ES2334231T3 - Uso de secuencias regulatorias para la expresion transitoria especifica en celulas determinadas de manera neuronal. - Google Patents

Uso de secuencias regulatorias para la expresion transitoria especifica en celulas determinadas de manera neuronal. Download PDF

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Abstract

Uso de una secuencia reguladora seleccionada del grupo que consiste en (a) secuencias reguladoras que comprenden la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1, mostrada en SEQ ID NO: 2, mostrada en SEQ ID NO: 3 o mostrada en SEQ ID NO: 4; (b) secuencias reguladoras que comprenden la secuencia de nucleótidos contenida en la inserción del clon DSM 15111 y obtenible mediante amplificación usando dos oligonucleótidos que tienen las secuencias indicadas en SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10; (c) secuencias reguladoras que comprenden al menos una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 de la posición 1166 a 1746, de la posición 1166 a 2049, de la posición 1785 a 1843 o de la posición 1953 a 2775; (d) secuencias reguladoras que comprenden al menos una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 de la posición 529 a 1079, de la posición 529 a 1390, de la posición 1118 a 1175 o de la posición 1291 a 2137; (e) secuencias reguladoras que comprenden al menos una parte funcional de una secuencia de (a) a (d) en donde dicha parte funcional produce expresión específica en células determinadas neuronales proliferativas; (f) secuencias reguladoras que producen expresión específica en células determinadas neuronales proliferativas que comprenden una secuencia de nucleótidos que es al menos el 75% idéntica a una secuencia definida en (a) a (d) o que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos el 78% idéntica a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1 de la posición 1166 a 1746 o de la posición 1166 a 2049 o a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 2 de la posición 529 a 1079 o de la posición 529 a 1390, que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos el 82% idéntica a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1 de la posición 1785 a 1843 o a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 2 de la posición 1118 a 1175 o que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos el 75% idéntica a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1 de la posición 1953 a 2775 o a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 2 de la posición 1291 a 2137; y (g) secuencias reguladoras que comprenden una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas de hibridación con una hebra complementaria de la secuencia reguladora definida en (a) a (f) y que produce expresión específica en células determinadas neuronales proliferativas, para la expresión temprana, transitoria de un secuencia de nucleótidos heteróloga en células determinadas neuronales siempre que no se modifique la identidad genética de la línea germinal de seres humanos y en donde dichas células no son células troncales embrionarias humanas.

Description

Uso de secuencias regulatorias para la expresión transitoria específica en células determinadas de manera neuronal.
La presente invención se refiere al uso de secuencias reguladoras para mediar la expresión específica transitoria temprana en células determinadas neuronales proliferativas. Además, se divulgan los usos de moléculas recombinantes de ácido nucleico que comprenden dichas secuencias reguladoras para mediar la expresión específica transitoria temprana en células determinadas neuronales proliferativas así como para la generación de organismos transgénicos no humanos y/o células huésped. Además, la invención proporciona animales transgénicos no humanos y/o células huésped que comprenden dichas secuencias reguladoras y/o moléculas recombinantes de ácido nucleico siempre que no se modifique la identidad genética de la línea germinal de seres humanos y en donde dicha célula huésped no es una célula troncal embrionaria humana. La invención también describe métodos para la preparación de tales vectores, células huésped y animales transgénicos no humanos así como métodos para la detección y/o aislamiento de células determinadas neuronales. Además, se proporcionan métodos para el cribado de compuestos capaces de regular la actividad de células determinadas neuronales, neurogénesis, estimular la proliferación de células precursoras comprometidas neuronalmente y/o diferenciación neuronal y la invención también se refiere a métodos para la detección y análisis de procesos de diferenciación neuronal, migración neuronal y/o determinación neuronal. Por último, la invención se refiere a composiciones diagnósticas y farmacéuticas que comprenden las secuencias reguladoras, moléculas recombinantes de ácido nucleico, células huésped o células determinadas neuronales aisladas descritas aquí.
Las células troncales neurales (NSC) multipotentes del cerebro en desarrollo y adulto proliferan, se reproducen y dan lugar a neuronas, astrocitos y oligodendroglía, los tres tipos celulares principales del sistema nervioso central (SNC). La neurogénesis, la diferenciación neuronal de NSC multipotentes, requiere compromiso de destino celular, restricción de linaje neuronal y posterior diferenciación y maduración. Los cambios posteriores en la identidad celular desde NSC a neuroblastos, células precursoras restringidas/determinadas neuronales y neuronas maduras están regulados por cambios intrínsecos en la expresión génica.
Las NSC multipotentes se caracterizan por la expresión de "marcadores", como nestina, Notch1 y Musashi (véase Lendahl, Cell 60 (1990), 585-595). Sin embargo, estos marcadores no están restringidos a las NSC, y por lo tanto son insuficientes para la identificación de NSC. Por ejemplo Musashi se encuentra en células hepáticas, células de sertoli de testículo y células sanguíneas de cordón umbilical, como se muestra en Shu, Biochem. Biophys. Res. Commun. 293 (2002), 150-154; Saunders, Biol. Reprod. 66 (2002), 500-507 y Sanchez-Ramos, Exp. Neurol. 171 (2001), 109-115. Las células precursoras restringidas/determinadas neuronales se caracterizan por la expresión de PSA-NCAM (Doetsch, J. Neurosci. 17 (1997), 5046-5061). Sin embargo, la expresión de PSA-NCAM no está restringida a células precursoras determinadas neuronales, sino que también se encuentra en precursores de oligodendrocitos; véase Grinspan, J. Neurosci. Res. 41 (1995), 540-551. El isotipo \betaIII de tubulina se usa como marcador neuronal temprano (entre otros, Palmer, Nature 411 (2001), 42-43). Su expresión, sin embargo, no está restringida a células precursoras determinadas neuronales, sino que se puede detectar aún en algunas neuronas maduras y también en células no neuronales del epitelio pigmentoso como muestran Moskowitz, J. Neurosci. Res. 34 (1993), 129-134 y Vinores, Exp. Eye Res. 60 (1995), 385-400.
El SNC de mamífero adulto, aunque clásicamente se ve como un tejido no regenerativo, mantiene el potencial de generar nuevas neuronas. Dos áreas de neurogénesis adulta están bien documentadas: el giro dentado de la formación del hipocampo y el eje pared del ventrículo lateral/bulbo olfatorio, como describió por primera vez Altman ((1965) J. Comp. Neurol 124, 319-335 y (1969) J. Comp. Neurol. 137, 433-457). En el hipocampo, las neuronas recién generadas surgen de células en proliferación en el límite entre el hilio y la capa de células granulares, véase (Cameron, Neuroscience 56 (1993), 337-344; Kuhn, J. Neurosci 16 (1996), 2027-2033 o Seri, J. Neurosci 21 (2001), 7153-7160). La neurogénesis de las células granulares del hipocampo continúa durante toda la vida, aunque se observa un declive constante con el envejecimiento (Kuhn (1996), loc. cit.; Kempermann, J. Neuroscience 18 (1998), 3206-3212). Las células destinadas al bulbo olfatorio (BO), se originan de una población de células troncales neurales y progenitores que se dividen en la pared del ventrículo lateral (Doetsch, J. Neurosci 17 (1997), 5046-5061). Las células precursoras restringidas/determinas neuronales recién generadas migran hacia el BO a través de una estructura denominada el canal migratorio rostral (CMR). En el BO, las células precursoras restringidas neuronales que entran se integran y completan la diferenciación como células granulares y neuronas periglomerulares (Betarbet, J. Dev. Neurosci 14 (1996), 921-930; Winner, Eur J Neurosci. 16(9 (2002)), 1681-1689).
Aunque la neurogénesis aún tiene lugar en el SNC de mamífero adulto, el cerebro dañado es en gran parte incapaz de una auto-reparación estructural funcionalmente significativa. Esto refleja la incapacidad de las NSC y los precursores restringidos neuronales presentes en las regiones neurogénicas de migrar hacia las regiones dañadas en gran cantidad y reconstruir circuitos. Para alcanzar una masa crítica de células de reemplazo en una localización específica del SNC, el injerto celular parece ser un planteamiento prometedor. Se han investigado diferentes fuentes de células, tales como tejido mesencefálico fetal disociado, células troncales derivadas de blastocistos o prosencéfalos embrionarios expandidas in vitro y células troncales neurales del cerebro adulto para su uso potencial en experimentos de trasplante, véase, entre otros, Brundin, Brain 123 (2000), 1380-1390; Freed. N. Engl. J. Med. 344 (2001), 710-719; Bjorklund; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002), 2344-2349; Brustle, Curr. Opin. Neurobiol. 6 (1996), 688-695; Englund, Exp. Neurol. 173 (2002), 1-21 o Gage, Science 287 (2000), 1433-1438. En seres humanos que padecen la enfermedad de Parkinson, el implante de tejido fetal ha producido algún grado de recuperación funcional (Piccini, Nat. Neurosci. 2 (1999), 1137-1140; Brundin (2000), loc. cit. o Freed (2001), loc. cit.). Sin embargo, el acceso muy limitado a tejido fetal y las preocupaciones éticas que rodean su uso en pacientes han reforzado la búsqueda de fuentes alternativas de células precursoras restringidas neuronales, en particular aquellas recogidas de tejidos adultos. Sólo recientemente, se han acometido los primeros intentos para el aislamiento directo de NSC mediante antígenos de superficie celular o mediante expresión de genes indicadores dirigidos por promotores. Las NSC multipotentes se aislaron directamente de tejido cerebral fetal humano usando selección positiva para CD133 y selección negativa para CD34 y CD45 (Uchida, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000), 14720-14725) o selección para el dominio extracelular de Notch1 (Johansson (1999), loc. cit.). Sin embargo, ambos planteamientos tienen sus limitaciones, ya que ni la expresión CD133, ni la de Notch1 es específica para células troncales neurales, como se muestra en Yin, Blood 90 (1997), 5002-5012 o Stier, Blood 99 (2002), 2369-2378. Se emplearon marcadores genéticos tales como el elemento potenciador específico de células troncales neurales del gen de la nestina, el promotor pan-neuronal de la tubulina \alpha1 (T\alpha1) o el promotor de 2',3'-nucleótido cíclico 3'-fosfodiesterasa (CNP) de precursores de oligodendroglía para el aislamiento y enriquecimiento de poblaciones de progenitores neuronales específicos que expresan proteína fluorescente verde (GFP) bajo el control de los elementos promotor/potenciador de diferentes tipos celulares; véase Roy, J. Neurosci. Res. 59 (2000), 321-331, Wang, Dev. Neurosci. 22 (2000), 167-176; Roy, J. Neurosci. 19 (1999), 9986-9995; Sawamoto, J. Neurosci. Res. 65 (2001), 220-227; Kawaguchi, Mol. Cell Neurosci. 17 (2001), 259-273; WO 00/23571; WO 98/32879 o WO 01/53503. Con todo, los elementos genéticos empleados son solamente útiles para el aislamiento de ciertas poblaciones celulares; el elemento del promotor de nestina es útil para el aislamiento de células troncales neurales multipotentes, el promotor de la tubulina \alpha1 (T\alpha1) para neuronas diferenciadas, y el promotor de CNP para el aislamiento de precursores de oligodendrocitos. Ninguno de los elementos genéticos descritos hasta ahora es específico para y se puede usar para la detección y aislamiento de células precursoras restringidas/determinadas neuronales, en particular células que son capaces de proliferación adicional. Tal elemento genético o tal marcador idealmente se debe inducir en la población precursora restringida neuronal, para detectar las neuronas nuevas mientras se generan, y posteriormente disminuir en neuronas maduras. El progreso en el campo de la neurogénesis, biología de NSC (célula troncal neuronal), técnicas de aislamiento celular y aplicaciones clínicas futuras para las NSC está actualmente limitado por la falta de expresión de genes o marcadores específicos de tipo celular, en particular marcadores para neuroblastos, células determinadas neuronales o células precursoras neuronales que producen únicamente neuronas. Hay una necesidad clara para identificación e introducción de tales
marcadores.
La neurogénesis en adultos se detecta típicamente mediante la incorporación de bromodesoxiuridina (BrdU) en las células en división y comarcaje de células positivas para BrdU con marcadores para neuronas maduras. La BrdU es un marcador de la fecha de nacimiento que marca de forma permanente células nacidas en el momento de la aplicación de la BrdU y permite, en combinación con marcadores específicos de tipos celulares, el análisis de destino celular distinto. Con todo, tales métodos, como la incorporación de BrdU tienen serias limitaciones en el uso médico y científico, debido, entre otros, a los obstáculos técnicos y fisiológicos y a las propiedades toxicológicas de la BrdU. Además, se ha usado el marcaje con retrovirus para seguir las células en división y su destino celular en el SNC. Sin embargo, estos métodos tienen sus limitaciones en la detección de neurogénesis (Cooper-Kuhn, Brain Res. Dev. Brain. Res. 134 (2002), 13-21). Por ejemplo, la incorporación de retrovirus requiere inyecciones intracraneales agresivas, que producen lesiones parenquimales y posibles reacciones inflamatorias. Además, las barreras de difusión previenen el marcaje con retrovirus de poblaciones progenitoras más grandes. Por último, aunque la transfección sea estable, los genes indicadores codificados viralmente pueden disminuir con el tiempo (Duch, J. Virol 68 (1994), 5596-5601). Por otra parte, la BrdU, que se integra en el ADN de las células en división, se diluye en la progenie de una célula marcada después de múltiples divisiones posteriores. Las dificultades asociadas con estos métodos y la incompatibilidad con análisis de tejido humano piden indicadores de neurogénesis nuevos, específicos y cuantificables.
Durante el desarrollo del sistema nervioso central, la proteína de unión a microtúbulos doblecortina (DCX) se asocia con migración de neuroblastos. Además de este papel en el desarrollo, la expresión de DCX se mantiene alta en ciertas áreas del cerebro adulto de mamífero. Estas áreas, principalmente el giro dentado y la pared del ventrículo lateral junto con el canal migratorio rostral y el bulbo olfatorio, mantienen la capacidad de generar nuevas neuronas en la edad adulta.
La doblecortina (DCX) se detecta primero en el día embrionario 10,5 de ratón, DCX se expresa a niveles altos en el SNC en desarrollo de ratón (des Portes, Cell 92 (1998), 51-61; Francis, Neuron 23 (1999), 247-256 y WO 99/27089). La expresión de DCX se mantiene en áreas de neurogénesis continua en el cerebro adulto (Nacher, Eur. J. Neurosci 14 (2001), 629-644). La morfología de las células que expresan DCX es consistente con la de neuronas que migran. Además, muchas de estas células se comarcaron con PSA-NCAM, un antígeno también presente en neuronas que migran (Bonfanti, Neurosci 62 (1994), 291-305). El gen Dcx se describió originalmente en el contexto de trastornos corticales humanos (Gleeson Cell 92 (1998), 63-72). Los alelos mutantes de Dcx provocan un deterioro migratorio de neuronas y producen displasia cortical (des Portes (1998), loc. cit.; Gleeson (1998) loc. cit.; y Couillard-Despres, Curr. Mol. Med. 1 (2001), 677-688).
Como se ha mencionado aquí anteriormente, se han descrito en la técnica algunos marcadores o patrones de expresión adicionales relacionados con el sistema neuronal. Por ejemplo, WO 93/07280 describe la transcripción específica de astrocitos de genes humanos. En particular, WO 93/07280 divulga secuencias capaces de regular la transcripción específica de astrocitos de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP). WO 95/25792 describe un promotor neuronal endógeno expresado durante el crecimiento de neuronas tanto en desarrollo como maduras, es decir el promotor de \alpha-tubulina T\alpha1. Según WO 95/25792 este promotor dirige la expresión en neuronas embrionarias, neuronas de recién nacidos y se mantiene expresado en neuronas adultas. En WO 98/32879 se emplean una pluralidad de promotores en un método para separar células, en donde algunos de los promotores descritos son promotores neuronales o específicos de neuronas que comprenden el promotor de la enolasa, el promotor de la MAP-1B, el promotor de la descarboxilasa, el promotor de la dopamina \beta-hidrolasa, el promotor de NCAM, HES-5, promotor de la proteína HLH, el promotor de la \alpha1 tubulina (también descrito en la anteriormente mencionada WO 95/25792), promotor de \alpha-internexina, promotor de periferina o el promotor de GAP-43. Todos los promotores mencionados en WO 98/32879 son promotores que no son específicos para células progenitoras tempranas específicas de neuronas. En particular se divulgan: el promotor de la enolasa específica de neuronas (Andersen, Eur J. Cell Bio 62 (1993), 324-332; Alouani, Hum. Gene Ther. 3 (1992), 487-499); el promotor de MAP-1B (Liu y Fischer, Gene 171 (1996), 307-308); el promotor de L1 (Chalepakis, DNA Cell Biol. 13 (1994), 891-900); el promotor de la aminoácido aromático descarboxilasa (Le Van Thai, Mol. Brain Res. 17 (1993), 227-238); el promotor de la dopamina \beta-hidroxilasa (Mercer, Neuron 7 (1991), 703-716); el promotor de NCAM (Holst, J. Biol. Chem. 269 (1994), 22245-22252); el promotor de la proteína HES-5 HLH (Takebashi, J. Biol. Chem. 270 (1995), 1342-1349); el promotor de la \alpha1-tubulin (WO 95/25792, loc. cit.); el promotor de \alpha-internexina (Ching, J. Biol. Chem. 266 (1991), 19459-19468); el promotor de periferina (Karpov, Biol. Cell 76 (1992), 43-48); el promotor de sinapsina (Chin, J. Biol. Chem. 269 (1994), 18507-18513); el promotor de GAP-43 (Starr, Brain Res. 638 (1994), 211-220); el promotor de la nucleótido cíclico fosforilasa I (Scherer, Neuron 12 (1994), 1363-1375); el promotor de la proteína básica de la mielina (Wrabetz, J. Neurosci. Res. 36 (1993), 455-471); el promotor del núcleo mínimo del virus JC (Krebs, J. Virol. 69 (1995), 2434-2442); el promotor de la proteína proteolípido (Cambi y Kamholz, Neurochem. Res. 19 (1994), 1055-1060); el promotor de la nucleótido cíclico fosforilasa II (Scherer, Neuron 12 (1994), 1363-1375). Para proporcionar medios de identificar células precursoras de oligodendrocitos, WO 00/23571 propone el uso de un promotor que específicamente dirige la expresión en dichos oligodendrocitos o células progenitoras de los mismos. Como promotores específicos, se divulgan los siguientes promotores: el promotor de CNP-P1, el promotor de CNP-P2, el promotor de CNP-P1+P2, el promotor de NCAM, el promotor de la proteína básica de la mielina, el promotor del núcleo mínimo del virus JC, el promotor de la glicoproteína asociada a mielina, el promotor de la proteína proteolípido o el promotor de P/CNP2. WO 01/53503 describe un método para enriquecer células progenitoras neurales del hipocampo empleando un promotor que específicamente dirige la expresión en células progenitoras neurales pero no en otras células de tejido del hipocampo. No obstante, WO 01/53503 propone el uso del promotor de la tubulina T\alpha1 o el potenciador de nestina (Lothian, Eur. J. Neurosci. 9 (1997), 452-462). Como se ha señalado aquí anteriormente, el promotor de la tubulina T\alpha1 también es activo en neuronas maduras y la nestina no sólo se expresa en células neuroepiteliales sino también en otras poblaciones celulares (véase Cai, Dev. Biol. 251 (2002), 221-240). Además, la nestina de filamento intermedio también se expresa después de lesión traumática de la médula espinal o tejido cerebral; véase entre otros, Shibuya, Neurosci. 114 (2002), 905-916. Además, la expresión de nestina persiste en astrocitos (Schmid-Kastner, Int. J. Dev. Neurosci. 20 (2002), 29-38) y se ha propuesto que un gran porcentaje de células que expresan nestina están comprometidas a células astrogliales (Wei, Brain Res. Dev. Brain Res. 139 (2002), 9-17). El promotor de la enolasa específica de neuronas con frecuencia se expresa en varios tumores, y se encuentra de forma rutinaria en análisis histopatológicos. Por lo tanto, el uso médico o diagnóstico de este promotor es arriesgado puesto que puede producir un enriquecimiento de células que son tumorigénicas o un enriquecimiento en células poco diferenciadas de origen no neuronal; véase Lee, Surg. Today 30(7) (2000), 658-662; Nakachi, J. Gastroenterol 35(8) 6 (2000), 31-634; Standop, Pancreas 23(1) (2001), 36-39 o Muroi, Intern. Med. 39(10) (2000), 843-846. El promotor de MAP-1B se expresa a nivel alto en neuronas maduras sometidas a reorganización o brote sinápticos. También se expresa mucho en neuronas maduras presente en los ganglios de la raíz dorsal y las neuronas motoras de la médula espinal, véase Illing, Audiology and Neurootology 6 (2001), 319-345 o Soares, Eur. J. Neurosci. 16(4) (2002), 593-606. El promotor de L1 produce expresión de proteínas en neuronas maduras del cerebro tales como células de Golgi, granulares, en cesta y estrelladas del cerebelo y las interneuronas piramidales, granulares e hiliares en el hipocampo y ganglio, células amacrinas y horizontales de la retina; Ranker, J. Neurosci. 23(1) (2003), 277-286. En mamíferos adultos el promotor de la aminoácido aromático descarboxilasa es activo en las neuronas dopaminérgicas y serotoninérgicas, por lo tanto, el promotor es solamente activo en neuronas maduras diferenciadas; Chatelin, Brain Res. Mol. Brain Res. 97(2) (2001), 149-160. El promotor de la dopamina beta-hidroxilasa es principalmente activo en neuronas dopaminérgicas diferenciadas, Matsushita, J. Neurochem. 82(2) (2002), 295-304. El promotor de NCAM no es específico de neuronas, ya que durante la miogénesis in vitro de células musculares, se puede observar un aumento de algunos transcritos de NCAM. Además, NCAM también se puede expresar en células de Schwann; Roubin, Exp. Cell Res. 200(2) (1992), 500-505 o Dedkov, Acta Neuropathol 103(6) (2002), 565-574. El promotor de HES-5 hélice-bucle-hélice es un promotor que se sabe que es activo en células que se diferencian a astrocitos; Ohtsuka, J. Biol. Chem. 276(32) (2001), 30467-30474. En el SNC adulto el promotor de la alfa-internexina es activo principalmente en neuronas diferenciadas del cerebro, cerebelo y médula espinal. En particular, aún es activo en las células granulares del cerebelo; Ching, J. Neurosci. 19(8) (1999), 2974-2986 y Lavavasseur, Mol. Brain Res. 69 (1999), 104-112. El promotor de la periferina es todavía activo en muchas neuronas maduras diferenciadas del sistema nervioso periférico. En el sistema nervioso central, se expresa en neuronas con proyecciones periféricas. Se puede reinducir en el sistema nervioso central después de lesión perforante e isquemia cerebral; véase, entre otros, Beaulieu. Brain Res. 946 (2002), 153-161. También el promotor de la sinapsina es activo en neuronas maduras diferenciadas; véase, Chin, J. Biol. Chem. 269 (1994), 18507-18513. De forma similar, el promotor de GAP-43 se induce en neuronas maduras en regeneración; véase Uvadia, Development 128(7) (2001), 1175-1182. El promotor de la nucleótido cíclico fosforilasa I, el promotor de la proteína proteolípido y el promotor de la proteína básica de la mielina están activados y son específicos en oligodendrocitos; véase, Scherer, Neuron 12(6) (1994), 1365-1375; Wrabetz, J. Neurosci. Res. 36(4) (1993), 455-471 y Cambi, Neurochem. Res. 19(8) (1994), 1055-1060. De forma similar, el promotor de la nucleótido cíclico fosforilasa I es activo en precursores de oligodendrocitos; Scherer, Neuron 12(6) (1994), 1365-1375. Además, el promotor del núcleo mínimo del virus JC previamente descrito in vivo es solamente activo en células de glía; véase Krebs, J. Virol. 69(4) (1995), 2432-2442.
En resumen, hasta la fecha no hay disponibles ni marcadores ni secuencias de regulación génica muy específicos que proporcionen medios de detección de células restringidas/determinadas neuronales o que medien la expresión específica en tales células en mamíferos, preferiblemente seres humanos.
La discusión de la técnica anterior aquí anteriormente destaca la necesidad para medios y métodos para la detección y/o aislamiento de células específicas que están restringidas a un destino neuronal, es decir, para la detección y aislamiento de células precursoras restringidas neuronales. Las dificultades asociadas con los métodos de la técnica anterior discutidos aquí anteriormente y la incompatibilidad con análisis de tejidos humanos confirman que se desean indicadores de neurogénesis nuevos, específicos y cuantificables. Considerando el beneficio terapéutico de tales células y la constante necesidad de expresión génica específica de células, el problema técnico que subyace a la presente invención es la provisión como marcadores selectivos y métodos de marcaje para células determinadas neuronales in vivo e in vitro.
Las células divulgadas y usadas aquí y que son parte de la presente invención no son células troncales embrionarias humanas y la identidad de la línea germinal de seres humanos no se modifica.
Según la invención, este problema se resuelve mediante la provisión de las formas de realización de las reivindicaciones.
De esta manera, la presente invención se refiere al uso de una secuencia reguladora para la expresión transitoria temprana específica de una secuencia heteróloga de nucleótidos en células determinadas neuronales proliferativas, seleccionándose dicha secuencia reguladora del grupo que consiste en
(a)
secuencias reguladoras que comprenden la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 1, como se muestra en SEQ ID NO: 2, como se muestra en SEQ ID NO: 3 o como se muestra en SEQ ID NO: 4;
(b)
secuencias reguladoras que comprenden la secuencia de nucleótidos contenida en la inserción del clon DSM 15111 y obtenibles mediante amplificación usando dos oligonucleótidos que tienen las secuencias indicadas en SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10;
(c)
secuencias reguladoras que comprenden al menos una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 desde la posición 1166 a 1746, de la posición 1166 a 2049, de la posición 1785 a 1843 o de la posición 1953 a 2775;
(d)
secuencias reguladoras que comprenden al menos una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 de la posición 529 a 1079, de la posición 529 a 1390, de la posición 1118 a 1175 o de la posición 1291 a 2137;
(e)
secuencias reguladoras que comprenden al menos una parte funcional de una secuencia de (a) a (d) y que producen expresión específica en células determinadas neuronales;
(f)
secuencias reguladoras que comprenden una secuencia de nucleótidos que es al menos el 75% idéntica a una secuencia como se define en (a) a (d) o que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos el 78% idéntica a la secuencia de nucleótidos como se muestra en SEQ ID NO: 1 de la posición 1166 a 1746 o de la posición 116 a 2049 o a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 2 de la posición 529 a 1079, de la posición 529 a 1390 que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos el 82% idéntica a la secuencia de nucleótidos como se muestra en SEQ ID NO: 1 de la posición 1785 a 1843 o a la secuencia de nucleótidos como se muestra en SEQ ID NO: 2 de la posición 1118 a 1175 o que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos el 75% idéntica a la secuencia de nucleótidos como se muestra en SEQ ID NO: 1 de la posición 1953 a 2775 o a la secuencia de nucleótidos como se muestra en SEQ ID NO: 2 de la posición 1291 a 2137; y
(g)
secuencias reguladoras que comprenden una secuencia de nucleótidos que hibrida con una hebra complementaria de la secuencia reguladora definida en (a) a (f).
Las secuencias reguladoras descritas aquí son capaces de impartir expresión específica de célula, determinada neuronal a las secuencias de nucleótidos que controlan. Además, las secuencias reguladoras descritas aquí tienen la ventaja de que son activas en células determinadas neuronales en proliferación.
Como se documenta en los ejemplos adjuntos la invención se basa en el sorprendente descubrimiento de que la doblecortina (DCX) se expresa de forma transitoria y temprana en células progenitoras neuronales en proliferación, neuroblastos proliferantes recién generados, células precursoras neuronales en migración así como células determinadas/restringidas neuronales en proliferación. Todas estas células producen neuronas, y la secuencia reguladora como se define aquí puede dirigir con éxito la expresión de genes heterólogos o secuencias codificantes en células que son determinadas neuronales/restringidas neuronales y mitóticamente activas.
En esta invención, se muestra que la doblecortina actúa como un indicador para neurogénesis adulta y se determinó el patrón temporal de expresión de DCX en regiones neurogénicas del cerebro adulto. La invención como se documenta en los ejemplos, también se refiere al hecho de que se puede mostrar que cuando las células recién generadas empiezan a expresar marcadores neuronales maduros, la inmunorreactividad de DCX desciende bruscamente por debajo del nivel de detección y permanece indetectable después. Este patrón de expresión transitorio de DCX en células progenitoras neuronalmente comprometidas/neuroblastos en proliferación documenta que DCX es un marcador adecuado para neurogénesis adulta y proporciona, entre otros, una alternativa al marcaje con BrdU. También se observa y documenta que la cantidad de células que expresan DCX disminuye con la edad, lo que coincide con la reducción de la neurogénesis en el giro dentado en envejecimiento. Los resultados de la invención solo se pudieron obtener puesto que los anticuerpos empleados en este estudio son muy específicos para DCX. Además, los ejemplos muestran convincentemente que la secuencia reguladora, que se refiere a la expresión de DCX in vivo y como se define aquí, es suficiente y específicamente activa en células determinadas neuronales/restringidas neuronales. Como se documenta en los ejemplos adjuntos, en un ratón transgénico adulto que expresa EGFP bajo el control de la secuencia reguladora de la invención, se encuentra alta expresión de EGFP exclusivamente en regiones neurogénicas del cerebro. No se puede detectar expresión en órganos diferentes del SNC, tales como piel, músculo, intestino, riñón, hígado, corazón, pulmón, etc. Dentro de las regiones neurogénicas (giro dentado del hipocampo, pared ventricular, canal rostra-migratorio y bulbo olfatorio), la expresión de EGFP se solapa en gran parte con la expresión de DCX endógena. Por lo tanto, EGFP bajo el control de la secuencia reguladora como se define aquí se expresa en células determinadas/restringidas neuronales que son mitóticamente activas. Además, la morfología de las células que expresan EGFP se parece a la de neuronas jóvenes inmaduras o a la de células precursoras neuronales en migración. En el contexto de esta invención, se puede mostrar que la expresión de EGFP no colocaliza con la proteína ácida fibrilar glial (GFAP), un marcador de astrocitos, excluyendo un destino de célula astroglial de las células positivas para EGFP. De forma similar, la secuencia reguladora de la invención no dirige la expresión de EGFP en células HEK293, un tipo de linaje celular no neuronal.
La neurogénesis es un proceso que implica la regulación de proliferación, determinación y diferenciación celulares, en particular de células similares a neuronas, pero no limitadas a, neuronas dopaminérgicas/colinérgicas/GABAérgicas o noradrenérgicas. Las células troncales neurales son células multipotentes que se dividen lentamente que están en las regiones neurogénicas. Dan lugar a células precursoras determinadas neuronales de división rápida que mediante proliferación aumentan y potencian la actividad neurogénica de una célula troncal neural. Después de varias rondas de división se vuelven posmitóticas y empiezan a diferenciarse neuronalmente y a madurar. Por lo tanto, los cambios dinámicos del nivel de neurogénesis se producen principalmente a nivel de proliferación de precursores neuronales. Las células que dan lugar a células que expresan DCX podrían ser proliferativas o quiescentes. En el contexto de esta invención, "quiescente" significa células que actualmente no se dividen que tienen el potencial de dividirse en el futuro. El término "neurogénesis" como se usa aquí, describe todos los sucesos que se producen cuando las células en un punto de su vida inducen e inician un programa de determinación neuronal/diferenciación neuronal que finalmente produce la adquisición de un fenotipo neuronal. Dichas células pueden ser células troncales neurales, pero también pueden ser otras células/tipos de células del organismo que tienen el potencial de adquirir un fenotipo neuronal. Se dan ejemplos correspondientes más adelante y en la parte experimental.
Según esta invención, el término "expresión transitoria y temprana"/"expresión temprana transitoria" define un periodo de tiempo que empieza después del momento en que una célula se ha restringido a un destino neuronal, pero antes de que dicha célula exprese un marcador para células neuronales maduras/neuronas, tal como NeuN. Según esta invención y documentado en los ejemplos, la actividad de la secuencia reguladora de DCX descrita aquí disminuye progresivamente concomitante con la maduración neuronal, definida por la aparición de marcadores neuronales maduros, como NeuN.
Como se demuestra en la parte experimental, se pudo mostrar que DCX se expresa temprano, ya durante la proliferación de neuroblastos, y mucho antes (7 días) del inicio de la expresión de NeuN en el giro dentado de rata. Esto está en fuerte contraste con datos de Kempermann, Development 130 (2003), 391-399, que demuestra que las neuronas adquieren un fenotipo maduro (expresión de NeuN) justo después del nacimiento celular (1 día después de la incorporación de BrdU). Basado en estos datos, Kempermann concluye que el uso de DCX no es suficiente como indicador de neurogénesis. Además, y en contraste con esta invención, Cooper-Kuhn (2002), loc. cit. mostró que DCX no está presente en el conjunto proliferativo de precursores neuronales, sino sólo en células posmitóticas no proliferativas. Sin embargo, para los usos, métodos, células genéticamente modificadas y organismos no humanos proporcionados en esta invención es particularmente importante que DCX se exprese en células proliferativas. Por ejemplo, para el aislamiento de células progenitoras neuronalmente comprometidas, para la propagación in vitro, para procedimientos de cribado (de fármacos) que buscan compuestos con la capacidad de aumentar el conjunto de células progenitoras neuronalmente comprometidas in vitro así como para intervenciones médicas en el cerebro adulto como se describe aquí, es importante que se empleen células proliferativas neuronalmente comprometidas capaces de expresar específicamente secuencias heterólogas (moléculas de ácido nucleico, genes, etc.) como se describe aquí. Todos estos usos y métodos, según esto, requieren que el tipo de célula al que se dirigen sea proliferativamente activa.
El término "célula determinada neuronal" se refiere a una célula/tipo de célula que (después de y durante la diferenciación) producirán exclusivamente, directamente o a través de su progenie, neuronas. También se prevé que dicho término se refiera a células/tipos celulares que, en marcos experimentales o en condiciones in vitro seleccionadas, adquieren un fenotipo neuronal. Un ejemplo de tales condiciones se da en la parte experimental adjunta que se refiere a células del epitelio pigmentado de la retina (RPE), en donde se ilustra que las secuencias reguladoras descritas aquí pueden ser activas en células RPE y que estas células tienen la capacidad de adquirir un fenotipo neuronal. Por lo tanto, el término "célula determinada neuronal" también comprende células que no son necesariamente de origen neuro-ectodérmico, como entre otras, células del sistema hematopoyético, células mesenquimatosas o células ectodérmicas. Se dan definiciones y explicaciones adicionales para el término "célula determinada neuronal" más adelante y en la parte experimental.
La expresión transitoria y temprana de la secuencia heteróloga de nucleótidos se observa específicamente y/o únicamente en las células determinadas neuronales definidas anteriormente. Según esto, el término "expresión específica, temprana y transitoria" significa que la expresión temprana y transitoria se debe a la actividad de la secuencia reguladora definida aquí y que dicha actividad produce la expresión de una molécula heteróloga de ácido nucleico en células determinadas neuronales.
La invención proporciona un sistema de selección y marcador para células restringidas neuronales, preferiblemente células precursoras restringidas neuronales y un sistema indicador para neurogénesis, preferiblemente para neurogénesis que se produce en un mamífero posnatalmente, lo más preferiblemente para neurogénesis en cerebro adulto de mamífero. Los descubrimientos como se documentan en esta invención están en claro contraste con los resultados e interpretaciones en la técnica. Por ejemplo, Kempermann (2003), loc. cit., es de la opinión de que no es suficiente usar el marcador neuronal doblecortina (DCX) como indicador de neurogénesis. En el trabajo de Kempermann, el número relativo de neuronas nuevas, detectado mediante doble marcaje de BrdU/NeuN permanece estable durante el periodo de investigación (de 1 día a 11 meses después del marcaje de BrdU). No obstante, Kemperman y colaboradores pierden los puntos temporales tempranos (entre 2 horas y 7 días después de inyección única de BrdU) y, según esto, no se observa la ola inicial de células positivas para BrdU/DCX que más tarde se convierten en células BrdU/NeuN. Por lo tanto, los resultados presentados aquí están en claro contraste con los datos de Kempermann, Development 130 (2003), 391-399, que demuestra que las neuronas adquieren un fenotipo maduro (expresión de NeuN) justo después del nacimiento celular (1 día después de la incorporación de BrdU). Basado en estos datos, Kempermann concluye que el uso de DCX no es suficiente como indicador de neurogénesis.
De forma similar, Nacher, European Journal of Neuroscience 14 (2001). 629-644, enseña que DCX se expresa y encuentra en células dentro de áreas, donde "no se produce migración neuronal adulta". Nacher concluye que DCX se expresa en neuronas diferenciadas y especula "que la expresión de DCX en neuronas diferenciadas podría estar relacionada con su capacidad para la reorganización de microtúbulos". Al contrario que Nacher (2001), la invención y los ejemplos adjuntos documentan que el descenso de DCX en células determinadas neuronales recién nacidas coincide con la maduración a neuronas y que en neuronas maduras, DCX no se detecta. Por lo tanto, la técnica anterior, ni ha sido capaz de relacionar la población de células que expresan DCX a las posteriores neuronas maduras positivas para NeuN ni el hecho de que DCX se expresa solamente de forma transitoria temprana en células progenitoras proliferativas neuronalmente comprometidas. La técnica anterior no ha sido capaz de relacionar la expresión de DCX con el conjunto proliferativo de células precursoras neuronalmente determinadas. Como mucho, la técnica anterior, como Nacher (2001) loc. cit. y Cooper-Kuhn (2002) loc. cit., ha especulado que DCX puede ser un marcador para neuronas "inmaduras", "jóvenes" y/o "en migración" no proliferativas y posmitóticas o incluso células no neuronales, tales como células gliales. Por el contrario, la presente invención muestra que la expresión dirigida por el promotor de DCX es un marcador transitorio útil para sucesos neurogénicos tempranos tales como compromiso neuronal y proliferación neurogénica y se pueden emplear con éxito en los usos y métodos proporcionados aquí.
La técnica anterior consideró DCX como un marcador específico para neuronas jóvenes posmitóticas no proliferativas, es decir, células posmitóticas que han perdido irreversiblemente su capacidad de dividirse. No obstante, y al contrario que en la técnica anterior aquí se documenta y en particular en los ejemplos que DCX se expresa ya en el conjunto proliferativo de células precursoras neuronales. Este descubrimiento sorprendente no solo permite la detección de estas células restringidas/determinadas neuronales y, según esto, la detección de cambios dinámicos en neurogénesis sino que también proporciona herramientas únicas para la detección/identificación y/o verificación de sustancia neurogénica, como se describirá aquí posteriormente.
Además, la invención muestra que ni la inmunorreactividad de DCX ni la expresión de EGFP bajo el control de la secuencia reguladora humana de DCX descrita aquí colocalizan con la proteína ácida fibrilar glial (GFAP), un marcador para astrocitos, excluyendo un destino celular astroglial de las células que expresan la proteína DCX o EGFP bajo las secuencias reguladoras definidas aquí. La invención documenta además que DCX no se expresa en células gliales, tales como astrocitos u oligodendrocitos, lo que está en claro contraste con la noción de (Nacher, Europ. J. Neurosc. 14 (2001), 629-644) que DCX sólo se expresa en células gliales.
Con la provisión de los usos específicos de las secuencias reguladoras proporcionadas aquí, ahora es posible detectar y/o seleccionar células determinadas neuronales (es decir, neuronas recién generadas) in vivo e in vitro. Según esto, la presente invención proporciona usos específicos (detallados aquí posteriormente) para dichas secuencias reguladoras así como para células huésped y organismos huésped útiles, como animales transgénicos no humanos, que comprenden dichas secuencias reguladoras y son particularmente útiles en los métodos descritos aquí más adelante. Al contrario que los métodos en la técnica anterior que emplean planteamientos inmunohistológicos que comprenden pasos perjudiciales de fijación y/o permeabilización, la invención proporciona ahora medios en donde se puede determinar, medir y analizar la actividad de células troncales/progenitoras neuronales sin fijación. Según esto, la presente invención proporciona métodos para detectar y seleccionar in vitro e in vivo células precursoras restringidas neuronales, que derivan, entre otros, de órganos y poblaciones más grandes de tipos celulares mezclados de mamíferos, preferiblemente de ratón o rata, lo más preferiblemente de seres humanos. Por lo tanto, la invención también comprende usos específicos de una secuencia reguladora de ácido nucleico definida aquí. Las secuencias reguladoras inventivas se pueden usar, entre otros, para aislar células proliferativas restringidas neuronales, para cambiar la biología de células restringidas neuronales, así como para identificar células restringidas neuronales dentro de una población grande de tipos celulares mezclados, tanto in vitro como in vivo. Preferiblemente dichas células son células progenitoras restringidas/determinadas neuronales. El marcador/indicador específico de neurogénesis proporcionado aquí y documentado en los ejemplos adjuntos también es útil para el análisis de potenciales agentes terapéuticos y el descubrimiento de dianas de fármacos para estimular células troncales endógenas del SNC para generar nuevas células nerviosas en el SNC. Además, tal indicador genético proporcionado aquí permite la detección y aislamiento in vitro e in vivo de cualquier célula en un órgano o población mayor de tipos celulares mezclados que está en el proceso de adquirir un fenotipo neuronal. Por lo tanto, tal sistema de marcador/indicador proporcionado aquí permite los medios de detección para procesos asociados con transdiferenciación neuronal. Las formas de realización correspondientes para estos usos y métodos se proporcionan aquí a continuación.
El término "secuencia reguladora" se refiere a secuencias de nucleótidos que influencian el nivel de expresión de una molécula de ácido nucleico, es decir, un gen (o de una secuencia de ácido nucleico que codifica una, entre otros, molécula antisentido), por ejemplo haciendo la expresión específica de célula o tejido. En este sentido, las secuencias reguladoras se pretende que signifiquen elementos también denominados de aquí en adelante elementos reguladores que dan a un promotor, preferiblemente a un promotor mínimo, propiedades de expresión adicionales. En el contexto de la invención, el término "promotor" se refiere a secuencias de nucleótidos que son necesarias para iniciar la transcripción, es decir para unir ARN polimerasa y por ejemplo contienen la caja TATA o un motivo similar a la caja TATA. Además, el término "secuencia reguladora" también puede comprender secuencias fuera de la región 5' flanqueante del promotor. Tales secuencias son funcionales en ambas orientaciones y están menos fijadas en sus posiciones que los promotores, preferiblemente están dentro de la región de secuencias no traducidas del gen DCX de mamífero, preferiblemente de ratón o humano, como se describen aquí en el marco de la presente invención (SEQ ID NOs 1 a 4). Tales elementos de secuencia pueden incluir potenciadores, silenciadores así como moduladores adicionales que pueden regular la expresión de un gen por aumento o descenso o que pueden hacer el promotor descrito aquí inducible. Los potenciadores o silenciadores con frecuencia se localizan en intrones o en la región 3' flanqueante de un gen. La secuencia reguladora también puede ser un promotor que dentro del significado de la invención se caracteriza por ejercer todas las funciones de un promotor, es decir iniciación de la polimerización de ARN, mediación de una potencia de expresión específica y regulación de expresión, preferiblemente dependiendo del tipo celular, en especial preferiblemente con especificidad por células determinadas neuronales/restringidas neuronales, preferiblemente células progenitoras determinadas/restringidas neuronales. Las secuencias representadas en SEQ ID NOs. 1 a 4 o los segmentos definidos anteriormente de dichas secuencias son secuencias reguladoras que al mismo tiempo corresponden a la definición de un promotor.
Un ejemplo de tal secuencia reguladora según esta invención es el inserto del clon depositado DSM 15111. DSM 15111 es el plásmido pEGFP-N1 (de Clontech, GenBank U55762; con el promotor CMV delecionado) que comprende un inserto que corresponde del nucleótido 1 al nucleótido 3509 de SEQ ID NO. 1, y referenciado por el depositante como STBL2-phuDCXpromoEGFP1. DSM 15111 se depositó en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares GmbH, Braunschweig, Alemania, el 25 de julio de 2002. Dicho depósito lo hizo la Universidad de Ratisbona (Klinikum), Franz-Josef-Strauss Allee 11, 93053 Ratisbona, Alemania. El inserto del clon depositado comprende la secuencia reguladora humana de DCX como se ha definido aquí anteriormente y se puede obtener por métodos conocidos en la técnica, que comprende, por ejemplo, reacciones de PCR. Por ejemplo, con el uso de oligonucleótidos, por ejemplo secuencias como las indicadas en SEQ ID NOs 9 y 10, se puede amplificar el promotor/secuencia reguladora completa del gen humano DCX; véase también el ejemplo II adjunto. También se pueden emplear dichos dos oligonucleótidos (oligo no: 1: AAC ACC TAT TAA TGC CCA; SEQ ID NO: 9 y oligo no: 2: TCA GAG ACC TGA GCG TGG GAG AA; SEQ ID NO: 10) para obtener una secuencia reguladora de la presente invención a partir del clon depositado DSM 15111. Por medio de pares de oligonucleótidos se pueden amplificar y obtener fragmentos delecionados en 5' o delecionados en 3' de las secuencias reguladoras humanas de DCX que todavía permiten expresión específica de célula determinada neuronal. Mediante la provisión de las secuencias divulgadas aquí, el experto en la materia está fácilmente en una posición de deducir oligonucleótidos correspondientes. Según esto, los pares de oligonucleótidos que permiten al experto en la materia amplificar los fragmentos correspondientes del promotor del clon depositado pueden derivar de las secuencias de nucleótidos indicadas en SEQ ID NOs. 1 a 4. Cuando se proporcionan las secuencias reguladoras de la invención de la secuencia reguladora humana de DCX mediante amplificación del clon DSM15111, la especificidad de la reacción de PCR puede aumentar por una reacción de PCR precedente adicional. Además, la secuencia de los fragmentos del promotor se puede detectar mediante secuenciación directa sirviendo el clon depositado como molde. Para este fin, el experto en la materia puede derivar cebadores de secuenciación de las secuencias de nucleótidos indicadas en SEQ ID Nos. 1 a 4.
La invención se basa en el descubrimiento de que la expresión transitoria, temprana de DCX proporciona medios para la detección y aislamiento de células determinadas neuronales y proliferativas y que un fragmento de promotor de alrededor de 3,5 kb del gen humano de DCX (Fig. 9 y SEQ ID NO. 1, respectivamente), clonado en 5' de la región codificante de un gen indicador (proteína fluorescente verde, EGFP o DsRed2) produce la expresión de dicho gen indicador en, entre otras, células precursoras neuronales de cultivos de telencéfalo disociado (ratón), en neuroblastos jóvenes de cultivos de células troncales corticales fetales humanas (véase los ejemplos adjuntos) o en células cultivadas, como células de prosencéfalo embrionario de ratón de día 10 a 14. Además, se pudo documentar que animales transgénicos no humanos que expresan genes marcadores (por ejemplo, EGFP) bajo el control de las secuencias reguladoras divulgadas aquí, sólo muestran expresión del gen marcador en precursores determinados/restringidos neuronales recién generados, en particular en regiones del cerebro implicadas en neurogénesis activa. Hasta ahora, la técnica anterior no ha proporcionado secuencias o medios que causan la especificidad de la expresión de DCX descrita anteriormente. Se puede probar la especificidad para células restringidas neuronales/determinadas neuronales de las partes funcionales de las secuencias reguladoras de las mismas, entre otras, mediante estudios de deleción y transfecciones proporcionados aquí. Por ejemplo, la transfección de moléculas recombinantes que comprenden una secuencia reguladora (o un fragmento o parte funcional de la misma) de la presente invención no producirá una secuencia (marcadora/indicadora) expresada en células no neuronales, como fibroblastos o células HEK293. No obstante, una transfección correspondiente en células que son células precursoras neuronales, como transfección en células de prosencéfalo embrionario de ratón de día 10 a día 14,5 cultivadas, produce una activación de las secuencias reguladoras como se divulga aquí y la correspondiente secuencia marcadora/indicadora se expresa. Por lo tanto, el experto en la materia está en posición de deducir, entre otras, partes o fragmentos funcionales de las secuencias reguladoras inventivas.
El aislamiento de secuencias parciales a partir de una de las secuencias reguladoras anteriormente descritas se puede alcanzar mediante métodos estándar de biología molecular que conoce el experto en la materia, por ejemplo según Sambrook (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989)). Esta fuente también se puede usar para todas las otras técnicas de biología molecular mencionadas en la presente descripción. Para ensayar la especificidad celular de los fragmentos aislados en células restringidas neuronales, se pueden usar los métodos descritos en los ejemplos y aquí posteriormente. Para este fin, los fragmentos de las secuencias como se han definido anteriormente, entre otros, se clonan en vectores de expresión que comprenden un gen marcador/gen indicador adicional y, en experimentos paralelos, la expresión de un gen indicador en células restringidas neuronales y en células que no expresan DCX o células que no son o no son todavía restringidas/determinadas neuronales (por ejemplo, células troncales todavía pluripotentes, células precursores gliales, glioblastos, astrocitos, neuronas maduras, células que no son del sistema nervioso, como fibroblastos o células epiteliales). Posteriormente, se mide en ensayos (transitorios) si los fragmentos de la secuencia reguladora divulgados aquí producen una expresión específica del gen marcador/indicador en la célula restringida/determinada neuronal. La expresión específica en células restringidas neuronales dentro del significado de la invención, por ejemplo, se reconoce si el nivel de expresión comparado con las células que no expresan DCX o el correspondiente gen marcador aumenta al menos 5 veces, preferiblemente al menos 8 veces, en especial preferiblemente al menos 10 veces, en particular preferiblemente al menos 15 veces y lo más preferiblemente al menos 20 veces.
Los fragmentos funcionales de las secuencias reguladoras a ser empleados según la presente invención preferiblemente comprenden, pero no están limitados a, secuencias reguladoras que comprenden al menos una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 de la posición 1166 a 1746 (o de la posición 1166 a 2049), de la posición 1785 a 1843 o de la posición 1953 a 2775 y/o al menos una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 de la posición 529 a 1079 (o de la posición 529 a 1390), de la posición 1118 a 1175 o de la posición 1291 a 2137. Sin embargo, en una forma de realización más preferida de la presente invención, el fragmento funcional de la secuencia reguladora para la expresión de DCX (es decir, la secuencia reguladora capaz de producir expresión temprana transitoria de secuencias heterólogas de nucleótidos en células determinadas neuronales) comprende o es la secuencia de nucleótidos como se muestra en SEQ ID NO: 1 de los nucleótidos 1166 a 1746 o de los nucleótidos 1166 a 2049 y de los nucleótidos 1953-2775 (correspondientes a las "regiones 2 y 4" como se define en la figura 12 adjunta). De forma similar, dicha secuencia reguladora puede comprender o puede ser los nucleótidos como se muestra en SEQ ID NO. 2 de los nucleótidos 529-1079 o de los nucleótidos 529 a 1390 y de los nucleótidos 1291-2137 (también correspondientes a las "regiones 2 y 4" como se define en la figura 12 adjunta). En una forma de realización más preferida de la invención, la secuencia reguladora a ser empleada es la secuencia de nucleótidos definida como "región 2" aquí y en los ejemplo adjuntos pudiendo dicha región también (y además) comprender el siguiente "exón" o "exones". Según esto, la secuencia reguladora a ser empleada, en una forma de realización, es o comprende los nucleótidos 1166 a 1746 (ó 1166 a 2049) de SEQ ID NO. 1 o es o comprende los nucleótidos 529 a 1079 (ó 529 a 1390). En este contexto, también secuencias de nucleótidos que son al menos el 78%, más preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 85%, más preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95% y lo más preferiblemente al menos el 99% idénticas a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1 de la posición 1166 a 1746 (ó de 1166 a 2049) o a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 2 de la posición 529 a 1079 (ó de 529 a 1390) y/o secuencias de nucleótidos que son al menos el 75%, más preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 85%, más preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95% y lo más preferiblemente al menos el 99% idénticas a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1 de la posición 1953 a 2775 o a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 2 de la posición 1291 a 2137 pueden estar comprendidas en una secuencia reguladora que causa/dirige expresión en células determinadas neuronales. También se prevé que la secuencia reguladora comprenda solamente las secuencias de nucleótidos como se muestran en las regiones 2 y 4 aquí definidas (véase la figura 12) u homólogos de las mismas que son al menos el 78%, más preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 85%, más preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95% y lo más preferiblemente al menos el 99% idénticas a las regiones 2 y 4 como se define aquí. Dichas regiones 2 y 4 pueden estar directamente unidas a nivel de nucleótido, pero también se prevé que dichas regiones estén separadas por una secuencia espaciadora, que puede ser el espaciador como se muestra entre estas dos regiones en SEQ ID Nos. 1 y 2 (o representadas como "región 3 y exón 1 y 2") en la figura 12 o que puede, más preferiblemente no estar relacionado con el espaciador como se muestra en SEQ ID Nos. 1 ó 2 (y en la figura 12). La técnica anterior ha proporcionado y depositado una secuencia de nucleótido "AL450490" en GenBank. No obstante, al contrario que la presente invención, en AL450490 un gen definido como "gen DCX" comprende solamente la región codificante de DCX y un corto fragmento 5' de 748 nucleótidos delante del ATG presente en el exón 4.
Otro aspecto de la invención se refiere a los usos definidos anteriormente de las secuencias reguladoras que hibridan con una de las secuencias reguladoras de la invención descritas anteriormente, preferiblemente a la hebra complementaria de la misma, y producen la expresión específica de células restringida/determinada neuronal de una secuencia de nucleótidos controlada por ellas.
Estas secuencias que hibridan pueden ser promotores como se definen anteriormente o elementos reguladores que dan especificidad de célula restringida/determinada neuronal a promotores mínimos.
El término "hibridar" como se usa se refiere a condiciones convencionales de hibridación, preferiblemente condiciones de hibridación en las que se usa como solución SSPE 5x, SDS al 1%, solución de Denhardts 1x y/o las temperaturas de hibridación están entre 35ºC y 70ºC, preferiblemente 65ºC. Después de la hibridación, el lavado se lleva a cabo preferiblemente primero con SSC 2x, SDS al 1% y posteriormente con SSC 0,2x a temperaturas entre 35ºC y 70ºC, preferiblemente a 65ºC (respecto a la definición de SSPE, SSC y solución de Denhardts véase Sambrook, loc. cit.). Las condiciones rigurosas de hibridación como por ejemplo las descritas en Sambrook, supra, son particularmente preferidas. Las condiciones rigurosas de hibridación particularmente preferidas están por ejemplo presentes si la hibridación y el lavado se hacen a 65ºC como se indica anteriormente. Las condiciones de hibridación no rigurosas, por ejemplo con la hibridación y el lavado realizados a 45ºC son menos preferidas y a 35ºC incluso menos.
Tales secuencias reguladoras preferiblemente muestran una homología, determinada mediante identidad de secuencia, de al menos el 75%, preferiblemente de al menos el 80%, más preferiblemente de al menos el 85%, incluso más preferiblemente de al menos el 90% y lo más preferiblemente de al menos el 95% a una secuencia definida en (a) a (d) aquí anteriormente. No obstante, la invención también se refiere a secuencias reguladoras que comprende o es una secuencia de nucleótidos que es al menos el 78%, más preferiblemente al menos el 80%, incluso más preferiblemente al menos el 90% y lo más preferiblemente al menos el 95% idéntica a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1 de la posición 1166 a 1746 (ó de 1166 a 2049) o a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 2 de la posición 529 a 1079 (o de la posición 529 a 1390). También se prevén secuencias reguladoras que comprenden o es una secuencia de nucleótidos que es al menos el 82%, más preferiblemente al menos el 85%, incluso más preferiblemente al menos el 90% y lo más preferiblemente al menos el 95% idéntica a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1 de la posición 1785 a 1843 o a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 2 de la posición 1118 a 1175. De forma similar, la invención proporciona usos de secuencias reguladoras que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos el 75%, más preferiblemente al menos el 80%, incluso más preferiblemente al menos el 90% y lo más preferiblemente al menos el 95% idéntica a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1 de la posición 1953 a 2775 o a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 2 de la posición 1291 a 2137.
Las secuencias reguladoras a ser empleadas según esta invención preferiblemente muestran una homología, determinada mediante identidad de secuencia, de al menos el 50%, preferiblemente al menos el 60%, en particular preferiblemente al menos el 70%, ventajosamente al menos el 80%, preferiblemente al menos el 90% y en especial preferiblemente al menos el 95% a las secuencias indicadas en SEQ ID NO 1 a 4, preferiblemente a lo largo de la longitud completa de las secuencias comparadas. Las secuencias que hibridan son preferiblemente fragmentos que tienen una longitud de al menos 100, más preferiblemente al menos 200, más preferiblemente al menos 300, más preferiblemente al menos 400 y lo más preferiblemente al menos 500 nucleótidos que tienen una identidad de al menos el 75%, preferiblemente al menos el 80%, en especial preferiblemente de al menos el 90% y en particular preferiblemente de al menos el 95% con la secuencia mostrada en SEQ ID NO. 1, 2, 3 ó 4, respectivamente. Si dos secuencias que se van a comparar entre sí difieren en longitud, la identidad de secuencia preferiblemente se refiere al porcentaje de los residuos de nucleótidos de la secuencia más corta que son idénticos a los residuos de nucleótidos de la secuencia más larga. La identidad de secuencia se puede determinar convencionalmente con el uso de programas de ordenador tal como el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive Madison, WI 53711). Bestfit utiliza el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2 (1981), 482-489, para encontrar el segmento que tiene la mayor identidad de secuencia entre dos secuencias. Cuando se usa Bestfit u otro programa de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia particular tiene por ejemplo el 95% de identidad con una secuencia de referencia de la presente invención, los parámetros se ajustan preferiblemente de tal manera que el porcentaje de identidad se calcula a lo largo de la longitud entera de la secuencia de referencia y que se permiten brechas de homología de hasta el 5% del número total de nucleótidos en la secuencia de referencia. Cuando se usa Bestfit, los denominados parámetros opcionales preferiblemente se dejan en sus valores de preajuste ("por defecto"). Las desviaciones que aparecen en la comparación entre una secuencia determinada y las secuencias de la invención descritas anteriormente se pueden producir por ejemplo, por adición, deleción, sustitución, inserción o recombinación. Tal comparación de secuencia también se puede llevar a cabo preferiblemente con el programa "fasta20u66" (versión 2.0u66, septiembre de 1998 por William R. Pearson y la Universidad de Virginia; véase también W.R. Pearson, Methods in Enzymology 183 (1990), 63-98, ejemplos adjuntos y http://workbench.sdsc.edu/). Para este fin, se pueden usar los ajustes "por defecto" de los parámetros.
Las técnicas descritas en los ejemplos adjuntos se pueden, entre otros, usar para determinar si las secuencias que hibridan median expresión específica de célula determinada neuronal/restringida neuronal.
Como se ha señalado anteriormente, el término "célula determinada neuronal" se refiere, según esta invención a células que se diferencian a neuronas o que se dividen en células restringidas neuronales, es decir, en células que generan solamente neuronas. Según esto, el término "célula determinada neuronal" como se emplea aquí también comprende "células restringidas neuronales". Por lo tanto, las "células determinadas/restringidas neuronales" como se describen en esta invención producen durante su diferenciación o desarrollo única y exclusivamente neuronas y no otras células del sistema nervioso, como, oligodendrocitos, astrocitos, células de Schwann, células de microglia, células de glía o incluso células como células endoteliales, fibroblastos y similares. Sin embargo, el término "célula determinada/restringida neuronal" también comprende células progenitoras o troncales, que activan la secuencia reguladora de la presente invención y, por ello, están en una vía de diferenciación/desarrollo restringida/determinada que produce (una)
neurona(s). Las células troncales pueden proliferar para dar lugar a células hijas idénticas a las células madre y así aumentar la población de células troncales. De forma alternativa, se pueden dividir en varios tipos de células. Una célula troncal que puede producir cualquier tipo de célula de un organismo, por ejemplo una célula troncal embrionaria, se denomina totipotente, mientras que una célula troncal que puede producir sólo un subconjunto definido de tipos celulares se denomina pluripotente. En varios órganos y sistemas, se han descrito células troncales somáticas. Estas células troncales somáticas tienen el potencial de dividirse en células hijas idénticas a las células madre y así renovar o aumentar la población de células troncales somáticas. De forma alternativa, una célula hija se puede diferenciar en varios tipos celulares relevantes a este órgano/sistema. Por ejemplo, se han descrito células troncales neurales en el sistema nervioso central (SNC). Estas células se pueden diferenciar a neuronas, astrocitos y oligodendrocitos, es decir, los tres tipos celulares principales del SNC. La capacidad de células más o menos diferenciadas de generar tipos celulares presentes en otro órgano/sistema se denomina transdiferenciación. Según esto, el término "célula restringida/determinada neuronal" como se emplea aquí también se refiere a células, como células troncales o células que se transdiferencian, que comprenden una secuencia reguladora activada de la presente invención. No obstante, el término "célula(s) determinada(s)/restringida(s) neuronal(es)" como se usa aquí se tiene que delimitar de células troncales no diferenciadas multi/pluripotentes que no tienen o no activarán la secuencia reguladora descrita aquí. El término "célula restringida/determinada neuronal" se refiere, por lo tanto, a cualquier célula/tipo celular que producirá exclusivamente, directamente o a través de su progenie, neuronas in vivo o en marcos/condiciones experimentales o in vitro seleccionadas. El término "célula restringida/determinada neuronal" también comprende células que migran, como células precursoras neuronales en migración. Proporcionando las secuencias reguladoras de la doblecortina (DCX), la presente invención proporciona una herramienta distinta para detectar, seguir, seleccionar y/o aislar "células restringidas/determinadas neuronales". Según esto, la presente invención proporciona usos y métodos específicos ventajosos, en donde se usan las secuencias reguladoras descritas aquí o células huésped/organismos huésped (como animales transgénicos no humanos, así como órganos, tejidos o células de tales organismos) que comprenden las secuencias reguladoras o moléculas recombinantes de ácido nucleico como se definen aquí.
En una forma de realización preferida particular, la secuencia reguladora de la presente invención es de origen humano, de rata o ratón. Las secuencias humana y de ratón correspondientes se ilustran en SEQ ID NO. 1 y 2. Las secuencias reguladoras de la invención son preferiblemente moléculas de ADN o ARN, siendo las moléculas de ADN preferiblemente ADN genómico.
La invención también se refiere a usos de moléculas recombinantes de ácido nucleico que comprenden la secuencia reguladora descrita aquí. Dicha molécula recombinante de ácido nucleico comprende las secuencias reguladoras en una forma "aislada", preferiblemente en combinación con una secuencia heteróloga de ácido nucleico a ser expresada. Como se usa aquí, el término "aislada" cuando se usa junto con una molécula de ácido nucleico/secuencias reguladoras de la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un organismo en una forma sustancialmente purificada (es decir, sustancialmente libre de otras sustancias que se originan en ese organismo), o una molécula de ácido nucleico que tiene la misma secuencia de nucleótidos pero no necesariamente separada del organismo (es decir, moléculas de ácido nucleico sintetizadas o producidas de forma recombinante).
Preferiblemente y lo más previsto, las secuencias reguladoras descritas en la presente invención están unidas operativamente a secuencias heterólogas adicionales de ácido nucleico en una molécula recombinante de ácido nucleico. Como se detalla aquí posteriormente, dicha secuencia adicional de ácido nucleico puede ser un gen codificante así como una secuencia de ácido nucleico que, tras la expresión, produce una construcción antisentido, una ribozima o similar.
Como se emplea aquí, el término "molécula heteróloga de ácido nucleico", significa una molécula de ácido nucleico que preferiblemente está operativamente unida a la secuencia reguladora descrita anteriormente pero no es una molécula de ácido nucleico que codifica doblecortina (DCX) o un fragmento de la misma. Por lo tanto, dicha "molécula heteróloga de ácido nucleico" se origina de un contexto genético diferente que la secuencia reguladora descrita anteriormente. Ejemplos no limitantes de tales "moléculas heterólogas de ácido nucleico" se dan aquí a continuación y comprenden en particular, moléculas marcadoras, como luciferasa, galactosidasa, GFP, EGFP, DsRed, etc., o moléculas etiqueta, como etiquetas Flag, CBP y otras. No obstante, como se detalla posteriormente, también se prevén genes de receptores, genes anti-apoptóticos, genes que codifican moléculas de determinación/diferenciación, factores tróficos, proteínas de superficie, factores de transcripción, moléculas que dirigen la migración u orientación neuronal. También se prevén moléculas de ácido nucleico que no codifican proteínas como "moléculas heterólogas de ácido nucleico". Tales ácidos nucleicos comprenden, pero no están limitados a, moléculas antisentido, aptámeros, ribozimas, moléculas inhibidoras de ARN y similares.
El término "molécula recombinante de ácido nucleico" se refiere a moléculas de ácido nucleico que se originan de un contexto genético diferente y se combinan por métodos de biología molecular. Aquí, el término "contexto genético diferente" se refiere a genomas de diferentes especies, variedades o individuos o posiciones diferentes en un genoma. Las moléculas recombinantes de ácido nucleico pueden contener no solo secuencias naturales sino también secuencias, que, comparadas con las naturales están mutadas, modificadas químicamente u otras, las secuencias en conjunto son secuencias sintetizadas de nuevo.
Las moléculas recombinantes de ácido nucleico de la invención muestran una o más de las secuencias reguladoras descritas anteriormente en combinación con secuencias de otro contexto genético. Un ejemplo de una molécula recombinante de ácido nucleico contiene una o más secuencias reguladoras de la invención o un promotor mínimo derivado y obtenible de las secuencias divulgadas aquí en combinación con un gen diferente del gen DCX, preferiblemente diferente que el gen humano de doblecortina. El término "molécula recombinante de ácido nucleico", por lo tanto, no se refiere a moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia codificante de DCX bajo el control de las secuencias reguladoras proporcionadas aquí. Las secuencias reguladoras son elementos reguladores de promotor que dan una expresión específica de célula determinada neuronal/restringida neuronal.
Además, las moléculas recombinantes de ácido nucleico pueden contener, aparte de un promotor que contiene una o más secuencias reguladoras de la invención, una secuencia poliligadora localizada en dirección 3' de la misma y que comprende uno o más sitios de restricción en los que se pueden clonar secuencias de nucleótidos por métodos conocidos para el experto en la materia, que de esta manera está bajo el control de expresión del promotor. Dicho poliligador está preferiblemente en una región situada directamente detrás del punto de inicio de la transcripción definido por el promotor.
Además, la molécula recombinante de ácido nucleico descrita aquí puede contener una señal de terminación de la transcripción en 3' del poliligador. En el estado de la técnica se describen ejemplos de señales de terminación adecuadas. La señal de terminación puede ser, por ejemplo, la señal de poliadenilación de la timidina quinasa. Las moléculas recombinantes de ácido nucleico descritas aquí que preferiblemente contienen una secuencia de nucleótidos a ser expresada se pueden emplear directamente para usos dentro del significado de la presente invención, tales como transfecciones de ADN, la generación de células huésped genéticamente modificadas o de animales transgénicos no humanos. Además, dichas moléculas recombinantes se pueden emplear en métodos de cribado descritos aquí así como en marcos médicos y científicos. Las moléculas recombinantes de ácido nucleico de la invención se pueden, por ejemplo, multiplicar mediantes técnicas convencionales de amplificación in vitro, por ejemplo PCR. Sin embargo, también se pueden multiplicar convencionalmente in vivo en un vector, y después de la preparación de ácido nucleico y posterior eliminación del vector, por ejemplo, mediante corte de restricción, se pueden suministrar para usos que requieren por ejemplo unidades de expresión linealizadas. Las moléculas recombinantes de ácido nucleico, que preferiblemente contienen una secuencia de nucleótidos a ser expresada, también pueden constituir unidades de expresión que con frecuencia se designan casetes de expresión que se pueden clonar fácilmente en diferentes vectores estándar y dependiendo del vector pueden ejercer de esta manera diferentes funciones.
En una forma de realización preferida particular, la molécula recombinante de ácido nucleico de la invención comprende la secuencia reguladora de la invención que controla la expresión de la secuencia adicional de nucleótidos.
Preferiblemente, en el contexto de esta invención, la secuencia de nucleótidos adicional a ser expresada se introduce "cerca" o a una cierta distancia del extremo 3' de las secuencias reguladoras definidas aquí. "Cerca" significa que la(s) secuencia(s) adicional(es) de nucleótidos o partes de la(s) misma(s) se clonan directamente o a una cierta distancia de las secuencias reguladoras anteriormente mencionadas, en dirección 5', 3' o a intervalos. La clonación se lleva a cabo, sin embargo, preferiblemente en 3' porque, como se sabe, las secuencias reguladoras mencionadas anteriormente (promotores o partes funcionales de los mismos), requieren distancias relativamente definidas desde el punto de iniciación de la transcripción y desde la caja TATA, respectivamente, para su modo de funcionamiento, es decir para unirse a la ARN polimerasa o factores de transcripción. "A una cierta distancia" significa una distancia que es adecuada para permitir que los silenciadores o potenciadores ejerzan su función. Los ejemplos correspondientes se documentan aquí posteriormente, por ejemplo, la producción de construcciones que expresan genes marcadores seleccionables. Es importante que también se prevea que se empleen secuencias parciales de las secuencias reguladoras definidas anteriormente en el contexto de esta invención, es decir que se construyen moléculas recombinantes de ácido nucleico que comprenden secuencias parciales o fragmentos funcionales de las secuencias reguladoras para DCX como se definen aquí. Tales construcciones también se pueden ensayar en los ensayos proporcionados aquí, por ejemplo ensayos de expresión transitoria para su función y nivel de expresión. Por ejemplo, se puede analizar una construcción que comprende una secuencia parcial de la secuencia reguladora inventiva, y para fines de comparación, la misma construcción sin dicha secuencia parcial, en un ensayo de expresión transitoria en células cultivadas (preferiblemente una célula primaria, como células precursoras neuronales de ratón del día embrionario 12 derivadas del prosencéfalo) y en células que no son capaces o que no expresan DCX (como células HEK293). Si la diferencia del nivel de expresión entre células capaces de no expresar DCX es mayor en el caso de la construcción con la secuencia parcial que en el caso de la construcción sin el trozo parcial, entonces esta secuencia parcial comprende un silenciador funcional o un elemento potenciador. Técnicas adicionales para delimitar tales elementos están disponibles para el experto en la materia. Un ejemplo detallado de una de tales técnicas es como sigue: es, entre otros, posible deducir el elemento promotor mínimo en la secuencia reguladora descrita aquí, mediante la construcción de mutantes de deleción que expresan una de las proteínas fluorescentes o luminiscentes, por ejemplo, EGFP o DsRed etc. El promotor mínimo debe ser suficiente y necesario para dirigir la expresión de un gen en células precursoras neuronales, células determinadas/restringidas neuronales. Los promotores mínimos preferidos comprenden bien sola o en combinación la "región 2" y/o la "región 4" como se define en la figura 12, que corresponde a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 de la posición 1166 a 1746 (o de la posición 1166 a 2049) y de la posición 1953 a 2775 o la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 de la posición 529 a 1079 (o de la posición 529 a 1390) y de la posición 1291 a 2137. Dicha secuencia reguladora mínima deseada, preferiblemente y en una forma de realización, no comprende la secuencia de nucleótidos que comprende la posición 3169 a 3501/3509 de SEQ ID NO. 1, no comprende la secuencia de nucleótidos que comprende la posición 2525 a 2859 de SEQ ID NO. 2 o no comprende homólogos de las mismas. Estas secuencias de nucleótidos corresponden a la "región 5" como se define en la figura 12. No obstante, es importante que la secuencia reguladora a ser empleada en los usos y métodos de la presente invención, como se caracteriza aquí, también pueda comprender dicha "región 5". Una parte opcional adicional de la secuencia reguladora descrita aquí y a ser empleada es la "región 1" como se define en la figura 12 adjunta.
Las construcciones funcionales de la secuencia reguladora que producen expresión transitoria, específica en la célula determinada neuronal se pueden ensayar, por ejemplo, mediante transfección, en células precursores neuronales derivadas de prosencéfalo de ratón de día embrionario 10 a 14 y analizar la expresión como se demuestra en los ejemplos adjuntos. Las transfecciones en células no neuronales, por ejemplo células HEK293, sirven como controles negativos, ya que el promotor funcional no debe ser activo en células no neuronales. Además, las transfecciones se pueden hacer usando células positivas para EGFP derivadas del animal transgénico (ejemplo 4). Un promotor/fragmento de promotor debe ser activo en estas células, sin embargo debe ser inactivo en células negativas para EGFP de los mismos animales. Se adjuntan los correspondientes ejemplos prácticos.
La forma de realización comprende las secuencias reguladoras descritas anteriormente que se combinan con al menos una secuencia de nucleótidos, que se puede proporcionar mediante amplificación del inserto del clon depositado DSM15111, usando por ejemplo PCR, o partes del mismo. Tal secuencia adicional en el clon depositado DSM15111 codifica una proteína fluorescente verde mejorada. Para la amplificación de dicho gen/secuencia de nucleótidos adicional (aquí EGFP), por ejemplo se pueden usar pares de oligonucleótidos. Se pueden emplear las secuencias de los indicados por las SEQ ID NOs: 13 y 14, es decir las secuencias ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG (SEQ ID No: 13) o CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC (SEQ ID No: 14) para amplificar la EGFP en dicho clon DSM15111. Según esto, se puede cambiar la secuencia adicional que codifica EGFP en el clon depositado DSM15111 por cualquier otra secuencia deseada.
Según esta invención, también se prevé que se comprenda más de una secuencia adicional en la molécula recombinante de ácido nucleico descrita aquí. Según esto, la invención también se refiere al uso de moléculas recombinantes de ácido nucleico que comprenden, además de las secuencias reguladoras de DCX, genes agrupados, preferiblemente en el mismo marco de lectura. Por ejemplo, se pueden localizar dos secuencias de nucleótidos una detrás de otra en un marco de lectura, es decir, que están traduccionalmente fusionadas (si ambas secuencias de nucleótidos codifican una proteína o fragmento de la misma). Estas regiones codificantes pueden estar directamente adyacentes o estar separadas por un espaciador. Un espaciador separa la estructura terciaria de dos proteínas espacialmente entre sí, para prevenir que sus estructuras terciarias interaccionen negativamente. El espaciador tiene, sin embargo, preferiblemente la función de actuar como un punto de ataque para una proteasa, preferiblemente una proteasa endógena de la célula transfectada, con el resultado de que las proteínas expresadas se separan in vivo. De forma alternativa, el espaciador puede contener una secuencia IRES (sitio interno de entrada al ribosoma). Esto permite que se transcriban ambos genes bajo el control de un único promotor, produciéndose su traducción por separado.
Por otra parte, las dos secuencias de nucleótidos también se pueden codificar transcripcionalmente de forma independiente entre sí. Para este fin, cada secuencia de nucleótidos está bajo el control de su propio promotor, con al menos un promotor, preferiblemente ambos promotores, que comprende las secuencias reguladoras de la presente invención.
Tal forma de realización permitiría las ventajas particulares de la co-transfección con construcciones de expresión que codifican diferentes proteínas o fragmentos de las mismas.
Otra forma de realización preferida de la invención se refiere a usos de las moléculas recombinantes de ácido nucleico o vectores descritos anteriormente, por lo que estas moléculas recombinantes de ácido nucleico contienen/comprenden además una secuencia de nucleótidos a ser expresada, en donde la expresión de la secuencia de nucleótidos está controlada por la secuencia reguladora de DCX o un promotor/potenciador de DCX que comprende la secuencia reguladora. En el contexto de esta invención, también se prevé que la secuencia reguladora se emplee en su forma inducible.
Las "secuencias de nucleótidos a ser expresadas" codifican una proteína o (poli)péptido o moléculas de ARN que manifiestan su función a nivel de ARN. Las secuencias de nucleótidos que codifican una proteína, polipéptido o péptido comprenden una región codificante que está caracterizada por un codón de iniciación (ATG), una secuencia de tripletes de bases que codifican aminoácidos y un codón de terminación (TGA, TAG ó TAA) si se refiere a ADN. En el caso de ARN, la timidina (T) se cambia por uracilo (U). En el caso de codones degenerados de aminoácidos, se pueden adaptar los tripletes de bases según el uso de codones de las células diana, usando técnicas de la técnica anterior. Ejemplos de secuencias de nucleótidos que expresan moléculas de ARN son ARN antisentido, ARN inhibidor, ARNi o ribozimas.
En una forma de realización adicional, la invención se refiere a (una) molécula(s) recombinante(s) de ácido nucleico descrita(s) aquí, en donde dicha secuencia de nucleótidos a ser expresada bajo el control de la secuencia reguladora de la invención es un gen seleccionado del grupo que consiste en un gen marcador o receptor, un gen antiapoptótico, un gen de determinación/diferenciación, un gen capaz de inducir y/o dirigir migración u orientación neuronal, un gen que codifica una etiqueta, un gen que codifica un factor trófico, un gen que codifica una proteína de superficie, un gen codifica un factor de transcripción, un gen que codifica una enzima o en donde dicha secuencia de nucleótidos a ser expresada es una secuencia antisentido o codifica una ribozima o una molécula de ARN inhibidora/interferente o similares. Según esto, la invención se refiere en una forma de realización, dicho gen marcador o receptor a ser expresado bajo el control de las secuencias reguladoras aquí divulgadas son, por ejemplo, proteínas fluorescentes (por ejemplo, proteína fluorescente verde) o proteínas que pueden, directa o indirectamente, producir una señal visible o medible, cuando se expresan (por ejemplo, cloranfenicol acetiltransferasa, beta-galactosidasa).
Ejemplos de genes marcadores o indicadores, que permiten la actividad de expresión de las secuencias reguladoras, preferiblemente promotores, a ser detectados, preferiblemente en células eucariotas, se describen en la bibliografía. Ejemplos de genes indicadores codifican luciferasa, proteína fluorescente (verde/roja) y variantes de la misma, como EGFP (proteína fluorescente verde mejorada), RFP (proteína fluorescente roja, como DsRed o DsRed2), CFP (proteína fluorescente cian), BFP (proteína fluorescente azul verde), YFP (proteína fluorescente amarilla), \beta-galactosidasa o cloranfenicol acetiltransferasa, y similares.
Por ejemplo, GFP puede ser de Aequorea victoria (Patente de EE.UU. No. 5491084). Un plásmido que codifica la GFP de Aequorea victoria está disponible de la ATCC, número de acceso 87451. Otras formas mutadas de esta GFP incluyendo, pero no limitadas a, pRSGFP, EGFP, RFP/DsRed y EYFP, BFP, YFP, entre otras, están comercialmente disponibles de, entre otros, Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, California). Por ejemplo, DsRed2 también está disponible de Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, California); véase los ejemplos adjuntos. Además se pueden expresar proteínas luminiscentes adicionales bajo el control de la secuencia reguladora proporcionada aquí. En este contexto, se prevé una secuencia de nucleótidos que codifica, entre otras, una proteína de la familia de la luciferasa.
La invención también se refiere a una molécula recombinante de ácido nucleico que comprende la secuencia reguladora de la invención y un gen bajo su control, por lo que dicho gen codifica una etiqueta. Dicha etiqueta se puede seleccionar del grupo que consiste en una etiqueta de His, glutatión, una etiqueta Strep, una etiqueta Flag, CBP (péptido de unión a calmodulina), TAG-100 (disponible de Quiagen), etiqueta E2 (de la proteína transactivadora E2 del virus del papiloma bovino de tipo I) y etiqueta Z, pero no está limitada a las mismas. Por ejemplo, se pueden emplear la etiqueta auto-cortable de unión a quitina (por ejemplo, del sistema IMPACT-CN) o la hemaglutinina de la gripe (HA) según esta invención. También se prevé que la molécula recombinante de ácido nucleico de esta invención sea capaz de expresar una secuencia de péptido o proteína que se puede detectar por un anticuerpo específico (o un fragmento o derivado de anticuerpo) dirigido contra dicho péptido o proteína.
Es además una forma de realización de la invención que la molécula recombinante de ácido nucleico a ser usada según la invención codifique una proteína de superficie (celular), que se puede detectar mediante anticuerpos específicos dirigidos contra dicha proteína de superficie celular. Un gen que codifica una superficie puede ser por ejemplo, CD 24. Esta molécula de superficie celular se empleó con éxito para selección de células transducidas, véase Pawliuk, Blood 84 (1994), 2868-2877.
Se puede seleccionar un gen que codifica un factor trófico y se expresa bajo el control de la secuencia reguladora de la presente invención del grupo que consiste en NGF, BDNF, PDGF, NT-3, NT-4, NT-5, VEGF, PEDF, EGF, FGF, IGF, cardiotrofina, eritropoyetina, leptina, LIF y TGF. Estas moléculas recombinantes de ácido nucleico son muy útiles en marcos médicos así como científicos. Por ejemplo, se puede usar NGF en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer (Winkler, J. Mol. Med. 76(8) (1998), 555-567), NT-3 en el tratamiento de la enfermedad de Huntington (Perez-Navarro, J. Neurochem. 75(5) (2000), 2190-2199) o la enfermedad de Parkinson (Espejo, Cell Transplant. 9(1) (2000), 45-53). De forma similar, la expresión de NT-4/5 puede tener efectos beneficiosos en el tratamiento de la enfermedad de Huntington (Perez-Navarro, J. Neurochem. 75(5) (2000), 2190-2199). Se puede desear VEGF en el tratamiento del ictus (Jin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(18) (2000), 10242-10247), mientras que PEDF puede tener efectos beneficiosos en enfermedades de neuronas motoras, como ELA (Bilak, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 58(7) (1999), 719-728). También se describe que EGF, FGF y PDGF tienen efectos beneficiosos en el tratamiento o prevención del ictus (Nakatomi, Cell. 110(4) (2002), 429-441 y Krupinski, Stroke 28(3) (1997), 564-573). Se estudió IGF en la intervención de ictus (Liu., Neurosci, Lett. 308(2) (2001), 91-94) y en tratamiento de la enfermedad de Huntington (Humbert, Dev Cell. 2(6) (2002), 831-837). De forma similar, se empleó BDNF en la intervención médica de la enfermedad de Huntington (Perez-Navarro, J. Neurochem. 75(5) (2000), 2190-2199) y lesión de médula espinal (Hammond, Neuroreport 10(12) (1999), 2671-2675). Se empleó GDNF en la enfermedad Parkinson (Nakajima, Brain Res. 916(1-2) (2001), 76-84; Espejo, Cell Transplant. 9(1) (2000), 45-53) y HGF, como CNTF, se usaron en el tratamiento de esclerosis lateral amiotrófica, ELA (Sun, J. Neurosci. 22(15) (2002), 6537-6548 y Sendtner, Nature 358(6386) (1992), 502-504). La cardiotrofina (Toth, J. Neuroscience Res. 69(5) (2002), 622-632) protege las células PC12 contra el daño excitador, agresión oxidativa y apoptosis y se describió que la eritropoyetina (Juul, Acta. Peadiatr. Supl. 91(438) (2002), 36-42) tenía funciones neurotróficas y neuroprotectoras en el cerebro en desarrollo y lesionado. La leptina (Dicou, Neuroreport 12(18) (2001), 3947-3951) ejerce neuroprotección contra toxicidad, mientras que LIF (Marzella, Hear. Res. 138(1-2) (1999), 73-80) fomenta la supervivencia de cultivos disociados de células de ganglio espinal. Sin embargo, el uso de la molécula recombinante de ácido nucleico que expresa factores tróficos, especialmente los factores tróficos enumerados anteriormente, no está limitada por los distintos trastornos mencionados anteriormente y se prevén usos médicos adicionales.
En una forma de realización adicional de la molécula recombinante de ácido nucleico de la presente invención, el gen anti-apoptótico a ser expresado bajo el control de la secuencia reguladora inventiva se selecciona del grupo de bcl-2, Brn-3a, PTEN y (una) anticaspasa(s). Se consideran que las moléculas antiapoptóticas y/o las moléculas de ácido nucleico que inhiben las moléculas apoptóticas, como caspasas, tal como antisentido-caspasa-3, reducen la muerte celular de células determinadas neuronales. Esto es especialmente importante, ya que las regiones apoptóticas y neurogénicas en el cerebro adulto se solapan (Biebl, Neurosci. Lett. 291(1) (2000), 17-20). Fomentar la supervivencia de células determinadas neuronales podría aumentar la población total de neuronas en el cerebro adulto. Brn-3a, por ejemplo, activa la expresión de Bcl-x(L) y Bcl-2 y fomenta la supervivencia neuronal in vivo así como in vitro (Smith, Mol. Cell Neurosci. 17(3) (2001), 460-470).
También se prevé que el gen de determinación/diferenciación a ser expresado bajo el control de la secuencia reguladora descrita aquí sea el factor de determinación dopaminérgica Nurr1. Nurr1 induce y fomenta la diferenciación dopaminérgica de células troncales (Chung, Eur. J. Neurosci. 16(10) (2002), 1829-1838).
El gen capaz de inducir y/o dirigir la migración u orientación neuronal y que se expresa bajo el control de la secuencia reguladora de la presente invención puede ser, entre otros, netrina, neuropilina, CXCR4, SDF-1, DCC, slit, robo, una semaforina, un miembro de la familia plexina, un miembro de la familia efrina. Estas moléculas de migración y/o orientación son bien conocidas en la técnica y se refieren a, por ejemplo, moléculas de atracción/repulsión de axones en crecimiento para restablecer la conexión sináptica. Los ejemplos son CXCR4 y su ligando SDF-1 (Lu, PNAS 99(10) (2002), 7090-709. Sin CXCR4 funcional, falla la morfogénesis del GD (giro dentado) del hipocampo. Según esta invención, se prevé que la pérdida de la señalización de SDF-1/CXCR4 podría al menos en parte, mediar este defecto migratorio. Se han descrito miembros de la familia semaforina/plexina en Chen, Neuron 32 (2001), 249-263. Por ejemplo, in vivo, PlexA3 es crucial para el direccionamiento apropiado de un subconjunto de aferentes del hipocampo, pero menos importante para la orientación del axón periférico del ganglio cervical superior y DRG. El sistema de orientación slit/robo se describe en Zou, Cell 102 (2000), 363-375. Los receptores de neutropilinas se expresan en las neuronas comisurales y se requieren para la navegación de los axones comisurales a través de la línea media del SNC hasta sus dianas rostrales después de cruzar la línea media. En este sistema, las semaforinas de clase 3 actúan en concierto con otra clase de proteínas repelentes, las slit, para prevenir que los axones comisurales vuelvan a cruzar o se queden en la línea media. Una pequeña familia de proteínas secretadas, denominadas netrinas, atraen los axones comisurales antes de que crucen la línea media. La atracción inducida por netrinas está mediada por la familia DCC (delecionado en cáncer colorrectal) de receptores que inducen Frazzled en Drosophila, UNC40 en C. elegans y DCC y neurogenina en vertebrados, véase Yu, Nat Neurosci 4 (2001), 1169-1176. Las efrinas y los receptores de efrina (Eph) también se conocen en la técnica, véase por ejemplo, Kullander, Genes Dev 15 (2001), 877-888. La desactivación de efrinaB3, un ligando de EphA4, proporcionó fuerte evidencia de que EphA4 interacciona con efrinaB3, expresada en la línea media, 
\hbox{para prevenir que
los axones CST vuelvan a cruzar de forma anómala la línea
media.}
En una forma de realización adicional de la invención, el gen que codifica un factor de transcripción y que está controlado por la secuencia reguladora descrita aquí se puede seleccionar del grupo que consiste en NeuroD, BMP4, Nurr1 o ShcC.
La invención también proporciona usos anteriormente descritos de una molécula recombinante de ácido nucleico en donde se expresa una enzima bajo el control de la secuencia reguladora de DCX. Un ejemplo preferido, además de los genes indicadores mencionados anteriormente como \beta-galactosidasa o luciferasa es CRE (recombinasa CRE). Se prevé, entre otros, que CRE se exprese bajo el control de la secuencia reguladora de DCX descrita aquí y tal construcción se emplea en la generación de un animal transgénico no humano. Según esto, la molécula recombinante de ácido nucleico se puede usar para transfección de, por ejemplo, un cigoto o una célula ES, para la preparación de dicho animal transgénico para su uso en estudios de recombinación y sistemas de deleción de genes. Tales animales transgénicos positivos para CRE o tales células positivas para CRE son en particular útiles para la modificación genética dirigida específica de sitio y tiempo, por ejemplo en sistemas modelo de ratón o en sistemas de células ES; véase entre otros, Metzger, Methods 24 (2001), 71-80; Liu, Nat. Genet. 30 (2002), 66-72 o Yeh, PNAS 15 (2002), 13498-13503.
La molécula recombinante de ácido nucleico descrita y empleada en esta invención también puede ser una molécula de ácido nucleico que comprende las secuencias reguladoras de DCX descritas aquí y la secuencia de nucleótidos a ser expresada bajo su control, por lo que dicha secuencia de expresión controlada es una secuencia antisentido o codifica una ribozima o una molécula de ARN inhibidora.
Las secuencias antisentido y ribozimas son moléculas cuya expresión sucede a nivel de ARN. Las "secuencias antisentido" que son complementarias a un ARNm presente en la célula diana o una parte del mismo, la parte que posiblemente comprende la región codificante, la región no traducida 5' y/o 3'. Los ARN antisentido, es decir los transcritos de la secuencia antisentido, son capaces de hibridar in vivo con el ARNm complementario y de esta manera inhibir su traducción.
Las "ribozimas" son moléculas catalíticas de ARN. En el contexto de la presente invención las ribozimas son preferiblemente aquellas que se pueden unir específicamente a un ARNm de modo que lo vuelve inaccesible a una traducción con éxito ejerciendo una actividad catalítica, preferiblemente mediante corte hidrolítico. Las instrucciones para seleccionar secuencias antisentido adecuadas y para construir ribozimas con la especificidad de secuencia deseada se describen en la bibliografía y se pueden encontrar por ejemplo en "Antisense: From Technology to Therapy" (Schlingensiepen, R., Brysch, W., Schlingensiepen, K.-H., eds., Blackwell Science Ltd. Oxford, 1997) o Rossi (AIDS Research and Human Retroviruses 8 (1992), 183). Dichas ribozimas también se pueden dirigir a moléculas de ADN que codifican los correspondientes ARN. Las ribozimas son moléculas de ARN catalíticamente activas capaces de cortar moléculas de ARN y secuencias diana específicas. Por medio de técnicas de ADN recombinante es posible cambiar la especificidad de las ribozimas. Hay varias clases de ribozimas. Para aplicaciones prácticas cuyo fin es el corte específico del transcrito de un cierto gen, preferiblemente se hace uso de representantes de dos grupos diferentes de ribozimas. El primer grupo está compuesto de ribozimas que pertenecen al tipo de ribozimas de intrón del grupo I. El segundo grupo consiste en ribozimas que como rasgo estructural característico muestran el denominado motivo "cabeza de martillo". El reconocimiento específico de la molécula diana de ARN se puede modificar cambiando las secuencias que flanquean este motivo. Mediante emparejamiento de base con secuencias en la molécula diana estas secuencias determinan la posición en la que tiene lugar la reacción catalítica y por lo tanto el corte de la molécula diana. Puesto que los requerimientos de secuencia para un corte eficaz son bajos, en principio es posible desarrollar ribozimas específicas para prácticamente cada molécula de ARN deseada. Para producir moléculas de ADN que codifican una ribozima que corta específicamente transcritos de un gen que codifica una proteína a ser inhibida o inactivada, se une bilateralmente una secuencia de ADN que codifica un dominio catalítico de una ribozima con secuencias de ADN que son homólogas a secuencias que codifican la proteína diana. Según esta invención dicha secuencia que codifica una ribozima o su dominio catalítico está bajo el control de las secuencias reguladoras (o partes o fragmentos funcionales de las mismas) de la invención. La expresión de ribozimas para disminuir la actividad de ciertas proteínas también la conoce el experto en la materia, y se describe, por ejemplo, en EP-B1 0 321 201 ó EP-B1 0 360 257.
La tecnología antisentido se puede usar para controlar la expresión génica mediante formación de hélices triples o ADN o ARN antisentido, por lo que el efecto inhibidor se basa en la unión específica de una molécula de ácido nucleico a ADN o ARN. El oligonucleótido antisentido de, por ejemplo, al menos 10 nucleótidos de longitud puede estar bajo el control de las secuencias reguladoras descritas aquí. El oligonucleótido antisentido de ADN o ARN hibrida con el ARNm deseado (que se debe inactivar o inhibir) in vivo y bloquea la traducción de dicho ARNm y/o produce la desestabilización de la molécula de ARNm (Okano, J. Neurochem. 56 (1991), 560; Oligodeoxynucleotides as antisense inhibitors of gene expression, CRC Press, Boca Raton, FL, EE.UU. (1988)).
Para aplicar un planteamiento de triple hélice, se puede diseñar un oligonucleótido de ADN que sea complementario a una región del gen a ser inhibido o inactivado según los principios establecidos en la técnica anterior (véase por ejemplo, Lee, Nucl. Acids Res. 6 (1979), 3073; Cooney, Science 241 (1988), 456 y Dervan, Science 251 (1991), 1360). Tal oligonucleótido que forma triple hélice se puede usar para prevenir la transcripción del gen específico. Los oligonucleótidos descritos anteriormente se pueden distribuir, entre otros, a través de un vector de distribución de genes como se describe posteriormente. También este planteamiento produce la inhibición in vivo de la expresión génica de la proteína respectiva. Los oligonucleótidos correspondientes tienen una longitud de preferiblemente al menos 10, en particular al menos de 15 y particularmente preferiblemente de al menos 50 nucleótidos. Se caracterizan en que hibridan específicamente con dicho polinucleótido, es decir que no hibridan o solo en pequeño grado con otras secuencias de ácido nucleico.
Una forma de realización particularmente preferida se refiere al uso de las moléculas recombinantes de ácido nucleico o vectores, en donde la secuencia antisentido, ARNi o la ribozima es específica para una inhibición y/o un descenso de una proteína de apoptosis, como una caspasa. Esto es de interés particular en el contexto de esta invención, ya que las regiones apoptóticas y neurogénicas se solapan en el cerebro adulto; véase Biebl, Neurosci Lett 291 (2000), 17-20. Fomentar la supervivencia de células determinadas neuronales por medios y métodos proporcionados aquí aumenta la población total de células determinadas neuronales y neuronas en tejido nervioso, en cultivos in vitro o en el cerebro adulto. Por ejemplo, se considera que la inhibición de la caspasa 3 por la molécula recombinante descrita anteriormente produce muerte celular reducida de células determinadas neuronales in vivo e in vitro.
Las moléculas inhibidoras de ARN (ARNi/iARN) preferidas se pueden seleccionar del grupo que consiste en ARNi, ARNip, ARNhc y ARNtp.
El término ARN de interferencia (ARNi) se conoce muy bien en la técnica y normalmente describe el uso de ARN bicatenario que se dirige a ARNm específicos para degradación, silenciando de esta manera su expresión. El ARN bicatenario (ARNbc) que se ajusta a la secuencia de un gen se sintetiza in vitro y se introduce en una célula. El ARNbc se alimenta en un proceso natural, pero solo parcialmente entendido que incluye la nucleasa altamente conservada dicer que corta moléculas precursoras de ARNbc en ARN interferentes pequeños (ARNip). La generación y preparación de ARNip así como el método para inhibir la expresión de un gen diana se describe, entre otros, en WO 02/055693, Wei, Dev. Biol. 15 (2000), 239-255; La Count, Biochem. Paras. 111 (2000), 67-76; Baker, Curr. Biol. 10 (2000), 1071-1074; Svoboda, Development 127 (2000), 4147-4156 o Marie, Curr. Biol. 10 (2000), 289-292. Estos ARNip construyen entonces la parte específica de secuencia de un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), una nucleasa multicomplejo que destruye ARN mensajeros homólogos al disparador de silenciamiento). Elbashir, EMBO J. 20 (2001), 6877-6888 mostró que se pueden usar dúplex de ARN de 21 nucleótidos en cultivo celular para interferir con la expresión génica en células de mamífero. Ya se sabe que la iARN está mediada muy eficazmente por ARNip en células de mamífero pero la generación de líneas celulares estables o animales transgénicos no humanos estaba limitada. Sin embargo, se pueden emplear nuevas generaciones de vectores para expresar establemente, por ejemplo ARN horquillados cortos (ARNhc). La expresión estable de ARN interferentes pequeños en células de mamífero se muestra, entre otros en Brummelkamp, Science 296 (2002), 550-553. Además Paul, Nat. Biotechnol. 20 (2002), 505-508 documenta la expresión eficaz de ARN interferentes pequeños en células humanas. La interferencia de ARN mediante la expresión de ARN interferentes pequeños y ARN horquillados cortos en células de mamíferos también fue mostrada por Yu, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 99 (2002), 6047-6052. El planteamiento del ARNhc para el silenciamiento de genes se conoce bien en la técnica y puede comprender el uso de ARNtp (temporales pequeños); véase, entre otros, Paddison, Genes Dev. 16 (2002), 948-958.
Como se ha mencionado anteriormente, en la técnica se conocen planteamientos para el silenciamiento génico y comprenden el planteamiento de "ARN" como ARNi o ARNip. El uso con éxito de tales planteamientos se ha mostrado en Paddison (2002), loc. cit., Elbashir, Methods 26 (2002), 199-213; Novina, Mat. Med. Junio 3 (2002), 2002; Donze, Nucl. Acids Res. 30 (2002), e46; Paul, Nat. Biotech 20 (2002), 505-508; Lee, Nat. Biotech. 20 (2002), 500-505; Miyagashi, Nat. Biotech. 20 (2002), 497-500; Yu, PNAS 99 (2002), 6047-6052 o Brummelkamp, Science 296 (2002), 550-553. Estos planteamientos pueden estar basados en vectores, por ejemplo el vector pSUPER o se pueden emplear vectores de ARN polIII como se ilustra entre otros, en Yu (2002), loc. cit.; Miyagishi (2002), loc. cit. o Brummelkamp (2002), loc. cit. Se prevé que las secuencias reguladoras de la presente invención se usen de forma similar a los sistemas basados en los vectores pSUPER o ARN polIII.
Otra forma de realización preferida de la invención se refiere a los usos descritos anteriormente de secuencias de nucleótidos que comprenden un fragmento que tiene una longitud de al menos 15 nucleótidos que específicamente hibridan en condiciones rigurosas con un hebra de una secuencia reguladora de DCX descrita en el contexto de la invención.
Las secuencias de nucleótidos que hibridan según la presente forma de realización pueden servir por ejemplo como sondas que por ejemplo contribuyen a identificar promotores homólogos, preferiblemente secuencias reguladoras de otros genes que, debido a ciertos elementos de secuencia correspondientes, inducen un patrón de expresión comparable al de las secuencias reguladoras de la invención. Además, estas secuencias se pueden usar para diseñar oligonucleótidos adecuados, por ejemplo como cebadores de PCR.
El término "hibridación" ya se ha definido anteriormente. Las secuencias de nucleótidos preferiblemente hibridan en condiciones rigurosas. Los fragmentos tienen una longitud de al menos 15 nucleótidos, preferiblemente de al menos 20 nucleótidos, particularmente preferiblemente de al menos 50 nucleótidos, en especial preferiblemente de al menos 100 nucleótidos, ventajosamente de al menos 200 nucleótidos y lo más preferiblemente de al menos 500 nucleótidos.
La invención también proporciona el uso de un vector que contiene la secuencia reguladora inventiva o la molécula recombinante de ácido nucleico descrita aquí anteriormente, por lo cual dicho vector preferiblemente se usa para la expresión temprana transitoria de secuencias heterólogas de nucleótidos en células determinadas neuronales proliferativas.
El término "vector" se refiere a moléculas de ácido nucleico circulares o lineales que se pueden replicar de forma autónoma en las células huésped en las que se introducen. Los vectores pueden contener las moléculas recombinantes de ácido nucleico caracterizadas anteriormente en su longitud total o pueden contener, aparte de las secuencias reguladoras de la invención, los componentes descritos para las moléculas recombinantes de ácido nucleico, tales como un promotor mínimo, poliligador y/o señal de terminación.
Los vectores de la invención pueden ser adecuados para replicación en células huésped procariotas y/o eucariotas. Contienen el correspondiente origen de replicación. Los vectores son preferiblemente adecuados para replicación en células de mamífero, en particular preferiblemente en células humanas.
Los vectores de la invención preferiblemente contienen un marcador de selección. El experto en la materia conoce ejemplos de genes de marcadores de selección. Los genes de marcadores de selección que son adecuados para selección en células huéspedes eucariotas son por ejemplo, genes para dihidrofolato reductasa, resistencia a G418 o neomicina.
Los vectores de la invención son preferiblemente vectores de expresión para la expresión en células eucariotas. Tales vectores se pueden construir empezando de vectores de expresión conocidos cambiando su promotor o las secuencias que no pertenecen al promotor mínimo por las secuencias reguladoras de la invención o suplementando con las secuencias reguladoras (elementos reguladores) de esta invención. Ejemplos de vectores de expresión que se pueden modificar de esta manera son pcDV1 (Pharmacia), pRC/CMV, pcDNA1 o pcDNA3 (Invitrogen).
Como se documenta en los ejemplos adjuntos, el vector de la presente invención puede comprender, entre otros (un)
gen(es) marcador(es) o receptor(es) que es GFP, EGFP o RFP.
En una forma de realización preferida particular de la invención el vector a ser usado comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en
(a)
una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 5, 6 ó 26 o mostrada en SEQ ID NO: 7, 8 ó 27;
(b)
una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia reguladora y el gen heterólogo como se comprenden en la construcción depositada con el número de acceso DSM 15111; y
(c)
una secuencia de nucleótidos que es al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 85%, más preferiblemente al menos el 90% y lo más preferiblemente al menos el 95% idéntica a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NOS: 5 a 8, 26 ó 27 y que comprende una secuencia reguladora de la reivindicación 1 ó 2.
Las secuencias correspondientes (SEQ ID Nos 5 a 8, 26 ó 27) también se ilustran en las figuras, ejemplos o lista de secuencias adjuntas. Las identidades de secuencia de los vectores descritos aquí se pueden deducir por métodos conocidos en la técnica y también ilustrados aquí anteriormente.
Es importante que los vectores a ser empleados según la invención también puedan comprender partes o fragmentos funcionales de la secuencia reguladora como se divulga aquí. Los fragmentos y partes funcionales también se pueden deducir mediante métodos descritos anteriormente y comprenden, por ejemplo, estudios de transfección con secuencias reguladoras parciales/fragmentadas unidas, entre otros, a genes marcadores/indicadores expresables.
En una forma de realización particularmente preferida, los vectores descritos anteriormente son virus.
En el estado de la técnica, se han descrito un gran número de vectores virales para transfección de células de mamífero ex vivo o in vivo. Estos son derivados de virus patogénicos de mamífero o humanos, a los que se les ha privado de sus propiedades patogénicas mediante modificación genética. Para transfección los vectores virales se empaquetan in vitro según métodos que conoce el experto en la materia, es decir, se proporcionan proteínas de la envoltura vírica. Se pueden usar virus de ADN y ARN. Ejemplos de virus para transfección de células de mamífero, preferiblemente humanas, son herpesvirus, lentivirus, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados.
En otra forma de realización de la invención, los vectores descritos anteriormente son adecuados para terapia génica o vacunación con un ácido nucleico. La terapia génica y vacunación con ácido nucleico se basan en la introducción de genes terapéuticos o inmunizantes en células ex vivo o in vivo. Los vectores o sistemas de vectores y métodos adecuados para usarlos para terapia génica o vacunación con ADN/ARN se describen en la bibliografía y los conoce el experto en la materia, véase, por ejemplo, Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO 94/29469; WO 97/00957; Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640; o Verma, Nature 389 (1997), 239-242 Geddes, Front Neuroendocrinol. 20 (1999), 296-316 y las referencias citadas en los mismos. De interés particular es el hecho de que también se han descrito en neurología sistemas de distribución génica/planteamientos de terapia génica por Tuszyski, J. Neurosci. 19 (2002), 207 o Blesch, Brain Res Bull. 57 (2002), 833-833. Se han propuesto y descrito estrategias de recambio global de genes y células a través de células troncales y similares por Park, Gene Therapy 9 (2002), 613-624. Las moléculas recombinantes de ácido nucleico o vectores descritas anteriormente por ejemplo se pueden diseñar para la introducción directa o para la introducción a través de liposomas o vectores virales, por ejemplo, vectores adenovirales, lentivirales de virus adenoasociados (AAV), vectores de herpes o retrovirales.
En una forma de realización preferida adicional, la invención se refiere a una célula/célula huésped genéticamente modificada que comprende la secuencia reguladora, la molécula recombinante de ácido nucleico o el vector como se ha descrito anteriormente siempre que no se modifique la identidad genética de la línea germinal de seres humanos y en donde dicha célula huésped no es una célula troncal embrionaria humana. También se proporciona(n) (un) método(s)
para preparar células huésped genéticamente modificadas, caracterizado en que las células huésped se transfectan con uno de los vectores descritos anteriormente y la célula huésped transfectada se cultiva en un medio de cultivo. El término "genéticamente modificado" significa que la célula huésped o el huésped contienen, además del genoma natural, una molécula de ácido nucleico o un vector de la presente invención, que se ha introducido en la célula huésped o el huésped o en un precursor. La molécula de ácido nucleico o el vector pueden estar presentes en la célula huésped/huésped genéticamente modificado como molécula independiente fuera del genoma, preferiblemente como una molécula replicable, o se pueden integrar establemente en el genoma de la célula huésped o huésped.
La introducción de un vector en células huésped se puede llevar a cabo según métodos estándar conocidos como por ejemplo se describen en Sambrook (loc. cit.). Los ejemplos de técnicas de transfección aplicables son transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE dextrano, electroporación, transducción, infección, lipofección o transferencia biolística. El cultivo posterior se puede llevar a cabo usando métodos estándar también, o en el caso de la modificación genética de células neuronales, preferiblemente los métodos descritos en los ejemplos y referencias citadas allí.
En otra forma de realización preferida, la invención se refiere a células huésped que están genéticamente modificadas con una secuencia reguladora, una molécula recombinante de ácido nucleico o un vector de la presente invención o que se pueden obtener mediante el método descrito anteriormente. Lo más preferiblemente, la célula huésped es capaz de proliferación y capaz de adquirir (por ejemplo en condiciones experimentales in vivo o in vitro) un fenotipo neuronal.
La célula huésped de la presente invención en principio puede ser cualquier célula procariota o eucariota e incluye, entre otras, células de mamífero, células de hongo, célula vegetales, células de insecto o células bacterianas.
Las células huésped de la presente invención deben ser capaces de ser mitóticamente activas y deben ser capaces de adquirir un fenotipo neural, en particular en condiciones in vitro. Las células bacterianas adecuadas son aquellas que en general se usan para clonación, tales como E. coli o Bacillus subtilis. Ejemplos de células fúngicas son células de levadura, preferiblemente aquellas de los géneros Saccharomyces o Pichia, en particular preferiblemente Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris. Las células animales adecuadas incluyen por ejemplo, células de insecto, células de vertebrado, preferiblemente células de mamífero, tales como CHO, COS7, Hela, NIH3T3, MOLT-4, Jurkat, K562, HepG2, Neuro 2A, teratocarcinoma P19 y similares. No obstante, también se prevén células primarias cultivadas, como células del hipocampo cultivadas o células RPE cultivadas. En la técnica se describen líneas celulares adecuadas adicionales y se pueden obtener por ejemplo de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ, Braunschweig). En este contexto es importante que también se pueden transfectar células no neuronales con una secuencia reguladora, una secuencia recombinante de ácido nucleico o un vector de la invención. Estas células transfectadas son particularmente útiles en los métodos descritos aquí posteriormente que se refieren, entre otros, a métodos de cribado para compuestos capaces de inducir programas de diferenciación/determinación en células que producen, directa o indirectamente, una neurona o un fenotipo similar a neurona. Como se ilustra en los ejemplos adjuntos, una célula COS7 no estimulada, transfectada con una construcción descrita aquí, es decir, un gen EGFP bajo el control de la secuencia reguladora de la presente invención, en condiciones normales de cultivo, no expresa dicho marcador/indicador. No obstante, se pueden emplear estas células en sistemas de cribado, por ejemplo cribados de alto rendimiento, donde se prueba la capacidad de compuestos para activar la secuencia reguladora de la invención.
La forma de realización de las células huésped que son células cerebrales o neuronales es particularmente preferida.
El sitio primario de aplicación de las secuencias reguladoras, moléculas recombinantes de ácido nucleico o vectores de la invención son células progenitoras o troncales neuronales así como células troncales embrionarias generales (células ES) no humanas. En particular las células troncales embrionarias no humanas transfectadas con las secuencias reguladoras, moléculas recombinantes de ácido nucleico o vectores son útiles en los métodos descritos aquí posteriormente y en cribados de alto rendimiento. Las células aisladas también pueden ser células precursoras o troncales que se pueden convertir en células determinadas neuronales mediante cultivo in vitro adecuado. Los métodos correspondientes se describen en la técnica. Las células huésped de mamífero, lo más preferiblemente de origen humano son particularmente preferidas en la presente invención, en donde dicha célula huésped no es una célula troncal embrionaria humana.
Según esto, la célula huésped de la invención puede ser una célula neuronal, una célula ES no humana, un célula germinal no humana (por ejemplo, un cigoto que es particularmente útil para la preparación de animales transgénicos no humanos como se detalla en los ejemplos adjuntos) o una línea celular cultivada como se define anteriormente o una célula primaria, como células de hipocampo, células RPE o células del bulbo olfatorio.
La invención también se refiere a un método para preparar una célula huésped genéticamente modificada, caracterizado en que la célula huésped se transfecta con una molécula de ácido nucleico que es o comprende la secuencia reguladora de DCX, la molécula recombinante de ácido nucleico o el vector descritos anteriormente, siempre que no se modifique la identidad genética de la línea germinal de seres humanos y en donde dicha célula huésped no es una célula troncal embrionaria humana.
Se conocen varios métodos en la técnica para introducir moléculas de ácido nucleico en células huésped. Estos incluyen pero no están limitados a microinyección, en la que el ADN se inyecta directamente en el núcleo de células a través agujas de cristal finas; incubación con dextrano, en el que el ADN se incuba con un polímero de hidrato de carbono inerte (dextrano) al que se ha acoplado un grupo químico cargado positivamente (DEAE, por dietilaminoetil). El ADN se pega al DEAE-dextrano a través sus grupos fosfato negativamente cargados. Estas partículas grandes que contienen ADN se pegan a su vez a las superficies de células, que se piensa que las captan mediante un proceso conocido como endocitosis. Parte del ADN evita la destrucción en el citoplasma de la célula y escapa al núcleo, donde se transcribe a ARN como cualquier otro gen en la célula; coprecipitación con fosfato de calcio, en el que las células captan ADN de forma eficaz en forma de un precipitado con fosfato de calcio; electroporación, en el que las células se colocan en una solución que contiene ADN y se someten a pulso eléctrico breve que produce que se abran transitoriamente orificios en sus membranas. El ADN entra a través de los orificios directamente al citoplasma, evitando las vesículas endocíticas que se dan en los procedimientos de DEAE-dextrano y fosfato de calcio (el paso a través de estas vesículas puede algunas veces destruir o dañar el ADN); transformación mediada por liposomas, en el que el ADN se incorpora en vesículas lipídicas artificiales, liposomas, que se fusionan con la membrana celular, distribuyendo su contenido directamente al citoplasma; transformación biolística, en el que el ADN se absorbe a la superficie de partículas de oro y se dispara en las células a alta presión usando un dispositivo balístico; y transformación mediada por virus, en el que las moléculas de ácido nucleico se introducen en las células usando vectores virales. Puesto que el crecimiento del virus depende de la capacidad de introducir el genoma vírico en las células, los virus han ideado mecanismos eficaces para hacer eso. Estos virus incluyen, como se ha mencionado anteriormente, retrovirus y lentivirus, adenovirus, herpesvirus y virus adenoasociados. Como se indica, algunos de estos métodos de transformar una célula requieren el uso de un vector plasmídico intermediario. La patente de EE.UU. No. 4237224 a Cohen y Boyer describe la producción de sistemas de expresión en forma de plásmidos recombinantes usando corte con enzimas de restricción y ligación con ADN ligasas. Estos plásmidos recombinantes se introducen después por medio de transformación y se replican en cultivos unicelulares incluyendo organismos procariotas y células procariotas hechas crecer en cultivos. Las secuencias de ADN se clonan en el vector plasmídico usando procedimientos de clonación estándar conocidos en la técnica, como describe Sambrook (1989), loc. cit.
Según uno de los métodos descritos posteriormente, se introduce de esta manera una molécula de ácido nucleico que codifica, por ejemplo GFP bajo el control de una secuencia reguladora de la presente invención en una pluralidad de células. La secuencia reguladora que controla la expresión de GFP, sin embargo, sólo funciona en el tipo celular de interés (es decir, células determinadas neuronales). Por lo tanto, GFP solo se expresa en el tipo celular de interés. Puesto que GFP es una proteína fluorescente, las células de interés se pueden por lo tanto identificar de entre la pluralidad de células mediante la fluorescencia de GFP.
Se puede usar cualquier medio adecuado de detectar las células fluorescentes. Las células se pueden identificar usando óptica epifluorescente, y se pueden recoger y aislar físicamente mediante dispositivos mecánicos tales como Quixell (Stoelting, Inc., St Louis, Missouri) o pinzas láser (Cell Robotics Inc., Albuquerque, Nuevo México). También se pueden separar en masa mediante separación de células activada por fluorescencia, un método que separa de forma eficaz las células fluorescentes de las células no fluorescentes (por ejemplo, Wang (1998)).
Como se explicará además posteriormente, una forma de realización de la presente invención proporciona de esta manera el aislamiento y enriquecimiento de células determinadas neuronales de tejido nervioso embrionario y adulto, en particular cerebro derivado tanto de roedor como humano. Específicamente, se proporciona la separación de células activada por fluorescencia de células humanas de hipocampo, transfectadas con la proteína fluorescente de elección dirigida por el promotor/potenciador de DCX descrito aquí.
Como también se ilustra en los ejemplos adjuntos, uno de los descubrimientos básicos de la invención es el hecho de que los animales transgénicos no humanos generados aquí expresan secuencias heterólogas de ácido nucleico bajo el control de las secuencias reguladoras proporcionadas aquí y que dicha expresión se limita a células que son determinadas/restringidas neuronales y mitóticamente activas.
Por lo tanto, la presente invención también proporciona un animal transgénico no humano que comprende células huésped de la presente invención y/o que comprende en sus células al menos una copia adicional de la secuencia reguladora de la invención o que comprende en sus células una molécula recombinante de ácido nucleico de la invención. Como se muestra en los ejemplos, la generación de tal animal transgénico está dentro de la capacidad del experto en la materia. Las técnicas correspondientes se describen, entre otros, en "Current Protocols in Neuroscience" (2001), John Wiley & Sons, Capítulo 3.16. Según esto, la invención también se refiere a un método para generar un animal transgénico no humano que comprende el paso de introducir una secuencia reguladora o una molécula recombinante de ácido nucleico de la invención en una célula ES o una célula germinal. El animal transgénico no humano se puede seleccionar de una pluralidad de animales transgénicos, por ejemplo invertebrados como C. elegans, Drosophila o vertebrados como pollo. No obstante, es más preferido un transgénico no humano que sea un mamífero, más preferiblemente una rata o un cerdo y lo más preferiblemente un ratón.
Preferiblemente, el animal transgénico no humano comprende en sus células una molécula recombinante de ácido nucleico que expresa un gen marcador bajo el control de la secuencia reguladora de esta invención. Lo más preferiblemente, el animal transgénico no humano comprende en sus células una molécula recombinante de ácido nucleico que comprende la secuencia reguladora de la invención y además una secuencia de nucleótidos bajo el control de dicha secuencia reguladora y que codifica un gen marcador/indicador, como proteína fluorescente verde (GFP o EGFP). Formas de realización correspondientes adicionales están en los ejemplos. El animal transgénico no humano proporcionado y descrito aquí es particularmente útil en métodos de cribado y pruebas farmacológicas descritos aquí posteriormente. En particular, el animal transgénico no humano descrito aquí se puede emplear en ensayos de cribado de fármacos así como en estudios científicos y médicos en donde se siguen, seleccionan y/o aíslan células determinadas neuronales.
En una forma de realización adicional la invención proporciona una composición que comprende la secuencia reguladora, la molécula recombinante de ácido nucleico, el vector o una célula huésped genéticamente modificada como se describe aquí. Dicha composición también puede comprender células o tejido derivado y/o obtenido de un animal transgénico descrito anteriormente. Tales células o tejidos pueden ser particularmente útiles en xenoinjertos. Lo más preferiblemente, tal composición es una composición farmacéutica, que comprende opcionalmente un soporte o diluyente farmacéuticamente aceptable o una composición de diagnóstico, que además comprende opcionalmente medios de detección adecuados.
Para formular células para administración como una composición farmacéutica, las células se resuspenden en un material soporte farmacéuticamente aceptable. Esto aplica, entre otras, a células determinadas neuronales obtenidas o seleccionadas mediante los métodos descritos aquí. Ejemplos de material soporte son agua, solución de cloruro de sodio, dextrosa, glicerol, etc., o combinaciones de las mismas. Además, la suspensión de células a ser administrada puede contener sustancias adicionales, tales como agentes emulsionantes, reguladores de pH, adyuvantes o también factores neurotróficos, tales como BDNF o NT-3 y similares.
Los ejemplos de soportes, excipientes y/o diluyentes farmacéuticos adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tal como emulsiones de aceite en agua, varios tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc. Las composiciones que comprenden tales soportes se pueden formular mediante métodos convencionales bien conocidos. Estas composiciones farmacéuticas se pueden administrar al sujeto a una dosis adecuada. La administración de las composiciones adecuadas se puede realizar por vías diferentes, por ejemplo mediante administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica, intradérmica o intranasal y similares. Particularmente preferida es la administración intracerebral. La pauta posológica la determinará el médico y los factores clínicos. Como es bien sabido en la técnicas médicas, las dosis para cualquier paciente dependen de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, el área de superficie corporal, edad, el compuesto particular a ser administrado, el sexo, tiempo y vía de administración, salud general y otros fármacos que se administren al mismo tiempo. Puede estar presente sustancia proteínica farmacéuticamente activa en cantidades entre 1 \mug y 10 mg por dosis; sin embrago, se prevén dosis por debajo o por encima de este intervalo ejemplar, especialmente considerando los factores mencionados anteriormente. Si la pauta es una infusión continua, también debe estar en el intervalo de 1 \mug a 10 mg unidades por kilogramo de peso corporal por minuto, respectivamente. Se puede seguir la evolución mediante evaluación periódica. Las composiciones de la invención se pueden administrar de forma local o sistémica. Las composiciones de la invención también se pueden administrar directamente a los sitios diana, por ejemplo mediante distribución biolística a un sitio diana interno o externo o mediante catéter a un sitio en una arteria. Las preparaciones para la administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones estériles acuosas o no acuosas. Ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tal aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tal como oleato de etilo. Los soportes acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluyendo solución salina y medios tamponados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, solución de Ringer con lactato o aceites no volátiles. Los vehículos intravenosos incluyen regeneradores de líquido y nutrientes, regeneradores de electrolitos (tales como los basados en dextrosa de Ringer) y similares. También pueden estar presentes conservantes u otros aditivos tales como, por ejemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes y gases inertes y similares. Además, la composición farmacéutica de la invención puede comprender agentes adicionales dependiendo del uso deseado de la composición farmacéutica.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden producir de una manera que es conocida en la técnica, por ejemplo, por medio de procesos convencionales de mezclar, disolver, granular, hacer grajeas, moler, emulsionar, encapsular, atrapar o liofilizar. La composición farmacéutica se puede proporcionar como una sal y se puede formar con muchos ácidos, incluyendo, pero no limitados a, clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Las sales tienden a ser más solubles en solventes acuosos u otros protónicos de lo que son las correspondientes formas base libre. En otros casos, la preparación preferida puede ser un polvo liofilizado que puede contener cualquiera o todos de los siguientes: histidina 1-50 mM, sacarosa del 0,1-2% y manitol del 2-7%, en un intervalo de pH de 4,5 a 5,5, que se combina con un tampón antes de su uso. Después de preparar las composiciones farmacéuticas, se pueden colocar en un envase adecuado y marcar para el tratamiento de una afección indicada. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso en la invención incluyen composiciones en donde los principios activos se contienen en una cantidad eficaz para alcanzar el propósito deseado. La determinación de una dosis eficaz está dentro de la capacidad de los expertos en la materia. Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente en ensayos en cultivos celulares, por ejemplo, de células neuronales cultivadas, líneas celulares o en modelos animales, normalmente ratones, conejos, perros o cerdos. El modelo animal también se puede usar para determinar el intervalo de concentración y vía de administración apropiados. Tal información se puede usar después para determinar las dosis y vías de administración útiles en seres humanos. Se pueden determinar la eficacia terapéutica y la toxicidad mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población) y DL50 (dosis letal para el 50% de la población). La relación de dosis entre efectos terapéuticos y tóxicos es el índice terapéutico, y se puede expresar como el cociente DL50/DE50. Las composiciones farmacéuticas que muestran índices terapéuticos grandes se prefieren. Los datos obtenidos de los ensayos de cultivos celulares y estudios animales se usan en formular un intervalo de dosificación para uso en seres humanos. La dosis contenida en tales composiciones está preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis varía dentro de este intervalo dependiendo de la forma posológica empleada, la sensibilidad del paciente y la vía de administración. La dosis exacta la determinará el médico, a la luz de factores relacionados con el sujeto que requiere tratamiento. Se ajustan la dosis y administración para proporcionar niveles suficientes del grupo activo o para mantener el efecto deseado. Los factores que se deben tener en cuenta incluyen la gravedad de la enfermedad, la salud general del sujeto, edad, peso y género del sujeto, dieta, tiempo y frecuencia de administración, combinación(es) de fármacos, sensibilidades de reacción y tolerancia/respuesta a la
terapia.
Los modos de administrar agentes farmacéuticos con ácidos nucleicos se describen en la técnica, por ejemplo (Fynan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 11478-11482; Boyer, Nat. Med. 3 (1997), 526-532; Webster, Vaccine 12 (1994), 1495-1498; Montgomery, DNA Cell Biol. 12 (1993), 777-783; Barry, Nature 311 (1995), 632-635; Xu y Liew, Immunology 84 (1995), 173-176; Zhoug, Eur. J. Immunol. 26 (1996), 2749-2757; Luke, J. Inf. Dis. 175 (1997), 91-97; Mor, Biochem. Pharmacology 55 (1998), 11511153; Donelly, Annu. Rev. Immun. 15 (1997), 617-648; MacGregor, J. Infect. Dis. 178 (1998), 92-100). Ejemplos particulares del campo neurológico comprenden Blits, Cell Transplant 11 (2002), 593-613; Boulis, J. Neurosurg. 96 (2002), 212-219. Como se ha mencionado anteriormente, actualmente están en marcha planteamientos de terapia génica para ciertos trastornos y ofrecen nuevos métodos de tratamiento, véase, entre otros, Frank, Surg. Oncol. Clin. N. Am. 11 (2002), 589-606 o Hull, Nurs. Stand. 17 (2002), 39-42.
Para su uso las moléculas de ácido nucleico descritas aquí se pueden formular en una forma neutra o como una sal. El experto en la materia conoce las sales farmacéuticamente eficaces. Las moléculas de ácido nucleico, en particular las moléculas recombinantes de ácido nucleico descritas anteriormente se pueden usar entre otros para tratar y/o para prevenir trastornos neurológicos y se administran en dosis que son farmacológicamente eficaces para profilaxis o tratamiento.
Las composiciones farmacéuticas para inyección típicamente se preparan como una solución o suspensión líquida. Las preparaciones se pueden emulsionar o el principio activo se puede encapsular en liposomas. Los principios activos con frecuencia se mezclan con materiales soporte que son compatibles con el principio activo. Ejemplos de materiales soporte son agua, solución de cloruro de sodio, dextrosa, glicerol, etanol, etc., o combinaciones de las mismas. La vacuna así como otros agentes farmacéuticos de ácidos nucleicos de la invención también pueden contener sustancias auxiliares, tales como emulsionantes, reguladores de pH y/o adyuvantes.
El ADN se puede administrar mediante transferencia biolística en lugar de mediante inyección (patente de EE.UU. No. 5100702; Kalkbrenner, Meth. Mol. Biol. 83 (1996), 203-216). Para este fin, el ADN, es decir las moléculas recombinantes de ácido nucleico o vectores de la presente invención, se unen a partículas pequeñas, por ejemplo partículas de oro o partículas de material biocompatible y se aceleran mediante presión de gas y se introducen en el cerebro. El ADN también se puede administrar por vía oral o sublingual o aplicar a la mucosa del aparato respiratorio mediante aplicación nasal o intratraqueal (para esto, se dan ejemplos en Etchart, J. Gen. Virol. 78 (1997), 1577-1580 o McCluskie, Antisense and Nucleic Acid Drug Development 8 (1998), 401-414).
De interés particular en el contexto de esta invención también es una composición farmacéutica que comprende células determinadas/restringidas neuronales proliferativas aisladas y/o obtenidas según los métodos descritos aquí posteriormente.
Un "paciente" o "sujeto" para los fines de la presente invención incluye tanto seres humanos como otros animales, particularmente, mamíferos, y otros organismos. De esta manera, los métodos son aplicables tanto a terapia humana como aplicaciones veterinarias. En la forma de realización preferida el paciente es un mamífero, y en la forma de realización más preferida el paciente es un ser humano. Lo más preferiblemente, la composición farmacéutica a ser preparada según esta invención se va a administrar por uno o varios de los modos siguientes: la administración puede ser oral, intravenosa, intraaterial, intratraqueal, intranasal, subcutánea, intramuscular, intracraneal (es decir, intraventricular), intracerebral o intraespinal (intratecal), epidérmica o transdérmica, pulmonar (por ejemplo, inhalación o insuflación de aerosol o polvo), mediante distribución a la mucosa bucal o rectal así como distribución oftálmica.
En otra forma de realización, la presente invención proporciona un kit que comprende la secuencia reguladora, la molécula recombinante de ácido nucleico, el vector de cualquiera o una célula huésped o una genéticamente modificada descrita aquí.
La invención proporciona además el uso de una molécula recombinante de ácido nucleico, de un vector o de una célula huésped modificada genéticamente (que expresan todas o son capaces de expresar una molécula heteróloga de ácido nucleico bajo el control del promotor de DCX descrito aquí) para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno o enfermedad neurológica. Dicho trastorno o enfermedad neurológica preferiblemente es una enfermedad neurodegenerativa, una lesión del SNC o SNP, hipoxia, isquemia, epilepsia, ictus, traumatismo del SNC, un trastorno tumoral del sistema nervioso, un trastorno neural causado por lesión toxicológica, un trastorno neuro-oftalmológico, un trastorno psiquiátrico, pérdida o daño neurológico relacionado con la edad o es un trastorno neurológico causado por un malformación en el desarrollo, una malformación cerebral o un trastorno de migración neuronal. Las enfermedades neurodegenerativas en este contexto son, entre otras, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, ELA, enfermedad de Creutzfeld-Jacobs o demencia, como demencia por VIH. Como se ha mencionado anteriormente, también se pueden tratar otros trastornos neurológicos, como la enfermedad de Huntington, ictus, isquemia, lesiones, como lesiones de la médula espinal o lesiones cerebrales, o lesiones toxicológicas, con los compuestos de la presente invención.
También se prevé que se emplee la molécula recombinante de ácido nucleico, el vector o la célula huésped genéticamente modificada como se describe aquí y capaz de expresar una secuencia heteróloga de ácido nucleico en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de trastornos de aprendizaje y/o memoria o para la potenciación de la memoria o la capacidad de aprendizaje. Los trastornos de memoria o aprendizaje comprenden, pero no están limitados a, demencias, traumatismos, sífilis o apraxias. Se prevé que, por ejemplo se emplee una molécula recombinante de ácido nucleico como se describe aquí y que consiste en el promotor de DCX (o un fragmento funcional del mismo) y un gen heterólogo (dirigido por dicho promotor y que expresa un gen antiapoptótico.
Según esto, la presente invención también proporciona un método para tratar y/o prevenir un trastorno o enfermedad neurológica que comprende la administración de un compuesto de la presente invención a un sujeto en necesidad de tal tratamiento. Preferiblemente dicho sujeto es un paciente humano. Como se discutirá aquí posteriormente, la presente invención también proporciona medios y métodos para la detección y/o aislamiento de células determinadas/restringidas neuronales. Estas células también son particularmente útiles en marcos médicos y también pueden estar comprendidas en composiciones farmacéuticas de la invención y emplearse en pautas de tratamiento y/o prevención en, preferiblemente, pacientes humanos.
Por lo tanto, y como se ilustra aquí más adelante, la invención también proporciona el uso de una molécula recombinante de ácido nucleico o de un vector de la invención para la preparación de una composición de diagnóstico para la detección de (una) célula(s) determinada(s) neuronal(es). Además, el uso de un ácido nucleico recombinante, de un vector o de una célula huésped genéticamente modificada como se describe aquí para la preparación de una composición de diagnóstico para el aislamiento de (una) células(s) determinada(s) neuronal(es) en proliferación es una forma de realización de la presente invención.
En aún una forma de realización adicional, la invención se refiere a un método de detección de (una) célula(s) determinada(s) neuronal(es) en proliferación que comprende los pasos de (a) expresar en una pluralidad de células un ácido nucleico recombinante o un vector de la invención y (b) seleccionar las células que expresan una secuencia heteróloga de nucleótidos bajo el control de la secuencia reguladora como se define aquí. En una forma de realización dicho método comprende en el paso (b) la detección de un gen marcador o indicador heterólogo expresado. Dicho método puede comprender la detección de un marcador fluorescente expresado, como GFP y derivados de la misma o un gen que codifica una enzima como \beta-Gal, CAT o luciferasa. Como se ilustra aquí más adelante, los métodos proporcionados aquí pueden comprender un análisis por FACS (separación celular activada por fluorescencia), análisis por MACS (separación celular magnética mediante, entre otros, columnas de separación de MS) o aislamiento de afinidad (por ejemplo con bolas magnéticas y similares) de células a ser seleccionadas y aisladas. Tales métodos los conoce el experto en la materia, véase, por ejemplo, Kawaguchi, Mol. Cell Neurosci. 17 (2001), 259-273; WO 00/23571 o WO 01/53503.
Como se ha señalado aquí anteriormente, la presente invención proporciona por primera vez medios para la detección y aislamiento de células determinadas/restringidas neuronales proliferativas in vivo. Puesto que DCX es una proteína que se expresa intracelularmente, los sistemas de selección basados en la detección del ARNm de DCX o proteína DCX expresados sólo se pueden llevar a cabo cuando las células se fijan y/o permeabilizan y, según esto, se destruyen. No obstante, la presente invención proporciona sistemas de detección/selección que permiten la detección/selección in vivo de células restringidas/determinadas neuronales proliferativas, en particular células troncales o progenitoras restringidas/determinadas neuronales. Debido a la provisión de secuencias reguladoras de DCX específicas la invención, por lo tanto, permite planteamientos únicos y sencillos de aislamiento para células neuronales deseadas, es decir, células restringidas neuronales que no se desarrollan a células no deseadas, como, por ejemplo, astrocitos, oligodendrocitos o incluso células no neuronales, como células del sistema hematopoyético o células epiteliales.
Según esto, la invención también proporciona un método para la detección de (una) célula(s) restringida(s)
neuronal(es) proliferativa(s) que comprende el paso de seleccionar en una pluralidad de células (una) célula(s) que comprende(n) una secuencia reguladora de DCX activada. Dicho método puede comprender además un paso de separar (una) célula(s) que expresa(n) una secuencia heteróloga de nucleótidos bajo el control de la secuencia reguladora descrita aquí de (una) célula(s) que no es/son capaz/capaces de expresar dicha secuencia heteróloga de ácido nucleico o puede comprender un paso adicional de separar (una) célula(s) que comprende(n) una secuencia reguladora activada como se define aquí. La activación de dicha secuencia reguladora se puede determinar, entre otros, mediante la expresión de un gen o una secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador o un indicador como se ha definido anteriormente. Dicho marcador/indicador puede, por ejemplo, comprender una proteína fluorescente o una enzima, como luciferasa o \beta-gal y similares.
Según esto, la invención también proporciona un método para separar células determinadas neuronales proliferativas de una población mezcla de tipos celulares de tejido nervioso, basado en la expresión selectiva de tipo celular de las secuencias reguladoras específicas/"promotores" para DCX. Este método incluye seleccionar la secuencia reguladora de DCX como se ha definido aquí que funciona selectivamente en las células determinadas neuronales, introduciendo una molécula de ácido nucleico que codifica un marcador, proteína marcadora como una proteína fluorescente bajo el control de dicho promotor en todos los tipos celulares de la población mezcla de tipos celulares del sistema nervioso, por ejemplo, tejido del hipocampo permitiendo que solo las células determinadas neuronales, pero no otros tipos celulares dentro de la población mezcla, expresen dicha proteína marcadora, identificando células de la población mezcla de tipos celulares que expresan dicho marcador/proteína marcadora, que están restringidas a células determinadas neuronales, y separando las células marcadas de la población mezcla de tipos celulares, en donde las células separadas se restringen a células determinadas neuronales.
El experto en la materia está fácilmente en la posición de llevar a cabo los métodos proporcionados aquí. Se describen métodos para separar células en WO 98/32879, WO 00/23571 o WO 01/53503.
Debido a los métodos proporcionados aquí, ahora es posible obtener una población distinta de células determinadas/restringidas neuronales proliferativas. Según esto, en una forma de realización, la presente invención se refiere a una célula determinada neuronal aislada o a una preparación enriquecida o purificada de células determinadas neuronales aisladas y la progenie de las mismas, en donde estas células determinadas neuronales aisladas o progenie de las mismas expresan una secuencia heteróloga de nucleótidos bajo el control de una secuencia reguladora de DCX como se define aquí. En el contexto de las formas de realización proporcionadas aquí, el término "aislada" se refiere a (una) célula(s) determinada(s) neuronal(es) proliferativa(s) que se obtiene(n) mediante métodos descritos aquí y que se han separado de tejido (nervioso) y/o poblaciones/suspensiones celulares que comprenden otras células neurales, como células gliales, células de microglia, células endoteliales, oligodendrocitos o neuronas maduras completamente desarrolladas y similares. También se prevé el aislamiento y separación de (una) célula(s) determinada(s) neuronal(es) proliferativa(s) de células troncales no diferenciadas multi/pluripotentes.
La población distinta de células determinadas/restringidas neuronales proliferativas obtenidas mediante los métodos de esta invención son particularmente útiles en ensayos de cribado (por ejemplo para sustancias neuroactivas) así como para fines médicos.
La invención se refiere a la detección de células determinadas/restringidas neuronales mitóticamente activas o a una preparación aislada y/o enriquecida o purificada de células determinadas/restringidas neuronales proliferativas aisladas. La invención también se refiere a un método de separar células determinadas/restringidas neuronales proliferativas de una población mixta de células de tejido nervioso u otros tejidos de un organismo, tal como pollo, roedor o ser humano, basado en la expresión específica de tipo celular de un promotor/elemento regulador específico de células determinadas/restringidas neuronales, como se divulga aquí. Esta invención comprende, por ejemplo, la expresión selectiva de una molécula de ácido nucleico que codifica un marcador detectable (proteína fluorescente, proteína luminiscente, antígeno de superficie, etiqueta, etc.) bajo el control de la secuencia reguladora de DCX descrita aquí. Cuando se usa una proteína fluorescente, las células fluorescentes de una población mezcla de tipos celulares son células determinadas/restringidas neuronales mitóticamente activas y se pueden identificar y separar del resto de las células. Las células separadas de esta manera son células determinadas/restringidas neuronales, como se documenta en los ejemplos adjuntos. El promotor/secuencia reguladora descrito aquí dirige específicamente la expresión en células determinadas/restringidas neuronales, pero no en otras células del organismo o de la población mixta de células.
La secuencia reguladora de la invención que dirige la expresión de un marcador detectable se puede introducir en una pluralidad de células, órganos y organismos. Esto incluye, pero no está limitado a, la introducción en células mediante varios métodos que conocen los expertos en la materia, por ejemplo transfección (basada en liposomas, electroporación, basada en balística, etc.) o transducción mediada por virus (adenovirus, retrovirus, etc.) y la introducción en organismos mediante varios métodos que conocen los expertos en la materia, por ejemplo transfección (basada en liposomas, electroporación, basada en biolística, etc.) o transducción mediada por virus (adenovirus, retrovirus, etc.) y tecnología de transgénicos.
Después de la expresión específica de célula de la proteína marcadora detectable, por ejemplo proteína fluorescente verde (GFP) o proteína fluorescente verde mejorada (EGFP), las células que expresan la proteína fluorescente se detectan y/o separan por medios apropiados, tal como separación celular activada por fluorescencia. Los métodos para el aislamiento y separación de células que expresan un marcador detectable están disponibles y los conocen los expertos en la materia (Roy, J. Neuroscience 59 (2000), 321-331; Kawaguchi 2001, loc.cit.).
A pesar de la forma de realización descrita anteriormente, la invención también se refiere a una de las secuencias reguladoras descritas aquí para la expresión de otras secuencias heterólogas de ácido nucleico además de genes marcadores o indicadores.
En otra forma de realización preferida, la presente invención se refiere al uso de las secuencias reguladoras o las moléculas recombinantes de ácido nucleico o vectores de la invención, que preferiblemente expresan un gen indicador, para identificar y aislar elementos en cis de la secuencia reguladora que media la expresión específica de células determinadas/restringidas neuronales.
En otra forma de realización preferida, la presente invención se refiere al uso de las secuencias reguladoras o las moléculas recombinantes de ácido nucleico o vectores de la invención, que preferiblemente expresan un gen indicador, para determinar el grado de maduración de células determinadas/restringidas neuronales o para determinar la influencia de compuestos candidatos/fármacos y similares en su programa de diferenciación y/o su desarrollo. Esta forma de realización se puede usar por ejemplo para determinar el grado de maduración de células neuronales o células troncales neurales cultivadas in vitro que se van a usar en estudios clínicos. No obstante, también se prevé que se ensaye el grado de maduración de otras células (células humanas y no humanas) mediante los usos y métodos proporcionados aquí. Por ejemplo, se prevé que se transfecten/transduzcan células, por ejemplo, células no neuronales/neurales, como células HEK293, fibroblastos con las moléculas recombinantes de ácido nucleico como se describe anteriormente y que se empleen dichas células en métodos de cribado como se proporcionan aquí. Según esto, estas células (huésped) transfectadas/transducidas pueden proporcionar herramientas valiosas en ensayos de cribado de fármacos. Como se documenta en los ejemplos adjuntos la expresión dirigida por las secuencias reguladoras de doblecortina proporciona medios únicos para determinar la fase de desarrollo de una célula restringida neuronal, puesto que la doblecortina solamente se expresa de forma transitoria 
\hbox{durante una fase temprana restringida durante
el desarrollo o diferenciación de neuronas.}
Otra forma de realización de la invención se refiere al uso de las secuencias reguladoras, las moléculas recombinantes de ácido nucleico, los vectores, las células huésped o los animales transgénicos no humanos (o sus células, tejidos u órganos) descritos aquí para identificar y aislar factores que median la expresión específica en células restringidas neuronales/determinadas neuronales. Los métodos detallados para tal uso se describen aquí posteriormente.
Como ya se ha mencionado anteriormente, las células determinadas/restringidas neuronales que se pueden detectar y aislar mediante los métodos proporcionados aquí también son útiles en marcos médicos y en la prevención y/o tratamiento de trastornos neurológicos y/o el tratamiento o prevención de trastornos de memoria y aprendizaje. Por lo tanto, la invención se refiere, en una forma de realización, al uso de (una) célula(s) determinada(s) neuronal(es) detectada(s) o aislada(s) mediante el método descrito aquí para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno o enfermedad neurológica. La presente invención también proporciona medios para el aislamiento y separación de células restringidas/determinadas neuronales proliferativas de una población mixta de células o de órganos u organismos de diferentes especies. Estas células aisladas se pueden usar para diferentes propósitos, incluyendo estudiar las propiedades moleculares y celulares de esta población celular, y para trasplante médico. Las estrategias de trasplante para el sistema nervioso central (SNC) enfermo requieren células no tumorigénicas, bien caracterizadas que sean capaces de diferenciarse en los tipos celulares apropiados. Para el reemplazo de células neuronales, las células determinadas/restringidas neuronales son las más adecuadas puesto que ya están determinadas para convertirse en neuronas, pero no están aún completamente diferenciadas y todavía son lo suficientemente flexibles para adquirir el fenotipo neuronal requerido.
También se pueden usar la molécula recombinante de ácido nucleico o un vector de la invención para determinar el grado de maduración de una célula neuronal. El experto en la materia puede por ejemplo emplear estudios de transfección en donde la molécula recombinante de ácido nucleico o el vector de la invención dirige la expresión de un gen marcador o indicador. Analizando el grado de expresión de dicho gen marcador o indicador, el experto en la materia está fácilmente en una posición para determinar la fase de desarrollo de una célula transfectada o transducida con dicha molécula de ácido nucleico recombinante o dicho vector. Una señal positiva indica que la célula a ser analizada ha encendido el programa de determinación/diferenciación neuronal, ya que la secuencia reguladora de DCX divulgada aquí es activa.
También se pueden emplear y usar la molécula recombinante de ácido nucleico, el vector, la célula huésped genéticamente modificada o el animal transgénico no humano (u órganos, tejidos o células del mismo) de la presente invención para identificar y/o aislar factores y/o compuestos capaces de regular la actividad de células determinadas neuronales, neurogénesis y/o diferenciación o migración neuronal. Según esto, se pueden emplear la molécula recombinante de ácido nucleico, el vector, la célula huésped genéticamente modificada o el animal transgénico no humano (o partes como órganos y células aislados de dicho animal) de la presente invención en, entre otros, métodos de cribado como se describe. Dicha molécula recombinante de ácido nucleico, dicho vector y/o dicha célula huésped genéticamente modificada de la invención son particularmente útiles para la generación de un animal transgénico no humano.
Por lo tanto, la invención también proporciona animales transgénicos no humanos así como el uso de dicho animal transgénico no humano para identificar y/o obtener una molécula capaz de modificar el destino celular de una célula troncal neuronal o un progenitor neuronal. Preferiblemente, dicho animal transgénico comprende en sus células somáticas y/o germinales al menos una copia adicional de la secuencia reguladora de DCX (o una parte o fragmento funcional de la misma) que controla la expresión o no expresión de un gen marcador/indicador seleccionable o de cualquier otra molécula heteróloga de ácido nucleico. Tal animal puede ser un animal "knock-in", que expresa por ejemplo un gen marcador/indicador, como GFP, EGFP o DsRed, bajo el control de una secuencia reguladora proporcionada aquí. No obstante, un animal transgénico inventivo también puede ser un animal transgénico que no expresa una secuencia de ácido nucleico bajo el control de la secuencia reguladora descrita aquí. Tal animal puede ser un animal transgénico en el que la correspondiente secuencia reguladora endógena de doblecortina (DCX) se ha inactivado o delecionado (por ejemplo, un "animal knock-out" o un animal que comprende una versión mutada no funcional de las correspondientes secuencias reguladoras de DCX). En dicho animal "knock-out" las secuencias reguladoras descritas aquí se inactivan o suprimen. Los ejemplos adjuntos ilustran cómo se pueden obtener y emplear tales animales transgénicos en los métodos de la presente invención.
El animal transgénico no humano más preferido de la presente invención comprende en sus células al menos una copia adicional de la secuencia reguladora unida descrita aquí, preferiblemente operativamente unida a un gen heterólogo, como un gen que codifica un marcador/indicador (por ejemplo, luciferasa, GFP, DsRed, EGFP y similares).
En una forma de realización preferida particular de la invención, se divulga un método de cribado de compuestos capaces de regular actividad de células determinadas neuronales, neurogénesis y/o diferenciación, dicho método comprende los pasos de: (a) poner en contacto una molécula recombinante de ácido nucleico, un vector o una célula huésped genéticamente modificada o un animal transgénico no humano de la invención o un animal transgénico no humano generado mediante el método de la invención con (un) compuesto(s) que se sospecha que directa o indirectamente interacciona(n) con la secuencia reguladora como de define aquí; y (b) se detecta si dicho(s) compuesto(s) es/son capaz/capaces de interaccionar con dicha secuencia reguladora.
Dicho "poner en contacto" se puede llevar a cabo in vivo así como in vitro. Por ejemplo, se prevé que dicho animal transgénico se ponga en contacto con el compuesto/candidatos a ensayar. Dicho(s) compuesto(s) se puede(n), entre otros, inyectar en dicho animal, por ejemplo mediante inyección intercerebral/intercraneal. De forma similar, se pueden poner en contacto in vitro células transfectadas con una molécula recombinante de ácido nucleico como se divulga aquí con los compuestos a ensayar, por ejemplo introduciendo los compuestos de prueba en el medio de cultivo. La detección, si dicho(s) compuesto(s) es/son capaz/capaces de interaccionar con la secuencia reguladora de la invención, puede implicar la detección, si la secuencia reguladora está activada. Se dan modelos correspondientes no limitantes aquí posteriormente y en los ejemplos adjuntos.
El término "poner en contacto una molécula recombinante de ácido nucleico de la invención con (un) compuesto(s) que se sospecha que directa o indirectamente interacciona(n) con la secuencia reguladora" puede comprender pruebas de interacción. Tales pruebas se pueden llevar a cabo mediante ensayos inmunológicos, bioquímicos específicos y/o ensayos genéticos que se conocen en la técnica y comprenden ensayos homogéneos y heterogéneos. Por ejemplo, en el método de la presente invención, las pruebas de interacción a ser empleadas según la invención se pueden usar para detectar una respuesta de la interacción directa o indirecta de la secuencia reguladora con la molécula candidata. Dichos ensayos de interacción que emplean sistemas de lectura son bien conocidos en la técnica y comprenden, entre otros, cribados por doble híbrido (como se describe, entre otros en EP-0 963 376, WO 98/25947, WO 00/02911 y modificado para la detección de compañeros de interacción para las secuencias reguladoras de la invención), columnas de arrastre de GST, ensayos de coprecipitación a partir de extractos celulares como se describe, entre otros, en Kasus-Jacobi, Oncogene 19 (2000), 2052-2059, sistemas de "trampa de interacciones" (como se describe, entre otros, en US 6004746), ensayos de unión in vitro y similares. Se describen métodos adicionales de ensayos de interacción y los correspondientes sistemas de lectura en, entre otros, US 5525490, WO 99/51741, WO 00/17221, WO 00/14271, WO 00/05410. De relevancia particular según esta invención son los ensayos de interacción que comprenden métodos bioquímicos/genéticos como, por ejemplo, ensayos de desplazamiento de bandas que se emplean para deducir, entre otros, compuestos proteínicos capaces de interaccionar con secuencias reguladoras/promotores.
Además, el método mencionado anteriormente para el cribado de compuestos capaces de regular la actividad de células determinadas neuronales, neurogénesis y/o diferenciación neuronal puede comprender el cribado de sustancias que son capaces de inducir un programa de diferenciación en una célula de prueba/huésped que comprende la secuencia reguladora de la presente invención. Dichos métodos de cribado también pueden comprender el cribado de compuestos que activan, directa o indirectamente, la secuencia reguladora de DCX definida aquí y que producen migración de una célula en donde dicha secuencia reguladora está activada. La presente invención proporciona métodos de cribado de fármacos, como se detallará posteriormente.
Una diferencia en el perfil de expresión de una molécula de ácido nucleico bajo el control de una secuencia reguladora (o una parte o fragmento funcional de la misma) en ausencia del agente candidato comparado con el perfil de expresión en presencia del agente candidato indica que el agente modula la expresión de DCX. Dicho agente es, según esto, capaz de "interaccionar con la secuencia reguladora" de la presente invención, cuando una lectura correspondiente puntúa positivamente. Por ejemplo, un agente candidato puede provocar la expresión de un gen marcador o indicador, como EGFP, DsRed o GFP bajo el control de la secuencia reguladora de DCX descrita aquí. En este caso, el compuesto candidato, directa o indirectamente, ha interaccionado con dicha secuencia reguladora. Se prevé una interacción directa, entre otros, de un factor de transcripción específico capaz de unirse a la secuencia reguladora de la invención y de inducir transcripción. Un ejemplo de interacción indirecta de un compuesto candidato comprende, pero no está limitado a, la implicación de una vía de transducción de señales. De forma similar, también se prevé que se ensayen diferencias en la respuesta fisiológica, por ejemplo de la respuesta electrofisiológica, en ausencia o en presencia de la molécula candidata para la modulación específica de la actividad de la secuencia reguladora de la presente invención indica que el agente/molécula/compuesto candidato es capaz de modificar dicha actividad. La diferencia, como se usa aquí, es estadísticamente significativa y preferiblemente representa al menos un 30%, más preferiblemente al menos el 50%, más preferiblemente al menos un 90% de diferencia.
Según esto, el promotor específico de DCX divulgado aquí puede estar unido a un gen indicador adecuado, por ejemplo DsRed, luciferasa o GFP y similares, y usarse en ensayos basados en células para cribar compuestos capaces de modular, mediante regulación positiva o negativa de DCX, una molécula que se expresa de forma transitoria en neurogénesis, como se detalla en los ejemplos adjuntos.
La comparación mencionada anteriormente entre la respuesta tras poner en contacto la secuencia reguladora de la invención con dicha molécula candidata y la respuesta estándar medida en ausencia de dicha molécula candidata puede proporcionar la presencia, la ausencia, el descenso o el aumento de una señal específica en el sistema de lectura. Dicho sistema de lectura, como se describe aquí puede ser, por ejemplo, un sistema de lectura bioquímico o fisiológico, como un sistema de lectura electrofisiológico. También se prevén sistemas de lectura genéticos. Se puede clasificar, por lo tanto, una señal específica que aumenta sobre la señal/respuesta estándar como que es un activador de la secuencia reguladora de DCX proporcionada aquí, mientras que se puede clasificar una señal disminuida como diagnóstica para un inhibidor de la función o expresión de la secuencia reguladora de DCX.
Como se detallará más adelante, la invención también se refiere al uso de una molécula recombinante de ácido nucleico, de un vector, de una célula huésped genéticamente modificada o de un animal transgénico no humano de la invención o un animal transgénico no humano generado mediante el método de la invención o al uso de (una) célula(s) determinada(s) neuronal(es) aislada(s) mediante el método de la invención o de (una) célula determinada neuronal o una preparación enriquecida o purificada de células determinadas neuronales aisladas y progenie de las mismas como se describe aquí para seguir in vivo o in vitro neuronas recién generadas, células determinadas neuronales trasplantadas o células determinadas neuronales en migración.
Como se ha descrito anteriormente, la presente invención se refiere, entre otros, a los usos específicos de moléculas recombinantes de ácido nucleico que codifican genes marcadores o actividades indicadoras estando dirigida la expresión de dichos marcadores e indicadores por la secuencia reguladora descrita en la invención como promotor de DCX. Por ejemplo, se puede usar una actividad enzimática como actividad marcadora o indicadora que se puede detectar en un huésped de la presente invención, por ejemplo una célula huésped o un animal transgénico, así como en tejidos y órganos de dicho animal. El sistema proporcionado en esta invención también permite el seguimiento in vivo e in vitro de neuronas recién generadas. Por ejemplo, es posible el análisis por imágenes in vivo de neuronas en generación durante su "estado naciente" debido a las provisiones de la presente invención. Según esto, se proporciona un sistema ideal in vivo, que permite, entre otros, el ensayo de condiciones medioambientales, condiciones y lesiones psico- y fisiológicas sobre la generación y migración de neuronas. Además, se puede probar el potencial de sustancias/compuestos y mezclas de compuestos, tales como potenciales agentes terapéuticos, para influir la neurogénesis durante el desarrollo y en adulto empleando, entre otros, los animales transgénicos de la invención. Puesto que las moléculas marcadoras/indicadoras se expresan en las células huésped o animales transgénicos de la invención, su expresión es específicamente detectable en células determinadas/restringidas neuronales proliferativas y su expresión disminuye en neuronas maduras. El análisis por imágenes in vivo del marcador/indicador o de la actividad marcadora/indicadora permite un análisis cualitativo y cuantitativo de la actividad neurogénica en la célula huésped o el animal transgénico de la invención. En particular, en el animal transgénico de la invención, se puede estudiar la migración de las células precursoras neuronales. Sin embargo, también es posible emplear células que expresan la molécula recombinante de ácido nucleico de la invención en tales estudios. Por ejemplo, se puede trasplantar tal célula huésped o célula determinada neuronal a un animal de prueba y se puede visualizar o medir in vivo el destino de la célula trasplantada. Según esto, los métodos de la invención permiten el seguimiento in vivo de células trasplantadas que llevan el ácido nucleico recombinante como se describe en la invención, y se puede seguir su proceso de migración y determinación/restricción/diferenciación neuronal por medios conocidos en la técnica. Además de los experimentos in vivo, la invención se puede usar para seguir células determinadas/restringidas neuronales que migran en una preparación de tejido in vitro/ex situ que comprende células que comprenden una molécula recombinante de ácido nucleico de la invención. En este contexto, una molécula preferida a ser expresada bajo el control de la secuencia reguladora de la invención es luciferasa o sus derivados.
El método de análisis por imágenes ópticas no agresivo de, por ejemplo, actividad luciferasa en animales vivos, tales como ratones o ratas trasplantados o transgénicos, está disponible y lo conocen los expertos en la materia (Bhaumik y Gambhir, PNAS 99 (2002), 377-382; Wu, Molecular Therapy 4 (2001), 297-306) y se describe en los ejemplos. Aquí, se usa una cámara con un dispositivo de cargas acopladas (CCD) refrigerada para la evaluación in vivo. La cámara CCD se monta en una cámara de imágenes hermética a la luz, que contiene el organismo huésped tal como un ratón transgénico que expresa luciferasa bajo la secuencia reguladora de la invención. Las ventajas de usar análisis óptico de imágenes no agresivo basado en luciferasa son varias: 1. comparada con proteínas indicadoras colorimétricas y fluorescentes que requieren una fuente externa de luz para la excitación, el/los gen(es) de la luciferasa bioluminiscente, tal como la luciferasa de luciérnaga, no necesita excitación por luz externa, autoemite luz de las longitudes de onda del amarillo al verde en presencia de luciferina, ATP, magnesio y oxígeno. Por lo tanto, las células que activan la expresión de, por ejemplo, luciferasa bajo la secuencia reguladora de la invención (células restringidas/determinadas neuronales) sólo son luminiscentes durante un periodo transitorio de tiempo y por lo tanto permite múltiples medidas en tiempo real en un mismo animal. 2. La rápida velocidad de recambio de luciferasa (T 1/2 = 3 h) en presencia del sustrato luciferina permite medidas en tiempo real. 3. Hay una relación lineal entre la concentración de luciferasa y la luz emitida en 7 a 8 órdenes de magnitud.
Por lo tanto, la invención proporciona medios y métodos in vivo e in vitro que permiten el cribado de sustancias/compuestos candidatos capaces de influenciar y/o modificar el destino y desarrollo de células neuronales, como células precursoras neuronales así como células restringidas/determinadas neuronales. Además, con los medios y métodos proporcionados aquí, en particular las células huésped y los animales transgénicos no humanos, ahora es posible cribar sustancias/candidatos que fomentan la neurogénesis. Las sustancias no sólo son útiles en la prevención y terapia de trastornos y enfermedades neurológicos sino que también son útiles en el tratamiento de psicosis, trastornos de aprendizaje o memoria. Además, se proporcionan métodos in vivo, in vitro y ex situ que permiten el seguimiento de células que comprenden una secuencia reguladora activada descrita en la invención. También se prevé que se lleven a cabo ensayo de migración de células, empleando la molécula recombinante de ácido nucleico, los vectores, las células huésped, así como células o tejidos derivados de los animales transgénicos de la invención. Estos ensayos pueden comprender experimentos de injertos. Como ejemplo no limitante, se prevén que se lleven a cabo experimentos de injertos de una especie a otra, por ejemplo, se pueden injertar las células obtenidas de un ratón transgénico que comprende en sus células una molécula recombinante de ácido nucleico como se describe anteriormente (por ejemplo el transgén luciferasa, GFP, DsRed o similares) en, por ejemplo, rata (cerebro) y se pueden ensayar comportamiento de migración, supervivencia y/o diferenciación de dichas células injertadas.
Como se ha mencionado anteriormente, se pueden emplear en particular sistemas celulares o animales transgénicos (o células, tejidos u órganos de los mismos) que comprenden la molécula recombinante de ácido nucleico descrita anteriormente en cribados de fármacos, por ejemplo en cribados para la detección y/o aislamiento de sustancias y fármacos que, directa o indirectamente activan la secuencia reguladora de DCX y que fomentan, entre otros, programas de diferenciación/determinación en células hacia un fenotipo de neurona o hacia una neurona. Como ejemplo no limitante, se puede usar un modelo de ratón transgénico (o sus células, tejidos u órganos, como el cerebro) como se describe en los ejemplos adjuntos y que expresa un gen marcador (por ejemplo, luciferasa, DsRed, EGFP y similares) bajo el control de la secuencia reguladora descrita aquí en experimentos de cribado de fármacos, para ensayar el potencial neurogénico (es decir, el potencial de generar nuevas neuronas en el cerebro adulto) de un compuesto. El giro dentado y el sistema ventrículo lateral/canal migratorio rostral/bulbo olfatorio son las dos regiones prominentes del cerebro adulto, que producen nuevas neuronas. Por lo tanto, estas dos regiones se pueden analizar en estos ratones para producción aumentada de nuevas neuronas. Se pueden analizar otras regiones cerebrales, tales como neocorteza, cuerpo estriado, cerebelo, sustancia negra y médula espinal que tienen neurogénesis muy baja o indetectable en el adulto, para ensayar la capacidad de una compuesto de inducir neurogénesis de novo. En un experimento ejemplificado, los animales reciben un compuesto o una mezcla de compuestos a ser ensayados mediante, por ejemplo, infusión intracerebroventricular a través de minibombas osmóticas (Kuhn, J. Neurosci. 17 (1997), 5820-5829) o mediante administración periférica (tales como vías intraperitoneal, subcutánea o intravenosa). Después de varios días de tratamiento los animales se sacrificarán y se retirarán los cerebros. Para medir la cantidad de células productoras de marcador (por ejemplo GFP), se pueden usar varios métodos de detección: Por ejemplo, se puede emplear el contaje histológico de células. Se cortarán los cerebros en un micrótomo y se montarán en portaobjetos para análisis histológico. Con este método se pueden contar el número de células que expresan el marcador (por ejemplo GFP) en las áreas cerebrales anteriormente mencionadas de forma manual usando un microscopio de fluorescencia o con la ayuda de sistemas de análisis morfométricos automáticos o semiautomáticos. El fin es generar el número de células que expresan el marcador por estructura cerebral. Se pueden comparar los datos de animales que recibieron un fármaco, con animales controles o animales que recibieron un fármaco de referencia. De forma similar, se puede emplear detección de fluorescencia histológica. Para evitar contaje manual de células que exige mucho tiempo, se puede tomar una medida directa de la intensidad de fluorescencia para evaluar el nivel de expresión. Los cerebros se procesarán para análisis histológico y se analizan imágenes individuales de ciertas áreas cerebrales para el marcador (aquí intensidad de fluorescencia) usando software morfométrico tal como NIH Image. El fin es generar un índice de intensidad de marcador (por ejemplo, GFP) para cada ratón para comparar animales, que recibieron un compuesto, con animales controles, o animales que recibieron un fármaco de referencia. También se pueden usar métodos bioquímicos: después de la homogenización, este procedimiento puede permitir la determinación de fluorescencia total de marcador por muestra analizada. Se pueden usar áreas microdisecadas del cerebro o cerebro completo para cuantificar la cantidad de marcador fluorescente verde (por ejemplo, GFP, EGFP y similares) de sobrenadante de homogenados de tejido. Los sobrenadantes se pueden analizar en un fluorímetro, tal como un lector de placas de ELISA fluorescentes. Además, también se puede emplear análisis por FACS. Como ilustración, se microdisecan los cerebros de los animales transgénicos que expresan el marcador bajo el control de la secuencia reguladora de la invención para analizar las áreas cerebrales mencionadas anteriormente para células que expresan marcador. Después de la homogenización del tejido, se pueden inyectar suspensiones de células únicas en un analizador de células activado por fluorescencia para determinar la fracción de células que expresan marcador (por ejemplo, GFP) entre la población total de células en una estructura cerebral determinada.
Los animales transgénicos no humanos así como las células y órganos aislados de dicho animal son parcialmente útiles (como las células huésped descritas aquí) para los métodos de cribado divulgados en esta invención. Son parcialmente útiles en ensayos in vivo e in vitro para probar las propiedades neurogénicas de compuestos candi-
datos.
Los agentes candidatos para compuestos capaces de regular la actividad de células determinadas neuronales, neurogénesis y/o diferenciación neuronal abarcan numerosas clases químicas. Por ejemplo, se prevé que se empleen antidepresivos o factores de crecimiento en los sistemas de cribado proporcionados aquí. Los agentes candidatos típicos también son típicamente compuestos orgánicos, preferiblemente compuestos orgánicos pequeños. Los compuestos orgánicos pequeños tienen un peso molecular de más de 50 Da sin embargo de menos de alrededor de 2.500 Da, preferiblemente, menos de alrededor de 1.000 Da, más preferiblemente, menos de alrededor de 500 Da. Los agentes candidatos comprenden grupos químicos funcionales necesarios para interacciones estructurales con lípidos, proteínas y/o ADN, y típicamente incluyen al menos un grupo amino, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, preferiblemente al menos dos de los grupos químicos funcionales, más preferiblemente al menos tres. Los agentes candidatos con frecuencia comprenden estructuras de carbono cíclicas o heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriormente mencionados. Los agentes candidatos también se encuentran entre las biomoléculas incluyendo péptidos, proteínas, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos, y similares. Donde el agente es o está codificado por un ácido nucleico transfectado, dicho ácido nucleico es típicamente ADN o ARN. El compuesto candidato mismo puede ser una molécula de ácido nucleico, por ejemplo un ADN o un ARN que codifica un candidato potencial. Tales candidatos comprenden por ejemplo, moléculas de ácido nucleico que codifican factores de transcripción o proteínas/péptidos implicados en desarrollo neuronal y similares. Tal candidato también puede ser, sin embargo, un compuesto que inhibe la expresión de proteínas. Tales candidatos inhibidores pueden ser, entre otros, moléculas de ácido nucleico que comprenden, por ejemplo oligonucleótidos antisentido, ARNi y similares. Las moléculas candidatas que se pueden usar según el método de la presente invención también incluyen, entre otros, péptidos, proteínas, lípidos, anticuerpos, aptámeros, intrámeros o compuestos orgánicos pequeños.
Como se ha mencionado anteriormente, los agentes candidatos se pueden obtener de una amplia variedad de fuentes incluyendo librerías de compuestos naturales o sintéticos. Por ejemplo, están disponibles numerosos medios para la síntesis al azar y dirigida de una amplia variedad de compuestos orgánicos y biomoléculas. De forma alternativa, están disponibles o se producen fácilmente librerías de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales. Además, las librerías y compuestos naturales o sintéticamente producidos son fácilmente modificables por medios convencionales químicos, físicos y bioquímicos. Además, se pueden someter agentes farmacológicos conocidos a modificaciones químicas dirigidas o al azar, tales como acilación, alquilación, esterificación, amidación, etc., para producir análogos estructurales.
La molécula candidata a ser ensayada en el método de la presente invención puede ser una sustancia única aislada así como una pluralidad de sustancias que pueden ser o no idénticas. Dicha(s) molécula(s)/compuesto(s) candidato(s) puede(n) estar comprendido(s) en, por ejemplo, muestras, por ejemplo, extractos celulares de, por ejemplo, plantas, animales o microorganismos. Además, dicho(s) compuesto(s) puede(n) ser conocido(s) en la técnica pero hasta ahora no se sabía que eran capaces de influenciar la actividad de las secuencias reguladoras de DCX o no se sabía que eran capaces de influenciar la expresión de las secuencias reguladoras de DCX, respectivamente. La pluralidad de compuestos se puede, por ejemplo, añadir a una muestra in vitro, al medio de cultivo o inyectar en la célula o un animal de prueba, preferiblemente un animal de prueba transgénico no humano.
Si se identifica una muestra (colección de moléculas candidatas) que contiene (un) compuesto(s) en el/los
método(s) de la invención, entonces es posible aislar el compuesto de la muestra original identificada como que contiene el compuesto en cuestión o se puede subdividir la muestra original, por ejemplo, si consiste en una pluralidad de compuestos diferentes de modo que se reduzca el número de sustancias diferentes por muestra y repetir el método con las subdivisiones de la muestra original. Se puede determinar entonces si dicha muestra o compuesto muestra las propiedades deseadas mediante métodos conocidos en la técnica tal como se describe aquí. Dependiendo de la complejidad de las muestras, los pasos descritos anteriormente se pueden realizar varias veces, preferiblemente hasta que la muestra identificada según el método de la invención sólo comprende un número limitado de o sólo una sustancia(s). Preferiblemente dicha muestra comprende sustancias de propiedades químicas y/o físicas similares, y lo más preferiblemente dichas sustancias son idénticas. Los métodos de la presente invención los puede realizar y diseñar fácilmente el experto en la materia, por ejemplo según otros ensayos basados en células descritos en la técnica anterior (véase, por ejemplo, EP-A-0 403 506). Además, el experto en la materia reconocerá fácilmente que se pueden usar compuestos y/o células adicionales para realizar los métodos de la invención, por ejemplo, células huésped transfectadas/transducidas como se describe aquí anteriormente. También se prevé que los métodos de la presente invención se empleen en células, tejido u órganos del animal transgénico descrito anteriormente.
Los compuestos/moléculas candidatas a ser ensayadas también pueden ser derivados funcionales o análogos de activadores o inhibidores conocidos. Los métodos para la preparación de derivados y análogos químicos los conoce bien el experto en la materia y se describen en, por ejemplo, Beilstein, loc. cit. Además, se pueden ensayar los efectos de dichos derivados y análogos según métodos conocidos en la técnica y/o como se describe aquí. Además, se pueden usar peptidomiméticos y/o diseño asistido por ordenador de activadores o inhibidores apropiados de la expresión de la secuencia reguladora de DCX, por ejemplo, según los métodos descritos aquí. Se describen sistemas de ordenador apropiados para el diseño asistido por ordenador de, por ejemplo, proteínas y péptidos, en la técnica anterior, por ejemplo, en Berry, Biochem. Soc. Trans. 22 (1994), 1033-1036; Wodak, Ann. N. Y. Acad. Sci. 501 (1987), 1-13; Pabo, Biochemistry 25 (1986), 5987-5991. Se pueden usar los resultados obtenidos de los análisis informáticos descritos anteriormente en combinación con el método de la invención para, por ejemplo, optimizar compuestos, sustancias o moléculas conocidos. También se pueden identificar compuestos/moléculas candidatos apropiados mediante la síntesis de librerías combinatorias de peptidomiméticos mediante modificación química sucesiva y ensayo de los compuestos resultantes, por ejemplo según los métodos descritos aquí. Los métodos para la generación y uso de librerías combinatorias de peptidomiméticos se describen en la técnica anterior, por ejemplo en Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220-234 y Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709-715.
También se describe aquí un método para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno o enfermedad neurológica que comprende los pasos del/de los método(s) descritos aquí y, además, la formulación de (un) compuesto(s) capaz/capaces de regular la actividad de células troncales neurales, neurogénesis y/o diferenciación neuronal detectada y/o obtenida mediante dicho(s) método(s) con un soporte, excipientes y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de soportes, excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables se mencionan aquí anteriormente.
Los métodos descritos aquí son particularmente adecuados para el cribado de fármacos de alto rendimiento automatizado usando estaciones de trabajo dispensadoras de líquido robóticas. Está disponible la automatización robótica similar para plaqueo de células de alto rendimiento y detección de varias lecturas de ensayos.
En general se corren una pluralidad de mezclas de ensayos en paralelo con diferentes concentraciones de agente para obtener una respuesta diferencial a varias concentraciones. Típicamente, una de estas concentraciones sirve como control negativo, es decir, a concentración cero o por debajo de los límites de detección del ensayo.
Estas y otras formas de realización se divulgan y son obvias para el experto en la materia y están abarcadas por la descripción y los ejemplos de la presente invención. Se puede obtener bibliografía adicional respecto a uno de los métodos, medios y usos, mencionados anteriormente que se pueden aplicar dentro del significado de la presente invención de la técnica anterior, por ejemplo en bibliotecas públicas, por ejemplo con el uso de medios electrónicos. Para este fin, se puede acceder a bases de datos públicas, tal como "Medline" a través de internet, por ejemplo en la dirección http://www.ncbi.nlm.nih.qov/PubMed/medline.html.
El experto en la materia conoce bases de datos adicionales y direcciones que se pueden coger de internet, por ejemplo en la dirección http://www.lycos.com. Se da una visión general de fuentes de información respecto a patentes o solicitudes de patente en biotecnología en Berks, TIBTECH 121 (1994), 352-364.
Las figuras muestran:
Figura 1: Análisis por inmunotransferencia de anticuerpos dirigidos contra doblecortina (DCX). Se separó homogenado de tejido de bulbo olfatorio adulto de rata en un SDS-PAGE de poliacrilamida al 12% y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa. Cada carril, que contenía 2 \mug de proteína, se incubó en una solución diferente de anticuerpo. El carril 1 se incubó en una solución que contenía anticuerpo de cabra anti-doblecortina C-18 (Santa Cruz Laboratories), el carril 2 se incubó en una solución que contenía anticuerpo de cabra anti-doblecortina N-19 (Santa Cruz Laboratories) y el carril 3 se incubó en una solución que contenía anticuerpo de ratón anti-doblecortina (Transduction Laboratories). El complejo inmune se detectó mediante quimioluminiscencia. El anticuerpo de cabra anti-doblecortina C-18 fue el más específico y reconoció una banda única de aproximadamente 40 kDa, que corresponde al peso molecular esperado de la doblecortina.
Figura 2: Evolución temporal de la expresión de DCX en células recién generadas del giro dentado adulto. Después de inyectar BrdU en ratas de 2 meses de edad, se determinaron los cambios en la capa de células granulares del giro dentado durante un periodo de 180 días en el comarcaje de BrdU con DCX y NeuN. La evolución temporal en (A) representa el porcentaje de células inmunopositivas para BrdU con comarcaje para DCX (diamantes), NeuN (cuadrados) o DCX+NeuN (círculos). Los datos se presentan como el porcentaje de células positivas para BrdU por región, para cada tiempo después de la inyección de BrdU (n = 4 animales por grupo, media \pm EEM). (B-G) Imágenes representativas de la capa de células granulares del giro dentado que representa la inmunodetección de BrdU (bloque central) (inmuno-reactividad nuclear), DCX (inmuno-reactividad citoplásmica detectada en las regiones del pericarion y en las prolongaciones que cruzan la capa de células granulares (bloque izquierdo) y NeuN (bloque derecho) (inmuno-reactividad nuclear) a las 2 horas (B), 4 días (C), 7 días (D), 10 días (E), 21 días (F), 60 días (G). Las flechas indican ejemplos de doble marcaje de BrdU con DCX y los asteriscos indican doble marcaje de BrdU con NeuN.
Figura 3: Expresión de DCX en células en proliferación. Para confirmar que DCX se expresa en células en proliferación, se usó comarcaje de DCX con Ki-67, un marcador para células que experimentan división. (A) En la zona subgranular del giro dentado (ZSV) y (B) en la zona subventricular de la pared del ventrículo lateral (GD) se puede detectar fácilmente el doble marcaje DCX/Ki-67 como grupos de células proliferativas. La inmuno-reactividad de Ki67 se localiza en el núcleo, mientras que la inmuno-reactividad de DCX es citoplásmica. Algunos de los núcleos inmuno-reactivos a Ki-67 se indican con flechas.
Figura 4: Morfología de las células que expresan DCX en el giro dentado. Se encontraron dos fenotipos diferentes de células positivas para DCX en el giro dentado, que se correlacionan con el doble marcaje de BrdU en ciertos puntos temporales después de la aplicación de BrdU: (A) células amorfas y con ramificaciones cortas en la zona subgranular con una orientación tangencial a lo largo de la capa de células granulares y (B) células situadas en la base de capa de células granulares, con prolongaciones orientadas de forma perpendicular que alcanzan la capa molecular. Las flechas señalan a células comarcadas con BrdU y DCX.
Figura 5: La expresión de doblecortina disminuye en el giro dentado en envejecimiento. Se seleccionaron para el análisis 6 tiempos que variaban desde animales de 2 meses de edad hasta animales de 21 meses de edad. Estos tiempos cubren el intervalo durante el que se ha descrito previamente la disminución dependiente de la edad en la neurogénesis en el hipocampo (Kuhn, J. Neurosci, 16 (1996), 2027-2033). Las imágenes se obtuvieron mediante microscopia confocal usando secciones representativas del giro dentado. Se eligieron las áreas de mayor intensidad de DCX de cada sección para el procesamiento de imágenes. La inmunorreactividad de DCX se puede apreciar en las numerosas prolongaciones que cruzan la capa de células granular. La inmunorreactividad de NeuN está presente en la mayoría de núcleos de las células granulares, destacando de esta manera la capa de células granulares.
Figura 6: Morfología de células que expresan DCX durante la neurogénesis en el bulbo olfatorio. Similar al giro dentado, se pueden encontrar múltiples fenotipos morfológicos de células inmunorreactivas para DCX en la zona subventricular (CMR), canal migratorio rostral (ZSV) y bulbo olfatorio (BO), que se correlacionan con el doble marcaje de BrdU y DCX a diferentes puntos temporales después de la aplicación de BrdU: células amorfas y con ramificaciones cortas en la zona subventricular que sufren división celular, células tangencialmente orientadas en el canal migratorio rostral, que representan neuroblastos que migran y células en el bulbo olfatorio que extienden neuritas en la capa plexiforme, indicativo de neuroblastos en diferenciación y neuronas jóvenes. Un dibujo anatómico esquemático (centro) representa la posición anatómica desde la que se tomaron las fotos.
Figura 7: Evolución temporal de la expresión de DCX en células recién generadas del bulbo olfatorio adulto. Después de inyectar BrdU en ratas de 2 meses de edad, se determinaron los cambios en la capa de células granulares del bulbo olfatorio durante un periodo de 180 días en el comarcaje de BrdU con DCX y NeuN. La evolución temporal en (A) representa el porcentaje de células inmunopositivas para BrdU con comarcaje para DCX (diamantes), NeuN (cuadrados) o DCX+NeuN (círculos). Los datos se presentan como los porcentajes de células positivas para BrdU por región, para cada tiempo después de la inyección de BrdU (n = 4 animales por grupo, media \pm EEM). (B-G) Imágenes representativas de la capa de células granulares del bulbo olfatorio que representan BrdU (bloque central) (inmuno-reactividad nuclear), DCX (bloque izquierdo) (inmuno-reactividad citoplásmica detectada en el soma celular y prolongaciones) y NeuN (bloque derecho) (inmuno-reactividad nuclear) a las 2 horas (B), 4 días (C), 7 días (D), 10 días (E), 21 días (F), 60 días (G). Las flechas indican ejemplos de doble marcaje de BrdU con DCX. Nótese que no se pudo encontrar doble marcaje BrdU/DCX a las 2 horas y 4 días después del marcaje, puesto que las células precursoras neuronales positivas para BrdU de la ZSV tienen que migrar a través del CMR y llegan al bulbo olfatorio después de aproximadamente 4 días.
Figura 8: Diagramas de los plásmidos phuDCXpromoEGFP1 y phuDCXpromoDsRed2. Se subclonó la secuencia reguladora del gen de DCX en pEGFP-N1 y pDsRed2-1 de BD Biosciencies Clontech. Se eliminó el promotor del citomegalovirus (CMV) del vector pEFGP-N1 antes de la inserción de las secuencias reguladoras de DCX. La secuencia reguladora se subclonó para controlar la expresión de las proteínas fluorescentes EGFP (A) o DsRed2 (B). Ejemplos del gen indicador EGFP bajo el control de la secuencia reguladora humana de DCX son las Seq ID NO: 5 y 7. Ejemplos del gen indicador 
\hbox{DsRed2 bajo el control de la
secuencia reguladora humana de DCX son las Seq ID NO: 6 y
8.}
Figura 9: Alineamiento #1. Secuencias reguladoras humanas frente a ratón. Alineamiento global óptimo entre la secuencia ID no: 1 y la secuencia ID No: 2 usando la función de alineamiento "fasta20u66, versión 2.0u66" disponible en Biology Workbench del Centro de Superordenadores de San Diego.
Figura 10: Diagrama de las secuencias reguladoras de DCX humanas frente a ratón. A) Se ilustran las dos secuencias (SEQ ID NO. 1: humana y SEQ ID NO 2: ratón) con las secuencias de exones como cajas negras. Sólo se representan los fragmentos de exones no traducidos putativos, es decir, exón 1, exón 2, exón 3 y el principio del exón 4. B) La secuencia de ácido nucleico fuera de los exones se puede subdividir en regiones. El diagrama ilustra las posiciones de estas regiones y exones. La tabla da las posiciones de nucleótidos de estas regiones y exones en las secuencias reguladoras de DCX humana y de ratón, así como el porcentaje de identidad entre las regiones y exones correspondientes de las dos secuencias. El fragmento de la secuencia reguladora de DCX humana comprendida entre los nucleótidos número 1166-3509 corresponde a la región diagnóstica.
Figura 11: Alineamiento #2. Alineamiento de las regiones diagnósticas de las secuencias reguladoras de DCX humanas frente a ratón. Alineamiento global óptimo entre la secuencia ID no: 3 (humana) y la secuencia Id No: 4 (de ratón) usando la función de alineamiento "fasta20u66, versión 2.0u66" disponible en Biology Workbench del Centro de Superordenadores de San Diego.
Figura 12: Estrategia de clonación de la secuencia reguladora humana de DCX. Representación esquemática de la clonación de la secuencia reguladora humana de DCX usando un planteamiento de amplificación por PCR (como se describe en el ejemplo II).
Figura 13: Expresión del gen EGFP bajo el control de la secuencia reguladora humana de DCX.
A) Se sembraron cultivos de prosencéfalo disociado de ratón de día embrionario 14,5, que contenían células precursoras restringidas neuronales, sobre matriz de poliornitina/laminina durante una semana en presencia de NT3 y suero fetal de ternera. Los cultivos se transfectaron con el vector phuDCXpromoEGFP1. Dos días después del final de la transfección, se examinó la expresión del gen indicador EGFP en los cultivos. En el panel derecho se usó DAPI como contratinción nuclear. Esta fotografía documenta la presencia de células con la morfología de neuroblastos jóvenes que expresan el gen indicador EGFP. El recuadro documenta las varias morfologías de las células transfectadas con el gen indicador EGFP expresado bajo un promotor ubicuo (CMV; promotor del citomegalovirus).
B) Se trataron y transfectaron células troncales corticales fetales humanas como en (A). La fotografía documenta la presencia de células con la morfología de neuroblastos jóvenes que expresan el gen indicador EGFP.
C) Se sembraron cultivos de la línea celular COS7 (ATCC, número CRL-1651), derivados de células de riñón de Cercopithecus aethiops transformadas con SV40 y por lo tanto que no contienen células precursoras restringidas neuronales, sobre matriz de poliornitina/laminina durante 24 horas y se transfectaron con el vector phuDCXpromoEGFP1. Dos días después del final de la transfección, se examinó la expresión del gen indicador EGFP en los cultivos. Pocas células expresaron el gen marcador EGFP en el límite inferior de detección. En el panel derecho se usó DAPI como una contratinción nuclear. Por el contrario, en un cultivo idéntico transfectado con un vector que codifica el gen indicador EGFP bajo el control de un promotor ubicuo, es decir el promotor de CMV, se pudo detectar fuerte expresión del gen indicador en numerosas células (véase el recuadro de C).
Figura 14: Estrategia para la generación de ratones transgénicos que expresan el gen EGFP bajo el control de la secuencia reguladora humana de DCX. Descripción esquemática de la generación de ratones transgénicos que expresan el gen indicador EGFP bajo el control de la secuencia reguladora humana de DCX (como se describe en el ejemplo IV).
Figura 15: Patrón de expresión de EGFP bajo el control de la secuencia reguladora humana de DCX en dos líneas de ratones transgénicos. Detección de la señal fluorescente de EGFP en secciones sagitales de cerebro de ratones transgénicos huDCXpromoEGFP1 de un mes de edad de la línea 299 y la línea 303. La señal del gen indicador EGFP se puede detectar en precursores restringidos neuronales recién generados, en particular en regiones implicadas en neurogénesis activa, es decir, en el giro dentado y en eje zona subventricular-bulbo olfatorio. A-F) ratón transgénico de la línea 299. A-C) señal de EGFP detectada en el bulbo olfatorio (A), corteza (B), giro dentado (C), respectivamente. D-F) contratinción usando el fluorocromo que une ADN, DAPI, en los mismos campos visuales que en A-C. G-L, ratón transgénico de la línea 303. G-I) señal de EGFP detectada en el bulbo olfatorio (G), corteza (H), giro dentado (I), respectivamente. J-L) contratinción usando el fluorocromo que une ADN, DAPI, en los mismos campos visuales que en G-I.
Figura 16: Inmunocaracterización del ratón transgénico huDCXpromoEGFP1. Se procesó el bulbo olfatorio de un ratón transgénico huDCXpromoEGFP1 de un mes de edad de la línea 303 para inmunohistoquímica usando anticuerpos dirigidos contra el polipéptido doblecortina o el polipéptido GFAP. Las fotografías A a C documentan la colocalización de la expresión del gen indicador EGFP, bajo el control de la secuencia reguladora humana de DCX, con la expresión endógena de la doblecortina de ratón. Las flechas señalan algunos somas celulares para permitir la comparación de (B) señal del indicador EGFP con (A) expresión endógena de la doblecortina de ratón. C) muestra una superposición de las señales documentadas en los paneles A y B. El polipéptido indicador EGFP se localiza preferentemente en el soma celular, mientras que el polipéptido doblecortina se distribuye más significativamente en las prolongaciones celulares. Las fotografías D a F documentan la ausencia de colocalización de la expresión del gen indicador EGFP, bajo el control de la secuencia reguladora humana de DCX, con la expresión de GFAP, un polipéptido expresado en astrocitos. Las flechas señalan a (D) astrocitos detectados mediante anticuerpo anti-GFAP. Estas células no expresaron el gen indicador EGFP como reveló la ausencia de señal fluorescente de EGFP en las coordenadas correspondientes (E). F) muestra una superposición de las señales documentadas en los paneles D y E.
Figura 17: Sitios de unión putativos para factores de transcripción en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. Se muestran los sitios de unión putativos para factores de transcripción en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 determinados mediante análisis por ordenador (como se describe en el texto).
Figura 18: Actividad específica de la secuencia reguladora humana de DCX en células de linaje neuronal. Se transfectaron de forma transitoria diferentes tipos celulares (HEK293, COS7, CTX, TNA2, N20.1, D283Med, Neuro2A y MEF de E10,5) con pEGFP-N1 o phuDCXpromoEGFP1 y se analizó la expresión de EGFP. Mientras que todos los tipos celulares se pueden transfectar y expresan EGFP bajo el control del promotor ubicuo de CMV (bloque izquierdo), la secuencia reguladora de DCX dirige la expresión del gen indicador específicamente en células de linaje neuronal (bloque derecho).
Figura 19: Análisis cuantitativo de la actividad del promotor. Se transfectaron de forma transitoria diferentes tipos celulares (HEK293, COS7, CTX TNA2, N20.1, D283Med, Neuro2A y MEF de E10,5) con pEGFP-N1 o phuDCXpromoEGFP1 y se analizó la expresión de EGFP. A) Se analiza y muestra el porcentaje de células que expresa EGFP. B) Se muestra la eficacia de expresión (calculada como el porcentaje de células que expresa EGFP después de la transfección con phuDCXpromoEGFP1 relativo al porcentaje de células que expresa EGFP después de la transfección con pEGFP-N1). Nótese el alto nivel de eficacia de expresión en células de linaje neuronal.
Figura 20: Análisis del tipo celular de células presentes en células MEF de E10,5. Se analizó la expresión de marcadores en células MEF de E10,5 después de una semana de diferenciación. A) muestra la tinción de inmunofluorescencia de diferentes marcadores presentes en el cultivo. B) muestra un análisis cuantitativo de los porcentajes de células que expresan los diferentes marcadores en cultivos de células MEF de E10,5.
Figura 21: Frecuencia de coexpresión de DCX con varios marcadores en células MEF de E10,5 después de 1 semana de diferenciación. Nótese que la expresión de DCX colocaliza con tipos de células determinadas neuronales, y no células de glía (GFAP, GalC) ni troncales (nestina).
Figura 22: Análisis del tipo celular de células en las que la secuencia reguladora humana de DCX es activa. Se transfectaron de forma transitoria MEF de E10,5 con phuDCXpromoEGFP1 y se inmunotiñeron para diferentes marcadores. Las células positivas para EGFP se comarcaron con marcadores endógenos para células determinadas neuronales, pero no con marcadores de células troncales o de glía.
Figura 23: Análisis cuantitativo de los experimentos en la figura 22. Se cuantificó la frecuencia de la presencia de los varios marcadores mostrados en la figura 22 en células MEF de E10,5 que expresaban EGFP después de transfección con phuDCXpromoEGFP1. Además, para fines comparativos, se muestra la frecuencia de expresión de DCX-EGFP en células MEF de E10,5 después de transfección con pEGFP-N1.
Figura 24: Construcciones de deleción de SEQ ID NO: 1. Se usaron los fragmentos de deleción presentados en esta figura para controlar la expresión del gen indicador EGFP como se muestra en las SEQ ID NO: 20 a 25.
Figura 25: Actividad específica de las construcciones de deleción de la figura 24 cuando se transfectan en células MEF de E10,5. Se transfectaron de forma transitoria MEF de E10,5 con diferentes construcciones de deleción y se analizó el porcentaje de células positivas para EGFP que se comarcaron con DCX.
Figura 26: Las células derivadas del cuerpo ciliar y de RPE expresan marcadores progenitores in vitro. (A) RT-PCR para \beta III tubulina, nestina, Pax6, Dcx y musashi con GAPDH como estándar. Los productos son de 140 pb para cada par de cebadores. (B)-(D) Inmunotinción para el marcador de célula troncal neural nestina con contratinción de DAPI en células derivadas de RPE después de 21 DIV en condiciones de diferenciación (NB/B27 + SFT al 5%).
Figura 27: Fenotipo y morfología neuronal en células derivadas de RPE y cuantificación de diferenciación en células CC y RPE. Se muestran células derivadas de cultivos de RPE de pase número 3 hechas crecer durante 7 días en cubreobjetos de vidrio recubiertos de laminina. (A)-(C) Inmunotinción para \beta III tubulina con contratinción nuclear de DAPI. La morfología de las células es de carácter neuronal. (D)-(F) Doble inmunotinción para \beta III tubulina y el marcador precursor neuronal Dcx con contratinción nuclear de DAPI. (G)-(I) Inmunotinción para \beta III tubulina (H) y Dcx (G) con contratinción nuclear de DAPI en células RPE hechas crecer en condiciones de proliferación en plástico recubierto con colágeno. La célula muestra una morfología más epitelial y no coexpresa Dcx. (J), (K) Cuantificación del porcentaje de células que expresan Dcx y \beta III tubulina en cultivos de CC y RPE después de 7 DIV en condiciones de diferenciación. Los datos se expresan como valor medio +/- error estándar de la media (EEM).
Figura 28: Enriquecimiento de células que expresan DsRed2 derivadas de un animal como se describe en ejemplo IV mediante separación por FACS. Se analizaron cultivos celulares de cerebros disociados de ratones transgénicos huDCXpromoDsRed2 neonatales inmediatamente después de la separación por FACS. (A) Fotografía de contraste de fase de un cultivo compuesto de células separadas por FACS para la presencia de fluorescencia de DsRed2. (B) Señal de fluorescencia obtenida de la proteína indicadora DsRed2 detectada en el mismo campo de observación que en A. Algunas células que expresan el gen indicador DsRed2 están marcadas con flechas, mientras que algunas células desprovistas de DsRed2 están marcadas con una punta de flecha. Nótese que más del 99% de las células expresan el gen indicador DsRed2. (C) Fotografía de contraste de fase de un cultivo compuesto de células separadas por FACS para la ausencia de fluorescencia de DsRed2. (D) Señal de fluorescencia obtenida de la proteína indicadora DsRed2 detectada en el mismo campo de observación que en C. Nótese que más del 99% de las células son negativas, es decir, no expresan el gen indicador DsRed2. La barra de escala en D representa 200 \mum.
Figura 29: Las células que expresan un gen fluorescente (EGFP o DsRed2) derivadas de un animal como se describe en el ejemplo IV enriquecidas por FACS producen células positivas para doblecortina. Cultivos celulares originados de cerebros neonatales disociados de ratones transgénicos huDCXpromoDsRed2 o nestina-EGFP. Las células se separaron por FACS en poblaciones positiva y negativa respecto a su expresión de los genes indicadores DsRed2 y EGFP, respectivamente. Las poblaciones separadas se mantuvieron en cultivo durante 1 día antes de la fijación como se describe en el ejemplo VI. Los paneles A a C documentan que las células derivadas de ratones transgénicos huDCXpromoDsRed2 separadas para la presencia del indicador DsRed2 (A) produjeron un cultivo con >90% de las células que expresaban doblecortina (B), la contratinción nuclear con DAPI se muestra en (C). Los paneles D a F documentan que las células derivadas de ratones transgénicos huDCXpromoDsRed2 separadas para la ausencia del indicador DsRed2 (D) produjeron un cultivo con <5% de las células que expresaban doblecortina (B), la contratinción nuclear con DAPI se muestra en (F). Los paneles G a I documentan que las células derivadas de ratones transgénicos nestina-EGFP separadas para la presencia del indicador EGFP (G) produjeron un cultivo mixto con algunas células que expresaban doblecortina (H), la contratinción nuclear con DAPI se muestra en (I). Los paneles J a L documentan que las células derivadas de ratones transgénicos nestina-EGFP separadas para la ausencia del indicador EGFP (J) también produjeron un cultivo mixto con algunas de las células que expresaban doblecortina (K), la contratinción nuclear con DAPI se muestra en (L). El nivel de expresión del gen indicador EGFP en las células nestina-EGFP separadas por FACS disminuye significativamente después de 1 día de cultivo en cubreobjetos. La presencia de restos celulares es responsable de algo de la unión inespecífica del anticuerpo de doblecortina. Sólo se consideraron células con una morfología nuclear normal. La barra de escala en (L) representa 100 \mum.
Figura 30: Ratones transgénicos huDCXpromoEGFP para estudiar variaciones en los niveles de neurogénesis. Se muestra la fluorescencia de EGFP en el giro dentado de diferentes ratones transgénicos. A) muestra una sección de un ratón de 1 mes de edad, B) muestra una sección de un ratón de 2 meses de edad, C) muestra una sección de un ratón de 12 meses de edad. Nótese la disminución en la intensidad de fluorescencia de EGFP como función de la edad según el descenso descrito en neurogénesis relacionado con la edad. D y E) muestran secciones de ratones de tres meses de edad D) un ratón control y E) un ratón 7 días después de convulsiones epilépticas inducidas experimentalmente. Nótese el aumento en la señal de EGFP relacionada con las convulsiones en E) según el aumento descrito de neurogénesis que sucede después de la actividad de convulsión. F) muestra los resultados de un análisis cuantitativo.
Los ejemplos ilustran la invención.
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Ejemplo I
Expresión transitoria de doblecortina (DCX) durante la neurogénesis en adulto a) Materiales y métodos usados en este estudio Animales e inyecciones de BrdU
Se mantuvieron ratas hembra Wistar (Charles River-Wiga, Sulzfeld, Alemania) en un ciclo normal de luz oscuridad (12 horas de luz/12 horas de oscuridad) y tuvieron acceso libre a alimento y agua. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por la comisión de cuidado animal de la universidad y por el gobierno local y estuvieron de acuerdo con las directrices del NIH y la ley alemana. Los animales recibieron a los 2 meses de edad inyecciones intraperitoneales con BrdU (50 mg/kg de peso corporal). Los animales perfundidos a las 2 horas, 4 y 7 días después del tratamiento con BrdU recibieron una única inyección de BrdU. Los animales que se sacrificaron a los 10, 14 y 21 días, 1, 2, 3, 4, 6, 9, 14 y 19 meses después de la inyección de BrdU recibieron a diario inyecciones en 4 días consecutivos. Cada tiempo consistió en 3 animales.
SDS-PAGE/inmunotransferencia
Se homogenizó el bulbo olfatorio de una rata hembra Wistar (Charles River-Wiga, Sulzfeld, Alemania) de 2 meses de edad en tampón SUB (SDS al 0,5%, urea 8 M, \beta-mercaptoetanol al 2%) y se centrifugó a temperatura ambiente durante 10 minutos a 12.000xg para eliminar los restos insolubles. Se determinó la concentración de proteína en el sobrenadante usando el reactivo de Bradford (Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU.). La muestra (2 \mug/carril) se sometió a electroforesis en un SDS-PAGE de poliacrilamida al 12% y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa (Schleicher and Schuell, Dassel, Alemania).
Las membranas se colocaron en tampón de bloqueo (Tris-HCl 20 mM, pH 7,3, NaCl al 0,9%, gelatina de teleósteo al 1% (Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU.) y Tween-20 al 0,1%) durante 1 hora a temperatura ambiente. El mismo tampón sirvió para las diluciones de los anticuerpos, así como para los lavados. Para la detección de DCX, se usaron los anticuerpos primarios siguientes: anti-DCX C-18 de cabra (1:500, Santa Cruz Labs, Santa Cruz, EE.UU.), anti-DCX N-19 de cabra (1:500, Santa Cruz Labs, Santa Cruz, EE.UU.) y anti-DCX de ratón (1:500, Transduction Labs, Lexington, EE.UU.). Las membranas se incubaron en las soluciones de los anticuerpos primarios durante la noche a 4ºC en una mesa rotatoria. Al día siguiente, las membranas se lavaron y se incubaron además con anticuerpos secundarios específicos de especie conjugados a peroxidasa durante 2 horas a temperatura ambiente (anti-cabra de conejo 1:5000 (Sigma, Taufkirchen, Alemania) y anti-ratón de burro 1:5000 (Jackson ImmunoResearch, West Grove, EE.UU.). Las membranas se lavaron y el complejo inmune se detectó usando el sustrato de quimioluminiscente SuperSignal West Pico (Perbio, Bonn, Alemania) según el protocolo del fabricante.
Histología
Los animales se anestesiaron profundamente y se perfundieron transcardiacamente con paraformaldehído al 4% en tampón fosfato 100 mM, pH 7,4. Se disecaron los cerebros, se sumergieron durante la noche en fijador, y se transfirieron a sacarosa al 30%/tampón fosfato 100 mM, pH 7,4 durante al menos 48 horas. Los cerebros se cortaron en secciones sagitales de 40 \mum usando un microtomo de deslizamiento. Las secciones se almacenaron a -20ºC en solución crioprotectora hasta la tinción (glicerol al 25% v/v, etilenglicol al 25% v/v y tampón fosfato 0,05 M, pH 7,4).
Inmunofluorescencia
Para permitir una mejor penetración de los anticuerpos en áreas de alta densidad neuronal, se colocaron secciones de flotación libre en solución de Triton X-100 al 1%/TBS (solución salina tamponada con Tris: Tris-HCl 0,1 M pH 7,4/NaCl al 0,9%) durante 15 minutos, seguido por tres lavados consecutivos de 5 minutos con TBS. Para la detección de BrdU incorporada, las secciones se sometieron al siguiente procedimiento: incubación en NaCl 0,3 M/tampón citrato 30 mM pH 7,0/formamida al 50% (v/v) a 65ºC durante 2 horas, lavado en NaCl 0,3 M/tampón citrato 30 mM pH 7,0, incubación en HCl 2 N a 37ºC durante 30 minutos, lavado en tampón borato 0,1 M (pH 8,5) durante 10 minutos, lavado en TBS. Las secciones se bloquearon en TBS/suero de burro al 3%/Triton X-100 al 0,1% (TBS-DS-TX) durante 30 minutos, seguido por incubación con los anticuerpos primarios en TBS-DS-TX durante 48 horas a 4ºC. Se usaron las siguientes diluciones de anticuerpo primario: anti-BrdU de rata (1:500 Accurrate, Westbury, EE.UU.), anti-NeuN de ratón (1:500, Chemicon, Temecula, EE.UU.), anti-DCX C-18 de cabra (1:500, Santa Cruz Labs, Santa Cruz, EE.UU.), anti-KI67 de conejo (1:500, Novacastra Laboratories Ltd., Newcastle Upon Tyne, RU). Las secciones se lavaron después en TBS tres veces durante 10 minutos, y luego se incubaron con anticuerpos secundarios en TBS-DS-TX durante 2 horas. Se usaron los siguientes anticuerpos secundarios conjugados a fluorocrono: fragmento F(ab)_{2} anti-rata-CY5 de burro, fragmento F(ab)_{2} anti-ratón-rodaminaX de burro, fragmento F(ab)_{2} anti-cabra-FITC de burro y anti-conejo-FITC de burro (todos a 2 \mug/ml, Jackson ImmunoResearch, West Grove, EE.UU.). Después de varios lavados en TBS, las secciones se montaron en portaobjetos de vidrio recubiertas de gelatina y se cubrieron usando Prolong (Molecular Probes, Eugene, OR).
Cuantificación
Se realizó el análisis usando un microscopio confocal (TCS-NT, Leica Microsystem, Bensheim, Alemania) equipado con un objetivo de inmersión en aceite APO 40xPL (1,25 NA) y un ajuste de apertura que se corresponde a un espesor del plano focal de menos de 2 \mum. Se analizaron células positivas para BrdU seleccionadas al azar en su eje z entero para excluir doble marcaje falso debido a una superposición de señales de diferentes células (Kuhn (1997) loc. cit.). Se examinaron un mínimo de 50 células positivas para BrdU por región de interés para comarcaje con DCX y NeuN en cada animal y tiempo. Los datos se presentan como el porcentaje medio de células positivas para BrdU, que se comarcaron para DCX, NeuN o DCX/NeuN (media +/- EEM).
b) Selección de anticuerpo de doblecortina para análisis por inmunotransferencia
Se examinó la especificidad de tres anticuerpos comercialmente disponibles dirigidos contra DCX mediante análisis por inmunotransferencia. Los tres anticuerpos detectaron una banda de 40 kDa, consistente con el peso molecular de la proteína DCX (figura 1). No obstante, el anticuerpo dirigido contra el extremo C-terminal de DCX (Santa Cruz Labs, Santa Cruz, EE.UU.) demostró ser el más específico (figura 1, carril 1). Los otros dos anticuerpos (figura 1, carril 2 y 3) detectaron otras varias proteínas a pesos moleculares mayores. Una de tales bandas podría ser la quinasa similar a doblecortina (DCLK), una proteína relacionada que comparte un 85% de homología con el extremo N-terminal de DCX (Ohara, DNA Res. 4 (1997), 53-59). DCLK es una proteína quinasa asociada a microtúbulos que también se expresa en cerebro. Debido a su mayor especificidad se eligió el anticuerpo anti-DCX C-18 de cabra para el análisis inmunohistológico de secciones de tejido. Según esto, el presente estudio documenta que sólo se pueden emplear anticuerpos muy específicos dirigidos contra DCX para elucidar la expresión temporal y espacial de dicha DCX.
c) Expresión de doblecortina durante neurogénesis en el hipocampo adulto Análisis de evolución temporal
Se examinó el patrón de expresión de DCX en células recién generadas mediante marcaje de inmunofluorescencia de DCX y BrdU en las regiones neurogénicas del cerebro adulto de rata a diferentes tiempos después de la administración de BrdU. Primero se cuantificó el número de células positivas para BrdU que expresaban DCX en el giro dentado (figura 2). En el tiempo más temprano analizado, es decir, 2 horas después de la administración de BrdU, se observó comarcaje de DCX en el 60% de las células recién nacidas (figura 2). El hecho de que la mayoría de las células positivas para BrdU expresaran DCX en el tiempo más temprano sugería fuertemente que las células en proliferación ya expresaban DCX. Para sustanciar más esta observación, se pudo demostrar el comarcaje frecuente de DCX con Ki-67. Ki67 es un antígeno enriquecido en células en proliferación durante la síntesis de ADN y mitosis, en el hipocampo y pared del ventrículo lateral (figura 3). Entre los días siete y diez después del marcaje el porcentaje de células positivas para BrdU que expresaban DCX aumentó más hasta más del 90% (figura 2). Posteriormente, la expresión de DCX disminuyó rápidamente. Se observó en sólo el 2% de las células positivas para BrdU en un mes y se volvió indetectable a los dos meses después del marcaje.
Hacia la fase final de la diferenciación neuronal, las células recién nacidas empiezan a expresar proteínas típicamente presentes en neuronas maduras tales como el marcador neuronal nuclear NeuN, la enolasa especifica de neuronas (NSE) o calbindina (Cameron (1993), loc. cit.; Kuhn (1996), loc. cit. y Kuhn, J. Neurosci, 17 (1997), 5820-5829). Una vez inducidos, estos marcadores se expresan durante toda la vida de la neurona. Por esa razón, se usó NeuN para determinar cuando los precursores neuronales recién generados se volvían maduros y hasta qué grado solapaban las expresiones de NeuN y DCX. Se detectaron por primera vez las células marcadas con BrdU inmunorreactivas para NeuN en el hipocampo 10 días después de la inyección de BrdU (figura 2). La mayoría de las células positivas para NeuN coexpresaban DCX entre el día 10 y el 14, posteriormente el comarcaje NeuN/DCX ya no fue detectable más. El porcentaje de células positivas para BrdU que expresan NeuN aumentó hasta alrededor del 80% un mes después del marcaje y aumentó adicionalmente hasta más del 90% a tiempos posteriores analizados (figura 2). Se analizaron las regiones adyacentes no neurogénicas, el hilio y las capas moleculares del giro dentado, como áreas control. La colocalización de cuerpos celulares positivos para BrdU con DCX o NeuN no se detectó en estas
regiones.
Morfología de células que expresan DCX
Es interesante advertir que la morfología de las células que expresan DCX cambió según maduraban los neuroblastos (figura 4). Se observaron dos morfologías celulares. En los primeros días después del marcaje con BrdU, las células positivas para DCX formaban grupos en la zona subgranular adyacente al margen interno de la capa de células granulares. Algunas de estas células no tenían prolongaciones definidas, mientras que otras recordaban a neuroblastos con prolongaciones orientadas en paralelo a la capa de células granulares (figura 4a). Posteriormente, alrededor de 10 días después del marcaje con BrdU, las células positivas para DCX se integraron en la capa de células granulares y mostraron prolongaciones que abarcaban la capa entera y más allá en la capa molecular (Figura
4b).
d) Expresión de doblecortina en el giro dentado que envejece
Previamente se ha descrito una disminución dependiente de la edad de la neurogénesis en la capa de células granulares del giro dentado (Kuhn (1996), loc. cit.). Por consiguiente, se realizó un análisis de la expresión de DCX como función de la edad. La mayor incidencia de inmunorreactividad de DCX se observó en los animales más jóvenes examinados, es decir, ratas de 2 meses. La cantidad total de células que expresaban DCX disminuyó notablemente a los 11 meses de edad, y muy pocas células positivas para DCX eran detectables en ratas de 21 meses (figura 5). La reducción de células que expresan DCX en el giro dentado es consistente con y sustancia la disminución de la neurogénesis dependiente de la edad descrita.
El estudio actual analizó la evolución temporal de expresión de DCX en células nacidas en el giro dentado y la pared del ventrículo lateral/bulbo olfatorio adultos. DCX se expresa en un alto grado en células en división (figura 2 y figura 3). DCX no se detecta en la zona ventricular embrionaria durante el desarrollo de la corteza (Gleeson, Neuron 23 (1999), 257-271), pero se expresa en células en proliferación de la ZSV y el hipocampo adultos. Aparentemente, las células progenitoras neurales fetales y adultas tienen diferentes identidades y propiedades molecu-
lares.
e) Expresión de doblecortina en la capa de células granulares del bulbo olfatorio
Los neuroblastos recién generados del bulbo olfatorio surgen en la zona subventricular (ZSV) de la pared del ventrículo lateral, donde tiene lugar la proliferación de las células troncales neurales y los progenitores neuronalmente comprometidos (Doetsch (1997), loc. cit.). Las células nuevas forman cadenas de células en migración, que convergen para formar el canal migratorio rostral. Después de alcanzar el bulbo olfatorio (BO) las células se integran en la capa de células granulares y la región periglomerular y empiezan a expresar marcadores neuronales
maduros.
Zona subventricular/canal migratorio rostral
DCX se expresa ya fuertemente en la zona subventricular (Figura 6). Similar al hipocampo, numerosas células en la zona subventricular se marcaron doblemente para DCX y el marcador de proliferación Ki-67, lo que indica división celular frecuente de los neuroblastos (figura 3). La morfología de las células que expresan DCX en la zona subventricular es mayoritariamente bipolar con prolongaciones cortas (figura 6). Las células positivas para DCX se organizan en estructuras similares a cadenas, que se ha descrito previamente para neuroblastos migratorios (Lois, Science 271 (1996), 978-981). En el canal migratorio rostral, los neuroblastos que expresan DCX tienen una morfología elongada con una prolongación principal, consistente con migración de neuroblastos hacia el BO (figura
6).
Bulbo olfatorio
Por último, en el BO las células que expresan DCX adoptan una morfología más compleja, de forma similar a la observada para las células que se integran en la capa granular de células del hipocampo (figura 6). Por consiguiente, las células marcadas con BrdU que vienen de la ZSV se detectaron primero en el bulbo olfatorio cuatro días después de la inyección de BrdU. Este intervalo refleja el tiempo requerido para que los neuroblastos migren de la ZSV, donde surgen e incorporan BrdU, al BO. Cuatro días después del marcaje, se encontró que sólo el 2% de las células marcadas con BrdU en el BO expresaban DCX. A este tiempo, el porcentaje es relativamente bajo puesto que la mayoría de las células marcadas con BrdU observadas en el BO provienen de la división celular in situ de células no neuronales. Durante los siguientes días, mientras la mayoría de los neuroblastos recién generados de la ZSV alcanza el BO, este porcentaje aumentó rápidamente. Diez días después del marcaje, aproximadamente el 70% de las células positivas para BrdU en el BO expresaban DCX (figura 7). Similar al hipocampo, el número de células positivas para BrdU que expresaban DCX en el BO disminuyó a niveles muy bajos un mes después del marcaje y permaneció indetectable a lo largo de los tiempos posteriores. La colocalización de BrdU con NeuN se detectó primero a los 14 días después de la inyección de BrdU. A este tiempo, el 24% de las células marcadas con BrdU expresaban NeuN (figura 7). El porcentaje de células marcadas con BrdU que expresaban NeuN aumentó hasta casi el 90% en un mes y permaneció a este nivel en los tiempos posteriores analizados.
f) Doblecortina es un marcador útil para células determinadas neuronales y la detección de la neurogénesis, independiente de los métodos de pre-marcaje
En los primeros 10 días después del marcaje de BrdU, el porcentaje de células positivas para DCX entre las célula nuevas aumentó hasta alrededor del 90%. Sin embargo, una vez que las células se hacen más viejas y empiezan a expresar marcadores de neuronas maduras DCX disminuye hasta niveles indetectables. Aunque no es posible predecir el destino de células positivas para DCX individuales a partir de análisis histológicos, es muy curioso que el porcentaje de comarcaje BrdU/DCX es casi idéntico al porcentaje de células nuevas que posteriormente se diferencian a neuronas (>90% de comarcaje BrdU/NeuN, véanse las figuras 2 y 7). Esto muestra que DCX se expresa de forma transitoria en células neuronalmente comprometidas y por lo tanto puede servir como un indicador para neurogénesis
adulta.
La inmunorreactividad de DCX no se encuentra exclusivamente en neuronas inmaduras, sino que se ha descrito que está ocasionalmente presente en neuronas con morfología diferenciada en regiones no neurogénicas, incluyendo la corteza, cuerpo estriado y cuerpo calloso (Nacher (2001) loc. cit.). Sin embargo, en el estudio actual sólo se observaron niveles muy bajos de expresión de DCX fuera de las regiones neurogénicas. Una razón para esta discrepancia podría ser uso de diferentes antisueros contra DCX entre estudios. Como se muestra mediante el análisis comparativo de inmunotransferencia, los anticuerpos reconocen antígenos adicionales en un grado diferente y por lo tanto pueden no reflejar DCX sola (Figura 1). Otra explicación para la expresión ocasional de DCX fuera de las regiones neurogénicas podría ser que la neurogénesis tal vez pueda existir en estas regiones.
Esta hipótesis está apoyada por evidencias recientes de que la inducción de la neurogénesis en la corteza y el cuerpo estriado en condiciones patológicas se asocia con la migración de progenitores neuronales positivos para DCX de la pared del ventrículo lateral (Magavi, Naute 405 (2000), 951-955; Arvidsson, Nat. Med. 8 (2002), 963-970). Además, otros estudios han sugerido que la neurogénesis adulta es una característica común de varias regiones cerebrales, incluyendo la corteza y amígdala (Gould, PNAS 96 (1999), 5263-5267; Pencea, Exp. Neurol. 172 (2001), 1-16; Bernier PNAS 99 (2002), 11464-11469) aunque a niveles muy bajos.
Puesto que DCX es una proteína, que une, ata y estabiliza microtúbulos, podría desempeñar un papel en varios escenarios neuronales dependientes del citoesqueleto incluyendo migración de células precursoras neuronales, translocación nuclear y maduración axonal y dendrítica. Aquí, se encontró y documentó de forma sorprendente que, debido a la evolución temporal de la expresión de DCX durante la maduración neuronal en el cerebro adulto, DCX está presente no sólo en progenitores neuronales en proliferación y migración sino también en diferenciación, por ejemplo, durante la elongación y arborización dendrítica (figuras 2, 4 y 6). Se ha mostrado que LIS1, una proteína funcionalmente similar a DCX y asociada con la migración neuronal, regula la proliferación de neuroblastos, la translocación y posicionamiento nuclear así como la elaboración dendrítica y el transporte axonal en drosophila (Swan, Nat. Cell Biol 1 (1999), 444-449; Lei, Dev. Biol. 226 (2000), 57-72; Liu, Nat Cell Biol. 2 (2000), 776-783 así como Leveter Trends Neurosci 24 (2001), 489-492) lo que indica que las proteínas asociadas a microtúbulos desempeñan papeles importantes en la mayoría de las funciones celulares que implican reordenamiento del cito-
esqueleto.
Además de caracterizar el papel de DCX en el cerebro adulto, los resultados documentados aquí mejoran los ensayos y análisis de neurogénesis a nivel metodológico. Las técnicas tradicionales para estudiar la neurogénesis han utilizado el marcaje con timidina tritiada, BrdU o retrovirus, junto con varios marcadores neuronales para abordar la naturaleza y destino de la población de células troncales neurales. Las limitaciones de estos protocolos, en particular la necesidad de realizar premarcaje in vivo, han hecho la identificación de un marcador específico y temprano para el linaje neuronal de gran importancia. En este estudio, se muestra que DCX se detecta en neuroblastos en el primer mes después de su surgimiento. El patrón y especificidad de expresión temporal de DCX en las regiones neurogénicas adultas sugiere que DCX es un marcador útil para la detección de neurogénesis independiente de métodos de premarcaje, como incorporación de BrdU. Tal marcador de neurogénesis proporciona una herramienta valiosa especialmente en circunstancias que impiden el uso de BrdU, por ejemplo en análisis post mortem de tejido cerebral
humano.
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Ejemplo II
Clonación de la secuencia reguladora humana de DCX Amplificación por PCR del fragmento genómico que comprende la secuencia reguladora humana de DCX
Usando la secuencia parcial del cromosoma X humano disponible con número de acceso de GenBank AL450490, se diseñaron dos oligonucleótidos (oligo no: 1: AAC ACC TAT TAA TGC CCA; SEQ ID NO: 9 y oligo no: 2:TCA GAG ACC TGA GCG TGG GAG AA; SEQ ID NO: 10) para la amplificación por PCR de un fragmento de aproximadamente 3,5 pares de kilobases. Se eligió la secuencia del fragmento amplificado para que comprendiera aproximadamente 1,5 pares de kilobases de secuencia genómica en 5' del putativo exón 1 de DCX, la secuencia genómica que corresponde a los tres primeros intrones de DCX y unos pocos pares de bases en 5' de la posición de inicio de la secuencia codificante de la proteína DCX localizada en el putativo exón 4.
La amplificación por PCR en el ADN genómico humano se realizó usando el kit Expand High Fideliey PCR System (Roche) según el protocolo del fabricante. Se usó el siguiente protocolo de PCR:
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Preparación del producto de PCR que comprende la secuencia reguladora humana de DCX para subclonación
Se un obtuvo un único producto de PCR de aproximadamente 3,5 pares de kilobases visualizado en una electroforesis en gel de agarosa al 1%. El ADN presente en la banda de 3,5 pares de kilobases se recuperó usando el kit MiniElute Gel Extraction (Qiagen). El fragmento purificado se hizo de extremo romos con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I sin la adición de dNTP libres. El fragmento de extremos romos se fosforiló después usando la polinucleótido quinasa de T4 en presencia de ATP. Este fragmento procesado de ADN corresponde a la secuencia ID no: 1 y se usó adicionalmente para subclonación.
Preparación del vector de clonación que contiene el gen indicador EGFP
Se delecionó el promotor de CMV del plásmido pEGFP-N1 (Clontech) usando las enzimas de restricción AseI y NheI. Se aisló un fragmento de ADN de aproximadamente 4,1 pares de kilobases correspondiente al vector pEFGP-N1 linearizado sin el promotor de CMV de un gel de agarosa al 1% después de electroforesis usando el kit MiniElute Gel Extraction (Qiagen). El fragmento de ADN aislado se hizo de extremo romos usando el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I en presencia de dNTP libres 33 microM. El fragmento resultante de ADN se recircularizó usando la ADN ligasa de T4 produciendo un vector pEGFP-N1 sin promotor de aproximadamente 4,1 pares de
kilobases.
Subclonación del fragmento de PCR que comprende la secuencia reguladora humana de DCX en el vector pEGFP-N1 sin promotor
Para la inserción de la secuencia reguladora humana de DCX, el vector pEGFP-N1 sin promotor se linearizó usando la enzima de restricción SmaI. El fragmento de ADN se desfosforiló usando fosfatasa alcalina de intestino de ternera. El fragmento linearizado se aisló en un gel de agarosa al 1% seguido por extracción usando el kit MiniElute Gel Extraction (Qiagen). El vector lineal resultante y el fragmento de ADN correspondiente a la secuencia reguladora humana de DCX se ligaron en un plásmido circular usando la ADN ligasa de T4 según el protocolo del fabricante (New England Biolabs). En esta construcción de aproximadamente 7,7 pares de kilobases, phuDCXpromoEGFP1 secuencia ID no: 7, la secuencia reguladora humana de DCX controla la expresión del gen EGFP (figura
8A).
Subclonación del fragmento de PCR que comprende la secuencia reguladora humana de DCX en el vector pDsRed2-1
Se digirió el vector pDsRed2-1 (Clontech) con las enzimas de restricción SalI y BamHI. Se purificó un fragmento de ADN de aproximadamente 4,1 pares de kilobases en un gel de agarosa al 1% seguido por extracción usando el kit MiniElute Gel Extraction (Qiagen). El fragmento de ADN se desfosforiló usando fosfatasa alcalina de intestino de ternera. Se digirió el vector phuDCXpromoEGFP1 con las enzimas de restricción SalI y BamHI. Se purificó un fragmento de ADN de aproximadamente 3,5 pares de kilobases, que codifica la secuencia reguladora humana de DCX, mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1% seguido por extracción usando el kit MiniElute Gel Extraction (Qiagen). El fragmento purificado se ligó al vector pDsRed2-1 preparado usando la ADN polimerasa de T4 según el protocolo del fabricante (New England Biolabs). En el vector resultante, phuDCXpromoDsRed2 secuencia ID no: 8, de aproximadamente 7,6 pares de kilobases, la secuencia reguladora humana de DCX controla la expresión del gen indicador DsRed2. El protocolo de clonación se esquematiza en la figura 12.
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Ejemplo III
Expresión del vector phuDCXpromoEGFP1 en cultivos celulares Cultivos celulares de prosencéfalo embrionario de ratón
Se sacrificaron ratones hembra preñadas C57BL/6Ncrl (Charles River Laboratories) por dislocación cervical. Se retiraron los úteros y se sumergieron en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DBPS) helada. Se liberaron los embriones del día embrionario 12,5 a 14,5 de los úteros, se disecó el prosencéfalo y se separó de los tejidos circundantes. El prosencéfalo disecado se lavó una vez en DPBS helado, se transfirió a una placa petri y se disoció mecánicamente con la hoja de un bisturí. La preparación resultante se lavó en DPBS. Después de 5 minutos de centrifugación a 120xg, el precipitado se resuspendió en solución PPD que contenía papaína al 0,01% (Worthington Biochemicals, Inglaterra), dispasa II al 0,1% (Boehringer, Alemania), DNasa I al 0,01% (Worthington Biochemicals, Inglaterra) y MgSO_{4} 12,4 mM en HBSS sin Mg^{++}/Ca^{++} (PAA, Alemania) y se incubó durante 30 a 40 minutos a 37ºC. La preparación celular se trituró cada 10 minutos a través de una pipeta. Las células disociadas se recogieron mediante centrifugación de 5 minutos a 120xg. El precipitado se resuspendió en medio neurobasal (Gibco BRL, Alemania) y se lavó tres veces. Por último, la preparación celular se resuspendió en medio neurobasal suplementado con B27 (Gibco BRL, Alemania), L-glutamina 2 mM (PAN, Alemania), penicilina 100 U/mL, estreptomicina 0,1 mg/mL (PAN, Alemania), heparina 2 \mug/mL (Sigma, Alemania), bFGF-2 20 ng/mL (R&D Systems, Alemania) y EGF 20 ng/mL (R&D Systems, Alemania) y se mantuvo a 37ºC en una atmósfera humidificada que contenía CO_{2} al 5%. Los cultivos que crecen en suspensión formaron agregados celulares a los que se denomina neuroesferas. Para disociar estas neuroesferas para pasar, los cultivos se centrifugaron durante 5 minutos a 120xg y el precipitado se resuspendió en Accutase (Innovative Cell Technologies, Inc.). La suspensión se incubó a 37ºC durante 10 minutos. Los agregados disociados se recuperaron mediante centrifugación durante 5 minutos a 120x y las células se volvieron a sembrar en el medio de crecimiento descrito anteriormente.
Cultivos de células corticales fetales humanas
Estos cultivos se originan de un cerebro humano de 8 semanas tras la concepción. La descripción de las condiciones de cultivo se ha descrito previamente en Svendsen, Journal of Neuroscience Methods 85 (1998), 141-152.
Preparación de cultivos celulares de prosencéfalo para transfección
Después de la disociación de los agregados celulares con Accutase (Innovative Cell Technologies, Inc.) a 37ºC durante 10 minutos, las células se sembraron en cubreobjetos recubiertos con poliornitina y laminina a una densidad de 7,5 x 10^{4} células por cm^{2}, en medio neurobasal suplementado con B27 (Gibco BRL, Alemania), L-glutamina 2 mM (PAN, Alemania), penicilina 100 U/mL, estreptomicina 0,1 mg/mL (PAN, Alemania), NT3 10 ng/mL y suero fetal de ternera al 1% y se mantuvieron durante 1 semana a 37ºC en una atmósfera humidificada de CO_{2} al 5%.
Cultivos de células COS7
Las células COS7 se obtuvieron de la ATCC, EE.UU. (número CRL-1651) y se mantuvieron en cultivo en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), que contenía suero fetal de ternera al 10%, glucosa 4,5 g/L, penicilina 100 U/mL, estreptomicina 0,1 mg/mL y glutamina 4 mM a 37ºC en una atmósfera humidificada de CO_{2} al 5%. Las células se sembraron en cubreobjetos recubiertos con poliornitina y laminina a una densidad de 7,5 x 10^{4} células por cm^{2}, 1 día antes de la transfección. Como se muestra en la figura 13, sólo se puede detectar una expresión ligera, no específica de alguna fluorescencia verde en células COS7 transfectadas con el vector phuDCXpromoEGFP1.
Transfección de cultivos celulares con el vector phuDCXpromoEGFP1
La transfección se realizó usando 3 \mug del vector phuDCXpromoEGFP1 en presencia de 5 \mul del reactivo lípido catiónico Metafectene (Biontex Laboratories, Alemania) en un volumen final de 1 mL según el protocolo del fabricante. Dos días después del final de la transfección, se examinó la expresión del gen indicador EGFP en los cultivos usando un microscopio de fluorescencia invertido Olympus IX70. La contratinción nuclear se realizó con diclorhidrato de 4'6'-diamidino-2-fenilindol hidrato a 0,25 \mug/\muL (DAPI, Sigma, Alemania).
Como se documenta en la figura 13, las secuencias reguladoras humanas de DCX se activan para dirigir la expresión del gen indicador EGFP específicamente en células restringidas/determinadas neuronales.
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Ejemplo IV
Análisis de líneas de ratones transgénicos que expresan el gen indicador EGFP bajo el control de la secuencia reguladora humana de DCX Generación de líneas de ratones transgénicos que expresan el gen indicador EGFP bajo el control de la secuencia reguladora humana de DCX
Para la generación de líneas de ratones transgénicos, se digirieron 100 microgramos de vector phuDCXpromoEGFP1 usando las enzimas de restricción AflII y XhoI. Se obtuvo un fragmento de ADN de aproximadamente 4,5 pares de kilobases, Secuencia ID no: 5, que lleva la secuencia reguladora humana de DCX, el gen EGFP y una señal de poliadenilación de SV40, mediante electroforesis en gel de agarosa seguido por extracción usando el kit Geneclean (Bio 101, Carlsbad, CA, EE.UU.). Se inyectó una solución de Tris 10 mM; EDTA 0,1 mM que contenía el fragmento de ADN purificado a 1 ng/microL en el pronúcleo de embriones de ratón B6C3F1 (Harlan) en la fase de una célula. Los embriones supervivientes se transfirieron el mismo día al oviducto de ratones receptores CD-1 pseudopreñadas de 0,5 días poscoito. El protocolo para la generación de líneas de ratones transgénicos se esquematiza en la figura 14.
Los ratones que llevan el transgén huDCXpromoEGFP1 se aparearon con ratones C57BL/6Ncrl (Charles River Laboratories) para expandir la colonia.
Identificación de los ratones transgénicos huDCXpromoEGFP1
Se cortó un trozo de aproximadamente 5 mm de la cola de los ratones para obtener ADN genómico. El ADN se purificó del trozo de la cola usando el kit DNeasy Tissue (Qiagen). Se realizó amplificación por PCR en ADN genómico de ratón para detectar la presencia del gen indicador EGFP. La PCR se realizó usando la polimerasa Amplitaq (Roche) y los siguientes oligonucleótidos: oligo no.3: AAG TTC ATC TGC ACC ACC GGC (SEQ ID NO. 11) y oligo no.4: CTT TAC TTG TAC AGC TCG TCC (SEQ ID NO.: 12).
Se usó el siguiente protocolo de PCR:
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El producto de amplificación de PCR se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa. Los ratones transgénicos se pudieron identificar por la presencia de un producto de PCR de aproximadamente 600 pares de bases.
Análisis de la expresión del transgén huDCXpromoEGFP1
Ratones transgénicos de la línea 299 y la línea 303 de un mes de edad se anestesiaron profundamente y perfundieron transcardiacamente con paraformaldehído al 4% en tampón fosfato 100 mM, pH 7,4. Los cerebros se disecaron, se sumergieron durante la noche en fijador y se transfirieron a sacarosa al 30%/tampón fosfato 100 mM, pH 7,4 durante al menos 48 horas. Los cerebros se cortaron en secciones sagitales de 40 \mum usando un microtomo de deslizamiento. Las secciones se almacenaron a -20ºC en solución crioprotectora hasta la tinción (glicerol al 25% v/v, etilenglicol al 25% v/v y tampón fosfato 0,05 M, pH 7,4).
Para la observación directa del patrón de expresión del transgén, se contratiñeron las secciones con diclorhidrato de 4'6'-diamidino-2-fenilindol hidrato a 0,25 \mug/\muL (DAPI, Sigma, Alemania) en solución salina tamponada en Tris (TBS: Tris-HCl 0,1 M, pH 7,4/NaCl al 0,9%) durante 10 minutos. La tinción con DAPI marca cada núcleo de la sección. Las secciones se lavaron dos veces durante 10 minutos en TBS y se montaron en portaobjetos de vidrio recubiertos con gelatina. Los portaobjetos se cubrieron usando Prolong (Molecular Probes, Eugene, EE.UU.). La documentación se realizó usando un microscopio Leica DMR (Leica Mikroskopie und Systeme GmbH, Alemania) equipado con una cámara digital Spot (Diagnostic Instrument Inc., EE.UU.).
Para el análisis inmunohistológico, las secciones se bloquearon en solución salina tamponada en Tris (TBS: Tris-HCl 0,1 M, pH 7,4/NaCl al 0,9%) que contenía suero de burro al 3% y Triton X-100 al 0,1% (TBS-DS-TX) durante 30 minutos, seguido por incubación con los anticuerpos primarios en TBS-DS-TX durante 48 horas a 4ºC. Se usaron las siguientes diluciones de anticuerpos primarios: anti-DCX C-18 de cabra (1:500, Santa Cruz Labs, Santa Cruz, EE.UU.) y anti-GFAP de conejo (1:1000, Dako, Dinamarca). Las secciones se lavaron después en TBS tres veces durante 10 minutos y después se incubaron con los anticuerpos secundarios en TBS-DS-TX durante 2 horas. Se usaron los siguientes anticuerpos secundarios conjugados a fluorocromos: anticuerpos anti-cabra de burro Alexa fluor 568 y anti-conejo de cabra Alexa fluor 568 (4 microgramos/mL, Molecular Probes, Eugene, EE.UU.). La contratinción nuclear se realizó con TO-PRO-3 0,5 microM (Molecular Probes, Eugene, EE.UU.) durante 10 minutos. Después de varios lavados en TBS, las secciones se montaron en portaobjetos de vidrio recubiertos con gelatina y se cubrieron usando Prolong (Molecular Probes, Eugene, EE.UU.).
El análisis se realizó usando un microscopio confocal (TCS-NT, Leica Microsystems, Bensheim, Alemania) equipado con un objetivo de inmersión de aceite 40xPL APO (1,25 NA) y un ajuste de apertura que corresponde a un espesor del plano focal de menos de 2 \mum.
De los embriones de ratón que se microinyectaron con el fragmento de ADN que codifica el gen indicador EGFP bajo el control de la secuencia reguladora humana de DCX, 101 ratones sobrevivieron y se desarrollaron en ratones maduros. El cribado por PCR del ADN genómico aislado de la cola del ratón reveló que 8 animales eran transgénicos, 5 machos y 3 hembras. Se analizó el patrón de expresión del gen indicador EGFP en el SNC observando secciones de cerebro de ratones transgénicos huDCXpromoEGFP1 de un mes de edad de la línea 299 y de la línea 303 con un microscopio de fluorescencia. Se observó alta expresión del indicador EGFP en el giro dentado de la formación del hipocampo, en la zona subventricular, en la corriente migratoria rostral y en el bulbo olfatorio (figura 15). Se sabe que estas regiones contienen células precursoras restringidas neuronales y células que expresan doblecortina. Por lo tanto, la expresión del gen indicador EGFP se da en las regiones relevantes esperadas del uso de la secuencia reguladora humana de DCX.
La inmunohistología se realizó en secciones de cerebro de ratones transgénicos huDCXpromoEGFP1 de la línea 303 para definir qué tipo de célula expresaba el gen indicador DCX. La figura 16 muestra una colocalización de la expresión endógena de doblecortina en el bulbo olfatorio con la expresión del gen indicador EGFP. También se observó una ausencia de colocalización en astrocitos, aquí detectados con un anticuerpo anti-GFAP, y la expresión del gen indicador EGFP. Por lo tanto, el gen indicador EGFP se expresa en células precursoras restringidas neuronales que expresan doblecortina endógena y no se expresa en otros tipos celulares, como astrocitos.
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Ejemplo V
Enriquecimiento de células que expresan un gen fluorescente (EGFP o DsRed2) derivadas de un animal como se describe en el ejemplo IV mediante separación por FACS
El tejido cerebral de ratones transgénicos en diferentes fases del desarrollo, que comprenden fases embrionaria, posnatal y adulta, se retira y se transfiere a DPBS (PAN, Alemania) a 4ºC con o sin glucosa 4,5 g/L (solución DPBS-glu). Se eliminan las meninges superpuestas y los vasos sanguíneos tanto como es posible y el tejido cerebral se corta en trozos pequeños con un bisturí. De forma alternativa, se disecan regiones específicas del cerebro, tales como hipocampo, bulbo olfatorio, pared del ventrículo lateral, cuerpo estriado, cerebelo o corteza. El tejido se lava en DPBS o DPBS-glu para eliminar el exceso de sangre y se resuspende en solución PPD compuesta de papaína al 0,01% (Worthington Biochemicals, Inglaterra), dispasa II al 0,1% (Roche, Alemania), DNasa I al 0,01% (Worthington Biochemicals, Inglaterra) y MgSO_{4} 12,4 mM en solución de sales equilibrada de Hank (HBSS, PAN, Alemania) sin Ca^{++}/Mg^{++} y se digirió durante 30 a 40 minutos a 37ºC con trituración suave cada 5 a 10 minutos. La suspensión celular se centrifuga después a 200xg durante 5 minutos, se lava dos veces con HBSS sin Ca^{++}/Mg^{++} y se resuspende en 1 ml de HBSS sin Ca^{++}/Mg^{++}. La suspensión celular se pasa a través de un colador de células de 30 \mum (Becton-Dickinson, Alemania).
La suspensión celular se separa después usando un citómetro de flujo FACS Vantage equipado con un separador celular (Becton-Dickinson, Alemania) usando el software CELLQuest. La población de células se analiza usando la dispersión de luz frontal y de ángulo derecho (lateral), la fluorescencia de EGFP mediante un filtro de paso de banda de 530 \pm 15 nm y la fluorescencia de DsRed mediante un filtro de paso de banda de 575 \pm 13 nm, según pasan el haz de un láser iónico de argón (488 nm 100 mW). Además, las células muertas se pudieron excluir usando sustancias que marcan las células con membranas dañadas, por ejemplo usando una solución de yoduro de propidio a 10 \mug/ml. Se pueden usar las células derivadas de un ratón de tipo salvaje para definir el nivel de fluorescencia de fondo. Un error de separación por debajo del 5%, que procede de separación falsa o de la presencia de doblete/multiplex de células compuestos de células positivas y negativas, es esperado y aceptable. La figura 28 ilustra poblaciones de células separadas obtenidas de cerebros disociados de ratones transgénicos neonatos huDCXpromoDsRed2. La separación por FACS de estos cerebros disociados para la presencia de fluorescencia de DsRed2 produjo una población de células en la que más del 99% de las células expresaba el gen indicador DsRed2 visualizado directamente después de la separación con un microscopio de fluorescencia invertido Olympus IX70. De forma similar, la separación para la ausencia d fluorescencia en las células de los cerebros disociados produjo una población de células en la que menos del 1% de las células expresaban el gen indicador DsRed2 visualizado directamente después de la separación con un microscopio de fluorescencia invertido Olympus IX70.
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Ejemplo VI
Las células que expresan un gen fluorescente (EGFP o DsRed2) derivadas de un animal como se describe en el ejemplo IV enriquecidas por FACS producen células positivas para doblecortina
Se cultivan las células separadas viables del ejemplo V (anterior) en medio neurobasal (Gibco BRL, Alemania) suplementado con B27 (Gibco BRL, Alemania), suero fetal de ternera al 5% (PAN, Alemania), L-glutamina 2 mM (PAN, Alemania), penicilina 100 U/ml, estreptomicina 0,1 mg/ml (PAN, Alemania) en placas de 12 pocillos a diferentes densidades, por ejemplo, 1x10^{5} células por pocillo y ml de medio, en cubreobjetos de vidrio pre-recubiertos secuencialmente con una solución de poliornitina 250 \mug/ml seguido por una solución de laminina 5 \mug/ml. Después de diferentes periodos en cultivo, por ejemplo de 1 día a 7 días, las células se fijan usando una solución de paraformaldehído al 4% tamponada con fosfato pH 7,4 (paraformaldehído al 4% peso/volumen, NaH_{2}PO_{4} 100 mM, CaCl_{2} 0,4 mM, sacarosa 50 mM) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se lavan dos veces con DPBS (PAN, Alemania) durante 10 minutos a temperatura ambiente y se bloquean usando una solución que contiene gelatina de piel de pescado (Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, NaCl 0,15 M, seroalbúmina bovina al 1%, gelatina de teleósteo al 0,2% (Sigma, Alemania), Triton X-100 al 0,1% (Sigma, Alemania)) durante una hora a temperatura ambiente. La solución que contiene gelatina de piel de pescado también se usa para las diluciones de anticuerpo y los pasos de lavado. Las muestras se incuban durante la noche a 4ºC con los anticuerpos primarios a las siguientes diluciones: anti-DCX C-18 de cabra de 1:100 a 1:1000 (Santa Cruz Labs, EE.UU.), anti-galactocerebrósidos de ratón 1:500 (Chemicon, EE.UU.), anti-GFAP de conejo 1:1000 (Dako, Dinamarca), anti-Ki67 de conejo 1:500 (Novocastra, RU); anti-nestina de conejo 1:200 (Chemicon, EE.UU.), anti-nestina 1:200 de ratón (Pharmingen International, EE.UU.), anti-\betaIII-tubulina de ratón 1:500 (clon 5G8, Promega, EE.UU.), anti-\betaIII-tubulina de ratón 1:500 (clon TUJ1, Babco, EE.UU.). Los anticuerpos secundarios conjugados a fluorocromos se diluyeron 1:500 (anti-ratón o conejo o cabra de burro, Dianova, Alemania). La contratinción nuclear se realizó con diclorhidrato de 4'6'-diamidino-2-fenilindol hidrato a 0,25 \mug/\mul (DAPI, Sigma, Alemania). Después del último lavado, las muestras se enjuagaron brevemente con PBS y se montaron en portaobjetos usando Prolong (Molecular Probes, Países Bajos). En caso donde los antígenos son sensibles a detergentes, por ejemplo galactocerebrósidos, se omite el Triton X-100 de la solución que contiene gelatina de piel de pescado.
Se pueden usar células disociadas de ratones transgénicos neonatos que expresan el gen indicador EGFP bajo el control del promotor de la nestina neural (Kawaguchi, Mol Cell Neurosci 17 (2001), 259-273) como control de separación por FACS de una manera similar a cómo se describe en el ejemplo V. Las células que expresan nestina (en este modelo transgénico = expresan EGFP) constituyen la población de células troncales neurales. Tras la diferenciación, estas células tienen el potencial de generar tres tipos principales de células encontradas en el sistema nervioso central, es decir, neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. La población de células separadas para la presencia de la proteína indicadora EGFP debe tener el potencial en el experimento descrito anteriormente de hacerse neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. La población celular separada para la ausencia de proteína indicadora EGFP también tiene este potencial, ya que puede estar constituida de células precursoras para neuronas y glía que ya están más diferenciadas que la población de células troncales y por lo tanto ya no expresan nestina (EGFP). Por lo tanto, las poblaciones (positiva y negativa) de células separadas para la expresión de EGFP bajo el control del promotor de la nestina neural deben generar poblaciones mixtas de neuronas y glía tras la diferenciación.
La figura 29 ilustra una inmunotinción para doblecortina realizada en cultivos celulares que se originan de cerebros disociados de ratones transgénicos neonatos huDCXpromoDsRed2 y de ratones transgénicos neonatos nestina-EGFP que se separaron por FACS para la presencia/ausencia de proteína indicadora fluorescente. Los cultivos se fijaron después de un día de cultivo en medio neurobasal (Gibco BRL, Alemania) suplementado con B27 (Gibco BRL, Alemania), suero fetal de ternera al 5% (PAN, Alemania), L-glutamina 2 mM (PAN, Alemania), penicilina 100 U/ml, estreptomicina 0,1 mg/ml (PAN, Alemania) en placas de 12 pocillos en cubreobjetos de vidrio pre-recubiertos secuencialmente con una solución de poliornitina 250 \mug/ml seguido por una solución de laminina 5 \mug/ml, como se ha descrito anteriormente. La figura 29 documenta que la separación por FACS de una suspensión de células individuales de cerebros disociados de ratones transgénicos neonatos huDCXpromoDsRed2 para células que expresan el gen indicador DsRed2 produjo un enriquecimiento de la población de células que expresan doblecortina. La separación por FACS de las células que no expresan el gen indicador DsRed2 produjo un cultivo con muy pocas células que expresaban doblecortina después de 1 día en cultivo. La figura 29 también documenta que la separación por FACS de una suspensión de células individuales de cerebros disociados de ratones transgénicos neonatos nestina-EGFP para células que expresan el gen indicador EGFP no produjo enriquecimiento de la población de células que expresan doblecortina comparado con las células separadas para la ausencia de expresión de EGFP.
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Ejemplo VII
Las células que expresan un gen marcador fluorescente (EGFP o DsRed2) derivadas de un animal como se define en el ejemplo IV enriquecidas por FACS producen cultivos enriquecidos en precursores neuronales
Se cultivan las células separadas viables del ejemplo V (anterior) en medio neurobasal (Gibco BRL, Alemania) suplementado con B27 (Gibco BRL, Alemania), suero fetal de ternera al 5% (PAN, Alemania), L-glutamina 2 mM (PAN, Alemania), penicilina 100 U/ml, estreptomicina 0,1 mg/ml (PAN, Alemania) en placas de 12 pocillos a diferentes densidades, por ejemplo, 1x10^{5} células por pocillo y ml de medio, en cubreobjetos de vidrio pre-recubiertos secuencialmente con una solución de poliornitina 250 \mug/ml seguido por una solución de laminina 5 \mug/ml. Después de diferentes periodos en cultivo, por ejemplo de 1 día a 7 días, las células se fijan usando una solución de paraformaldehído al 4% tamponada con fosfato pH 7,4 (paraformaldehído al 4% peso/volumen, NaH_{2}PO_{4} 100 mM, CaCl_{2} 0,4 mM, sacarosa 50 mM) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se lavan dos veces con DPBS (PAN, Alemania) durante 10 minutos a temperatura ambiente y se bloquean usando una solución que contiene gelatina de piel de pescado (Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, NaCl 0,15 M, seroalbúmina bovina al 1%, gelatina de teleósteo al 0,2% (Sigma, Alemania), Triton X-100 al 0,1% (Sigma, Alemania)) durante una hora a temperatura ambiente. Se usa la misma solución que contiene gelatina de piel de pescado para las diluciones de anticuerpo y los pasos de lavado. Las muestras se incuban durante la noche a 4ºC con los anticuerpos primarios a las siguientes diluciones: anti-DCX C-18 de cabra de 1:100 a 1:1000 (Santa Cruz Labs, EE.UU.); anti-galactocerebrósidos de ratón 1:500 (Chemicon, EE.UU.); anti-GFAP de conejo 1:1000 (Dako, Dinamarca); anti-Ki67 de conejo 1:500 (Novocastra, RU); anti-nestina de conejo 1:200 (Chemicon, EE.UU.); anti-nestina 1:200 de ratón (Pharmingen International, EE.UU.); anti-\betaIII-tubulina de ratón 1:500 (clon 5G8, Promega, EE.UU.); anti-\betaIII-tubulina de ratón 1:500 (clon TUJ1, Babco, EE.UU.). Los anticuerpos secundarios conjugados a fluorocromos se diluyeron 1:500 (anti-ratón o conejo o cabra de burro, Dianova, Alemania). La contratinción nuclear se realiza con diclorhidrato de 4'6'-diamisino-2-fenilindol hidrato a 0,25 \mug/\mul (DAPI, Sigma, Alemania). Después del último lavado, las muestras se enjuagan brevemente con PBS y se montaron en portaobjetos usando Prolong (Molecular Probes, Países Bajos). En los casos donde los antígenos son sensibles a detergentes, por ejemplo galactocerebrósidos, se omite Triton X-100 de la solución que contiene gelatina de piel de pescado.
Se pueden usar las células disociadas de ratones transgénicos neonatos que expresan el gen indicador EGFP bajo el control del promotor de la nestina neural (Kawaguchi, Mol Cell Neurosci 17 (2001), 259-273) como control de separación por FACS de una manera similar a cómo se describe en el ejemplo V. Las células que expresan nestina (en este modelo transgénico = expresan EGFP) constituyen la población de células troncales neurales. Tras la diferenciación, estas células tienen el potencial de generar tres tipos principales de células encontradas en el sistema nervioso central, es decir, neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. La población de células separadas para la presencia de la proteína indicadora EGFP debe tener el potencial en el experimento descrito anteriormente de convertirse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. La población celular separada para la ausencia de proteína indicadora EGFP también tiene este potencial, ya que puede estar constituida de células precursoras para neuronas y glía que ya están más diferenciadas que la población de células troncales y por lo tanto ya no expresan nestina (EGFP). Por lo tanto, las dos poblaciones (positiva y negativa) de células separadas para la expresión de EGFP bajo el control del promotor de la nestina neural deben generar poblaciones mixtas de neuronas y glía tras la diferenciación.
Inmunodetección de \betaIII-tubulina realizada en cultivos celulares que se originan de cerebros disociados de ratones transgénicos neonatos huDCXpromoDsRed2 y de ratones transgénicos neonatos nestina-EGFP que se separan por FACS para la presencia/ausencia de proteína indicadora fluorescente. Los cultivos se fijan después de un día de cultivo en medio neurobasal (Gibco BRL, Alemania) suplementado con B27 (Gibco BRL, Alemania), suero fetal de ternera al 5% (PAN, Alemania), L-glutamina 2 mM (PAN, Alemania), penicilina 100 U/ml, estreptomicina 0,1 mg/ml (PAN, Alemania) en placas de 12 pocillos en cubreobjetos de vidrio pre-recubiertos secuencialmente con una solución de poliornitina 250 \mug/ml seguido por una solución de laminina 5 \mug/ml, como se ha descrito anteriormente. La separación por FACS de una suspensión de células individuales de cerebros disociados de ratones transgénicos neonatos huDCXpromoDsRed2 para células que expresan el gen indicador DsRed2 produce un enriquecimiento de la población de células que expresan \betaIII-tubulina. Puesto que \betaIII-tubulina se expresa en precursores neuronales, la separación por FACS de células que expresan el vector huDCXpromoDsRed2 es un medio eficaz de generar a partir de una población mixta de células un cultivo enriquecido en precursores neuronales. La separación por FACS de las células que no expresan el gen indicador DsRed2 produce un cultivo que contiene muy pocas células que expresan \betaIII-tubulina después de 1 día en cultivo. La separación por FACS de una suspensión de células individuales de cerebros disociados de ratones transgénicos neonatos nestina-EGFP para células que expresan el gen indicador EGFP no produce enriquecimiento de la población de células que expresan \betaIII-tubulina comparado con el cultivo de células separadas para la ausencia de expresión de EGFP.
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Ejemplo VIII
Enriquecimiento de células positivas para EGFP mediante transfección y separación por FACS Preparación de cultivos celulares Cultivos de prosencéfalo embrionario de rata, ratón y pollo
Los cultivos de prosencéfalo embrionario de ratón, rata o pollo se preparan como sigue: se sacrifican ratas preñadas tales como Sprague-Dawley, Wistar, Fisher 344, o ratones preñados, tales como C57/bl6 en el día de gestación 10,5 por sobredosis de pentobarbital, se retiran sus fetos, se decapitan y se disecan sus cerebros. Se tiene especial cuidado de no contaminar con tejido meníngeo y osteoide del cráneo. Para los cultivos de cerebro de pollo, se diseca el prosencéfalo de embriones recién decapitados después de 6, 8, 10 ó 12 días de gestación. En cada caso el tejido se recoge a 4ºC en DPBS (PAN, Alemania) con glucosa 4,5 g/L (Merck, Alemania) (DPBS/glu). El tejido se trata enzimáticamente en solución PPD que contiene papaína al 0,01% (Worthington Biochemicals, Inglaterra), dispasa II al 0,1% (Boehringer, Alemania), DNasa I al 0,01% (Worthington Biochemicals, Inglaterra) y MgSO_{4} 12,4 mM en HBSS (PAN, Alemania) sin Mg^{++}/Ca^{++} (PAA, Alemania) y se digiere durante 20 minutos a 37ºC con trituración suave cada 5 minutos. La suspensión celular se centrifuga después a 200xg durante 5 minutos, se lava dos veces con HBSS -Ca/-Mg y se resuspende en 2 ml de HBSS -Ca/-Mg. Las células se disocian triturando secuencialmente 20/10/5, a través de pipetas pasteur de vidrio cada vez más estrechas, y se resuspende en medio NB (Gibco BRL, Alemania) suplementado con B27 (Gibco BRL, Alemania) (NB/B27), SFT al 5% (PAN, Alemania), L-glutamina 2 mM (PAN, Alemania), penicilina 100 \mug/ml/estreptomicina 0,1 mg/mL (PAN, Alemania). Las células se siembran en placas de 12 pocillos recubiertos de poliornitina (250 \mug/ml) y laminina (5 \mug/ml) a diferentes densidades celulares (de 10E5 a 10E7 células/pocillo y ml) y se hacen crecer durante dos a siete días.
Cultivos adultos
Se retiran los cerebros de ratones tales como C57/bl6 o ratas, tales como Sprague-Dawley, Wistar, Fisher 344, de más de un mes de edad, después de sacrificarlos. Se eliminan las meninges superpuestas y los vasos sanguíneos, y el tejido cerebral se corta en trozos pequeños con un bisturí. De forma alternativa, se disecan regiones específicas del cerebro, tales como hipocampo, bulbo olfatorio, pared del ventrículo lateral, cuerpo estriado, cerebelo o corteza. El tejido se lava en DPBS/glu para eliminar el exceso de sangre y se resuspende en solución PPD que contiene papaína al 0,01% (Worthington Biochemicals, Inglaterra), dispasa II al 0,1% (Boehringer, Alemania), DNasa I al 0,01% (Worthington Biochemicals, Inglaterra) y MgSO_{4} 12,4 mM en HBSS (PAN, Alemania) sin Mg^{++}/Ca^{++} (PAA, Alemania) y se digiere durante 30 a 40 minutos a 37ºC con trituración suave cada 10 minutos. La suspensión celular se centrifuga después a 200xg durante 5 minutos, se lava dos veces con HBSS -Ca/-Mg y se resuspende en 2 ml de HBSS -Ca/-Mg. Las células se disocian triturando secuencialmente 20/10/5, a través de pipetas pasteur de vidrio cada vez más estrechas y se pasan a través de un colador celular de 30 \mum (Becton-Dickinson), y se resuspenden en medio NB (Gibco BRL, Alemania) suplementado con B27 (Gibco BRL, Alemania) (NB/B27), SFT al 5% (PAN, Alemania), L-glutamina 2 mM (PAN, Alemania), penicilina 100 \mug/ml/estreptomicina 0,1 mg/mL (PAN, Alemania). Las células se siembran en placas de 12 pocillos recubiertos de poliornitina (250 \mug/ml) y laminina (5 \mug/ml) a diferentes densidades celulares (de 10E5 a 10E7 células/pocillo y ml) y se hacen crecer durante dos a siete días.
Cultivos de explantes
De forma alternativa a los cultivos en monocapa disociados, también se usan explantes de tejido para experimentos de transfección. Aquí, se aíslan y disecan tejidos cerebrales de ratones, ratas o humanos adultos, tales como hipocampo, pared ventricular o bulbo olfatorio como se describe anteriormente y se cortan en trozos pequeños con un bisturí. Se realiza la disección adicional en trozos de 200 \mum de forma automática usando un cortador de tejido McIllwain. Los explantes de siembran después en placas Falcon de 35 nm recubiertas de poliornitina (250 \mug/ml) y laminina (5 \mug/ml) en medio NB (Gibco BRL, Alemania) suplementado con B27 (Gibco BRL, Alemania) (NB/B27), SFT al 5% (PAN, Alemania), L-glutamina 2 mM (PAN, Alemania), penicilina 100 \mug/ml/estreptomicina 0,1 mg/mL (PAN, Alemania).
Métodos de transfección
Transfección liposomal: Se siembran las células derivadas de diferentes fuentes, tales como embrionarias o adultas, tales como de pollo, ratón, rata o humanas como se describe anteriormente. De dos a siete días después de sembrar, el medio se cambia a medio de transfección que comprende medio NB (Gibco BRL, Alemania) suplementado con B27 (Gibco BRL, Alemania) (NB/B27), L-glutamina 2 mM (PAN, Alemania) para eliminar el suero y Pen/Estrep durante 1 hora. 3 \mug de ADN (SEQ ID NO: 7; vector EGFP bajo el control de la secuencia reguladora de DCX) y 5 \mul de reactivo lípido catiónico (Metafectene) se diluyen cada uno en 50 \mul de medio de transfección. Las diluciones de ADN y Metafectene se mezclan suavemente, la mezcla se incuba a temperatura ambiente durante 20 minutos antes de pipetear sobre las células en la placa de 12 pocillos. La transfección dura de 8 a 10 horas, después el sobrenadante se cambia por medio reciente que contiene antibióticos y suero. El análisis de imágenes de EGFP se realiza 12-38 horas después de la transfección, usando un microscopio Olympus IX70 con óptica de epifluorescencia.
Transferencia génica mediada por partículas: De forma alternativa a la transfección basada en liposoma, los genes se pueden introducir en diferentes tipos de células mediante distribución mediada por partículas, usando un sistema de distribución de partículas de biolística (Bio-Rad PDS 1000). Se preparan cultivos de explantes como se ha descrito anteriormente. Después de una incubación durante la noche, los explantes cerebrales están bien adheridos a la placa. El medio se retira durante, y se vuelve a añadir después de la distribución génica. Para la distribución génica, se recubren partículas de oro (de 0,6 ó 1 \mum, 50 ml de 60 mg/ml, Bio-Rad) con 5 \mug de ADN plasmídico, tal como (SEQ ID NO: 7; vector de EGFP bajo el control de la secuencia reguladora de DCX) durante 1 hora, después de lo cual las partículas se recogen mediante centrifugación, se lavan y se resuspenden en 50 \mul de etanol al 100%. Se añaden un total de 8 \mul de suspensión partícula de oro/ADN en un disco macrosoporte estéril (Bio-Rad) y el etanol se evapora. El macrosoporte se monta después en un sistema de distribución de partículas biolístico y las muestras se colocan a 5 a 10 cm de distancia de la pantalla de parada. Se suministra helio con una presión de 1500 psi y una presión de ruptura de 1000-1200 psi usando un disco de ruptura de 1100 psi. Se realiza el bombardeo en un vacío de cámara de 20-25 Hg.
De forma alternativa a los métodos de distribución génica basada en liposomas o mediada por partículas, se puede concebir la distribución génica mediada por virus usando vectores tales como vectores adenovirales, de virus adenoasociados, lentivirales o retrovirales para distribuir un gen marcador bajo el control de la secuencia reguladora de DCX. Se pueden usar diferentes tipos de células incluyendo embrionarias o adultas, de ratón, rata, pollo o humanas para la administración génica del gen indicador EGFP bajo el control del promotor humano de DCX usando los diferentes vectores virales. Usando un vector adenoviral a una concentración de 10 pfu/célula, aproximadamente el 20% de las células de cultivos de prosencéfalo expresan EGFP 3 días después de la infección. A 1000 pfu/célula, más del 50% de las células expresa EGFP.
Separación por FACS: Las células se disocian usando Accutase (PAA) y se cargan con 10 \mug/ml de yoduro de propidio (PI) y se pasan a través de un colador celular de 30 \mum (Becton-Dickinson). Las células se analizan y separan usando un citómetro de flujo/separador celular FACS Vantage (Becton-Dickinson) equipado con software CELLQuest. Las células (2x10E6 células/ml) se analizan mediante dispersión de luz frontal y de ángulo derecho (lateral), fluorescencia de PI y fluorescencia de EGFP a través de un filtro de paso de banda de 510 \pm 20 nm, según pasan el haz con un láser iónico de argón (488 nm, 100 mW). Las células muertas se excluyen seleccionando poblaciones en la dispersión frontal y lateral, y eliminando los sucesos positivos de yoduro de propidio. Se usaron células que no se transfectaron para ajustar la fluorescencia de fondo. Se acepta una tasa de falsos positivos de 0,02 \pm 0,05% para asegurar un rendimiento adecuado.
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Ejemplo IX
Las células que expresan un gen fluorescente (EGFP) derivadas de un experimento de transfección enriquecidas por FACS producen células positivas para doblecortina
Las células viables del ejemplo VIII (anterior) se separan en medio NB (Gibco BRL, Alemania) suplementado con B27 (Gibco BRL, Alemania) (NB/B27), SFT al 5% (PAN, Alemania), L-glutamina 2 mM (PAN, Alemania), penicilina 100 \mug/ml/estreptomicina 0,1 mg/mL (PAN, Alemania) a una velocidad de 3000 sucesos/s. Las células separadas se siembran en cubreobjetos de vidrio recubiertos de poliornitina (250 \mug/ml) y laminina (5 \mug/ml) en placas de 12 pocillos a diferentes densidades celulares (de 10E5 a 10E7 células/pocillo y ml) y se hacen crecer durante dos a siete días. Las células se fijan con paraformaldehído al 4% precalentado a 37ºC tamponado con fosfato pH 7,4 (paraformaldehído al 4% peso/volumen, NaH_{2}PO_{4} 100 mM, CaCl_{2} 0,4 mM, sacarosa 50 mM) durante 30 minutos y se procesan para inmunohistoquímica. Después de 30 minutos de fijación a temperatura ambiente con paraformaldehído al 4% tamponado con fosfato, las muestras se bloquean durante un mínimo de 1 hora en tampón de gelatina de piel de pescado (Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, NaCl 0,15 M, seroalbúmina bovina al 1%, gelatina de teleósteo al 0,2% (Sigma, Alemania), Triton X-100 al 0,1%) a temperatura ambiente. Las muestras se incuban durante la noche a 4ºC con los anticuerpos primarios a las siguientes diluciones: anti-DCX C-18 de cabra (1:500, Santa Cruz Labs, Santa Cruz, EE.UU.); anti-galactocerebrósido de ratón 1:500 (Chemicon, EE.UU.); anti-GFAP de conejo 1:1000 (Dako, Dinamarca); anti-Ki67 de conejo 1:500 (Novocastra, RU); anti-nestina de conejo 1:200 (Chemicon, EE.UU.); anti-nestina de ratón 1:200 (Pharmingen International, EE.UU.); anti-\betaIII-tubulina de ratón 1:500 (clon 5G8, Promega, EE.UU.); anti-\betaIII-tubulina de ratón 1:500 (clon TUJ1, Babco, EE.UU.). Los anticuerpos secundarios conjugados a fluorocromos se diluyeron 1:500 (anti-ratón o conejo de burro, Dianova, Alemania). Todas las diluciones de anticuerpo y los lavados se realizan con el mismo tampón de gelatina de piel de pescado. La contratinción nuclear se realiza con diclorhidrato de 4'6'-diamidino-2-fenilindol hidrato a 0,25 \mug/\mul (DAPI, Sigma, Alemania). Después del último lavado, las muestras se enjuagan brevemente con PBS y se montan en portaobjetos usando Prolong (Molecular Probes, Países Bajos). En los casos donde los antígenos son sensibles a detergentes (GalC), se omite Triton X-100 del tampón de gelatina de piel de pescado.
Las células disociadas se separan en una de dos fracciones, una negativa para EGFP y una positiva para EGFP. Las células separadas se cultivan y analizan mediante inmunohistoquímica como se ha descrito anteriormente. 2 días después de la separación, la mayoría de las células de la fracción positiva para EGFP siguen expresando EGFP y la inmunotinción para doblecortina reveló que más del 90% de las células expresa doblecortina. Por el contrario, muy pocas de las células de la fracción negativa para EGFP expresan doblecortina.
Dos días después de la separación celular, menos del 5% de las células derivadas de la población positiva para EGFP expresa el marcador progenitor neuroectodérmico nestina, ninguna de las células expresa el marcador glial GFAP o el marcador de oligondendocitos GalC, sin embargo, más del 90% de las células expresa \betaIII tubulina, un marcador neuronal que se induce pronto durante la diferenciación neuronal. Las células que expresan doblecortina coexpresan \betaIII tubulina. La doblecortina se expresa en muy pocas de las células derivadas de la fracción negativa para EGFP. Sin embargo, se encontró que menos del 1% de las células expresan nestina, más del 30% de las células expresan GFAP, no se pudo detectar tinción de GalC, pero el 10% de las células expresa \betaIII tubulina. Estas son probablemente neuronas maduras, ya que algunas células expresan también el marcador neuronal MAP2.
Siete días después de la separación y siembra, la señal de EGFP en células derivadas de la fracción positiva para EGFP disminuye y apenas se detecta. Al mismo tiempo, la expresión de doblecortina disminuye en el cultivo determinada mediante inmunotinción. Ninguna de las células en estos cultivos es positiva para nestina, pero la mayoría de las células expresan ahora \betaIII tubulina. Muchas de estas células (más del 20%) expresan MAP2 y GAP-43, marcadores para neuronas que maduran. En los cultivos derivados de la fracción negativa para EGFP, el número de células gliales positivas para GFAP aumenta probablemente debido al crecimiento glial, mientras que el número de neuronas no cambia.
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Ejemplo X
Experimentos de trasplantes usando células enriquecidas en células que expresan EGFP-DCX
Las células pueden derivar de un animal transgénico como se describe en el ejemplo IV o de células transfectadas como se describe en el ejemplo III.
Los trasplantes se realizan según protocolos previamente establecidos. Se preparan suspensiones de células individuales para trasplante mediante separación por FACS como se ha descrito anteriormente y se separan en HBSS. Las células se resuspenden en HBSS a una concentración de 100.000 células/\mul. Se necesita determinar los parámetros específicos de inyección dependiendo del modelo animal, pero inicialmente las células se inyectan en sitios específicos recibiendo cada sitio de infusión 0,5 \mul (50.000 células). Se realiza una única inyección de presión volumétrica de la suspensión celular en el cerebro usando un microinyector digitalmente controlado a través de una micropipeta de vidrio estirado con el diámetro de la punta de aproximadamente 100 \mum.
El injerto de células humanas o de ratón en roedores requiere inmunosupresión para prevenir rechazo de los injertos por el huésped. Esto se alcanza mediante tratamiento continuo con clicosporina o FK506.
Modelos animales
Enfermedad de Alzheimer (EA). Las neuronas colinérgicas del sistema colinérgico del prosencéfalo están significativamente afectadas en la EA y su progresiva muerte celular produce deterioro cognitivo y demencia. Los animales con lesiones discretas del sistema colinérgico del prosencéfalo muestran deficiencias similares en tareas de aprendizaje y memoria. Las lesiones se realizan en células colinérgicas del septo medio, banda diagonal y núcleo basal mediante inyección intraventricular de una neurotoxina específica (192-IgG-saporina). Las neuronas colinérgicas absorben esta toxina selectivamente y produce muerte celular en 7 días después de la aplicación. Cuando la lesión es completa los niveles de actividad colinérgica en la corteza y el hipocampo se reducen a menos del 20% de los valores preoperatorios. Brevemente, se realizan infusiones intraventriculares de la inmunotoxina inyectando 3,5 \mug de 192-IgG-saponina en un volumen final de 5 \mul de solución salina durante un periodo de 5 minutos en el ventrículo lateral derecho. Los trasplantes se realizan alrededor de 2 semanas después de la lesión para probar la capacidad de las células de reemplazar las neuronas colinérgicas perdidas y para mejorar la función en tareas de aprendizaje.
Enfermedad de Parkinson. Un modelo de ratón que se usa ampliamente como modelo animal de la EP se basa en la aplicación sistémica del compuesto 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP), para una revisión véase (Kaakkola y Teravainen (1990); Langston (1985). Los pasos principales en la expresión de la neurotoxicidad implican la conversión MPTP en el agente tóxico ión 1-metil-4-fenilpiridinio (MPP+) por la monoamino oxidasa de tipo B (MAO-B) en células gliales, la absorción específica de MPP+ en neuronas dopaminérgicas nigro-estratiales y la acumulación intraneuronal de MPP+. Induce selectivamente muerte celular de las células dopaminérgicas en la sustancia negra y produce deficiencias motoras graves. Brevemente, ratones C57BL/6 (de 8 semanas de edad) reciben una única inyección s.c. de MPTP 40 mg/kg. Se ha mostrado que típicamente esta pauta induce una eliminación de dopamina estratial reproducible del 80% en ratones C57BL/6 (Chan (1997)) 7 días después de la inyección. Una semana después de inducir síntomas similares al Parkinson en ratones se injertan células en el cuerpo estriado para mejorar la liberación de dopamina en esta estructura, y la sustancia negra para la reconstrucción de la proyección nigro-estratial.
Ictus: el modelo de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO). Brevemente, se anestesian ratas Wistar macho que pesan de 250-270 g con isoflurano al 4% en una mezcla de N_{2}O al 70% y O_{2} al 30% y se intuban orotraquealmente para ventilación mecánica. Se usan una lámpara calentadora y almohadilla termostáticamente reguladas para mantener la temperatura del cuerpo a 37ºC. Se controla el flujo sanguíneo cortical local en cada hemisferio en la arteria cerebral mediante flujometría por laser-doppler. Después de la exposición de la bifurcación carótida derecha y ligación de las ramas de la arteria carótida interna (ICA) con microscopio de operaciones, se liga la arteria carótida externa y se corta lejos de la arteria tiroidea superior. Después, se introduce un monofilamento de nailon 4-0 recubierto de silicona en la ECA y suavemente se avanza a través de la ICA hasta que su punta ocluye el origen de la MCA. Mediante esto, el flujo sanguíneo cortical local en el territorio de la MCA cae hasta alrededor del 20% de la línea basal. La sutura endovascular permanece en su lugar hasta que se permite la reperfusión retirando el filamento. Los sitios de trasplante para células incluyen los ganglios basales y la sustancia blanca subcortical (núcleo isquémico) y la corteza suprayacente (penumbra isquémica) del hemisferio isquémico.
Morfología
El trasplante de células en modelos animales de enfermedades neurológicas proporciona información sobre la integración y supervivencia de células injertadas, su potencial de diferenciación en condiciones patológicas y su capacidad de reemplazar funcionalmente neuronas que mueren. Para la evaluación morfológica los cerebros se retiran a tiempos predeterminados después del injerto. La tinción inmunohistoquímica con anticuerpos específicos determinará el número y distribución de las células injertadas. En combinación con marcadores celulares para neuronas, astrocitos y oligodendrocitos, se determina el destino de diferenciación para las células a través de inmunofluorescencia múltiple y microscopia láser confocal. Cuando sea necesario, se realizará la caracterización de fenotipos neuronales individuales usando anticuerpos transmisores específicos.
También se prevén experimentos de injerto de otras especies, por ejemplo, se pueden injertar células de ratón en, por ejemplo, rata (cerebro) y se pueden ensayar comportamiento de migración, supervivencia y/o diferenciación de dichas células injertadas.
Preparación de tejido. Los animales se sacrifican a diferentes tiempos después del injerto con una sobredosis de anestésico y se perfunden transcardiacamente con paraformaldehído al 4% en tampón fosfato. Se retiran los cerebros, se almacenan en fijador durante la noche, y después se transfieren a sacarosa al 30%. Para la inmunohistoquímica en flotación libre, se cortan secciones de 40 \mum en un microtomo de deslizamiento y se almacenan a -20ºC en solución crioprotectora.
Estereología cuantitativa. Las secciones que atraviesan las regiones injertadas se tiñen de forma inmunohistoquímica para la proteína que se expresa bajo el control de la secuencia reguladora de DCX.
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Ejemplo XI
Estudios de deleción y transfección. Generación de mutantes de deleción de la secuencia reguladora humana de DCX para definir el promotor mínimo humano de DCX y sus elementos reguladores Generación de mutantes de deleción
Usando la secuencia reguladora humana de DCX subclonada, por ejemplo el vector phuDCXpromoEGFP1, es posible diseñar protocolos de deleción usando enzimas de restricción. Digiriendo el vector con las enzimas de restricción apropiadas, es posible separar un segmento de la secuencia reguladora humana de DCX. El trozo restante del vector puede tener extremos compatibles para la recircularización usando ADN ligasa de T4 o se puede necesitar primero hacer extremos romos. Para generar un fragmento de ADN con extremos romos compatibles, se puede hacer uso del fragmento Klenow de la ADN polimerasa I en presencia de un exceso de dNTP libres.
De forma alternativa, los segmentos de la secuencia reguladora humana de DCX se pueden amplificar por PCR y subclonar en el vector EGFP-N1 sin promotor, como se describe en ejemplo II. Esta estrategia permite una selección más precisa de las regiones a ser analizadas, sin el requerimiento de sitios para enzimas de restricción. Varios de estos fragmentos amplificados se pueden subclonar fácilmente en tándem delante de un gen indicador, tal como el gen indicador EGFP.
Análisis de la actividad promotora de expresión de la secuencia reguladora humana de DCX y sus subregiones
Se puede evaluar la actividad promotora de expresión de la secuencia reguladora humana de DCX, así como de los varios mutantes de deleción, transfectando células progenitoras restringidas neuronales. Estas células se pueden obtener de la disociación de prosencéfalos de embriones de ratón de día embrionario 10,5 a 12,5. Las suspensiones de células obtenidas de estos prosencéfalos embrionarios contienen varios tipos celulares, incluyendo células precursoras restringidas neuronales. Se pueden realizar transfecciones paralelas de estos cultivos de prosencéfalos disociados usando el gen indicador EGFP bajo el control de un promotor ubicuo, tal como CMV, bajo el control de la secuencia reguladora humana de DCX o bajo el control de cualquier fragmento de la secuencia reguladora humana de DCX. La comparación de los niveles de expresión del gen indicador EGFP, visualizado con un microscopio de fluorescencia, permite el análisis de la actividad promotora de expresión de la secuencia que controla la expresión del gen indicador EGFP. De forma alternativa, las células transfectadas se pueden analizar por FACS, que permite una cuantificación rápida del porcentaje de células que expresan el gen indicador EGFP así como la intensidad relativa de expresión.
También se pueden obtener las células precursoras restringidas neuronales mediante el uso de ratones transgénicos huDCXpromoEGFP1. La disociación de las regiones del SNC que tienen neurogénesis proporcionará una suspensión celular que contiene varios tipos de células, incluyendo células precursoras restringidas neuronales. Esta suspensión de células se puede dividir en fracciones de células que expresan el indicador EGFP y de células que no expresan el indicador EGFP mediante separación por FACS usando la señal fluorescente de la proteína indicadora EGFP como el criterio de separación. Las células positivas para EGFP corresponderían a células precursoras restringidas neuronales, y las células negativas para EGFP a todos los otros tipos celulares. Estas dos poblaciones se pueden transfectar, por ejemplo con el gen indicador fluorescente DsRed2 bajo el control de la secuencia reguladora humana de DCX y bajo el control de fragmentos de la secuencia reguladora humana de DCX.
La especificidad celular de las secuencias reguladoras con frecuencia es el resultado de elementos inductores de expresión, que inducen la expresión del gen en un tipo celular específico deseado, y elementos inhibidores de expresión, que bloquean la expresión del gen en tipo celulares diferentes del tipo celular deseado. El uso de dos fracciones celulares separadas permite la identificación de elementos inductores e inhibidores. El análisis de la expresión del gen indicador DsRed2 en las células positivas para EGFP transfectadas, permite determinar si la secuencia reguladora es capaz de inducir la expresión del gen indicador DsRed2 en células que son restringidas neuronales, revelando la presencia de suficientes elementos inductores de la expresión. El análisis de la expresión del gen indicador DsRed2 en las células negativas para EGFP transfectadas permite determinar si se ha delecionado algún elemento inhibidor de la expresión. En este caso, la expresión de DsRed2 se observaría en células negativas para EGFP.
El uso de líneas celulares establecidas, tales como células COS7, también se puede usar para evaluar la deleción de elementos inhibidores de expresión en la secuencia reguladora humana de DCX, que produce la expresión del gen indicador en células diferentes de células progenitoras restringidas neuronales.
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Ejemplo XII
Sitios putativos de unión de factores de transcripción en las secuencias reguladoras de DCX
Se aplicaron los siguientes programas para el análisis de secuencias: fasta20u66, versión 2.0u66 disponible en Biology Workbench del Centro de Superordenadores de San Diego (http://workbench.sdsc.edu) para alineamiento; MatInspector, versión 6.2.1, disponible de Genomatix Software GmbH (Munich, Alemania, www.genomatix.de) para análisis de sitios de unión de factores de transcripción (Quandt (1995) Nucleic Acids Research 23, 48784884).
El análisis de SEQ ID NO: 1 reveló sitios putativos de unión para Brn-2 (posición 1985-2001; 2774-2790), NeuroD1 (posición 1821-1833), E2F-1 (posiciones 1831-1845; 2675-2689; 2761-2775), E2F-2 (posiciones 2309-2323), Smad3 (posición 1397-1405), Smad4 (posición 1397-1405) (Fig. 17). El análisis de SEQ ID NO: 2 reveló un patrón similar de sitios de unión para Brn-2 (posiciones 153- 66; 2136-2152), Brn-3 (posición 926-942), NeuroD1 (posiciones 178-190; 1154-1166; 2468-2480), E2F-1 (posiciones 196-210; 561-575; 1136-1150; 1616-1630; 1800-1814), E2F-2 (posición 2578-2592) y Fast1 (posiciones 574-588; 646-660) (Figura 17).
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Ejemplo XIII
La secuencia reguladora de DCX es activa específica en células determinadas neuronales in vitro Células y cultivo celular
Si no se cita de otra manera, las soluciones para cultivo de células se obtuvieron de PAN Biotech GmbH (Aidenbach, Alemania), los recipientes de cultivo de plástico de TPP (Trasadingen, Suiza). Las células HEK293 (Clontech, Heidelberg, Alemania) y las células COS7 (ATCC, EE.UU., # CRL-1651) se mantuvieron en medio Eagle modificado por Dulbecco ajustado para contener suero fetal de ternera al 10%, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 0,1 mg/ml, L-glutamina 4 mM, bicarbonato de sodio 1,5 g/l y glucosa 4,5 g/l a 37ºC en una atmósfera humidificada que contenía CO_{2} al 5%. Las CTX TNA2 (línea de astrocitos de rata, ECACC # 98102213) se mantuvieron en DMEM ajustado para contener suero fetal de ternera al 10%, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 0,1 mg/ml, L-glutamina 2 mM, bicarbonato de sodio 1,5 g/l y piruvato de sodio 1 mM a 37ºC en una atmósfera humidificada que contenía CO_{2} al 5%. N20.1, una línea de oligodendrocitos de ratón, fue amablemente suministrada por Anthony T. Campagnoni, Universidad de California, Los Angeles, EE.UU. Para proliferación, las células N20.1 se mantuvieron en F12 de HAM/DMEM 1:1 suplementado con glucosa 2,4 g/l, L-glutamina 0,18 g/l, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 0,1 mg/ml y gentamicina 22,5 mg/l a 33ºC en una atmósfera humidificada que contenía CO_{2} al 5%. Para diferenciar esta línea en un fenotipo oligodendrocítico, las células se mantuvieron en el mismo medio, pero a 39ºC durante 7 días. D283Med (ATCC, EE.UU., # HTB-185) y Neuro2A (ATCC, EE.UU., # CCL-131) se mantuvieron en medio mínimo esencial (Eagle) con BSS de Earle ajustado para contener suero fetal de ternera al 10%, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 0,1 mg/ml, L-glutamina 2 mM, bicarbonato de sodio 1,5 g/l, piruvato de sodio 1 mM y aminoácidos no esenciales 0,1 mM a 37ºC en una atmósfera humidificada que contenía CO_{2} al 5%. Las células se sembraron en placas de cultivo de plástico a una densidad de 2,5 x 10^{4} células por cm^{2} un día antes de realizar la transfección. Antes de sembrar las células D283Med, las placas de cultivo se cubrieron con poliornitina (250 \mug/ml) y laminina (15 \mug/ml). 1 día después de la transfección, las células se volvieron a sembrar en cubreobjetos de vidrio recubiertos con poliornitina (250 \mug/ml) y laminina (15 \mug/ml) a una densidad de 7,5 x 10^{4} células por cm^{2}. Se prepararon cultivos de prosencéfalo embrionario de ratón (MEF) como sigue: Se sacrificaron ratones hembras preñadas C57Bl/6Ncrl (Charles River Laboratories, Sulzfeld, Alemania) por dislocación cervical. Se retiraron los úteros y se sumergieron en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) helada. Los embriones del día embrionario 10,5 a 12,5 se liberaron de los úteros, se disecaron los prosencéfalos y se separaron de los tejidos circundantes. Los prosencéfalos disecados se lavaron una vez en DPBS helado, se transfirieron a una placa petri y se disociaron mecánicamente con la hoja de un bisturí. La preparación resultante se lavó en DPBS. Después de una centrifugación de 5 minutos a 120xg, el precipitado se resuspendió en solución PPD que contenía papaína al 0,01% (Worthington Biochemicals, Inglaterra), dispasa II al 0,1% (Boehringer, Alemania), DNasa I al 0,01% (Worthington Biochemicals, Inglaterra) y MgSO_{4} 12,4 mM en HBSS (PAN, Alemania) sin Mg^{++}/Ca^{++} (PAA, Alemania) y se incubó durante 30 a 40 minutos a 37ºC. La solución celular se trituró cada 10 minutos a través de una pipeta. Las células disociadas se recogieron mediante centrifugación de 5 minutos a 120xg. El precipitado se resuspendió en medio neurobasal sin suero (Gibco BRL, Alemania) y se lavó tres veces. Por último, la preparación celular se resuspendió en medio neurobasal suplementado con B27 (Gibco BRL, Alemania), L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 0,1 mg/ml, suero fetal de ternera al 5%, se sembraron en cubreobjetos recubiertos con poliornitina (250 \mug/ml) y laminina (15 \mug/ml) a una densidad de 2,5 x 10^{5} células por cm^{2} y se mantuvieron durante 4 días a 37ºC en una atmósfera humidificada que contenía CO_{2} al 5% antes de la
transfección.
Transfecciones
Las transfecciones de las líneas celulares se realizaron en placas de cultivo de 10 cm^{2} (placas de 6 pocillos) usando 3 \mug de plásmido (phuDCXpromoEGFP1 o phuDCXpromoDsRed2) por placa en presencia de 5 \mul de Metafectene (Biontex Laboratories, Munich, Alemania) en un volumen final de 2 ml según el protocolo del fabricante. El medio se cambió después de 12 horas. Un día después del final de la transfección, las células se tripsinizaron y se volvieron a sembrar en cubreobjetos de vidrio recubiertos de poliornitina/laminina durante otras 24 horas antes del análisis inmunohistológico. Las células MEF se transfectaron directamente en los cubreobjetos de vidrio recubiertos en los que se habían sembrado para formar un cultivo diferenciado. Las transfecciones de células MEF se realizaron usando 1,2 \mug de plásmido por 4 cm^{2} de superficie de cultivo en presencia de 3 \mul de Metafectene en un volumen final de 1 ml según el protocolo del fabricante. El medio se cambió después de 12 horas, las células se incubaron durante otros 4 días en condiciones de cultivo antes del análisis inmunohistológico. Después del final de la transfección, se examinó la expresión del gen indicador EGFP o DsRed2 en todos los cultivos usando un microscopio de fluorescencia invertido Olympus IX70. Para preparar extractos celulares de líneas celulares transfectadas o cultivos primarios de MEF transfectados, las células se sembraron y transfectaron en placas de 10 cm^{2} y se recogieron directamente del recipiente de cultivo con un raspador de células.
Inmunotinciones
Después de 30 minutos de fijación a temperatura ambiente con paraformaldehído al 4% tamponado con fosfato, las muestras se bloquearon durante un mínimo de 1 hora en tampón de gelatina de piel de pescado (Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, NaCl 0,15 M, seroalbúmina bovina al 1%, gelatina de teleósteo al 0,2% (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania), Triton X-100 al 0,1%) a temperatura ambiente. Las muestras se incuban durante la noche a 4ºC con los anticuerpos primarios a las siguientes diluciones: anti-doblecortina C-18 de cabra 1:1000, (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.); anti-galactocerebrósido de conejo 1:250 (AB142, Chemicon, Temecula, CA, EE.UU.); anti-GFAP de conejo 1:1000 (Dako, Glostrup, Dinamarca); anti-Ki67 de conejo 1:500 (Novocastra, Newcastle upon Tyne, RU); anti-nestina de ratón 1:500 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA, EE.UU.); anti-\betaIII-tubulina de ratón 1:500 (clon 5G8, Promega, Madison, Wisconsin, EE.UU.); anti-neurofilamento 200 de conejo (Chemicon, Temecula, CA, EE.UU.); anti-map-2a/b de ratón (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania). Los anticuerpos secundarios conjugados a fluorocromos se diluyeron 1:500 (anti IgG anti-ratón, conejo y cabra de burro conjugado con Rodamina Red^{TM}-X, conjugado con Cy^{TM}5, conjugado con fluoresceína (FITC) de Dianova GmbH, Hamburgo, Alemania). Todas las diluciones de anticuerpo y los lavados se realizan con el mismo tampón de gelatina de piel de pescado. La contratinción nuclear se realiza con diclorhidrato de 4'6'-diamidino-2-fenilindol hidrato a 0,25 \mug/\mul (DAPI, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania) o TO-PRO-3 (Molecular Probes, Eugene, OR, EE.UU.). Después del último lavado, las muestras se enjuagaron brevemente con PBS y se montaron en portaobjetos usando Fluoromount (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL, EE.UU.). En los casos donde los antígenos eran sensibles a detergentes, se omitió el Triton X-100 del tampón de gelatina de piel de pescado.
Análisis por inmunotransferencia
Para preparar extractos de proteínas de líneas celulares transfectadas o cultivos primarios de MEF transfectados, las células se sembraron y transfectaron en placas de 10 cm^{2}. Las células se recogieron del recipiente de cultivo en solución salina tamponada con fosfato usando un raspador de células y se recogieron mediante centrifugación de 5 minutos a 200xg. Las proteínas se extrajeron homogenizando el precipitado celular en tampón SUB (dodecil sulfato de sodio al 0,5%, urea 8 M, \beta-mercaptoetanol al 2%), pasando la suspensión al menos 5 veces a través de una aguja de calibre 20 ajustada a una jeringuilla de plástico de 2 ml y separando el lisado de los restos mediante centrifugación a 10.000 x g durante 10 minutos. Se evaluó la concentración de la proteína total en el sobrenadante usando el método de Bradford. Se corrieron 5 \mug de proteína total por carril en un gel SDS-PAGE al 12,5% a 2 mA/cm y se transfirió a 2,5 mA/cm^{2} durante 0,7 horas a una membrana de nitrocelulosa (tamaño de poro de 0,45 \mum, Protran BA 85; Schleicher + Schuell, Dassel, Alemania). El bloqueo de la membrana, incubación con los anticuerpos y pasos de lavado se realizaron en tapón de western de gelatina de piel de pescado (Tris-HCl 20 mM, pH 7,3, NaCl al 0,9%, gelatina de piel de pescado al 1%, Tween-20 al 0,1%). Para detectar doblecortina, EGFP o actina inmunológicamente, la membrana se bloqueó durante 2 horas a temperatura ambiente, se ensayó con anti-DCX (IgG de cabra, dilución 1:1000, Santa Cruz, Santa Cruz, CA, EE.UU.), anti-EGFP (IgG de cabra, dilución 1:1000, Rockland, Gilbertsville, PA, EE.UU.) o anti-actina (IgG de conejo, dilución 1:5000, Sigma, Taufkirchen, Alemania) durante la noche a 4ºC. Las membranas se lavaron e incubaron con IgG de burro anti-cabra (dilución 1:50.000, Sigma, Taufkirchen, Alemania) o anticuerpo secundario anti-conejo (dilución 1:50.000, Dianova, Hamburgo, Alemania) conjugado con peroxidasa de rábano durante 2 horas a temperatura ambiente y se lavaron antes de realizar la detección con ECL de los conjugados proteína-anticuerpo (ECL-Plus Western Blotting Detection System, Amersham-Pharmacia, Friburgo, Alemania) según el protocolo del fabricante.
Análisis cuantitativo
Se examinaron las inmunotinciones de las células cultivadas usando microscopia láser confocal. Para determinar la relación de células que expresan un cierto marcador o proteína indicadora, se examinaron cinco campos visuales elegidos al azar, con un aumento de 200 x. Primero, se determinó el número total de células en el campo según la contratinción nuclear, después se determinó el número de células positivas para marcador o transgén. Para detectar el comarcaje de marcadores endógenos o el comarcaje de marcador e indicador, se escogieron al azar células que expresaban el marcador o indicador y se examinaron para coexpresión con el otro marcador. Para este fin, se uso un aumento de 400 X, se examinó un número total de 40 células positivas para el marcador en cada modelo.
Actividad específica de la secuencia reguladora humana de DCX en células de linaje neuronal
Para ensayar la actividad de SEQ ID NO: 1 como promotor, se transfectó de forma transitoria el vector de expresión phuDCXpromoEGFP1 (SEQ ID NO: 7) (figura 8A) en diferentes tipos de células. Se usaron células HEK293 y COS7 como ejemplos de células no neuronales, las células restringidas al linaje glial estaban representadas por la línea celular astrocítica CTX TNA2 y por la línea oligodendroglial N20.1, la población neural mixta por la línea de células de neuroblastoma de ratón Nuero-2a y por las células de meduloblastoma humano D283 Med, y para un tipo celular fisiológico más relevante, se usaron células primarias de prosencéfalo embrionario de ratón de día embrionario 10,5 a 12,5 (MEF). La expresión se analizó mediante análisis de inmunotransferencia y microscopia de fluorescencia cualitativa y cuantitativa. La expresión de EGFP dirigida por SEQ ID NO: 1 no se detectó o apenas en las células no neurales HEK293 y COS7 y no en CTX TNA2 y N20.1, fue débilmente detectable en las líneas celulares neurales D283 Med y Neuro-2a, y fuertemente detectable en células MEF (figura 18). Las pocas células no neuronales que expresan EGFP bajo la secuencia reguladora humana de DCX expresaron EGFP sólo a niveles bajos, comparados con la expresión dirigida por el potenciador de CMV en estas líneas celulares o comparados con la expresión dirigida por la secuencia reguladores humana de DCX en las células neuronales Neuro-2a y MEF (figura 18). La actividad del fragmento del promotor de DCX se correlacionó bien con la expresión de DCX endógena, demostrada mediante análisis de inmunotransferencia. Las transfecciones control con pEGFP-N1 para dirigir la expresión a través de promotor ubicuo CMV demostraron que todos los tipos celulares eran transfectables y expresaban EGFP (figura 18). Estas células transfectadas expresaron EGFP a niveles altos (figura 18). Sin embargo, las tasas de transfección variaron entre los diferentes tipos celulares, de modo que las células HEK293, COS7 y Neuro-2a mostraron eficiencias de transfección del 6% al 14%, mientras que CTX TNA2, D283 y MEF primarios tuvieron eficiencias de transfección por debajo del 3% (figura 19). Calculando el coeficiente de actividad relativa del promotor mediante (% de células que expresan phuDCXpromoEGFP1 divido por el % de células que expresan pEGFP-N1)x100 indica que en hasta el 30,6% de las células MEF transfectadas, la secuencia reguladora humana de DCX es activa (figura 19). Se encontró una actividad específica más baja en células Neuro-2a y D283 (aprox. del 7 al 12%), y no se encontró actividad en las líneas de células no neuronales HEK293, CTX TNA2 y N20.1. Las células COS7 activaron la secuencia reguladora humana de DCX rara y débilmente. Comparada con la fuerte expresión observada en células neuronales, este nivel se considera no significativo. En resumen, estos experimentos sugieren que la secuencia reguladora humana de DCX se activa predominantemente en células proliferativas de linaje
neuronal.
La secuencia reguladora humana de DCX es predominantemente activa en células determinadas neuronales jóvenes.
El siguiente conjunto de experimentos se dirigieron hacia la pregunta de si, en experimentos de transfección transitoria, la SEQ ID NO: 1 tiene una actividad similar comparada con el promotor endógeno de DCX. Para eso, se hizo uso de las células MEF. Este sistema de cultivo está compuesto de diferentes tipos celulares del sistema nervioso en desarrollo. El análisis inmunocitoquímico reveló un porcentaje bajo de células troncales neurales positivas para nestina (1,17%) y células proliferantes positivas para Ki67 (2,24%) (figura 20). La gran mayoría de las células expresaba marcadores de neuronas jóvenes, tales como DCX (16,43%), Map2ab (16,08%) y \betatubIII (24,31%), pocas células expresaban el marcador neuronal maduro NF200 (2,34%) (figura 20). GFAP se expresaba en el 12,87% de las células, y el marcador oligodendrocítico GalC se detectó en sólo el 0,32% de las células. DCX colocalizaba con células que expresaban Map2ab (92,5%), \betatubIII (72,5%) y NF200 (5%), no con el marcador de células troncales neurales nestina, y no con células que expresaban el marcador neuronal maduro NF200, el marcador astrocítico GFAP o el marcador oligodendrocítico GalC (figura 21).
En células que expresaban EGFP después de transfección transitoria con SEQ ID NO: 7 se observó un patrón similar (figura 22, figura 23). Ninguna de las células positivas para EGFP fue inmunorreactiva para nestina ni para el marcador glial GalC, un porcentaje minoritario de células que expresaban EGFP se tiñó para el marcador glial GFAP (2,5%), el 25% de las células que expresaban EGFP eran positivas para Ki67, el 67,5% para Map2ab, el 25% para \betatubIII, el 22,5% para NF200. De forma más importante, la gran mayoría de las células que expresaban EGFP eran inmunorreactivas para DCX (82,5%) (figura 23), lo que indica que la actividad de la secuencia reguladora humana de DCX se correlaciona con la expresión génica endógena de DCX. Además de la expresión de marcadores que sugiere un fenotipo neuronal joven para las células que expresan EGFP, las células muestran una morfología característica de células neuronales jóvenes o precursoras neuronales, indicado por un soma celular pequeño y un patrón de neuritas bipolar a oligopolar (figura 22).
Las deleciones en el promotor de DCX definen las regiones requeridas para expresión y para especificidad.
El análisis de secuencia de la secuencia reguladora humana de DCX definió varias regiones importantes posibles (figura 10). Para analizar la relevancia de algunas de estas regiones, se construyeron varios mutantes de deleción y se probó su actividad en células MEF (figura 24). Según esto, la región 2 comprende una parte crítica de la secuencia reguladora (figura 25).
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Ejemplo XIV
Expresión de DCX como marcador para la diferenciación trans-neuronal
Las células del epitelio pigmentoso de la retina (RPE) de mamíferos superiores son células epiteliales completamente diferenciadas que no expresan marcadores neuronales in vivo (Zhao, Int. Rev. Cytol. 171 (1997), 225-266). Sin embargo, existe evidencia sustancial, de des- o trans-diferenciación de células RPE. In vivo, el desprendimiento retinal experimentalmente inducido causa proliferación focal de células RPE en el sitio del desprendimiento en varias especies de mamífero (Anderson, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 21 (1981), 10-16). En este sistema, las células RPE se redondean, pierden sus prolongaciones apicales y se dividen para formar una capa de tres a cuatro células de espesor. In vitro, la des- y trans-diferenciación de células RPE de mamífero está bien documentada. Los cultivos primarios de células RPE pierden sus marcadores de diferenciación tales como pigmentación y los marcadores de diferenciación RPE10 y RPE65 (Neill. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34 (1993), 453-462; Hamel, J. Neurosci. Res. 34 (1993), 414-425). La transdiferenciación neuronal se encontró en cultivos de RPE humanas mediante expresión del marcador neuronal temprano beta III-tubulina y en una población minoritaria de células RPE humanas cultivadas que expresan la enolasa específica de neuronas y el marcador neuronal neurofilamento 200 (Vinores, Exp. Eye Res. 60 (1995), 385-400). Además, el ARNm de la proteína asociada a microtúbulos específica neuronal MAP 1B se induce en células RPE humanas cultivadas (Esser, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 38 (1997), 2852-2856). Este ejemplo demuestra la expresión de DCX en la transdiferenciación de células RPE.
Se sedaron brevemente ratas Long Evans adultas y se sacrificaron por decapitación. Se retiraron los ojos en DPBS (PAN, Alemania) helado. Se disecaron los ojos primero abriendo el ojo un poco por detrás del límite de la esclerótica y el resto del ojo. Para la preparación de células troncales derivadas del cuerpo ciliar (CC), la parte frontal del ojo se cortó limpia de los tejidos circundantes, incluyendo el humor vítreo, células RPE, iris y retina neural y se digirieron trozos del cuerpo ciliar en solución PPD (papaína al 0,01% (Worthington Biochemicals, EE.UU.), dispasa II al 0,1% (Boehringer Mannheim, Alemania), DNasa I al 0,01% (Worthington Biochemicals, EE.UU.) y 149 mg de MgSO_{4}*7H_{2}O en solución de sales equilibrada de Hank sin Ca^{2+}/Mg^{2+} (PAN, Alemania) para 100 ml). Para la preparación de células RPE, se sacó la retina neural de la cúpula óptica y después se aplicó una solución de dispasa II al 2% a la cúpula. Se recogieron las cúpulas en placas de 96 pocillos y se incubaron a 37ºC durante 30 minutos. Después de eso las células RPE se lavaron suavemente desde el tejido coroide subyacente y se recogieron en PBS helado. Después de un paso de incubación de 15 minutos en solución PPD, las células se procesaron igual que las células derivadas del CC. Típicamente, se digirió el tejido de diez ojos y la solución PPD que contenía las células se trituró cada 10 minutos. Las células disociadas se recogieron mediante centrifugación (188 rcf) y se resuspendieron en 5 ml de DMEM/F12 frío. Las células se lavaron tres veces con trituración completa. Por último, las células se sembraron a 1x10^{5} célula/2 ml en medio neurobasal (NB) suplementado con B27, penicilina/estreptavidina 0,1 g/L, L-glutamina 2 mM, EGF 20 ng/ml, FGF-2 20 ng/ml y heparina 2 \mug/ml más suero fetal de ternera al 1% (SFT, PAA, Alemania). Las células se sembraron en placas de 6 pocillos (cada pocillo de 35 mm) y los cultivos se mantuvieron a 37ºC en un incubador con aire al 95%, CO_{2} al 5%. Las células individuales empezaron a formar esferas a los 2 a 3 días en cultivos y siguieron creciendo en masa y número durante las siguientes semanas. La mitad del medio se cambió cada 4 días. Para pasar las células, se recogió el medio de cultivo que contenía las esferas flotantes en un tubo de centrífuga de 15 ml y se centrifugó a 188 rcf durante 5 minutos. El precipitado se resuspendió en 200 \mul de Acutasse^{TM} y se trituró 5 veces. Adicionalmente la suspensión celular se colocó a 37ºC durante 10 minutos. Después de la disociación, las células se trituraron de nuevo, se centrifugaron a 188 rcf y se resuspendieron en medio NB/B27. Para visualizar la proliferación en estudios inmunohistoquímicos, se usó el análogo de timidina bromodesoxiuridina (BrdU). Se suplementaron células después del pase #3 con BrdU 10 \muM en NB/B27 durante 24 horas antes de sembrar en cubreobjetos de vidrio recubiertos. Durante el tiempo de diferenciación (7 días), el medio se cambió cada 3 días, pero no se añadió BrdU nueva.
Las células disociadas del margen ciliar (CC) o epitelio pigmentoso de la retina (RPE) adultos se colocaron en cultivo y se analizó su potencial proliferativo. Cuando se sembraron por primera vez después de la disociación, los cultivos estaban compuestos de células individuales, mayoritariamente pigmentadas que ocasionalmente aparecían en grupos pequeños, probablemente debido a una disociación no completa durante el proceso de preparación. Después de una fase inicial de crecimiento de aproximadamente 3-4 días, las células empezaron a formar agregados, denominados esferas. El mismo proceso se ha detectado en células troncales derivadas de adulto de otras regiones neurogénicas del sistema nervioso central, por ejemplo el hipocampo (HC) o la zona subventricular (ZSV). Las esferas crecieron en tamaño durante las siguientes 4 semanas. Las esferas crecieron por proliferación celular como se indica por la incorporación de BrdU y un análisis cuantitativo del número de células mostró que los cultivos se expandieron durante el tiempo. Además, un análisis clonal reveló que tanto las células derivadas del CC como del RPE son capaces de expandirse clonalmente en condiciones de dilución limitada y por lo tanto indica una similitud a cultivos de células troncales conocidos de por ejemplo, el HC o la ZSV. En cultivos derivados del CC, el número de células inicialmente aumentó tres veces durante las primeras dos semanas. Después, la proliferación celular cesó y el número de células alcanzó una meseta, lo que sugiere que las células generadas sobrevivieron en cultivo. El aumento en el número de células se retrasó ligeramente en células derivadas de RPE, pero básicamente mostraron la misma cinética que las células del CC y finalmente también alcanzaron una meseta con un recuento de células que no se pudo aumentar mediante cultivo más largo. Las células derivadas tanto del CC como del RPE se pudieron mantener en cultivo hasta 12 semanas (ó 6 pases) antes de un cambio en la morfología de las células indicado por una parada del crecimiento y proliferación. Las células disociadas y pasadas fácilmente volvieron a formar esferas con cinética de crecimiento similar a las esferas primarias.
Se ensayó en las células la expresión de marcadores de células troncales neurales nestina y musashi, el gen proneural Pax6, el marcador precursor neural DCX y un marcador neuronal temprano \betaIII tubulina. Se hicieron crecer células derivadas del CC y RPE en condiciones de proliferación (medio NB/B27 con EGF/FGF/heparina y SFT al 1%). Se realizó análisis de RT-PCR y mostró que estas células expresan el marcador precursor neuronal DCX (figura 26), que indica que en efecto, las células del CC y RPE adultas y completamente diferenciadas se pueden transdiferenciar a una célula neuronal. Se encontró que aproximadamente el 8% de las células eran inmunorreactivas para DCX mediante inmunotinción (figura 27). Además, se expresó \betaIII tubulina en hasta el 15% de las células (figura 27). De forma sorprendente, \betaIII tubulina se expresaba en dos tipos de células: una con aspecto epitelial plano, y una con morfología neuronal incluyendo estructura bi- o pluripolar, con prolongaciones creciendo. El doble marcaje para DCX ilustra que DCX identifica la subpoblación de \betaIII tubulina con morfología neuronal, lo que indica que en efecto DCX es un marcador para restricción neuronal y determinación/diferenciación neuronal en estas células y sugiere que DCX es un indicador fiable de diferenciación neuronal y transdiferenciación neuronal.
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Ejemplo XV
Enriquecimiento de células en transdiferenciación neuronal que expresan un gen fluorescente (EGFP) bajo la secuencia reguladora del gen humano de DCX como se describe aquí mediante separación por FACS
Se preparan células de RPE de ojos de ratones transgénicos huDCXpromoEGFP1 de fases embrionaria, posnatal y adulta, y se cultivan como se describe en el ejemplo XIV. Las células se disocian usando Accutase (PAA) y se cargan con yoduro de propidio (PI) 10 \mug/ml y se pasan a través de un colador celular de 30 micrómetros (Becton-Dickinson). Las células se analizan y separan usando un citómetro de flujo/separador celular FACS Vantage (Becton-Dickinson) equipado con software CELLQuest. Las células (2x10E6 células/ml) se analizan mediante dispersión de luz frontal y de ángulo derecho (lateral), fluorescencia de PI y fluorescencia de EGFP a través de un filtro de paso de banda de 510 \pm 20 nm, según pasan el haz con un láser iónico de argón (488 nm, 100 mW). Las células muertas se excluyen seleccionando poblaciones en la dispersión frontal y lateral, y eliminando los sucesos positivos de yoduro de propidio. Se usaron células de animales de tipo salvaje para ajustar la fluorescencia de fondo. Se acepta una tasa de falsos positivos de 0,02 \pm 0,05% para asegurar un rendimiento adecuado.
Las células viables se separan en medio NB (Gibco BRL, Alemania) suplementado con B27 (Gibco BRL, Alemania) (NB/B27), SFT al 5% (PAN, Alemania), L-glutamina 2 mM (PAN, Alemania), penicilina 100 U/ml/estreptomicina 0,1 mg/ml (PAN, Alemania) a una velocidad de 3000 sucesos/s. Las células separadas se siembran en cubreobjetos de vidrio recubiertos de poliornitina (250 \mug/ml) y laminina (5 \mug/ml) en placas de 12 pocillos a diferentes densidades celulares (de 10E5 a 10E7 células/pocillo y ml) y se hacen crecer durante dos a siete días. Las células se fijan con paraformaldehído al 4% precalentado a 37ºC tamponado con fosfato pH 7,4 (paraformaldehído al 4% peso/volumen, NaH_{2}PO_{4} 100 mM, CaCl_{2} 0,4 mM, sacarosa 50 mM) durante 30 minutos y se procesan para inmunohistoquímica. Después de 30 minutos de fijación a temperatura ambiente con paraformaldehído al 4% tamponado con fosfato, las muestras se bloquean durante un mínimo de 1 hora en tampón de gelatina de piel de pescado (Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, NaCl 0,15 M, seroalbúmina bovina al 1%, gelatina de teleósteo al 0,2% (Sigma, Alemania), Triton X-100 al 0,1%) a temperatura ambiente. Las muestras se incuban durante la noche a 4ºC con los anticuerpos primarios a las siguientes diluciones: anti-DCX C-18 de cabra (1:500, Santa Cruz Labs, Santa Cruz, EE.UU.); anti-galactocerebrósido de ratón 1:500 (Chemicon, EE.UU.); anti-GFAP de conejo 1:1000 (Dako, Dinamarca); anti-Ki67 de conejo 1:500 (Novocastra, RU); anti-nestina de conejo 1:200 (Chemicon, EE.UU.); anti-nestina de ratón 1:200 (Pharmingen International, EE.UU.); anti-\betaIII-tubulina de ratón 1:500 (clon 5G8, Promega, EE.UU.); anti-\betaIII-tubulina de ratón 1:500 (clon TUJ1, Babco, EE.UU.). Los anticuerpos secundarios conjugados a fluorocromos se diluyen 1:500 (anti-ratón o conejo de burro, Dianova, Alemania). Todas las diluciones de anticuerpo y los lavados se realizan con el tampón de gelatina de piel de pescado. La contratinción nuclear se realiza con diclorhidrato de 4'6'-diamidino-2-fenilindol hidrato a 0,25 \mug/\mul (DAPI, Sigma, Alemania). Después del último lavado, las muestras se enjuagan brevemente con PBS y se montan en portaobjetos usando Prolong (Molecular Probes, Países Bajos). En los casos donde los antígenos son sensibles a detergentes (GalC), se omite Triton X-100 del tampón de gelatina de piel de pescado.
Las células disociadas se separan en una de dos fracciones, una negativa para EGFP y una positiva para EGFP. Las células separadas se cultivan y analizan mediante inmunohistoquímica como se ha descrito anteriormente. Dos días después de la separación, la mayoría de las células de la fracción positiva para EGFP siguen expresando EGFP y la inmunotinción para DCX reveló que más del 90% de las células expresa DCX. Por el contrario, ninguna de las células de la fracción negativa para EGFP expresa DCX.
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Ejemplo XVI
Análisis por imágenes in vivo de neurogénesis adulta usando un ratón transgénico que comprende SEQ ID NO: 26 (secuencia reguladora humana de DCX - luciferasa)
El análisis por imágenes in vivo de sucesos fisiológicos mediante genes indicadores EGFP y/o luciferasa se está volviendo cada vez más interesante, ya que permite el análisis de cambios dinámicos fisiológicos y/o patofisiológicos en forma longitudinal y en tiempo real (Gambhir, Neoplasia 2 (1-2) (2000), 118-38; Wu, Mol. Ther. 4(4) (2001), 297-306). En este 
\hbox{ejemplo, se detectan cambios en el nivel de neurogénesis
adulto  in vivo   mediante medidas luminométricas.}
Se generan ratones transgénicos como en los ejemplos anteriores, pero en lugar de expresar EGFP o DsRed2, se coloca el gen de la luciferasa bajo el control de la secuencia reguladora humana de DCX como se define aquí (véase SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 27). Se usan coelenterazina (Hayward, California, EE.UU.), un sustrato para la luciferasa de renilla, y la sal de potasio de la D-luciferina de luciérnaga (Xenogen, California, EE.UU.), el sustrato para la luciferasa de luciérnaga. El sistema in vivo Imaging (IVIS, Xenogen) consiste en un cámara CCD refrigerada montada en una cámara de muestra hermética a la luz (caja oscura), un controlador de cámara, un sistema de refrigeración de la cámara y un sistema informático Windows. El ratón transgénico se coloca en la cámara de muestras montada con la cámara CCD refrigerada a -120ºC, con un campo de visión ajustado a 25 cm por encima del estante de muestra. Se mide la emisión de fotones. Se superimponen las imágenes fotográficas en escala de grises y las imágenes en color bioluminiscentes usando el software de recubrimiento LIVINGIMAGE V. 2.11 (Xenogen) y el software de análisis de imágenes IGOR (V. 4.02 A, Wave Metrics, Lage Oswego, Oregón). Se selecciona manualmente una región de interés (por ejemplo, la cabeza).
Los ratones se anestesian mediante inyección i.p. de una solución de ketamina/xilazina (4:1). A los ratones se les inyecta mediante inyección en la vena de la cola coelenterazina 0,7 mg/kg de peso corporal o D-luciferina 150 mg/kg de peso corporal y se hace un barrido con 15 barridos de 1 minuto usando la cámara CCD refrigerada.
La bioluminiscencia se detecta específicamente en las dos regiones neurogénicas, el giro dentado del hipocampo y el eje zona subventricular-canal rostramigratorio-bulbo olfatorio. Ninguna otra región del cerebro es bioluminiscente, y lo mismo el resto del cuerpo donde se realizan barridos de otras regiones del cuerpo. En la siguiente serie de experimentos, la neurogénesis en el cerebro adulto aumenta por las condiciones experimentales tales como actividad física, administración de antidepresivos y convulsiones experimentalmente inducidas. Aquí los cambios en bioluminiscencia se correlacionan con los cambios en neurogénesis descritos. Hay un claro descenso en el nivel de bioluminiscencia en el giro dentado del hipocampo con los animales de edad creciente. El descenso en la bioluminiscencia también se puede observar con el mismo animal en un estudio longitudinal. De forma similar, el aumento de la neurogénesis en el hipocampo después de convulsiones se puede detectar fácilmente mediante los niveles elevados de bioluminiscencia.
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Ejemplo XVII
Uso de ratones transgénicos huDCXpromoEGFP1 para estudiar variación en los niveles de neurogénesis
Se ha descrito que el nivel de neurogénesis en el giro dentado disminuye durante el envejecimiento (Kuhn, J. Neurosci. 6 (1996), 2027-2033). Usando los ratones transgénicos huDCXpromoEGFP1 del ejemplo IV, la cuantificación de la intensidad de la fluorescencia de EGFP en las áreas neurogénicas puede servir como indicador del nivel de neurogénesis en estas regiones.
Para el estudio del descenso en neurogénesis relacionado con la edad que se produce en el giro dentado, se anestesiaron profundamente ratones de la línea 303 de huDCXpromoEGFP1 de 1, 2 y 12 meses de edad y se perfundieron con paraformaldehído al 4% en tampón fosfato 100 mM pH 7,4. Los cerebros se disecaron, se sumergieron durante la noche en fijador y se transfirieron a sacarosa al 30%/tampón fosfato 100 mM, pH 7,4 durante 24 horas. Los cerebros se cortaron en secciones sagitales de 40 \mum usando un microtomo de deslizamiento. Las secciones se almacenaron a -20ºC en solución crioprotectora hasta su uso (glicerol al 25% v/v, etilenglicol al 25% v/v, tampón fosfato 0,05 M pH 7,4).
Para comparar la intensidad de fluorescencia entre los ratones transgénicos de diferentes edades, se pusieron las secciones en portaobjetos para el microscopio (SuperFrost Plus, Menzel-Gläser, Alemania) y se montaron usando Fluoromount-G (Southern Biotechnology Associates, Inc., EE.UU.). La señal de fluorescencia se registró usando un microscopio Leica (Leica Mikroskopie und Systeme GmbH, Wetzlar, Alemania) equipado con una cámara digital y software Spot^{TM} (Diagnostic Instrument, Inc., Sterling Heights, EE.UU.). La intensidad de fluorescencia se cuantificó midiendo el valor gris medio de los pixeles en el área de células granulares del giro dentado usando el software ImageJ (Image J 1.29, Institutos Nacionales de Salud, EE.UU.). El nivel de fluorescencia observado en la corteza del animal de un mes se usó como nivel de fluorescencia de fondo y se restó de los valores grises medios calculados para los giros dentados. La figura 30 (paneles A a C) documenta los niveles de fluorescencia detectados en el giro dentado de los ratones transgénicos de la línea 303 de huDCXpromoEGFP1 jóvenes frente a viejos. Las adquisiciones de las fotos se realizaron usando la misma iluminación, tiempo de exposición y posprocesamiento de imágenes para todos los ratones transgénicos, lo que permite, por lo tanto, la comparación directa. La figura 30 documenta un descenso significativo en el nivel de fluorescencia de EGFP detectada en el giro dentado de ratones transgénicos viejos comprados con los niveles observados en los ratones transgénicos jóvenes, confirmando de esta manera que el uso de los ratones transgénicos huDCXpromoEGFP1 proporciona un medio eficaz para seguir la variación en los niveles de neurogénesis entre individuos. La figura 30F presenta el resultado de la cuantificación realizada usando ImageJ en el giro dentado de cuatro ratones, es decir, los tres presentados en la figura 30A-C y un cuarto animal de 2 meses de edad. Para cada animal, se cuantificaron 4 secciones que contenían un segmento del giro dentado para generar una media y una desviación estándar. La cuantificación demuestra que la reducción de la neurogénesis observada durante el envejecimiento está acompañada por una reducción en la señal de fluorescencia de EGFP como función del envejecimiento, es decir 1 mes > 2 meses > 12 meses. Además, la comparación de dos ratones de 2 meses de edad demuestra que la variación interindividual es mínima.
Se ha descrito que las convulsiones epilépticas provocan un aumento del nivel de neurogénesis en el giro dentado (Parent, J. Neurosci. 17 (1997), 3727-3738). Usando ratones transgénicos huDCXpromoEGFP1, la comparación de las intensidades de fluorescencia de EGFP en el giro dentado de animales control y animales en los se indujeron experimentalmente convulsiones epilépticas permite la medida de la variación en neurogénesis.
Para este fin, ratones transgénicos huDCXpromoEGFP1 de tres meses de edad recibieron 1 mg de escopolamina por kilogramo de peso corporal i.p. (Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU.). Veinte minutos después, a estos animales se les inyecto 340 mg de pilocarpina por kilogramo de peso corporal i.p. (Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU.). La actividad de las convulsiones se siguió conductualmente, y después de 120 minutos, las convulsiones se terminaron usando 10 mg de diazepan por kilogramo de peso corporal i.p. (Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU.). Sólo los ratones que mostraron actividad convulsiva continua después del tratamiento con pilocarpina se usaron en este experimento. Los ratones control recibieron inyecciones de solución salina en lugar de la escopolamina y pilocarpina, pero sin embargo recibieron inyecciones de diazepam. Todos los animales recibieron comida y agua ad libitum. Los animales se procesaron para análisis histológico 7 días después de la inducción de las convulsiones. Los animales se anestesiaron profundamente y se perfundieron con paraformaldehído al 4% en tampón fosfato 100 mM pH 7,4. Los cerebros se disecaron, se sumergieron durante la noche en fijador y se transfirieron a sacarosa al 30%/tampón fosfato 100 mM, pH 7,4 durante 24 horas. Los cerebros se cortaron en secciones sagitales de 40 \mum usando un microtomo de deslizamiento. Las secciones se almacenaron a -20ºC en solución crioprotectora hasta su uso (glicerol al 25% v/v, etilenglicol al 25% v/v, tampón fosfato 0,05 M pH 7,4).
Para comparación de la intensidad de fluorescencia entre los ratones transgénicos, se pusieron las secciones de animales de la misma edad en portaobjetos para el microscopio (SuperFrost Plus, Menzel-Gläser, Alemania) y se montaron usando Fluoromount-G (Southern Biotechnology Associates, Inc., EE.UU.). La señal de fluorescencia se registró usando un microscopio Leica (Leica Mikroskopie und Systeme GmbH, Wetzlar, Alemania) equipado con una cámara digital y software Spot^{TM} (Diagnostic Instrument, Inc., Sterling Heights, EE.UU.). La intensidad de fluorescencia se cuantificó midiendo el valor gris medio de los pixeles en el área de células granulares del giro dentado usando el software ImageJ (Image J 1.29, Institutos Nacionales de Salud, EE.UU.). El nivel de fluorescencia observado en la corteza del animal control se usó como nivel de fluorescencia de fondo y se restó de los valores grises medios calculados para los giros dentados. La figura 30D-E documenta un aumento en el nivel de fluorescencia de EGFP detectado en el giro dentado de ratones transgénicos en los que se habían inducido convulsiones epilépticas experimentalmente comparado con el nivel observado en los ratones transgénicos controles, confirmando que el uso de los ratones transgénicos huDCXpromoEGFP1 proporciona un medio eficaz para seguir la variación en los niveles de neurogénesis entre individuos. La figura 30F presenta el resultado de la cuantificación realizada usando ImageJ en el giro dentado del ratón control y uno en que las convulsiones se habían inducido experimentalmente. Para cada animal, se cuantificaron 4 secciones que contenían un segmento del giro dentado para generar una media y una desviación estándar. La cuantificación (figura 30F) demuestra que el aumento en la neurogénesis que se produce en el animal en el que se han inducido convulsiones experimentalmente está acompañado por un aumento de la señal de fluorescencia de EGFP. Por lo tanto, la cuantificación de la señal de fluorescencia en los ratones transgénicos huDCXpromoEGFP1 se puede emplear fácilmente para cuantificar la modulación en neurogénesis.
<110> Klinikum de la Universidad de Ratisbona
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<120> Secuencias reguladoras para la expresión específica en células determinadas de manera neuronal y usos de las mismas
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<130> G3041 PCT S3
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<160> 28
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<170> PatentIn versión 3.1
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<210> 1
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<211> 3509
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<212> ADN
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<213> homo sapiens 
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<400> 1
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3 
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5 
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<210> 2
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<211> 2881
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<212> ADN
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<213> mus musculus 
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<400> 2
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6 
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7 
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<210> 3
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<211> 2344
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<212> ADN
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<213> homo sapiens 
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<400> 3
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8 
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9 
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<210> 4
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<211> 2353
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<212> ADN
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<213> mus musculus 
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<400> 4
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10 
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11 
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<210> 5
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<211> 4532
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> construcción de fusión homo sapiens y EGFP
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 4488
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> construcción de fusión homo sapiens y DsRed2
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 7660
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> construcción de fusión homo sapiens y EGFP
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<400> 7
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<210> 8
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<223> construcción de fusión homo sapiens y DsRed2
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28 
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<210> 9
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<400> 9
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29 
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<210> 10
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> homo sapiens 
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<400> 10
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30 
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<210> 11
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> aequorea victoria 
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<400> 11
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<210> 12
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> derivada de EGFP
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<400> 12
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<210> 13
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> derivada de la construcción comprendida en DSM 15111
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<400> 13
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33 
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<210> 14
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> derivada de la construcción comprendida en DSM 15111
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
34 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1910
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
35 
\hskip0,8cm
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3103
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
37 
\hskip0,8cm
38 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2906
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
39 
\hskip0,8cm
40 
\hskip0,8cm
41 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2127
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
42 
\hskip0,8cm
43 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1315
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
44 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6036
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción de fusión homo sapiens y EGFP
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
45 
\hskip0,8cm
46 
\hskip0,8cm
47 
\hskip0,8cm
48 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7238
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción de fusión homo sapiens y EGFP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
49 
\hskip0,8cm
50 
\hskip0,8cm
51 
\hskip0,8cm
52 
\hskip0,8cm
53 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7057
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción de fusión homo sapiens y EGFP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
54 
\hskip0,8cm
55 
\hskip0,8cm
56 
\hskip0,8cm
57 
\hskip0,8cm
58 
\hskip0,8cm
59 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6278
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción de fusión homo sapiens y EGFP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
60 
\hskip0,8cm
61 
\hskip0,8cm
62 
\hskip0,8cm
63 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6495
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción de fusión homo sapiens y EGFP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
64 
\hskip0,8cm
65 
\hskip0,8cm
66 
\hskip0,8cm
67 
\hskip0,8cm
68 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5466
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción de fusión homo sapiens y EGFP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
69 
\hskip0,8cm
70 
\hskip0,8cm
71 
\hskip0,8cm
72 
\hskip0,8cm
73 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5468
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción de fusión homo sapiens y luciferasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
74 
\hskip0,8cm
75 
\hskip0,8cm
76 
\hskip0,8cm
77 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8307
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción de fusión homo sapiens y luciferasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
78 
\hskip0,8cm
79 
\hskip0,8cm
80 
\hskip0,8cm
81 
\hskip0,8cm
82 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2344
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\hskip0,8cm
83 
\hskip0,8cm
84

Claims (55)

1. Uso de una secuencia reguladora seleccionada del grupo que consiste en
(a)
secuencias reguladoras que comprenden la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1, mostrada en SEQ ID NO: 2, mostrada en SEQ ID NO: 3 o mostrada en SEQ ID NO: 4;
(b)
secuencias reguladoras que comprenden la secuencia de nucleótidos contenida en la inserción del clon DSM 15111 y obtenible mediante amplificación usando dos oligonucleótidos que tienen las secuencias indicadas en SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10;
(c)
secuencias reguladoras que comprenden al menos una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 de la posición 1166 a 1746, de la posición 1166 a 2049, de la posición 1785 a 1843 o de la posición 1953 a 2775;
(d)
secuencias reguladoras que comprenden al menos una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 de la posición 529 a 1079, de la posición 529 a 1390, de la posición 1118 a 1175 o de la posición 1291 a 2137;
(e)
secuencias reguladoras que comprenden al menos una parte funcional de una secuencia de (a) a (d) en donde dicha parte funcional produce expresión específica en células determinadas neuronales proliferativas;
(f)
secuencias reguladoras que producen expresión específica en células determinadas neuronales proliferativas que comprenden una secuencia de nucleótidos que es al menos el 75% idéntica a una secuencia definida en (a) a (d) o que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos el 78% idéntica a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1 de la posición 1166 a 1746 o de la posición 1166 a 2049 o a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 2 de la posición 529 a 1079 o de la posición 529 a 1390, que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos el 82% idéntica a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1 de la posición 1785 a 1843 o a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 2 de la posición 1118 a 1175 o que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos el 75% idéntica a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1 de la posición 1953 a 2775 o a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 2 de la posición 1291 a 2137; y
(g)
secuencias reguladoras que comprenden una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas de hibridación con una hebra complementaria de la secuencia reguladora definida en (a) a (f) y que produce expresión específica en células determinadas neuronales proliferativas,
para la expresión temprana, transitoria de un secuencia de nucleótidos heteróloga en células determinadas neuronales siempre que no se modifique la identidad genética de la línea germinal de seres humanos y en donde dichas células no son células troncales embrionarias humanas.
2. El uso de la reivindicación 1, en donde dicha secuencia reguladora es de origen humano, de ratón o rata.
3. El uso de la reivindicación 1 ó 2, en donde dicha secuencia reguladora está comprendida en una molécula recombinante de ácido nucleico.
4. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha secuencia heteróloga de nucleótidos a ser expresada es un gen seleccionado del grupo que consiste en un gen marcador, un gen receptor, un gen anti-apoptótico, un gen de determinación/diferenciación, un gen capaz de inducir y/o dirigir migración u orientación neuronal, un gen que codifica una etiqueta, un gen que codifica un factor trófico, un gen que codifica una proteína de superficie, un gen que codifica un factor de transcripción o una gen que codifica una enzima, o en donde dicha secuencia de nucleótidos a ser expresada es una secuencia antisentido o codifica una ribozima o una molécula de ARN inhibidora.
5. El uso de la reivindicación 4, en donde dicho gen marcador o receptor se selecciona del grupo que consiste en GFP, EGFP, RFP, CFP, BFP, YFP, DsRed, \beta-galactosidasa, luciferasa o cloranfenicol acetiltransferasa.
6. El uso de la reivindicación 4, en donde dicho gen que codifica una etiqueta se selecciona del grupo que consiste en etiqueta His, glutatión, etiqueta Strep, etiqueta flag, CBP, TAG-100, etiqueta E2 y etiqueta Z.
7. El uso de la reivindicación 4, en donde dicho gen que codifica una proteína de superficie es CD24.
8. El uso de la reivindicación 4, en donde dicho gen que codifica un factor trófico se selecciona del grupo que consiste en NGF, BDNF, PDGF, NT-3, NT-4, NT-5, VEGF, PEDF, EGF, FGF, IGF, cardiotrofina, eritropoyetina, leptina, LIF y TGF.
9. El uso de la reivindicación 4, en donde dicho gen antiapoptótico se selecciona del grupo que consiste en bcl-2, Brn-3a, PTEN y (una) anticaspasa(s).
10. El uso de la reivindicación 4, en donde dicho gen de determinación/diferenciación es el factor de determinación dopaminérgico Nurr1.
11. El uso de la reivindicación 4, en donde dicho gen capaz de inducir y/o dirigir migración u orientación neuronal se selecciona del grupo que consiste en netrina, neuropilina, CXCR4, SDF-1, DCC, slit, robo, una semaforina, un miembro de la familia plexina y un miembro de la familia efrina.
12. El uso de la reivindicación 4, en donde dicho gen que codifica un factor de transcripción se selecciona del grupo que consiste en NeuroD, BMP4, Nurr1 o ShcC.
13. El uso de la reivindicación 4, en donde dicho gen que codifica una enzima es CRE.
14. El uso de la reivindicación 4, en donde dicha secuencia heteróloga de nucleótidos a ser expresada es una secuencia antisentido o codifica una ribozima o una molécula de ARN inhibidora.
15. El uso de la reivindicación 4 ó 14, en donde dicho ARN inhibidor se selecciona del grupo que consiste en ARNi, ARNip, ARNhc y ARNtp.
16. El uso de un vector que comprende la secuencia reguladora o la molécula recombinante de ácido nucleico definida en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para la expresión específica, temprana transitoria de una secuencia heteróloga de nucleótidos en células determinadas neuronales proliferativas siempre que no se modifique la identidad genética de la línea germinal de seres humanos y en donde dichas células no son células troncales embrionarias humanas.
17. El uso de la reivindicación 16, en donde dicho vector es un vector de expresión génica.
18. El uso de la reivindicación 16 ó 17, en donde dicho vector es un vector que expresa un gen marcador o indi-
cador.
19. El uso de la reivindicación 18, en donde dicho gen marcador o receptor es GFP, EGFP, RFP, CFP, BFP, YFP, DsRed, \beta-galactosidasa, luciferasa o cloranfenicol acetiltransferasa.
20. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, en donde dicho vector comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en
(a)
una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 5, 6 ó 26 o mostrada en SEQ ID NO: 7, 8 ó 27;
(b)
una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia reguladora y el gen heterólogo como se comprende en la construcción depositada con el número de acceso DSM 15111; y
(c)
una secuencia de nucleótidos que es al menos el 80% idéntica a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NOS: 5 a 8, 26 ó 27 y que comprende una secuencia reguladora de la reivindicación 1 ó 2.
21. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, en donde dicho vector es un virus.
22. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 16, 17 ó 20, en donde dicho vector es adecuado para terapia génica o vacunación con una molécula de ácido nucleico.
23. El uso de la secuencia reguladora o la molécula recombinante de ácido nucleico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o del vector como se define en cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22 para la generación de una célula huésped genéticamente modificada, siempre que no se modifique la identidad genética de la línea germinal de seres humanos y en donde dicha célula huésped no es una célula troncal embrionaria humana.
24. El uso de la reivindicación 23, en donde dicha célula es una célula neuronal, una célula ES no humana, una célula germinal no humana, un línea celular cultivada o una célula primaria.
25. El uso de las reivindicaciones 23 ó 24, en donde dicha célula huésped es de origen mamífero.
26. Un método para preparar una célula huésped genéticamente modificada, caracterizado en que la célula huésped se transfecta con una molécula de ácido nucleico que es o que comprende la secuencia reguladora o la molécula recombinante de ácido nucleico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o el vector como se define en cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22, siempre que no se modifique la identidad genética de la línea germinal de seres humanos y en donde dicha célula huésped no es una célula troncal embrionaria humana.
27. Un método para la generación de un animal transgénico no humano que comprende el paso de introducir una secuencia reguladora como se define en la reivindicación 1 ó 2 o una molécula recombinante de ácido nucleico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 15 en una célula ES o una célula germinal.
28. Un animal transgénico no humano que comprende células huésped como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 23 a 24, o que comprende en sus células al menos una copia adicional de la secuencia reguladora como se define en la reivindicación 1 ó 2 o que comprende en sus células una molécula recombinante de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 15.
29. El animal transgénico no humano de la reivindicación 28 que comprende en sus células una molécula recombinante de ácido nucleico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 15.
30. El animal transgénico de la reivindicación 29, en donde dicho animal transgénico es un ratón o una rata.
31. El animal transgénico no humano de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30 que comprende en sus células una molécula recombinante de ácido nucleico que comprende la secuencia reguladora como se define en la reivindicación 1 ó 2 y además una secuencia de nucleótidos bajo el control de dicha secuencia reguladora que codifica GFP, EGFP, RFP, BFP, YFP, \beta-galactosidasa, cloranfenicol acetiltransferasa o luciferasa.
32. Una célula huésped genéticamente modificada, caracterizada en que la célula huésped se transfecta con una molécula de ácido nucleico que es o que comprende la secuencia reguladora a la molécula recombinante de ácido nucleico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o el vector como se define en cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22, siempre que no se modifique la identidad genética de la línea germinal de seres humanos y en donde dicha célula huésped no es una célula troncal embrionaria humana.
33. Una composición que comprende la secuencia reguladora como se define en la reivindicación 1 ó 2, la molécula recombinante de ácido nucleico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 15 o el vector como se define en cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22 o una célula huésped genéticamente modificada como se define en cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25 ó 32.
34. La composición de la reivindicación 33, que es una composición farmacéutica, que opcionalmente comprende un soporte o diluyente farmacéuticamente aceptable.
35. La composición de la reivindicación 33, que es una composición diagnóstica, que además comprende opcionalmente medios adecuados de detección.
36. Kit que comprende la secuencia reguladora como se define en la reivindicación 1 ó 2, la molécula recombinante de ácido nucleico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 15 o el vector como se define en cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22 o una célula huésped genéticamente modificada como se define en cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25 ó 32.
37. Uso de una molécula recombinante de ácido nucleico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 15, de un vector como se define en cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22 o una célula huésped genéticamente modificada como se define en cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25 ó 32 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno o enfermedad neurológicos o para la potenciación de las capacidades de aprendizaje y/o memoria.
38. El uso de la reivindicación 37, en donde dicho trastorno o enfermedad neurológica es una enfermedad neurodegenerativa, una lesión del SNC o SNP, hipoxia, isquemia, epilepsia, ictus, traumatismo del SNC, un trastorno neurooftalmológico, un trastorno psiquiátrico, un trastorno tumoral del sistema nervioso, un trastorno neural causado por una agresión toxicológica, una pérdida o daño neurológico relacionado con la edad, o es un trastorno neurológico causado por un malformación del desarrollo, una malformación cerebral o un trastorno de migración neuronal.
39. El uso de la reivindicación 38, en donde la enfermedad neurodegenerativa es enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, ELA, enfermedad de Huntington, enfermedad de Creutzfeld-Jacobs o demencia por VIH.
40. Uso de una molécula recombinante de ácido nucleico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 15 o un vector como se define en cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22 para la preparación de una composición de diagnóstico para la detección de (una) célula(s) determinada(s) neuronal(es).
41. Uso de una molécula recombinante de ácido nucleico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 15 o un vector como se define en cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22 o una célula huésped genéticamente modificada como se define en cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25 ó 32 para la preparación de una composición de diagnóstico para la detección y/o aislamiento de (una) célula(s) determinada(s) neuronal(es) prolifera-
tiva(s).
\newpage
42. Un método in vitro para la detección de (una) célula(s) determinada(s) neuronal(es) proliferativa(s) que comprende los pasos de
(a)
expresar en una pluralidad de células una molécula recombinante de ácido nucleico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 15 o un vector como se define en cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22;
(b)
seleccionar las células que expresan una secuencia heteróloga de nucleótidos bajo el control de la secuencia reguladora como se define en la reivindicación 1 ó 2,
siempre que no se modifique la identidad genética de la línea germinal de seres humanos y en donde dicha célula no sea una célula troncal embrionaria humana.
43. El método de la reivindicación 42, que comprende en el paso (b) la detección de un gen marcador o indicador heterólogo expresado.
44. El método de la reivindicación 42 ó 43 que comprende la detección de un marcador o indicador fluorescente o una enzima expresada.
45. El método de cualquiera de las reivindicaciones 42 a 44, que comprende análisis por FACS, análisis por MACS o aislamiento de afinidad.
46. Un método in vitro para la detección de (una) célula(s) determinada(s) neuronal(es) proliferativa(s) que comprende el paso de seleccionar en una pluralidad de células la(s) célula(s) que comprende(n) una secuencia reguladora activada como se define en la reivindicación 1 ó 2, siempre que no se modifique la identidad genética de la línea germinal de seres humanos y en donde dicha célula no sea una célula troncal embrionaria humana.
47. Un método para el aislamiento de (una) célula(s) determinada(s) neuronal(es) proliferativa(s) que comprende los pasos de detección según cualquiera de las reivindicaciones 42 a 46 y un paso adicional de separar la(s) células que expresa(n) una secuencia heteróloga de nucleótidos bajo el control de la secuencia reguladora como se define en la reivindicación 1 ó 2 de (una) célula(s) que no es/son capaz/capaces de expresar dicha secuencia heteróloga de nucleótidos o que comprende un paso adicional de separar (una) célula(s) que comprende(n) una secuencia reguladora activada como se define en la reivindicación 1 ó 2, siempre que no se modifique la identidad genética de la línea germinal de seres humanos y en donde dicha célula no sea una célula troncal embrionaria humana.
48. Una célula determinada neuronal proliferativa aislada o un preparación enriquecida o purificada de células determinadas neuronales proliferativas aisladas y la progenie de las mismas detectadas y/o aisladas mediante el método de cualquiera de las reivindicaciones 42 a 47, en donde dichas células o progenie de las misma expresan una secuencia heteróloga de nucleótidos bajo el control de la secuencia reguladora como se define en la reivindicación 1 ó 2.
49. Uso de (una) célula(s) determinada(s) neuronal(es) proliferativa(s) detectada(s) mediante el método de cualquiera de las reivindicaciones 42 a 45, o de (una) célula(s) determinada(s) neuronal(es) proliferativa(s) aislada(s) mediante el método de la reivindicación 47, en donde dicha célula o progenie de la misma expresa una secuencia heteróloga de nucleótidos bajo el control de la secuencia reguladora como se define en la reivindicación 1 ó 2, o de una célula determinada neuronal proliferativa aislada o una preparación enriquecida o purificada de células determinadas neuronales aisladas y progenie de las mismas de la reivindicación 48 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno o enfermedad neurológica.
50. Uso de (una) célula(s) determinada(s) neuronal(es) proliferativa(s) detectada(s) mediante el método de cualquiera de las reivindicaciones 42 a 45, o de (una) célula(s) determinada(s) neuronal(es) proliferativa(s) aislada(s) mediante el método de la reivindicación 47, en donde dicha célula o progenie de la misma expresa una secuencia heteróloga de nucleótidos bajo el control de la secuencia reguladora como se define en la reivindicación 1 ó 2, o de una célula determinada neuronal proliferativa aislada o una preparación enriquecida o purificada de células determinadas neuronales aisladas y progenie de las mismas de la reivindicación 48 para la preparación de una composición de cribado para ensayos in vitro empleados en probar las propiedades neurogénicas de (un) compuesto(s).
51. Uso de una molécula recombinante de ácido nucleico definida en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 15, o de un vector definido en cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22 para determinar el grado de maduración de una célula neuronal.
52. Uso de una molécula recombinante de ácido nucleico definida en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 15, o de un vector definido en cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22, o de una célula huésped genéticamente modificada definida en cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25 ó 32, de un animal transgénico no humano de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31 o generado mediante el método de la reivindicación 27, o de (una) célula(s) determinada(s) neuronal(es) proliferativa(s) aislada(s) mediante el método de la reivindicación 47, en donde dicha célula o progenie de la misma expresa una secuencia heteróloga de nucleótidos bajo el control de la secuencia reguladora como se define en la reivindicación 1 ó 2, o de una célula determinada neuronal proliferativa aislada o una preparación enriquecida o purificada de células determinadas neuronales aisladas y progenie de las mismas de la reivindicación 48 para identificar y/o aislar factores y/o compuestos capaces de regular la actividad de células troncales neurales, neurogénesis y/o diferenciación neuronal.
53. Uso de una molécula recombinante de ácido nucleico definida en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 15, o de un vector definido en cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22, o de una células huésped genéticamente modificada definida en cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25 ó 32, de un animal transgénico no humano de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31 o generado mediante el método de la reivindicación 27 o de (una) célula(s) determinada(s) neuronal(es) proliferativa(s) aislada(s) mediante el método de la reivindicación 47, en donde dicha célula o progenie de la misma expresa una secuencia heteróloga de nucleótidos bajo el control de la secuencia reguladora como se define en la reivindicación 1 ó 2, o de una célula determinada neuronal proliferativa aislada o una preparación enriquecida o purificada de células determinadas neuronales aisladas y progenie de las mismas de la reivindicación 48 para el seguimiento in vitro de neuronas recién generadas, de células determinadas neuronales trasplantadas o de células determinadas neuronales en migración.
54. Uso de una molécula recombinante de ácido nucleico definida en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 15, de un vector definido en cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22 o de una célula huésped genéticamente modificada definida en cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25 ó 32 para la generación de una animal transgénico no humano.
55. Un método de cribado de compuestos capaces de regular la actividad de células troncales neurales, neurogénesis y/o diferenciación neuronal que comprende los pasos de:
(a)
poner en contacto una molécula recombinante de ácido nucleico definida en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 15, un vector definido en cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22, una célula huésped genéticamente modificada definida en cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25 ó 32, o un animal transgénico no humano de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31 o poner en contacto (una) célula(s) determinada(s) neuronal(es) proliferativa(s) aislada(s) mediante el método de la reivindicación 47, en donde dicha célula o progenie de la misma expresa una secuencia heteróloga de nucleótidos bajo el control de la secuencia reguladora como se define en la reivindicación 1 ó 2, o una célula determinada neuronal proliferativa aislada o una preparación enriquecida o purificada de células determinadas neuronales aisladas y progenie de las mismas de la reivindicación 48 con (un) compuesto(s) que se sospecha que interacciona(n) directa o indirectamente con la secuencia reguladora definida en la reivindicación 1 ó 2;
(b)
detectar si dicho(s) compuesto(s) es capaz/son capaces de interaccionar con dicha secuencia reguladora.
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