ES2335489T3

ES2335489T3 - Promotor de ii-18bp, su preparacion y empleo.

Info

Publication number: ES2335489T3
Application number: ES03751245T
Authority: ES
Inventors: Daniela Weizmann Institute of Science NOVICK; Menachem Rubinstein; Vladimir Hurgin
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 2002-10-10
Filing date: 2003-10-09
Publication date: 2010-03-29
Anticipated expiration: 2023-10-09
Also published as: HK1082510A1; NO334018B1; IL167768A; CA2501879C; JP2006501839A; IL152232A0; NO20051938L; EP1556412B1; CY1109904T1; AU2003269465A1; PT1556412E; BR0315222A; MXPA05003871A; EP1556412A2; CN100372871C; CN1726225A; KR20050083727A; US7868154B2; AU2003269465B2; WO2004033694A3

Abstract

Una secuencia de DNA que codifica el promotor de la IL-18BP humana (SEC. ID Nº: 1), o un fragmento funcional de la misma, o un derivado funcional de la misma, en donde el extremo 3'' de dicha secuencia de DNA o fragmento de la misma comprende la SEC ID Nº 5.

Description

Promotor de IL-18BP, su preparación y empleo.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al promotor de la proteína de unión de interleucina-18 (IL-18BP), a su preparación y a su uso.

Fundamento de la invención

Las proteínas de unión de citocinas (receptores de citocina solubles) son normalmente los dominios de unión del ligando extracelular de sus correspondientes receptores de citocina de la superficie de la célula. Son producidas bien sea mediante ayuste alternativo o por segmentación proteolítica del receptor de la superficie de la célula. Estos receptores solubles han sido descritos en el pasado: por ejemplo, los receptores para IL-6 y IFN\gamma (Novick et al. 1989), TNF (Engelmann et al. 1989 y Engelmann et al. 1990), IL-1 y IL-4 (Maliszewski et al. 1990) y IFN\alpha/\beta (Novick et al. 1994, Novick et al. 1992). Una proteína de unión de citocina llamada osteoprotegerina (OPG, también conocida como factor inhibidor de los osteoclastos OCIF), un miembro de la familia de TNFR/Fas, parece ser el primer ejemplo de receptor soluble que existe solamente como proteína segregada (Anderson et al. 1997, Simonet et al. 1997, Yasuda et al. 1998).

Una proteína de unión de interleucina-18 (IL-18BP) fue purificada por afinidad, en una columna IL-18, a partir de orina (Novick et al. 1999). La IL-18BP anula la inducción de IL-18 de IFN\gamma, y la activación de IL-18 de NF-kB in vitro. Además, la IL-18-BP inhibe la inducción del IFN\gamma en ratones inyectados con LPS. El gen de IL-18BP fue localizado en el cromosoma 11 humano, y no pudo encontrarse ningún exón que codifique un dominio transmembrana en la secuencia genómica de 8,3 kb que comprende el gen IL-18BP. Cuatro isoformas de IL-18BP generadas por ayuste de mRNA alternativo han sido encontradas hasta ahora en seres humanos. Fueron denominadas IL-18BP a, b, c, y d, compartiendo todas ellas el mismo término N y difiriendo en el término C (Novick et al. 1999). Estas isoformas varían en su capacidad para unir IL-18 (Kim et al. 2000). De las cuatro, se sabe que las isoformas humanas IL-18BP (hIL-18BP) a y c tienen una capacidad neutralizadora para IL-18. La isoforma de IL-18BP más abundante, la isoforma variante ayustada a, muestra una alta afinidad por IL-18 con una on-rate rápida y una off-rate lenta, y una constante de disociación (Kd) de aproximadamente 0,4 nM (Kim et al. 2000). La IL-18BP se expresa constitutivamente en el bazo (Novick 1999), y circula a concentraciones en el plasma de 2,5 ng/ml (Novick et al. 2001). Los restos implicados en la interacción de la IL-18 con la IL-18BP han sido descritos mediante el uso de modelos computerizados (Kim et al. 2000) y basándose en la interacción entre la proteína similar IL-1\beta con la IL-1R tipo I (Vigers et al. 1997). De acuerdo con el modelo de unión de IL-18 a la IL-18BP, se ha propuesto que el resto Glu en posición 42 y el resto Lys en posición 89 de la IL-18 se unen a Lys-130 y Glu-114 de IL-18BP, respectivamente (Kim et al. 2000).

Como se ha indicado, la IL-18 induce el IFN\gamma del que, a su vez, recientemente se ha publicado que induce la generación in vitro de mRNA de IL-18BPa (Muhl et al 2000). Por consiguiente, la IL-18BPa podría servir como señal de "parada", terminando la respuesta inflamatoria.

La IL-18BP es significativamente homóloga respecto de una familia de proteínas codificadas por varios virus de viruela (Novick et al. 1999, Xiang y Moss 1999). La inhibición de la IL-18 por esta IL-18BP viral putativa puede atenuar la respuesta Th1 antiviral inflamatoria.

La IL-18BP en suero es significativamente elevada en la sepsis, lo que indica su papel en la regulación de respuestas inmunitarias in vivo (Novick et al. 2001). En realidad, la IL-18BP es inducida por el IFN\gamma en varias células, sugiriendo que sirve como inhibidor de la retroalimentación negativa de la respuesta inmunitaria mediada por IL-18 (Mughl et al. 2000).

Resultados preliminares indican que el mRNA de IL-18BP se detecta en leucocitos, colon, intestino delgado, próstata y, de un modo particular, en las células del bazo (Novick et al. 1999). Las células componentes del bazo están constituidas por macrófagos, linfocitos y células plasmáticas con células adicionales derivadas de la circulación.

La actividad de elementos que controlan la transcripción, promotores y mejoradores (enhancers), varía considerablemente entre tipos de células distintos. Los promotores y los mejoradores consisten en breves matrices de secuencias de DNA que interaccionan específicamente con proteínas celulares implicadas en la transcripción (revisado en Dynan y Tjian 1985, McKnight y Tjian 1986, Sassone-Corsi y Borreli 1986 y Maniatis et al. 1987). La combinación de diferentes secuencias de reconocimiento y las cantidades de factores de transcripción afines determinan la eficacia con la que se transcribe un gen dado en un tipo de célula concreto. Muchos promotores eucarióticos contienen dos tipos de secuencias de reconocimiento: la secuencia TATA ("caja TATA") y los elementos promotores secuencia arriba. Se cree que la caja TATA, situada 25-30 pb secuencia arriba del sitio de iniciación de la transcripción, está implicada en dirigir a la RNA polimerasa II para que comience la síntesis de RNA en el sitio correcto. En cambio, los elementos promotores secuencia arriba determinan la velocidad a la que se inicia la transcripción. Los elementos mejoradores pueden estimular la transcripción hasta 1000 veces a partir de los promotores homólogos o heterólogos ligados. Sin embargo, a diferencia de los elementos promotores secuencia arriba, los mejoradores son activos cuando se colocan secuencia abajo del sitio de iniciación de la transcripción o a una considerable distancia del promotor. Muchos mejoradores de genes celulares trabajan exclusivamente en un tejido o tipo de célula particular (revisado por Voss et al. 1986, Maniatis et al. 1987). Además, algunos mejoradores se hacen activos solamente bajo condiciones específicas que son generadas por la presencia de un inductor, tal como una hormona o un ion metálico (revisado por Sassone-Corsi y Borrelli 1986 y Maniatis 1987). A causa de estas diferencias en las especificidades de la células de los mejoradores celulares, la elección de los elementos promotores y mejoradores a incorporar en un vector de expresión eucariótico vendrá determinada por los tipos de células en los que se va a expresar el gen recombinante. En cambio, el uso de un vector prefabricado que contiene un promotor y un mejorador celular específicos puede limitar gravemente los tipos de células en los que puede obtenerse la expresión.

Muchos elementos mejoradores derivados de virus tienen una gama de hospedadores más amplia y son activos en una diversidad de tejidos, aun cuando se observan diferencias cuantitativas significativas entre los diferentes tipos de células. Por ejemplo el mejorador temprano SV40 es activo promiscuamente en muchos tipos de células derivadas de una diversidad de especies de mamíferos, y en consecuencia se han usado vectores que incorporan este mejorador (Dijkema et al. 1985). Otras dos combinaciones de mejorador y promotor que son activas en una amplia gama de células se derivan de la repetición larga (LTR) del genoma del virus del sarcoma de Rous (Gorman et al. 1982b) y del citomegalovirus humano (Boshart et al. 1985).

Sumario de la invención

La invención se refiere a una secuencia de DNA que codifica el promotor de IL-18BP humana (SEC ID NO: 1), o un fragmento tal como los de las SEC ID NOS 2 o 3, o un derivado funcional de la misma, en donde el extremo 3' de dicha secuencia de DNA o fragmento de la misma comprende la SEC ID NO: 5.

Más específicamente, un derivado de acuerdo con la presente invención puede ser el DNA de la invención mutado en uno o más sitios AP1 presentes en un elemento silenciador presente en la secuencia, y la secuencia de DNA puede contener además un gen ligado operativamente al promotor de IL-18BP.

En un aspecto de la invención, el gen puede codificar p. ej. IL-18BP o una proteína heteróloga tal como luciferasa, interferón beta, TNF, eritropoietina, activador del plasminógeno tisular, factor estimulador de la colonia de granulocitos, superóxido de manganeso dismutasa, una inmunoglobulina, o un fragmento de la misma, hormona del crecimiento, y proteínas de unión con el receptor de FSH, hCG, IL-18, hsLDLR y TNF.

La invención proporciona un vector que comprende una secuencia de DNA que codifica el promotor de IL-18BP humana, una célula hospedadora que comprende el vector p. ej. células CHO, WISH, HepG2, Cos, CV-1, HeLA, y Hakat U937, y un método para la producción de una proteína recombinante, que comprende cultivar la célula hospedadora y aislar la proteína recombinante producida.

Además, la invención proporciona un vector de virus recombinante que comprende una porción del genoma del virus, un fragmento de DNA que codifica un gen de interés y un fragmento de DNA que comprende una secuencia de DNA que codifica el promotor de IL-18BP humana. Más específicamente, la porción de virus puede ser p. ej. un virus adeno-asociado, y un retrovirus tal como HIV, HFV, MLV, FIV y VSV.

También la presente invención proporciona un método para regular la expresión específica de la célula de un gen de interés, que comprende transducir una célula de mamífero diana con el vector de virus de la invención en una célula diana tal como una célula troncal hematopoiética, y un monocito. El gen de interés puede ser p. ej. una proteína que confiere resistencia a la infección por HIV. La regulación de la expresión específica de la célula de un gen de interés puede usarse en el tratamiento p. ej. de la infección por el HIV, el tratamiento de trastornos hematopoiéticos tales como SCID, la enfermedad granulomatosa crónica y la talasemia.

También se describe un método de terapia génica para el tratamiento de una enfermedad en un individuo que muestra IFN\gamma elevado en un tejido corporal, que comprende la administración de una cantidad efectiva del vector de virus de la invención, que opcionalmente comprende además la administración de factores IL-6 y/o TNF-\alpha y/o IRF y/o C/EBP\beta.

En otro aspecto, la invención se refiere a ratones transgénicos que albergan la secuencia de DNA que codifica una secuencia de DNA de la invención.

Además la invención enseña el uso de una secuencia de DNA que codifica el promotor de IL-18BP humana (SEC ID Nº: 1), o un fragmento o un derivado funcional de la misma, en donde el extremo 3' de dicha secuencia de DNA o fragmento de la misma comprende la SEC ID NO: 5, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad.

También, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de una secuencia de DNA que codifica el promotor de la IL-18BP humana (SEC ID Nº: 1), o un fragmento o un derivado funcional de la misma, en donde el extremo 3' de dicha secuencia de DNA o fragmento de la misma comprende la SEC ID Nº: 5.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra una representación esquemática de la región del promotor del gen IL-18BP, incluyendo los 5 elementos reguladores.

La figura 2 muestra la cinética de la inducción de IL-18BP y el sinergismo con TNF\alpha y IL-6. (A) IFN\gamma induce IL-18BP de una manera dependiente de la dosis y del tiempo en células WISH humanas. Las células se incuban con las concentraciones indicadas de IFN\gamma durante 24 y 48 h. (B) Efectos sinérgicos de TNF\alpha IL-6 y su combinación en IL-18BP inducida por IFN\gamma. Células HepG2 fueron incubadas con las combinaciones indicadas de IFN\gamma (100 U/ml), TNF\alpha (20 ng/ml) y IL-6 (300 U/ml). La inducción de IL-18BP por cada combinación fue significativamente más alta (p < 0,05) que la inducción por IFN\gamma sólo. Los datos son medias \pm SD (n = 3, para A; n = 4, para B).

La figura 3 muestra una representación esquemática de la organización exón-intrón conservada de los genes de IL-18BP humanos y de ratón. El gen humano de IL-18BPa fue comparado con el gen IL-18BPd de ratón. Los exones están indicados. El sitio de inicio de la transcripción, el sitio de inicio de la traducción (ATG), el codón de parada (Stop) y la señal de poliadenilación (PAS) están indicados para el gen humano de IL-18BPa.

La figura 4 muestra que la inducción de IL-18BP por IFN\gamma es a nivel transcripcional y depende de la síntesis de proteína de novo. (A) RT-PCR semicuantitativa de mRNA de IL-18BP a partir de células HepG2 que fueron pre-incubadas con actinomicina D (1 \mug/ml, 30 min), lavadas e incubadas con IFN\gamma (100 U/ml) durante los tiempos indicados. La RT-PCR de mRNA de \beta actina se muestra como testigo (B) RT-PCR semi-cuantitativa de mRNA de IL-18BP a partir de células HepG2 que fueron pre-incubadas con cicloheximida (20 \mug/ml) y IFN\gamma (100 U/ml) durante los tiempos indicados.

La figura 5 muestra la actividad basal e inducida por IFN\gamma, de vectores informadores de luciferasa que llevan el promotor de la IL-18BP humana. El tamaño del inserto, que se extiende desde el sitio de inicio de la transcripción (+1), se da entre paréntesis. Los números en círculos representan los diversos elementos de respuesta: 1. GAS. 2. IRF-E. 3. C/EBP-E (2 sitios). 4. Silenciador. 5. Mejorador distal. Los cuadrados rellenos representan mutación en un elemento de respuesta específica. Células HepG2 fueron co-transfectadas con el vector informador indicado y pSV40 \betaGAL. Todos los valores de luciferasa fueron normalizados a actividad de \beta-galactosidasa. (A) actividad de luciferasa en extractos de células no inducidas relativa a la de células transfectadas con vector pGL3-Basic. (B) actividad de luciferasa en células transfectadas con los vectores seleccionados e inducidas con IFN\gamma. El número de veces de inducción es sobre la actividad basal como se da en (A).

La figura 6 muestra que el IRF-1 es esencial para la expresión de IL-18BP en ratones. IL-18BP en suero, de ratones C57BI/6 IRF-1^{-/-} y testigo C57 BI/6 que fueron inyectados intraperitonealmente con IFN\gamma murino (53.000 u/ratón). Los ratones fueron sangrados antes de la inyección y 24 h después de la inyección. La IL-18BP en suero se determinó mediante ELISA. Los datos son media \pm SE (n = 6 para cada grupo). Las diferencias entre la IL-18BP en suero en el testigo y en ratones deficientes en IRF, así como la inducción de IL-18BP en los ratones testigo, fueron estadísticamente significativas (p < 0,05).

La figura 7 muestra el papel de IRF-1 y C/EBP\beta en la inducción del gen IL-18BP y su asociación. (A) ensayo de desplazamiento de la movilidad electroforética (EMSA Ejemplo 18) de sondas de DNA ds (DNA de cadena doble) correspondientes a las bases -33 a -75 (IRF-E, panel izquierdo) y -8 a -55 (GAS, panel derecho). Células HepG2 fueron tratadas con IFN\gamma durante los tiempos indicados y se dejó que los extractos nucleares reaccionasen con las sondas de IRF-E o GAS. Las bandas desplazadas se indican también por puntas de flecha rellenas. El complejo GAS fue también sometido a superdesplazamiento con los anticuerpos indicados. La banda superdesplazada está indicada por una punta de flecha abierta. (B) RT-PCR semicuantitativa de mRNA de IL-18BP de células HepG2 que fueron transfectadas con las combinaciones indicadas de vectores de expresión de IRF-1 o C/EBP\beta. Cuando se indica, se añadió IFN\gamma y las células se recolectaron 5 h más tarde. Los valores se normalizaron a mRNA de \beta actina. (C) actividad de luciferasa en células transfectadas con el vector informador de la luciferasa pGL3 (1272), que contiene el promotor completo de IL-18BP, junto con la concentración indicada de pCDNA3-IRF-1 (círculos) y 1 \mug/10^{6} células de pCDNA3-C/EBP\beta. Alternativamente, las células fueron transfectadas con la concentración indicada de pCDNA3-C/EBP\beta (cuadrados) y 0,1 \mug/10^{6} células de pCDNA3-IRF-1. La actividad de la luciferasa fue normalizada por la actividad de \beta Gal. (D) inmunotransferencias de extractos nucleares y citoplásmicos (véase el Ejemplo 17 para la preparación de los extractos) de células tratadas con IFN\gamma (100 U/ml, 2 h). Los extractos fueron inmunoprecipitados (IP) e inmunotransferidos (IB: ImmunoBlotted) con los anticuerpos indicados.

La figura 8 muestra los factores que se unen al promotor de IL-18BP en la inducción con IFN\gamma (A) EMSA con el C/EBP\beta E proximal y extractos de células completas después del tratamiento con IFN\gamma. Cuando se indica, los extractos fueron superdesplazados con los anticuerpos indicados. (B) EMSA con una sonda correspondiente al mejorador distal y extractos de células completas después del tratamiento con IFN\gamma. Cuando se indica, los extractos fueron superdesplazados con los anticuerpos indicados, con o sin competición con ds DNA correspondiente a la mitad proximal de la sonda. Las bandas desplazadas se indican mediante puntas de flecha rellenas y la banda super desplazada se indican mediante puntas de flecha vacías.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere al promotor de la IL-18BP humana. Este promotor impulsa la expresión constitutiva de IL-18BP en células concretas, por ejemplo en monocitos y la inducción mediada por IFN\gamma de la expresión de IL-18BP en muchas células. El promotor de IL-18BP humana es capaz de dirigir la expresión constitutiva y la inducida por IFN\gamma de una proteína heteróloga.

La invención se refiere a una secuencia de DNA que codifica el promotor de la IL-18BP humana (SEC ID Nº: 1), o un fragmento o un derivado funcional de la misma, en donde el extremo 3' de dicha secuencia de DNA o fragmento de la misma comprende la SEC ID N: 5.

El mRNA de IL-18BP se detecta en leucocitos, colon, intestino delgado, próstata y principalmente en las células del bazo (Novick et al. 1999). En uno de los ejemplos que se exponen más adelante se demuestra que la proteína IL-18 se expresa constitutivamente en los monocitos. Se ha encontrado que la expresión de IL-18BP está inducida por IFN\gamma, no sólo en los monocitos sino también en muchas células diferentes, y que esta inducción podría mejorarse mediante la adición de IL-6 y TNF\alpha.

Se encontró que la síntesis de proteína de novo es esencial para la activación del gen IL-18BP por IFN\gamma.

El sitio de inicio de la transcripción del mRNA de la IL-18BPa humana fue determinado mediante 5' RACE.

El mRNA 3' de la proteína dedo de zinc (Zn finger) localizado secuencia arriba del gen IL-8BP se encontró así limitando la secuencia reguladora potencial secuencia arriba de IL-18BPa a 1601 bases secuencia arriba de la base 1.

Se han identificado seis elementos reguladores (figura 1) dentro de esta región (de la transcripción proximal a la transcripción distal): 1- secuencias gamma activadas (GAS; Gamma Activated Sequences) en las bases -24 a -32, 2- Un elemento de respuesta IRF-1,2 (IRF-E) que abarca las bases -57 a -69, 3- y 4- dos elementos de respuesta C/EBP\beta en las bases -309 a -322 y -621 a- 634, 5- un silenciador en los restos -625 a -1106 y 6- un elemento mejorador que abarca las bases -1106 a -1272. Una serie de vectores informadores de luciferasa con truncamientos progresivos en el extremo 5' del fragmento de 1601 pb fueron ensayados en células HepG2 (una línea de carcinoma hepatocelular humano). La región de 1272 kb expuesta en SEC ID NO: 1 dirige tanto una expresión basal observada en algunos tejidos y tipos de células, como la inducción por IFN\gamma. Las pruebas de actividad del promotor en fragmentos de DNA truncados sucesivamente dentro de esta región demostraron que un fragmento de DNA de 122 pb, proximal al sitio de iniciación de la transcripción expuesto en la SEC ID NO: 3 comprende el promotor mínimo. Este promotor mínimo es también inducible. Sin embargo, otras secuencias reguladoras secuencia arriba de este promotor mínimo sí que contribuyeron a la cuantía de la inducción. Se encontró que un fragmento de DNA de 635 pb que contiene, además de los elementos IRF-1 y GAS, dos elementos C/EBPp, expuesto en la SEC ID NO: 2, confiere inducción máxima de la expresión de luciferasa por IFN\gamma.

Experimentos in-vivo llevados a cabo con ratones deficientes en IRF-1, confirmaron la importancia de IRF-1 como mediador de la expresión basal de IL 18BP, así como de la inducida por IFN\gamma.

Se ha encontrado que, en la inducción por IFN\gamma, se induce la expresión del factor IRF-1 y el factor se compleja con C/EBP\beta que está constitutivamente presente en las células. El complejo se une al elemento promotor GAS proximal y a su elemento promotor adyacente IRF-E.

Se encontró que el mejorador presente en el extremo distal del sitio de transcripción interacciona con el promotor basal a través de IRF-1.

La presente invención se refiere al promotor de IL18BP de la SEC ID Nº: 1 o un fragmento del mismo y a métodos para regular la expresión génica. Más en particular, la presente invención se refiere a las secuencias de DNA aisladas de IL-18BP 1272 pb (SEC ID Nº: 1) o un fragmento de la misma tal como 635 pb (SEC ID NO: 2) y 122 pb (SEC ID NO: 3) que son capaces de dirigir la expresión del gen.

Esta región del promotor de IL-18BP ha sido clonada y secuenciada y corresponde a nucleótidos en los 1272 pb secuencia arriba del sitio de inicio de la transcripción de IL-18BP (SEQ. ID. NO: 1).

La presente invención incluye el promotor de IL-18BP entero (SEC ID Nº: 1), pero también las secuencias de DNA que comprenden un fragmento del mismo (SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 3), capaz de dirigir la transcripción, y por tanto finalmente la expresión del gen, y puede usarse con otras porciones de la región del promotor de IL-18BP, o alternativamente con promotores heterólogos o elementos promotores heterólogos para controlar la transcripción del gen. Este promotor o fragmento del mismo es capaz de inducción por el IFN\gamma. Tal inducción puede mejorarse más por sobreexpresión de IRF-1 y/o C/EBP\beta y/o por tratamiento con IL-6 y/o TNF\alpha.

Los derivados funcionales del promotor expuestos en la SEC ID Nº: 1, o el fragmento del mismo tal como la SEC ID Nº: 2 o la SEC ID Nº: 3, son mutantes en los que de 1 a 10, preferentemente de 1 a 5, más preferentemente 1 nucleótido, es reemplazado con otro, o es borrado, y que son capaces de dirigir la expresión del gen y la inducción por IFN\gamma.

Las secuencias de DNA de la presente invención que comprenden un promotor de IL-18BP (SEC ID NO: 1) o un fragmento del mismo tal como el de la SEC ID Nº: 2 o la SEC ID Nº: 3, pueden ser aisladas usando diversos métodos conocidos en la técnica. Pueden emplearse al menos tres métodos principales alternativos:

(1) el aislamiento de la secuencia de DNA a partir de DNA genómico que contiene la secuencia; (2) la síntesis química de la secuencia de DNA; y (3) la síntesis de la secuencia de DNA mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

En el primer método, puede cribarse una genoteca de DNA genómico humano con el fin de identificar una secuencia de DNA que comprende un promotor de IL-18BP o elemento promotor de IL-18BP.

En el segundo método, puede sintetizarse químicamente una secuencia de DNA que comprende un promotor de IL-18BP o un elemento promotor de IL-18BP. Por ejemplo, puede sintetizarse una secuencia de DNA que comprende una región del promotor de IL-18BP o un promotor de IL-18BP como una serie de 100 oligonucleótidos de base que pueden ser ligados secuencialmente (mediante los apropiados sitios de restricción terminal) para formar la secuencia lineal de nucleótidos correcta.

En el tercer método, puede sintetizarse una secuencia de DNA que comprende una región de promotor de IL-18BP o un promotor de IL-18BP usando PCR. De forma resumida, pares de oligonucleótidos de DNA sintéticos, de al menos 15 bases de longitud (cebadores para PCR), que se hibridan con cadenas opuestas de la secuencia diana de DNA, pueden usarse para amplificar o multiplicar enzimáticamente la región interpuesta de DNA en la secuencia diana. Ciclos repetidos de desnaturalización por el calor del molde, apareamiento de los cebadores y alargamiento de los términos 3' de los cebadores apareados, con una DNA polimerasa, tienen por resultado la amplificación del segmento definido por los extremos 5' de los cebadores de PCR. Véanse las patentes de EE.UU. nº 4.683.195 y 4.683.202.

Se demostró que el promotor de IL-18BP de la invención es capaz de conferir expresión basal y también expresión inducida por IFN\gamma de un gen heterólogo. Así, el promotor de IL-18BP tiene ambas actividades, basal e inducible.

Aunque la secuencia de nucleótidos del promotor se expone en la SEQ. ID. NO. 1 o fragmentos del mismo que tienen actividades de promotor y se hace referencia a tal secuencia en la memoria descriptiva, se reconoce que pueden prepararse derivados de nucleótidos que no afectan a la función del promotor o del elemento promotor. Estas secuencias de nucleótidos modificadas pueden prepararse, por ejemplo, mutando la secuencia de nucleótidos de manera que la mutación tenga por resultado el borrado (deleción), la sustitución, la inserción, la inversión o la adición de uno o más nucleótidos usando varios métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden emplearse los métodos de mutagénesis dirigida al sitio descritos en Taylor, J. W. et al., Nucl. Acids Res. 13, 8749-8764 (1985) y Kunkel, J. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 482-492 (1985). Además, en firmas comerciales pueden adquirirse kits para la mutagénesis dirigida al sitio. Por ejemplo, un kit para la realización de mutagénesis dirigida al sitio puede adquirirse de Amersham Corp. (Arlington Heights, Ils.). La presente invención incluye DNA que contiene secuencias al menos un 50% idénticas y preferentemente un 75% idénticas y más preferentemente un 90% idénticas a la SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 2 y SEC ID Nº: 3 respectivamente, con la condición de que la actividad del promotor sea retenida y/o mejorada. Uno de tales derivados, p. ej. en la SEC ID NO: 1, es el mutado en uno o en los tres sitios API presentes en la región del silenciador.

La secuencia de nucleótidos que comprende el promotor de IL-18BP, un fragmento del mismo y/o un derivado del mismo puede ser enlazada operativamente a la región codificante de cualquier gen de interés para expresar ese gen en una célula hospedadora apropiada. Por enlazada operativamente se entiende enlazada operativamente para promotor y elementos. Para la expresión de un gen de interés, se prefiere que el promotor de IL-18BP entero en SEQ. ID. Nº: 1 o un fragmento del mismo tal como en SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 3 o un derivado del mismo, esté enlazado operativamente al gen de interés. Como se muestra más adelante en la sección de ejemplo, el promotor de IL-18BP, o un fragmento del mismo tal como el de la SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 3 es capaz de dirigir la expresión de genes heterólogos. También se contempla la expresión de genes homólogos con el promotor de la invención.

El promotor puede contener además un intrón, por ejemplo el primer intrón de IL-18BP.

Un promotor o elemento promotor de IL-18BP "ligado operativamente" dirigirá la transcripción de una molécula de ácido nucleico juntada en el marco de lectura apropiado. Con respecto a los promotores heterólogos, los promotores y elementos de la invención están ligados operativamente cuando controlan la función de tales promotores
heterólogos.

Como se señaló anteriormente, el promotor de IL-18BP, un fragmento del mismo y secuencias derivadas del mismo de la presente invención, pueden utilizarse para expresar cualquier gen de interés. Típicamente, se usa para este propósito un vector de expresión. Así pues, la presente invención concierne además a vectores de expresión que comprenden una secuencia de DNA aislada capaz de dirigir la expresión del gen, que comprende un promotor de IL-18BP o un fragmento del mismo o un derivado del mismo. Los vectores de expresión contienen preferentemente un promotor de IL-18BP un fragmento del mismo o un derivado del mismo, que tiene una secuencia de nucleótidos correspondiente a la SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 3, respectivamente, o fragmentos del mismo y/o derivados. También se prefieren vectores de expresión que comprenden además un gen homólogo o heterólogo ligado operativamente al promotor de IL-18BP o un fragmento del mismo y/o un derivado del mismo secuencia de nucleótidos modificada del mismo.

Los vectores de expresión de utilidad en la presente invención están frecuentemente en forma de "plásmidos", que se refieren a DNAs circulares de doble cadena que, en su forma de vector, no están unidos al cromosoma. Sin embargo, se entiende que la invención incluye estas otras formas de vectores de expresión que sirven para funciones equivalentes y que subsiguientemente se hacen conocidas en la técnica.

Los vectores de expresión útiles en la presente invención contienen típicamente un origen de replicación, un promotor de IL-18BP localizado enfrente (i. e., secuencia arriba) del gen de interés, secuencias de terminación de la transcripción y el vector restante. Los vectores de expresión pueden incluir también otras secuencias de DNA conocidas en la técnica, por ejemplo, secuencias conductoras de estabilidad que proporcionan estabilidad del producto de expresión, secuencias conductoras excretoras que proporcionan la secreción del producto de expresión, secuencias que permiten la expresión del gen estructural que se ha de modular (p. ej., por la presencia o la ausencia de nutrientes u otros inductores en el medio de crecimiento), secuencias marcadoras que son capaces de proporcionar la selección fenotípica en células hospedadoras transformadas, y secuencias que proporcionan sitios para la segmentación por endonucleasas de restricción. Las características del actual vector de expresión usado han de ser compatibles con la célula hospedadora que se va a emplear. Un vector de expresión como se contempla por la presente invención es al menos capaz de dirigir la transcripción, y preferentemente la expresión, del gen de interés dictada por la región del promotor de IL-18BP o promotor de IL-18BP o una secuencia de nucleótidos modificada de la misma. Los orígenes de replicación adecuados incluyen, por ejemplo, el del virus del simio 40 (SV40). Las secuencias de terminación adecuadas incluyen, por ejemplo, la del virus del simio 40 (SV40). El promotor de la invención puede emplearse para la expresión de prácticamente cualquier gen de interés, por ejemplo, los que codifican productos terapéuticos tales como interferón-beta, TNF, eritropoietina, activador del plasminógeno tisular, factor estimulador de las colonias de granulocitos, superóxido de manganeso dismutasa, una inmunoglobulina, o fragmento de la misma, hormona del crecimiento, hsLDLR, FSH, hCG, IL-18, proteínas de unión del receptor de TNF y proteínas de unión de IL-18. Todos estos materiales son conocidos en la técnica y muchos de ellos son disponibles comercialmente.

Los vectores de expresión adecuados que contienen las secuencias codificadoras y de control adecuadas pueden construirse usando técnicas de DNA recombinante estándar conocidas en la técnica, muchas de las cuales se describen en Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989).

La presente invención concierne adicionalmente a células hospedadoras que contienen un vector de expresión que comprende una secuencia de DNA aislada capaz de dirigir la expresión génica, que comprende una región del promotor de IL-18BP o un promotor de IL-18BP o secuencia de nucleótidos modificada del mismo. Preferentemente, la región del promotor de IL-18BP tiene la secuencia de nucleótidos correspondiente a 1272 pb secuencia arriba del sitio de inicio de la transcripción de IL-18BP expuesta en la SEC ID Nº: 1, o un fragmento de la misma tal como la secuencia de nucleótidos correspondiente a 635 pb secuencia arriba del sitio de inicio de la transcripción expuesta en la SEC ID NO: 2 o un fragmento de la misma tal como la secuencia de nucleótidos de 122 pb secuencia arriba del sitio de inicio de la transcripción expuesta en la SEC ID Nº: 3. También se prefieren células hospedadoras que contienen un vector de expresión, que además comprenden un gen homólogo o heterólogo ligado operativamente a la región del promotor de IL-18BP o la IL-18BP expuesta en la SEC ID Nº: 1 o un fragmento de la misma. Las células hospedadoras adecuadas incluyen, por ejemplo, células humanas HeLa o células del mono verde africano CV-1 y COS-1, células CHO, HepG2, células WISH, Hakat U937, etc.

Se prefieren células hospedadoras que contienen receptores para IFN\gamma, que permiten la inducción del promotor de IL-18BP y por consiguiente la expresión mejorada del gen de interés.

Los vectores de expresión pueden ser introducidos en las células hospedadoras por varios métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede llevarse a cabo la transfección de las células hospedadoras con vectores de expresión por el método de precipitación con fosfato cálcico. Sin embargo, también pueden emplearse otros métodos para introducir vectores de expresión en células hospedadoras, por ejemplo, electroporación, fusión biolística, fusión liposomal, inyección nuclear e infección viral o por fagos.

Una vez que un vector de expresión ha sido introducido en una célula hospedadora apropiada, la célula hospedadora puede ser cultivada y el polipéptido codificado por el gen de interés puede ser aislado. Alternativamente, una vez que ha sido introducido un vector de expresión en una célula hospedadora apropiada, la célula puede ser cultivada y, después de llegar a la densidad celular deseada, las células pueden ser estimuladas con IFN\gamma y puede ser aislado el polipéptido codificado por el gen de interés.

Las células hospedadoras que contienen un vector de expresión que contiene una secuencia de DNA que codifica un gen de interés pueden ser identificadas usando varios métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, hibridación DNA-DNA, establecimiento de la presencia o ausencia de funciones de gen marcador, establecimiento del nivel de transcripción medido por la producción de transcriptos de mRNA del gen de interés en la célula hospedadora, y detección del producto génico inmunológicamente.

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Las secuencias de DNA de los vectores de expresión, plásmidos o moléculas de DNA de la presente invención pueden determinarse por varios métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede emplearse el método de terminación de la cadena didesoxi que se describe en Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977), o el método de Maxam-Gilbert que se describe in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560-564 (1977).

Se ha de entender que nucleótidos específicos o regiones dentro del promotor de IL-18BP pueden ser identificados como necesarios para la regulación. Estas regiones o nucleótidos pueden localizarse por disección estructural fina de los elementos, y pueden estudiarse por experimentos que analizan la capacidad funcional de mutantes del promotor. Por ejemplo, pueden generarse mutaciones de un solo par de bases de elementos del promotor o deleciones progresivas, tales como las empleadas en la sección de ejemplo más adelante, empleando PCR. De esta manera, se amplifican varias regiones del promotor mutadas o construcciones de deleción, y después se clonan de nuevo en construcciones informadoras y se evalúan con técnicas de transfección y de ensayo de luciferasa (como se exponen en la sección de ejemplo más adelante). Estos fragmentos amplificados pueden ser clonados de nuevo en el contexto del promotor de IL-18BP y también en las construcciones del promotor heterólogo. De esta forma se identifican las secuencias exactas de nucleótidos que son importantes para dirigir la transcripción del gen.

Este análisis identificará también cambios de nucleótidos que no afectan a la función del promotor, o que pueden aumentar la función del promotor. Así, pueden construirse también promotores derivados funcionales y elementos promotores.

El análisis funcional de la región del promotor o el promotor puede facilitarse por estudios de la huella (footprint) y de desplazamiento de gel. El conocimiento de los pares de bases exactos importantes para mediar en la unión de proteínas proporciona evidencia de las bases importantes para mediar en la respuesta transcriptional.

La invención, por tanto, comprende además los pares de bases importantes en la interacción DNA-proteína. Tales pares de bases pueden ser explicados. Pueden emplearse fragmentos genómicos que contienen las áreas de interés en experimentos de obtención de huella (footprinting) in vitro [Galas et al., Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981)]. El fragmento de restricción aislado puede ser radiomarcado y subsiguientemente incubado con extractos nucleares hechos con técnicas establecidas a partir de células que se espera que contengan proteínas de unión a DNA, que se unirán al fragmento [por ejemplo, Dignam et al., Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983)]. Los fragmentos de DNA marcados se incuban con los extractos nucleares, se digieren con DNAsa I, y se someten a electroforesis en un gel de poliacrilamida desnaturalizante. Las proteínas de unión a DNA en el extracto celular se unen a su secuencia de reconocimiento contenida en el fragmento de restricción marcado, y protege al DNA de la digestión por la DNAsa. Las regiones de protección delinean el sitio de unión. Pueden usarse reacciones de secuenciación del fragmento de Maxam y Gilbert como marcador para definir los nucleótidos protegidos de la digestión por la DNAsa.

La invención se dirige también a la identificación y caracterización de factores de actuación trans que interaccionan con el promotor o elementos del promotor. Las secuencias reguladoras de actuación cis sirven de sitios de unión para proteínas que se denominan factores de transacción (TAF) [Dynan W. S., Tjian T. Nature 316, 774-778 (1985); Maniatis, T. et al., Science 236, 1237-1245 (1987)]. Se supone que cada gen se une a una o más proteínas en cada una de sus secuencias reguladoras, y estas proteínas interaccionan con otra y RNA polimerasa II de una manera que controla la transcripción.

Se han identificado TAFs en extractos nucleares por su capacidad para unirse a fragmentos de DNA de secuencia de actuación cis y retrasar su movilidad electroforética. [Dignam, J. D. et al., Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983); Dynan, W., Cell 58, 1-4 (1989); Fletcher, C. et al., Cell 773-781 (1987); Scheidereit, C. et al., Cell 51, 783-793 (1987)].

Las secuencias de actuación cis son útiles en ensayos de retardo en gel para determinar la actividad de unión en extractos nucleares. La tecnología para ensayos de desplazamiento de gel se describe en la bibliografía e incluye muchos de los mismos reactivos usados en experimentos de "footprinting" o de huella genética [Fried, M. et al. , Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981); Revzin, A., Biotechniques 7,346-355 (1989); Strauss, F. A. et al., Cell 37, 889-901 (1984)]. Fragmentos de restricción marcados con 32 P, o bien pares alineados de oligos complementarios, son incubados con extractos nucleares y poli d (I-C) en un tampón de unión, y los productos de esta reacción se someten a electroforesis en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante. La posición del fragmento de DNA en el gel, determinada con autorradiografía, se retarda en los casos en los que la proteína se ha unido al DNA. La cuantía del retardo es función relativa del tamaño de la proteína.

Las proteínas de unión así identificadas pueden entonces ser purificadas y finalmente clonadas usando técnicas conocidas.

El promotor de IL-18BP encuentra también uso en estudios transgénicos. Los ratones transgénicos proporcionan un poderoso modelo genético para el estudio de varias enfermedades humanas entre las que se incluye el cáncer. También han proporcionado un importante método in vivo para estudios de regulación génica que han confirmado y ampliado observaciones hechas con experimentos de gen informador de transfección (p. ej. luciferasa) [Palmiter, F. L. et al., Ann. Rev. Genet. 20, 465-499 (1986)]. Estudios con la intención de diseccionar las señales que permiten la relación en cuanto al desarrollo de la expresión génica pueden realizarse raras veces en modelos de cultivo de células y probablemente se estudia mejor con un modelo transgénico. Este tipo de experimento es posible debido a la notable conservación de secuencias reguladoras entre las especies, de manera que las señales reguladoras humanas son interpretadas con precisión por la maquinaria de transcripción de los ratones.

Las construcciones expresadas en ratones transgénicos podrían por tanto proporcionar mucha información acerca de la regulación del gen de la IL-18BP.

Pueden obtenerse ratones transgénicos por métodos conocidos en la técnica. El método más usado por el cual se han producido animales transgénicos implica inyectar una molécula de DNA en el pronúcleo masculino de un huevo fertilizado [Brinster et al., Cell 27, 223 (1981); Costantini et al., Nature 294, 982 (1981); Harpers et al., Nature 293, 540 (1981); Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 5016 (1981); Gordon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 1260 (1976)].

Una vez que la molécula de DNA ha sido inyectada en la célula del huevo fertilizado, la célula es implantada en el útero de la hembra receptora y se deja desarrollar en un animal. Así, todas las células del animal resultante deben contener la secuencia génica introducida.

Los ratones transgénicos resultantes o fundadores pueden ser criados y la progenie se puede analizar para establecer líneas a partir de los fundadores, que expresen el transgén. En los animales transgénicos, pueden someterse a cribaje múltiples tejidos para observar la existencia de expresión génica. Estudios del RNA en las diversas líneas de ratones permitirán la evaluación de independencia del sitio de integración para los niveles de expresión del transgén. Véanse Hogan, B. et al. Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1986).

El promotor de IL-18BP y elementos promotores pueden proporcionar también un medio útil de llevar a cabo la terapia génica.

La "terapia génica" es la administración de material genético para modificar o manipular la expresión de un producto génico para alterar las propiedades biológicas de células vivas para uso terapéutico.

Las células pueden ser alogénicas o autólogas. Las células pueden ser modificadas ex-vivo para la subsiguiente administración al sujeto, o alteradas in vivo por productos de terapia génica dados directamente al sujeto.

Para la mayor parte, las construcciones que comprenden el promotor de IL-18BP o un fragmento del mismo y/o un derivado del mismo serán utilizadas para dirigir la expresión génica en aquellas células cuando el gen IL-18BP se expresa normalmente, por ejemplo células mononucleares. Puede utilizarse cualquier medio disponible en la técnica para la transferencia de las construcciones a animales, incluyendo seres humanos. Esto incluye vectores virales, en particular vectores retrovirales (véanse, por ejemplo, Zweibel et al, Science 243, 220 (1989), y las referencias citadas en ella), así como otros métodos.

Los vectores recombinantes AAV se han mostrado bastante prometedores para al suministro de genes terapéuticos en hígado y musculatura esquelética (Snyder et al. 1997, Murphy et al. 1997, Song et al. 1998, Snyder et al. 1999, Herzog et al. 1997). Los ratones generados por rotura del gen del factor de coagulación IX muestran trastornos hemorrágicos graves y se parecen mucho al fenotipo observado en pacientes de hemofilia B. Se ha publicado (Wang et al. 1999) una única inyección intraportal de un vector de virus adeno-asociado (AAV) recombinante que codifica cDNA del factor IX canino bajo el control de un mejorador/promotor específico del hígado, conduce a una corrección a largo plazo y completa del trastorno hemorrágico.

Los vectores retrovirales, derivados de oncorretrovirus tales como el virus de la leucemia murina (MVL), han sido los vectores más ampliamente utilizados para transferir genes, porque el genoma del vector se integra en los cromosomas de las células diana, resultando la expresión estable de los transgenes (I. M. Verma y N. Somia. Nature 389, 239 (1997)) aun cuando se probó que estos vectores son buenos especialmente para dividir células. Los vectores de lentivirus, tales como los vectores de HIV, se están utilizando en la actualidad para células no en división (Mioshi et al. Science 1999 283: 682-686). La capacidad de los lentivirus para infectar células no en división, tales como macrófagos, hace de ellos buenos candidatos para su uso como herramientas de transferencia de genes. Los vectores de HIV facilitan la transducción de células troncales hematopoiéticas humanas en reposo (HSCs: hematopoietic stem cells).

Las células troncales hematopoiéticas (HSC) son una diana atractiva para la terapia génica de trastornos hematopoiéticos heredados, así como otros trastornos adquiridos, porque estas células tienen la facultad de regenerar el sistema hematopoiético completo. Por ejemplo las células troncales hematopoiéticas pueden regenerar células monolíticas que se sabe que están implicadas en la patogénesis del virus de la inmunodeficiencia humana 1 (HIV-1).

A pesar de más de 15 años de investigación en el campo de la terapia génica usando células troncales hematopoiéticas, el mayor obstáculo sigue siendo la incapacidad para insertar genes de forma eficiente y estable en estas células. Los vectores retrovirales basados en el virus de la leucemia murina de Moloney (MLV) han sido los más ampliamente usados, pero dan una transferencia de genes relativamente baja a HSC pluripotenciales humanas y una expresión génica que con frecuencia es insatisfactoria.

Recientemente, se han hecho intentos de modificación genética de células troncales hematopoiéticas con genes que inhiben la replicación del HIV-1, para el desarrollo de monocitos resistentes a la infección por HIV-1 (Kohn et al. 1999).

Teóricamente, la inserción de un gen capaz de conferir resistencia al HIV-1 en células troncales hematopoiéticas tendría por resultado que ese gen estaría presente en los monocitos maduros de la descendencia y otras células susceptibles al HIV-1. Así, el uso de un promotor que es activo en células monolíticas, tal como el promotor de IL-18BP o un fragmento del mismo, para la terapia génica del HIV-1, es ventajoso.

La terapia génica de la mayor parte de los trastornos genéticos de la sangre (p. ej. la enfermedad granulomatosa crónica SCID, talasemia etc.) requiere transferencia de genes ex vivo a linajes de células transplantables, HSCs autorrenovables, y regulación de la expresión transgénica en uno o más linajes de células. La corrección de trastornos que afectan a una progenie específica de HSCs (p. ej. hemoglobinopatías o talasemias, infección por HIV-1) requiere restringir la expresión de genes terapéuticos de una manera específica del linaje de la célula (Iotti et al. 2002). En estos casos, el direccionamiento transcripcional del gen transferido es obligado. La expresión del gen en diferentes tipos de células es dependiente de la fuerza relativa del promotor usado.

No obstante, la mayor parte de los estudios preclínicos llevados a cabo hasta ahora se han apoyado en el uso de promotores virales constitutivos para impulsar la expresión trasgénica. Por ejemplo en el vector HIV-1 usa promotor interno de CMV y el promotor de CMV murino el vector retroviral murino LTR. La regulación transgénica apropiada en el marco de un vector retroviral es una tarea difícil debido a la interferencia transcriptional entre la repetición terminal larga (LTR) y los mejoradores-promotores internos y la inestabilidad genética de secuencias reguladoras complejas. En la presente invención el promotor de IL-18BP, que se sabe que impulsa la transcripción en las células mononucleares, se usa para impulsar la expresión transgénica en HSCs, el precursor de tales células mononucleares.

La modificación genética de células troncales hematopoiéticas con "genes anti HIV" podría conducir al desarrollo de linfocitos y monocitos resistentes a la infección por HIV después del trasplante. Pueden recuperarse HSC de pacientes infectados por HIV-1, aislarse la células CD34+, ser transducidas in vitro con un vector retroviral que lleva una proteína inhibidora de HIV-1 bajo el control del promotor de IL-18BP (en vez del promotor retroviral) y reinfundir estas células en estos pacientes (Kohn et al. 1999).

La fuente de HSC más comúnmente usada son las células troncales hematopoiéticas de la sangre periférica (PBSC: peripheral blood stem cells), que han reemplazado en gran medida a la médula ósea en el marco del trasplante autólogo (Gale et al. 1992 y Kessinger et al. 1991). Las PBSC se movilizan desde la médula ósea a la circulación periférica mediante la administración de factores tales como G-CSF o GM-CSF durante 3 a 5 días y entonces pueden ser recolectadas mediante leucoaféresis. Varios estudios han señalado que el injerto tiene lugar más rápidamente cuando se trasplantan células troncales sanguíneas periféricas en vez de células de la médula ósea (Henon et al. 1992 y Chao et al. 1993).

Las células progenitoras clonogénicas contenidas en PBSC movilizadas con el factor G-CSF son bastante susceptibles a la transferencia de genes mediada por retrovirus, mientras que la tasa de transducción de células troncales con reconstitución a largo plazo en PBSC no es mejor que en la médula ósea (Breni et al. 1992, Cassel et al. 1993, Dunbar et al. 1995). Se ha observado que sujetos infectados por HIV-1 pueden tener una movilización exitosa y recolección de PBSC movilizadas con G-CSF sin aumento alguno de los niveles de HIV-1 endógeno, al menos durante las etapas tempranas de la enfermedad (Junker et al. 1997 y Slobod et al. 1996).

Otra fuente de células troncales hematopoiéticas es la sangre del cordón umbilical (UCB) que se ha demostrado que es susceptible a la transducción retroviral, potencialmente incluso más que las células de la médula ósea (Moritz et al. 1993 y Hao et al. 1995). El uso de células HSC de la UCB podría ser particularmente beneficioso para los neonatos infectados con HIV-1. Como la transmisión es en su mayor parte perinatal, la sangre del cordón umbilical debe contener números y función normales de células troncales hematopoiéticas, que pueden estar disminuidas en la médula ósea de niños y adultos infectados por HIV-1 (Kearns et al. 1997).

Se ha desarrollado un gran número de genes sintéticos que pueden suprimir la replicación del HIV-1 ("genes anti-HIV-1"), entre los que se incluye: antisentido, ribozimas, mutantes dominantes-negativos (p. ej. RevMIO), señuelos de RNA (RNA decoys), anticuerpos intracelulares para prevenir la expresión de proteínas virales o co-receptores celulares, etc. (Veres et al. 1996, Zhou et al. 1994, Couture et al 1996, Malim et al. 1989, Bahner et al 1993 y Sullenger et al. 1990, Lee et al. 1994, Marasco et al. 1997 y Chen et al. 1997). En muchos casos, se ha demostrado en sistemas modelo que estos genes anti-HIV-1 son capaces de suprimir significativamente la replicación del HIV-1 y en algunos casos incluso de limitar la entrada del virus en las células (36, 39-44). Si esencialmente el 100% de las HSC de un paciente y las células monocíticas resultantes pudiesen hacerse incapaces de soportar la replicación del HIV-1, es probable que resultarían cargas víricas disminuidas. Teóricamente, se requeriría la inhibición activa de la replicación del HIV-1 en el 99,9% de las células susceptibles para producir una reducción 3-log de la carga de virus, un efecto con frecuencia producido por la terapia anti-retroviral altamente efectiva. Sin embargo, con las capacidades limitadas para transducir efectivamente altos porcentajes de células troncales hematopoiéticas humanas, actualmente no es posible proteger la mayoría de células susceptibles. Un mecanismo alternativo para la eficacia se basa en la posibilidad de que células modificadas por ingeniería genética para que sean incapaces soportar la replicación activa del HIV-1 puedan ser protegidas de la citopaticidad inducida viralmente, y por tanto tener una ventaja de supervivencia selectiva en comparación con las células no protegidas. En ese caso, un número modesto de células protegidas puede comprender un porcentaje aumentado de todos los monocitos, llevando a cierta preservación de la función inmunitaria.

La presente invención se refiere también a composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo aceptable farmacéuticamente y un virus que comprende una secuencia de la presente invención correspondiente a la región del promotor de IL-18BP o promotor ligado operativamente a un gen de interés que codifica un fármaco adecuado. Estas composiciones pueden usarse preferentemente para dirigir un fármaco a tejidos en los que los niveles de IFN\gamma son elevados.

Habiendo descrito ahora la invención, se entenderá más fácilmente haciendo referencia a los ejemplos que siguen, que se proporcionan a título de ilustración y que no se pretende que sean limitantes de la presente invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Expresión basal de IL-18BP en monocitos

El mRNA de IL-18BP de detecta en los leucocitos, colon, intestino delgado, próstata y en particular en las células esplénicas (Novick et al. 1999). Las células esplénicas consisten en macrófagos, linfocitos y células plasmáticas con células adicionales derivadas de la circulación.

Con el fin de determinar la expresión de la proteína IL-18BP en las células, se usó una prueba ELISA específica (Ejemplo 12). Se encontró que las células mononucleares de la sangre periférica humana (PBMC peripheral blood mononuclear cells) producen constitutivamente IL-18BP (0,7-1,5 ng/ml). Las células U-937, una línea de células derivada de células malignas obtenidas de la efusión pleural de un paciente de linfoma histiocítico, no expresaron nada de IL-18BP. Las células U-937 pueden ser inducidas a diferenciación monolítica terminal por el tratamiento con ésteres de forbol. Una expresión basal de IL-18BP de 0,07 \pm 0,01 ng/ml fue detectada solamente después de la diferenciación de las células en células tipo macrófago por estimulación con TPA (10 ng/ml). Estos resultados indican que la IL-18BP se produce constitutivamente en monocitos y macrófagos.

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Ejemplo 2 Inducción de la expresión de IL-18BP en varias células diferentes

Con anterioridad se ha publicado que el IFN\gamma indujo mRNA de L-18BP y proteína en varias líneas de células tales como la línea de células de queratinocitos, una línea de células de carcinoma de colon, y en células mesangiales renales primarias (Muhl et al. 2000). Se estudió la inducción de IL-18BP en varias líneas de células humanas y en células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) por IFN\gamma y otras citocinas. La expresión de IL-18BP inducida por IFN\gamma (véase el Ejemplo 11 para la monitorización del mRNA y el Ejemplo 12 para el ELISA) en una manera dependiente de la dosis, mostrando un valor de EC50 a 50 U/ml en células WISH y HepG2 (figura 2 A y B). La IL-18BP aparentemente se acumuló en los sobrenadantes del cultivo de células WISH, ya que su concentración era más alta a las 48 h en comparación con las 24 h (figura 2 A).

Las células mononucleares de la sangre periférica humana (PBMC) produjeron constitutivamente IL-18BP (0,7-1,5 ng/ml), y el tratamiento con IFN\gamma (100 U/ml) hizo aumentar el nivel de IL-18BP en 1,7 \pm 0,1 y 2,1 \pm 0,3 veces a 24 y 48 h, respectivamente (p < 0,05, n = 4). No se observó ningún efecto sobre la producción de IL-18BP al hacer el pre-tratamiento de las PBMC con TPA.

La inducción de IL-18BP por IFN\gamma fue ensayada en la línea de células U937. El IFN\gamma no indujo IL-18BP en células U937 no diferenciadas, sin embargo, después de la diferenciación con éster de forbol (TPA, 10 ng/ml) en células de tipo macrófago, se obtuvo un nivel basal de IL-18BP (0,07 \pm 0,01 ng/ml), y aumentó en 4,6 \pm 0,05 veces al hacer la inducción con IFN\gamma (100 U/ml, 24 h), aumentando más a las 96 h (no mostrado).

El efecto de otras citocinas, tales como IFN\alpha2, IFN\beta, IL-1, IL-6, IL-12, IL-18 y TNF\alpha, sobre la expresión de IL-18BP, fue ensayado en células HepG2 (figura 2B). Los resultados obtenidos después de la incubación de las células con las distintas citocinas en presencia o en ausencia de IFN\gamma (Fig. 1 en la web PNAS) muestra que IFN\alpha2, IFN\beta, IL-1, IL-6, IL-12, IL-18 y TNF\alpha no indujeron IL-18BP solos. Sin embargo, en células HepG2 la IL-6 y el TNF\alpha actuaron sinérgicamente con IFN\gamma, proporcionando un aumento de IL-18BP estadísticamente significativo.

Estos resultados indican que la IL-18BP puede ser inducida por IFN\gamma, en monocitos y en muchas células diferentes. La inducción de IL-18BP por IFN\gamma se intensifica más mediante la adición de IL-6 y TNF\alpha.

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Ejemplo 3 El gen de IL-18BP está regulado transcripcionalmente por el IFN\gamma, requiriendo síntesis de proteínas de novo

Con el fin de comprobar si la inducción de mRNA de IL-18BP por el IFN\gamma es a nivel de la transcripción, se midió el efecto del interferón en células HepG2 y Wish en presencia de un inhibidor de la traducción, actinomicina D (Fig. 3A). El aumento de los niveles de mRNA de IL-18BP fue detectable por medio de RT-PCR semicuantitativa después de 3 h de tratamiento con IFN\gamma en células HepG2, y solamente después de 5 h en células Hakat y WISH. El pretratamiento de las células HepG2 y WISH con actinomicina D antes de la estimulación con IFN\gamma anuló la expresión de MRNA de IL-18BP en varios valores del tiempo, lo que indica que el IFN\gamma estimula la síntesis de mRNA de novo.

La acumulación de IL-18BP fue evidente a las 24 h, y más, después del tratamiento con IFN\gamma, lo que apoya una dependencia de la expresión de IL-18BP de la inducción de proteínas precedente, p. ej. factores de transcripción, por el IFN\gamma. Por consiguiente, con el fin de confirmar tal hipótesis, se empleó además un inhibidor de proteína, cicloheximida, para comprobar si la inducción del mRNA de IL-18BP por IFN\gamma requiere la síntesis de proteínas de novo. Los resultados resumidos en la figura 3B indican que el pretratamiento de las células con cicloheximida anuló la inducción del mRNA de IL-18BP. Este resultado indica que la síntesis de proteína de novo es esencial para la activación del gen de IL-18BP por el IFN\gamma.

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Ejemplo 4 Definir el sitio de inicio de la transcripción de IL-18BPa y su región del promotor, con el fin de cartografiar el promotor de IL-18BP

Para estudiar la región del promotor de IL-18BP, se requiere en primer lugar localizar específicamente el sitio de inicio de la transcripción.

El sitio de inicio de la transcripción del mRNA de IL-18BPa humana se determinó mediante 5' RACE (RACE Ejemplo 14). Solamente un producto de la PCR, correspondiente a IL-18BPa, la variante de ayuste más abundante, fue obtenido por 5' RACE. El análisis de la secuencia de DNA de este producto reveló el sitio de inicio de la transcripción y un exón adicional de 50 pb después del sitio de inicio de la transcripción en el extremo 5' del mRNA de IL-18BPa humana, correspondiente a las posiciones 785-835 del DNA genómico de IL-18BP (puede encontrarse en la base de datos de nucleótidos Entrez pubmed, nº de registro AF110798). En consecuencia, se generó un nuevo mapa exón-intrón comparando el DNA genómico con el mRNA al que se añadió el nuevo exon 5' (véase la Fig. 4).

Teniendo el sitio de inicio de la transcripción de IL-18BPa (base 1), pudo analizarse más intensamente el DNA genómico humano secuencia arriba de la base 1 (cromosoma llq clon: RP11-757C15, nº de registro AP000719.4 nucleótidos secuencia arriba de la base 152.178) correspondiente a la región del promotor de IL-18BP. La comparación de este DNA con la base de datos de la etiqueta de secuencia expresada (EST: Expressed Sequence Tag) en NCBI por el programa BLAST, reveló un gen secuencia arriba en la cadena +, que codifica una proteína dedo de zinc (Zinc-finger) (nº de registro AK001961). La secuencia de mRNA depositada de esta proteína dedo de zinc fue prolongada más por el programa "Instant RACE" (www. LabOnWeb.com), que escaneó una colección extensiva de ESTs humanas. El programa puso el mRNA del extremo 3' de la proteína dedo de Zn en el nucleótido 150.517 del clon genómico RP11-757C15, limitando así la secuencia reguladora secuencia arriba potencial de la IL-18BPa a 1661 bases secuencia arriba de la base 1.

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Ejemplo 5 Explorar el promotor mínimo, secuencia arriba del gen de IL-18BP, capaz de promover la expresión constitutiva de un gen heterológo

Con el fin de encontrar el fragmento mínimo de DNA, secuencia arriba del gen de IL-18BP, capaz de dirigir la expresión de un gen exógeno tal como el gen informador de la luciferasa, fueron generados un vector que contiene hasta 1601 pb correspondiente a la secuencia de DNA secuencia arriba de la base 1 y que incluye 50 pb secuencia abajo del sitio de inicio de la transcripción (SEC ID NO: 5), y vectores que tienen formas truncadas de este DNA (Fig. 5A) fusionados con el gen de la luciferasa (Ejemplo 15). La actividad de la luciferasa en células HepG2 humanas (una línea de carcinoma hepatocelular humano) transfectadas con un vector (pGL3 (1601)) que comprende el de 1601 pb corriente arriba, fue 10,3 \pm 0,9 veces más alta que la actividad obtenida con el vector pGL3 vacío. Tal actividad no fue observada cuando el mismo DNA fue insertado en la orientación opuesta (pGL3 (-1601)). Este resultado demostró que el DNA 1601 pb secuencia arriba de la base 1 tiene actividad de promotor basal. El examen de la secuencia de este fragmento de 1601 pb DNA de 1601 pb reveló que no incluye un elemento de la caja TATA, pero tenía varios dominios ricos en GC cerca del sitio de inicio de la transcripción en las bases -3 a -9, -39 a -48 y -122 a -132. El análisis de la secuencia de DNA de 1601 pb mediante el programa TFSEARCH identificó una secuencia gamma-activada (GAS) en las bases -24 a -32 (Fig. 1). Un análisis más profundo reveló un elemento de respuesta (IRF-E) IRF 1,2 que abarca las bases -57 a -69 y dos elementos de respuesta C/EBP\beta (C/EBP-E) en las bases -309 a -322 y -621 a -634.

Se ensayó una serie de vectores informadores de luciferasa con truncamientos progresivos en el extremo 5' del fragmento de 1601 pb. Los resultados resumidos en la figura 5A indican que todas las construcciones, incluyendo pGL3 (122), que contienen solamente los elementos IRF y GAS, fueron al menos tan efectivas como pGL3 (1601) en el apoyo a la actividad de promotor basal.

Estos resultados revelaron que el fragmento de 122 pb (SEC ID Nº: 3) que comprende los elementos IRF y GAS son suficientes para promover la actividad basal de un gen heterólogo (Fig. 5A).

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Ejemplo 6 Explorar el promotor mínimo, secuencia arriba del gen de IL-18BP, capaz de promover la expresión inducible de un gen heterólogo

Con el fin de identificar el fragmento de DNA mínimo, región secuencia arriba del promotor de IL-18BP capaz de promover la expresión de la luciferasa inducida por IFN\gamma, se ensayaron los vectores de DNA truncados del ejemplo precedente en células HepG2 transfectadas en presencia de IFN\gamma (figura 5B, para las transfecciones véase el ejemplo 16).

Los resultados resumidos en la figura 5B indican que después de 24 h el IFN\gamma hizo aumentar la actividad de la luciferasa en 33 veces sobre el nivel de expresión basal en el vector que incluye solamente los elementos IRF-E y GAS (vector pGL3 (122)). Este resultado demuestra que el par IRF-E-GAS sólo puede mediar la inducción génica heteróloga por IFN\gamma. La inclusión de elementos C/EBP-E1 y 2 (pGL3 (656)) hizo aumentar significativamente la inducción de la actividad de la luciferasa por IFN\gamma a 88 veces sobre la actividad basal, lo que demuestra la importancia de estos elementos en la inductividad por IFN\gamma. En cambio, la inclusión de un DNA secuencia arriba adicional a tal inserto (pGL3 (1106) anuló la inducción de la actividad de la luciferasa por encima de su nivel basal. Este resultado sugirió que dentro de las bases -656 a -1106 (secuencia arriba del segundo elemento C/EBP-E1) reside un elemento silenciador. Se demostró que tres elementos de respuesta AP1 están presentes dentro de la región silenciadora y que c-Jun se une y está implicado en la silenciación del gen de IL-18BP a través de los tres elementos de respuesta AP-1.

La extensión más profunda del promotor en 88 bases secuencia arriba del silenciador (pGL3 (1272)) restableció la respuesta a IFN\gamma, sugiriendo que en las bases -1106 a -1272 reside un elemento mejorador, y su activación por IFN\gamma suprime el efecto del silenciador vecino. Más extensión de la secuencia no afectó a la actividad basal o inducida por IFN\gamma, sugiriendo que todas las secuencias reguladoras secuencia arriba estaban localizadas dentro de las bases -1 a -1272 (SEC ID Nº: 1).

De todas las construcciones ensayadas, la inductividad del pGL3 (656) es la más alta, lo que indica que este fragmento de DNA contiene el promotor inducible óptimo de IL-18BP.

Los resultados indican que el promotor inducible mínimo está situado 122 pb secuencia arriba del sitio de inicio de la transcripción (SEC ID Nº: 3) que contiene los elementos IRF-E y GAS, en donde el promotor inducible máximo y óptimo está situado 656bp secuencia arriba del sitio de inicio de la transcripción (SEC ID NO: 2) que contiene, además de los elementos IRF-E y GAS, dos elementos C/EBPp.

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Ejemplo 7 Participación de IRF-1 en la expresión de IL-18BP in-vivo

Para explorar la participación de IFR-1, cuyo sitio de unión se encontró que estaba en el promotor de IL-18BP, en la expresión de IL-18BP, se estudió la expresión de IL-18BP en ratones deficientes en IRF-1.

Los niveles de IL-18BP se midieron en ratones deficientes en IRF-1 (Jackson Laboratories, Bar Harbor ME) antes y después de la administración de IFN\gamma murinay, y se compararon con los de ratones testigo C57B1/6 (Fig. 6). La IL-18BP basal en el suero en los ratones testigo C57B1/6 fue 9,1 \pm 1,9 ng/ml y fue aumentada significativamente por IFN\gamma a 22,4 \pm 2,2 ng/ml. En cambio, la IL-18BP en suero en ratones deficientes en IRF-1 estaba por debajo del límite de detección y aumentó a solamente 0,7 \pm 1,15 ng/ml con IFN\gamma. Este resultado confirmó la importancia del IRF-1 como mediador de la expresión de IL 18BP tanto basal como inducida por IFN\gamma.

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Ejemplo 8 Detección de los factores de transcripción que se unen al promotor de IL-18BP bajo condiciones inductivas

Se emplearon ensayos de desplazamiento de la movilidad electroforética (EMSA: Electrophoretic Mobility Shift Assays, Ejemplo 18) para identificar las interacciones proteína-DNA entre los diversos elementos de respuesta dentro del promotor de IL-18BP. Sondas marcadas de DNA ds (doble cadena) correspondientes a las bases -33 a -75 (que contienen el IRF-E) y -8 a -55 (que contienen el GAS) se dejaron unir con extractos nucleares de células testigo y de células tratadas con IFN\gamma. Un complejo de la sonda que contiene IRF-E y proteína o proteínas nucleares fue evidente después de la incubación de las células durante 1 h con IFN\gamma y se observó la respuesta máxima a las 3 h (Fig. 7 A, pistas 1-5). Como se esperaba, la adición de anticuerpos contra IRF-E provocó un "super-desplazamiento", mientras que los anticuerpos anti transductor de la señal y activador de transcripción 1 (STAT1) no tuvo efecto (datos no mostrados). Al contrario que con IRF-E, la sonda que contiene GAS se asoció constitutivamente con una proteína (Fig. 7 A, pista 6), y este complejo fue mejorado en la inducción de las células IFN\gamma durante 3 a 6 h (pistas 7,8). Es de esperar que GAS se una al dímero STAT1 inducido por IFN\gamma. Sin embargo, el complejo no fue afectado por anticuerpos contra STAT1 (pista 10), lo que sugiere que el dímero de STAT1 inducido por IFN\gamma no estaba asociado con este GAS. El mismo resultado negativo se obtuvo con extractos nucleares de células tratadas con IFN\gamma durante solamente 15 ó 30 min (datos no mostrados). Sorprendentemente, este complejo fue anulado por anticuerpos contra C/EBP\beta (pista 9) y fue superdesplazado con anticuerpos contra IRF-1 (pista 10). Por ello la sonda de DNA que contiene GAS parece unirse a C/EBP\beta a pesar de la falta de un C/EBP\beta E de consenso.

Los resultados obtenidos con EMSA indican que, en la inducción con IFN\gamma, el IRF-1 se une al elemento IRF-E en el promotor de IL-18BP. Además, se forma un complejo que comprende IRF-1 y C/EBP\beta y se une al elemento GAS.

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Ejemplo 9 Explorar el papel del complejo IRF-1-C/EBPp en la inducción de IL-18BP

Para estudiar mejor el papel de IRF-1 y C/EBP\beta en la inducción del gen de IL-18BP, se midió el mRNA de IL-18BPa mediante PT-PCR semicuantitativa después de la sobreexpresión de IRF-1 y C/EBP\beta empleando la transfección de vectores de expresión (Ejemplo 14, Fig. 7 B). La sobreexpresión del factor de transcripción o bien de una combinación de ambos factores en células HepG2 no indujo mRNA de IL-18BP. Este resultado sugirió que se requieren factores inducidos por IFN\gamma adicionales para la activación del gen de IL-18BP. La transfección de las células con uno cualquiera de los vectores de expresión seguida por su inducción con IFN\gamma redujo realmente el mRNA de IL-18BP en comparación con IFN\gamma sólo. En cambio, la coexpresión de los dos factores de transcripción hizo aumentar la inducción de mRNA de IL-18BP por IFN\gamma. Este resultado sugirió que IRF-1 y C/EBP\beta han de estar presentes en una determinada relación, posiblemente formando un complejo dentro del complejo de iniciación de la transcripción. Para estudiar mejor la posible interacción entre IRF-1 y C/EBP se llevó a cabo una titulación de la actividad de luciferasa cotransfectando células con pGL3 (1272), una cantidad fija de un vector de expresión IRF-1 y cantidades variables de vector de expresión C/EBPR. Del mismo modo, se midió la actividad de la luciferasa cuando se mantenía constante el vector C/EBP\beta y con cantidades variables de vector IRF-1. En ambos casos se obtuvo una curva de respuesta a la dosis en forma de campana, lo que sugiere que la inducción de IL-18BP óptima requiere una relación molar fija entre estos dos factores de transcripción (Fig. 7 C).

Se realizaron estudios de inmunoprecipitación con el fin de confirmar la asociación física entre IRF-1 y C/EBP\beta (Ejemplo 19, Fig. 7 D). La inmunoprecipitación (ip) seguida por inmunotransferencia (ib: immunoblotting) de proteínas nucleares y citoplásmicas (Ejemplo 15) procedentes de células tratadas con IFN\gamma, con anticuerpos contra CfEBP\beta, reveló que C/EBP\beta se expresa constitutivamente en células HepG2 y transloca al núcleo en respuesta a IFN\gamma (panel superior). Al contrario que C/EBP\beta que no se induce por IFN\gamma, la ip y la ib de extractos celulares con anticuerpos contra IRF-1 revelaron que el IFN\gamma induce la expresión de IRF-1. Pero al igual que C/EBP\beta, en la inducción por IFN\gamma, IRF-1 se transloca al núcleo (panel intermedio). La ip con anticuerpos contra C/EBP\beta, seguida por la ib con anticuerpos contra IRF-1, reveló la presencia de un complejo IRF-1-C/EBP\beta estable en la fracción nuclear (panel inferior). Estos resultados confirman la formación del IRF-1-C/EBP\beta en la inducción con IFN\gamma y es la primera demostración de la existencia de tal complejo entre estos dos factores de transcripción. Así, al tener lugar la inducción por IFN\gamma, la secuencia proximal que contiene GAS y su IRF-E adyacente se unen al complejo de C/EBP\beta y IRF-1.

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Ejemplo 10 Explorar el papel de los C/EBP-Es en el promotor de la actividad de IL-18BP

Los dos sitios C/EBP\beta en la posiciones -309 a -322 y -621 a -634 no tienen un IRF-E adyacente. En realidad, el EMSA (ensayo de desplazamiento de la movilidad electroforética) (Ejemplo 18) de una sonda correspondiente a los sitios C/EBP\beta en las posiciones -309 a -322 reveló una banda retardada (punta de flecha rellena) que estaba superdesplazada con anticuerpos contra C/EBP\beta (punta de flecha vacía) pero no con anticuerpos contra IRF-1 (Fig. 8 A). Por ello se sacó la conclusión de que este sitio se une a C/EBP\beta y no su complejo con IRF-1. Además, esta banda fue generada con un extracto nuclear de células HepG2 no inducidas que expresan constitutivamente C/EBP\beta, pero que carecen de IRF-1. De hecho, el IFN\gamma no hizo aumentar la expresión de C/EBP\beta en estas células (Fig. 8 D) y en consecuencia no hizo aumentar intensidad de la banda retardada (Fig. 8 A). Resultados similares fueron obtenidos con el sitio más distal C/EBP\beta (datos no mostrados).

Los resultados indican que el factor de transcripción C/EBP, a diferencia del IRF-1, se expresa constitutivamente y no es inducido por IFN\gamma, y que además de unirse a IRF-1 y a GAS, se une a los dos elementos C/EBP presentes en el promotor de IL-18BP.

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Ejemplo 11 Estudiar el papel del mejorador en la expresión de IL-18BP

El papel regulador del mejorador distal fue estudiado mediante EMSA (Ejemplo 18) con una sonda DNA de 192 pb, correspondientes a los nucleótidos -1081 a -1272. El extracto nuclear de células HepG2 testigo formó un complejo con esta sonda (Fig. 8 B, punta de flecha rellena). En el tratamiento de las células con IFN\gamma, el complejo fue más intenso y algo más retardado. Entonces se realizó un superdesplazamiento de este complejo con anticuerpos dirigidos contra IRF-1, C/EBP\beta y cFos. De estos, solamente el anti IRF-1 provocó un superdesplazamiento (Fig. 8 B, punta de flecha vacía). Un DNA ds no marcado correspondiente a los nucleótidos -1083 a -1174 no compitió con la sonda radiomarcada, lo que indica que las proteínas nucleares estaban unidas a los restos -1175 a -1272. Como el IRF-E fue identificado solamente en la región proximal, este resultado sugiere que el mejorador distal estaba probablemente asociado con el IRF-E proximal.

Estos resultados indican que el mejorador distal interacciona con el promotor basal a través de IRF-1.

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Ejemplo 12 ELISA para IL-18BP

La IL-18BP humana se midió mediante un ELISA de doble anticuerpo como se ha descrito (Novick et al 2001). La IL-18BP de ratón se midió mediante un ELISA de doble anticuerpo usando anticuerpo policlonal purificado por afinidad de antígeno de conejo, contra IL-18BP murina y anticuerpo biotinilado, que se obtuvieron de Cytolab, Israel.

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Ejemplo 13 Aislamiento y PCR con Transcripción Inversa (RT) del RNA

Después del tratamiento en medio libre de suero, las células HepG2 y WISH (10^{6}) fueron recolectadas en los tiempos indicados y el RNA total se extrajo usando reactivo TRI. El cDNA se preparó usando hexámeros aleatorios y SuperscriptII (Invitrogen^{TM}, Leek, Holanda) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La PCR se llevó a cabo con los cebadores siguientes: IL-18BP humana, 5'CACGTCGTCACTCTCCTGG y 5'CGACGTGACGCTG
GACAAC; IRF-1 humana 5'GACCCTGGCTAGAGATGCAG y 5'GAGCTGCTGAGTCCATCAG; \beta Actina humana 5'GTGGGGCGCCCCAGGCACCA y 5'CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC. Las amplificaciones se hicieron por desnaturalización inicial (92ºC, 2 min), 28 ciclos de desnaturalización (92ºC, 45 sec.), apareamiento (annealing) (62ºC, 1 min) y alargamiento (extensión) (72ºC, 1,5 min), y alargamiento final (72ºC, 10 min). Los productos de PCR resultantes fueron resueltos mediante electroforesis en gel de agarosa (1%).

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Ejemplo 14 Amplificación (multiplicación) rápida de los extremos de cDNA 5' (5'RACE)

Se llevó a cabo 5'RACE con un sistema 5'RACE (GIBCO BRL) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. De forma resumida, el RNA total de las células WISH tratadas con IFN\gamma fue sometido a transcripción inversa (Ejemplo 13) con un cebador complementario de los nucleótidos 89 a 70 del mRNA de IL-18BPa (GenBank nº de registro AF110799) seguido por el tailing (adición de cola de nucleótidos) de los extremos recién sintetizados, con un DNA de anclaje. Después se realizó la PCR con un cebador directo complementario del DNA de anclaje y un cebador inverso anidado complementario a los nucleótidos 31 a 11 del mRNA de IL-18BPa. Los productos de la PCR fueron después subclonados y sometidos a análisis de secuencia de DNA.

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Ejemplo 15 Plásmidos y clonación

La región del promotor de IL-18BPa putativa completa de 1601 pb fue obtenida por PCR del DNA genómico usando un cebador sentido (S4753.pgl) que contiene un sitio Kpn I (5' CTATATGGTACCCACCCTTCCTTTTACTTTTTCC) y un cebador inverso (R1exA) que contiene un sitio NHe I (5'TATCGCTAGCCAGTCACACAGGGAGGCAGT). El producto de la PCR fue clonado en el vector pGEM-T Easy (Promega, Madison, WI) y comprobado por análisis de la secuencia de DNA. Un fragmento Kpn I-Nhe I fue aislado del clon pGEM-T Easy y ligado en el vector pGL3-Basic (Promega) usando el kit de ligación rápida de DNA (Roche) para dar pGL3 (1601). Una serie de informadores truncados 5' (pGL3 (1454), pGL3 (1274), pGL3 (1106), pGL3 (656), pGL3 (280) y pGL3 (122) fue igualmente preparada con el mismo cebador inverso y con los siguientes cebadores sentido, respectivamente:

S334. pgl 5':: CTATATGGTACCCATGAACTAGACACCTAGAG;

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S415. pgl 5':: CTATATGGTACCCTACAAGAAGTTTGAGATCA;

S501. pgl 5':: CTATATGGTACCCAGCCGTTGCACCCTCCCAATCAC;

lexD pgl 5':: CTATATGGTACCGTCTTGGAGCTCCTAGAGG;

S504. pgl 5':: CTATATGGTACCCACCAAAGTCCTGACACTTG y

Sl39. pgl 5':: TTGGTACCCACTGAACTTTGGCTAAAGC.

Todos los productos de la PCR fueron también clonados en el vector pGL3-Basic en la orientación opuesta para servir de testigos.

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Ejemplo 16 Ensayos de transfección transitoria

Células HepG2 o WISH en placas de 6 pocillos (0,5 x 10^{6}/pocillo) fueron transfectadas usando FuGENE 6 y el vector informador de luciferasa indicado (0,5 \mug/pocillo) y pSV40 (3GAL (0,2 pg/pocillo, Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En algunos casos la co-transfección se hizo con los siguientes vectores de expresión: pcDNA3-IRF-1 (0,07-1,5 \mug/pocillo, proporcionado gentilmente por el Dr. B. Levy, Technion, Israel); pcDNA3-C/EBP\beta (0,5-2,5 pg/pocillo, proporcionado gentilmente por el Dr. D. Zipori, Weizmann Institute of Science). Al cabo de 16 h las células fueron tratadas con IFN\gamma (100 U/ml), IL-6 (150 U/ml), o TNF\alpha (10 ng/ml), o sus combinaciones indicadas, en medio libre de suero, durante 24 h. Las células fueron después recolectadas y lisadas, y se midió la actividad de la luciferasa. Todos los resultados fueron normalizados frente a la actividad de p-galactosidasa.

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Ejemplo 17 Preparación de extractos nucleares y citoplásmicos

Las células se lavaron 3x con solución salina tamponada con fosfato (PBS) enfriada con hielo e inmediatamente se congelaron en nitrógeno líquido. Los sedimentos de células fueron resuspendidos en cuatro veces el volumen de las células empaquetadas, de tampón citoplásmico (Hepes 10 mM, pH 7,9, NaCl 10 mM, EDTA 0,1 mM, 5% (en vol.) de glicerol, MgCl_{2} 1,5 mM, ditiotreitol (DTT) 1 mM, PMSF 0,5 mM, NaF 50 mM, Na_{3}VO_{4} 0,1 mM, EGTA 2 mM, EDTA 10 mM, Na_{2}Mo0_{4} 10 mM, 2 \mug/ml de cada uno de los productos leupeptina, pepstatina y aprotinina). El lisado fue centrifugado (3000 x g, 10 min.) y se recogió el sobrenadante que contiene las proteínas citoplásmicas. El sedimento fue resuspendido en 2,5 veces el volumen de las células empaquetadas, de tampón nuclear (idéntico al tampón citoplásmico excepto que el NaCl fue aumentado a 0,42 M). Los residuos de los núcleos se eliminaros por centrifugación (15.000 x g, 20 min., 4ºC), se congelaron en nitrógeno líquido partes alícuotas del sobrenadante y se almacenaron a -80ºC.

La concentración de proteína se determinó mediante un kit de reactivos de ensayo de proteína BCA (Pierce, Rockford USA) usando albúmina de suero bovino como patrón.

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Ejemplo 18 Ensayos de desplazamiento de la movilidad electroforética

Oligonucleótidos ds (doble cadena) correspondientes a elementos de respuesta seleccionados (10 pmol) fueron marcados con [^{32}P]3 ATP mediante polinucleótido cinasa (New England Biolabs). Los extractos nucleares (5 \mug de proteína) fueron preincubados (15 min., 0ºC) junto con poli (dI-dC) (Amersham Pharmacia Biotechnology) en 20 \mul de tampón EMSA (Hepes 20 mM pH 7,5; MgCl_{2} 5 mM, EDTA 2 mM, DTT 5 mM y 5% (en vol.) de glicerol). Después se añadió una sonda marcada (3 x 10^{4} cpm) y la incubación continuó durante 30 min. más a temperatura ambiente. Para los ensayos de superdesplazamiento, las muestras se incubaron con los anticuerpos indicados (4 \mug, 1 h a 0ºC) antes de la adición de la sonda. Se añadió un exceso de 200 veces de competidores de tipo silvestre y mutados, junto con la sonda de interés. Las mezclas de reacción fueron después sometidas a electroforesis en geles de poliacrilamida al 5% no desnaturalizante. Los geles se secaron bajo vacío y se autorradiografiaron durante la noche a -80ºC.

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Ejemplo 19 Análisis de inmunoprecipitación (ip) e inmunotransferencia (ib)

Extractos de proteína nuclear o citoplásmica (80 \mug) fueron incubados con 6 \mug de los anticuerpos policlonales indicados, durante la noche, a 4ºC, y se inmunoprecipitaron con bolas de Proteína G Sepharose (Pharmacia) durante 1 h a temperatura ambiente. Las bolas se hirvieron después en tampón para muestra para SDS-PAGE que contiene 10% de DTT, y el sobrenadante se resolvió mediante SDS-PAGE (10% de acrilamida) bajo condiciones reductoras. El gel se transfirió después a una membrana de nitrocelulosa y las proteínas se detectaron con los anticuerpos indicados. Los complejos inmunitarios fueron identificados mediante el kit de detección Super Signal^{TM} (Pierce).

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Ejemplo 20 Preparación de r-hsLDLR de CHO usando el promotor de IL-18BP

Células CHO recombinantes estables que expresan LDLR humanos solubles son generadas por cotransfección de células CHO-DUKX carentes del gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (Urlaub, G. et al., 1980) con dos vectores de expresión: uno que contiene el dominio de unión con el ligando N-terminal del LDLR, que comienza en el resto de aminoácido Asp (+4) hasta Glu 291 (+291), y pDHFR, que contiene el gen murino para DHFR, DHFR controlada por el promotor temprano SV40 y gen sLDLR por el promotor de IL-18BP (SEC ID Nº: 2) y elementos de terminación de la transcripción de la región temprana SV40. La transfección se lleva a cabo mediante liposomas catiónicos usando LipofectAmine (Gibco BRL), de acuerdo con el protocolo descrito por el fabricante. Setenta y dos horas después de la transfección, la células se transfieren a un medio selectivo carente de desoxi y ribonucleósidos y suplementado con 10% de FCS dializado. Las células que expresan actividad de DHFR son capaces de formar colonias, que se aíslan levantando las células con discos de papel empapados en tripsina. Las células se desarrollan y se seleccionan por su actividad de r-hsLDLR. Las células transfectadas se someten después a amplificación génica mediante MTX, seguida por subclonación y selección de los clones productores estables.

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<110> Yeda Research and Development Co. Ltd.

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Rubinstein, Menachem

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Novick, Daniela

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Hurgin, Vladimir

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<120> PROMOTOR PARA IL-18BP, SU PREPARACION Y SU USO

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<130> 596PCT

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<150> 152232

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<151> 10-10-2002

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<160> 5

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 1272

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

1

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<210> 2

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<211> 634

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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3

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<210> 3

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<211> 122

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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4

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<210> 4

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<211> 1061

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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5

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<210> 5

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<211> 51

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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cccagaagca gctctggtgc tgaagagagc actgcctccc tgtgtgactg g

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51

Claims

1. Una secuencia de DNA que codifica el promotor de la IL-18BP humana (SEC. ID Nº: 1), o un fragmento funcional de la misma, o un derivado funcional de la misma, en donde el extremo 3' de dicha secuencia de DNA o fragmento de la misma comprende la SEC ID Nº 5.

2. La secuencia de DNA según la reivindicación 1ª, en la que el derivado está mutado en uno o más de los sitios AP1 presentes en un elemento silenciador presente en la secuencia.

3. La secuencia de DNA según la reivindicación 1ª, en la que el fragmento comprende la SEC ID NO: 2.

4. La secuencia de DNA según la reivindicación 1ª, en la que el fragmento comprende la SEC ID NO: 3.

5. La secuencia de DNA según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 4ª, que comprende además un intrón.

6. La secuencia de DNA según la reivindicación 5ª, en la que el intrón consiste en el primer intrón de IL-18BP.

7. La secuencia de DNA según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que contiene además un gen ligado operativamente al promotor de IL-18BP.

8. La secuencia de DNA según la reivindicación 7ª, en la que el gen codifica IL-18BP.

9. La secuencia de DNA según la reivindicación 7ª, en la que el gen codifica una proteína heteróloga.

10. La secuencia de DNA según la reivindicación 9ª, en la que el gen heterólogo codifica el gen de la luciferasa.

11. La secuencia de DNA según la reivindicación 9ª, en la que el gen heterólogo codifica una proteína elegida entre interferón-beta, TNF, eritropoietina, activador del plasminógeno tisular, factor estimulador de las colonias de granulocitos, superóxido de manganeso dismutasa, una inmunoglobulina o un fragmento de la misma, hormona del crecimiento, FSH, hCG, IL-18, hsLDLR y proteínas de unión con el receptor del TNF.

12. Un vector que comprende una secuencia de DNA según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

13. Una célula hospedadora que comprende un vector según la reivindicación 12ª.

14. Una célula hospedadora según la reivindicación 13ª, que es una célula de mamífero.

15. Una célula hospedadora según la reivindicación 14ª, elegida entre células CHO, WISH, HepG2, Cos, CV-1, HeLA, y Hakat U937.

16. Un método para la producción de una proteína recombinante, que comprende cultivar una célula hospedadora según una cualquiera de las reivindicaciones 13ª a 15ª, y aislar la proteína recombinante producida.

17. Un vector de virus recombinante que comprende una porción del genoma del virus, un fragmento de DNA que codifica un gen de interés y un fragmento de DNA que comprende una secuencia de DNA que codifica el promotor de IL-18BP humana según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 6ª, unido operativamente al gen de interés.

18. Un vector de virus recombinante según la reivindicación 17ª, en el que el gen de interés se elige entre interferón-beta, TNF, eritropoietina, activador del plasminógeno tisular, factor estimulador de las colonias de granulocitos, superóxido de manganeso dismutasa, una inmunoglobulina o un fragmento de la misma, hormona del crecimiento, FSH, hCG, IL-18, hsLDLR y proteínas de unión con el receptor del TNF.

19. Un vector de virus recombinante según la reivindicación 17ª, en el que la porción del genoma del virus pertenece a un virus adenoasociado.

20. Un vector de virus recombinante según la reivindicación 17ª, en el que la porción del genoma del virus pertenece a un retrovirus.

21. Un vector de virus recombinante según la reivindicación 20ª, en el que el retrovirus se elige entre HIV, HFV, MLV, FIV y VSV.

22. Un método in vitro de regulación de la expresión específica de la célula de un gen de interés, que comprende transducir una célula diana de mamífero con un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 17ª a 21ª.

23. Un método según la reivindicación 22ª, en el que la célula diana es una célula troncal hematopoiética.

24. Un método según la reivindicación 22ª, en el que la célula diana es un monocito.

25. Un método según la reivindicación 24ª, en el que la célula diana es un macrófago.

26. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 22ª a 25ª, en el que el gen de interés codifica una proteína que confiere resistencia a la infección por el HIV.

27. El uso del vector de virus recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 17ª a 21ª para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la infección por HIV, trastornos hematopoiéticos tales como SCID, enfermedad granulomatosa crónica y talasemia, y/o de una enfermedad en un individuo que muestra un IFN\gamma elevado en un tejido corporal.

28. El uso según la reivindicación 27ª, en el que el medicamento es para el tratamiento de una enfermedad en un individuo que muestra un IFN\gamma elevado en un tejido corporal, y comprende además factores IL-6 y/o TNF\alpha y/o IRF y/o C/EBP\beta.

29. Ratones transgénicos que albergan la secuencia de DNA que codifica una secuencia de DNA según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 11ª.

30. El uso de una secuencia de DNA que codifica el promotor de la IL-18BP humana (SEC ID NO: 1), o un fragmento o un derivado funcional de la misma, en donde el extremo 3' de dicha secuencia de DNA o fragmento de la misma comprende la SEC ID NO: 5, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una infección por HIV, trastornos hematopoiéticos tales como SCID, enfermedad granulomatosa crónica y talasemia, y/o de una enfermedad en un individuo que muestra un INF\gamma elevado en un tejido corporal.

31. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de una secuencia de DNA que codifica el promotor de la IL-18BP humana (SEC ID NO: 1) o un fragmento funcional o un derivado funcional de la misma, en la que el extremo 3' de dicha secuencia de DNA o fragmento de la misma comprende la SEC ID NO: 5.