol y una coenzima. La coenzima incluye dinucleótidos de nicotinamida y adenina (abreviados en lo sucesivo como NADs) tales como dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD), dinucleótidos de nicotinamida y acetilpiridina (acetil-NAD), dinucleótidos de nicotinamida e hipoxantina (deamino-NAD), dinucleótido de adenina y piridina aldehído (aldehído-NAD), fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADP), dinucleótido de tionicotinamida y adenina (tio-NAD) y fosfato de dinucleótido de tionicotinamida y adenina (tio-NADP).
En la tabla 1 se muestra la relación entre las actividades relativas al utilizar cada coenzima (correspondiendo el 100% cuando se utiliza NAD como coenzima). Las actividades relativas se determinaron cambiando la coenzima según el siguiente procedimiento.
Prueba analítica de actividad relativa Composición de la solución de reacción
Tampón:
Tampón de glicina 100 mM (pH 10,0)
Sustrato:
Mioinositol 20 mM (Sigma Co., Ltd.)
Coenzima:
2 mM
\quad
(NAD, tio-NAD, NADP, tio-NADP; Oriental Yeast Co., Ltd.)
\newpage
Se añade un mL de la anterior solución de reacción a una cubeta de cuarzo. A continuación, la cubeta de cuarzo se introduce en un espectrofotómetro ajustado a una temperatura de 37ºC. La cubeta se incuba durante 5 minutos o más y a continuación se añade a la misma 20 \mul de una solución enzimática de aproximadamente 1,0 U/mL y se mezcla. La velocidad inicial se calcula en función de un cambio de absorbancia por minuto a una longitud de onda peculiar para cada coenzima reducida. La velocidad inicial obtenida con cada coenzima se compara con la velocidad inicial (100%) obtenida utilizando NAD como coenzima a fin de obtener la actividad relativa.
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TABLA 1 Relación de actividad relativa para cada coenzima utilizada
1 
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(3) Especificidad del sustrato
Según la prueba analítica de actividad relativa descrita anteriormente, la medición se llevó a cabo utilizando la misma concentración de D-quiroinositol, D-manosa, D-fructosa, D-galactosa, manitol, epiinositol o esciloinositol en lugar del sustrato en la solución de reacción. La tabla 2 recoge la actividad enzimática de cada sustrato, tomando la velocidad inicial de la reacción con el mioinositol como 100%. Se revela que la enzima derivada de la cepa F.sp.671 es deshidrogenasa con una alta especificidad para el mioinositol.
Entre los sustratos utilizados se incluyen D-manosa, D-fructosa, D-galactosa, manitol, D-quiroinositol (como antes: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), mioinositol, epiinositol y esciloinositol (como antes: Sigma Co., Ltd.).
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TABLA 2 Especificidad del sustrato
2 
\newpage
(4) pH óptimo
Tras la prueba analítica de actividad relativa descrita anteriormente, la medición se llevó a cabo utilizando tampón Tris 100 mM (pH 7,0-9,0) y tampón de glicina 100 mM (pH 9,0-11,0) en lugar de tampón de glicina 100 mM de pH 10,0 en la solución de reacción. La medición mostró que el pH óptimo era de aproximadamente 11,0 (sustrato: mioinositol).
(5) Peso molecular
Se utilizó el gel TSK G300SW (0,75 \Phi x 600 mm), eluyente: tampón de fosfato 50 mM (pH 7,5) + 0,2 M Na_{2}SO_{4} + 0,05% NaN_{3}, un juego de marcadores moleculares de Oriental Yeast Co., Ltd. (Japón) y un cromatógrafo fabricado por Shimadzu Corporation (Japón). Para la detección, se midieron la absorbancia con UV de 280 nm y se midió la actividad de cada fracción. Se utilizó mioinositol como sustrato en la medición de la actividad, revelando el peso molecular de 40.000 \pm 10.000.
(6) Estabilidad térmica
La enzima conservó prácticamente un 100% de actividad remanente tras un tratamiento a 40ºC durante 15 minutos. La solución enzimática de aproximadamente 5 U/mL se sometió a tratamiento térmico durante 15 minutos. La actividad remanente se midió siguiendo la prueba analítica de actividad enzimática descrita anteriormente. En la medición de la actividad, se utilizó mioinositol como sustrato.
(7) Valor Km
Siguiendo la prueba analítica de actividad relativa descrita anteriormente, se cambiaron la concentración de mioinositol y las concentraciones de NAD y de tio-NAD a fin de determinar los valores de Km respectivos. Siguiendo la prueba analítica de actividad descrita anteriormente, se cambió la concentración de sustrato a fin de calcular el valor de Km.
Valor Km para el sustrato
Mioinositol: 1,7 \pm 0,2 mM
Valor Km para la coenzima
NAD: 0,04 \pm 0,01 mM
Tio-NAD: 4,5 \pm 1 mM
Para realizar la determinación cuantitativa de mioinositol con mayor sensibilidad, se puede seguir el procedimiento de ciclación enzimática. En la siguiente ecuación se ilustra un ejemplo del procedimiento de ciclación enzimática.
3
En la ecuación, A1 representa NAD(P) o tio-NAD(P); A2 representa una forma reducida de A1; B1 representa NAD(P) reducido cuando A1 es tio-NAD(P) o tio-NAD(P) reducido cuando A1 es NAD(P); y B2 representa un producto oxidado de B1. Según se emplea en el presente documento, NAD(P) representa dinucleótido de nicotinamida y adenina y fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina.
Para la composición de la solución de la reacción cuantitativa de mioinositol utilizando la ciclación enzimática, se seleccionan apropiadamente dos o más coenzimas, en vista de los valores Km de las coenzimas respectivas de mioinositol deshidrogenasa, y similares, y posteriormente se ajusta el pH entre los valores de pH óptimos para la reacción directa/reacción inversa para conseguir un avance eficaz de la ciclación enzimática. Las cantidades de A1 y de B1 deben estar en exceso con respecto al contenido de mioinositol presente en una muestra y también en exceso con respecto a los valores de mioinositol deshidrogenasa para A1 y B1.
Al utilizar, por ejemplo, mioinositol deshidrogenasa derivada de F.sp.671, los valores de Km para NAD y tio-NAD son 0,04 mM y 4,5 mM, respectivamente. Para la reacción de ciclación, se pueden seleccionar tio-NAD y NADH como coenzimas. Las concentraciones de Al y B1 se encuentran, preferentemente, entre 0,02 mM y 2 M, de forma particularmente preferente entre 0,05 y 100 mM. La cantidad de mioinositol deshidrogenasa se encuentra, preferentemente, entre 1 y 1000 U/mL, de forma particularmente preferente entre 1 y 100 U/mL. Las cantidades se pueden seleccionar adecuadamente sobre la base del tipo y cantidad de la muestra de prueba, el contenido de mioinositol en la muestra que se va a analizar, y similares; pero también se admiten otras cantidades.
Cuando se utiliza hexocinasa como enzima para eliminar los azúcares presentes en una muestra, se puede optar por cualquier hexocinasa capaz de catalizar la reacción de glucosa a glucosa-6-fosfato, como, por ejemplo, la hexocinasa derivada de la especie Bacillus. La hexocinasa preferente es aquella que presente una excelente estabilidad térmica. La hexocinasa que presente una excelente estabilidad térmica se puede obtener con el procedimiento descrito en el documento "Stable Hexokinase and Production Method Thereof" (Hexocinasa estable y método de fabricación de la misma) (JP 2000-078982 A).
Dado que el ADP generado junto con la glucosa-6-fosfato presenta cierto efecto inhibidor sobre la reacción en el procedimiento de ciclación enzimática, los presentes inventores han utilizado de manera satisfactoria una hexocinasa dependiente de ADP simultáneamente con hexocinasa a fin de mejorar sustancialmente la eliminación de glucosa sin ninguna influencia sobre la reacción de la mioinositol deshidrogenasa.
Glc+ATP+Mg^{2+} ->G-6-P+ADP
Glc+ADP+Mg^{2+} ->G-6-P+AMP
ATP: 5'-trifosfato de adenosina
ADP: 5'-difosfato de adenosina
AMP: 5'-monofosfato de adenosina
La prueba analítica de la actividad de la hexocinasa se lleva a cabo del siguiente modo.
Composición de la solución de reacción
Tampón Tris 50 mM (pH 8,5) (Sigma Co., Ltd.)
Glucosa 20 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
ATP 4 mM (Oriental Yeast Co., Ltd.)
Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa 5 U/mL (Toyobo Co., Ltd.)
NADP 1 mM (Oriental Yeast Co., Ltd.)
Cloruro de magnesio 10 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
Solución para disolver y diluir la enzima: Tampón Tris 50 mM (pH 8, 5)
Se añade un mL de la solución de reacción anterior a una cubeta de cuarzo con una longitud de paso óptico de 1 cm, y se incuba a 37ºC durante 5 minutos. A continuación, se añaden a la cubeta 20 \muL de la solución enzimática, que está diluida B veces, y se mezcla para comenzar la reacción. La absorbancia a 340 nm se mide desde el inicio de la reacción a fin de obtener el cambio de absorbancia A1 por minuto, que muestra una reacción lineal. De igual forma, se realiza una prueba ciega en una reacción similar a fin de obtener el cambio de absorbancia A0 por minuto, con la excepción de que se añaden 50 \muL de la solución para disolver y diluir la enzima, en lugar de la solución enzimática. Se calcula la actividad enzimática a partir de la siguiente ecuación.
U/mL =[(A1-A0)/6,22] x [1,02/0,02] x B
Los números de la ecuación tienen los siguientes significados.
6,22:
Coeficiente de extinción milimolar del NADPH a 340 nm
1,02:
Volumen total de solución de reacción (mL)
0,02:
Volumen de solución enzimática utilizado en la reacción (mL)
B:
Factor de dilución de la solución enzimática
\newpage
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La prueba analítica de la actividad de la hexocinasa dependiente de ADP se lleva a cabo del siguiente modo.
Composición de la solución de reacción
Tampón Tris 50 mM (pH 7,5)
Solución de glucosa 20 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
Solución de ADP 2 mM (pH 7,0) (Oriental Yeast Co., Ltd.)
Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa 5 U/mL (Asahi Kasei Corporation)
Solución de NADP 1 mM (Oriental Yeast Co., Ltd.)
Solución de cloruro de magnesio 2 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
Solución para disolver y diluir la enzima: Tampón Tris 10 mM (pH 7, 5)
Se añaden tres mL de la anterior solución de reacción a un pequeño tubo de ensayo, y se incuba a 37ºC durante 5 minutos. A continuación, se añaden a la cubeta 50 \muL de la solución enzimática, que está diluida B veces, y se mezcla para comenzar la reacción. La absorbancia a 340 nm se mide desde el inicio de la reacción a fin de obtener el cambio de absorbancia A1 por minuto, que muestra una reacción lineal. De igual forma, se realiza una prueba ciega en una reacción similar a fin de obtener el cambio de absorbancia A0 por minuto, con la excepción de que se añaden 50 \muL de la solución para disolver y diluir la enzima, en lugar de la solución enzimática. Se calcula la actividad enzimática a partir de la siguiente ecuación.
U/mL =[(A1-A0)/6,22] x [3,05/0,05] x B
Los números de la ecuación tienen los siguientes significados.
6,22:
Coeficiente de extinción milimolar del NADPH a 340 nm
3,05:
Volumen total de solución de reacción (mL)
0,05:
Volumen de solución enzimática utilizado en la reacción (mL)
B:
Factor de dilución de la solución enzimática
La cantidad de hexocinasa se encuentra, preferentemente, entre 1 y 1.000 U/mL, de forma particularmente preferente entre 1 y 100 U/mL. La cantidad de hexocinasa dependiente de ADP se encuentra, preferentemente, entre 1 y 1.000 U/mL, de forma particularmente preferente entre 1 y 100 U/mL. Las cantidades se pueden seleccionar adecuadamente dependiendo del tipo y cantidad de la muestra de prueba, y también se pueden utilizar otras cantidades.
Además, para la determinación del mioinositol en orina en un amplio rango de su concentración con buena reproducibilidad, se debe realizar una reacción de ciclación enzimática de forma eficaz. Como resultado de un examen intensivo de las concentraciones y relación entre tio-NAD y NADH, dos coenzimas que se utilizan en la reacción de ciclación enzimática, Los presentes inventores han descubierto que el nivel de tio-NAD es preferentemente de 0,01 mM o más, de forma particularmente preferente entre 2 y 10 mM en una concentración final y la relación entre NADH/tio-NAD se encuentra, preferentemente, entre 0,01 y 0,5, de forma particularmente preferente entre 0,01 y 0,1. No obstante, las cantidades se pueden seleccionar adecuadamente dependiendo del tipo y cantidad de la muestra de prueba, y también se pueden aplicar otras cantidades.
Ejemplos
Los ejemplos de la presente invención y los ejemplos de referencia se describirán con detalle, pero la presente invención no se limita a ellos.
Ejemplo de referencia 1
Estudio de los niveles de tio-NAD 1) Reactivos R-1
MES 5 mM (ácido 2-morfolinoetanosulfónico) (pH 6,0)
Tio-NAD entre 0 y 40 mM (Oriental Yeast Co., Ltd.)
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R-2; Reactivo para la determinación cuantitativa del mioinositol
Bicina 200 mM (pH 9,0)
NADH 0,3 mM (Oriental Yeast Co., Ltd.)
Mioinositol deshidrogenasa 25 U/mL (Asahi Kasei Corporation)
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2) Método
El dispositivo de medición utilizado fue un Autoanalyzer 71705 (Hitachi Chemical Co., Ltd.). A 3 \muL de solución de mioinositol en concentraciones comprendidas entre 0 y 3.000 \muM, se añadieron 180 \muL del reactivo R-1 y se incubó a 37ºC durante 4,8 minutos, seguido de la adición de 180 \muL de reactivo R-2 para comenzar la reacción. Se midieron las absorbancias a 405 nm transcurridos 5,4 y 7,8 minutos desde el inicio de la reacción, y a continuación se calculó la diferencia entre ellas. Se calculó una tasa creciente de absorbancia por minuto (\DeltarABS/min) y seguidamente se investigó la sensibilidad con respecto a la solución estándar.
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3) Resultados
Los resultados se recogen en la figura 1. Según se muestra en la figura 1, utilizando tio-NAD a concentraciones finales de entre 0,1 y 10 mM, se observó la linealidad de la curva de calibración en el intervalo de concentraciones de mioinositol de entre 0 y 3.000 \mum. Además, se ha descubierto que la concentración final de tio-NAD se encuentra preferentemente entre 2 y 10 mM a fin de potenciar la sensibilidad de la detección de mioinositol.
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Ejemplo de referencia 2
Estudio sobre los tampones en los reactivos para la determinación cuantitativa del mioinositol 1) Reactivos R-1
MES 5 mM (pH 6,0)
Tio-NAD 5 mM (Oriental Yeast Co., Ltd.)
R-2; Reactivo para la determinación cuantitativa del mioinositol
Tampón 100 mM (pH 8,8)
NADH 0,5 mM (Oriental Yeast Co., Ltd.)
Mioinositol deshidrogenasa 10 U/mL (Asahi Kasei Corporation)
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2) Método
Los reactivos R-2 para la determinación cuantitativa del mioinositol se prepararon siguiendo la composición mostrada anteriormente, seleccionándose un tampón entre:
Tris (Tris(hidroximetil)aminometano),
Tricina (N-Tris(hidroximetil)metilglicina),
Bicina (N,N-bis(hidroxietil)glicina),
TAPS (ácido N-Tris(hidroximetil)metil-3-aminopropanosulfónico),
TEA (trietanolamina),
CHES (ácido 2-ciclohexilamino)etanosulfónico), y
AMPSO (ácido 3-((1,1-dimetil-2-hidroxietil)amino)-2-hidroxipropanosulfónico).
\newpage
El dispositivo de medición utilizado fue un Autoanalyzer 71705 (Hitachi Chemical Co., Ltd.). A 15 \muL de solución patrón 100-\muM de mioinositol preparada de antemano, se añadieron 180 \muL del reactivo R-1 y se incubó a 37ºC durante 4,8 minutos, seguido de la adición de 60 \muL de reactivo R-2 para comenzar la reacción. Se midieron las absorbancias a 405 nm transcurridos 5,4 y 7,8 minutos desde el inicio de la reacción, y a continuación se calculó la diferencia entre ellas. Se calculó una tasa creciente de absorbancia por minuto (\DeltamABS/min) y seguidamente se investigó la sensibilidad con respecto a la solución estándar. Se evaluó la estabilidad de cada reactivo R-2 mediante una prueba de aceleración en la que se almacenó sólo el reactivo R-2 en una incubadora a 30ºC durante 20 días, tras lo cual se llevó a cabo la misma prueba descrita anteriormente en el 7º, 12º y 20º días.
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3) Resultados
Los resultados se recogen en la figura 2. Los tampones que muestran una sensibilidad estable en comparación con la solución patrón fueron Tris, Tricina, Bicina y TEA; y el tampón con la sensibilidad más estable fue Bicina
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Ejemplo de referencia 3
Estudio sobre la ADP-hexocinasa 1) Reactivos R-1
MES 5 mM (pH 6,0)
MgCl_{2} 5 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
ATP 8 mM (Oriental Yeast Co., Ltd.)
Tio-NAD 10 mM (Oriental Yeast Co., Ltd.)
ATP-hexocinasa 10 U/mL (Asahi Kasei Corporation)
ADP-hexocinasa entre 0 y 4 U/mL (Asahi Kasei Corporation)
R-2; Reactivo para la determinación cuantitativa del mioinositol
Bicina 200 mM (pH 9,0)
NADH 0,3 mM (Oriental Yeast Co., Ltd.)
Mioinositol deshidrogenara 25 U/mL (Asahi Kasei Corporation)
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2) Método
El dispositivo de medición utilizado fue un Autoanalyzer 71705 (Hitachi Chemical Co., Ltd.). Se prepararon muestras mezclando 100 \muL de solución de mioinositol 2.000 \muM y 1 mL de solución de glucosa de entre 0 y 10 g/dL. A 3 \muL de cada muestra, se añadieron 180 \muL del reactivo R-1 y se incubó a 37ºC durante 4,8 minutos, seguido de la adición de 180 \muL de reactivo R-2 para comenzar la reacción. Se midieron las absorbancias a 405 nm transcurridos 5,4 y 7,8 minutos desde el inicio de la reacción, y a continuación se calculó la diferencia entre ellas. Se calculó una tasa creciente de absorbancia por minuto (\DeltamABS/min) y seguidamente se investigó la sensibilidad de las muestras respectivas.,
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3) Resultados
Los resultados se recogen en la figura 3. Tal y como resulta evidente en la figura 3, cuando se utiliza la ATP-hexocinasa sola, el aumento del nivel de glucosa, por ejemplo, hasta 10 g/dL, tiene influencia sobre la sensibilidad. Por el contrario, cuando se utiliza la ATP-hexocinasa junto con la ADP-hexocinasa, el aumento del nivel de glucosa no influye en la sensibilidad. Esto indica que la glucosa presente en una muestra se puede eliminar mediante la reacción simultánea con ATP-hexocinasa y ADP-hexocinasa y, por tanto, se puede determinar de forma más precisa el nivel de mioinositol.
\newpage
Ejemplo de referencia 4
Determinación cuantitativa del mioinositol con alta sensibilidad utilizando una enzima 1) Reactivos
Reactivo para el análisis del mioinositol
R-1; Reactivo de eliminación de la glucosa
MES 5 mM (pH 6,0)
NaN_{3} al 0,05% (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
OP-10 al 0,05% (Nippon Chemicals)
MgCl_{2} 5 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
ATP 8 mM (Oriental Yeast Co., Ltd.)
Tio-NAD 10 mM (Oriental Yeast Co., Ltd.)
ATP-hexocinasa 10 U/mL (Asahi Kasei Corporation)
ADP-hexocinasa 4 U/mL (Asahi Kasei Corporation)
R-2; Reactivo para la determinación cuantitativa del mioinositol
Bicina 200 mM (pH 9,0)
NaN_{3} al 0,05 ó (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
KHCO_{3} 40 mM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
NADH 0,3 mM (Oriental Yeast Co., Ltd.)
Mioinositol deshidrogenasa 25 U/mL (Asahi Kasei Corporation)
2) Método
El dispositivo de medición utilizado fue un Autoanalyzer 7170S (Hitachi Chemical Co., Ltd.). A 3 \muL de la solución de mioinositol preparada de antemano, se añadieron 180 \muL del reactivo de eliminación de la glucosa y se incubó a 37ºC durante 4,8 minutos para la reacción de eliminación de la glucosa, y seguidamente se añadieron a la misma 180 \muL del reactivo para la determinación cuantitativa del mioinositol a fin de comenzar la reacción. Se midieron las absorbancias a 405 nm transcurridos 5,4 y 7,8 minutos desde el inicio de la reacción, y a continuación se calculó la diferencia entre ellas. Se calculó una tasa creciente de absorbancia por minuto (\DeltamABS/min).
3) Resultados
Los resultados se recogen en la figura 4. Según se muestra en la figura 4, el presente reactivo analítico permitió realizar la determinación cuantitativa del mioinositol de una forma sencilla. El intervalo de medición del mioinositol fue de 0 a 2,000 \muM y el límite inferior de detección fue de 10 \muM cuando el límite inferior de detección se definió como la concentración mínima, que no se superpone con "la media de \DeltamABS/min + 2 x desviación típica" obtenida mediante múltiples mediciones de mioinositol 0 mM.
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Ejemplo 1 Detección de alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa mediante la determinación del mioinositol en orina 1) Pacientes
Ciento doce pacientes participaron en la prueba estándar de sobrecarga oral de 75 g de glucosa. Se extrajeron muestras de sangre justo antes de la sobrecarga de glucosa y transcurridos 30, 60, 120 y 180 minutos después de la sobrecarga de glucosa a fin de determinar los niveles de glucosa y de insulina en sangre. Simultáneamente, se recogieron muestras de orina justo antes de la sobrecarga de glucosa y transcurridos 60, 120 y 180 minutos desde la sobrecarga de glucosa a fin de determinar los niveles de mioinositol, glucosa en orina y creatinina.
2) Reactivos y pruebas analíticas
Glucosa en sangre: Procedimiento con electrodos (Kyoto Daiichi Kagaku Corporation: GA-1160)
Insulina: Procedimiento con anticuerpo RIA2
Reactivo para el análisis del mioinositol: el mismo del ejemplo 4
Glucosa en orina: Procedimiento con electrodos (Kyoto Daiichi Kagaku Corporation: GA-1160)
Creatinina: Prueba Creatinina-AH de Wako (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
3) Procedimiento
Como índice de tolerancia a la glucosa se utilizó \SigmaPG, el total de los niveles de glucosa en sangre justo antes de la sobrecarga oral de 75 g de glucosa, y transcurridos 30, 60 y 120 minutos desde la sobrecarga de glucosa. Se determinó el nivel de mioinositol y el nivel de creatinina en las muestras de orina respectivas justo antes de la sobrecarga oral de 75 g de glucosa y transcurridos 30, 60 y 120 minutos desde la sobrecarga de glucosa a fin de calcular la relación entre la cantidad de mioinositol y la cantidad de creatinina excretada en la orina (mioinositol/creatinina). Además, se utilizó la \Delta del contenido de mioinositol [(contenido de mioinositol a los 60 min - contenido de mioinositol antes de la sobrecarga)/2] + [(contenido de mioinositol a los 120 min - contenido de mioinositol antes de la sobrecarga)/2] como índice del nivel de mioinositol entre antes y después de la sobrecarga de glucosa. Se investigó la relación entre \SigmaPG y la \Delta del contenido de mioinositol.
4) Resultados
Los resultados se recogen en la tabla 3 y en la figura 5. Según se muestra en la figura 5, \SigmaPG y \Delta del contenido de mioinositol mostraron una muy buena correlación. Un mayor \SigmaPG indica que los niveles de glucosa en sangre se mantienen altos tras la sobrecarga de glucosa y, por tanto, la presencia de alteraciones de la tolerancia a la glucosa. Además, por ejemplo, si el valor característico de la \Deltamioinositol está fijado en 10 \mug/mg Cre (creatinina), es posible realizar una detección eficaz en los casos que presenten alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa con un nivel \SigmaPG de aproximadamente 530 mg/dL.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 3
4
TABLA 3 (continuación)
5
TABLA 3 (continuación)
6 
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Ejemplo 2 Detección de la secreción precoz alterada de insulina mediante la determinación del mioinositol en orina 1) Pacientes
Los mismos del ejemplo 1.
2) Reactivos y pruebas analíticas
Los mismos del ejemplo 1.
3) Procedimiento
Se determinaron los niveles de mioinositol y los niveles de creatinina en cada muestra de orina justo antes de la sobrecarga oral de 75 g de glucosa y transcurridos 60 y 120 minutos desde la sobrecarga de glucosa, y a continuación se obtuvo la relación entre la cantidad de mioinositol y la cantidad de creatinina excretada en la orina (mioinositol/creatinina). Además, se utilizó la \Delta del contenido de mioinositol [(contenido de mioinositol a los 60 min - contenido de mioinositol antes de la sobrecarga)/2] + [(contenido de mioinositol a los 120 min - contenido de mioinositol antes de la sobrecarga)/2] como índice del nivel de mioinositol entre antes y después de la sobrecarga de glucosa. Se investigó la relación entre el índice insulinógeno (I.I) y la \Delta del contenido de mioinositol.
4) Resultados
Los resultados se recogen en la figura 6. Según se muestra en la figura 6, se calculó la relación entre el índice insulinógeno y la \Delta del contenido de mioinositol. En un gran porcentaje de los casos en los que la \Delta del contenido de mioinositol fue de 15 \mum/mg Cre o superior, el índice insulinógeno resultó ser inferior a 0,4. Según las directrices de la Sociedad Japonesa de la Diabetes, un índice insulinógeno inferior a 0,4 puede indicar la presencia de secreción precoz alterada de insulina. Según resulta evidente en vistas de la figura 6, si el valor característico de la \Deltamioinositol es de 15 \mug/mg Cre, se puede realizar una detección eficaz en los casos en los que el índice insulinógeno sea inferior a 0,4, o que presenten una secreción precoz alterada de insulina.
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Ejemplo 3 Detección de alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa mediante la determinación del mioinositol en orina y de la glucosa en orina 1) Pacientes
Los mismos del ejemplo 1.
2) Reactivos y pruebas analíticas
Los mismos del ejemplo 1.
3) Procedimiento
Se determinaron los niveles de mioinositol y los niveles de creatinina en cada muestra de orina justo antes de la sobrecarga oral de 75 g de glucosa y transcurridos 60 y 120 minutos desde la sobrecarga de glucosa. A continuación, se obtuvo la relación entre la cantidad de mioinositol y la cantidad de creatinina excretada en la orina (mioinositol/creatinina). Al mismo tiempo, también se obtuvieron los niveles de glucosa en orina. Se utilizó la \Delta del contenido de mioinositol [(contenido de mioinositol a los 60 min - contenido de mioinositol antes de la sobrecarga)/2] + [(contenido de mioinositol a los 120 min - contenido de mioinositol antes de la sobrecarga)/2] como índice del nivel de mioinositol entre antes y después de la sobrecarga de glucosa.
4) Resultados
El caso que presentó un \Delta del contenido de mioinositol de 10 \mug/mg Cre o superior se marcó con un signo más (+), mientras que el resto de casos se marcaron con un signo menos (-). Del mismo modo, en el caso de la glucosa en orina, el caso que presentó un nivel de glucosa en orina de 50 mg/dL o superior transcurridas 2 horas desde la sobrecarga de glucosa se marcó con un "+", mientras que el resto de casos se marcaron con un "-". Se utilizaron los valores de \SigmaPG calculados en el ejemplo 5.
De los 112 pacientes analizados, 52 pacientes se encontraron en el grupo \Deltamioinositol (-) y glucosa en orina (-), 12 pacientes se encontraron en el grupo \Deltamioinositol (+) y glucosa en orina (-), y 48 pacientes se encontraron en el grupo \Deltamioinositol (+) y glucosa en orina (+). Ningún paciente se incluyó en el grupo \Deltamioinositol (-) y glucosa en orina (+). Se compararon entre sí los valores \SigmaPG respectivos del grupo \Deltamioinositol (-) y glucosa en orina (-), del grupo \Deltamioinositol (+) y glucosa en orina (-), y del grupo \Deltamioinositol (+) y glucosa en orina (+).
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Los resultados se recogen en la figura 7. Según se muestra en la figura 7, la media y la desviación típica de los valores de \SigmaPG del grupo \Deltamioinositol (-) y glucosa en orina (-) fueron 453 mg/dL y 76.6 mg/dL, respectivamente. La media y la desviación típica de los valores de \SigmaPG del grupo \Deltamioinositol (+) y glucosa en orina (-) fueron 556 mg/dL y 81,1 mg/dL, respectivamente. La media y la desviación típica de los valores de \SigmaPG del grupo \Deltamioinositol (+) y glucosa en orina (+) fueron 791 mg/dL y 164,8 mg/dL, respectivamente. Además, comparado con el valor \SigmaPG del grupo \Deltamioinositol (-) y glucosa en orina (-), el valor \SigmaPG del grupo \Deltamioinositol (+) y glucosa en orina (-) resultó significativamente más alto, y también el valor \SigmaPG del grupo \Deltamioinositol (+) y glucosa en orina (+) resultó significativamente mucho más alto. Todo esto muestra que el grado de alteración de la tolerancia a la glucosa se podría determinar de forma no invasiva obteniendo conjuntamente el mioinositol en orina y la glucosa en orina.
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Ejemplo 4 Detección de la secreción precoz alterada de insulina mediante la determinación del mioinositol en orina y la glucosa en orina 1) Pacientes
Los mismos del ejemplo 1.
2) Reactivos y pruebas analíticas
Los mismos del ejemplo 1.
3) Procedimiento
El mismo del ejemplo 3
4) Resultados
El caso que presentó un \Delta del contenido de mioinositol de 10 \mug/mg Cre o superior se marcó con un signo más (+), mientras que el resto de casos se marcaron con un signo menos (-). Del mismo modo, en el caso de la glucosa en orina, el caso que presentó un nivel de glucosa en orina de 50 mg/dL o superior transcurridas 2 horas desde la sobrecarga de glucosa se marcó con un "+", mientras que el resto de casos se marcaron con un "-". Se utilizaron los valores del índice insulinógeno calculados en el ejemplo 2.
Se compararon entre sí los valores del índice insulinógeno respectivos (\DeltaIRI 30-0/\DeltaPG 30-0) del grupo
\Deltamioinositol (-) y glucosa en orina (-), del grupo \Deltamioinositol (+) y glucosa en orina (-), y del grupo \Deltamioinositol (+) y glucosa en orina (+).
Los resultados se recogen en la figura 8. Según se muestra en la figura 8, la media y la desviación típica de \DeltaIRI 30-0/\DeltaPG 30-0 del grupo \Deltamioinositol (-) y glucosa en orina (-) fueron 1,32 y 0,79, respectivamente. La media y la desviación típica de \DeltaIRI 30-0/\DeltaPG 30-0 del grupo \Deltamioinositol (+) y glucosa en orina (-) fueron 0,45 y 0,42, respectivamente. La media y la desviación típica de \DeltaIRI 30-0/\DeltaPG 30-0 del grupo \Deltamioinositol (+) y glucosa en orina (+) fueron 0,16 y 0,19, respectivamente. Además, comparado con el valor 4IRI 30-0/\DeltaPG 30-0 del grupo \Deltamioinositol (-) y glucosa en orina (-), el valor \DeltaIRI 30-0/\DeltaPG 30-0 del grupo \Deltamioinositol (+) y glucosa en orina (-) resultó significativamente más bajo, y también el valor \DeltaIRI 30-0/\DeltaPG 30-0 del grupo \Deltamioinositol (+) y glucosa en orina (+) resultó significativamente mucho más bajo. Todo esto muestra que el grado de secreción precoz alterada de insulina se podría determinar de forma no invasiva obteniendo conjuntamente el mioinositol en orina y la glucosa en orina.
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Ejemplo 5 Detección de alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa mediante la determinación del mioinositol en orina 1) Pacientes
De los mostrados en el ejemplo 1, 59 pacientes evaluados como NGT que presentaron un nivel de glucosa en sangre en ayunas inferior a 110 mg/dL y el nivel de glucosa dos horas después de la sobrecarga inferior a 140 mg/dL.
2) Reactivos y pruebas analíticas
Los mismos del ejemplo 1.
3) Procedimiento
De los pacientes evaluados como NGT, se denominan grupo B a aquéllos que presentaron el nivel de glucosa una hora después de la sobrecarga de 180 mg/dL o superior o el nivel de glucosa dos horas después de la sobrecarga de 120 mg/dL o superior, mientras que los casos que mostraron una tolerancia a la glucosa ligeramente reducida (alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa) junto con todos los demás se denominaron grupo A. De los cincuenta y nueve pacientes del grupo NGT, 45 pacientes pertenecieron al grupo A y 14 pacientes pertenecieron al grupo B. Se obtuvo la relación entre la cantidad de mioinositol y la cantidad de creatinina excretada en la orina (mioinositol/creatinina) en los grupos A o B determinando los niveles de mioinositol y los niveles de creatinina en cada muestra de orina justo antes de la sobrecarga oral de 75 g de glucosa y transcurridos 60 y 120 minutos desde la sobrecarga de glucosa.
Además, se utilizó la \Delta del contenido de mioinositol [(contenido de mioinositol a los 60 min - contenido de mioinositol antes de la sobrecarga)/2] + [(contenido de mioinositol a los 120 min - contenido de mioinositol antes de la sobrecarga)/2] como índice del nivel de mioinositol entre antes y después de la sobrecarga de glucosa.
4) Resultados
Los resultados se recogen en la figura 9. Según se muestra en la figura 9, la media de la \Delta del contenido de mioinositol del grupo A fue de 3,9 \mug/mg Cre, mientras que la media de la \Delta del contenido de mioinositol del grupo B fue de 25,8 \mug/mg Cre. En comparación con el grupo A, el grupo B (alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa) con una tolerancia a la glucosa ligeramente reducida presentó una mayor \Delta del contenido de mioinositol.
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Ejemplo 6 Detección del defecto secretor de insulina mediante la determinación del mioinositol en orina 1) Pacientes
Los mismos del ejemplo 1.
2) Reactivos y pruebas analíticas
Los mismos del ejemplo 1.
3) Procedimiento
De los pacientes evaluados como NGT, se incluyen en el grupo B aquéllos con un índice insulinógeno inferior a 0,4, mientras que el resto de los pacientes se incluyen en el grupo A. De los cincuenta y nueve pacientes del grupo NGT, 37 pacientes pertenecieron al grupo A y 22 pacientes pertenecieron al grupo B. Se obtuvo la relación entre la cantidad de mioinositol y la cantidad de creatinina excretada en la orina (mioinositol/creatinina) en los grupos A o B determinando los niveles de mioinositol y los niveles de creatinina en cada muestra de orina justo antes de la sobrecarga oral de 75 g de glucosa y transcurridos 60 y 120 minutos desde la sobrecarga de glucosa.
Además, se utilizó la \Delta del contenido de mioinositol [(contenido de mioinositol a los 60 min - contenido de mioinositol antes de la sobrecarga)/2] + [(contenido de mioinositol a los 120 min - contenido de mioinositol antes de la sobrecarga)/2] como índice del nivel de mioinositol entre antes y después de la sobrecarga de glucosa.
4) Resultados
Los resultados se recogen en la figura 10. Según se muestra en la figura 10, la media de la \Delta del contenido de mioinositol del grupo A fue de 4,4 \mug/mg Cre, mientras que la media de la \Delta del contenido de mioinositol del grupo B fue de 16, 9 \mug/mg Cre. En comparación con el grupo A, el grupo B con secreción precoz alterada de insulina presentó una mayor \Delta del contenido de mioinositol.
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Ejemplo 7 Relación entre el mioinositol en orina en la prueba de sobrecarga de glucosa y el mioinositol en orina en la prueba de sobrecarga de alimentos 1) Pacientes
De los mostrados en el Ejemplo 1, 52 pacientes que accedieron a someterse a la prueba de sobrecarga de alimentos, que incluyeron 22 pacientes NGT (grupo C), 14 pacientes de tipo límite (grupo B) y 16 pacientes de diabetes mellitus (grupo D). Se extrajeron muestras de sangre antes de la ingesta de alimentos y transcurridos 120 minutos desde la ingesta, y se determinó el nivel de glucosa en sangre y el nivel de insulina. Además, se recogieron muestras de orina antes de la ingesta de alimentos y transcurridos 120 minutos desde la ingesta, y a continuación se determinó el nivel de mioinositol, el nivel de glucosa en orina y el nivel de creatinina.
2) Reactivos y pruebas analíticas
Los mismos del ejemplo 1.
3) Procedimiento
Tras la recogida de las muestras de sangre y de orina en ayunas, los pacientes ingirieron una comida. La comida estaba formada por alimentos cocinados en envases flexibles esterilizables (Wellness Menus (Nichirei Corporation) y arroz hervido envasado (Sato Foods Industries, Co., Ltd.)) con un contenido de 91,6 g de hidratos de carbono, 31,0 g de proteínas, 13,9 g de grasas y 1,1 g de sodio con un aporte energético de 662 kcal. Transcurridos 120 minutos desde la comida, se recogieron muestras de sangre y muestras de orina. Se obtuvo la relación entre la cantidad de mioinositol y la cantidad de creatinina excretada en la orina (mioinositol/creatinina) determinando el nivel de mioinositol y el nivel de creatinina en cada muestra de orina. Además, se utilizó la \Delta del contenido de mioinositol [(contenido de mioinositol a los 120 min - contenido de mioinositol antes de la sobrecarga)] como índice del contenido de mioinositol entre antes y después de la comida.
4) Resultados
La figura 11 muestra la relación entre la \Deltamioinositol (eje X) en la prueba de sobrecarga de glucosa y la \Delta mioinositol (eje Y) en la prueba de sobrecarga de alimentos. Según se muestra en la figura 11, la \Deltamioinositol en la prueba de sobrecarga de glucosa y la \Deltamioinositol en la prueba de sobrecarga de alimentos presentaron una muy buena correlación (Y=1,044X-2,0, r=0,83, P<0,0001) y tomaron prácticamente los mismos valores. Estos resultados revelan que las alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa o el defecto secretor de insulina se pueden detectar determinando los niveles de mioinositol en orina antes de una ingesta de alimentos, aun cuando no se realice una prueba de sobrecarga de glucosa.
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Ejemplo 8 Relación entre el mioinositol en orina en la prueba de sobrecarga de glucosa y el mioinositol en orina en la prueba de sobrecarga de alimentos 1) Pacientes
Los mismos del ejemplo 7.
2) Reactivos y pruebas analíticas
Los mismos del ejemplo 1.
3) Procedimiento
El mismo del ejemplo 7
4) Resultados
La figura 12 muestra la relación entre la \Deltamioinositol en la prueba de sobrecarga de glucosa y la \Delta mioinositol en la prueba de sobrecarga de alimentos para cada grupo. Según se muestra en la figura 12, la \Deltamioinositol en la prueba de sobrecarga de glucosa y la \Deltamioinositol en la prueba de sobrecarga de alimentos resultaron muy coherentes entre sí para cada grupo. Estos resultados revelan que las alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa y el defecto secretor de insulina se pueden detectar determinando los niveles de mioinositol en orina antes y después de una ingesta de alimentos, aun cuando no se realice una prueba de sobrecarga de glucosa.
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Ejemplo 9 Relación entre el mioinositol en orina en la prueba de sobrecarga de alimentos y las alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa en personas con glucosa en orina negativa 1) Pacientes
De los mostrados en el ejemplo 7, 32 personas que presentaron glucosa en orina negativa (inferior a 50 mg/dL) 2 horas después de la comida.
2) Reactivos y pruebas analíticas
Los mismos del ejemplo 1.
3) Procedimiento
El mismo del ejemplo 7, con la excepción de que las personas con una \Deltamioinositol de 7 \mug/mg Cre o superior en la prueba de sobrecarga de alimentos se incluyeron en el grupo (+), mientras que el resto se incluyó en el grupo (-).
4) Resultados
Los resultados se recogen en la figura 13. Según se muestra en la figura 13, incluso en el caso de las personas con glucosa en orina negativa 2 horas después de la comida, muchas de las personas del grupo \Deltamioinositol (+) presentaron mayores \SigmaPG en la prueba de sobrecarga de glucosa, en comparación con las pertenecientes al grupo \Deltamioinositol (-). Estos resultados revelan que, incluso en el caso de las personas con glucosa en orina negativa 2 horas después de la comida, el grado de alteración de la tolerancia a la glucosa se puede determinar de forma no invasiva mediante la determinación de los niveles de mioinositol en orina antes y después de una ingesta de alimentos.
Aplicabilidad industrial
Según lo descrito anteriormente, la presente invención da a conocer un procedimiento para la detección de alteraciones ligeras de la tolerancia a la glucosa y/o de la secreción precoz alterada de insulina de una forma no invasiva y cómoda con una buena reproducibilidad.
Referencia a materiales biológicos depositados
(1) (a) Nombre y dirección de la organización depositaria, en la que se han depositado los presentes materiales biológicos:
Nombre: Depositario del Organismo Internacional de Patentes, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada;
Dirección: Centro 6 Tsukuba, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japón;
(b) Fecha de depósito en la organización citada en (a): 12 de octubre de 2000 (fecha del depósito original);
(c) Número de depósito para el depósito otorgado por la organización citada en (a): FERM BP-7323.

Claims (9)

1. Método para la eliminación de glucosa en una muestra, caracterizado porque se utilizan simultáneamente ATP-hexocinasa y ADP-hexocinasa para la reacción de eliminación de glucosa en la muestra.
2. Método para la determinación cuantitativa del nivel de mioinositol en una muestra utilizando enzimáticamente mioinositol dehidrogenasa en presencia de tio-NAD y NADH, caracterizado porque se utilizan en combinación dos tipos de cinasas, de manera que dichos dos tipos de cinasas son ATP-hexocinasa y un agente eliminador de ADP.
3. Método para la determinación cuantitativa del nivel de mioinositol, según la reivindicación 2, en el que el agente eliminador de ADP es ADP-hexocinasa.
4. Compuesto para la determinación cuantitativa de mioinositol, caracterizado porque el compuesto comprende como mínimo:
1)
tio-NAD;
2)
NADH;
3)
mioinositol dehidrogenasa;
4)
dos tipos de cinasas, de manera que dichos dos tipos de cinasas son ATP-hexocinasa y un agente eliminador de ADP.
5. Compuesto para la determinación cuantitativa de mioinositol, según la reivindicación 4, en el que el agente eliminador de ADP es ADP-hexocinasa.
6. Compuesto para la determinación cuantitativa de mioinositol, según las reivindicaciones 4 ó 5, caracterizado porque el compuesto comprende además un tampón seleccionado entre:
Bicina(N,N-Bis(hidroxietil)glicina),
Tris(Tris(hidroximetil)aminometano); TEA(Trietanolamina), y
Tricina(N-Tris(hidroximetil)-metilglicina).
7. Compuesto para la determinación cuantitativa de mioinositol, según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque la concentración final de tio-NAD es de 0,1mM o más.
8. Compuesto para la determinación cuantitativa de mioinositol, caracterizado porque la concentración final de tio-NAD es de 2 a 10 mM.
9. Método para la eliminación de la glucosa de una muestra, que comprende como mínimo las siguientes fases:
hacer reaccionar ATP con glucosa de la muestra para convertirlas en ADP y glucosa-6-fosfato; y
hacer reaccionar el ADP obtenido de este modo con glucosa de la muestra para convertirlas en AMP y glucosa-6-fosfato.
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