ES2335304T3 - Uso de polimeros activados para la separacion de multimeros proteicos y polipeptidicos. - Google Patents
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Abstract
Uso de un polímero activado para separar un multímero polipeptídico asociado no covalentemente, que comprende múltiples subunidades polipeptídicas, en múltiples subunidades polipeptídicas, en el que - el polímero activado comprende una fracción química mediante la cual el polímero puede enlazarse covalentemente a la subunidad polipeptídica en el multímero polipeptídico asociado no covalentemente. - el polímero activado es un polietilenglicol activado, un polidextran activado o una poli-L-lisina activada, y - cada una de las subunidades polipeptídicas comprende una cadena polipeptídica única; y/o un grupo de al menos dos cadenas polipeptídicas únicas, en las que al menos dos cadenas polipeptídicas únicas están enlazadas covalentemente, una a la otra, y en las que al menos una de las subunidades polipeptídicas comprende un anticuerpo de cadena única que comprende al menos una región variable de anticuerpo.
Description
Uso de polímeros activados para la separación de
multímeros proteicos y polipeptídicos.
La presente invención se refiere a un uso de
polímeros activados. Específicamente, la presente invención se
refiere a un uso de polímeros activados en el campo de la
preparación de proteínas y/o polipéptidos.
Tras una expresión recombinante, las moléculas
proteicas y/o polipeptídicas existen frecuentemente en una o más
isoformas, es decir, estas moléculas exhiben frecuentemente
heterogenicidad de producto. Como ejemplo particularmente bien
estudiado, se conoce que los anticuerpos de cadena única, o scFvs,
existen tras una expresión recombinante como una mezcla de especies
monoméricas y multiméricas, principalmente diméricas. Las especies
monoméricas resultan de la asociación covalente o no covalente de
las regiones variables del anticuerpo en la misma cadena
polipeptídica, unas con las otras. Por otra parte, las especies
diméricas resultan de una asociación de la primera cadena
polipeptídica y de la segunda cadena polipeptídica, comprendiendo
cada una, por ejemplo, dos regiones variables A y B complementarias
del anticuerpo, una con la otra, de manera que la región variable A
de la primera cadena polipeptídica se asocia con la región variable
B de la segunda cadena polipeptídica, y viceversa. Estas especies
son conocidas normalmente como un diacuerpo (Hudson et al.
(1999) J. Immunol. Met. 231, 177-189).
En los casos en que los polipéptidos están
destinados a un uso terapéutico posterior, dicha heterogenicidad de
producto es generalmente no deseable, ya que los productos
heterogéneos exhiben frecuentemente propiedades farmacocinéticas o
actividades biológicas distintas. En el desarrollo de un polipéptido
terapéutico, es importante poder predecir como actuará este
polipéptido in vivo (es decir, su modo de acción cualitativo)
así como la magnitud de esta actividad biológica (es decir, su
eficacia cuantitativa y su distribución en el cuerpo). Dichas
predicciones son frecuentemente difíciles de realizar con seguridad
para productos heterogéneos (Moore et al. (1999)
Biochemistry. 38, 13960-13967).
Sin embargo, también puede ser problemático
crear un producto homogéneo que permanezca como tal. Esto es así
debido a que la heterogenicidad del polipéptido es frecuentemente el
resultado de un equilibrio termodinámico entre el polipéptido
monomérico y el multimérico; tras la retirada de una de las
especies, el equilibrio se restablece entre ambas especies (Lee
et al. (2002) J. Mol. Biol. 320,107-127).
Esto se aplica tanto a la fracción retirada como a la fracción
restante, de manera que un tiempo después de una separación
cromatográfica, cada fracción exhibirá aproximadamente la misma
relación monómero:multímero, siendo esta relación el resultado de
la equilibración isomérica entre ambas o entre todas las especies de
polipéptidos. Entonces, una simple retirada cromatográfica de una
de las especies polipeptídicas representa frecuentemente solo una
solución temporal al problema de la heterogenicidad del producto,
ya que frecuentemente existe un impulso termodinámico natural hacia
un producto heterogéneo. Este problema puede ser salvado mediante la
conversión de un producto purificado deseado en una forma en la que
la equilibración termodinámica entre las isoformas ya no pueda
ocurrir, por ejemplo, en un producto liofilizado. A continuación,
este producto liofilizado es reconstituido inmediatamente antes de
la administración en el punto de tratamiento, de manera que se
eliminan una equilibración termodinámica no deseada y un incremento
concomitante en la heterogenicidad del producto o al menos se
mantienen en un mínimo absoluto. Sin embargo, la separación de la
isoforma no deseada de una mezcla heterogénea resulta frecuentemente
en una pérdida considerable de producto polipeptídico.
Independientemente de los problemas de la
heterogenicidad polipeptídica, el desarrollador de los polipéptidos
terapéuticos se encuentra frecuentemente con la necesidad de modular
las propiedades farmacocinéticas y/o inmunogénicas del polipéptido
destinado a ser administrado. Por ejemplo, el polipéptido destinado
para terapia puede ser eliminado del suero del paciente demasiado
rápidamente para provocar cualquier efecto terapéutico, un problema
que generalmente se convierte en más intratable cuanto más pequeño
es el peso molecular del polipéptido. La tasa de eliminación de un
polipéptido terapéutico del suero de un paciente puede ser acelerada
sin desearlo si el polipéptido desencadena una respuesta
inmunogénica, es decir, si el sistema inmune del paciente monta una
respuesta inmune al material extraño. Por cada una de estas razones,
es frecuentemente deseable derivar un polipéptido destinado para la
administración a un paciente, de manera que se extienda la vida
media en suero y se reduzca la inmunogenicidad del polipéptido,
siendo lo primero un resultado, al menos en parte, de lo último.
Estos objetivos se han cumplido mediante una
conjugación de polímeros orgánicos extendidos con polipéptidos
terapéuticos. Para citar un ejemplo en la literatura, se ha usado
una conjugación de polipéptidos con polietilenglicol ("PEG")
con este fin (Roberts et al. (2002) Adv. Drug Delivers Rev.
54, 459-476). La conjugación con polímeros
orgánicos extendidos incrementa el peso molecular efectivo de los
polipéptidos mientras que, al mismo tiempo, los protege del
reconocimiento por el sistema inmune, cada uno de los cuales tiene
el efecto de que la vida media en suero del polipéptido se extiende
ventajosamente.
Por lo tanto, el desarrollador de polipéptidos
terapéuticos se encuentra frecuentemente con el reto doble de
generar un producto homogéneo mejorando al mismo tiempo las
propiedades farmacocinéticas y/o inmunogénicas de este producto.
Combinadas, estas consideraciones necesitan numerosas etapas
secuenciales de aislamiento, purificación y conjugación, cada una
de las cuales resulta en una pérdida de producto y tiempo y, en
general, en una complejidad y un coste añadidos a todo el proceso
de producción. Por lo tanto, es un objeto de la invención
proporcionar una manera alternativa, más concertada, de abordar los
problemas mencionados anteriormente.
\newpage
Los inventores de la presente invención han
descubierto ahora sorprendentemente que la conjugación de
polipéptidos con polímeros extendidos resulta no solo en las
ventajas ya reconocidas para dichos polímeros (es decir, mejora de
las propiedades farmacocinéticas y/o inmunogénicas de un producto),
sino también en la separación de polipéptidos multiméricos en
polipéptidos monoméricos conjugados en una manera permanente.
Por consiguiente, un aspecto de la presente
invención se refiere al uso de un polímero activado para separar un
multímero polipeptídico asociado no covalentemente, que comprende
múltiples subunidades polipeptídicas, en dichas múltiples
subunidades polipeptídicas, según las reivindicaciones adjuntas.
Según este aspecto de la invención, se usa un
polímero, preferentemente un polímero orgánico, en una forma
activada. El término "activada" se refiere a cualquier forma
del polímero que comprenda una fracción química mediante la cual el
polímero pueda ser enlazado covalentemente a una subunidad
polipeptídica en el multímero polipeptídico asociado no
covalentemente. Debido a que un polímero que comprende dicha
fracción retendrá esta fracción tras enlazarse covalentemente a la
subunidad polipeptídica, el término "polímero activado", tal
como se usa en la presente memoria, se refiere al polímero tanto
antes como también después del acoplamiento a la subunidad
polipeptídica, es decir, un polímero activado que ya ha formado un
enlace covalente con una subunidad polipeptídica será denominado
todavía como un "polímero activado". Preferentemente, la
fracción química para el enlace covalente al polipéptido
reaccionará bajo condiciones fisiológicas o condiciones cercanas a
las fisiológicas, o al menos bajo condiciones que no serán dañinas
para las subunidades polipeptídicas del multímero polipeptídico
asociado no covalente-
mente.
mente.
La expresión "multímero polipeptídico asociado
no covalentemente" debe entenderse que abarca cualquier especie
polipeptídica que comprende al menos dos cadenas polipeptídicas que
pueden separarse una de la otra sin romper ningún enlace químico
covalente. La asociación puede ser de una naturaleza ordenada, por
ejemplo del tipo observado entre dos polipéptidos que son
complementarios estéricamente y/o electrostáticamente uno respecto
al otro. Como un ejemplo de dicha asociación ordenada, puede
imaginarse un homodímero polipeptídico del tipo descrito
anteriormente en el contexto de anticuerpos diméricos de cadena
única (es decir, "diacuerpos"). Como alternativa, la
asociación puede ser de una naturaleza desordenada, por ejemplo, del
tipo observado en un precipitado polipeptídico, en el que las
cadenas polipeptídicas individuales se aglomeran y se hacen
insolubles en una solución acuosa. Como un ejemplo de dicha
asociación desordenada, puede imaginarse cuerpos de inclusión
insolubles resultantes de una expresión recombinante de
polipéptidos.
Sin embargo, el uso inventivo es independiente
de si el multímero polipeptídico está asociado en una manera
ordenada o desordenada. Tras una reacción covalente entre al menos
una, preferentemente cada una de las múltiples subunidades
polipeptídicas del multímero polipeptídico asociado no
covalentemente, con al menos una molécula del polímero activado,
tal como se ha descrito anteriormente, estas múltiples subunidades
polipeptídicas se convierten en separadas unas de las otras a lo
largo de las líneas de su asociación mutua no covalente.
El término "separar" (como verbo) debe
entenderse como el acto de introducir una distancia suficiente, en
solución, entre dos subunidades polipeptídicas previamente asociadas
no covalentemente, de manera que ya no existe ninguna, o alguna
interacción molecular atractiva considerable entre estas dos
subunidades. Las interacciones moleculares que pueden existir entre
dos subunidades polipeptídicas asociadas no covalentemente
previamente a una separación pueden incluir, por ejemplo, una o más
interacciones de enlace de hidrógeno, interacciones de Van der
Waals, solapamiento de orbitales pi deslocalizados, interacciones
hidrófobas e interacciones electrostáticas/iónicas. Tras la
reacción con el polímero activado, la distancia entre cada una de
las dos subunidades polipeptídicas, por razonas detalladas más
adelante, se incrementa de manera que las fuerzas atractivas
globales entre estas dos subunidades polipeptídicas decrece hasta
cero o al menos se hace muy pequeña.
La mención de "dos subunidades
polipeptídicas" no debe entenderse de manera restrictiva, sino de
manera ilustrativa de la separación efectuada entre dos subunidades
polipeptídicas cualesquiera asociadas no covalentemente dentro de
un multímero polipeptídico asociado no covalentemente. Por lo tanto,
el uso inventivo puede aplicarse a multímeros polipeptídicos
asociados no covalentemente que comprenden tan solo dos subunidades
polipeptídicas asociadas no covalentemente, así como a multímeros
polipeptídicos asociados no covalentemente que comprenden dos, o
incluso más de dos, es decir, tres, cuatro, cinco, seis, o incluso
muchas subunidades polipeptídicas asociadas no covalentemente. En
el último caso, cada una de estas muchas subunidades polipeptídicas
estarán asociadas no covalentemente a una o más de las otras
subunidades polipeptídicas; el proceso de separación descrito en el
párrafo anterior debe entenderse como ilustrativo del efecto del uso
inventivo en un interfaz determinado entre dos subunidades
polipeptídicas cualesquiera. Visto desde el punto de vista de un
único multímero polipeptídico asociado no covalentemente, entonces,
el proceso de separación de este multímero en sus múltiples
subunidades polipeptídicas constituyentes implicará muchas de tales
separaciones moleculares ocurriendo secuencial y/o simultáneamente
entre cada uno de los interfaces subunidad-subunidad
comprendidos dentro del multímero polipeptídico asociado no
covalentemente.
El uso inventivo implica varias ventajas.
Principalmente, al comprender que un polímero activado puede ser
usado no solo para la mejora de las propiedades farmacocinéticas y/o
inmunogénicas de un polipéptido terapéutico, sino también para
convertir una mezcla polipeptídica isoméricamente heterogénea en
monómero (es decir, en una única especie definida), los inventores
han conseguido un nivel de coordinación no observado previamente en
la producción de polipéptidos destinados para uso terapéutico. Las
propiedades farmacocinéticas y/o inmunogénicas de los polipéptidos
destinados para la administración no solo pueden mejorarse mediante
la manera conocida mediante la conjugación con polímero, sino que
esta conversión en conjugado puede realizarse sin tener que separar
primero un isómero polipeptídico monomérico deseado de sus diversas
especies multiméricas. Por sí solo, esto implica una
racionalización de la producción global de polipéptidos
terapéuticos, que conduce, tal como lo hace en una etapa de
proceso, a un resultado obtenible previamente solo mediante la
realización de múltiples etapas de proceso. Sin embargo, el uso
inventivo tiene un efecto adicional que lo hace especialmente
susceptible para la producción de polipéptidos terapéuticos. La
conjugación con polímero parece prevenir también el
restablecimiento no deseado del equilibrio termodinámico entre las
especies polipeptídicas monoméricas y multiméricas. Es decir, una
vez que cada subunidad polipeptídica es separada del multímero
polipeptídico asociado no covalentemente, esta subunidad tenderá a
permanecer separada y no se re-asociará con otras
subunidades para formar de nuevo un nuevo multímero polipeptídico.
Entonces, el uso inventivo permite no solo el establecimiento sino
que permite también el mantenimiento de una homogenicidad deseable
del producto en polipéptido monomérico.
En breve, el uso inventivo permite la obtención,
en una única etapa, de un polipéptido homogéneo conjugado con
polímero, cuyo conjugado polipéptido-polímero puede
ser purificado, a continuación, para uso terapéutico.
Pueden imaginarse diversos escenarios ventajosos
para la aplicación del uso inventivo. En el primero, se parte de la
posesión de un multímero polipeptídico asociado no covalentemente,
homogéneo o casi homogéneo, para el cual el equilibrio isomérico se
encuentra lejos del lado del multímero, pero las especies
monoméricas se desean en una forma conjugada con polímero. En este
caso, puede imaginarse la reacción siguiente (en la que el
multímero es un homodímero que comprende dos subunidades
monoméricas, con propósitos ilustrativos, "AP" representa un
polímero activado, y "SU" representa una subunidad
monomérica):
Como alternativa, se puede partir de la posesión
de una mezcla polipeptídica isoméricamente heterogénea que
comprende una tasa de equilibrio de (una vez más) polipéptido
homodimérico y monomérico, en la que el dímero comprende dos
subunidades idénticas, y el monómero comprende un polipéptido
idéntico a cada una de las dos subunidades en el dímero
(abreviaciones iguales a las anteriores):
En cada uno de los dos escenarios no exhaustivos
representados anteriormente, el uso inventivo del polímero activado
resulta, en una etapa, en un producto homogéneo en monómero y
conjugado apropiadamente con polímero para un uso posterior como un
elemento terapéutico. Pueden imaginarse otros escenarios, y estos se
describen en mayor detalle más adelante.
Sin limitarse a la teoría, los presentes
inventores creen que el efecto ventajoso del uso inventivo puede
estar relacionado con las fluctuaciones cinéticas que tienen lugar
en cualquier solución polipeptídica con el tiempo. Específicamente,
se conoce que una estructura polipeptídica determinada cambia
continuamente entre diferentes estados conformacionales, es decir,
subestructuras. La rapidez de esta transición depende de una serie
de factores, entre ellos la secuencia de aminoácidos particular del
polipéptido y la temperatura del medio. Como un ejemplo en el campo
de la tecnología de anticuerpos de cadena única, se conoce que dos
regiones variables de anticuerpo, asociadas intramolecularmente,
conectadas mutuamente por una secuencia de unión polipeptídica se
abren y se cierran continuamente en solución; se habla de
"respiración molecular". En el contexto específico de dos
subunidades polipeptídicas asociadas no covalentemente, dicha
"respiración" ocurre no entre dos regiones polipeptídicas
localizadas en la misma cadena polipeptídica, sino entre dos cadenas
polipeptídicas distintas asociadas no covalentemente que pertenecen
a dos subunidades polipeptídicas distintas. En el caso, como en el
uso inventivo, de que al menos una de estas dos subunidades
polipeptídicas se ha conjugado con al menos una molécula de
polímero activado, parte del polímero no estructurado puede
deslizarse entre las dos subunidades polipeptídicas cuando éstas
experimentan una transición entre dos conformaciones y, al hacerlo,
se mueven más lejos una de la otra. En la región en la que la
estructura polimérica se ha solapado entre las subunidades
polipeptídicas adyacentes, estas últimas no pueden
re-aproximarse una a la otra en la región de
interposición del polímero, aunque todavía permanecen fuertemente
asociadas en otras regiones entre las cuales no se ha interpuesto
ningún polímero. En la siguiente transición conformacional, cuando
las partes todavía asociadas de las dos subunidades polipeptídicas
se separan de nuevo una de la otra, el polímero que está ya
insertado parcialmente se desliza más profundamente entre las dos
subunidades polipeptídicas, de manera que se previene que una parte
aún más grande de las superficies de las dos subunidades
polipeptídicas se re-asocien, y así continuamente.
Los presentes inventores creen que una interposición progresiva del
polímero, como una forma de cuña, entre las dos subunidades
polipeptídicas del multímero polipeptídico sirve, con el tiempo,
para deshacer el multímero polipeptídico en sus subunidades
polipeptídicas constituyentes, cada una de las cuales al final está
conjugada o se conjuga con al menos un polímero activado por sí
misma.
\newpage
Según una realización de la invención, el
polímero activado tiene un peso molecular de al menos 3.000 g/mol y
comprende de 25 a 70% en peso de átomos polares. El peso molecular
del polímero activado requerido para conseguir el efecto ventajoso,
tal como el expuesto anteriormente, variará generalmente
directamente con el tamaño de las porciones hidrófobas dentro de la
subunidad polipeptídica mediante la cual ocurre la multimerización.
Debido a que el tamaño de dichas partes hidrófobas no variará
directamente con el tamaño de las subunidades polipeptídicas dentro
del multímero polipeptídico asociado no covalentemente, no es
posible, de manera fácil, predecir a priori exactamente qué
peso molecular del polímero activado debería usarse para obtener
resultados óptimos, conociendo previamente el peso molecular de las
subunidades polipeptídicas a separar. Sin embargo, las
realizaciones preferentes de la invención prevén el uso de un
polímero activado que tiene un peso molecular de 3.500 g/mol, 5.000
g/mol, 20.000 g/mol o 40.000 g/mol. Aquí, debe entenderse que los
valores de peso molecular proporcionados en la presente memoria
representan valores promedio de peso molecular, como es común en el
campo de la química polimérica. Es decir, que los valores de peso
molecular proporcionados en la presente memoria representan el peso
molecular que se encuentra más frecuentemente en una distribución
Gaussiana de muchos pesos moleculares dentro de una muestra de
polímero activado. Como tal, la indicación de un valor particular
para el peso molecular en la presente memoria no excluye el
escenario en el que dentro de una muestra de polímero activado,
existan moléculas poliméricas con pesos moleculares tanto mayores
como menores que el valor de peso molecular indicado.
Las realizaciones preferentes de la invención
prevén el uso de un polímero activado que comprende de 27 a 60% en
peso de átomos polares, particularmente de 32 a 45% en peso de
átomos polares, de 35 a 38% en peso de átomos polares; de 36 a 37%
en peso de átomos polares; de 27 a 28% en peso de átomos polares; de
48 a 50% en peso de átomos polares; o de 54 a 56% en peso de átomos
polares. Un polímero activado con estos intervalos de contenido de
átomos polares exhibirá generalmente las características que se cree
que son responsables del efecto observado.
La expresión "átomos polares" debe
entenderse que se refiere a átomos que participan en interacciones
de enlace de hidrógeno con moléculas de agua en solución acuosa y
que, por lo tanto, contribuyen a que un polímero exhiba propiedades
clasificadas generalmente por las personas con conocimientos en la
materia como "hidrófilas". Los miembros predominantes de esta
clase de átomos incluyen oxígeno, azufre, flúor, cloro, fósforo y
nitrógeno. Una persona con conocimientos en la materia comprenderá
que una persona está limitada en su elección de átomos polares por
qué átomos serán también susceptibles a la inclusión en una molécula
terapéutica destinada a la administración a un paciente.
A la luz del mecanismo propuesto anteriormente,
en el que el multímero polipeptídico experimenta una transición
entre diferentes sub-conformaciones es deshecho en
sus subunidades polipeptídicas constituyentes mediante la
interposición gradual del polímero activado, puede entenderse por
qué los polímeros activados con el contenido o contenidos
anteriores de átomos polares, es decir, polímeros activados que son
altamente hidrófilos, serían muy apropiados para separar las
subunidades polipeptídicas de un multímero polipeptídico. En medio
acuoso, las subunidades polipeptídicas de un multímero
polipeptídico asociado no covalentemente se asocian normalmente,
unas con las otras, en interfaces hidrófobos (Bahadur et al.
(2004) J. Mol. Biol. 336, 943-955). La inserción
gradual del polímero activado entre dichos interfaces cambia el
entorno interno entre las superficies opuestas de las dos
subunidades polipeptídicas en una manera fundamental: el entorno
previamente hidrófobo entre las subunidades polipeptídicas se
convierte de manera creciente en hidrófilo debido a la presencia de
la estructura polimérica hidrófila. En dicho escenario, las caras
hidrófobas de las dos subunidades polipeptídicas ya no pueden
interactuar, y la tendencia de estas dos subunidades polipeptídicas
a asociarse se reduce enormemente o se pierde completamente.
Según una realización adicional de la invención,
cada subunidad polipeptídica comprendida dentro del multímero
polipeptídico asociado no covalentemente comprende una cadena
polipeptídica única y/o un grupo de al menos dos cadenas
polipeptídicas únicas, en las que al menos dos cadenas
polipeptídicas únicas están enlazadas covalentemente, una a la
otra, para formar el grupo. En el caso de que cada subunidad
polipeptídica comprenda una cadena polipeptídica única, el
multímero polipeptídico asociado no covalentemente puede ser
entendido como una colección de dos o más cadenas polipeptídicas
distintas que están asociadas no covalentemente, unas a las otras.
Como un ejemplo, puede imaginarse dicho multímero polipeptídico
asociado no covalentemente como un "diacuerpo", tal como se ha
expuesto anteriormente en la presente memoria. En tal caso, el uso
de la invención separaría las dos cadenas polipeptídicas scFv
individuales, una de la otra, de manera que se generan dos moléculas
scFv distintas, estando cada una de ellas enlazada covalentemente a
al menos una molécula de polímero activado.
Según una realización especialmente preferente
de la invención, la subunidad polipeptídica comprende una cadena
polipeptídica única y la cadena polipeptídica única es un anticuerpo
de cadena única, es decir, una molécula scFv. Entonces, esta
realización de la invención resulta en múltiples moléculas scFv
distintas, cada una enlazada covalentemente a al menos una
molécula, preferentemente a una molécula de polímero activado, donde
estas moléculas scFv estaban previamente asociadas no
covalentemente en un multímero polipeptídico asociado no
covalentemente.
Según otra realización especialmente preferente
de la invención, la subunidad polipeptídica comprende solo una
región variable de un anticuerpo, tal como una región variable de un
anticuerpo que es capaz de enlazarse específicamente solo a
antígeno, es decir, sin emparejarse con otra región variable de
anticuerpo. Aquí, entonces, el multímero polipeptídico asociado no
covalentemente comprende muchos dominios variables de anticuerpo
asociados no covalentemente, cada uno de los cuales es capaz
independientemente de enlazarse a antígeno, es decir, cada uno de
los cuales es un "anticuerpo de dominio único".
En el caso de que cada subunidad polipeptídica
comprenda un grupo de al menos dos cadenas polipeptídicas únicas,
el uso inventivo separará el multímero polipeptídico asociado no
covalentemente en al menos dos grupos de cadenas polipeptídicas
únicas (es decir, dos subunidades), en las que cada grupo comprende
al menos dos cadenas polipeptídicas únicas, cada una de las cuales
está enlazada covalentemente a al menos otra cadena polipeptídica
única dentro de la misma subunidad. Dicha fijación covalente tomará
más frecuentemente la forma de uniones disulfuro entre residuos
cisteína en las dos cadenas polipeptídicas respectivas. Como ejemplo
de una subunidad polipeptídica que comprende al menos dos cadenas
polipeptídicas únicas enlazadas covalentemente, puede imaginarse
una molécula Fab que comprende una cadena pesada de anticuerpo y una
cadena ligera de anticuerpo, en las que las cadenas pesada y ligera
de anticuerpo están enlazadas mediante disulfuro una a la otra.
Aquí, un multímero polipeptídico asociado no covalentemente que
comprende múltiples moléculas Fab asociadas no covalentemente una a
la otra pueden ser separadas mediante el uso inventivo en múltiples
moléculas Fab distintas, cada una enlazada covalentemente con al
menos una molécula de polímero activado.
Como otro ejemplo de una subunidad polipeptídica
que comprende un grupo de al menos dos cadenas polipeptídicas
únicas enlazadas covalentemente, puede imaginarse una molécula de
anticuerpo completo, es decir, una molécula IgC que comprende dos
cadenas polipeptídicas pesadas y dos cadenas polipeptídicas ligeras,
estando cada cadena ligera enlazada covalentemente, es decir,
enlazada mediante disulfuro, a una cadena pesada, y estando las dos
cadenas polipeptídicas pesadas enlazadas mediante disulfuro una a la
otra. Aquí, un multímero polipeptídico asociado no covalentemente
que comprende múltiples moléculas IgC asociadas no covalentemente
una a la otra pueden ser separadas mediante el uso inventivo en
múltiples moléculas IgC distintas, cada una enlazada covalentemente
con al menos una molécula de polímero activado.
Según una realización adicional, el multímero
polipeptídico asociado no covalentemente puede comprender
subunidades polipeptídicas de dos tipos diferentes: un tipo que
comprende una cadena polipeptídica única, tal como se ha explicado
anteriormente, y el otro tipo que comprende un grupo de dos o más
cadenas polipeptídicas enlazadas covalentemente, tal como se ha
explicado anteriormente. En dicho multímero polipeptídico asociado
no covalentemente, una subunidad polipeptídica que comprende una
cadena polipeptídica única puede estar asociado no covalentemente
con una cadena polipeptídica de una subunidad polipeptídica que
comprende múltiples cadenas polipeptídicas enlazadas
covalentemente. En este caso, el uso inventivo resultaría, después
de la separación por conjugación con polímero activado, en una
subunidad polipeptídica de cadena única enlazada covalentemente con
al menos una molécula, preferentemente una molécula de polímero
activado e, independientemente, un grupo de cadenas polipeptídicas
únicas enlazadas covalentemente, estando el grupo en su conjunto
enlazado covalentemente con al menos una molécula, preferentemente
una molécula de polímero activado.
Según una realización adicional de la invención,
cada subunidad polipeptídica está enlazada covalentemente al
polímero activado mediante un grupo amino, un grupo sulfhidrilo, un
grupo carboxilo o un grupo hidroxilo comprendido dentro de la
subunidad polipeptídica. Tal como conoce una persona con
conocimientos en la materia, la mayoría de los polipéptidos
comprenderá al menos un grupo amino, carboxilo y/o hidroxilo, ya que
estos son fracciones de cadena lateral de aminoácidos normales.
Cuando el polímero activado usado en el uso inventivo es uno que
reaccionará covalentemente con un grupo amino, carboxilo y/o
hidroxilo, es por lo tanto probable que la subunidad polipeptídica
separada se fijará covalentemente a más de una molécula de polímero
activado. Sin embargo, el uso de un polímero activado que formará
un enlace covalente con un grupo sulfhidrilo en las subunidades
polipeptídicas comprendidas dentro del multímero polipeptídico es
especialmente preferente, ya que el número de dichos grupos en un
polipéptido puede ajustarse frecuentemente (incorporando u omitiendo
residuos de cisteína) de manera que no más de un polímero activado
estará enlazado covalentemente a la subunidad polipeptídica tras la
separación del multímero polipeptídico asociado no covalentemente.
Para las aplicaciones terapéuticas, frecuentemente es beneficioso
para una homogeneidad de producto ventajosa, limitar el número de
polímeros activados que están fijados a un polipéptido terapéutico a
determinado número. Para los fines del presente uso inventivo de
polímeros activados, generalmente es suficiente limitar el número de
polímeros activados que finalmente están enlazados covalentemente a
una subunidad polipéptida a uno.
En el caso de que el polímero activado sea capaz
de formar un enlace químico covalente con un grupo amino
comprendido dentro de la subunidad polipeptídica, el polímero
activado comprende ventajosamente un grupo hidroxisucinimidilo, un
grupo carboxilo, un grupo epóxido, un grupo ceto o un grupo
aldehído. Todos estos grupos son capaces de reaccionar
covalentemente con amina bajo condiciones fisiológicas o condiciones
cercanas a las fisiológicas. En el caso de que el polímero activado
sea capaz de formar un enlace químico covalente con un grupo
sulfhidrilo comprendido dentro de la subunidad polipeptídica, el
polímero activado comprende ventajosamente un grupo maleimida, un
grupo vinil sulfona o un grupo sulfhidrilo, preferentemente un grupo
maleimida. Todos estos grupos son capaces de reaccionar
covalentemente con sulfhidrilo bajo condiciones fisiológicas o
condiciones cercanas a las fisiológicas. En el caso de que el
polímero activado sea capaz de formar un enlace químico covalente
con un grupo carboxilo comprendido dentro de la subunidad
polipeptídica, el polímero activado comprende ventajosamente un
grupo amino o un grupo hidroxilo. Ambos de estos grupos son capaces
de reaccionar covalentemente con carboxilo bajo condiciones
fisiológicas o condiciones cercanas a las fisiológicas. En el caso
de que el polímero activado sea capaz de formar un enlace químico
covalente con un grupo hidroxilo comprendido dentro de la subunidad
polipeptídica, el polímero activado comprende ventajosamente un
grupo carboxilo, un grupo aldehído o un grupo ceto, siendo el grupo
carboxilo especialmente preferente. Estos grupos son capaces de
reaccionar covalentemente con hidroxilo bajo condiciones
fisiológicas o condiciones cercanas a las fisiológicas.
Según una realización adicional de la invención,
cada subunidad polipeptídica puede estar enlazada covalentemente al
polímero activado mediante un carbohidrato comprendido dentro de la
subunidad polipeptídica, cuyo carbohidrato ha sido modificado
químicamente previamente para comprender al menos un grupo aldehído.
Una persona con conocimientos ordinarios en la materia conoce como
convertir un carbohidrato en un aldehído, por ejemplo, mediante un
tratamiento con periodato de sodio (aproximadamente 10 mM) suave.
En células eucariotas, muchos polipéptidos experimentan
modificaciones post-translacionales que implican
glicosilación, es decir, funcionalización del polipéptido expresado
con carbohidrato, cuya forma puede ser en algunos casos bastante
compleja. Un multímero polipeptídico asociado no covalentemente
puede ser el resultado de expresar un polipéptido recombinante en un
sistema de expresión de huésped eucariota, por ejemplo un sistema
de levadura o célula de ovario de hámster chino ("CHO"), y por
lo tanto, puede presentar dicho patrón de glicosilación. Dichos
multímeros polipeptídicos que comprenden subunidades polipeptídicas
glicosiladas son también susceptibles del uso inventivo, ya que un
polímero activado que comprende un grupo amino libre reaccionará
con un carbohidrato que ha sido convertido, al menos parcialmente,
en aldehído para formar una base Schiff estable, que puede entonces
ser convertida a una amina secundaria estable mediante aminación
reductiva. Por supuesto, una subunidad polipeptídica que ha
experimentado algún grado de modificación
post-translacional no necesita estar enlazado
covalentemente al polímero activado mediante sus grupos
carbohidrato que han sido re-funcionalizados como
aldehídos; un acoplamiento al polímero activado mediante cualquiera
de las otras químicas indicadas anteriormente en esta memoria, es
decir, directamente entre grupos que pertenecen a los aminoácidos
de las subunidades polipeptídicas y el polímero activado, es
también posible. Por lo tanto, con polipéptidos modificados
post-translacionalmente, el acoplamiento de polímero
activado mediante un carbohidrato funcionalizado con aldehído
representa meramente un modo adicional de acoplamiento dentro del
uso de la invención.
Según la invención, el polímero activado puede
ser un polietilen glicol ("PEG") activado. El PEG activado
puede tomar muchas formas comerciales disponibles, por ejemplo
mPEG-SPA (mPEG-propionato de
succinimidilo), mPEG-SBA
(mPEG-butanoato de succinimidilo),
mPEG-SMB
(mPEG-alfa-metilbutanoato de
succinimidilo), mPEG2-NHS
(mPEG2-N-hidroxisuccinimida),
mPEG-OPTE (mPEG-tioéster),
mPEG-CM-HBA-NHS
(mPEG-carboximetil-
3-ácido hidroxibutanoico-N-hidroxisuccinato), mPEG-ACET (mPEG-acetaldehído dietil acetal), mPEG2-acetaldehído (equivalente a mPEG2-dietil acetal), mPEG-propionaldehído, mPEG2-propionaldehído, mPEG-butiraldehído,
mPEG2-butiraldehído, mPEG-cetonas, mPEG-MAL (mPEG-maleimida), mPEG2-MAL (mPEG2-maleimida) y
mPEG-tioles (todos estos polímeros estando disponibles comercialmente en Nektar Therapeutics, San Carlos, CA, US). Todos son especialmente preferentes como polímero activado dentro de esta realización de la invención siempre que exista un grupo químico complementario dentro de la subunidad polipeptídica del multímero polipeptídico asociado no covalentemente, mediante el cual puede tener lugar el acoplamiento covalente.
3-ácido hidroxibutanoico-N-hidroxisuccinato), mPEG-ACET (mPEG-acetaldehído dietil acetal), mPEG2-acetaldehído (equivalente a mPEG2-dietil acetal), mPEG-propionaldehído, mPEG2-propionaldehído, mPEG-butiraldehído,
mPEG2-butiraldehído, mPEG-cetonas, mPEG-MAL (mPEG-maleimida), mPEG2-MAL (mPEG2-maleimida) y
mPEG-tioles (todos estos polímeros estando disponibles comercialmente en Nektar Therapeutics, San Carlos, CA, US). Todos son especialmente preferentes como polímero activado dentro de esta realización de la invención siempre que exista un grupo químico complementario dentro de la subunidad polipeptídica del multímero polipeptídico asociado no covalentemente, mediante el cual puede tener lugar el acoplamiento covalente.
Según la invención, el polímero activado puede
ser un polidextran activado o un
poli-L-lisina activado.
Según una realización adicional de la invención,
el polímero activado puede estar fijado a la subunidad polipeptídica
por medio de interacciones no covalentes que, bajo condiciones
fisiológicas, exhiben típicamente una fuerza cercana a la de un
enlace químico covalente. Un ejemplo de dicha fuerte fijación no
covalente puede ser la interacción de alta afinidad de la biotina
para avidina o estreptavidina. Tal como es conocido en general, la
biotina y la avidina, o la biotina y la estreptavidina exhiben
semejante alta afinidad de unión, unas para las otras, que su
complejo permanece asociado bajo condiciones fisiológicas típicas.
En este caso, las subunidades polipeptídicas individuales dentro
del multímero polipeptídico asociado no covalentemente deben ser
funcionalizadas con un miembro del complejo no covalente objetivo,
mientras que el polímero activado debe ser funcionalizado con el
otro miembro de este complejo de manera que, cuando el polímero
activado funcionalizado se hace contactar con una subunidad
polipeptídica funcionalizada respectiva, la fuerte interacción no
covalente entre dichos dos miembros resultará, realmente, en que
cada subunidad polipeptídica dentro del multímero polipeptídico
está enlazada a al menos una molécula de polímero activado.
A continuación, se describirá la invención en
mayor detalle, por medio de las figuras y los ejemplos
siguientes.
Fig. 1 Representación esquemática del uso
inventivo.
Fig. 2 Patrón de elución de polipéptido scFv
purificado por cromatografía de afinidad por metales inmovilizados
(IMAC) que muestra un pico que contiene tanto scFv monomérico como
dimérico
Fig. 3 Patrón de elución resultante de una
cromatografía de exclusión por tamaños ("SEC") de la fracción
de elución que contiene el pico polipeptídico mostrado en la Fig.
2
Fig. 4 Análisis SDS-PAGE de las
fracciones polipeptídicas scFv obtenidas de los análisis SEC e IAC
mostrados en las Figs. 2 y 3
Fig. 5 Patrones de elución SEC independientes,
superpuestos, de polipéptidos scFv monoméricos y diméricos tras una
PEGilación independiente de cada una de estas fracciones
polipeptídicas
A continuación se describirá la invención en
mayor detalle por medio de ejemplos.
La Fig. 1 muestra, de manera general, una
representación esquemática del uso según la invención, en la que la
letra A representa un multímero polipeptídico asociado no
covalentemente, la letra B representa una subunidad polipeptídica
dentro del multímero polipeptídico asociado no covalentemente A (por
ejemplo, una subunidad polipeptídica B respectiva puede ser un
polipéptido scFv), y la letra C representa una molécula de polímero
activado.
La Fig. 1 representa el uso de la invención en
forma genérica, mostrando un escenario en el que el multímero
polipeptídico asociado no covalentemente A está formado por cuatro
subunidades polipeptídicas B. Cada subunidad polipeptídica B está
asociada no covalentemente a al menos otra subunidad polipeptídica
B, de manera que el multímero polipeptídico asociado no
covalentemente A resultante se mantiene unido enteramente por las
interacciones no covalentes entre sus subunidades polipeptídicas B
constituyentes, es decir, ninguna subunidad polipeptídica B está
conectada a ninguna otra subunidad polipeptídica B mediante un
enlace químico covalente. Se supone que cada una de las subunidades
polipeptídicas B comprende un grupo químico capaz de formar un
enlace covalente con al menos una molécula de polímero activado C.
El multímero polipeptídico asociado no covalentemente A se hace
reaccionar con al menos cuatro moléculas de polímero activado C bajo
condiciones susceptibles para la formación de un enlace químico
covalente entre al menos una molécula de polímero activado C y cada
una de las subunidades polipeptídicas B. El resultado de esta
reacción es que las subunidades polipeptídicas B individuales que
conforman el multímero polipeptídico asociado no covalentemente A
son separadas unas de las otras para obtener cuatro subunidades
polipeptídicas B individuales, cada una de las cuales está enlazada
covalentemente a al menos un polímero activado C. Normalmente, cada
subunidad polipeptídica B será idéntica, siendo el resultado de,
por ejemplo, una expresión recombinante de una célula huésped. Sin
embargo, es posible que un multímero polipeptídico asociado no
covalentemente A pueda estar compuesto, por ejemplo, de subunidades
polipeptídicas B, B', B'', etc., dichas subunidades B, B', B''
siendo diferentes unas de las otras, tal como puede ser el caso
para variantes expresadas incompletamente de un polipéptido
recombinante deseado. Independientemente de si el multímero
polipeptídico asociado no covalentemente A está compuesto de
subunidades polipeptídicas B idénticas o no idénticas, dichas
subunidades polipeptídicas B pueden ser separadas, unas de las
otras, según el uso de la invención siempre que estas puedan formar
un enlace covalente con al menos una molécula de polímero activado.
Tal como ilustra claramente la Fig. 1, el uso de la invención
proporciona una manera eficiente de deshacer multímeros
polipeptídicos no deseados, en múltiples monómeros polipeptídicos
homogéneos deseados, cada monómero polipeptídico deseado estando
enlazado covalentemente a al menos una molécula de polímero. De
esta manera, el polipéptido que, de otra manera, permanecería
irresoluble en forma monomérica puede ser resuelto, incrementando
la producción global de este polipéptido monomérico enlazado a
polímero.
\vskip1.000000\baselineskip
Un polipéptido (es decir, una cadena
polipeptídica única que contiene regiones de anticuerpo VH y VL
conectadas por un enlazador polipeptídico) fue expresado en BL21 DE3
de E. coli transfectado con un vector pBAD (Xoma) con
resistencia a kanamicina, codificando el vector pBAD el scFv
deseado. El cultivo de expresión fue incubado en medio LB que
contenía 50 \mug/mL de kanamicina a 300 rpm y 37ºC durante 12
horas. La expresión genética fue inducida añadiendo
L-arabinosa a una concentración total de 0,08%
(p/v), seguido por una agitación adicional a 300 rpm durante 15
horas a 30ºC.
A continuación, las células fueron recogidas
mediante centrifugación a 10.000 x g durante 15 minutos y fueron
resuspendidas en un total de 900 mL 1X PBS. La proteína scFv fue
extraída mediante 6 ciclos de congelación-deshielo.
Finalmente, las suspensiones fueron centrifugadas a 16.000 x g y 4ºC
durante 15 minutos. A continuación, los sobrenadantes aclarados
fueron usados como preparación periplásmica cruda.
Generalmente, la proteína scFv cruda fue
purificada en un proceso de purificación de dos etapas que incluye
cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC) y
filtración en gel. Se usaron un sistema Äkta FPLC (Pharmacia) y
Unicorn Software para la cromatografía. Todas las sustancias
químicas eran de calidad de investigación y se obtuvieron en Sigma
(Desisenhofen) o Merck (Darmstadt).
La IMAC se realizó usando una columna NiNTA
(Qiagen) cargada con NiSO_{4}, según el protocolo del fabricante.
La columna fue equilibrada con tampón A (20 mM NaPP pH 7,5, 0,4 M
NaCl, 10 mM imidazol) y la preparación periplásmica (500 ml), que
contenía 10 mM imidazol fue aplicada a la columna (5 ml) a una tasa
de fluencia de 3 ml/min. La columna fue lavada con tampón A para
retirar la muestra no enlazada. La proteína enlazada fue eluída
usando 100% de tampón B (20 mM NaPP pH 7,5, 0,4 M NaCl, 0,5 M
imidizol). Las fracciones de proteína eluída de la etapa usando
100% de tampón B fueron agrupados para una purificación
adicional.
Los resultados se muestran en la Fig. 2, con el
pico polipeptídico eluyendo a aproximadamente 420 ml. "M+D"
indica que este pico es el resultado de formas tanto monoméricas
como (homo)diméricas de scFV. Estas dos formas juntas forman
un pico en la Fig. 2, ya que la IMAC no diferencia entre
polipéptidos de diferente peso molecular sino que une proteínas
etiquetadas con histidina de cualquier tipo.
El polipéptido contenido dentro del pico de
elución "M+D" de la Fig. 2 fue sometido, a continuación, a
cromatografía de filtración en gel (es decir, SEC) a una tasa de
fluencia de 1 ml/min en una columna Superdex 200 HiPrep (Pharmacia)
o una columna Sephadex 400 equilibrada con 20 mM Tris pH 7,2, 250 mM
NaCl, 5% v/v glicerol, 2 mM DTT. La columna fue calibrada
previamente para la determinación de peso molecular (equipo marcador
de peso molecular, Sigma MW GF-200). La Fig. 3
muestra los resultados de la columna Superdex 200 HiPrep SEC. Se
observan dos picos polipeptídicos principales, uno a un volumen de
elución de aproximadamente 68 ml y otro a un volumen de elución de
aproximadamente 80 ml. El primero, indicado en la Fig. 3 como
"D", corresponde al polipéptido scFv en forma dimérica con un
peso molecular de aproximadamente 54 kD (es decir, una estructura de
tipo diacuerpo en la que dos polipéptidos scFv idénticos están
asociados linealmente
cabeza-con-cola de manera que el VH
de una cadena scFv se asocia intermolecularmente con el VL de otra
cadena scFv), mientras que el último, indicado en la Fig. 3 como
"M", corresponde al polipéptido scFv en forma monomérica con un
peso molecular de aproximadamente 27 kD (es decir, un scFv en el
que el VH y el VL de una cadena scFv única se asocian
intramolecularmente uno con el otro).
Con el fin de confirmar que el pico "D" en
la Fig. 3 es, de hecho, debido a la forma dimérica asociada no
covalentemente del polipéptido que da lugar al pico "M" en la
Fig. 3, se realizó una electroforesis en gel poliacrilamida
(SDS-PAGE) desnaturalizante sobre las fracciones de
proteína obtenidas de la cromatografía de filtración en gel,
descrita anteriormente. Se realizó una SDS-PAGE bajo
condiciones reductivas con geles Bis Tris al 4-12%
prefabricados (Invitrogen). La preparación y aplicación de las
muestras se realizaron según el protocolo del fabricante. El peso
molecular se determinó con proteína estándar Multimark (Invitrogen).
El gel fue tintado con Coomassie coloidal (protocolo Invitrogen).
Los resultados se muestran en la Fig. 4.
La pista 1 de la Fig. 4 muestra pesos
moleculares en escalera. La pista 2 de la Fig. 4 es la fracción de
elución de la filtración en gel que contiene los agregados de peso
molecular alto que se eluyeron previamente al pico a
aproximadamente 68 ml, es decir, a volúmenes de elución de
aproximadamente 48 ml a aproximadamente 62 ml. La pista 3 de la
Fig. 4 muestra el pico de elución de filtración en gel a
aproximadamente 68 ml, atribuido al dímero scFv. La pista 4 de la
Fig. 4 muestra el pico de elución de filtración en gel a
aproximadamente 80 ml atribuido al monómero scFv. La pista 5 de la
Fig. 4 muestra el eluato IMAC que contiene todos los productos
proteínicos obtenidos de las células E. coli destruidas. La
flecha horizontal situada inmediatamente a la derecha del gel en la
Fig. 4 indica la posición del monómero polipeptídico scFv a
aproximadamente 27 kD.
Aunque los productos proteínicos de las pistas 3
y 4 de la Fig. 4 se eluyeron de la columna de filtración en gel a
volúmenes correspondientes a 54 kD y 27 kD, respectivamente, bajo
condiciones desnaturalizantes y reductivas del gel, estos dos
productos proteínicos trabajan de manera idéntica para reducir
SDS-PAGE, correspondiendo al peso molecular del
monómero polipeptídico scFv, 27 kD. Esto indica que el producto scFv
obtenido y purificado del lisato celular está, de hecho, presente
en dos formas, particularmente como un monómero scFv y como un
dímero scFv, separándose el polipéptido scFv dimérico en los
monómeros constituyentes bajo las condiciones desnaturalizantes y
reductivas de PAGE.
\vskip1.000000\baselineskip
Las fracciones polipeptídicas scFv monoméricas y
diméricas separadas mediante cromatografía de filtración en gel
fueron acopladas a polietilenglicol maleimida de 40 kD
("PEG-MAL 40") en reacciones de acoplamiento
independientes. El PEG-MAL usado fue un PEG
ramificado que presentaba dos cadenas de 20 kD de peso molecular
cada uno, es decir, mPEG2-MAL. Los polipéptidos scFv
habían sido modificados para contener un residuo cisteína libre en
el terminal C, de manera que la tasa de acoplamiento de
scFV:PEG-MAL 40 podía ser controlada a 1:1. Se
realizó el procedimiento siguiente independientemente para el scFv
monomérico y para el scFv dimérico.
El tampón usado para el acoplamiento contenía 50
mM Tris, glicerol al 5% vol, 2 mM DTT ajustado a pH 7,2. Esta
formulación estabilizó las proteínas y las mantuvo en solución,
previniendo la agregación y la precipitación no deseadas. El DTT
fue incluido para escindir cualquier enlace disulfuro de cisteína no
deseado en el terminal C del polipéptido scFv, asegurando la
presencia de un grupo tiol libre, que puede reaccionar
covalentemente con el grupo maleimida en PEG-MAL
40. Previamente a la PEGilación, el DTT fue retirado mediante
cromatografía de exclusión por tamaños usando Medio Sephadex G25
(Amersham Biosciences). Aquí, el volumen de carga se mantuvo por
debajo del 10% del volumen de columna para evitar la penetración del
DTT libre. La columna fue equilibrada con un tampón que contenía
400 mM NaCl, 500 mM imidazola, 20 mM fosfato ajustado a pH 7,2. El
mismo tampón fue usado para la elución.
El eluato fue recogido en fracciones de 90
\mul en una placa de 96 pocillos realizada en polipropileno de
baja unión a proteína. Las fracciones que contenían proteína fueron
detectadas mediante transferencia de 5 \mul de cada pocillo en
una placa de 96 pocillos, conteniendo cada pocillo del mismo una
mezcla 4:1 de PBS y reactivo de Bradford (BioRad). Las proteínas
hicieron que esta mezcla cambiase de color desde marrón claro a
azul y se midió la absorción óptica a 595 nm en un lector de placas
Tecan Spectrafluor Plus para confirmar la presencia de material
proteináceo. Las fracciones que contenían proteína fueron agrupadas
y las concentraciones de proteína fueron determinadas midiendo la
absorción a 280 nm y usando el coeficiente de absorción molar.
El PEG-MAL 40 fue pesado en dos
tubos de reacción con fondos redondos, un tubo para la reacción del
polipéptido scFv monomérico con PEG-MAL 40, y el
otro tubo para la reacción del polipéptido scFv dimérico con
PEG-MAL 40. Se calculó un exceso molecular de 5
moléculas PEG a 1 molécula scFv polipeptídica con un mínimo de 2,5
mg de PEG maleimida por ml de volumen final. Las soluciones
polipeptídicas que contenían el monómero scFv y el dímero scFv
fueron transferidas a dos tubos separados y el PEG fue disuelto
mediante un mezclado suave con una pipeta. La incubación se realizó
en un mezclador volteador-rotativo Dynal en la
oscuridad durante dos horas a temperatura ambiente o durante la
noche a 5ºC.
Los conjugados scFv-PEG fueron
purificados mediante cromatografía de intercambio de cationes para
retirar el polipéptido no conjugado y el PEG libre (resultados no
mostrados), y se confirmó la bioactividad de los productos finales.
Los conjugados scFv-PEG-MAL 40
finales purificados resultantes del acoplamiento independiente de
los polipéptidos scFv monoméricos y diméricos fueron ensayados para
la pureza en SD-PAGE y tanto el monómero como el
dímero PEGilado migraron a un peso molecular de aproximadamente 100
kD, el tamaño esperado del producto mediante este procedimiento de
detección debido a las características no globulares, es decir,
características lineales, de PEG, que hacen que el PEG trabaje de
manera diferente en SDS-PAG que una proteína de peso
molecular correspondiente (resultados no mostrados).
Además, los productos de reacción resultantes
del acoplamiento independiente de scFv monomérico y dimérico con
PEG-MAL 40 fueron analizados mediante SEC. Los
resultados de este análisis comparativo se muestran en la Fig. 5,
en la que "V0" indica el volumen vacío de la columna de
exclusión por tamaños, "M" indica el pico de proteína
correspondiente al polipéptido monómero scFv PEGilado, y "D"
indica el pico de proteína correspondiente al polipéptido dímero
scFv PEGilado. Tal como puede verse claramente en la Fig. 5, ambos
tipos de polipéptidos scFv PEGilados exhiben tiempos de retención
en columna idénticos (indicados en la línea vertical a trazos), lo
que significa que la PEGilación de un polipéptido scFv en forma
dimérica resulta en el mismo producto que la PEGilación del
polipéptido scFv correspondiente en forma monomérica,
particularmente, el monómero scFv PEGilado. Este resultado fue
confirmado adicionalmente mediante un análisis de cromatografía de
intercambio de cationes; la fuerza iónica necesaria para la elución
era idéntica para ambos monómero scFv PEGilado y dímero scFv
PEGilado (resultados no mostrados).
Claims (14)
1. Uso de un polímero activado para separar un
multímero polipeptídico asociado no covalentemente, que comprende
múltiples subunidades polipeptídicas, en múltiples subunidades
polipeptídicas, en el que
- -
- el polímero activado comprende una fracción química mediante la cual el polímero puede enlazarse covalentemente a la subunidad polipeptídica en el multímero polipeptídico asociado no covalentemente.
- -
- el polímero activado es un polietilenglicol activado, un polidextran activado o una poli-L-lisina activada, y
- -
- cada una de las subunidades polipeptídicas comprende una cadena polipeptídica única; y/o un grupo de al menos dos cadenas polipeptídicas únicas, en las que al menos dos cadenas polipeptídicas únicas están enlazadas covalentemente, una a la otra, y en las que al menos una de las subunidades polipeptídicas comprende un anticuerpo de cadena única que comprende al menos una región variable de anticuerpo.
2. Uso según la reivindicación 1, en el que el
polímero activado tiene un peso molecular de al menos 3.000 g/mol y
comprende de 25 a 70% en peso de átomos polares, en el que los
átomos polares son átomos que participan en interacciones de enlace
de hidrógeno con moléculas de agua en solución acuosa.
3. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que
cada una de las múltiples subunidades polipeptídicas en su forma
separada está enlazada al polímero activado.
4. Uso según la reivindicación 3, en el que cada
una de las múltiples subunidades polipeptídicas en su forma
separada está enlazada covalentemente al polímero activado.
5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, en el que el anticuerpo de cadena única comprende una o
más regiones variables de anticuerpo.
6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, en el que cada una de las subunidades polipeptídicas
está enlazada covalentemente al polímero activado mediante un grupo
amino, un grupo sulfhidrilo, un grupo carboxilo, un grupo hidroxilo
o un grupo aldehído comprendido dentro/en la subunidad
polipeptídica.
7. Uso según la reivindicación 6, en el que
- \bullet
- el polímero activado que es capaz de formar un enlace químico covalente con un grupo amino comprendido dentro de la subunidad polipeptídica comprende un grupo hidroxisucinimidilo, un grupo carboxilo, un grupo epóxido, un grupo ceto o un grupo aldehído;
- \bullet
- el polímero activado que es capaz de formar un enlace químico covalente con un grupo sulfhidrilo comprendido dentro de la subunidad polipeptídica comprende un grupo maleimida, un grupo vinil sulfona o un grupo sulfhidrilo;
- \bullet
- el polímero activado que es capaz de formar un enlace químico covalente con un grupo con un grupo carboxilo comprendido dentro de la subunidad polipeptídica comprende un grupo amino o un grupo hidroxilo; y/o
- \bullet
- el polímero activado que es capaz de formar un enlace químico covalente con un grupo hidroxilo comprendido dentro de la subunidad polipeptídica comprende un grupo carboxilo, un grupo aldehído o un grupo ceto.
8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
3-7, en el que cada subunidad polipeptídica está
enlazada covalentemente al polímero activado mediante un
carbohidrato comprendido dentro de la subunidad polipeptídica, cuyo
carbohidrato ha sido modificado químicamente para comprender al
menos un grupo aldehído.
9. Uso según la reivindicación 8, en el que el
polímero activado es capaz de formar un enlace químico covalente
con el carbohidrato que comprende el grupo aldehído que comprende un
grupo amino o un grupo hidracida.
10. Uso según la reivindicación 9, en el que el
enlace covalente entre el aldehído y el grupo amino o grupo
hidracida es estabilizado mediante aminación reductiva.
11. Uso según la reivindicación 1, en el que el
polietilenglicol se selecciona de entre el grupo que comprende
mPEG-SPA (mPEG-propionato de
succinimidilo), mPEG-SBA
(mPEG-butanoato de succinimidilo),
mPEG-SMB
(mPEG-alfa-metilbutanoato de
succinimidilo), mPEG2-NHS
(mPEG2-N-hidroxisuccinimida),
mPEG-OPTE (mPEG-tioéster),
mPEG-CM-HBA-NHS
(mPEG-carboximetil-3-ácido
hidroxibutanoico-N-hidroxisuccinato),
mPEG-ACET (mPEG-acetaldehído dietil
acetal), mPEG2-acetaldehído (equivalente a
mPEG2-dietil acetal),
mPEG-propionaldehído,
mPEG2-propionaldehído,
mPEG-butiraldehído,
mPEG2-butiraldehído, mPEG-cetonas,
mPEG-MAL (mPEG-maleimida),
mPEG2-MAL (mPEG2-maleimida) y
mPEG-tioles.
12. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, en el que el polímero activado tiene un peso molecular
de 3.500 g/mol, 5.000 g/mol, 20.000 g/mol o 40.000 g/mol.
13. Uso según la reivindicación 11 o la
reivindicación 12, en el que el mPEG-MAL es
mPEG-MAL o mPEG2-MAL que tiene un
peso molecular de 40.000 g/mol.
14. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, en el que el polímero activado comprende
- \bullet
- de 27 a 60% en peso de átomos polares, particularmente de 32 a 45% en peso de átomos polares, de 35 a 38% en peso de átomos polares, o
- \bullet
- de 36 a 37% en peso de átomos polares;
- \bullet
- de 27 a 28% en peso de átomos polares;
- \bullet
- de 48 a 50% en peso de átomos polares; o
- \bullet
- de 54 a 56% en peso de átomos polares,
en el que los átomos polares son átomos que
participan en interacciones de enlace de hidrógeno con moléculas de
agua en solución acuosa.
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