ES2374429T3 - Citoquinas de mamífero relacionadas con interleuquina 17. polinucleótidos que las codifican. usos. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo que se une al polipéptido maduro comprendido en la SEC ID Nº 14.

Description

Citoquinas de mamífero relacionadas con interleuquina 17. Polinucleótidos que las codifican. Usos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones relacionadas con proteínas que funcionan en el control de la fisiología, desarrollo y diferenciación de células de mamífero, por ejemplo células del sistema inmunológico de un mamífero. En particular, proporciona anticuerpos que regulan la fisiología, desarrollo, diferenciación celular o la función de varios tipos de células, incluidas las células hematopoyéticas.

Antecedentes de la invención

El sistema inmunológico de los vertebrados consiste en una serie de órganos y varios tipos de células diferentes. Dos tipos de células principales incluyen los linajes mieloide y linfoide. Entre las de linaje de células linfoides están las células B, que inicialmente se caracterizaron como que se diferenciaban en el hígado fetal o la médula ósea de adultos, y las células T, que inicialmente se caracterizaron como que se diferenciaban en el timo. Véase, por ejemplo, Paul (ed. 1998) Fundamental Immunology (4ª ed.) Raven Press, New York.

En muchos aspectos del desarrollo de una respuesta inmunitaria o diferenciación celular, las proteínas solubles conocidas como citoquinas desempeñan un papel crucial en la regulación de las interacciones celulares. Aparentemente, estas citoquinas median en las actividades celulares de muchos modos. En muchos casos se ha demostrado que modulan la proliferación, el crecimiento y la diferenciación de las células madre hematopoyéticas en el gran número de progenitores que componen los linajes responsables de una respuesta inmunitaria.

No obstante, las moléculas celulares que se expresan en diferentes estadios de las células de estas vías de maduración siguen sin estar completamente identificadas. Además, los papeles y mecanismos de acción de las moléculas de señalización que inducen, sostienen o modular los diversos estados fisiológicos, del desarrollo o proliferativos de estas células no se entienden del todo. Claramente, el sistema inmunológico y su respuesta a varias tensiones ha sido relevante para la medicina, por ejemplo enfermedades infecciosas, respuestas y tratamiento relacionados con el cáncer, respuestas alérgicas y de rechazo a transplantes. Véase, por ejemplo, Thorn, y col. Harrison’s Principles of Internal Medicine McGraw/Hill, New York.

La ciencia médica depende, en gran medida, del reclutamiento o supresión adecuados del sistema inmunológico al efectuar curas para respuestas fisiológicas insuficientes o inadecuadas a factores ambientales. No obstante, la falta de conocimientos sobre cómo se regula o se diferencia el sistema inmunológico ha bloqueado la capacidad para modular de forma ventajosa los mecanismos de defensa normales a los retos biológicos. Por tanto, las afecciones médicas que se caracterizan por una regulación anormal o inadecuada del desarrollo de la fisiología de células relevantes siguen sin poder tratarse. El descubrimiento y caracterización de citoquinas específicas contribuirán al desarrollo de terapias para una amplia gama de afecciones degenerativas o de otro tipo que afectan al sistema inmunológico, las células hematopoyéticas, así como otros tipos de células. La presente invención proporciona soluciones a algunos de estos problemas y a muchos otros.

Sumario de la invención

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de clones de ADNc que codifican varias proteínas de tipo citoquina que exhiben una similitud de secuencia significativa con la citoquina denominada CTLA-8.

La invención abarca anticuerpos. También se proporcionan varios usos de estas composiciones proteicas.

En ciertos aspectos de ácido nucleico, un polinucleótido aislado o recombinante que comprende la secuencia de una IL-174 de mamífero, que: codifica al menos 8 aminoácidos contiguos de SEC ID Nº 14; codifica al menos dos segmentos distintos de al menos 5 aminoácidos contiguos de SEC ID Nº 14; o comprende uno o más segmentos de al menos 21 nucleótidos contiguos de SEC ID Nº 14. Ciertos aspectos incluirán

(IL -174) que: codifica al menos 16 residuos aminoácidos contiguos de SEC ID Nº 14; codifica al menos dos segmentos distintos de al menos 10 y 13 residuos aminoácidos contiguos de SEC ID Nº 14; o comprende al menos 33 nucleótidos contiguos de SEC ID Nº 13; o comprende toda la porción de codificación madura de SEC ID Nº 13.

Se describen varios procedimientos, por ejemplo fabricando: a) un polipéptido que comprende expresar el vector de expresión descrito, de modo que se produce el polipéptido; b) un ácido nucleico dúplex que comprende poner en contacto un polinucleótido descrito con un ácido nucleico complementario, de modo que da lugar a la producción del ácido nucleico dúplex; o c) un polinucleótido descrito que comprende amplificar usando un procedimiento de PCR.

Como alternativa, un polinucleótido aislado o recombinante se describe en el presente documento, que hibrida en condiciones de lavado rigurosas de al menos 55 ºC y menos de 400 mM de la sal con el polinucleótido (IL-174) descrito que consiste en la porción de codificación de SEC ID Nº 13.

Otros aspectos incluyen dicho polinucleótido descrito: a) en el que las condiciones de lavado son al menos 65 ºC y

menos de 300 mM de sal; o b) que comprende al menos 50 nucleótidos contiguos de la porción de codificación de SEC ID Nº 13 (IL-174)

En el presente documento se describen ciertos kit que, por ejemplo, comprenden un polinucleótido descrito, y: a) instrucciones de uso del polinucleótido para detección; b) instrucciones para la eliminación del polinucleótido u otros reactivos del kit; o c) a y b.

En el presente documento también se describen varias células, por ejemplo una célula que contiene el vector de expresión, en la que la célula es: una células procariota; una célula eucariota; una célula bacteriana; una célula de levadura; una célula de insecto; una célula de mamífero; células de ratón; una célula de primate; o una célula humana.

Los aspectos polipeptídicos incluye, por ejemplo, un polipéptido antigénico recombinante o aislado

(IL-174) que comprende al menos: 1) un segmento de 8 residuos aminoácidos contiguos de SEC ID Nº 14 o ii) dos segmentos distintos de al menos 5 aminoácidos contiguos de SEC ID Nº 14.

Otros aspectos incluyen dicho polipéptido descrito, en el que: a) el segmento de 8 aminoácidos contiguos idénticos es de al menos 14 aminoácidos contiguos; o b) uno de los segmentos de al menos 5 aminoácidos contiguos comprende al menos 7 aminoácidos contiguos. Otros aspectos incluyen un polipéptido descrito, en el que (IL-174), el polipéptido: a) comprende la SEC ID Nº 14 madura; b) se une con selectividad a un anticuerpo policlonal generado contra un inmunógeno de la SEC ID Nº 14; c) comprende una pluralidad de distintos segmentos polipeptídicos de 10 aminoácidos contiguos de SEC ID Nº 14; d) tiene una longitud de al menos 30 aminoácidos; o e) exhibe al menos dos epítopos no solapantes que son selectivos de la SEC ID Nº 14 madura.

Otros varios aspectos incluyen dicho polipéptido descrito, que: a) está en una composición estéril; b) no está glicosilado; c) está desnaturalizado; d) es un polipéptido sintético; e) está unido a un sustrato sólido; f) es una proteína de fusión con un marcador de detección o purificación; g) es una sustitución 5 veces o menor de una secuencia natural; o h) es una variante de deleción o inserción de una secuencia natural.

También se divulgan procedimientos de uso de los polipéptidos descritos, por ejemplo: a) para marcar el polipéptido, que comprenden marcar el polipéptido con un marcador radioactivo; b) para separar el polipéptido de otro polipéptido en una mezcla, que comprende pasar la mezcla en una matriz cromatográfica de modo que se separan los polipéptidos; c) para identificar un compuesto que se une de forma selectiva al polipéptido, que comprende incubar el compuesto con el polipéptido en condiciones adecuadas; de modo que el compuesto se une al polipéptido; o d) para conjugar el polipéptido a una matriz, que comprende derivar el polipéptido con un reactivo reactivo y conjugar el polipéptido a la matriz.

También se proporcionan anticuerpos, incluido un compuesto de unión que comprende una porción de unión a antígeno de un anticuerpo que se une con selectividad a dicho polipéptido descrito, en el que el polipéptido (IL-174) comprende la SEC ID Nº 14.

Ciertas realizaciones abarcan dicho un compuesto de unión, en el que el anticuerpo es un anticuerpo policlonal que se produce contra el polipéptido de (IL-174) de la SEC ID N 14.

Otros aspectos incluyen dicho compuesto de unión descrito, en el que: a) anticuerpo: i) se inmunoselecciona; ii) se une a una proteína desnaturalizada; o iii) exhibe una kd al polipéptido de al menos 30 Mm; o b) compuesto de unión: i) está fijado a un sustrato sólido, incluido una perla o membrana de plástico; ii) es una composición estéril; o iii) está marcado de forma detectable, incluido un marcador radioactivo o fluorescente.

Se describen procedimientos que, por ejemplo, producen un complejo antígeno-anticuerpo, que comprenden poner en contacto un polipéptido que comprende la secuencia de la SEC ID Nº 14 con un compuesto de unión descrito, en condiciones que permiten la formación del complejo. Preferentemente, el compuesto de unión es un anticuerpo y el polipéptido es una muestra biológica.

Se proporcionan kit que, por ejemplo, comprenden un compuesto de unión descrito, y:

a) un polipéptido de la SEC ID Nº 14; b) instrucciones de uso del compuesto de unión para detección; o c) instrucciones para la eliminación del compuesto de unión u otros reactivos del kit.

Y se describe un procedimiento de evaluar la selectividad de la unión de un anticuerpo a una proteína de la SEC ID Nº 14 que comprende poner en contacto un anticuerpo descrito con la proteína y otra citoquina; y comparar la unión del anticuerpo a la proteína y a la citoquina.

Descripción detallada de las formas de realización preferidas

I. General.

En el presente documento se describen secuencias de ADN que codifican varias proteínas de mamífero que exhiben rasgos característicos estructurales de citoquinas, en particular relacionadas con la citoquina denominada CTLA-8 (también denominada IL-17). Se han descrito formas de rata, ratón, ser humano y un homólogo viral de la CTLA-8 y sus secuencias disponibles de GenBank. Véase Rouvier y col. (1993) J. Immunol. 150:5445-5456; Yao, y col. (1995) Immunity 3:811-821; Yao, y col. (1995) J. Immunol. 155:5483-5486; y Kennedy y col. (1996) J. Interferon and Cytokine Res. 16:611-617. La CTAL-8 tiene actividades implicadas en la artritis, el rechazo de injerto de riñón, la tumorigeneicidad, las interacciones virus-huésped y la inmunidad innata; y parece exhibir ciertas funciones reguladores similares a la IL-6. Véase PubMed (búsqueda por IL-17); Chabaud, y col. (1998) J. Immunol. 63:139148; Amin, y col. (1998) Curr. Opin. Rheumatol. 10:263-268; Van Kooten, y col. (1998) J. Am. Soc. Nephrol. 9:15261534; Fossiez, y col. (1998) Int. Rev. Immunol. 16:541-551; Knappe, y col. (1998) J. Virol. 72:5797-5801; Seow (1998) Vet. Immuno. Immunopathol. 63:139-48; y Teunissen, y col. (1998) J. Invest. Dermatol. 111:645-649. Un informe sobre la señalización a través del factor de transcripción NFKB implica una vía de señal que se usa en la inmunidad innata. Shalom-Barak, y col. (1998) J. Biol. Chem. 273:27467-27473.

En el presente documento, las secuencias de ADNc presentadas exhiben varios rasgos característicos de los ARNm que codifican citoquinas, factores de crecimiento y oncogenes. Dado que la IL-17 es el primer miembro de esta recién reconocida familia de citoquinas relacionada con el TGF-�, los solicitantes han designado la familia IL-170, con los miembros nuevos IL-172, IL-173, IL- 174, IL-176, IL-177; and IL-171 and IL-175. Se ha predicho que el plegamiento para esta familia es en de la familia de citoquinas del TGF-�. La familia de citoquinas del TGF-� y la familia de la IL-170 comparten la característica común de un motivo en nudo de cistina, que se caracteriza por un espaciado particular de los residuos de cisteína. Véase, por ejemplo, Sun y Davies (1995) Ann. Rev. Biophys. Biomolec. Struct. 24: 269-291; McDonald, y col. (1993) Cell 73:421-424; y Isaacs (1995) Curr. Op. Struct. Biol. 5:391

395. En particular, las estructuras sugieren un número conservado de cisteínas que corresponden y están numeradas a la IL-172 humana (SEC ID Nº 2), las cisteínas en 101, 103, 143, 156, y 158. La primera cisteína corresponde a la posición en la Tabla 7 de la IL-172 human (SEC ID Nº 2) val19. La cuarta cisteína corresponde a la de la IL-172 de ratón (SEC ID Nº 4) cys141; a la de la IL-173 humana (SEC ID Nº 6) cys119; a la de la IL-174 de ratón (SEC ID Nº 16) cys104; a la de la IL-171 humana (SEC ID Nº: 21) cys50. Los puentes disulfuro deberían ser cisteínas 2 con 5, y 3 con 6, y 1 con 4. El significado funcional de la similitud del plegamiento sugiere la formación de dímeros para la familia de la IL-170. Como consecuencia, los dímeros de la IL-170 acercarían dos receptores de la superficie celular a través de los cuales se producirá la transducción de señal.

Estas nuevas proteínas se designan relacionadas con CTLA-8 o, en general, proteínas IL-170- Las proteínas naturales deberían ser capaces de mediar en varias respuestas fisiológicas, lo que conduciría a las respuestas biológicas o fisiológicas en las células diana, por ejemplo las respuestas características de la señalización de citoquinas. Los estudios iniciales habían localizado el mensaje que codifica esta proteína a varias líneas celulares de células hematopoyéticas. Los genes que codifican el antígeno de CTLA-8 (IL-17) original se han mapeado en el cromosoma 1A de ratón y el cromosoma 2q31 humano. La CTLA-8 murina fue originalmente clonada por Rouvier y col. (1993) J. Immunol. 150:5445-5456. La IL-173 humana se ha mapeado en el cromosoma 13q11. También deberían estar disponibles secuencias similares para proteínas en otras especies de mamífero.

La CTLA-8 purificada, cuando se cultiva con sinoviocitos, es capaz de inducir la secreción de IL-6 a partir de estas células. Esta inducción se invierte con la adición de un anticuerpo neutralizante producido contra la CTLA-8 humana. Las células endoteliales, epiteliales fibroblastos y de carcinoma también exhiben respuestas al tratamiento con CTLA-8. Este dato sugiere que la CTLA-8 puede estar implicada en la fibrosis inflamatoria, por ejemplo psoriasis, esclerodermia, fibrosis pulmonar o cirrosis. La CTLA-8 puede también producir proliferación de carcinomas u otras células en cuando a que la IL-6 a menudo actúa como factor de crecimiento para dichas células. Como tal, es probable que los otros recién descubiertos miembros de la familia relacionados tengan actividades biológicas similares o relacionadas.

Las siguientes descripciones están dirigidas, a modo de ejemplo, anticuerpos frente a la IL-174 murina o humana, pero asimismo son aplicables a realizaciones relacionadas de otras especies.

II. Ácidos nucleicos

Las Tabla 1-6 divulgan las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de varias secuencias de nuevos miembros de la familia de la IL-170. Las secuencias de nucleótidos descritas y los reactivos relacionados son útiles en la construcción de clones de ADN útiles para extender los clones en ambas direcciones para la determinación de la secuencia de longitud completa o flanqueante, expresar polipéptidos de IL-170 o, por ejemplo, aislar un gen homólogo de otra fuente natural. Normalmente, las secuencias serán útiles en el aislamiento de otros genes, por ejemplo variantes alélicas, de ratón, y se aplicarán procedimientos similares para aislar genes de otras especies, por ejemplo animales de sangre caliente, tales como aves y mamíferos. La hibridación cruzada permitirá el aislamiento de genes de otras especies. Deberá estar disponible una serie de estrategias diferentes para aislar con éxito un clon de ácido nucleico adecuado de otras fuentes.

Tabla 1: Secuencia de nucleótidos que codifican un polipéptido IL-172 de primate, por ejemplo de ser humano, y la secuencia de aminoácidos prevista. También se pueden usar secuencias de ácido nucleico complementarias para muchos fines. Se indica el sitio de escisión de la señal predicha, pero puede haber unos pocos residuos en ambos

lados; sitio de glicosilación supuesto en los residuos 55-57. SEC ID Nº 1 y 2.

Segmentos particularmente interesantes incluyen, por ejemplo los que comienzan o terminan con gln1; va119; pro20; pro22; lys34; pro35; leu78; ser79; glu98; ala99; phe110; thr111; cys143; o arg144.

Secuencia de nucleótidos que codifican un polipéptido IL-172 de roedor, por ejemplo de ratón, y la secuencia de aminoácidos prevista. También se pueden usar secuencias de ácido nucleico complementarias para muchos fines. Se indica el sitio de escisión de la señal predicha, pero puede haber unos pocos residuos en ambos lados; sitio de glicosilación supuesto en los residuos 53-55. SEC ID Nº 3 y 4.

Segmentos particularmente interesantes incluyen, por ejemplo los que comienzan o terminan con arg1; ala17; pro18; pro20; his21; lys32; pro33; leu76; ser77; glu96; ala97; phe108; thr109; cys141; o arg142.

Tabla 2: Secuencia de nucleótidos que codifican un polipéptido IL-173 de primate, por ejemplo de ser humano, y la secuencia de aminoácidos prevista. También se pueden usar secuencias de ácido nucleico complementarias para muchos fines. SEC ID Nº 5 y 6.

Secuencia de nucleótidos suplementaria que codifican un polipéptido IL-173 de primate, por ejemplo de ser humano, y la secuencia de aminoácidos prevista. También se pueden usar secuencias de ácido nucleico complementarias para muchos fines. SEC ID Nº 7 y 8.

Motivos predichos importantes incluyen, por ejemplo AMPc PK en 50-53, 66-69, 72-75 y 113-116; Ca Fos en 82-84 y 66-168; sitios de miristoílo en 57-61 y 164-166; sitios de fosforilación en 50, 53, 72, 75, 80, 82, 113 y 116.

Secuencia de nucleótidos que codifican un polipéptido IL-173 de roedor, por ejemplo de rata, y la secuencia de aminoácidos prevista. También se pueden usar secuencias de ácido nucleico complementarias para muchos fines. SEC ID Nº 9 y 10.

Secuencia de nucleótidos suplementaria que codifican un polipéptido IL-173 de roedor, por ejemplo de ratón, y la secuencia de aminoácidos prevista. También se pueden usar secuencias de ácido nucleico complementarias para muchos fines. SEC ID Nº 11 y 12.

Motivos predichos importantes incluyen, por ejemplo sitios de AMPc PK en 50-53, 66-69, 72-75 y 113-116; sitios de fosforilación de Ca en 82-84 159-161 y 166-168; sitios de miristoílo en 57-61 y 101-105; sitios de N-glicosilo en 5153 y 164-166; sitios de fosforilación en 50, 53, 72, 75, 80, 82, 113 y 116; y sitios de fosforilación PKC en 4-6.

Tabla 3: Secuencia de nucleótidos que codifican un polipéptido IL-174 de primate, por ejemplo de ser humano, y la secuencia de aminoácidos prevista. También se pueden usar secuencias de ácido nucleico complementarias para muchos fines. SEC ID Nº 13 y 14.

Motivos predichos importantes incluyen, por ejemplo sitios de AMPc PK en 21-24, 53-56 y 95-98; sitios de

fosforilación de Ca en 15-17, 16-18 y 45-47; sitios de miristoílo en 12-16, 115-119 y 118-122; sitios de N-glicosilo en 104-107; sitios de fosforilación en 21, 23, 43, 53, 56, 95, 98 y 131; y sitios de fosforilación PKC en 41-43 y 119-121, y sitios de tirosina quinasa en 95-102.

Secuencia de nucleótidos que codifican un polipéptido IL-174 de roedor, por ejemplo de ratón, y la secuencia de aminoácidos prevista. También se pueden usar secuencias de ácido nucleico complementarias para muchos fines. SEC ID Nº 15 y 16.

Secuencia de nucleótidos suplementaria que codifican un polipéptido IL-174 de roedor, por ejemplo de ratón, y la secuencia de aminoácidos prevista. También se pueden usar secuencias de ácido nucleico complementarias para 10 muchos fines. SEC ID Nº 17 y 18.

Motivos predichos importantes incluyen, por ejemplo sitios de AMPc PK en 29-32 y 61-64; sitios de fosforilación de Ca en 18-20, 3-55 y 67-69; sitios de miristoílo en 123-127; sitios de N-glicosilo en 112-114; sitios de fosforilación en 29, 31, 51, 3, 61, 64, 139 y 141; y sitios de fosforilación PKC en 2-4, 49-51 y 127-129.

Tabla 4: Secuencia de nucleótidos que codifican un polipéptido IL-171 de primate, por ejemplo de ser humano, según el código de la IUPAC. También se pueden usar secuencias de ácido nucleico complementarias para muchos fines. SEC ID Nº 19:

Las SEC ID Nº 20 y 21 son secuencias traducibles de ADNc y de polipéptidos PATENTIN.

Secuencia de nucleótidos suplementaria que codifican un polipéptido IL-171 de primate, por ejemplo de ser humano.

También se pueden usar secuencias de ácido nucleico complementarias para muchos fines. Las SEC ID Nº 22 y 23: Tabla 5: Secuencia de nucleótidos que codifican una secuencia de IL-175 de primate, por ejemplo de ser humano, según el código de la IUPAC. También se pueden usar secuencias de ácido nucleico complementarias para muchos fines. Las SEC ID Nº 24:

Las SEC ID Nº 25 y 26 son secuencias traducibles de ADNc y de polipéptido PATENTIN. Se indica el sitio de escisión de la señal predicha, pero puede haber unos pocos residuos en ambos lados; sitio de glicosilación supuesto en los residuos 53-55.

Segmentos particularmente interesantes incluyen, por ejemplo los que comienzan o terminan con: cys17; pro18, pro19; va120; thr49; ser50; arg69; pro70; y el final de la secuencia disponible.

Tabla 6: Secuencia de nucleótidos suplementaria que codifican IL-176 de primate, por ejemplo de ser humano. También se pueden usar secuencias de ácido nucleico complementarias para muchos fines. Las SEC ID Nº 27 y 28: Secuencia de nucleótidos suplementaria que codifican IL-177 de primate, por ejemplo de ser humano. También se pueden usar secuencias de ácido nucleico complementarias para muchos fines. Las SEC ID Nº 29 y 30:

Tabla 7 Alineación de varios miembros de la familia CTLA-8/IL-170. La secuencia de la CTLA-8 de rata es la SEC ID Nº 31 (véase el documento GB L13839; 293329/30; la secuencia de la CTLA-8 de ratón es la SEC ID Nº 32 (véase el documento GB 1469917/8); la secuencia de la CTLA-8 humana es la SEC ID Nº 33 (véase el documento GB U32659; 115222/3); y el ORF13 del virus del herpes saimiri es la SEC ID Nº 34 (véase el documento GB Y13183; 2370235). CLUSTAL X (1,64 b) alineación de múltiples secuencias

Segmentos particularmente interesantes incluyen, por ejemplo los correspondientes a los segmentos de IL-172 o IL175, indicados anteriormente, con los otros miembros de la familia.

Los polipéptidos o proteína purificados son útiles para generar los anticuerpos mediante procedimientos estándar, como se ha descrito anteriormente. Los péptidos sintéticos o la proteína purificada se pueden presentar a un sistema inmunológico para generar una composición de unión específica, por ejemplo anticuerpos monoclonales o policlonales. Véase, por ejemplo, Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene; y Harlow y Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press.

Por ejemplo, la composición de unión específica podría usarse para la detección selectiva de una biblioteca de expresión hecha de una línea celular que expresa una proteína IL-174. La detección selectiva puede ser tinción estándar de la proteína expresada en la superficie o mediante panning. La detección selectiva de la expresión intracelular también se puede realizar mediante varios procedimientos de tinción o inmunofluorescencia. Las composiciones de unión podrían usarse para purificar por afinidad o clasificar células que expresan la proteína.

En el presente documento se describe el uso de ADN aislado o de fragmentos para codificar una correspondiente proteína o polipéptido de IL-174 biológicamente activa. Además, describe ADN aislado o recombinante que codifica una proteína o polipéptido biológicamente activa y que es capaz de hibridar en las condiciones adecuadas con las secuencias de ADN de IL-174 descritas en el presente documento. Dicha proteína o polipéptido biológicamente activa puede ser un antígeno intacto, o fragmento, y tiene una secuencia de aminoácidos tal como se divulga en la Tabla 3. Además, describe el uso de ADN recombinante o aislado, o fragmentos del mismo, que codifican proteínas que son homólogas a una proteína de IL-174 o que se aislaron usando ADNc que codifica una proteína de IL-174 como sonda. El ADN aislado puede tener las respectivas secuencias reguladoras en los lados de 5’ y 3’, por ejemplo promotores, potenciadores, señales de adición de poli-A y otros.

Un ácido nucleico “aislado” es un ácido nucleico, por ejemplo un ARN, ADN. O un polímero mixto, que está sustancialmente separado de otros componentes que acompañan de forma natural a la secuencia nativa, por ejemplo ribosomas, polimerasas y secuencias genómicas flanqueantes procedentes de las especies originales. El término abarca una secuencia de ácido nucleico que se ha retirado de su ambiente natural e incluye aislamientos de ADN recombinante o clonado y análogos químicamente sintetizados o análogos biológicamente sintetizados mediante sistemas heterólogos. Una molécula sustancialmente pura incluye formas aisladas de la molécula. Como alternativa, una especie purificada se puede separar de los componentes del huésped de un sistema de expresión recombinante. El tamaño de la homología de dicho ácido nucleico normalmente será menor que los vectores grandes, por ejemplo menor que decenas de kB, normalmente menor que varios kB y, preferentemente, en el intervalo de 2-6 kB.

Generalmente, un ácido nucleico aislado será una composición homogénea de moléculas pero, en algunas realizaciones, contendrá una heterogeneidad menor. Habitualmente, esta heterogeneidad se encuentra en los extremos del polímero o porciones no cruciales para una función o actividad biológica deseada.

Un ácido nucleico “recombinante” se define por su procedimiento de producción o por su estructura. En referencia a su procedimiento de producción, por ejemplo un producto fabricado mediante un procedimiento, el procedimiento es el uso de técnicas de ácido nucleico recombinante que implican, por ejemplo, intervención humana en la secuencia

de nucleótidos, normalmente selección o producción. Como alternativa, puede ser una ácido nucleico fabricado generando una secuencia que comprende la fusión de dos fragmentos que no son contiguos entre sí de forma natural, pero se excluirán los productos de la naturaleza, por ejemplo mutantes naturales. Por tanto, por ejemplo, se abarca los productos fabricados transformando células con cualquier vector no natural, como también los ácidos nucleicos que comprenden la secuencia derivada usando cualquier procedimiento de oligonucleótido sintético. Esto se realiza a menudo para sustituir un codón con un codón redundante que codifica el mismo aminoácido o un aminoácido conservador, al tiempo que normalmente introduce o elimina un sitio de reconocimiento de secuencia. Como alternativa, se realiza la unión de segmentos de ácido nucleico de funciones deseadas, para generar una única entidad genética que comprende una combinación deseada de funciones no encontradas en las formas naturales disponibles habitualmente. A menudo, los sitios de reconocimiento para enzimas de restricción son la diana de dichas manipulaciones artificiales, pero por diseño se pueden incorporar otras dianas específicas de sitio, por ejemplo promotores, ADN, sitios de replicación, secuencias de regulación, secuencias control u otras características útiles. Un concepto similar se pretende para un polipéptido recombinante, por ejemplo de fusión. Específicamente se incluyen ácidos nucleicos sintéticos que, por redundancia del código genético, codifican polipéptidos similares a los fragmentos de estos antígenos, y fusiones de secuencias de varias variantes de especies diferentes.

Un “fragmento” significativo en un contexto de ácido nucleico es un segmento contiguo de al menos aproximadamente 17 nucleótidos, generalmente al menos 20 nucleótidos, más generalmente al menos 23 nucleótidos, habitualmente al menos 26 nucleótidos, más habitualmente al menos 29 nucleótidos, a menudo al menos 32 nucleótidos, más a menudo al menos 25 nucleótidos, habitualmente al menos 38 nucleótidos, más habitualmente al menos 41 nucleótidos, normalmente al menos 44 nucleótidos, más normalmente al menos 47 nucleótidos, preferentemente al menos 50 nucleótidos, más preferentemente al menos 53 nucleótidos y, en realizaciones particularmente preferidas, serán al menos 56 o más nucleótidos. Dichos fragmentos pueden tener extremos en cualquier localización, pero, especialmente, en los límites entre los dominios estructurales.

En otros aspectos, divulga polinucleótidos (o polipéptidos) que comprenden una pluralidad de distintos segmentos, por ejemplo, no solapantes, de la longitud especificada. Normalmente, la pluralidad ser al menos dos, más normalmente al menos tres y, preferentemente, 5, 7 o incluso más. Aunque se proporcionan las longitudes mínimas, longitudes mayores, de varios tamaños, pueden ser adecuadas, por ejemplo uno de longitud 7 y dos de longitud 12-

Un ADN que codifica una proteína IL-174 será particularmente útil para identificad genes, especies de ARNm y ADNC que codifican proteínas relacionadas u homólogas, así como ADN que codifican proteínas homólogas de diferentes especies. Probablemente son homólogos en otras especies, incluidos primates. Varias proteínas de CTLA-8 deberían ser homólogas y están dentro del presente documento. No obstante, incluso las proteínas que tienen una relación de evolución más distante con el antígeno pueden aislarse más fácilmente en las condiciones adecuadas usando estás secuencias su son suficientemente homólogas. Las proteínas de proteína CTLA-8 de primate son de particular interés.

En el presente documento también se describen moléculas de ADN recombinante y fragmentos que tienen una secuencia de ADN idéntica o altamente homóloga con los ADN de I-174 aislados expuestos en el presente documento. En particular, las secuencias a menudo estarán operablemente unidas a segmentos de ADN que controlan la transcripción, traducción y replicación de ADN. Como alternativa, los clones recombinantes derivados de las secuencias genómicas, por ejemplo que contienen intrones, serán útiles para estudios transgénicos, incluidos, por ejemplo, células y organismos transgénicos, y para terapia génica. Véase, por ejemplo, Goodnow (1992) "Transgenic Animals" en Roitt (ed.) Encyclopedia of Immunology Academic Press, San Diego, pp. 1502-1504; Travis (1992) Science 256:1392-1394; Kuhn, y col. (1991) Science 254:707-710; Capecchi (1989) Science 244:1288; Robertson (ed. 1987) Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach IRL Press, Oxford; Rosenberg (1992) J. Clinical Oncology 10:180-199; y Cournoyer y Caskey (1993) Ann. Rev. Immunol. 11:297-329.

Las secuencias de ácidos nucleicos homólogos, cuando se comparan, exhibe una similitud significativa. Los patrones de homología en ácidos nucleicos son medidas de homología generalmente usadas en la técnica mediante comparación de secuencia o basadas en condiciones de hibridación. Las condiciones de hibridación se describen más detalladamente más adelante.

Homología sustancial en el contexto de comparación de secuencias de ácido nucleico significa que los segmentos, o sus hebras complementarias, cuando se comparan, son idénticos cuando están alineados óptimamente, con las inserciones o deleciones de nucleótidos adecuadas, en al menos aproximadamente el 50 % de los nucleótidos, en general al menos el 56 %, más generalmente al menos 50 %, habitualmente al menos 62 %, más habitualmente al menos 65 %, a menudo al menos 68 %, más a menudo al menos 71 %, normalmente al menos 74 %, más normalmente al menos 77 %, habitualmente al menos 80 %, más habitualmente al menos aproximadamente 85 %, preferentemente al menos aproximadamente 90 %, más preferentemente al menos aproximadamente 95 a 98 % o más, y, en realizaciones concretas, tan alta como de aproximadamente 99 % o más de los nucleótidos. Como alternativa, existe una homología sustancial cuando los segmentos hibridarán en condiciones de hibridación selectiva, con una hebra, o su complementaria, usando normalmente una secuencia derivada de la Tabla 2, 3 o 6. Normalmente se producirá hibridación selectiva cuando hay una homología de al menos aproximadamente 55 % en una extensión de al menos aproximadamente 14 nucleótidos, preferentemente al menos aproximadamente 65 %,

más preferentemente al menos aproximadamente 75 % y, más preferentemente, al menos aproximadamente 90 %. Véase, Kanehisa (1984) Nuc. Acids Res. 12:203-213. La longitud de la comparación de la homología, como se ha descrito, puede estar sobre tiras largas y, en ciertas realizaciones, estará sobre una tira de al menos aproximadamente 17 nucleótidos, normalmente al menos aproximadamente 20 nucleótidos, más normalmente al menos aproximadamente 24 nucleótidos, normalmente al menos aproximadamente 28 nucleótidos, más normalmente al menos aproximadamente 40 nucleótidos, preferentemente, al menos aproximadamente 50 nucleótidos y, más preferentemente, al menos aproximadamente 75 a 100 o más nucleótidos.

Condiciones rigurosas, en cuanto a la homología en el contexto de hibridación, serán condiciones rigurosas combinadas de sal, temperatura, disolventes orgánicos y otros parámetros, normalmente los controlados en las reacciones de hibridación. Condiciones de temperatura rigurosas normalmente incluirán temperaturas superiores a aproximadamente 30 ºC, más normalmente superiores a aproximadamente 37 ºC, normalmente superiores a aproximadamente 45 ºC, más normalmente superiores a aproximadamente 55 ºC, preferentemente superiores a aproximadamente 65 ºC y, más preferentemente, superiores a aproximadamente 70 ºC. Las condiciones rigurosas de sales serán, normalmente, inferiores a aproximadamente 1000 mM, normalmente, inferiores a aproximadamente 500 mM, más normalmente, inferiores a aproximadamente 400 mM, habitualmente inferiores a aproximadamente 300 mM, preferentemente inferiores a aproximadamente 200 mM y, más preferentemente inferiores a aproximadamente 150 mM. No obstante, la combinación de parámetros es mucho más importante que la medida de cualquier parámetro por separado. Véase, por ejemplo, Wetmur y Davidson (1968) J. Mol. Biol. 31:349-370. La hibridación en condiciones rigurosas deberá proporcionar un fondo de a menos 2 veces el fondo, preferentemente al menos 3-5 o más.

Como alternativa, para comparar secuencias, normalmente una secuencia actúa como secuencia de referencia con la que se comparan las secuencias problema. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias problema y de referencia se introducen en un ordenador, se designan las coordenadas de la subsecuencia, en caso necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencias. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para la(s) secuencia(s) problema con respecto a la secuencia de referencia, en base a los parámetros del programa designados.

La alineación óptima de secuencias para comparación se puede efectuar mediante, por ejemplo, el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482, el algoritmo de alineación por homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, mediante el procedimiento de búsqueda de similitudes de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444, mediante implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección visual (véase, en general, Ausubel y col., ant.).

Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea una alineación de múltiples secuencias de un grupo de secuencias relacionadas usando alineaciones pareadas progresivas para mostrar la relación y el porcentaje de identidad de secuencia. También representa un árbol o dendrograma que muestra las relaciones de agrupamiento usadas para crear la alineación. PILEUP usa una simplificación del procedimiento de alineación progresiva de Feng y Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35:351-360. El procedimiento usado es similar al procedimiento descrito por Higgins y Sharp (1989) CABIOS 5:151-153. El programa puede alinear hasta 300 secuencias, cada una de una longitud máxima de 5.000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de alineación múltiples comienza con la alineación pareada de las dos secuencias más similares, produciendo un grupo de dos secuencias alineadas. Después, este grupo se alinea a la siguiente secuencia más relacionada, o grupo de secuencias alineadas. Dos grupos de secuencias se alinean mediante extensión simple de la alineación apareada de dos secuencias individuales. La alineación final se consigue mediante una serie de alineaciones pareadas progresivas. El programa se ejecuta diseñando secuencias específicas y sus coordenadas de aminoácidos o nucleótidos para regiones de comparación de secuencia y designando los parámetros del programa. Por ejemplo, una secuencia de referencia se puede comparar con otras secuencias problema para determinar la relación del porcentaje de identidad de secuencia usando los parámetros siguientes: Peso del hueco por defecto (3,00), peso de la longitud del hueco por defecto (0,10) y huecos terminales pesados.

Otro ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. El software para realizar análisis BLAST está disponible para el público a través del National Center for Biotechnology Information (http:www.ncbi. nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar primero pares de secuencia de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia problema que coinciden o satisfacen alguna puntuación T umbral de valor positive cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T es el umbral de la puntuación de la palabra vecina (Altschul y col., anteriormente). Estas coincidencias de la palabra vecina inicial actúan como semillas para iniciar las búsquedas para encontrar los HSP que las contienen. Después, las coincidencias con la palabra se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia todo lo que la puntuación de la alineación acumulada se pueda incrementar. La extensión para las coincidencias de la palabra en cada dirección se detienen cuando: La puntuación de la alineación acumulada se salga de la cantidad X a partir de su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulada llega a cero o menor, debido

a la acumulación de una o más alineaciones de residuos que puntúan negativo; o se alcanza el final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLAST usa como valores predeterminados una longitud de palabra (W) de 11, las alineaciones (B) de la matriz de puntuación BLOSUM62 de 50 (véase Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 89:10915), expectativa (E) de 10, M= 5, N= 4, y una comparación de ambas hebras.

Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, p. ej., ., Karlin y Altschul (1993) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 90:5873-5787). Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de la suma más pequeña ((P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad de que se produzca al azar una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico problema con el ácido nucleico de referencia es inferior a aproximadamente 0,1, más preferentemente inferior a aproximadamente 0,01 y, lo más preferentemente, inferior a aproximadamente 0,001.

Una indicación adicional de que las dos secuencias de ácido nucleico de los polipéptidos son sustancialmente idénticas es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico es inmunológicamente transreactivo con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe más adelante. Por tanto, normalmente, un polipéptido es sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido cuando, por ejemplo, los dos péptidos difieren únicamente en las sustituciones conservadoras. Otra indicación de que las dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas hibridan entre sí en condiciones rigurosas, como se describe más adelante.

Las proteínas CTL-A8 de otra especie de mamífero se pueden clonar y aislar mediante hibridación de especies cruzadas con especies estrechamente relacionadas, por ejemplo ser humano, como se divulga en las Tablas 1-7. La homología puede ser relativamente baja entre especies relacionadas de forma distante y, por tanto, se aconseja la hibridación de especies relativamente estrechamente relacionadas- Como alternativa, la preparación de una preparación de anticuerpos que exhibe menos especificidad de especie puede ser útil en los enfoques de clonación de expresión.

III. Proteína IL-174 purificada

La secuencia predicha del polipéptido de IL-173 de primate, por ejemplo de ser humano, y de roedor, por ejemplo de ratón, se muestra en la Tabla 2. De forma similar, en la Tabla 3 se proporciona la secuencia de IL-174 de primate, por ejemplo de ser humano, y se le ha asignado la SEC ID Nº 14. En la Tabla 3 también se describe una IL-174 de roedor, por ejemplo murina. Las secuencias peptídicas permiten la preparación de péptidos para generar anticuerpos para reconocer dichos segmentos.

Como se usa en el presente documento, las expresiones “proteína IL-174 de primate” y “proteína IL-174 de roedor” abarcarán, cuando se usan en un contexto proteico, una proteína que tiene secuencias de aminoácido designadas mostradas en la Tabla 3, o un fragmento significativo de dicha proteína. También se refiere a un polipéptido derivado de primate o roedor que exhibe una función biológica similar o interacciona con los componentes de unión específicos de la proteína IL-174. Estos componentes de unión, por ejemplo anticuerpos, normalmente se unen a una proteína IL-174 con afinidad alta, por ejemplo al menos 100 nM, normalmente mejor que aproximadamente 30 nM, preferentemente mejor que aproximadamente 10 nM, y más preferentemente mejor que aproximadamente nM. Las proteínas homólogas se encontrarían en especies de mamífero, aparte de rata o seres humanos, por ejemplo ratón, primates y en el genoma del virus del herpes, por ejemplo ORF13. Las especies no mamíferas también deberían poseer genes y proteínas estructural o funcionalmente relacionados.

El término “polipéptido”, como se usa en el presente documento, incluye un fragmento o segmento significativo, y abarca una tira de residuos de aminoácidos de al menos aproximadamente 8 aminoácidos, generalmente al menos 10 aminoácidos, más generalmente al menos 12 aminoácidos, a menudo al menos 14 aminoácidos, más a menudo al menos 16 aminoácidos, normalmente al menos 18 aminoácidos, más normalmente al menos 20 aminoácidos, normalmente al menos 22 aminoácidos, más normalmente al menos 24 aminoácidos, preferentemente al menos 26 aminoácidos, más preferentemente al menos 28 aminoácidos y, en realizaciones particularmente preferidas, al menos aproximadamente 30 o más aminoácidos. Los extremos específicos de tal segmento estarán en cualquier combinación en la proteína, abarcando preferentemente dominios estructurales.

La expresión “composición de unión” se refiere a moléculas que se unen con especificidad a la proteína IL-174, por ejemplo de un modo ligando-receptor, una interacción anticuerpo-antígeno o compuestos, por ejemplo, proteínas, que se asocian específicamente con la proteína IL-174, por ejemplo en una interacción proteína-proteína natural fisiológicamente relevante, bien covalente o no covalente. La molécula puede ser un polímero o un reactivo químico. No se representa ninguna implicación en cuanto a si la proteína IL-170 es el ligando o el receptor de una interacción ligando-receptor, aparte de que la interacción exhibe una especificidad similar, por ejemplo una afinidad específica. Un análogo funcional puede ser una proteína con modificaciones estructurales o puede ser una molécula completamente no relacionada, por ejemplo que tiene una forma molecular que interacciona con los determinantes de unión adecuados. Las proteínas pueden servir como agonistas o antagonistas de un receptor, véase, por

ejemplo, Goodman y col. (eds. 1990) Goodman & Gilman’s: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8ª ed.), Pergamon Press.

La solubilidad de un polipéptido o fragmento depende del entorno y del polipéptido. Muchos parámetros afectan a la solubilidad del polipéptido, incluidos la temperatura, el entorno de electrolitos, el tamaño y las características moleculares del polipéptido, y la naturaleza del disolvente. Normalmente, la temperatura a la cual se usa el polipéptido varía de aproximadamente 4 ºC a aproximadamente 65 ºC. Normalmente, la temperatura de uso es superior a aproximadamente 18 ºC y más normalmente superior a aproximadamente 22 ºC. Para fines diagnósticos, la temperatura será, normalmente, aproximadamente la temperatura ambiente o mayor, pero inferior a la temperatura de desnaturalización de los componentes del ensayo. Para fines terapéuticos, la temperatura será, normalmente, la temperatura corporal, normalmente aproximadamente 37 ºC para seres humanos, aunque en ciertas situaciones la temperatura se puede elevar o disminuir in situ o in vitro.

Normalmente, los electrolitos se aproximarán a las condiciones fisiológicas in situ, pero se pueden modificar a una resistencia iónica mayor o menor cuando sea ventajoso. Los iones reales se pueden modificar para, por ejemplo, adaptarse a los tampones estándar usados en contextos fisiológicos o analíticos.

El tamaño y la estructura del polipéptido estarán, en general, en un estado sustancialmente estable y normalmente no estará en estado desnaturalizado. El polipéptido se puede asociar con otros polipéptidos en una estructura cuaternaria para, por ejemplo, conferir solubilidad, o se puede asociar con lípidos o detergentes de un modo que aproxime las interacciones de bicapa lipídica naturales.

Normalmente, el disolvente será un tampón biológicamente compatible de un tipo usado para la conservación de actividades biológicas y normalmente se aproximará al disolvente fisiológico. Normalmente, el disolvente tendrá un pH neutro, normalmente entre aproximadamente 5 y 10, y, preferentemente, aproximadamente 7,5. En ocasiones se añadirá un detergente, normalmente uno no desnaturalizado débil, por ejemplo CHS o CHAPS, o a una concentración suficientemente baja como para evitar una alteración significativa de las propiedades estructurales o fisiológicas del antígeno.

La solubilidad está reflejada por la sedimentación medida en unidades Svedberg, que constituyen una medida de la velocidad de sedimentación de una molécula en condiciones concretas. Tradicionalmente, la determinación de la velocidad de sedimentación se ha efectuado en una ultracentrífuga analítica, pero en la actualidad se realiza habitualmente en una ultracentrífuga estándar. Véase, Freifelder (1982) Physical Biochemistry (2d ed.), W.H. Freeman; y Cantor y Schimmel (1980) Biophysical Chemistry, partes 1-3, W.H. Freeman & Co., San Francisco. Como determinación bruta, una muestra que contiene un supuesto polipéptido soluble se centrifuga en una ultracentrífuga estándar de tamaño completo a aproximadamente 50K rpm durante aproximadamente 10 minutos y las moléculas solubles permanecerán en el sobrenadante. Una partícula o polipéptido soluble será, normalmente, inferior a aproximadamente 30S, más normalmente inferior a aproximadamente 15S, habitualmente inferior a aproximadamente 10S, más habitualmente inferior a aproximadamente 6S y, en realizaciones concretas, preferentemente inferior a aproximadamente 4S y más preferentemente inferior a aproximadamente 3S.

IV. Fabricación de la proteína IL-174; Miméticos

El ADN que codifica la proteína IL-174 o fragmentos de la misma se pueden obtener mediante síntesis química, detección selectiva de bibliotecas de ADNc o mediante detección selectiva de bibliotecas genómicas preparadas a partir de una amplia variedad de líneas celulares o de muestras de tejido.

Este ADN se puede expresar en una amplia variedad de células huésped para la síntesis de una proteína de longitud completa o fragmentos que a su vez pueden usarse para, por ejemplo, generar anticuerpos policlonales o monoclonales; para estudios de unión; para construcción y expresión de moléculas modificadas; y para estudios de estructura/función. Cada antígeno o sus fragmentos se puede expresar en células huésped que se han transformado

o transfeccionado con vectores de expresión adecuados. Estas moléculas se pueden purificar sustancialmente para que estén libres de proteínas o contaminantes celulares, aparte de los derivados del huésped recombinante y, por tanto, son particularmente útiles en composiciones farmacéuticas cuando se combinan con un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. El antígeno, o porciones del mismo, se puede expresar como fusiones con otras proteínas.

Normalmente, los vectores de expresión sin construcciones de ADN o ARN autoreplicantes que contienen el gen del antígeno deseado o sus fragmentos, normalmente unido operablemente a elementos de control genético adecuados que son reconocidos en una célula huésped adecuada. Estos elementos de control pueden efectuar la expresión en un huésped adecuado. El tipo específico de elementos de control necesarios para efectuar la expresión depende de la eventual célula huésped usada. En general, los elementos de control genéticos pueden incluir un sistema de promotor procariótico o un sistema de control de la expresión promotor eucariótico y normalmente incluyen un promotor transcripcional, un operador opcional para controlar el inicio de la transcripción, potenciadores de la transcripción para elevar los niveles de expresión de ARNm, una secuencia que codifica un sitio de unión al ribosoma adecuado y secuencias que terminan la transcripción y la traducción. Asimismo, los vectores de expresión habitualmente contienen un origen de replicación que permite que el vector se replique de forma independiente de la

célula huésped. También se conocen los procedimientos para amplificar el número de copias del vector, véase, p. ej., Kaufman y col. (1985) Molec. and Cell. Biol 5:1750-1759.

Los vectores descritos en el presente documento contienen ADN que codifica una proteína de IL-174, o un fragmento de la misma, que normalmente codifica un polipéptido biológicamente activo. El ADN puede estar bajo el control de un promotor viral y puede codificar un marcador de selección. La presente invención contempla además el uso de dichos vectores de expresión que son capaces de expresar ADNc eucariótico que codifica una proteína IL174 en un huésped procariota o eucariota, en el que el vector es compatible con el huésped y en el que el ADNc eucariótico que codifica el antígeno se inserta en el vector de modo que el crecimiento del huésped que contiene el vector expresa el ADNc en cuestión. Normalmente, los vectores de expresión están diseñados para la replicación estable en sus células huésped o para amplificación para incrementar considerablemente el número total de copias del gen deseable por célula. No siempre es necesario requerir que un vector de expresión se replique en una célula huésped, por ejemplo es posible efectuar la expresión transitoria del antígeno, o sus fragmentos, en varios huéspedes usando vectores que no contienen un origen de replicación reconocido por la célula huésped. También es posible usar vectores que producen la integración de un gen de la proteína IL-174 o sus fragmentos en el ADN del huésped mediante recombinación o integrar un promotor que controle la expresión de un gen endógeno.

Los vectores, como se usan en el presente documento, comprenden plásmidos, virus, bacteriófagos, fragmentos de ADN integrables y otros vehículos que permiten la integración de fragmentos de ADN en el genoma del huésped. Los vectores de expresión son vectores especializados que contienen elementos de control genético que efectúan la expresión de genes operablemente unidos. Los plásmidos son la forma de vector más usada, pero todas las demás formas de vectores que sirven una función equivalente y que se conocen, o pasan a ser conocidos, en la técnica son adecuadas para usar en el presente documento. Véase, por ejemplo, Pouwels y col. (1985 y Suplementos) Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., y Rodriquez, y col. (eds. 1988) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, MA.

Las células transformadas incluyen células, preferentemente de mamíferos, que se han transformado o transfeccionado con vectores que contienen un gen de IL-174, construidos normalmente usando técnicas de ADN recombinante. Las células huésped transformadas normalmente expresan el antígeno o sus fragmentos, pero para fines de clonación, amplificación y manipulación de su ADN, no necesitan expresar la proteína. En el presente documento también se describe el cultivo de células transformadas en un medio nutritivo, de modo que se permite que la proteína se acumule en el cultivo. La proteína se puede recuperar del cultivo o del medio de cultivo.

Para los fines descritos en el presente documento, las secuencias de ADN están operablemente unidas cuando están funcionalmente relacionadas entre sí. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o secuencia líder secretora está operablemente unido a un polipéptido si se expresa en forma de una preproteína o participa en la dirección del polipéptido a la membrana celular o en la secreción del polipéptido. Un promotor está operablemente unido a una secuencia de codificación si controla la transcripción del polipéptido, un sitio de unión al ribosoma está operablemente unido a una secuencia de codificación si está colocado para permitir la traducción. Normalmente, operablemente unido significa contiguo y en el marco de lectura, no obstante, ciertos elementos genéticos, como los genes represores, no están unidos de forma contigua pero se siguen uniendo a las secuencias del operador que, a su vez, controlan la expresión.

Las células huésped adecuadas incluyen células procariotas, eucariotas inferiores y eucariotas superiores. Los procariotas incluyen organismos gramnegativos y grampositivos, por ejemplo E. coli y B. subtilis. Los eucariotas inferiores incluyen levaduras, por ejemplo S. cerevisiae y Pichia, y especies del género Dictyostelium. Los eucariotas superiores incluyen líneas celulares de cultivo celular establecido de células animales, tanto de origen no mamífero, por ejemplo células de insecto, y aves, como de origen mamífero, por ejemplo ser humano, primates y roedores.

Los sistemas de vector-huésped procariota incluyen una amplia variedad de vectores para muchas especies diferentes. Como se usa en el presente documento, E. coli y sus vectores se usarán genéricamente para incluir vectores equivalentes usados en otros procariotas. Un vector representativo para amplificar el ADN es pBR322 o muchos de sus derivados. Los vectores que se pueden usar para expresar las proteínas IL-174 o sus fragmentos incluyen, entre otros, vectores como los que contienen el promotor lac (serie pUC); el promotor trp (pBR322-trp); el promotor lpp (serie pIN); el promotor lambda-pP o los promotores pR (pOTS); o promotores híbridos tales como ptac (pDR540). Véase Brosius y col. (1988) "Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac-, and Ipp-derived Promoters", en Rodriguez y Denhardt (eds.) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, Capítulo 10, pp. 205-236.

Los eucariotas inferiores, por ejemplo levaduras y Dictyostelium, se pueden transformar con vectores que codifican las proteínas IL-174. Para los fines de la presente invención, el huésped eucariota inferior más frecuente es la levadura de panadero, Saccharomyces cerevisiae. Se usará para representar genéricamente eucariotas inferiores, aunque también se dispone de un número de otras cepas y especies. Habitualmente, los vectores de levadura consisten en un origen de replicación (a menos que sea del tipo de integración), un gen de selección, un promotor, ADN que codifica la proteína deseada o sus fragmentos y las secuencias para la terminación de la traducción, poliadenilación y terminación de la transcripción. Vectores de expresión adecuados para levaduras incluyen dichos promotores constitutivos, tales como 3-fosfoglicerato quinasa y otros varios promotores de genes de enzimas

glicolíticas o promotores inducibles tales como el promotor de la alcohol deshidrogenasa 2 o el promotor de la metalotionina. Vectores adecuados incluyen derivados de los tipos siguientes: número de copias bajo de autoreplicantes (tal como la serie YRp), número de copias alto de autoreplicantes (tal como la serie YEp); tipos de integración (tal como la serie Ylp) o minicromosomas (tal como la serie YCp).

Células de cultivo tisular de eucariotas superiores son las células huésped preferidos para la expresión de la proteína IL-170 funcionalmente activa. En principio, se puede trabajar con muchas líneas celulares de cultivo tisular de eucariotas superiores, por ejemplo sistemas de expresión baculovirus de insecto, ya sea de una fuente invertebrada o vertebrada. No obstante, se prefieren las células de mamífero, en cuanto al procesamiento, tanto cotraduccionalmente como postraduccionalmente. La transformación o transfección y propagación de dichas células se ha convertido en un procedimiento de rutina. Ejemplos de líneas celulares útiles incluyen células HeLa, líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO), líneas de células de riñón de rata neonata (BRK), líneas celulares de insecto, líneas celulares de ave y líneas celulares de mono (COS). Los vectores de expresión para dichas líneas celulares normalmente incluyen un origen de replicación, un promotor, un sitio de iniciación de la traducción, sitios de corte y empalme de ARN (si se usa ADN genómico), u sitio de poliadenilación y un sitio de terminación de la transcripción. Normalmente estos vectores contienen un gen de selección o un gen de amplificación. Los vectores de expresión adecuados pueden ser plásmidos, virus o retrovirus portadores de promotores derivados de, por ejemplo, fuentes tales como adenovirus, SV40, parvovirus, virus variolovacunal o citomegalovirus. Ejemplos representativos de vectores de expresión adecuados incluyen pCDNA1: pCD, veáse Okayama, y col. (1985) Mol. Cell Biol. 5:1136-1142; pMClneo Poly-A, véase Thomas, y col. (1987) Cell 51:503-. 512; y un vector baculovirus tal como pAC 373 o pAC 610, véase O’Reilly, y col. (1992) Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual Freeman and Co., CRC Press, Boca Raton, Fla.

A menudo se desea expresar un polipéptido de la proteína IL-174 en un sistema que proporciona un patrón de glicosilación específico o definido. En este caso, el patrón habitual será el proporcionado de forma natural por el sistema de expresión. No obstante, el patrón se podrá modificar mediante exposición del polipéptido, por ejemplo una forma no glicosilada, a proteínas de glicosilación adecuadas introducidas en un sistema de expresión heterólogo. Por ejemplo, el gen de la proteína IL-174 se puede co-transformar con uno o más genes que codifican enzimas de glicosilación de mamífero o de otros. Usando este enfoque, se conseguirán ciertos patrones de glicosilación de mamífero o se aproximarán en células procariotas o de otro tipo.

La proteína IL-174, o un fragmento de la misma, se puede someter a ingeniería para unirse mediante fosfatidilinositol (PI) a una membrana celular, pero se puede retirar de las membranas mediante tratamiento con una enzima de escisión del fosfatidil inositol, por ejemplo fosfatidil inositol fosfolipasa C. Esto libera el antígeno en una forma biológicamente activa y permite la purificación mediante procedimientos estándar de química proteica. Véase, por ejemplo, Low (1989) Biochim. Biophys. Acta 988:427-454; Tse, y col. (1985) Science 230:1003-1008; y Brunner, y col. (1991) J. Cell Biol. 114:1275-1283.

Una vez que se ha caracterizada la proteína IL-174, se pueden preparar fragmentos o derivados de la misma mediante procedimientos convencionales para sintetizar péptidos. Estos incluyen procedimientos como los descritos en Stewart y Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Bodanszky y Bodanszky (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York; y Bodanszky (1984) The Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York. Por ejemplo, un proceso con azida, un proceso con cloruro ácido, un proceso con anhídrido ácido, un proceso con anhídrido mixto, un proceso con éster activo (p. ej., éster de pnitrofenilo, éster N-hidroxisuccinimida o éster de cianometilo), un proceso con carbodiimidazol, un proceso de oxidación-reducción, o un proceso con diciclohexilcarbodiimida (DCCD)/aditivo. Las síntesis de fase sólida y de fase en solución son ambas aplicables a los procesos anteriores.

La proteína IL-174, fragmentos o derivados se preparan adecuadamente de acuerdo con los procedimientos anteriores, como habitualmente se emplean en la síntesis peptídica, generalmente mediante un denominado procedimiento escalonado que comprende condensar un aminoácido con el aminoácido terminal, uno por uno en secuencia, o acoplando fragmentos peptídicos al aminoácido terminal. Los grupos amino que no se están usando en la reacción de acoplamiento normalmente están protegidos para evitar el acoplamiento en una localización incorrecta.

Si se adopta una síntesis de fase sólida, el aminoácido en el extremo C se une a un vehículo o soporte insoluble a través de su grupo carboxilo. El vehículo insoluble no está particularmente limitado, siempre que tenga capacidad de unión a un grupo carboxilo reactivo. Ejemplos de dichos vehículos insolubles incluyen resinas de halometilo, tales como la resina de clorometilo o resina de bromometilo, resinas de hidroximetilo, resinas de fenol, resinas tercalquiloxicarbonilhidrazidadas y similares.

Un aminoácido protegido por el grupo amino se une en secuencia mediante condensación de su grupo carboxilo activado y el grupo amino reactivo del péptido o cadena previamente formados, para sintetizar el péptido etapa por etapa. Después de sintetizar la secuencia completa, el péptido de suelta del vehículo insoluble para producir el péptido. Este enfoque en fase sólida se describe, en genera, en Merrifield y col. (1963) in J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156.

La proteína preparada y fragmentos de la misma se puede aislar y purificar en la mezcla de reacción por medio de separación peptídica, por ejemplo mediante extracción, precipitación, electroforesis y varias formas de cromatografía y similares. Las proteínas IL-174 descritas en el presente documento se pueden obtener en varios grados de pureza en función de su uso deseado. La purificación se puede realizar mediante el uso de técnicas de purificación proteica divulgadas en el presente documento o mediante el uso de los anticuerpos descritos en el presente documento en cromatografía de afinidad inmunoabsorbente, Esta cromatografía de afinidad inmunoabsorbente se lleva a cabo uniendo primero los anticuerpos a un soporte sólido y, después, poniendo en contacto los anticuerpos unidos con lisados solubilizados de células fuente adecuadas, lisados de otras células que expresan la proteína o lisados o sobrenadantes de células productoras de la proteína IL-174 como resultado de las técnicas de ADN, véase más adelante.

V. Variantes físicas

Las proteínas o péptidos que tienen una homología sustancia de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la proteína IL-174 también se describen en el presente documento. Las variantes incluyen especies

o variantes alélicas.

La homología de la secuencia de aminoácidos, o identidad de secuencia, se determina optimizando los apareamientos de residuos, en caso necesario introduciendo huecos según se requiera. Esto cambia al considerar las sustituciones conservadoras como coincidencias. Normalmente, las sustituciones conservadoras incluyen sustituciones dentro de los grupos siguientes: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. Normalmente, con las secuencias de aminoácidos homólogas se pretenden incluir variaciones naturales alélicas e interespecies en cada respectiva secuencia de proteínas. Las proteínas o péptidos homólogos típicos tendrán una homología del 25-100 % (si se pueden introducir huecos) a una homología del 50-100 % (si se incluyen sustituciones conservadoras) con la secuencia de aminoácidos de la proteína IL-170. Las medidas de homología serán, al menos, aproximadamente 35 %, generalmente al menos 40 %, más generalmente al menos 45 %, a menudo al menos 50 %, más a menudo al menos 55 %, normalmente al menos 60 %, más normalmente al menos 65 %, normalmente al menos 70 %, más normalmente al menos 75 %, preferentemente al menos 80 % y, más preferentemente, al menos 80 %, y, en realizaciones particularmente preferidas, al menos 85 % o más. Véase también Needleham y col. (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; Sankoff, y col. (1983) Capítulo uno en Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison Addison-Wesley, Reading, MA; y paquetes de software de IntelliGenetics, Mountain View, CA; y la University of Wisconsin Genetics Computer Group, Madison, WI.

El ADN aislado que codifica una proteína IL-174 se puede modificar fácilmente mediante sustituciones de nucleótidos, deleciones de nucleótidos, inserciones de nucleótidos e inversiones de tiras de nucleótidos. Estas modificaciones tienen como resultado nuevas secuencias de ADN que codifican estos antígenos, sus derivados o proteínas que tienen actividad fisiológica, inmunogénica o antigénica. Estas secuencias modificadas se pueden usar para producir antígenos mutantes o para potenciar la expresión. La expresión potenciada puede implicar amplificación génica, incremento de la transcripción, incremento de la traducción y otros mecanismos. Dichos derivados de proteína IL-174 mutantes incluyen mutaciones predeterminadas o específicas de sitio de la respectiva proteína o sus fragmentos. “Proteína IL-174 mutante” abarca un polipéptido que, de otro modo, entra dentro de la definición de homología de la proteína IL-174 murina o IL-174 humana como se ha indicado anteriormente, pero que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la de la proteína IL-174 que se encuentra en la naturaleza, por deleción, sustitución o inserción. En particular, “proteína IL-174 mutante específica de sitio” generalmente incluye proteínas que tienen una homología significativa con la correspondiente proteína que tiene secuencias de la Tabla 3 y que comparten varias actividades biológicas, por ejemplo antigénica o inmunogénica, con dichas secuencias y, en realizaciones preferidas, contienen la mayoría de las secuencias divulgadas. Conceptos similares se aplican a diferentes proteínas IL-174, particularmente las que se encuentran en varios animales de sangre caliente, por ejemplo mamíferos y aves. Como se ha indicado anteriormente, se subraya que, en general, con las descripciones se quiere abarcar todas las proteínas IL-174, no limitadas a la realización en ratón tratada específicamente.

Aunque los sitios de mutación específica de sitio están predeterminados, los mutantes no tienen que ser específicos de sitio. La mutagénesis de la proteína IL-174 se puede realizar efectuando inserciones o deleciones de aminoácidos. Se pueden generar sustituciones, deleciones, inserciones o cualquier combinación para llegar a una construcción final. Inserciones incluyen fusiones de amino o carboxi-terminales. Se puede realizar mutagénesis aleatoria en un codón diana y los mutantes expresados se pueden someter a detección selectiva para detectar la actividad deseada. Procedimientos para realizar mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en el ADN que tienen una secuencia conocida son bien conocidos en la técnica, por ejemplo mediante técnicas de mutagénesis con cebador M13 o reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Véase también Sambrook y col. (1989) y Ausubel, y col. (1987 y Suplementos).

Normalmente, las mutaciones en el ADN no deberían colocar secuencias de codificación fuera del marco de lectura y, preferentemente, no crearán regiones complementarias que podrían hibridar para producir la estructura secundaria del ARNm, tales como bucles u horquillas.

En el presente documento también se describen proteínas recombinantes, por ejemplo proteínas de fusión

heterólogas usando segmentos de estas proteínas.

Una proteína de fusión heteróloga es una fusión de proteínas o segmentos que en la naturaleza no están fusionadas normalmente del mismo modo. Por tanto, el producto de fusión de una inmunoglobulina con un polipéptido de IL-174 es una molécula proteica continua que tiene secuencias fusionadas en un enlace peptídico típico, normalmente preparada como un producto de traducción único y que exhibe propiedades derivadas de cada péptido fuente. Un concepto similar se aplica a las secuencias de ácido nucleico heterólogas.

Además, se pueden fabricar nuevas construcciones a partir de combinar dominios funcionales similares de otras proteínas. Por ejemplo, la unión a antígeno u otros segmentos se pueden “barrer” entre diferentes polipéptidos o fragmentos de fusión nuevos Véase, por ejemplo, Cunningham y col. (1989) Science 243:1330-1336; y O’Dowd, y col. (1988) J. Biol. Chem. 263:15985-15992. Por tanto, nuevos polipéptidos quiméricos que exhiben nuevas combinaciones de especificidades serán el resultado del enlace funcional de dominios biológicamente relevantes y otros dominios funcionales.

El procedimiento de fosforoamidita descrito por Beaucage y Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22:1859-1862, producirá fragmentos de ADN sintético adecuados. Un fragmento bicatenario a menudo se obtendrá mediante síntesis de la hebra complementaria y la hibridación de la hebra en las condiciones adecuadas o mediante adición de la hebra complementaria usando ADN polimerasa con una secuencia cebadora adecuada, por ejemplo técnicas de PCR.

VI. Variantes funcionales

El bloqueo de la respuesta fisiológica a las proteínas IL-174 puede ser el resultado de la inhibición de la unión del antígeno a su pareja de unión natural mediante, por ejemplo, inhibición competitiva. Por tanto, los ensayos in vitro de acuerdo con la presente invención a menudo usarán proteínas aisladas, membranas de células que expresan una proteína IL-174 recombinante asociada con la membrana, fragmentos solubles que comprenden los segmentos de unión a ligando o fragmentos unidos a sustratos de fase sólida. Estos ensayos también permitirán la determinación diagnóstica de los efectos de mutaciones y modificaciones de los segmentos de unión, o mutaciones y modificaciones de proteínas, por ejemplo análogos.

En el presente documento también se describe el uso de ensayos competitivos de detección selectiva de fármacos, por ejemplo en los que los anticuerpos neutralizantes frente a antígeno o fragmentos parejas de unión compiten con un compuesto de prueba para la unión a la proteína. De este modo, los anticuerpos se pueden usar para detectar la presencia de cualquier polipéptido que comparta uno o más sitios de unión antigénica de la proteína y también se pueden usar para ocupar sitios de unión en la proteína que, de otro modo, podrían interaccionar con una pareja de unión.

Adicionalmente, los anticuerpos neutralizantes frente la proteína IL-174 y fragmentos solubles del antígeno que contienen un sitio de unión al receptor de alta afinidad se pueden usar para inhibir la función antigénica en tejidos, por ejemplo tejidos que experimenta fisiología anormal.

“Derivados” de los antígenos de IL-174 incluyen mutantes de la secuencia de aminoácidos, variantes de glicosilación y conjugados covalentes o agregados con otros restos químicos. Derivados covalentes se pueden preparar mediante unión de funcionalidades a grupos que se encuentran en las cadenas laterales de aminoácidos de IL-174 o en los extremos N o C por medios que son bien conocidos en la técnica. Estos derivados pueden incluir, sin limitaciones, ésteres alifáticos o amidas del extremo carboxilo o de residuos que contienen cadenas laterales de carboxilo, derivados O-acilo de residuos que contienen grupos hidroxilo y derivados N-acilo del aminoácido aminoterminal o residuos que contienen grupos amino, por ejemplo lisina o arginina. Los grupos acilo se seleccionan del grupo de restos alquilo, incluido el alquilo normal de C3 a C18, de modo que se forman especies de alcanoilaroílo. La unión covalente a proteínas vehículo puede ser importante cuando los restos inmunogénicos son haptenos.

En particular se incluyen alteraciones de glicosilación hechas, por ejemplo, modificando los patrones de glicosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento, o en etapas de procesamiento adicionales. Medios particularmente preferidos para conseguir esto son mediante la exposición del polipéptido a enzimas de glicosilación derivadas de células que normalmente proporcionan dicho procesamiento, por ejemplo enzimas de glicosilación de mamífero. También se contemplan las enzimas de desglicosilación. También se abarcan versiones de la misma secuencia de aminoácidos primaria que tienen otras modificaciones menores, incluidos residuos de aminoácidos fosforilados, por ejemplo fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina.

Un grupo mayoritario de derivados son conjugados covalentes de la proteína de IL-174 o fragmentos de la misma con otras proteínas o polipéptidos. Estos derivados se pueden sintetizar en cultivos recombinantes, tales como fusiones en N o C terminal, o mediante el uso de agentes conocidos en la técnica por su utilidad en las proteínas de reticulación a través de grupos laterales reactivos. Los sitios de derivación antigénica preferidos con agentes de reticulación están en los grupos amino libres, restos hidratos de carbono y residuos de cisteína.

Los polipéptidos de fusión entre las proteínas IL-174 y otras proteínas homólogas o heterólogas también se describen. Los polipéptidos homólogos pueden ser fusiones entre diferentes marcadores de superficie, lo que tiene como resultado, por ejemplo, una proteína híbrida que exhibe especificidad de unión al receptor. Asimismo, las

fusiones heterólogas se pueden construir de modo que exhiban una combinación de propiedades o actividades de las proteínas derivadas. Ejemplos típicos son fusiones de un polipéptido indicador, por ejemplo luciferasa, con un segmento o dominio de un antígeno, por ejemplo un segmento de unión al receptor, de modo que se puede determinar fácilmente la presencia o localización del antígeno fusionado. Véase, por ejemplo, Dull, y col., patente de EE.UU. nº 4.859.609. Otras parejas de fusión génica incluyen ß-galactosidasa bacteriana, trpE, Proteína A, ßlactamasa, alfa amilasa, alcohol deshidrogenasa y factor de apareamiento alfa de levaduras. Véase, por ejemplo, ., Godowski y col. (1988) Science 241:812-816.

El procedimiento de fosforoamidita descrito por Beaucage y Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22:1859-1862, producirá fragmentos de ADN sintético adecuados. Un fragmento bicatenario a menudo se obtendrá mediante síntesis de la hebra complementaria y la hibridación de la hebra en las condiciones adecuadas o mediante adición de la hebra complementaria usando ADN polimerasa con una secuencia cebadora adecuada.

Dichos polipéptidos pueden también tener residuos aminoácidos que se han modificado químicamente mediante fosforilación, sulfonación, biotinilación o la adición o eliminación de otros restos, particularmente los que tienen formas moleculares similares a los grupos fosfato. En algunas realizaciones, las modificaciones serán reactivos de marcaje útiles o servirán como dianas de purificación, por ejemplo ligandos de afinidad.

Normalmente, las proteínas de fusión se pueden fabricar mediante procedimientos de ácido nucleico recombinante o mediante procedimientos de polipéptido sintéticos. Las técnicas para la manipulación y expresión de ácido nucleico se describen, en general, en, por ejemplo, Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning; A Laboratory Manual (2ª ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory. Las técnicas para la síntesis de polipéptidos se describen en, por ejemplo, Merrifield (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2156; Merrifield (1986) Science 232: 341-347; y Atherton, y col. (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford.

El uso de derivados de las proteínas IL-174 aparte de las variaciones en la secuencia de aminoácidos o glicosilación también se describen en el presente documento. Dichos derivados pueden implicar la asociación covalente o agregada con restos químicos. En general, estos derivados entran dentro de las tres clases: (1) sales, (2) modificaciones covalentes en residuos terminales y en la cadena lateral, y (3) complejos de adsorción, por ejemplo con membranas celulares. Dichos derivados covalentes o agregados son útiles como inmunógenos, como reactivos en inmunoensayos o en procedimientos de purificación, tal como para purificación por afinidad de antígenos u otras proteínas de unión. Por ejemplo, un antígeno de IL-754 se puede inmovilizar mediante unión covalente a un soporte sólido, tal como sefarosa activada por bromuro de cianógeno, mediante procedimientos que son bien conocidos en la técnica, o adsorberse sobre superficies de poliolefina, con o sin reticulación con glutaraldehído, para usar en el ensayo o purificación de anticuerpos proteicos anti-IL-174 o su receptor u otra pareja de unión. Los antígenos de IL174 también se pueden marcar con un grupo detectable, por ejemplo radioyodado mediante el procedimiento de cloramina T, unirse de forma covalente a quelatos de tierras raras o conjugado con otro resto fluorescente para uso en ensayos diagnósticos. La purificación de la proteína IL-174 se puede efectuar mediante anticuerpos inmovilizados

o parejas de unión.

Un antígeno de IL-174 solubilizado o fragmento descrito en el presente documento se puede usar como inmunógeno para la producción de antisueros o anticuerpos específicos de la proteína o fragmentos de los mismos. El antígeno purificado se puede usar para detectar anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión preparados mediante inmunización con varias formas de preparaciones impuras que contienen la proteína. En particular, el término “anticuerpos” también abarca fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos naturales. Las proteínas IL-174 purificadas también se pueden usar como reactivo para detectar cualquier anticuerpo generado en respuesta a la presencia de niveles elevados de la proteína o fragmentos celulares que contienen el antígeno, ambos pueden ser diagnósticos de una enfermedad o afección fisiológica anormal o específica. Adicionalmente, los fragmentos de antígeno pueden servir como inmunógenos para producir los anticuerpos de la presente invención, como se describe inmediatamente más adelante. Por ejemplo, la presente invención contempla anticuerpos producidos contra secuencias de aminoácidos codificadas por secuencias de nucleótidos mostradas en la Tabla 3, o fragmentos de proteínas que las contienen. En particular, la presente invención contempla anticuerpos que tienen afinidad de unión

o que se van a producir contra fragmentos específicos que se ha predicho que están fuera de la bicapa lipídica.

El aislamiento de variantes de especies estrechamente relacionadas adicionales también se describe en el presente documento. El análisis de transferencia southern estableció que existen entidades genéticas similares en otros mamíferos, por ejemplo ratas y seres humanos. Es probable que las proteínas IL-174 estén extendidas en las variantes de especies, por ejemplo roedores, lagomorfos, carnívoros, artiodáctilos, perisodáctilos y primates.

En el presente documento también se describen medios para aislar un grupo de antígenos relacionados que muestran diferencias y similitudes en la estructura, la expresión y la función. La elucidación de muchos de los efectos fisiológicos de los antígenos se acelerará considerablemente mediante el aislamiento y caracterización de distintas variantes de especies. En particular, en el presente documento se describen sondas útiles para identificar entidades genéticas homólogas en diferentes especies.

Los genes aislados permitirán la transformación de las células que carecen de expresión de una correspondiente proteína IL-174, por ejemplo tipos de especies o células que carecen de los correspondientes antígenos y deberán

exhibid actividad de fondo negativa. La expresión de genes transformados permitirá el aislamiento de líneas celulares antigénicamente puras, con variantes de una especie o definidas. Este enfoque permitirá la detección más sensible y la discriminación de los efectos fisiológicos de las proteínas IL-174. Fragmentos subcelulares, por ejemplo citoplastos o fragmentos de membrana, se pueden aislar y usar.

La disección de los elementos estructurales críticos que efectúan las diversas funciones fisiológicas o de diferenciación proporcionadas por las proteínas es posible usando técnicas estándar de biología molecular moderna, particularmente en la comparación de miembros de la clase relacionada. Véase, por ejemplo, la técnica de la mutagénesis de barrido de homólogos descrita en Cunningham y col. (1989) Science 243:1339-1336; y los enfoques usados en O’Dowd, y col. (1988) J. Biol. Chem. 263:15985-15992; y Lechleiter, y col. (1990) EMBO J. 9:4381-4390.

En particular, los dominios o segmentos funcionales se pueden sustituir entre variantes de especies para determinar qué características estructurales son importantes en la afinidad y la especificidad de la pareja de unión, así como la transducción de señal. Una matriz de variantes diferentes se usará para seleccionar moléculas que exhiben propiedades combinadas de interacción con diferentes variantes de especies de parejas de unión.

En ciertas circunstancias se puede producir internalización del antígeno y se puede producir interacción entre componentes intracelulares y segmentos “extracelulares” de proteínas implicadas en las interacciones. Los segmentos específicos de interacción de la proteína IL-174 con otros componentes intracelulares se pueden identificad mediante mutagénesis o medios bioquímicos directos, por ejemplo procedimientos de reticulación o de afinidad. También será aplicable el análisis de la estructura mediante procedimientos cristalográficos u otros procedimientos físicos. La investigación adicional del mecanismo de la función biológica incluirá el estudio de componentes asociados que pueden aislarse mediante procedimientos de afinidad o por medios genéticos, por ejemplo análisis por complementación de los mutantes.

Se efectuará el estudio adicional de la expresión y el control de la proteína IL-174. Los elementos de control asociados con los antígenos pueden exhibir desarrollo diferencial, específico de tejido u otros patrones de expresión. Las regiones genéticas anteriores o posteriores, por ejemplo elementos de control, son de interés.

Estudios estructurales del antígeno conducirán al diseño de nuevas variantes, particularmente análogos que exhiben propiedades de agonismo o de antagonismo sobre las parejas de unión. Esto se puede combinar con procedimientos de deyección selectiva descritos previamente para aislar las variantes que exhiben espectros de actividades deseados.

La expresión en otros tipos de células a menudo tendrá como resultado diferencias de glicosilación en un antígeno concreto. Varias variantes de especies pueden exhibir distintas funciones basadas en diferencias estructurales a parte de la secuencia de aminoácidos. Las modificaciones diferenciales pueden ser responsables de la función diferencial y ahora es posible la elucidación de los efectos.

Por tanto, en el presente documento se describen importantes reactivos relacionados con la interacción antígenopareja de unión. Aunque la descripción anterior se ha centrado principalmente en la proteína IL-174 murina e IL-174 humana, los expertos en la técnica reconocerán inmediatamente que la invención abarca otros antígenos, por ejemplo especies de ratón y de otros mamíferos o variantes alélicos, así como variantes de los mismos.

VII. Anticuerpos

Se pueden producir anticuerpos frente a las proteínas IL-174, incluidas las especies y las variantes alélicas, y fragmentos de las mismas, tanto en sus formas naturales como en sus formas recombinantes. Adicionalmente, se pueden producir anticuerpos frente a las proteínas IL-174 bien en sus formas activas como en sus formas inactivas. También se contemplan los anticuerpos antiidiotípicos.

Se pueden producir anticuerpos, incluidos fragmentos de unión y versiones monocatenarias, contra fragmentos predeterminados de los antígenos, mediante inmunización de animales con conjugados de los fragmentos con proteínas inmunogénicos. Los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de células que secretan el anticuerpo deseado. Estos anticuerpos se pueden seleccionar por la unión de proteínas IL-174 normales o defectivas o se pueden seleccionar por la actividad agonista o antagonista, por ejemplo mediada a través de una pareja de unión. Normalmente, estos anticuerpos monoclonales se unirán con al menos una KD de aproximadamente 1 µM, más normalmente de al menos aproximadamente 300 µM, habitualmente de al menos aproximadamente 10 µM, más habitualmente de al menos aproximadamente 30 µM, preferentemente de al menos aproximadamente 10 µM, y más preferentemente de al menos aproximadamente 3 µM, o mejor.

Un polipéptido de IL-174 que se une específicamente o que es específicamente inmunorreactivo con un anticuerpo, tal como, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, generado contra un inmunógeno definido, tal como, por ejemplo, un inmunógeno que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 14 madura o fragmentos de los mismos o un polipéptido generado del ácido nucleico de la SEC ID Nº 13 normalmente se determina en un inmunoensayo. Incluidos dentro de las medidas y límites de la presente invención son las secuencias de ácido nucleico que se describen en el presente documento, incluidas variantes funcionales, que codifican polipéptidos que se unen de forma selectiva a anticuerpos policlonales generados contra el polipéptido de IL-174 prototipo tal como

se ha definido estructural y funcionalmente en el presente documento.

Habitualmente, el inmunoensayo usa un antisuero policlonal que se ha producido, por ejemplo, frente a una proteína de la SEC ID Nº 14. Este antisuero se selecciona de modo que tenga reactividad cruzada contra otros miembros adecuados de la familia de IL-170, preferentemente de la misma especie, y tal reactividad cruzada se elimina mediante inmunoabsorción antes de usar en el inmunoensayo. Las preparaciones adecuadas de suero selectivo se pueden aislar y caracterizar.

Con el fin de producir antisueros para usar en un inmunoensayo, la proteína de la SEC ID Nº 14 se aísla tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo, la proteína recombinante se puede producir en una línea de células de mamífero. Un huésped adecuado, por ejemplo una cepa endogámica de ratones, tal como Balb/c, se inmuniza con la proteína de SEC ID Nº 14 usando un adyuvante convencional, tal como adyuvante de Freund, y un protocolo de inmunización de ratones estándar (véase Harlow and Lane). Como alternativa se puede usar un inmunógeno un péptido sintético de longitud sustancialmente completa derivado de las secuencias divulgadas en el presente documento. Los sueros policlonales se recogen y titulan contra la proteína inmunógena en un inmunoensayo, por ejemplo un inmunoensayo de fase sólida con el inmunógeno inmovilizado sobre un soporte sólido. Los antisueros policlonales con un título de 104 o mayor se seleccionan y analizan según su reactividad cruzada contra otros miembros de la familia de IL-170, por ejemplo IL-171, IL-172 o IL-175, usando un inmunoensayo de unión competitiva tal como el descrito en Harlow y Lane, ant., en las páginas 570-573. Preferentemente, al menos dos miembros de la familia de IL-170 se usan en esta determinación junto con la diana. Estos miembros de la familia de IL-170 se pueden producir como proteínas recombinantes y aislar usando biología molecular estándar y técnicas de química proteica como se describe en el presente documento. Por tanto, se pueden identificar o producir preparaciones de anticuerpos que tienen la selectividad o especificidad deseada por IL

174.

Los inmunoensayos en el formato de unión competitiva se pueden usar para las determinaciones de la reactividad cruzada. Por ejemplo, la proteína de la SEC ID Nº 14 se puede inmovilizar sobre un soporte sólido. Las proteínas añadidas al ensayo compiten con la unión de los antisueros frente al antígeno inmovilizado, La capacidad de las proteínas anteriores para competir con la unión de los antisueros a la proteína inmovilizada se compara con la proteína de la SEC ID Nº 14. El porcentaje de reactividad cruzada para las proteínas anteriores se calcula usando cálculos convencionales. Se seleccionan y combinan los antisueros con una reactividad cruzada inferior al 10 % con cada una de las proteínas enumeradas anteriormente. Después, los anticuerpos transreactivos se retiran de los antisueros combinados mediante inmunoabsorción con las proteínas enumeradas anteriormente.

Los antisueros inmunoabsorbidos y combinados se usan en un inmunoensayo de unión competitiva como se ha descrito anteriormente para comparar una segunda proteína con la proteína inmunógena. Con el fin de realizar esta comparación, las dos proteínas se someten a ensayo en un amplio abanico de concentraciones y se determina la cantidad de cada proteína requerida para inhibir el 50 % de la unión de los antisueros frente a la proteína inmovilizada. Si la cantidad de la segunda proteína requerida es inferior a dos veces la cantidad de la proteína, por ejemplo la SEC ID Nº 14 que se requiere, se dice que la segunda proteína se une específicamente a un anticuerpo generado frente al inmunógeno.

Los anticuerpos, incluidos los fragmentos de unión a antígeno, de la presente invención pueden tener valor diagnóstico o terapéutico significativo. Pueden ser potentes antagonistas que se unen a una pareja de unión e inhiben la unión al antígeno o inhiben la capacidad de un antígeno para producir una respuesta biológica. También pueden ser útiles como anticuerpos no neutralizantes y se pueden acoplar a toxinas o radionúclidos, de modo que cuando el anticuerpo se une al antígeno una célula que lo expresa, por ejemplo sobre su superficie, muere. Además, estos anticuerpos se pueden conjugar con fármacos u otros agentes terapéuticos, bien directa o indirectamente, por medio de un ligador, y pueden dirigir los fármacos.

Los anticuerpos de la presente invención también pueden ser útiles en aplicaciones diagnósticas. Como anticuerpos de captura o no neutralizantes se pueden seleccionar por su capacidad para unirse a los antígenos sin inhibir la unión por una pareja. Como anticuerpos neutralizantes pueden ser útiles en ensayos de unión competitiva. Asimismo serán útiles en la detección o cuantificación de la proteína IL-174 o sus parejas de unión. Véase, por ejemplo, Chan (ed. 1987) Immunoassay A Practical Guide Academic Press, Orlando, Fla.; Ngo (ed. 1988) Nonisotopic Immunoassay Plenum Press, NY: y Price and Newman (eds. 1991) Principles and Practice of Immunoassay Stockton Press, NY.

Los fragmentos de antígeno se pueden unir a otros materiales, particularmente polipéptidos, como polipéptidos fusionados o unidos covalentemente para usar como inmunógenos. Un antígeno o sus fragmentos se pueden fusionar o unir covalentemente a una variedad de inmunógenos, tales como hemocianina de larva californiana, seroalbúmina bovina, toxoide del tétanos, etc. Véase Microbiology, Hoeber Medical Division, Harper y Row, 1969; Landsteiner (1962) Specificity of Serological Reactions, Dover Publications, New York, and Williams, y col. (1967) Methods in Immunology and Immmochemistry, Vol. 1, Academic Press, New York, para descripciones de los procedimientos de preparación de antisueros policlonales. Un procedimiento típico implica hiperinmunización de un animal con un antígeno. A continuación se extrae la sangre del animal poco después de las inmunizaciones repetidas y se aísla la gamma globulina.

En algunos casos, es deseable preparar anticuerpos monoclonales de varios huéspedes de mamífero, tales como ratones, roedores, primates, seres humanos etc. La descripción de técnicas para preparar dichos anticuerpos monoclonales se puede encontrar en, por ejemplo, Stites, y col. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4ª ed.), Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y las referencias citadas en el mismo, Harlow y Lane (1988) Antibodies : A Laboratory Manual, CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2ª ed.) Academic Press, New York; y particularmente en Kohler y Milstein (1975) en Nature 256: 495-497, que trata un procedimiento de generar anticuerpos monoclonales. En resumen, este procedimiento implica inyectar un animal con un inmunógeno. Después, se sacrifica al animal y se extraen células del bazo, que después se fusionan con células de mieloma. El resultado es una célula híbrida o “hibridoma” que es capaz de reproducirse in vitro. La población de hibridomas se selecciona después para aislar clones individuales, cada uno de los cuales secreta una única especie de anticuerpo frente al inmunógeno. De este modo, la especie de anticuerpo individual obtenida son los productos de células B únicas inmortalizadas y clonadas del animal inmune generado en respuesta a un sitio específico reconocido sobre la sustancia inmunogénica.

Otras técnicas adecuadas implican la exposición in vitro de los linfocitos frente a polipéptidos antigénicos o, como alternativa, a la selección de bibliotecas de anticuerpos en fagos o vectores similares. Véase Huse y col. (1989) "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda," Science 246:1275-1281; y Ward, y col. (1989) Nature 341:544-546. Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención se pueden usar con o sin modificación, incluidos los anticuerpos quiméricos o humanizados. Con frecuencia, los polipéptidos y anticuerpos se marcan uniéndolos, bien covalente o no covalentemente, una sustancia que proporciona una señal detectable. Se conocen una amplia variedad de marcadores y técnicas de conjugación y se han publicado extensamente en la literatura científica y de patentes. Marcadores adecuadas incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, restos fluorescentes, restos quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Entre las patentes que enseñan el uso de estos marcadores se incluyen las patentes nº 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; y 4.366.241. Asimismo, se pueden producir inmunoglobulinas recombinantes, véase Cabilly, patente de EE.UU. nº 4.816.567.

Los anticuerpos descritos en el presente documento también se pueden usar para cromatografía de afinidad en el aislamiento de la proteína. Se pueden preparar columnas en las que los anticuerpos se unen a un soporte sólido, por ejemplo partículas, tales como agarosa, Sephadex o similares, en las que un lisado celular se puede pasar a través de la columna, se lava la columna, seguido de concentraciones crecientes de un desnaturalizante débil, de modo que se liberará la proteína IL-174 purificada.

Los anticuerpos también se pueden usar para realizar detección selectiva en bibliotecas de expresión de productos de expresión concretos. Normalmente, los anticuerpos usados en dicho procedimiento se marcarán con un resto que permita la fácil detección de la presencia del antígeno mediante la unión del anticuerpo.

Los anticuerpos producidos contra la proteína IL-174 también serán útiles para producir anticuerpos antiidiotípicos. Estos serán útiles para detectar o diagnosticar varias afecciones inmunológicas relacionadas con la expresión de los respectivos antígenos.

VIII. Usos

En el presente documento se describen reactivos que encontrarán utilidad en aplicaciones diagnósticas, como se describe en otro lugar del presente documento, por ejemplo en la descripción general de anomalías fisiológicas o del desarrollo, o más adelante en la descripción de los kit para diagnóstico.

En el presente documento se describen reactivos con un valor terapéutico significativo. La proteína IL-174 (natural o recombinante), fragmentos de la misma, y anticuerpos de la misma, junto con compuestos identificados porque tienen una afinidad de unión a la proteína IL-174, deberán ser útiles en el tratamiento de compuestos asociadas con la fisiología o el desarrollo anormal, incluida la proliferación anormal, por ejemplo afecciones cancerosas o afecciones degenerativas. La proliferación anormales, regeneración, degeneración y atrofia pueden modularse mediante tratamiento terapéutico adecuado usando las composiciones que se proporcionan en el presente documento. Por ejemplo, una enfermedad o trastorno asociado con la expresión anormal o señalización anormal por un antígeno de IL-174 deberá ser una diana probable para un agonista o antagonista de la proteína.

Otras afecciones del desarrollo anormal se conocen en los tipos de células que se ha mostrado que poseen el ARNm del antígeno de IL-174 mediante análisis de transferencia Northern. Véase Berkow (ed.) The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck & Co., Rahway, N.J.; y Thorn, y col. Harrison’s Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, N.Y. Estos problemas pueden ser susceptibles a la prevención o tratamiento usando las composiciones proporcionadas en el presente documento.

Se pueden purificar anticuerpos recombinantes que se unen a IL-174 y después se administran a un paciente. Estos reactivos se pueden combinar para uso terapéutico con ingredientes activos o inertes adicionales, por ejemplo en vehículos o diluyentes convencionales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo adyuvantes inmunogénicos, junto con estabilizantes y excipientes fisiológicamente inocuos. Estas combinaciones se pueden esterilizar mediante filtración e introducir en formas de dosificación, como mediante liofilización en viales de dosificación, o almacenar en

preparaciones acuosas estabilizadas. La presente invención también contempla el uso de anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos, incluidas formas que no complementan la unión.

Se puede realizar detección selectiva usando IL-174 para parejas de unión o compuestos que tienen afinidad de unión al antígeno de IL-174, incluido el aislamiento de componentes asociados. Después se pueden usar posteriores ensayos biológicos para determinar si el compuesto tiene actividad biológica intrínseca y, por tanto, es un agonista o antagonista en cuanto a que bloquea una actividad del antígeno. La presente invención contempla además el uso terapéutico de los anticuerpos frente a la proteína IL-174 como antagonistas. Este enfoque debería ser particularmente útil con otras variantes de especies de proteína IL-174.

Las cantidades de reactivos necesarias para una terapia eficaz dependerán de muchos factores diferentes, incluidos los medios de administración, el sitio diana, el estado fisiológico del paciente y otros medicamentos administrados. Por tanto, las dosificaciones de tratamiento deberán titularse para optimizar la seguridad y la eficacia. Normalmente, las dosificaciones usadas in vitro pueden proporcionar guías útiles en las cantidades útiles para administración in situ de estos reactivos. El análisis en animales de las dosis eficaces para el tratamiento de trastornos concretos proporcionará una indicación predictiva adicional de la dosificación humana. Se describen varias consideraciones en, por ejemplo, Gilman y col., (eds. 1990) Goodman and Gilman’s : The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8ª Ed., Pergamon Press; y Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17ª ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn. Los procedimientos de administración se tratan en ellos y más adelante para, por ejemplo, administración oral, intravenosa, intraperitoneal o intramuscular, difusión transdérmica y otras. Véase también, Langer (1990) Science 249:1527-1533. Vehículos farmacéuticamente aceptables incluirán agua, solución salina, tampones y otros compuestos descritos en, por ejemplo, The Merck Index, Merck & Co., Rahway, New Jersey. Habitualmente cabría esperar que los intervalos de dosificación estén en cantidades inferiores a concentraciones 1mM, normalmente inferiores a concentraciones de 10 mM, normalmente inferiores a concentraciones de 100 Mm, preferentemente inferiores a concentraciones de 100 pM (picomolar) y, más preferentemente, inferiores a concentraciones de 1 fM (femtomolar), con un vehículo adecuado. A menudo se usarán formulaciones de liberación lenta, o un aparato de liberación lenta, para administración continua.

La proteína IL-174, fragmentos de la misma, y anticuerpos frente a ella y sus fragmentos, antagonistas y agonistas, pueden administrarse directamente al huésped que se va a tratar o, dependiendo del tamaño de los compuestos, puede ser deseable conjugarlos con proteínas vehículo, tal como ovoalbúmina o seroalbúmina antes de su administración. Las formulaciones terapéuticas se pueden administrar en cualquier formulación de dosificación convencional. Aunque es posible administrar el ingrediente activo solo, es preferible presentarlo como una formulación farmacéutica. Normalmente, las formulaciones comprenden al menos un ingrediente activo, como se ha definido anteriormente, junto con uno o más vehículos aceptables. Cada vehículo deberá ser farmacéutica y fisiológicamente aceptable en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes y no dañinos para el paciente. Las formulaciones incluyen las adecuadas para administración oral, rectal, nasal o parenteral (incluidas las vías subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica). Las formulaciones pueden presentarse cómodamente en una forma de monodosis y pueden prepararse mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica de farmacia. Véase, por ejemplo, Gilman y col. (eds. 1990) Goodman and Gilman’s : The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8ª Ed., Pergamon Press, Parrytown, NY; Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17ª ed. (1990) Mack Publishing Co., Easton, Penn.; Avis, y col. (eds. 1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications 2ª ed., Dekker, NY; Lieberman, y col. (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets 2ª ed., Dekker, NY; y Lieberman, y col. (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, NY. La terapia descrita en el presente documento se puede combinar con, o usarse en asociación con, otro reactivo terapéutico, incluidas las citoquinas.

Las formas tanto natural como recombinantes de las proteínas IL-174 descritas en el presente documento son particularmente útiles en kit y procedimientos de ensayo que son capaces de seleccionar compuestos por la actividad de unión a las proteínas. En los últimos años se han desarrollado varios procedimientos de automatizar ensayos para permitir la detección selectiva de decenas de miles de compuestos en un periodo corto. Véase, por ejemplo, Fodor y col. (1991) Science 251:767-773, que describe los medios para analizar la afinidad de unión mediante una pluralidad de polímeros definidos sintetizados en un sustrato sólido. El desarrollo de ensayos adecuados se puede facilitar considerablemente con la disponibilidad de cantidades grandes de proteína IL-174 purificada soluble, como se describe en el presente documento.

El uso de antígeno recombinante como se describe en el presente documento en cualquiera de una variedad de técnicas de detección selectiva de fármacos es particularmente útiles para la detección selectiva de compuestos. Las ventajas de usar una proteína recombinante en la detección selectiva de ligandos específicos incluyen: (a) fuente renovable mejorada del antígeno de una fuente específica; (b) potencialmente mayor número de moléculas de antígeno por célula, dando una mejor proporción señal:radio en los ensayos; y (c) especificidad de variante de especie (que en teoría da mayor especificidad biológica y de la enfermedad). La proteína purificada se puede analizar en numerosos ensayos, habitualmente ensayos in vitro, que evalúan las respuestas biológicamente relevantes. Véase , por ejemplo, Coligan Current Protocols in Immunology; Hood, y col. Immunology Benjamin/Cummings; Paul (ed.) Fundamental Immunology; y Methods in Enzymology Academic Press.

Un procedimiento de detección selectiva del fármaco usa células huésped eucarióticas o procarióticas que se

transforman de forma estable con moléculas de ADN recombinante que expresan el los antígenos de IL-174. Se pueden aislar células que expresan un antígeno en aislamiento de otros antígenos funcionalmente equivalentes. Tales células, en forma viable o fija, se pueden usar para los ensayos de unión proteína-proteína estándar. Véase también Parce y col. (1989) Science 246:243-247; y Owicki, y col. (1990) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 87:4007 (4011), que describen procedimientos sensibles para detectar respuestas celulares. Son particularmente útiles los ensayos competitivos, en los que las células (fuente de proteína IL-174) se ponen en contacto e incuban con una pareja de unión marcada o anticuerpo que tiene una afinidad de unión al ligando conocida, tal como 125I-anticuerpo, y una muestra de ensayo cuya afinidad de unión a la composición de unión se está midiendo. Las composiciones de unión marcadas unidas y libres se separan después para evaluar el grado de unión al antígeno. La cantidad de compuesto de prueba unido es inversamente proporcional a la cantidad de unión del receptor marcado a la fuente conocida. Se puede usar una cualquiera de numerosas técnicas para separar el antígeno unido del libre con el fin de evaluar el grado de unión. Esta etapa de separación habitualmente podría implicar un procedimiento tal como la adhesión a filtros, seguido de lavado, adhesión a plástico seguida de lavado o centrifugación de membranas celulares. Asimismo se podrían usar células viables para la detección selectiva de los efectos de fármacos sobre las funciones mediadas por la proteína IL-174, por ejemplo los niveles del segundo mensajero, es decir Ca++; la proliferación celular; los cambios en el grupo de inositolfosfato; y otros. Algunos procedimientos de detección permiten la eliminación de una etapa de separación, por ejemplo un sistema de detección sensible a proximidad. Los pigmentos sensibles al calcio serán útiles para detectar los niveles de Ca++ con un fluorímetro o un aparato de clasificación celular por fluorescencia.

Otro procedimiento usa membranas de células huésped eucariotas o procariotas transformadas como la fuente de la proteína IL-174. Estas células se transforman de forma estable con vectores de ADN que dirigen la expresión de una proteína IL-174 asociada a la membrana, por ejemplo una forma sometida a ingeniería unida a la membrana. Esencialmente, las membranas se prepararían a partir de las células y se usarían en cualquier ensayo de unión de tipo receptor/ligando, tal como el ensayo competitivo expuesto anteriormente.

Otro enfoque más es usar la proteína IL-174 solubilizada sin purificar o solubilizada purificada de células huésped eucariotas o procariotas transformadas. Esto permite un ensayo de unión “molecular” con las ventajas de mayor especificidad, la capacidad de automatizar y un rendimiento alto en la prueba del fármaco.

Otra técnica para la detección selectiva del fármaco implica un enfoque que proporciona un alto rendimiento de la detección selectiva de compuestos que poseen una afinidad de unión adecuada por IL-174, tal como se describe con detalle en Geysen, solicitud de patente europea 84/03564, publicada el 13 de septiembre de 1984. En primer lugar, se sintetizan grandes números de pequeños compuestos peptídicos de prueba diferentes sobre un sustrato sólido, tal como agujas de plástico o alguna otra superficie adecuada, véase Fodor y col. (1991). Después, se hace reaccionar todas las agujas con la composición de unión IL-174 solubilizada, sin purificar o solubilizada purificada y se lavan. La etapa siguiente implica detectar la composición de unión unida.

El fundamente del diseño farmacológico puede también basarse en estudios estructurales de las formas moleculares de la proteína IL-174 y otros efectores o análogos. Los efectores pueden ser otras proteínas que participan en otras funciones en respuesta a la unión del antígeno u otras proteínas que normalmente interaccionan con el antígeno. Un medio para determinar qué sitios interaccionan con otras proteínas específicas es una determinación de la estructura física, por ejemplo cristalografía de rayos X o técnicas de RMN bidimensional. Estos proporcionarán guías en cuanto a qué residuos de aminoácidos forman regiones de contacto molecular. Para una descripción detallada de la determinación de la estructura proteica, véase, por ejemplo, Blundell y Johnson (1976) Protein Crystallography, Academic Press, New York.

La proteína IL-174 purificada se puede revestir directamente en placas para uso en las técnicas de detección selectiva de fármacos mencionadas anteriormente. No obstante, los anticuerpos no neutralizantes frente a estos ligandos se pueden usar como anticuerpos de captura para inmovilizar el respectivo ligando sobre la fase sólida.

IX. Kits

En el presente documento también se describe el uso de proteínas IL-174, fragmentos de las mismas, péptidos y sus productos de fusión en una variedad de kit diagnósticos y procedimientos para detectar la presencia de una composición de unión. Normalmente, el kit tendrá un compartimento que contiene un péptido definido de IL-174 o segmento génico o un reactivo que reconoce uno o el otro, por ejemplo fragmentos antigénicos o anticuerpos.

Un kit para determinar la afinidad de unión de un compuesto de prueba a una proteína IL-174 normalmente comprendería un compuesto de prueba; un compuesto marcado, por ejemplo un anticuerpo que tiene una afinidad de unión conocida por el antígeno; una fuente de proteína IL-174 (natural o recombinante); y un medio para separar el compuesto marcado unido del libre, tal como una fase sólida para inmovilizar el antígeno. Una vez que los compuestos se han sometido a detección selectiva, los que tienen una afinidad de unión adecuada por el antígeno se pueden evaluar en ensayos biológicos adecuados, como es bien conocido en la técnica, para determinar si exhiben actividades biológicas similares, con el antígeno natural. La disponibilidad de los polipéptidos de la proteína IL-174 recombinante también proporciona patrones bien definidos para calibrar dichos ensayos.

Un kit preferido para determinar la concentración de, por ejemplo, una proteína IL-174 en una muestra, normalmente comprendería un compuesto marcado, por ejemplo un anticuerpo, que tiene una afinidad de unión conocida por el antígeno; una fuente de antígeno (natural o recombinante); y un medio para separar el compuesto marcado unido del libre, por ejemplo una fase sólida para inmovilizar la proteína IL-174. Normalmente se proporcionarán los compartimentos que contienen reactivos e instrucciones.

Un procedimiento para determinar la concentración de la proteína IL-174 en una muestra normalmente comprendería las etapas de: (1) preparar membranas de una muestra compuesta por una fuente de proteína IL-174 unida a la membrana; (2) lavar las membranas y suspenderlas en un tampón; (3) solubilizar el antígeno incubando las membranas en un medio de cultivo al que se ha añadido un detergente adecuado; (4) ajustar la concentración de detergente del antígeno solubilizado; (5) poner en contacto e incubar dicha dilución con anticuerpo radiomarcado para formar complejos; (6) recuperar los complejos, tal como mediante filtración a través de filtros tratados con polietilenimina; y (7) medir la radioactividad de los complejos recuperados.

Los anticuerpos, incluidos los fragmentos de unión a antígeno, específicos para la proteína IL-174 o fragmentos son útiles en aplicaciones diagnósticas para detectar la presencia de niveles elevados de proteína IL-174 y/o sus fragmentos. Dichos ensayos diagnósticos pueden usar lisados, células vivas, células fijas, inmunofluorescencia, cultivos celulares, fluidos corporales y, además, pueden implicar la detección de antígenos relacionados con la proteína en suero, o similares. Los ensayos diagnósticos pueden ser homogéneos (sin una etapa de separación entre el reactivo libre y el complejo proteína-proteína) o heterogéneos (con una etapa de separación). Existen varios ensayos comerciales, tales como radioinmunoensayo (RIA), ensayo de inmunosorción ligado a enzima (ELISA), enzimoinmunoensayo (EIA), técnica de inmunoensayo de enzimas multiplicadas (EMIT), inmunoensayo fluorescente marcado con sustrato (SLFIA) y similares. Por ejemplo, se pueden emplear anticuerpos no marcados usando un segundo anticuerpo que está marcado y que reconoce el anticuerpo a una proteína IL-174 o a un fragmento concreto de la misma. Ensayos similares también se han discutido ampliamente en la literatura. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH.

Los anticuerpos antiidiotípicos pueden tener un uso similar para diagnosticar la presencia de anticuerpos contra una proteína IL-174, como tal puede ser diagnóstico de varios estados anormales. Por ejemplo, la sobreproducción de proteína IL-174 puede tener como resultado la producción de varias reacciones inmunológicas que pueden ser diagnósticas de estados fisiológicos anormales, particularmente en afecciones de células proliferativas, tales como cáncer o diferenciación anormal.

Con frecuencia, los reactivos para ensayos diagnósticos se suministran en kit de modo que se optimiza la sensibilidad del ensayo. Para la invención objeto, dependiendo de la naturaleza del ensayo, el protocolo y el marcador, se proporciona anticuerpo marcado o sin marcar o proteína IL-174 marcada. Normalmente esto se realiza junto con otros aditivos, tales como tampones, estabilizantes, materiales necesarios para la producción de señal, tales como sustratos de enzimas y similares. Preferentemente, el kit también contendrá instrucciones para un uso y eliminación adecuados de los contenidos tras su uso-. Normalmente el kit tiene compartimentos para cada reactivo útil. Deseablemente, los reactivos se proporcionan en forma de un polvo liofilizado seco, en el que los reactivos se pueden reconstituir en un medio acuoso proporcionando las concentraciones adecuadas de reactivos para realizar el ensayo.

Cualquiera de los constituyentes mencionados anteriormente de la detección selectiva de fármacos y los ensayos diagnósticos se pueden usar sin modificación o se pueden modificar de diversas formas. Por ejemplo, el marcaje se puede conseguir mediante unión covalente o no covalente de un resto que proporciona directa o indirectamente una señal detectable. En cualquiera de estos ensayos, el antígeno, el compuesto de prueba, la proteína IL-174 o los anticuerpos de la misma se pueden marcar directa o indirectamente. Las posibilidades para el marcaje directo incluyen grupos marcadores: radiomarcadores tales como 125I, enzimas (patente de EE.UU. nº 3.645.090) tales como peroxidasa y fosfatasa alcalina, y marcadores fluorescentes (patente de EE.UU. nº 3.940.475) capaces de monitorizar el cambio de intensidad de la fluorescencia, el desplazamiento de la longitud de onda o la polarización de la fluorescencia. Las posibilidades para el marcaje indirecto incluyen biotinilación de un constituyente, seguido de unión a avidina acoplada a uno de los grupos marcadores anteriores.

También hay numerosos procedimientos de separar el antígeno unido del libre o, como alternativa, el compuesto unido del libre. La proteína IL-174 se puede inmovilizar sobre varias matrices, seguido de lavado. Las matrices adecuadas incluyen plástico, tal como una placa de ELISA, filtros y perlas. Procedimientos de inmovilización de la proteína IL-174 en una matriz incluyen, sin limitaciones, adhesión directa a plástico, uso de un anticuerpo de captura, acoplamiento químico y biotinavidina. La última etapa en este enfoque implica la precipitación del complejo proteína-proteína mediante cualquiera de los diversos procedimientos, incluidos los que usan, por ejemplo, un disolvente orgánico tal como polietilenglicol, o una sal tal como sulfato amónico. Otras técnicas de separación adecuadas incluyen, sin limitaciones, el procedimiento de la partícula magnetizable con anticuerpo con fluoresceína descrito en Rattle y col. (1984) Clin. Chem. 30:1457-1461, y la separación con partículas magnéticas con doble anticuerpo, como se describe en la patente de EE.UU. nº 4.659.678.

Los procedimientos para unir proteínas, o sus fragmentos, a los diversos marcadores se han comunicado ampliamente en la literatura y no requieren una discusión detallada en el presente documento. Muchas de las

técnica implican el uso de grupos carboxilo activados, bien a través del uso de carbodiimida o de ésteres activos, para formar enlaces peptídicos, la formación de tioéteres mediante reacción de un grupo mercapto con un halógeno activado, tal como cloroacetilo, o una olefina activada, tal como maleimida, para unión o similar. Las proteínas de fusión también encuentran utilidad en estas aplicaciones.

Otro aspecto diagnóstico descrito en el presente documento implica el uso de secuencias de oligonucleótidos o polinucleótidos tomadas de la secuencia de una proteína IL-174. Estas secuencias se pueden usar como sondas para detectar niveles de mensaje antigénico en muestras de pacientes con sospecha de tener una afección anormal, por ejemplo cáncer o un problema del desarrollo. La preparación de secuencias nucleotídicas de ARN y ADN, el marcaje de las secuencias y el tamaño preferido de las secuencias ha recibido amplia descripción y discusión en la literatura. Normalmente, una sonda oligonucleotídica deberá tener al menos aproximadamente 14 nucleótidos, normalmente al menos aproximadamente 18 nucleótidos, y las sondas polinucleotídicas pueden tener hasta varios kilobases. Se pueden emplear varios marcadores, más habitualmente radionúclidos, particularmente 32P. No obstante, también se pueden emplear otras técnicas, tales como el uso de nucleótidos modificados con biotina para la introducción en un polinucleótido. A continuación, la biotina sirve como sitio de unión a avidina o anticuerpos, que se pueden marcar con una amplia variedad de marcadores, tales como radionúclidos, fluorescentes, enzimas o similares. Como alternativa, se pueden emplear anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, incluidos dúplex de ADN, dúplex de ARN, dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex de ADN-proteína. A su vez, los anticuerpos se pueden marcar y el ensayo se puede llevar a cabo cuando el dúplex está unido a una superficie, de modo que tras la formación del dúplex sobre la superficie, se puede detectar la presencia de anticuerpo unido al dúplex. El uso de sondas para el nuevo ARN anti-sentido se puede llevar a cabo en cualquier técnica convencional, tal como hibridación de ácido nucleico, más y menos detección selectiva, sondaje recombinatorio, traducción liberada de híbrido (HRT) y traducción detenida de híbrido (HART). Esto incluye también técnicas de multiplicación, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Otro enfoque usa, por ejemplo, ácido nucleico antisentido, incluida la introducción de ARN bicatenario (ARNds) para interferir genéticamente en la función génica, como se describe en, por ejemplo, Misquitta y col. (1999) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 96:1451-1456 y/o ribozimas para bloquear la traducción de un ARNm específico de IL-70. El uso de procedimientos antisentido para inhibir la traducción in vitro de genes es bien conocido en la técnica. Marcus-Sakura (1988) Anal. Biochem. 172:289; Akhtar (ed. 1995) Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics CRC Press, Inc.

También se contemplan kit diagnósticos que también pueden analizar la presencia cualitativa o cuantitativa de otros marcadores. El diagnóstico o pronóstico pueden depender de la combinación de indicaciones múltiples usadas como marcadores. Por tanto, los kit pueden analizar combinaciones de marcadores. Véase, por ejemplo, Viallet y col. (1989) Progress in Growth Factor Res. 1:89-97.

El amplio alcance de la presente divulgación se entenderá mejor con referencia a los ejemplos siguientes.

Ejemplos

I. Procedimientos generales

Algunos de los procedimientos convencionales se describen o se hace referencia a ellos en, por ejemplo, Maniatis y col. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook, y col., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2ª ed.), vols. 1-3,CSH Press, NY; Ausubel, y col., Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; o Ausubel, y col. (1987 y Suplementos) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York; Innis, y col., (eds. 1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, N.Y.; y Kohler, y col. (1995) Ouantitation of mRNA by Polymerase Chain Reaction Springer-Verlag, Berlín. Los procedimientos para purificación de proteínas incluyen procedimientos tales como precipitación con sulfato amónico, cromatografía de columna, electroforesis, centrifugación, cristalización y otros Véase, por ejemplo, Ausubel, y col. (1987 y suplementos periódicos); Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification" en Methods in Enzymology, vol. 182, y otros volúmenes en esta serie; y bibliografía del fabricante sobre el uso de productos de purificación de proteínas, por ejemplo Pharmacia, Piscataway, N.J., o Bio-Rad, Richmond, CA. La combinación con técnicas recombinantes permite la fusión a segmentos adecuados, por ejemplo, a una secuencia FLAG o una equivalente que puede fusionarse mediante una secuencia escindible con proteasa. Véase, por ejemplo, Hochuli (1989) Chemische Industrie 12:69-70; Hochuli (1990) "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" en Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principle and Methods 12:87-98, Plenum Press, N.Y.; y Crowe, y col. (1992) QIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System QUIAGEN, Inc., Chatsworth, CA.

En el presente documento también se incorpora por referencia una solicitud de patente similar dirigida a las citoquinas IL-171 e IL-175, número de registro fiscal DX0918P, presentada en la misma fecha que la presente.

Se describen varias técnicas inmunológicas convencionales en, por ejemplo, Hertzenberg y col., (eds. 1996) Weir’s Handbook of Experimental Immunology vols. 1-4, Blackwell Science; Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; y Methods in Enzymology vols. 70, 73, 74, 84, 92, 93, 108, 116, 121, 132, 150, 162, y 163. Ensayos con citoquinas se describen en, por ejemplo, Thomson (ed. 1998) The Cytokine Handbook (3ª ed.) Academic Press, San Diego; MireSluis and Thorpe (1998) Cytokines Academic Press, San Diego; Metcalf y Nicola

(1995) The Hematopoietic Colony Stimulating Factors Cambridge University Press; y Aggarwal y Gutterman (1991) Human Cytokines Blackwell Pub.

Los ensayos para actividades biológicas vasculares son bien conocidos en la técnica. Cubrirán las actividades angiogénicas y angioestáticas en tumores u otros tejidos, por ejemplo proliferación de músculo liso arterial (véase, por ejemplo, Koyoma, y col. (1996) Cell 87:1069-1078), adhesión de monocitos al epitelio vascular (véase McEvoy, y col. (1997) J. Exp. Med. 185:2069-2077), etc. Véase también Ross (1993) Nature 362:801-809; Rekhter y Gordon (1995) Am. J. Pathol. 147:668-677; Thyberg, y col., (1990) Atherosclerosis 10:966-990; y Gumbiner (1996) Cell 84:345-357.

Los ensayos para actividades biológicas de células neurales se describen en, por ejemplo, Wouterlood (ed. 1995) Neuroscience Protocols modules 10, Elsevier; Methods in Neurosciences Academic Press; y Neuromethods Humana Press, Totowa, NJ. Se describe metodología de sistemas de desarrollo en, por ejemplo, Meisami (ed.) Handbook of Human Growth and Developmental Biology CRC Press; y Chrispeels (ed.) Molecular Techniques and Approaches in Developmental Biology Interscience.

Se realizan análisis de secuencias por ordenador, por ejemplo, usando programas de software disponibles, incluidos los de las fuentes GCG(U. Wisconsin) y GenBank. Se usaron también basas de datos de secuencias públicas, de, por ejemplo, GenBank y otros.

Muchas técnicas aplicables a la IL-170 se pueden aplicar a estas entidades nuevas, como se describe en, por ejemplo, USSN.

Análisis FACS se describen en, por ejemplo, Melamed y col., (1990) Flow Cytometry and Sorting Wiley-Liss, Inc., New York, NY; Shapiro (1988) Practical Flow Cytometry Liss, New York, NY; y Robinson, y col. (1993) Handbook of Flow Cytometry Methods Wiley-Liss, New York, NY.

II. Aislamiento de un clon de ADN que codifica la proteína IL-170

El aislamiento de la CTLA-8 murina se describe en Rouvier, y col., (1993) J. Immunol. 150:5445-5456. Se dispone de procedimientos similares para aislar homólogos de especies de IL-173, IL-174, IL-176 y IL-177, junto con IL-171. IL-172 e IL-175.

Fuente de los mensajes de IL-170

Varias líneas celulares se someten a detección selectiva usando una sonda adecuada para la expresión de niveles altos del mensaje. Las líneas celulares adecuadas se seleccionan en base a los niveles de expresión del mensaje de IL-170 adecuada.

Aislamiento de un clon que codifica IL-170

Se usan técnicas convencionales de PCR para amplificar una secuencia génica de IL-170 de una biblioteca genómica o de ADNc o de ARNm. Se obtiene una biblioteca de genómica o de ADNc humanos y se somete a detección selectiva con ADNc adecuado o una sonda sintética adecuada. Se pueden preparar cebadores para PCR. Los cebadores adecuados se seleccionan de, por ejemplo, las secuencias proporcionadas y se aísla un clon de longitud completa. Se pueden preparar varias combinaciones de cebadores, de varias longitudes y, posiblemente, con diferencias en la secuencia. El clon de longitud completa se puede usar como sonda de hibridación para la detección selectiva de otros genes homólogos usando condiciones de hibridación rigurosas o menos rigurosas.

En otro procedimiento, se usan oligonucleótidos para la detección selectiva de una biblioteca. En combinación con técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se usan oligonucleótidos sintéticos en orientaciones adecuadas como cebadores para seleccionar los clones correctos de una biblioteca.

III. Caracterización bioquímica de las proteínas IL-170

Una proteína IL-170 se expresa en células heterólogas, por ejemplo la forma nativa o una forma recombinante que muestra el péptido FLAG en el extremo carboxi. Véase, por ejemplo, Crowe y col.. (1992) QIAexpress: The High Level Expression and Protein Purification System QIAGEN, Inc. Chatsworth, CA; y Hopp, y col., (1988) Bio/Technology 6:1204-1210. Estas dos formas se introducen en vectores de expresión, por ejemplo pME18S o pEE12, y, después, se transfeccionan en células adecuadas, por ejemplo células COS-7 o NSO, respectivamente. Las células electroporadas se cultivan durante, por ejemplo, 48 horas en medio RPMI suplementado con 10% de suero bovino fetal. Después, las células se incuban con 35S-Met y 35S-Cys con el fin de marcar las proteínas celulares. La comparación de las proteínas en condiciones reductoras sobre SDS-PAGE deberá mostrar que las células transfeccionadas con clones de longitud completa secretarán un polipéptido del tamaño adecuado, por ejemplo de aproximadamente 15.000 dalton. El tratamiento con endoglicosidasas demostrará si hay formas Nglicosiladas.

IV. Producción a gran escala, purificación de IL-170

Para ensayos biológicos, se produce IL-170 de mamífero en grandes cantidades, por ejemplo con células COS-7 transfeccionadas cultivadas en medio RPMI suplementado con 1% de Nutrodoma HU (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania) y después se purifica. La purificación puede usar cromatografía de afinidad usando anticuerpos, o técnicas de purificación de proteínas, por ejemplo usando anticuerpos para determinar las propiedades de separación.

Con el fin de producir mayores cantidades de proteínas nativas se pueden preparar transformantes estables de células NSO de acuerdo con la metodología desarrollada por Celltech (Slough, Berkshire, Reino Unido; solicitudes de patente internacional WO86/05807, WO87/04462, WO89/01036 y WO89/10404).

Normalmente, 1 litro de sobrenadante que contiene IL-173 o IL-173-FLAG humana se pasa por, por ejemplo, una columna de 60 ml de iones Zn++ injertados en una matriz de flujo rápido de Sefarosa quelante (Pharmacia, Upsalla, Suecia). Después de lavar con 10 volúmenes de tampón de unión (kit tampón His-Bind Buffer, Novagen, Madison, WI), las proteínas conservadas mediante los iones metálicos se eluyen con un gradiente de imidazol 20-100 mM. El contenido de IL-173-FLAG humana en las fracciones eluidas se determina mediante transferencia puntual usando el anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2 (Eastman Kodak, New Haven, CT), mientras que el contenido de IL-173 se evalúa mediante, por ejemplo, tinción de plata de SDS-PAGE no reductor. Las fracciones que contienen IL-170 se combinan después y se dializan contra PBS y se usan en ensayos biológicos o se purifican adicionalmente mediante, por ejemplo, HPLC de intercambio aniónico en una columna DEAE. Una tercera etapa de cromatografía con filtración en gel se puede realizar en una columna SUPERDEX G-75 HRD30 (Pharmacia Uppsala, Suecia). La purificación se puede evaluar mediante, por ejemplo, SDS-PAGE con tinción de plata.

V. Preparación de anticuerpos contra IL-173

Ratones Balb/c endogámicos Se inmunizan intraperitonealmente con, por ejemplo 1 ml de IL-173-FLAG humana purificada emulsionada en adyuvante completo de Freund el día 0 y en adyuvante incompleto de Freund los días 15 y 22. Se inyecta un refuerzo en los ratones con 0,5 ml de L-173 humana purificada administrada por vía intravenosa.

Se recoge el antisuero policlonal. El suero se puede purificar para obtener los anticuerpos. Los anticuerpos se pueden procesar adicionalmente, por ejemplo Fab, Fab2, Fv, o fragmentos similares.

Los hibridomas se crean usando, por ejemplo, la línea de células de mieloma no secretoras SP2/0-Ag8 y polietilenglicol 1000 (Sigma, St. Louis, MO) como agente de fusión. Las células de hibridoma se introducen en placas de cultivo tisular Falcon de 96 pocillos (Becton Dickinson, NJ) y se introduce medio DMEM F12 (Gibco, Gaithersburg, MD) suplementado con 80 mg/ml de gentamicina, glutamina 2 mM, 10 % de suero de caballo (Gibco, Gaithersburg, MD), 1 % de DCM (CRTS, Lyon, Francia) , azaserina 10-5M (Sigma, St. Louis, MO) e hipoxantina 5 x 10-5 M. Los sobrenadantes de los hibridomas se someten a detección selectiva de la producción de anticuerpos contra IL-173 humana mediante inmunohistoquímica (ICC) usando células COS-7 transfeccionadas con IL-173 humana fijada en acetona y mediante ELISA usando IL-173-FLAG humana purificada de sobrenadantes COS-7 como antígeno de recubrimiento. Alícuotas de los clones de células positivas se expanden durante 6 días y se crioconservan, así como se propagan en acistis de ratones bAlb/ tratados pristano (2,6,10,14-terametilpentadecano, Sigma, St. Louis, MO) que habían recibido una inyección intraperitoneal de pristano días antes. Normalmente, aproximadamente 105 células de hibridoma en 1 ml de PBS se administran intraperitonealmente y días después se recogen ascitis de cada ratón.

Tras la centrifugación de la ascitis, la fracción de anticuerpo se aísla mediante precipitación en sulfato amónico y cromatografía de intercambio aniónico en una columna de Zephyr-D silicio (IBF Sepracor) equilibrada con Tris 20 mM a pH 8,0. Las proteínas se eluyen con un gradiente de NaCl (que varía de 0 a 1 M, NaCl). Se recogen fracciones de 2 ml y se analizan mediante ELISA para detectar la presencia de anticuerpo anti-IL-173. Las fracciones que contienen actividad específica anti-IL-173 se combinan, dializan y congelan. Las alícuotas de los anticuerpos monoclonales purificados pueden marcarse con peroxidasa.

Las preparaciones de anticuerpos, policlonales o monoclonales, se pueden absorber de forma cruzada, deplecionar

o combinar para crear reactivos que exhiben combinaciones deseadas de selectividades y especificidades. Los antígenos específicos definidos se pueden inmovilizar en una matriz sólida y se usan para deplecionar de forma selectiva o seleccionar según las capacidades de unión deseadas.

VI. Cuantificación de la IL-173 humana

Entre los anticuerpos específicos de IL-173 se seleccionar los aislamientos clonales adecuados para cuantificar los niveles de IL-173 humana usando un ensayo de tipo sándwich. Los anticuerpos purificados se diluyen a, por ejemplo, 2 mg/ml en tampón de revestimiento (tampón carbonato, pH 9,6. Na2CO3 15mM, NaHCO3 35mM). Esta solución diluida se introduce en los pocillos de una placa de EILSA de 96 pocillos (Immunoplate Maxisorp F96 certificado, NUNC, Dinamarca) durante la noche a temperatura ambiente. Después, las placas se lavan manualmente por ejemplo con un tampón de lavado consistente en solución salina tamponada con fosfato y 0,05% de Tween 20 (Technicon Diagnositics, EE.UU.). A cada pocillo se añaden 110 ml de CTLA-8 humana purificada en tampón TBS-B-T [Tris 20 mM, NaCl 150 mM, 1 % de BSA (Sigma, St. Louis, MO) y 0,05 % de Tween 20]. Después de 3 horas de incubación a 37 ºC, las placas se lavan una vez. A cada pocillo se añaden 100 ml de Ac marcado con

peroxidasa a 5 mg/ml en tampón TBS-B-T y se incuban durante 2 horas a 37 ºC.

Después, los pocillos se lavan tres veces en tampón de lavado. A cada pocillo se añaden 100 ml de sustrato de peroxidasa, 2.2’ Azino-bis (ácido 3-etilbenztiazoina-6-sulfónico) (ABTS), diluido a 1 mg/ml en tampón citrato/fosfato, y la reacción colorimétrica se lee a 405 nm.

VII. Distribución de los genes de IL-170

La IL-173 humana se identificó a partir de la secuencia derivada de una biblioteca de ADN de la corteza frontal de cerebro de epiléptico. La IL-173 de rata se identificó a partir de una biblioteca de ADNc de cóclea, cerebro, cerebelo, ojo, pulmón y riñón. De nuevo, los genes parecen ser bastante raros, lo que sugiere que las distribuciones de la expresión estarían altamente restringidas.

La IL-174 de ratón se identificó a partir de la secuencia derivada de una biblioteca de ADNc derivado de embrión de ratón. El gene parece ser bastante raro, lo que sugiere que las distribuciones de la expresión estarían altamente restringidas.

La IL-171 humana se identificó a partir de una secuencia derivada de una célula T apoptótica. El gene parece ser bastante raro, lo que sugiere que las distribuciones de la expresión estarían altamente restringidas.

La IL-172 humana se identificó a partir de secuencias derivadas de corazón fetal humano, hígado y bazo, timo, tumor de timo y de todo el feto. El ratón derivó de secuencias derivadas de ratón, embrión, glándulas mamarias y órganos combinados. Ambos genes parecen ser bastante raros, lo que sugiere que sus distribuciones de la expresión estarían altamente restringidas.

La IL-175 humana se identificó a partir de una secuencia derivada de una célula T activada con tiouridina 12 horas. El gene parece ser bastante raro, lo que sugiere que las distribuciones de la expresión estarían altamente restringidas.

VIII. Mapeo cromosómico de los genes de IL-170

Se usa un ADNc aislado que codifica el gen de IL-170 adecuado. El mapeo del cromosoma es una técnica estándar. Véase, por ejemplo, BIOS Laboratories (New Haven, CT) y procedimientos de uso de un panel híbrido de células somáticas de ratón con PCR.

El gen de la IL-173 humana está en el cromosoma humano 13q11.

IX. Aislamiento de homólogos de IL-170

Una composición de unión, por ejemplo un anticuerpo, se usa para la detección selectiva de una biblioteca de expresión hecha de una línea celular que expresa una proteína IL-170. Se usan técnicas de tinción convencionales para detectar o clasificar antígeno intracelular o expresado en la superficie o células transformadas que se expresan en la superficie se someten a detección selectiva mediante panning. La detección selectiva de la expresión intracelular se realiza mediante varios procedimientos de tinción o inmunofluorescencia. Véase también McMahan y col. (1991) EMBO J. 10:2821-2832.

Procedimientos similares son aplicables para aislar variantes de especie o alélicas. Las variantes de especie se aíslan usando técnicas de hibridación de especie cruzada en base a un aislamiento de longitud completa o fragmento de una especie como sonda, o especies adecuadas.

X. Aislamiento de receptores para IL-170

Se dispone de procedimientos para la detección selectiva de una biblioteca de expresión hecha de una línea celular que expresa potenciales receptores de IL-170. Se produce un ligando de IL-170 marcado, como se ha descrito anteriormente. Se usan técnicas de tinción convencionales para detectar o clasificar el receptor expresado en la superficie o células transformadas que se expresan en la superficie se someten a detección selectiva mediante panning. Véase también McMahan y col. (1991) EMBO J. 10:2821-2832.

Por ejemplo, el día 0 se recubren previamente portaobjetos de permanox de 2 cámaras con 1 ml por cámara de fibronectina, 10 ng/ml en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Lavar una vez con PBS. Después, se siembran en placas las células COS a 2-3 x 105 células por cámara en 1,5 ml de medio de crecimiento. Incubar durante la noche a 37 ºC.

El día 1, para cada muestra, preparar 0,5 ml de una solución de 66 mg/ml de DEAE-dextrano, cloroquina 66 µM y4 µg de ADN en DME sin suero. Para cara grupo se prepara un control positivo, por ejemplo de ADNc de huIL-170-FLAG a una dilución de 1 y 1/200 y un simulado negativo. Lavar las células con DME sin suero. Añadir la solución de ADN e incubar 5 horas a 37 ºC. Retirar el medio y añadir 0,5 ml de 10 % de DMSO en DME durante 2,5 minutos. Retirar y lavar una vez con DME. Añadir 1,5 ml de medio de crecimiento e incubar durante la noche.

El día 2, cambiar el medio. Los días 3 o 4, las células se fijan y se tiñen. Lavar las células dos veces con solución salina tamponada de HANK (HBSS) y fijar en 45 de paraformaldehído (PFA)/glucosa durante 5 minutos. Lavar 3X con HBSS. Los portaobjetos se pueden almacenar a -80 ºC después de retirar todo el líquido. Para cada cámara se realizan incubaciones de 0,5 ml, del siguiente modo: Añadir HBSS/saponina (0,1 %) con 32 µl/ml de NaN3 1M durante 20 minutos. Después, las células se lavan con HBSS/saponina 1X. Se añade anticuerpo soluble a las células y se incuban durante 30 minutos. Lavar las células dos veces con HBSS/saponina. Añadir el segundo anticuerpo, por ejemplo anticuerpo anti-ratón Vector a una dilución de 1/200 e incubar durante 30 minutos. Preparar la solución de Elisa, por ejemplo solución de peroxidasa de rábano Vector Elite ABC y preincubar durante 30 minutos. Usar, por ejemplo, 1 gota de la solución A (avidina) y 1 gota de la solución B (biotina) por 2,5 ml de HBSS/saponina. Lavar las células dos veces con HBSS/saponina. Añadir la solución de ABC HRP e incubar durante 30 minutos. Lavar las células dos veces con HBSS, segundo lavado durante 2 minutos, que cierra las células. Después, añadir ácido diaminonbenzoico (DAB) Vector durante de 5 a 10 minutos. Usar 2 gotas de tampón más 4 gotas de DAB más 2 gotas de H2O2 por 5 ml de agua desionizada. Cuidadosamente retirar la cámara y lavar el portaobjetos en agua. Secar al aire unos minutos, después añadir 1 gota de Crystal Mount y una tapa. Cocer durante 5 minutos a 85-90 ºC.

Como alternativa, se usa el ligando marcado para purificar por afinidad o clasificar las células que expresan el receptor. Véase, por ejemplo, Sambrook, y col., o Ausubel y col.

Se pueden realizar muchas modificaciones y variaciones de la presente invención.

Las realizaciones específicas descritas en el presente documento se ofrecen a modo de ejemplo únicamente y la invención tiene que estar limitada únicamente por los términos de las reivindicaciones adjuntas.

En el presente documento también se describen los apartados siguientes:

1. Un polinucleótido aislado o recombinante que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

a) una secuencia de IL-173 de mamífero que:

i) codifica al menos 8 aminoácidos contiguos de las SEC ID Nº 6, 8,10, o 12 maduras; ii) codifica al menos dos segmentos distintos de al menos 5 aminoácidos contiguos de las SEC ID Nº 6, 8, 10 o 12 maduras; o iii) comprende uno o más segmentos de al menos 21 nucleótidos contiguos de las SEC ID Nº 5, 7, 9 u 11;

b) una secuencia de IL-174 de mamífero que:

i) codifica al menos 8 aminoácidos contiguos de las SEC ID Nº 14, 16 o18. ii) codifica al menos dos segmentos distintos de al menos 5 aminoácidos contiguos de las SEC ID Nº 14, 16 o 18; o iii) comprende uno o más segmentos de al menos 21 nucleótidos contiguos de las SEC ID Nº 14, 16 o18.

c) una secuencia de IL-176 de mamífero que:

i) codifica al menos 8 aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº 28;

ii) codifica al menos dos segmentos distintos de al menos 5 aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº 28 o

iii) comprende uno o más segmentos de al menos 21 nucleótidos contiguos de las SEC ID Nº 27; y

d) una secuencia de IL-177 de mamífero que:

i) codifica al menos 8 aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº 30;

ii) codifica al menos dos segmentos distintos de al menos 5 aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº 30 o

iii) comprende uno o más segmentos de al menos 21 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº 29.

2. El polinucleótido del apartado 1 en un vector de expresión, que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

a) una secuencia de IL-173 que:

i) codifica al menos 12 aminoácidos contiguos de las SEC ID Nº 6, 8, 10 o 12 maduras; ii) codifica al menos dos segmentos distintos de al menos 7 y 10 aminoácidos contiguos de las SEC ID Nº 6, 8, 10 o 12; o iii) o comprende al menos 27 nucleótidos contiguos de las SEC ID Nº 5, 7, 9 o 11;

b) una secuencia de IL-174 que:

i) codifica al menos 12 aminoácidos contiguos de las SEC ID Nº 14, 16 o18. ii) codifica al menos dos segmentos distintos de al menos 7 y 10 aminoácidos contiguos de las SEC ID Nº 14, 16 o 18; o

iii) o comprende al menos 27 nucleótidos contiguos de las SEC ID Nº 13, 15 o17.

c) una secuencia de IL-176 que:

i) codifica al menos 12 aminoácidos contiguos de las SEC ID Nº 28; ii) codifica al menos dos segmentos distintos de al menos 7 y 10 aminoácidos contiguos de las SEC ID Nº 28 o iii) o comprende al menos 27 nucleótidos contiguos de las SEC ID Nº 27; y

d) una secuencia de IL-177 que:

i) codifica al menos 12 aminoácidos contiguos de las SEC ID Nº 30; ii) codifica al menos dos segmentos distintos de al menos 7 y 10 aminoácidos contiguos de las SEC ID Nº 30 o iii) o comprende al menos 27 nucleótidos contiguos de las SEC ID Nº 29.

3. El polinucleótido del apartado 2 seleccionado del grupo que consiste en:

a) una secuencia de IL-173 que:

i) codifica al menos 16 residuos aminoácidos contiguos de las SEC ID Nº 6, 8, 10 o 12 maduras; ii) codifica al menos dos segmentos distintos de al menos 10 y 13 residuos aminoácidos contiguos de las SEC ID Nº 6, 8, 10 o 12 maduras; iii) o comprende al menos 33 nucleótidos contiguos de las SEC ID Nº 5, 7, 9 o 11; o iv) comprende toda la porción de codificación madura de las SEC ID Nº 5, 7, 9 o 11;

b) una secuencia de IL-174 que:

i) codifica al menos 16 residuos aminoácidos contiguos de las SEC ID Nº 14, 16 o18. ii) codifica al menos dos segmentos distintos de al menos 10 y 13 residuos aminoácidos contiguos de las SEC ID Nº 14, 16 o 18 maduras; o iii) o comprende al menos 33 nucleótidos contiguos de las SEC ID Nº 13, 15 o 17; o iv) comprende toda la porción de codificación madura de las SEC ID Nº 13, 15 o17.

c) una secuencia de IL-176 que:

i) codifica al menos 16 aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº 28; ii) codifica al menos dos segmentos distintos de al menos 10 y 14 residuos aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº 28; iii) o comprende al menos 33 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº 27 o iv) comprende toda la porción de codificación madura de la SEC ID Nº 27; y

d) una secuencia de IL-177 que:

i) codifica al menos 16 aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº 30 madura; ii) codifica al menos dos segmentos distintos de al menos 10 y 14 residuos aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº 30 madura; iii) o comprende al menos 33 nucleótidos contiguos de la SEC ID Nº 29 o iv) comprende toda la porción de codificación madura de la SEC ID Nº 29.

4.

Un procedimiento de fabricación de:

a) un polipéptido que comprende expresar dicho vector de expresión del apartado 2, de modo que se produce dicho polipéptido; b) un ácido nucleico dúplex que comprende poner en contacto un polinucleótido del apartado 2 con un ácido nucleico complementario, de modo que tiene como resultado la producción de dicho ácido nucleico dúplex; o c) un polinucleótido del apartado 2, que comprende amplificar usando un procedimiento de PCR.

5.

Un polinucleótido aislado o recombinante que hibrida en condiciones de lavado rigurosas de al menos 55 ºC y menos de 400 mM de sal con:

a) el polinucleótido (IL-173) del apartado 3 que consiste en las porciones de codificación maduras de las SEC ID Nº 5, 7, 9 o 11; b) el polinucleótido (IL-174) del apartado 3 que consiste en las porciones de codificación maduras de las SEC ID Nº 13, 15 o 17; o c) el polinucleótido (IL-176) del apartado 3 que consiste en las porciones de codificación maduras de la SEC ID Nº 27 o d) el polinucleótido (IL-177) del apartado 3 que consiste en las porciones de codificación maduras de la SEC ID Nº 29.

6.

Un polinucleótido del apartado 5: a) en el que dichas condiciones de lavado son, al menos, 65 ºC y menos de 300 mM de sal, o b) que comprende al menos 50 nucleótidos contiguos de la porción de codificación madura de:

i) SEC ID Nº 5, 7, 9 u 11 (IL,-173); ii) SEC ID Nº 13, 15 o 17 (IL-174); iii) SEC ID Nº 27 (IL-176); o iv) SEC ID Nº 29 (IL-177)

7.

Un kit que comprende dicho polinucleótido del apartado 6, e

a) instrucciones de uso de dicho polinucleótido para detección; b) instrucciones para la eliminación de dicho polinucleótido u otros reactivos de dicho kit; o c) tanto a como b.

8.

Una célula que contiene dicho vector de expresión del apartado 3, en el que dicha célula es: a) una célula procariota; b) una célula eucariota; c) una célula bacteriana; d) una célula de levadura; e) una célula de insecto; g) una célula de mamífero; g) una célula de ratón; h) una célula de primate; o i) una célula humana.

9.

Un polipéptido antigénico aislado o recombinante: a) (IL-173) que comprende al menos:

i) un segmento de 8 aminoácidos contiguos idénticos de las porciones de codificación maduras de las SEC ID Nº 6, 8, 10 o 12; o ii) dos segmentos distintos de al menos 5 aminoácidos contiguos idénticos de las porciones de codificación

maduras de las SEC ID Nº 6, 8, 10 o 12; o b) (IL-174) que comprende al menos:

i) un segmento de 8 aminoácidos contiguos idénticos de las porciones de codificación maduras de las SEC ID Nº 14, 16 o 18; o ii) dos segmentos distintos de al menos 5 aminoácidos contiguos idénticos de las porciones de codificación

maduras de las SEC ID Nº 14, 16 ó 18. c) (IL-176) que comprende al menos:

i) un segmento de 8 aminoácidos contiguos idénticos de las porciones de codificación maduras de las SEC ID Nº 28 o ii) dos segmentos distintos de al menos 5 aminoácidos contiguos idénticos de las porciones de codificación

maduras de las SEC ID Nº 28; d) (IL-177) que comprende al menos:

i) un segmento de 8 aminoácidos contiguos idénticos de las porciones de codificación maduras de las SEC ID Nº 30 o ii) dos segmentos distintos de al menos 5 aminoácidos contiguos idénticos de las porciones de codificación

maduras de las SEC ID Nº 30.

10.

El polipéptido del apartado 9, en el que:

a) dicho segmento de 8 aminoácidos contiguos idénticos es al menos 14 aminoácidos contiguos; o b) uno de dichos segmentos de 5 aminoácidos contiguos comprende al menos 7 aminoácidos contiguos.

11.

El polipéptido del apartado 9, en el que:

A) (IL-173) dicho polipéptido:

a) comprende la SEC ID Nº 6, 8, 10 o 12; b) se une con selectividad a un anticuerpo policlonal generado contra un inmunógeno de las SEC ID Nº 6, 8, 10

o 12 maduras; c) comprende una pluralidad de distintos segmentos polipeptídicos de 10 aminoácidos contiguos de las SEC ID Nº 6, 8, 10 o 12 maduras; d) es una variante alélica natural de las SEC ID Nº 8 o 12; e) tiene una longitud de al menos 30 aminoácidos; o f) exhibe al menos dos epítopos no solapantes que son selectivos de las SEC ID Nº 6, 8, 10 o 12 maduras;

B) (IL-174) dicho polipéptido:

a) comprende las SEC ID Nº 14, 16 o 18 maduras. b) se une con selectividad a un anticuerpo policlonal generado contra un inmunógeno de las SEC ID Nº 14, 16 o 18 maduras. c) comprende una pluralidad de distintos segmentos polipeptídicos de 10 aminoácidos contiguos de las SEC ID Nº 14, 16 o 18 maduras. d) es una variante alélica natural de las SEC ID Nº 14 o 18; e) tiene una longitud de al menos 30 aminoácidos; o f) exhibe al menos dos epítopos no solapantes que son selectivos de la proteína de primate de las SEC ID Nº 14, 16 o 18 maduras.

C) (IL-176) dicho polipéptido:

a) comprende una secuencia madura de SEC ID Nº 28; b) se une con selectividad a un anticuerpo policlonal generado contra un inmunógeno de la SEC ID Nº 28 madura; c) comprende una pluralidad de distintos segmentos polipeptídicos de 10 aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº 28 madura; d) es una variante alélica natural de la SEC ID Nº 28; e) tiene una longitud de al menos 30 aminoácidos; o f) exhibe al menos dos epítopos no solapantes que son selectivos de la SEC ID Nº 28 madura; o

D) (IL-177) dicho polipéptido:

a) comprende una secuencia madura de SEC ID Nº 30; b) se une con selectividad a un anticuerpo policlonal generado contra un inmunógeno de las SEC ID Nº 30 madura; c) comprende una pluralidad de distintos segmentos polipeptídicos de 10 aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº 30 madura; d) es una variante alélica natural de la SEC ID Nº 30; e) tiene una longitud de al menos 30 aminoácidos; o f) exhibe al menos dos epítopos no solapantes que son selectivos de la SEC ID Nº 30 madura.

12.

El polipéptido del apartado 11, que:

a) es una composición estéril; b) no está glicosilado; c) está desnaturalizado; d) es un polipéptido sintético; e) está fijado a un sustrato sólido; f) es una proteína de fusión con un marcador de detección o de purificación; g) es una sustitución por 5 o menos de una secuencia natural; o h) es una variante de deleción o inserción de una secuencia natural.

13.

Un procedimiento de uso de dicho polipéptido del apartado 9:

a) para marcar dicho polipéptido, que comprenden marcar dicho polipéptido con un marcador radioactivo; b) para separar dicho polipéptido de otro polipéptido en una mezcla, que comprende pasar dicha mezcla en una matriz cromatográfica, separando de este modo dichos polipéptidos; c) para identificar un compuesto que se une de forma selectiva a dicho polipéptido, que comprende incubar dicho compuesto con dicho polipéptido en las condiciones adecuadas, de modo que hace que compuesto se una a dicho polipéptido; o d) para conjugar dicho polipéptido con una matriz, que comprende derivar dicho polipéptido con un reactivo errático y conjugando dicho polipéptido con dicha matriz.

14.

Un compuesto de unión que comprende una porción de unión a antígeno de un anticuerpo que se une con selectividad a dicho polipéptido del apartado 11, en el que dicho polipéptido:

a) (IL-173) comprende las SEC ID Nº 6, 8, 10 o 12 maduras; o b) (IL-174) comprende las SEC ID Nº 14, 16 o 18 maduras; c) (IL-176) comprende la SEC ID Nº 28 madura; o d) (IL-177) comprende la SEC ID Nº 30 madura.

15.

El compuesto de unión del apartado 14, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo policlonal que se produce contra:

a) (IL-173) SEC ID Nº 6, 8, 10 o 12; o b) (IL-174) SEC ID Nº 14, 16 o 18; c) (IL-176) SEC ID Nº 28; o d) (IL-177) SEC ID Nº 30.

16.

El compuesto de unión que del apartado 14, en el que dicho:

a) anticuerpo:

i) se inmunoselecciona; ii) se une a una proteína desnaturalizada; o iii) exhibe una Kd a dicho polipéptido de al menos 30 mM; o

b) dicho compuesto de unión:

i) está fijado a un sustrato sólido, incluida una perla o membrana plástica; ii) es una composición estéril; o iii) está marcado de forma detectable, incluido un marcador radioactivo o fluorescente.

17.

Un procedimientos de producción de un complejo antígeno-anticuerpo, que comprenden poner en contacto un polipéptido que comprende la secuencia de las SEC ID Nº 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 28, o 30 con un compuesto de unión del apartado 14 en condiciones que permite que se forme dicho complejo.

18.

El procedimiento del apartado 17, en el que dicho compuesto de unión es un anticuerpo y dicho polipéptido es una muestra biológica.

19.

Un kit que comprende dicho compuesto de unión del apartado 14 y:

a) un polipéptido de las SEC ID Nº 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 28, o 30 maduras; b) instrucciones de uso de dicho compuesto de unión para detección; o c) instrucciones para la eliminación de dicho compuesto de unión u otros reactivos de dicho kit.

20.

Un procedimiento de evaluar la selectividad de la unión de un anticuerpo a una proteína de las SEC ID Nº 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 28 o 30 maduras, que comprende poner en contacto dicho anticuerpo con dicha proteína y otra citoquina; y comparar la unión de dicho anticuerpo a dicha proteína y a dich citoquina.

LISTADO DE SECUENCIAS

La SEC ID Nº 1 es una secuencia de ácido nucleico de IL-172 de primate.

La SEC ID Nº 2 es una secuencia polipeptídica de IL-172 de primate.

La SEC ID Nº es la una secuencia de ácido nucleico de IL-172 murina.

La SEC ID Nº 4 es una secuencia polipeptídica de IL-172 murina.

La SEC ID Nº es una secuencia de ácido nucleico de IL-173 de primate.

La SEC ID Nº 6 es una secuencia polipeptídica de IL-173 de primate.

La SEC ID Nº 7 es una secuencia de ácido nucleico suplementaria de IL-173 de primate.

La SEC ID Nº 8 es una secuencia polipeptídica suplementaria de IL-173 de primate. La SEC ID Nº 9 es una secuencia de ácido nucleico de IL-173 murina. La SEC ID Nº 10 es una secuencia polipeptídica de IL-173 murina. La SEC ID Nº 11 es una secuencia de ácido nucleico suplementaria de IL-173 murina. La SEC ID Nº 12 es una secuencia polipeptídica suplementaria de IL-173 murina. La SEC ID Nº 13 es la secuencia de ácido nucleico de IL-174 de primate. La SEC ID Nº 14 es una secuencia polipeptídica de IL-174 de primate. La SEC ID Nº 15 es una secuencia de ácido nucleico de IL-174 murina. La SEC ID Nº 16 es una secuencia polipeptídica de IL-174 murina. La SEC ID Nº 17 es una secuencia de ácido nucleico suplementaria de IL-174 murina. La SEC ID Nº 18 es una secuencia polipeptídica suplementaria de IL-174 murina. La SEC ID Nº 19 es una secuencia de ácido nucleico de IL-171 de primate según la IUPAC. La SEC ID Nº 20 es una secuencia de ácido nucleico de IL-171 de primate. La SEC ID Nº 21 es una secuencia polipeptídica de IL-171 de primate. La SEC ID Nº 22 es una secuencia de ácido nucleico suplementaria de IL-171 de primate. La SEC ID Nº 23 es una secuencia polipeptídica suplementaria de IL-171 de primate. La SEC ID Nº 24 es una secuencia de ácido nucleico de IL-175 de primate según la IUPAC. La SEC ID Nº 25 es una secuencia de ácido nucleico de IL-175 de primate. La SEC ID Nº 26 es una secuencia polipeptídica de IL-175 de primate. La SEC ID Nº 27 es una secuencia de ácido nucleico de IL-176 de primate. La SEC ID Nº 28 es una secuencia polipeptídica de IL-176 de primate. La SEC ID Nº 29 es una secuencia de ácido nucleico de IL-177 de primate. La SEC ID Nº 30 es una secuencia polipeptídica de IL-177 de primate. La SEC ID Nº 31 es una secuencia polipeptídica de CTLA-8 de rata. La SEC ID Nº 32 es una secuencia polipeptídica de CTLA-8 de ratón. La SEC ID Nº 33 es una secuencia polipeptídica de CTLA-8 de primate. La SEC ID Nº 34 es una secuencia polipeptídica de CTLA-8 viral.

<110> Schering Corporation

<120> Citoquinas purificadas de mamífero, reactivos y procedimientos relacionados

<130> DX0917K

<140> 35 <141>

<150> USSN 09/228.822

<151>

40 <160> 34

<170> PatentIn Ver. 2.1

<210> 1

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<212> ADN

<213> primate

5 <220>

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<222> (1)..(540)

<220> 10 <221> mat_peptide

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<212> PRT

<213> primate

<400> 2

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<211> 543

<212> ADN

<213> roedor

15 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(540)

<220> 20 <221> mat_peptide

<222> (67)..(540)

<400> 3

<210> 4

<211> 180

<212> PRT

<213> roedor

<400> 4

<210> 5

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<213> primate

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(453)

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<212> PRT

<213> primate

<400> 6

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<213> primate

<220>

<221> CDS 10 <222> (59)..(664)

<220>

<221> mat_peptide

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<212> PRT

<213> primate

<400> 8

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<213> roedor

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(132)

<400> 9

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<220>

<221> CDS

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<220>

<221> mat_peptide

<222> (73)..(615)

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<212> PRT

<213> roedor

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<220>

<221> CDS

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<220>

<221> mat_peptide

<222> (67)..(501)

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<212> PRT

<213> primate

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<213> roedor

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(432)

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<212> PRT

<213> roedor

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<213> roedor

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(507)

<220>

<221> mat_peptide

<222> (49)..(507) 15

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<212> PRT

<213> roedor

<400> 18

<210> 19 10 <211> 521

<212> ADN

<213> primate

<220> 15 <221> misc_feature

<222> (1)..(521)

<223> nota= &quot;n puede ser a, c, g o t&quot;

<400> 19 20

<210> 20

<211> 521

<212> ADN

<213> primate

<220> 5 <221> CDS

<222> (1).. (369)

<220>

<221> misc_feature 10 <222> (281)

<223> nota= &quot;los nucleótidos 281, 367, 437, 462 y 468 son c; cada uno puede ser, como alternativa a, g, o t; el aminoácido traducido depende del código genético&quot;

<400> 20 15

<210> 21

<211> 123 20 <212> PRT

<213> primate

<400> 21

5 <210> 22

<211> 1107

<212> ADN

<213> primate

10 <220>

<221> CDS

<222> (115)..(705)

<220> 15 <221> mat_peptide

<222> (166)..(705)

<400> 22

<210> 23

<211> 197

<212> PRT

<213> primate

<400> 23

<210> 24

<211> 403

<212> ADN 15 <213> primate

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(403) 20 <223> nota &quot;n puede ser a, c, g o t&quot;

<400> 24 <210> 25

<211> 403 5 <212> ADN

<213> primate

<220>

<221> CDS 10 <222> (71)..(403)

<220>

<221> mat_peptide

<222> (131)..(403) 15

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(403)

<223> nota= &quot;n puede ser a, c, g, o t; el aminoácido traducido depende del código genético&quot; 20

<400> 25

<210> 26

<211> 111

<212> PRT

<213> primate

<400> 26

<210> 27

<211> 784 5 <212> ADN

<213> primate

<220>

<221> CDS 10 <222> (3).. (281)

<400> 27

<210> 28

<211> 93

<212> PRT

<213> primate

<400> 28

<210> 29

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<212> ADN 15 <213> primate

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(189) 20

<400> 29

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<212> PRT

<213> primate

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<210> 32

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<212> PRT

<213> roedor

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<212> PRT

<213> primate

<400> 33

<210> 34

<211> 151

<212> PRT

<213> viral

<400> 34

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo que se une al polipéptido maduro comprendido en la SEC ID Nº
2. 14.
3. 2. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo se produce contra el polipéptido maduro 5 comprendido en la SEC ID Nº 14.

4. 3.

   Un kit que comprende el anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 o 2, y un polipéptido de la SEC ID Nº 14 madura..

5. 4.

   Una composición de diagnóstico que comprende el anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 o 2.

6. 5.

   Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 o 2.

   10 6. Un procedimientos de producción de un complejo antígeno-anticuerpo, que comprenden poner en contacto un polipéptido que comprende la secuencia de SEC ID Nº 14 con el anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 o 2, en condiciones que permiten la formación de dicho complejo.