ES2335133T3 - Procedimiento de fermentacion para la produccion de toxina de la difteria. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de fermentación que comprende una etapa de fermentación de crecimiento de una cepa de Corynebacterium diphtheria en un medio en un fermentador en condiciones de agitación suficiente para mantener un cultivo homogéneo y aireación limitada de manera que la pO2 dentro del cultivo descienda a menos del 4% para la mayoría de la etapa de fermentación en el que la etapa de fermentación tiene lugar en a) un fermentador de 100 a 250 litros a un KLa de 30 a 60 h-1 o b) en un fermentador de 250 a 800 litros a un KLa de 60-150 h-1.
Description
Procedimiento de fermentación para la producción
de toxina de la difteria.
La presente invención se refiere al campo de los
antígenos de la difteria, en particular toxinas (incluyendo formas
mutantes de toxina de la difteria, como CRM197) y al procedimiento
de fermentación para la fabricación de cultivos en volumen de
dichos antígenos.
La toxina de la difteria es una exotoxina de
proteínas producida por la bacteria Corynebacterium
diphtheria. Se produce como un polipéptido único que se divide
fácilmente para formar dos subunidades ligadas por un enlace de
disulfuro, Fragmento A y Fragmento B, como consecuencia de la
escisión en el residuo 190, 192 ó 193 (Moskaug y col., Biol. Chem.
264: 15709-15713, 1989). El Fragmento A es la parte
catalíticamente activa y es una
ADP-ribosiltransferasa dependiente de NAD que se
dirige específicamente al factor de síntesis de proteínas
EF-2, inactivando con ello EF-2 e
impidiendo la síntesis de proteínas en una célula.
La inmunidad a una toxina bacteriana como la
toxina de la difteria puede adquirirse naturalmente durante el
curso de una infección, o artificialmente por inyección de una forma
destoxificada de la toxina (toxoide) (Germanier, er, Bacterial
Vaccines, Academic Press, Orlando, Fl., 1984). Los toxoides se han
preparado tradicionalmente mediante modificación química de toxinas
nativas (Lingood y col., Brit. J. Exp. Path. 44; 177, 1963),
haciéndolos no tóxicos a la vez que se conserva la antigenicidad
que protege al animal vacunado contra provocación posterior por la
toxina natural. Alternativamente, se han descrito varias toxinas de
la difteria mutadas que tienen toxicidad reducida (documentos
US-4.709.017, US-4.950.740).
CRM197 es una forma no tóxica de la toxina de la
difteria pero que es inmunológicamene indistinguible de la toxina
de la difteria. CRM197 es producida por C. diphtheriae
infectada por la fase no toxígena \beta197tox- creada por
mutagénesis de nitrosoguanidina del corynefago toxígeno b (Uchida y
col., Nature New Biology (1971) 233; 8-11). La
proteína CRM197 tiene el mismo peso molecular que la toxina de la
difteria pero difiere de ella por un único cambio de base en el gen
estructural. Esto conduce a un cambio de glicina por glutamina de
aminoácido en posición 52 que hace el fragmento A incapaz de unirse
a NAD y por tanto no tóxico (Pappenheimer 1977, Ann Rev, Biochem.
46; 69-94, Rappuoli Applied and Environmental
Microbiology Sept 1983 pág. 560-564).
El toxoide de la difteria y una forma mutante
con toxicidad reducida, CRM197, son componentes de muchas vacunas
para proporcionar inmunidad contra Corynebacterium
diphtheriae. Se conocen varias vacunas de combinación que
pueden prevenir Bordetella pertussis, Clostridium tetani,
Corynebacterium diphtheriae y opcionalmente virus de
Hepatitis B y/o Haemophilus influenzae tipo b (véanse, por
ejemplo, los documentos WO-93/24.148 y
WO-97/00.697, W0-02/055.105).
También se han usado toxina de la difteria y
formas mutantes que incluyen CRM197 en vacunas como vehículos
seguros y eficaces dependientes de células T para sacáridos. CRM197
se usa en la actualidad en la vacuna conjugada CRM197 de
oligosacárido de Haemophilus influenzae tipo b (HibTitre®;
Lederle Praxis Biologicals, Rochester, N.Y.).
Los procedimientos para preparar toxoide de
difteria (TD) son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, TD
puede producirse por purificación de la toxina a partir de un
cultivo de Corynebacterium diphtheriae seguido de
destoxificación química, o puede prepararse por purificación de un
análogo recombinante, o destoxificado genéticamente de la toxina
(por ejemplo, CRM197, u otros mutantes según se describe en los
documentos US-4.709.017,
US-5.843.711, US-5.601.827 y
US-5.917.017). Corynebacterium diphtheriae se
cultiva en condiciones aerobias. Rappuoli y col. (Biotechnology
febrero 1985, pág. 161-163) sugieren que la pO2 debe
regularse al 25% mediante aireación con una mezcla de aire y
oxígeno que se regula automáticamente para mantener la pO2
deseada.
La producción de cantidades importantes de
toxinas de la difteria como CRM197 para su uso en vacunas se ha
visto obstaculizada debido a la baja abundancia de proteínas. Este
problema se ha abordado previamente mediante la introducción de
copias adicionales de un gen que codifica la toxina de la difteria o
una forma mutante en Corynebacterium diphtheriae (documentos
US-4.925.792; US-5.614.382). Dichos
procedimientos conducen a un aumento en la producción de
aproximadamente el triple. Los procedimientos de mejora adicional de
rendimientos de toxina de la difteria en una forma reproducible
serían beneficiosos para permitir niveles más altos de producción
de estos valiosos antígenos.
En consecuencia, la presente solicitud
proporciona un procedimiento de fermentación mejorado que comprende
una etapa de fermentación de cultivo de una cepa de
Corynebacterium diphtheria en medio en un fermentador en
condiciones de agitación suficiente para mantener un cultivo
homogéneo y aireación limitada de manera que la pO2 dentro del
cultivo descienda a menos del 4% para la mayoría de la etapa de
fermentación.
La fermentación tiene lugar en condiciones
aerobias, aunque de aireación limitada, de manera que se usa oxígeno
hasta que entra en el cultivo durante la mayoría de la
fermentación, es decir, después de la fase inicial en la que la
densidad de C. diphtheriae es relativamente baja y los
niveles de pO2 pueden ser más altos. Los autores de la invención
encontraron que el cultivo en dichas condiciones produce una
expresión más eficaz y/o consistente de toxina de la difteria o
mutante en comparación con los procedimientos de fermentación
efectuados a pO2 más alta. El procedimiento de la invención es más
sólido que la fermentación a niveles más altos de oxígeno, y
permite rendimientos de toxina de la difteria que se mantienen altos
incluso cuando el medio de cultivo contiene hierro añadido o cuando
se usan materias primas complejas de calidad variable.
En un segundo aspecto de la invención, se
proporciona un procedimiento para fabricar una preparación de toxina
de la difteria o mutante de la misma que comprende efectuar el
procedimiento de fermentación de la invención y aislar la toxina de
la difteria o mutante de la misma del cultivo. Aunque la toxina de
la difteria y los mutantes se describen en la presente memoria
descriptiva, se plantea que puede aislarse cualquier antígeno de
C. diphtheríae usando el procedimiento de la invención.
El uso de dicho procedimiento produce
rendimientos más elevados de toxina de la difteria o mutante, por
ejemplo CRM197, en comparación con cuando se mantiene la pO2 al 5%
o superior, por ejemplo el 20%.
En un aspecto adicional de la invención se
proporciona un uso de la toxina de la difteria o mutante de la
misma de la invención en la preparación de un medicamento para el
tratamiento o prevención de enfermedad bacteriana, en particular
enfermedad por C. diphtheriae.
En un aspecto adicional de la invención se
proporciona un procedimiento para prevenir o tratar infección
bacteriana, en particular infección por C. diphtheriae que
comprende la administración de la composición farmacéutica de la
invención a un paciente.
Fig. 1 Gráficos que muestran el perfil de
oxigenación y su uso para determinar el KLa de una fermentación. El
cuadro A muestra el curso temporal de la oxigenación después de un
cambio de nitrógeno a aire. El cuadro B muestra una representación
de ln(100-pO2) con respecto al tiempo que
permite la evaluación de KLa mediante la determinación del
gradiente de la línea.
Fig. 2 Visión general de un procedimiento de
fermentación para C. diphtheriae.
Fig. 3 Gráfico que muestra la cinética típica de
crecimiento de un cultivo de C. diphtheriae. La línea con
marcadores circulares muestra la DO a 650 nm después de varios
tiempos de cultivo. La línea marcada con rombos muestra el pH del
cultivo.
Fig. 4 Geles SDS-PAGE de
sobrenadantes de cultivo. Trayectoria 1 - marcadores de peso
molecular, trayectoria 2-1 \mug de CRM197
estándar, trayectoria 3-0,5 \mug de CRM197
estándar, trayectoria 4-0,25 \mug de CRM197
estándar, trayectorias 5-11, sobrenadantes de
fermentaciones de C. diphtheriae. El Gel A muestra los
sobrenadantes de CDT082 en trayectoria 5, CDT198 en trayectorias
6-8 (el sobrenadante se retiró a 22,5 horas para
trayectoria 6, 24 horas para trayectoria 7 y 28 horas para
trayectoria 8), CDT199 en trayectorias 9, 10 y 11 (el sobrenadante
se retiró a 22 horas 45 minutos en trayectoria 9, 24 horas 45
minutos en trayectoria 10 y después de posterior microfiltración y
filtración en trayectoria 11). El Gel B muestra sobrenadantes de
CDT082 en trayectoria 5, de CDT205 en trayectorias
6-9 (trayectoria 7 después de 21 horas 43 min de
fermentación, trayectoria 8 después de 23 horas de fermentación,
trayectoria 9 después de 24 horas de fermentación) y de CDT206 en
trayectorias 10-13 (trayectoria 10 después de 22
horas 10 min de fermentación, trayectoria 11 después de 23 horas 49
minutos de fermentación, trayectoria 12 después de 24 horas 30 min
de fermentación, trayectoria 13 después de microfiltración y
filtración).
Fig. 5 Gráfico que muestra el KLa de un
fermentador de 150 litros a diferentes velocidades de agitación en
condiciones de aireación de 23 litros por minuto.
Los términos "comprendiendo",
"comprenden" y "comprende" en la presente memoria
descriptiva pretenden según los autores de la invención ser
sustituibles opcionalmente por los términos "consistente en",
"consisten en" y "consiste en", respectivamente, en todos
los casos.
Un aspecto de la invención es un procedimiento
de fermentación que comprende una etapa de fermentación de cultivo
de una cepa de Corynebacterium diphtheria en medio en un
fermentador en condiciones de agitación suficiente para mantener un
cultivo homogéneo (por ejemplo suficiente para producir un tiempo de
mezclado inferior a 30, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1
segundos) y aireación limitada de manera que la pO2 dentro del
cultivo descienda a menos del 5%, 4%, 3%, 1% o 0,5% para la mayoría
de la etapa de fermentación. En una forma de realización preferida,
la pO2 desciende a aproximadamente cero, preferentemente para la
mayoría de la etapa de fermentación.
Por ejemplo, la pO2 dentro del cultivo desciende
a menos del 5%, 4%, 3%, 1% o 0,5% desde el momento en que la
Corynebacterium diphtheria se ha cultivado a una densidad
suficiente para que consuma la mayor parte del oxígeno en cuanto el
oxígeno entra en el cultivo (la fase de latencia, por ejemplo de al
menos 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 horas después del inicio de la
fermentación), hasta el punto en la fermentación en que la
concentración de pO2 vuelve a aumentar, cerca del final de la etapa
de fermentación (por ejemplo 16, 18, 20, 22 ó 24 horas después de
la fase de latencia).
\newpage
La fermentación termina normalmente y el cultivo
se recoge cuando la pO2 aumenta por encima de las condiciones de
aireación limitada. Debe observarse que en diferentes condiciones de
inoculación, por ejemplo cuando se inocula el fermentador con un
cultivo mucho mayor de C. diphtheriae, las condiciones de
aireación limitada comienzan inmediatamente después del inicio de
la de fermentación (por ejemplo, 1, 5, 10, 20, 30, 40 ó 60 minutos
después del inicio de la fermentación).
Una pO2 al 100% es la cantidad de oxígeno
presente cuando el medio (en ausencia de un cultivo) se satura con
oxígeno después de burbujeo de aire comprimido a través del medio a
34,5ºC y presión de 0,5 bar. Para un fermentador de 150 litros, la
tasa de aireación y la velocidad de agitación debe ajustarse a 23
litros/min y 240 rpm, mientras que para un fermentador de 20
litros, la tasa de aireación y la velocidad de agitación debe
ajustarse a 3 litros/min y 300 rpm. Puede ajustarse como la
cantidad de oxígeno presente en un medio de fermentación totalmente
aireado antes de inoculación.
Un cultivo homogéneo es un cultivo en el que las
bacterias están dispersas uniformemente por todo el fermentador de
manera que al menos el 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10% de las bacterias
están presentes en el 10% superior del medio de cultivo.
Una etapa de fermentación se define como la
etapa en la que se cultiva Corynebacterium diphtheriae dentro
del fermentador. La etapa de fermentación comienza con la
introducción del precultivo en el fermentador y termina cuando, en
las condiciones de aireación limitada descritas en la presente
memoria descriptiva, la pO2 aumenta eventualmente hasta más del
10%. La etapa de fermentación dura normalmente más de 12, 14, 16,
18, 20 ó 24 horas, por ejemplo entre 16 y 40 horas, o por ejemplo
entre 22 y 28 horas.
La agitación se hace opcionalmente mediante
movimiento del cultivo en el fermentador pero puede realizarse por
cualquier otro medio adecuado, por ejemplo por agitación,
vibromezclador y/o burbujeo de gas. La agitación es suficiente para
producir un tiempo de mezclado para el cultivo de menos de 20, 15,
10, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 segundos.
Puede medirse el tiempo de mezclado de un
cultivo en un fermentador de vidrio. Es el tiempo transcurrido
después de la introducción de una solución acuosa coloreada para
que la solución acuosa coloreada se disperse uniformemente en todo
el medio de cultivo.
Un fermentador es cualquier aparato adecuado
para la producción industrial de cultivos bacterianos. Sin embargo,
este término no incluye matraces de cultivo que se usan normalmente
para crecimiento de bacterias a menor escala.
La mayoría de la etapa de fermentación se define
como un tiempo de más del 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de la duración
total de la etapa de fermentación. La fermentación es normalmente en
condiciones de aireación limitada durante 12, 14, 16, 18, 20, 21,
22, 23, 24, 25, 26 ó 28 horas.
La aireación limitada describe las condiciones
de aireación que permiten a C. diphtheriae usar respiración
aerobia y limita así la cantidad de oxígeno disponible de manera
que, después de que el cultivo haya aumentado en densidad (por
ejemplo después de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 horas de
fermentación) el oxígeno se consume en muy breve tiempo después de
entrar en el cultivo de manera que la pO2 es inferior al 5, 4, 3,
2, 1 ó 0,5%. Debe observarse que al aumentar la cantidad de cultivo
usado para inocular el fermentador, las condiciones de aireación
limitada podrían conseguirse muy brevemente después de la
inoculación (por ejemplo después de 1, 5, 10, 20 ó 30 minutos
después del inicio de la fermentación).
Dichas condiciones de aireación limitada
conducen a una sólida expresión de una toxina como toxina de la
difteria o mutantes de la misma.
Una pO2 que desciende aproximadamente a cero se
consigue haciendo la tasa de aireación y agitación de manera que el
oxígeno introducido en el cultivo sea consumido por el cultivo para
respiración inmediatamente después de su introducción en el cultivo
de manera que a pesar de la aireación del cultivo, la pO2 se lee
como cero o cercana a cero en un monitor de oxígeno.
Durante la etapa de fermentación, la pO2
empezará en un nivel superior para un ajuste dado de agitación y
tasa de aireación. Esto se debe a que la densidad de bacterias en el
cultivo es baja al inicio de la etapa de fermentación y aumenta
durante la etapa de fermentación. Se requiere normalmente un periodo
de tiempo (por ejemplo, hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 horas)
antes de que la pO2 descienda a menos del 5%. Desde este punto en
adelante, la pO2 permanece por debajo del 5, 4, 3, 2, 1 ó 0,5%,
preferentemente en un nivel de aproximadamente cero hasta cerca del
fin de la etapa de fermentación, por ejemplo hasta la recogida del
fermentador.
Opcionalmente, la etapa de fermentación se
efectúa a KLa constante durante toda la etapa de fermentación.
Alternativamente, la etapa de fermentación se efectúa a uno o más
KLa de manera que la aireación limitada se consiga a los valores de
KLa presentes durante la mayoría (al menos el 50%, 60%, 70%, 80%,
90%, 95%) de la etapa de fermentación.
KLa es una medida de la tasa a la que el oxígeno
entra en el cultivo. Cuanto más alto es el KLa, mayor es la tasa a
la que se introduce oxígeno en el cultivo. Varios factores, como el
volumen y la composición, la agitación, la aireación, la presión,
la temperatura y la posición del medio y las características de las
partes móviles del fermentador influirán en el KLa de una etapa de
fermentación en particular.
Normalmente, el oxígeno se introduce en el
cultivo de fermentación haciendo burbujear aire comprimido a través
del cultivo. Cuando hay diferentes concentraciones de oxígeno
presentes en el aire introducido en el cultivo, la tasa de flujo
debe adaptarse para tener esto en cuenta. Por ejemplo, cuando se
introduce un suministro de oxígeno al 100% en el cultivo, la tasa
de flujo será consiguientemente más baja. Cuando se introduce gas
que contiene menos oxígeno que el aire en el cultivo, podría
aplicarse una tasa de flujo más alta.
El KLa puede medirse usando el procedimiento
descrito en el Ejemplo 1. El procedimiento implica el ajuste del
fermentador con las condiciones de volumen, temperatura, presión,
agitación y aireación del medio para el que se va a medir KLa,
expulsión de gas por sustitución del aire por gas nitrógeno,
introducción de gas por restauración de aireación con aire y medida
de la tasa a la que la pO2 recupera su nivel de estado
estacionario.
ln(100-pO2)
= -KLa \cdot T +
C
Al representar ln (100-p02) con
respecto al tiempo, el gradiente (o coeficiente angular) de la línea
es - KLa.
En el valor de KLa de una etapa de fermentación
influyen varios factores como la magnitud de agitación del cultivo
y la tasa de aireación del cultivo. Puede mantenerse un KLa
constante mientras, por ejemplo, se reduce la agitación del cultivo
y se incrementa la tasa de aireación o viceversa. Sin embargo, en
una forma de realización, la agitación del cultivo y la tasa de
aireación son constantes durante la etapa de fermentación.
La etapa de fermentación se efectúa, por
ejemplo, a un KLa de entre 10-200
h-1, 10-150 h-1,
10-100 h-1, 10-80
h-1, 10-50 h-1,
10-40 h-1, 10-30
h-1, 20-150 h-1,
20-100 h-1, 20-50
h-1, 20-60 h-1,
20-80 h-1, 20-30
h-1, 20-40 h-1,
30-60 h-1, 60-80
h-1, 60-150 h-1 ó
60-200 h-1.
El KLa del procedimiento de fermentación de la
invención puede diferir, dependiendo del tamaño del cultivo de
fermentación. Para cultivos de 10-30 litros, puede
usarse un KLa de 10-30 h-1,
15-30, 20-30 o 22-28
h-1. Para cultivos de 30-250
litros, puede usarse un KLa de 30-60 o
40-50 h-1. Para cultivos de
250-800 litros puede usarse un KLa de
30-50, 40-50, 40-60,
30-60, 30-80 ó
60-150 h-1. Para cultivos de
800-3.000 litros puede usarse un KLa de
30-50, 40-50, 40-60,
30-60, 30-80, 60-150
ó 60-200 h-1.
Para un tamaño de cultivo de fermentación de 10
a 30 litros, se consigue un KLa de 10-30
h-1 usando por ejemplo un flujo de aire o tasa de
aireación de 1 a 5 litros/min y una velocidad de agitación de 200 a
400 rpm, por ejemplo una tasa de aireación de 2 a 4 litros/min y
una velocidad de agitación de 250 a 350 rpm.
Para un cultivo de fermentación de 30 a 250
litros, se consigue un KLa de 30 a 60 h-1 usando por
ejemplo una tasa de flujo de aire de 15 a 25 litros/min y una
velocidad de agitación de 150 a 250 rpm, por ejemplo usando una
tasa de flujo de aire de 20 a 25 litros/min y una velocidad de
agitación de 200 a 250 rpm, por ejemplo usando una tasa de flujo de
aire de 15 a 20 litros/min y una velocidad de agitación de 200 a 250
rpm.
El pH del cultivo de C. diphtheriae en
medio CY durante la etapa de fermentación depende de las condiciones
de aireación y agitación del cultivo (Nikolajewski y col., J.
Biological Standardization, 1982, 10; 109-114). En
el inicio de la etapa de fermentación, el pH del medio CY es 7,4. En
el caso de baja aireación o KLa, el pH desciende a aproximadamente
5. En el caso de alta aireación, el pH aumenta hasta aproximadamente
8,5. En una forma de realización de la invención, la C.
diphtheriae se cultiva en medio CY o medio SOC (Sambrook J y
col., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) o medios
similares. El pH en el fermentador puede mantenerse entre 7,0 y 7,8,
por el grado de aireación, sin requerir opcionalmente adición de
ácido o base.
El procedimiento de la invención puede usarse
con cualquier cepa de Corynebacterium diphtheriae. Dichas
cepas pueden producir toxina de la difteria de tipo salvaje,
proteínas de fusión que incluyen toxina de la difteria o fragmento
de la misma (por ejemplo las desveladas en el documento
US-5.863.891) o formas mutantes o fragmentos de
toxina de la difteria, preferentemente los que tienen toxicidad
reducida. Algunos ejemplos de dichas toxinas mutantes son CRM176,
CRM 197, CRM228, CRM 45 (Uchida y col., J. Biol. Chem. 218;
3838-3844, 1973); CRM 9, CRM 45, CRM102, CRM 103 y
CRM107 y otras mutaciones descritas por Nicholls y Youle en
Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Marcel Dekker Inc,
1992; deleción o mutación de Glu-148 a Asp, Gln o
Ser y/o Ala 158 a Gly y otras mutaciones desveladas en los
documentos US-4.709.017 o
US-4.950.740; mutación de al menos uno o más
residuos Lys 516, Lys 526, Phe 530 y/o Lys 534 y otras mutaciones
desveladas en los documentos US-5.917.017 o
US-6.455.673; o fragmento desvelado en el documento
US-5.843.711. En una forma de realización, la cepa
de C. diphtheriae produce CRM197.
En una forma de realización, se usan las
siguientes cepas de C. diphtheriae en el procedimiento de la
invención; ATCC39255, ATCC39526, ATCC11049, ATCC11050, ATCC11051,
ATCC11951, ATCC11952, ATCC13812, ATCC14779, ATCC19409, ATCC27010,
ATCC27011, ATCC27012, ATCC296, ATCC43145, ATCC51280 o
ATCC51696.
ATCC51696.
El medio para su uso en la invención puede
contener uno o más de los siguientes constituyentes:
5-20 g/L, 10-16 g/L o 10 g/L de
casaminoácidos o hidrolizado de caseína, 5-20 g/L,
7-15 g/L o 9-12 g/L de peptona de
soja y/o 10-40 g/L, 14-32 g/L o
18-22 g/L de extracto de levadura.
Se sabe que el contenido de hierro del medio de
crecimiento puede afectar al crecimiento de C. diphtheriae e
influir en la producción de toxinas (veáse documento
WO-00/50.449). El hierro es esencial para
crecimiento bacteriano, sin embargo, se ha demostrado que el hierro
en grandes concentraciones inhibe la producción de toxina. Durante
el procedimiento de la invención, el contenido de hierro del medio
tiene un nivel inferior de 10, 50, 75, 100, 120 ó 150 ppb y un
límite superior de 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000,
1.500, 2.000, 3.000, 4.000 ó 5.000 ppb. Por ejemplo, las
concentraciones de hierro en el medio son: 50-1.000
ppb, 100-1.000 ppb, 200-1.000 ppb,
400-1.000 ppb, 500-1.500 ppb,
700-1.300 ppb, 50-2.000 ppb,
100-2.000 ppb, 200-2.000 ppb,
400-2.000 ppb, 700-2.000 ppb,
50-3.000 ppb, 100-3.000 ppb,
200-3.000 ppb, 400-3.000 ppb,
700-3.000 ppb, 1.000-3.000 ppb,
1.500-3.000 ppb, 1.700-3.000 ppb,
50-4.000 ppb, 100-4.000 ppb,
200-4.000 ppb, 400-4.000 ppb,
700-4.000 ppb, 1.000-4.000 ppb,
1.500-4.000 ppb, 1.700-4.000 ppb o
2.000-4.000 ppb. El hierro puede estar en la forma
de Fe2+ y/o Fe3+.
En una forma de realización, el procedimiento de
la invención es suficientemente tolerante a la presencia de sales
de hierro en el medio de manera que no se requiere tratamiento del
medio para eliminar el hierro antes del uso.
La etapa de fermentación tiene lugar a una
temperatura adecuada para el cultivo de C. diphtheriae, por
ejemplo 25-45ºC, 25-40ºC,
30-38ºC o 34-35ºC.
La etapa de fermentación está sujeta a una gran
cantidad de producción de espuma. Para controlar la formación de
espuma se añade opcionalmente un agente antiespumante al
fermentador. Opcionalmente se usa una sonda de espuma o un
dispositivo mecánico de ruptura de espuma en el fermentador, por
ejemplo, así como el agente antiespumante.
Un segundo aspecto de la invención es un
procedimiento para fabricar una preparación de un antígeno, por
ejemplo, toxina de la difteria o mutante o fragmento de la misma
que comprende las etapas de efectuar el procedimiento de
fermentación de la invención según se describe anteriormente y
aislar el antígeno, por ejemplo, toxina de la difteria o mutante o
fragmento de la misma del cultivo.
La toxicidad de la toxina de la difteria se
reduce opcionalmente mediante tratamiento químico que incluye
tratamiento con reactivos de reticulación para formar un toxoide.
Las referencias a una toxina incluyen toxoides.
La composición farmacéutica de la invención
comprende además opcionalmente antígenos adicionales en una vacuna
de combinación. En una forma de realización, el o los antígenos que
se combinarán con la toxina de la difteria, mutante o fragmento de
la misma según se describe anteriormente incluyen uno o más entre
toxoide del tétanos, pertussis de células enteras (Pw), pertussis
acelular (Pa) (según se describe más adelante), antígeno de
superficie de Hepatitis B, virus de Hepatitis A, polisacáridos u
oligosacáridos de Haemophilus influenzae b, polisacáridos u
oligosacáridos de Neisseria (por ejemplo N.
meningitidis), proteínas B de serotipos de N.
meningitidis, opcionalmente como parte de una vesícula de
membrana externa, polisacáridos u oligosacáridos neumocócicos,
proteínas neumocócicas o cualquiera de los antígenos enumerados a
continuación. Los polisacáridos bacterianos pueden conjugarse con
una proteína portadora. La toxina de la difteria o toxoide o
mutantes de toxina de la difteria como CRM197 o fragmentos, por
ejemplo preparados usando un procedimiento de la invención, pueden
usarse como proteína portadora. Sin embargo, también pueden usarse
otras proteínas portadoras como toxoide del tétanos, fragmento C de
toxoide del tétanos, neumolisina, Proteína D (documento
US-6.342.224). Una composición farmacéutica dada
contiene opcionalmente múltiples polisacáridos u oligosacáridos
conjugados con diferentes proteínas portadoras.
La toxina de la difteria, o mutante de la misma,
por ejemplo CRM197, o fragmento de la misma preparado usando el
procedimiento de la invención puede formularse con polisacáridos u
oligosacáridos capsulares obtenidos de uno o más de Neisseria
meningitidis, Haemophilus influenzae b, Streptococcus
pneumoniae, estreptococos del Grupo A, estreptococos del Grupo
B, Staphylococcus aureus o Staphylococcus epidermidis.
Por ejemplo, la composición farmacéutica o inmunógena puede
comprender polisacáridos capsulares obtenidos de uno o más de los
serogrupos A, C, W-135 e Y de Neisseria
meningitidis. Por ejemplo los serogrupos A y C; A y W, A e Y; C
y W, C e Y, W e Y; A, C y W; A C e Y; A, W e Y; C, W e Y o A, C, W e
Y pueden formularse con CRM197. En otro ejemplo, la composición
inmunógena comprende polisacáridos capsulares obtenidos de
Streptococcus pneumoniae. Los antígenos de polisacáridos
capsulares neumocócicos se seleccionan preferentemente entre
serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B,
17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F (con la máxima preferencia
de serotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F). Un ejemplo
adicional contendría los polisacáridos (u oligosacáridos)
capsulares PRP de Haemophilus influenzae tipo b. Un ejemplo
adicional contendría polisacáridos capsulares de Tipo 5, Tipo 8,
336, PNAG o dPNAG de Staphylococcus aureus. Un ejemplo
adicional contendría los polisacáridos capsulares de Tipo I, Tipo
II, Tipo III o PIA de Staphylococcus epidermidis. Un ejemplo
adicional contendría los polisacáridos capsulares de Tipo Ia, Tipo
Ic, Tipo II o Tipo III de estreptococos del Grupo B. Un ejemplo
adicional contendría los polisacáridos capsulares de estreptococos
del Grupo A, comprendiendo opcionalmente además al menos una
proteína M y más preferentemente múltiples tipos de proteína M.
Los polisacáridos bacterianos para su uso en la
invención pueden ser de longitud completa, siendo polisacáridos
nativos purificados. Alternativamente, los polisacáridos están
dimensionados entre 2 y 20 veces, por ejemplo de 2 a 5 veces, de 5
a 10 veces, de 10 a 15 veces o de 15 a 20 veces, de manera que los
polisacáridos son menores en tamaño para mayor manejabilidad. Los
oligosacáridos contienen normalmente entre 2 y 20 unidades de
repetición.
Dichos polisacáridos capsulares pueden ser no
conjugados o conjugados para una proteína portadora como toxoide
del tétanos, fragmento C de toxoide del tétanos, toxoide de la
difteria o CRM197 (ambos preparados, por ejemplo, por el
procedimiento de la invención), neumolisina o Proteína D (documento
US-6.342.224). La toxina tetánica, la toxina de la
difteria y la neumolisina se destoxifican por mutación genética y/o
por tratamiento químico.
El conjugado de polisacáridos u oligosacáridos
puede prepararse por cualquier técnica de acoplamiento conocida.
Por ejemplo el polisacárido puede acoplarse por medio de una unión
de tioéter. Este procedimiento de conjugación se basa en la
activación del polisacárido con tetrafluoroborato de
1-ciano-4-dimetilaminopiridinio
(CDAP) para formar un éster de cianato. El polisacárido activado
puede acoplarse así directamente o por medio de un grupo separador
a un grupo amino en la proteína portadora. Opcionalmente, el éster
de cianato se acopla con hexanodiamina y el polisacárido derivado
de amino se conjuga con la proteína portadora usando química de
heteroligación que implica la formación de la unión de tioéter.
Dichos conjugados se describen en la solicitud publicada PCT
W0-93/15.760 de Uniformed Services University.
Los conjugados pueden prepararse también por
procedimientos de aminación reductora directa según se describe en
los documentos US-4.365.170 (Jennings) y
US-4.673.574 (Anderson). Otros procedimientos se
describen en los documentos EP-0.161.188,
EP-208.375 y EP-0.477.508.
Un procedimiento adicional implica el
acoplamiento de un polisacárido activado con bromuro de cianógeno
derivado con ácido adípico hidrazida (ADH) para la proteína
portadora por mediante condensación de carbodiimida (Chu C. y col.,
Infect. Immunity, (1983) 245; 256).
En ejemplos particulares la toxina de la
difteria o fragmento de mutante de la misma (por ejemplo CRM197) se
conjuga con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,
17, 18, 19 ó 20 antígenos adicionales de la composición
farmacéutica. En una forma de realización, se conjuga con
componente(s) de polisacáridos, por ejemplo polisacáridos
bacterianos que incluyen los enumerados anteriormente.
La composición farmacéutica o inmunógena de la
invención puede comprender además componentes adicionales de
proteínas. Se formula opcionalmente con antígenos que proporcionan
protección contra una o más entre infecciones por tétanos y
Bordetella pertussis. El componente de pertussis puede destruir B.
pertussis (Pw) de células enteras o pertussis acelular (Pa) que
contiene al menos un antígeno (preferentemente dos o los tres) de
PT, FHA y pertactina de 69 kDa. Algunas otras formulaciones de
pertussis acelular contienen aglutinógenos como Fim 2 y Fim 3 y
estas vacunas se contemplan también para su uso en la invención.
Normalmente, el antígeno que proporciona protección contra tétanos
es toxoide del tétanos que es o bien toxinas inactivadas
químicamente (por ejemplo, después de tratamiento con formaldehído)
o bien inactivadas por la introducción de una o más mutaciones
puntuales.
La composición farmacéutica o inmunógena de la
invención comprende opcionalmente antígenos de proteínas
neumocócicas, por ejemplo aquellas proteínas neumocócicas que están
expuestas a la superficie externa del neumococo (susceptibles de
ser reconocidas por el sistema inmunitario de un hospedador durante
al menos parte del ciclo vital del neumococo), o son proteínas que
son secretadas o liberadas por el neumococo. Por ejemplo, la
proteína puede ser una toxina, adhesina, transductor de señales de
2 componentes o lipoproteína de Streptococcus pneumoniae, o
fragmentos de la misma. Los ejemplos de dichas proteínas incluyen,
pero no se limitan a: neumolisina (preferentemente destoxificada
por tratamiento químico o mutación) [Mitchell y col., Nucleic Acids
Res. 1990 Jul 11; 18(13): 4010 "Comparison of pneumolysin
genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 y
2", Mitchell y col., Biochim Biophys Acta 1989 Ene 23;
1007(1): 67-72 "Expression of the
pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification and
biological properties", documento WO-96/05.859
(A. Cyanamid), documento WO 90/06.951 (Paton y col.), documento
WO-99/03.884 (NAVA)]; PspA y variantes de deleción
de transmembrana de la misma (documento
US-5.804.193-Briles y col.); PspC y
variantes de deleción de transmembrana de la misma (documento
WO-97/09.994-Briles y col.); PsaA y
variantes de deleción de transmembrana de la misma (Berry &
Paton, Infect Immun 1996 Dic; 64(12):5255-62
"Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton
putative adhesin essential for virulence of Streptococcus
pneumoniae"); proteínas de unión a colinas neumocócicas y
variantes de deleción de transmembrana de la misma; CbpA y
variantes de deleción de transmembrana de la misma (documentos
WO-97.141.151; WO-99/51.266);
Gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa
(Infect. Immun. 1996 64:3544); HSP70 (documento
WO-96/40.928); PcpA (Sanchez-Beato
y col., FEMS Microbiol Lett 1998, 164:207-14);
proteína tipo M (documento EP-0.837.130) y adhesina
18627 (documento EP-0.834.568). Se desvelan
antígenos de proteínas neumocócicas para inclusión en la
composición inmunógena en los documentos
WO-98/18.931, WO-98/18.930 y
PCT/US99/30.390.
Los ejemplos de proteínas de Neisseria que se
formularán con la composición inmunógena de la invención incluyen
TbpA (documentos WO-93/0686,
EP-586.266; WO-92/03.467;
US-5.912.336), TbpB (documentos
WO-93/06.861; EP-586.266), Hsf
(documento WO-99/31.132), NspA (documento
WO-96/29.412) Hap (documento PCT/EP99/
02.766), PorA, PorB, OMP85 (también conocido como D15) (documento WO-00/23.595), PilQ (documento PCT/EP
99/03.603), PldA (documento PCT/EP99/06.718), FrpB (documento WO-96/31.618 véase ID SEC Nº 38), FrpA o FrpC o una parte conservada en común para dos de al menos 30, 50, 100, 500, 750 aminoácidos (documento WO-92/01.460), LbpA y/o LbpB (documento PCT/EP98/05.117; Schryvers y col., Med. Microbiol. 1999 32: 1117), FhaB (documento WO-98/02.547 ID. SEC. Nº 38), HasR (documento PCT/EP99/05.989), lipo02 (documento PCT/EP99/08.315), MltA (documento WO-99/57.280) y ctrA (documento PCT/EP00/00.135). Las proteínas de Neisseria se añaden opcionalmente como proteínas purificadas o como parte de una preparación de membrana exterior.
02.766), PorA, PorB, OMP85 (también conocido como D15) (documento WO-00/23.595), PilQ (documento PCT/EP
99/03.603), PldA (documento PCT/EP99/06.718), FrpB (documento WO-96/31.618 véase ID SEC Nº 38), FrpA o FrpC o una parte conservada en común para dos de al menos 30, 50, 100, 500, 750 aminoácidos (documento WO-92/01.460), LbpA y/o LbpB (documento PCT/EP98/05.117; Schryvers y col., Med. Microbiol. 1999 32: 1117), FhaB (documento WO-98/02.547 ID. SEC. Nº 38), HasR (documento PCT/EP99/05.989), lipo02 (documento PCT/EP99/08.315), MltA (documento WO-99/57.280) y ctrA (documento PCT/EP00/00.135). Las proteínas de Neisseria se añaden opcionalmente como proteínas purificadas o como parte de una preparación de membrana exterior.
La composición farmacéutica o inmunógena de la
invención comprende opcionalmente uno o más antígenos que pueden
proteger a un hospedador contra Haemophilus influenzae no
tipificables, VSR y/o uno o más antígenos que pueden proteger a un
hospedador contra virus de la gripe.
Los ejemplos de antígenos de proteínas H.
influenzae no tipificables incluyen proteína Fimbrina (documento
US-5.766.608) y fusiones que comprenden péptidos de
la misma (por ejemplo, Fusión LB1) (documento
US-5.843.464-Ohio State Research
Foundation), OMP26, P6, proteína D, TbpA, TbpB, Hia, Hmw1, Hmw2, Hap
y D15.
Los ejemplos de antígenos de virus de la gripe
incluyen virus enteros, vivos o inactivados, virus de la gripe
divididos, cultivados en huevos o células MDCK, o células Vero o
virosomas de la gripe enteros (según describe R. Gluck, Vaccine,
1992, 10, 915-920) o proteínas purificadas o
recombinantes de los mismos, como HA, NP, NA o proteínas M, o
combinaciones de los mismos.
Los ejemplos de antígenos de VSR (Virus
Sincitial Respiratorio) incluyen la glucoproteína F, la
glucoproteína G, la proteína HN, la proteína M o derivados de las
mismas.
Debe observarse que las composiciones
antigénicas de la invención pueden comprender uno o más
polisacáridos capsulares de una sola especie de bacterias. Las
composiciones antigénicas también pueden comprender polisacáridos
capsulares obtenidos de una o más especie de bacterias.
Opcionalmente, la composición inmunógena o
vacuna contiene una cantidad de un adyuvante suficiente para
potenciar la respuesta inmunitaria al inmunógeno. Los adyuvantes
adecuados incluyen, pero no se limitan a, sales de aluminio,
mezclas de escualeno (SAF-1), péptido de muramilo,
derivados de saponina, preparaciones de paredes celulares de
micobacteria, lípido A monofosforílico, derivados de ácido micólico,
tensioactivos de copolímeros de bloque no iónicos, Quil A,
subunidad de toxina B del cólera, polifosfaceno y derivados, y
complejos inmunoestimulantes (ISCOM) como los descritos por
Takahashi y col., (1990) Nature 344:873-875. Para
uso veterinario y para producción de anticuerpos en animales,
pueden usarse componentes mitógenos de adyuvante de Freund.
Como con todas las composiciones inmunógenas o
vacunas, las cantidades inmunológicamente eficaces de los
inmunógenos deben determinarse empíricamente. Los factores que
deben considerarse incluyen la inmunogenicidad, forme o no el
inmunógeno complejo con o unido covalentemente a un adyuvante o
proteína portadora u otro vehículo, ruta de administraciones y el
número de dosis de inmunización que se administrará. Dichos factores
son conocidos en la técnica de las vacunas y se sitúa bien dentro
de la técnica de los inmunólogos preparar dichas determinaciones
sin experimentación innecesaria.
El agente activo puede estar presente en
concentraciones variables en la composición farmacéutica o vacuna
de la invención. Normalmente, la concentración mínima de la
sustancia es una cantidad necesaria para lograr su uso pretendido,
mientras que la concentración máxima es la cantidad máxima que
permanecerá en solución o suspendida homogéneamente dentro de la
mezcla inicial. Por ejemplo, la cantidad mínima de un agente
terapéutico es preferentemente una que proporcionará una dosis
única terapéuticamente eficaz. Para sustancias bioactivas, la
concentración mínima es una cantidad necesaria para bioactividad
sobre reconstitución y la concentración máxima está en el punto en
el que no puede mantenerse una suspensión homogénea. En el caso de
unidades de dosis única, la cantidad es la de una sola aplicación
terapéutica. Generalmente, se espera que cada dosis comprenderá de
1 a 100 \mug de antígeno de proteína, preferentemente de 5 a 50
\mug y con la máxima preferencia de 5 a 25 \mug. Las dosis
preferidas de polisacáridos bacterianos son de 10 a 20 \mug, de 10
a 5 \mug, de 5 a 2,5 \mug o de 2,5 a 1 \mug. La cantidad
preferida de la sustancia varía de una sustancia a otra pero puede
determinarse fácilmente por un experto en la materia.
Las preparaciones de vacunas de la presente
invención pueden usarse para proteger o tratar a un mamífero (por
ejemplo, un paciente humano) susceptible de infección, por medio de
la administración de dicha vacuna a través de una ruta sistémica o
mucosa. Estas administraciones pueden incluir inyección por las
rutas intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea; o
por administración mucosa a los tractos oral/alimentario,
respiratorio, genitourinario. Aunque la vacuna de la invención
puede administrarse como una sola dosis, los componentes de la
misma también pueden coadministrarse conjuntamente al mismo tiempo o
en momentos diferentes (por ejemplo, si están presentes
polisacáridos en una vacuna, podrían administrarse por separado al
mismo tiempo o de 1 a 2 semanas después de la administración de la
combinación de proteínas bacterianas para coordinación óptima de
las respuestas inmunitarias con respecto a las demás). Además de una
sola ruta de administración, pueden usarse 2 rutas de
administración diferentes. Por ejemplo, los antígenos virales pueden
administrarse ID (intradérmicos), mientras que las proteínas
bacterianas pueden administrarse IM (intramusculares) o IN
(intranasales). Si están presentes polisacáridos, pueden
administrarse IM (o ID) y las proteínas bacterianas pueden
administrarse IN (o ID). Además, las vacunas de la invención pueden
administrarse IM para dosis iniciales e IN para dosis de
recuerdo.
La preparación de vacunas se describe
generalmente en Vaccine Design ("The subunit and adjuvant
approach" (ed. Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum
Press New York). La encapsulación en liposomas es descrita por
Fullerton, patente de EE.UU. 4.235.877.
Un aspecto adicional de la invención es un
procedimiento para fabricar una composición farmacéutica que
comprende una etapa de preparación de la toxina de la difteria o
fragmento o mutante de la misma (por ejemplo CRM197) usando el
procedimiento de fermentación de la invención y combinándola con un
vehículo farmacéuticamente aceptable y añadiendo opcionalmente
cualquiera de los antígenos adicionales mencionados
anteriormente.
Dicho procedimiento puede comprender además una
etapa de conjugación de la toxina de la difteria o fragmento o
mutante de la misma (por ejemplo CRM197) a uno o más componentes
adicionales de la composición farmacéutica, preferentemente
polisacáridos u oligosacáridos bacterianos según se describe
anteriormente.
Un aspecto adicional de la invención es el uso
de la toxina de la difteria o fragmento o mutante de la misma (por
ejemplo CRM197) de la invención en la preparación de un medicamento
para el tratamiento o prevención de enfermedad bacteriana, en
particular enfermedad por C. diphtheriae.
Un aspecto adicional de la invención es un
procedimiento de prevención o tratamiento de infección bacteriana,
en particular infección por C. diphtheriae, que comprende la
administración de la composición farmacéutica, la composición
inmunógena o la vacuna de la invención a un paciente.
La invención se ilustra en los ejemplos
adjuntos. Los ejemplos mostrados a continuación se efectúan usando
técnicas estándar, que son bien conocidas y rutinarias para los
expertos en la materia, excepto cuando en caso contrario se
describen en detalle. Los ejemplos son ilustrativos, pero no limitan
la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de medir KLa de una etapa de
fermentación, se llenó el fermentador con el volumen deseado de agua
y se aplicaron los parámetros de fermentación (por ejemplo
temperatura, presión, agitación y aireación) y se dejó que el
sistema alcanzara un estado estacionario. La sonda de pO2 se calibró
al 100%.
Se cambió rápidamente la aireación a gas
nitrógeno, mientras se mantenía la misma tasa de flujo. La pO2 se
siguió hasta que la pO2 cayó a menos del 5%. Cuando se alcanzó este
punto, se cambió la aireación rápidamente a aire mientras se
mantenía la misma tasa de flujo. Se siguió el nivel de pO2 y se
registró en varios puntos de tiempo como un porcentaje del nivel al
100% del estado estacionario original.
Se calculó KLa representando gráficamente el log
(100-pO2%) con respecto al tiempo. El coeficiente
angular de la parte lineal del gráfico corresponde a -Kla.
Normalmente, sólo se consideran los datos entre el 20% y el 80% de
la pO2.
En la Tabla 1 a continuación se muestran las
lecturas de la pO2 en varios puntos de tiempo.
Los resultados se representaron gráficamente
según se muestra en la fig. 1 y se determinó KLa a partir del
coeficiente angular de la línea en la fig. 1B.
\vskip1.000000\baselineskip
La bacteria usada en la preparación de CRM197
(Material de Reacción Cruzada) es una cepa mutante de
Corynebacterium diphtheriae obtenida por tratamiento con
nitrosoguanidina según el procedimiento de A. Pappenheimer (Nature
New Biol. 233:8-11, 1971). Expresa una toxina
diftérica destoxificada (aa 52: mutación de glicina a ácido
glutámico). Se obtuvo de ATCC en la que tiene la referencia 39255.
El esquema general del procedimiento de fermentación se muestra en
la fig. 2. Se retiró una semilla de trabajo que contenía 1,1 x
10^{10} ufc/m) del congelador (-70ºC) y se descongeló a
temperatura ambiente. Inmediatamente después de la descongelación,
se centrifugó el vial y se recogieron 250 \mul de la semilla con
una jeringuilla de 1 ml con aguja.
Este volumen se inyectó en 100 ml de solución
salina estéril (0,9%). Se agitó el matraz. Se tomaron 2 ml de la
suspensión con una jeringuilla de 2 ml con aguja y se usó para
inocular un erlenmeyer de 3 L que contenía 500 mL del medio
descrito en el documento US-4.925.792. Se incubó el
matraz a 34,5ºC \pm 0,5ºC a velocidad de agitación de 250 rpm
hasta que la densidad óptica (650 nm) alcanzó de 4,0 a 6,0 (después
de 16 a 19 h de incubación).
Se esterilizó un fermentador de 150 litros y se
transfirieron asépticamente 100 L de medio de cultivo en el
fermentador. Se llenó el frasco de ácido con 500 mL de
H_{3}PO_{4} al 25% (V/V); el pH del medio era inicialmente de
aproximadamente 7,4 y no se ajustó.
Se preparó el fermentador un día antes de la
inoculación y se guardó en condiciones de espera de 34,5ºC de
temperatura, 0,5 bar de presión, flujo de aire de 23 N Umin en el
espacio delantero y velocidad de agitación de 50 rpm durante 16 a
20 h, hasta inoculación.
Antes de la inoculación, se ajustó el
fermentador a las condiciones de cultivo de 34,5ºC de temperatura,
0,5 bar de presión, flujo de aire de 23 N Umin insuflado en el
medio y velocidad de agitación de 240 rpm. Una agitación de 240 rpm
da una velocidad de extremo de 1,76 m/s y un tiempo teórico de
mezcla de 3,9 segundos. El oxígeno disuelto no se regula, sólo se
monitoriza, se activó el sistema de control de espuma y se dejó que
el pH alcanzara 7,8 y posteriormente se mantuvo mediante adición de
H_{3}PO_{4}. Antes de inoculación, se ajustó la sonda de
pO2
al 100%.
al 100%.
La velocidad de agitación se ajustó a 240 rpm,
correspondiente a la velocidad periférica de 1,76 m/s. La velocidad
de agitación de 240 rpm combinada con una tasa de aireación de
23-L/min produjo un KLa (20-80%,
agua a 30ºC, 0,5 bar) estimado de 42 h-1 (véase
fig. 6).
Se inoculó el fermentador a través del orificio
de entrada del inóculo con 400 ml del cultivo de semillas descrito
anteriormente.
La fermentación continuó hasta que se cumplieron
las dos condiciones siguientes. Transcurrieron 20 horas de
fermentación y el nivel de oxígeno disuelto había aumentado al 10%.
La duración de fermentación total estuvo generalmente entre 22 y 28
h.
Al final de la fermentación, se cambió la
temperatura a un ajuste de 20ºC, se desactivó la regulación del pH
regulación, se cambió el flujo de aire en el espacio delantero con
el fin de limitar la formación de espuma, se desactivó el sistema
de control de espuma, y los demás parámetros no se cambiaron.
Se conectó el sistema de microfiltración al
fermentador y cuando la temperatura de la suspensión alcanzó 21ºC,
comenzó la microfiltración. La microfiltración se realizó en dos
fases: una concentración y una diafiltración. Durante la fase de
concentración, los parámetros fueron: presión de entrada: 0,6 bar,
presión de salida: -0,1 bar, flujo de permeado: mantenido constante
a 2 L/min usando una bomba peristáltica calibrada (la presión del
permeado fue de aproximadamente 0,3 bar). Se concentró la suspensión
hasta que sucedió primero uno de los siguientes eventos. O bien la
presión de entrada alcanzó 0,9 bar o bien se recuperaron 75 litros
de permeado.
Durante la fase de diafiltración, se usaron los
siguientes parámetros: la presión de entrada se mantuvo en la
presión alcanzada al final de la etapa de concentración (0,9 bar
máximo); se añadió agua a 2 litros/min; el agua total añadida fue
de 3 volúmenes de retenido.
Se filtró el retenido en una membrana de 0,22
\mum y se almacenó a +4ºC. Se probó la estabilidad del CRM 197 en
dicha suspensión después de hasta 4 días de almacenamiento a +4ºC o
a temperatura ambiente (+20ºC < TA < 23ºC). No se observó
degradación ni diferencias mediante cuantificación por ELlSA o en
SDS-page. Se realizó una prueba para confirmación
de ausencia de crecimiento en agar BAB incubado a 36ºC.
Se realizaron dos fermentaciones en escala de
150 L usando el protocolo de fermentación descrito anteriormente
(CDT 199 y CDT 206). Las condiciones de precultivo y cultivo se
muestran en las Tablas 2 y 3 y los rendimientos de CRM197 se
muestran en la Tabla 4. La fig. 3 muestra un gráfico de la cinética
de crecimiento típica de un precultivo. Cuando la D.O. (650 nm)
estaba entre 4,0 y 6,0, el cultivo estaba claramente en una fase
exponencial de crecimiento y el pH cambió sólo ligeramente.
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Durante la fermentación, se observaron
diferentes fases.
La primera fase se caracterizó por una
disminución del oxígeno disuelto hasta que se alcanzó el 0%
(duración de aproximadamente 6 a 7 h). Durante esta fase, el pH
permanece estable o disminuye ligeramente (aproximadamente 0,1
unidades de pH).
Durante la segunda fase el pH aumentó y alcanzó
una meseta a aproximadamente pH 7,8. En este nivel, se activó la
regulación del pH, sin embargo a menudo no hubo que añadir ningún
ácido en estas condiciones de fermentación. Durante esta meseta de
pH, se observó un aumento del nivel de oxígeno disuelto por encima
del 0% seguido por una caída al 0%.
La tercera fase se caracterizó por una
disminución del pH a aproximadamente 7,4.
Finalmente se observó un aumento de pO2 entre 22
y 24 h de fermentación. Ésta es la señal para la recogida.
Se analizaron los gases de escape del
fermentador por espectrómetro de masas. Se observó un perfil típico
de producción de CO_{2}.
Las dos fermentaciones presentadas se
prolongaron después de la señal de recogida con el fin de estimar la
cinética de producción de CRM 197. Observamos que el nivel de CRM
197 no aumenta después de que se alcanzara la señal de recogida pero
hubo un aumento en la producción de espuma. Con el fin de limitar
el consumo de antiespumante, es preferible detener la fermentación
en la señal de recogida. Sin embargo, el CRM 197 no parece afectado
por formación de espuma excesiva y no se produjo degradación.
Se muestran datos para la microfiltración de
CDT206.
Se recogieron 74,3 L de permeado cuando la
presión de entrada alcanzó 0,9 bares. La presión de salida estuvo
entre 0,15 y 0,10 bares durante toda la etapa de concentración. La
presión del permeado fue de 0,3 a 0,4 bares durante toda la etapa
de concentración y la etapa de concentración duró 36 minutos.
Para la fase de diafiltración, se añadieron
progresivamente 75 L de agua (2 Umin) mientras que se extrajo el
permeado con la misma tasa de flujo. La presión de entrada fue de
0,9 bar al comienzo y cayó a 0,7 bar al final de la diafiltración.
La presión de salida fue estable a 0,1 bar. La duración de la etapa
de diafiltración fue de 39 min.
El nivel de expresión de CRM197 en condiciones
de baja aireación fue generalmente de 2 a 4 veces superior al
conseguido en condiciones de mayor aireación cuando la pO2 se
mantuvo en el 5% o superior durante toda la fermentación.
Se aplicaron geles de SDS-PAGE
(fig. 4) de los sobrenadantes del cultivo en condición de reducción
de manera que fue posible detectar posibles bandas de degradación
(después de recorte, pueden detectarse 2 subunidades de 35 y 23 kD
respectivamente). Posteriormente se sometieron a tinción con azul de
Coomassie.
En la fig. 4A se muestran los geles teñidos con
coomassie de muestras de las dos fermentaciones (CDT 199) y 4B (CDT
206). El CRM 197 apareció en el peso molecular esperado (PM teórico:
58,4 kD). El CRM 197 no se degradó ya que no se observó ningún
cambio en el patrón en las muestras tomadas después de la señal de
fin de fermentación (Fig. 4A, trayectorias 9 y 10). La cantidad de
CRM 197 no estuvo afectada por la microfiltración y la filtración
final en 0,22 \muM ya que las trayectorias 9 y 11 de la fig. 4A
muestran cantidades equivalentes de CRM197.
La temperatura puede tener un efecto negativo en
la estabilidad de CRM (fig. 4B trayectoria 12). Esta muestra se
tomó mientras la válvula de muestra estaba caliente y se redujo la
cantidad de CRM197 presente en esta muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó un procedimiento similar al descrito en
el ejemplo 2 para fermentar C. diphtheriae con la salvedad
de que se usó un fermentador de 20 litros. Se agitó el cultivo a 300
rpm y se ajustó el flujo de aire a 3 litros/minuto. No se requirió
adición de ácido o base durante la fermentación ya que el pH se
mantuvo aproximadamente neutro durante toda la fermentación.
El cultivo creció hasta una DO final (650 nm) de
18,3. Se encontró que el rendimiento de CRM197 fue de 103 mg/litro
según evaluación por densitometría sobre gel con tinción.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento de fermentación de cultivo de
C. diphtheriae en condiciones de KLa constante puede
adaptarse para uso en fermentadores de otros tamaños y diferentes
diseños. Se consiguieron buenos rendimientos de producción de
CRM197 siguiendo las condiciones de tamaño del fermentador, flujo de
aire y velocidad de agitación indicadas en la Tabla 5. Las tres
fermentaciones de escala de 150 L se efectuaron en fermentadores de
diferente diseño.
Según se muestra en la tabla 5, el KLa fue
importante antes que la elección específica de las condiciones de
flujo de aire y velocidad de agitación. Así, un flujo de aire menor
podría compensarse con una velocidad de agitación mayor para
producir un KLa similar y seguían consiguiéndose los buenos
rendimientos de CRM197. La velocidad de agitación debe ser
suficiente para producir una suspensión homogénea y la aireación se
limita para mantener una pO2 baja. N.B. Se usaron diferentes
fermentadores para las fermentaciones de 20 litros. Las diferentes
geometrías de los diferentes fermentadores condujeron al intervalo
de valores de kLa mostrado en la tabla 5.
Sin embargo, diferentes condiciones de KLa
fueron óptimas para diferentes escalas de fermentación. De ahí que
para fermentación en un fermentador de 20 litros fuera óptimo un KLa
menor de 22 a 28 h-1.
Las condiciones óptimas de KLa son las que
permiten aireación limitada de manera que la pO2 dentro del cultivo
descienda a niveles bajos. Un experto en la materia debe ser capaz
fácilmente de determinar dichas condiciones para un tamaño y una
geometría concretos del fermentador.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó una serie de fermentaciones de cepa
ATCC 39255 de C. diphtheriae en escala de 20 litros siguiendo
el procedimiento expuesto en el Ejemplo 3 de manera que la pO2 fue
baja durante la mayoría de la fermentación o a un ajuste constante
de la pO2 al 5%. La cantidad de Fe3+ presente se modificó entre
ausencia de adición de Fe3+, 250 ppb de adición de Fe3+, 500 ppb de
adición de Fe3+ y 500 ppb de adición de Fe2+. El rendimiento de
CRM197 al final de la fermentación se midió por densitometría de un
gel de SDS-PAGE. Este procedimiento suele dar
resultados aproximadamente un 20% inferiores a los obtenidos
ELISA.
Como se muestra en la tabla 6, cuando se
fermenta C. diphtheriae en pO2 al 5%, la adición de hierro
conduce a una reducción del rendimiento. Sin embargo, cuando se
reduce el nivel de pO2 y la fermentación se efectúa en las
condiciones de pO2 baja a Kla constante según se describe en el
ejemplo 3, se consiguieron rendimientos más altos y en el
rendimiento no influyó la adición de Fe3+.
\vskip1.000000\baselineskip
El intervalo de concentración de hierro que no
influye en la expresión de CRM197 se determinó en microplacas. Las
microplacas estimulan las condiciones de aireación limitada que
existen en el procedimiento de fermentación de la invención.
El cultivo en microplacas se realizó en el mismo
medio que se usó en las fermentaciones descritas anteriormente (en
un medio similar a medio CY). Se añadió Fe3+ a partir de una
solución de reserva de FeCl_{3},6H_{2}O a 1 g/l de ion
Fe3+.
Los pocillos de las placas de microvaloración se
llenaron con el medio y se inocularon a 8 E5 bact/mL.
Las placas de microvaloración se incubaron a
34,5ºC en agitación de 250 rpm durante 46 h en el caso de
Corynebacterium diphtheriae que expresa CRM197 y Corynebacterium
diphtheriae que expresa Toxina de la difteria.
Las muestras se filtraron a través de un filtro
de 0,22 \mum.
La expresión se midió por procedimiento de
densitometría en SDS-page (XT Criterion
4-12% bis tris de BioRad) coloreada con azul de
Coomassie (tinción de azul Gelcode de Pierce). La referencia usada
para la cuantificación fue el mutante CRM de toxina de la difteria
de List Biological Laboratories INC, introducido en diferentes
concentraciones en el gel.
La Tabla 7 muestra la expresión de CRM197 en
diferentes concentraciones de hierro para C. diphtheriae
cultivada en condiciones de aireación limitada en pocillos de
microvaloración. La expresión de CRM197 fue escasamente sensible a
represión por Fe3+ y no se vio afectada significativamente por la
adición de 1 ppm o 2 ppm de Fe3+. Sólo a 3 ppm se produjo una caída
significativa en la expresión de CRM197. Incluso en este nivel de
Fe3+, la expresión de CRM197 siguió siendo del 79% de la conseguida
sin adición de Fe3+.
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Los rendimientos de CRM197 se expresan como un
porcentaje del rendimiento obtenido sin adición de Fe3+
extraordinario.
Los resultados de la expresión de TD se muestran
en la Tabla 8 para C. diphtheriae cultivada en pocillos de
microvaloración en las condiciones indicadas. La producción de TD en
condiciones de aireación limitada fue también escasamente sensible
a la represión por Fe3+. La expresión de TD aumentó al aumentar la
concentración de Fe3+ con una producción máxima de TD conseguida a
700 ppb. La expresión de TD empezó a descender sólo cuando la
concentración de Fe3+ se aumentó a 3 ppm.
Los rendimientos de TD se expresan como un
porcentaje del rendimiento alcanzado sin adición de Fe3+
extraordinario.
Claims (15)
1. Un procedimiento de fermentación que
comprende una etapa de fermentación de crecimiento de una cepa de
Corynebacterium diphtheria en un medio en un fermentador en
condiciones de agitación suficiente para mantener un cultivo
homogéneo y aireación limitada de manera que la pO2 dentro del
cultivo descienda a menos del 4% para la mayoría de la etapa de
fermentación en el que la etapa de fermentación tiene lugar en a) un
fermentador de 100 a 250 litros a un KLa de 30 a 60
h-1 o b) en un fermentador de 250 a 800 litros a un
KLa de 60-150 h-1.
2. El procedimiento de fermentación según la
reivindicación 1 en el que la pO2 desciende aproximadamente a cero
durante la mayoría de la etapa de fermentación.
3. El procedimiento según la reivindicación 1 ó
2 en el que la pO2 de menos del 4% se mantiene desde el momento en
que la Corynebacterium diphtheria se ha desarrollado hasta
una densidad suficiente para que la pO2 descienda a menos del 4%
debido al rápido consumo de oxígeno, hasta que se completa la etapa
de fermentación.
4. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 en el que la etapa de fermentación se
efectúa a KLa constante.
5. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en el que la etapa de fermentación se
efectúa a velocidad de agitación y tasa de aireación constantes.
6. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 en el que la etapa de fermentación se
efectúa en condiciones variables de kLa.
7. El procedimiento según las reivindicaciones 1
a 6 en el que la etapa de fermentación tiene lugar con un flujo de
aire de aire comprimido de 15 a 25 Umin y una velocidad de agitación
de 150 a 250 rpm.
8. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en el que el medio es CY, SOC o medio
similar y el pH dentro del fermentador se encuentra entre 7,0 y 7,8
por el grado de aireación sin requerir la adición de ácido o
base.
9. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en el que la cepa de Corynebacterium
diphtheria produce toxina de la difteria o un mutante de la
misma, en particular CRM197.
10. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en el que la cepa de Corynebacterium
diphtheria es ATCC39255.
11. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en el que el medio contiene entre 10 y
4.000 ppb de hierro.
12. Un procedimiento para fabricación de una
preparación de un antígeno de C. diphtheriae que comprende
las etapas de efectuar el procedimiento de fermentación según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y aislar el antígeno de
C. diphtheriae a partir del cultivo.
13. El procedimiento según la reivindicación 12
en el que el antígeno de C. diphtheriae es toxina de la
difteria o un fragmento o un mutante de la misma (por ejemplo
CRM197).
14. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 12 que comprende una etapa de adición de uno
o más antígenos adicionales al antígeno de C.
diphtheriae.
15. El procedimiento según la reivindicación 14
que comprende además una etapa de conjugación de la toxina de la
difteria o un fragmento o mutante de la misma para uno o más
antígenos adicionales.
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