ES2335557T3

ES2335557T3 - Conjugados de peptido-polisacarido.

Info

Publication number: ES2335557T3
Application number: ES98906928T
Authority: ES
Inventors: Monique Moreau; Noelle Mistretta
Original assignee: Sanofi Pasteur Inc
Current assignee: Sanofi Pasteur Inc
Priority date: 1997-01-21
Filing date: 1998-01-21
Publication date: 2010-03-29
Anticipated expiration: 2018-01-21
Also published as: DK0959905T3; US6472506B1; NO984341L; ATE451124T1; CA2246760C; WO1998031393A3; NO323870B1; CA2246760A1; DE69841362D1; EP0959905B1; NO984341D0; AU6295798A; EP0959905A2; WO1998031393A2; KR20000064696A; AU722315B2; JP2000507974A; PT959905E; NZ331578A; KR100593466B1

Abstract

Un procedimiento para conjugar (i) un péptido que contiene al menos seis restos de aminoácido, al menos uno de los cuales es un resto de cisteína, con (ii) un polisacárido que comprende al menos cuatro unidades repetitivas, comprendiendo dicho procedimiento: A (i) Activar el polisacárido con un enlazador bifuncional de fórmula (I) R1-A-R2 en la que R1 es un grupo maleimidilo, A es una cadena carbonada aromática o alifática sustituida o no sustituida, y R2 es un grupo succinimidilo, de forma que R2 reacciona con los grupos amino del polisacárido y se obtiene un polisacárido activado; y (ii) conjugar con el péptido el polisacárido activado, de forma que R1 reacciona con el grupo tiol del resto de cisteína y se obtiene un conjugado, en el que se introduce al azar una diversidad de entidades de péptido todo a lo largo de la cadena de polisacárido por unión covalente; o B (i) Derivatizar el polisacárido con un espaciador de fórmula (II) R3-B-R4 en la que R3 es un grupo funcional capaz de reaccionar con grupos amino, carboxilo o hidroxilo, B es una cadena carbonada aromática o alifática y R4 es un grupo amino, de forma que R3 reacciona con los grupos amino, carboxilo o hidroxilo del polisacárido y se obtiene un polisacárido derivatizado, en el que se introduce al azar una diversidad de entidades de espaciador todo a lo largo de la cadena de polisacárido; (ii) activar el polisacárido derivatizado con un enlazador bifuncional de fórmula (I) R1-A-R2 en la que R1 es un grupo maleimidilo, A es una cadena carbonada aromática o alifática sustituida o no sustituida, y R2 es un grupo succinimidilo, de forma que R2 reacciona con R4 y se obtiene un polisacárido activado; y (iii) conjugar con el péptido el polisacárido activado de forma que R1 reacciona con el grupo tiol del resto de cisteína del péptido y se obtiene un conjugado, en el que una diversidad de entidades de péptido se introduce al azar todo a lo largo de la cadena de polisacárido, por unión covalente.

Description

Conjugados de péptido-polisacárido.

La presente invención se refiere a un conjugado de polisacárido péptido y a un procedimiento para prepararlo. En una realización particular de la invención, el conjugado usa polisacáridos bacterianos o fúngicos y así puede ser útil para vacunas.

Los polisacáridos constituyen una amplia familia de moléculas poliméricas que son útiles en varios campos de la técnica. En algunos casos, requieren estar acoplados a un polipéptido, p. ej. una proteína o un péptido. Por ejemplo, los polisacáridos se usan en técnicas de diagnóstico o de purificación como medio matriz para reactivos de péptido. Los polisacáridos no inmunógenos tales como el dextrano son también útiles para presentar péptidos pequeños al sistema inmunológico como se describe en el documento EP 326 1 11. El realidad, los péptidos han de unirse a portadores de proteínas o han de ser administrados con un coadyuvante, siendo los compuestos de aluminio los más comúnmente usados. Sin embargo, los péptidos pequeños mezclados, adsorbidos o precipitados con estos coadyuvantes pueden verse impedidos por el gel de aluminio, y por tanto no estar disponibles para el sistema inmunológico. Para obviar este problema, el documento EP 326 111 enseña que los péptidos pueden ser conjugados con polisacáridos no inmunógenos. Tales conjugados, en presencia de compuestos de aluminio, pueden desencadenar una respuesta inmunitaria contra el resto peptídico.

En el campo de las vacunas, es también muy importante conjugar polipéptidos, p. ej. péptido o proteína, con polisacáridos inmunógenos, persiguiendo estos una respuesta inmunitaria contra los polisacáridos. En realidad, la cápsula y la pared celular de las bacterias (y también la pared celular de los hongos) están constituidas esencialmente por polisacáridos compuestos de unidades repetitivas muy específicas que llevan motivos de epítopo que normalmente no se encuentran en los mamíferos y que pueden mediar la inmunogenicidad. Por tanto, los polisacáridos, p. ej. los polisacáridos capsulares, han sido ya usados como vacunas contra enfermedades bacterianas tales como la meningitis, la neumonía y la fiebre tifoidea.

Sin embargo, hay un importante problema cuando se usan polisacáridos como vacunas. Aunque han demostrado ya ser inmunógenos, es decir, en otras palabras, desencadenan una respuesta inmunitaria cuando son administrados a tales mamíferos, e incluso aunque esta respuesta puede ser escasa, son específicos por cuanto pertenecen al pequeño número de antígenos que pueden inducir la producción de células B sin ayuda de células T. En consecuencia, se les denomina antígenos T-independientes (independientes de las células T).

La respuesta inmunitaria inducida por los antígenos T-independientes se caracteriza por varios aspectos entre los que se encuentran:

(i) La respuesta primaria es más débil y más temprana que la respuesta a los antígenos T-dependientes;

(ii) La respuesta del anticuerpo no madura en una elevada producción de IgG, con aumento de la afinidad, como se observa con los antígenos T-dependientes;

(iii) La memoria inmunitaria correspondiente a los antígenos T-independientes es escasa y por tanto, como la memoria inmunitaria es la clave para la respuesta inmunitaria secundaria que constituye la base del principio de la vacunación, un antígeno T-independiente es un antígeno pobre para inducir una respuesta inmunitaria protectora a largo plazo; y

(iv) Los niños no pueden responder a los polisacáridos antes de cumplir uno o dos años.

Para que induzcan una respuesta inmunitaria secundaria, los antígenos T-independientes necesitan estar unidos covalentemente a una proteína portadora tal como la toxina de la difteria o del tétanos, que da al antígeno el carácter T-dependiente. Su conjugado puede entonces ser complementado con un coadyuvante tal como un compuesto de aluminio o el coadyuvante de Freund completo o incompleto (estos dos últimos exclusivamente para ser usados en mamíferos distintos de los seres humanos), para que las respuesta inmunitaria se potencie (efecto del coadyuvante).

Por el término "portador" ("barriera") se entiende una molécula que, cuando se une covalentemente a un antígeno, p. ej. un polisacárido, es capaz de promover una respuesta T-dependiente contra el antígeno. Tal respuesta se muestra en un esquema de vacunación que comprende al menos dos inyecciones del conjugado antígeno-portador, con una separación de días, semanas o meses (sensibilización y refuerzo). En la primera infección (sensibilización), se muestra una respuesta débil del anticuerpo, mientras que en la inyección de refuerzo la respuesta del anticuerpo se desencadena a un nivel elevado. Tal respuesta aumentada no se observa con el control negativo constituido por el antígeno no conjugado.

En la técnica se dispone ya de varios métodos de conjugación. Los grupos funcionales polisacárido que están normalmente implicados pueden ser los grupos amino, carboxilo o hidroxilo situados a lo largo de la cadena o grupos aldehído, bien sean terminales o a lo largo de la cadena. Los grupos funcionales polipéptido que están normalmente implicados pueden ser grupos amino o carboxilo, terminales o presentes en las cadenas laterales aminoácido o incluso grupos tiol.

De una manera general, los conjugados de polisacárido pueden mostrar tres tipos de estructura dependiendo de la localización de los grupos funcionales tanto del polisacárido (bien sea a lo largo de la cadena o en el extremo) como del portador, que están implicados en la unión. Estos tipos de estructura se denominan, para hacer más fácil su descripción, tipos "Sun" o "Ear", "Rake" y "Lattice". Se ilustran en la Figura 1, en la que (A), (B) y (C), respectivamente, representan los tipos "Sun" (neoglicoconjugado), "Rake" y "Lattice".

En el tipo "Sun", un polisacárido está unido a una proteína o un péptido por medio de un grupo reactivo situado exclusivamente en un extremo de la cadena de polisacárido. Usualmente esto implica un grupo carbonilo situado en el extremo reductor de la cadena de polisacárido. Varias cadenas de polisacárido pueden unirse a la proteína, implicando la unión normalmente un grupo amino portado, p. ej., por un resto de lisina. Tales conjugados se definen también como neoglicoconjugados. A título de ejemplo, se logra un conjugado de este tipo en Alonso de Velasco et al., Infect. Immun. (1995) 63 : 961, Paradiso et al., Vaccine Research (1993) 2 (4) : 239, y Jennings en la patente de EE.UU. nº 4.356.170.

En el tipo "Rake", los péptidos están unidos a lo largo de la cadena de polisacárido. Un ejemplo de este tipo se proporciona en Lett et al., Infect. Immun. (1994) 62 : 785, y más apropiadamente en Lett et al., Infect. Immun. (1995) 63 : 2645 y Konen-Waisman et al., J. Immunol. (1995) : 5977. La unión implica al grupo amino portado por el único resto de lisina interno a la secuencia del péptido y/o el grupo amino terminal.

En el tipo "Lattice", la proteína y el polisacárido están entrecruzados. Esto se hace posible debido al hecho de que se usa una proteína en vez de un péptido (usualmente grupos amino o ácido situados a lo largo de la proteína), y de que intervienen grupos reactivos localizados a lo largo de la cadena de polisacárido. Un conjugado de este tipo se describe en la patente de EE.UU. nº 4.673.574 de Anderson. Schneerson et al., J. Exp. Med. (1980) 152 : 361, describen también un método de conjugación que conduce a un tipo "Lattice". Utiliza CNBr y, como enlazador, dihidrazida de ácido adípico (ADH). Están implicados los grupos hidroxilo presentes a lo largo de la cadena de polisacárido y los grupos amino de la cadena lateral de la proteína.

Cada una de estas estructuras puede conseguirse de acuerdo con una diversidad de procedimientos de conjugación. La unión puede ser un enlace directo como en la patente de EE.UU. nº 4.673.574 de Anderson, la patente de EE.UU. nº 4.356.170 de Jennings, Lett et al. o Könen-Waisman et al. La unión puede también ser un enlace indirecto por cuanto se usa una molécula de enlazador, como se ilustra en Schneerson et al. Además de un enlazador, también puede usarse un espaciador como se describe en Alonso de Velasco et al. o en Paradiso et al. (para el polisacárido neumocócico). Pueden estar implicados varios grupos funcionales presentes en el polisacárido, la proteína, el enlazador y opcionalmente, el espaciador.

Algunas de las referencias de la técnica anterior citadas anteriormente se presentan con más detalle a continuación:

En Alonso de Velasco et al., el portador es un péptido de aproximadamente 20 restos de aminoácido, que comprende un único resto de cisteína en cualquiera de los extremos. El polisacárido 17F de Streptococcus pneumoniae es primero derivatizado en el extremo reductor por aminación reductora con diaminopropano en presencia de NaCNBH_{3}. Después el polisacárido derivatizado es bromoacetilado con N-succinimidil bromoacetato como enlazador y el polisacárido así activado se acopla con el grupo tiol del único resto de cisteína N- o C-terminal del péptido. Así se obtiene un conjugado de un solo terminal (conjugado single-ended).

En Lett et al. (1994), el polisacárido de S. mutans o Saccaromyces cerevisiae es primero oxidado con peryodato para crear grupos aldehído todo a lo largo de la cadena de polisacárido. Después el polisacárido oxidado se acopla directamente mediante aminación reductora con un péptido, en presencia de NaCNBH_{3}.

En Paradiso et al. se usan dos polisacáridos: un polisacárido neumocócico y el fosfato de polirribitol (PRP) de Haemophilus influenzae. Al realizar la hidrólisis ácida del polisacárido neumocócico, primero se crea un grupo aldosa en el extremo de la cadena de polisacárido. Después se adicionan grupos amino en el extremo de la cadena en la aminación reductora con diaminometano en presencia de piridina borano. El polisacárido derivatizado se activa con succinimidil diéster de ácido adípico y se acopla con grupos amino de proteína o péptido: Volviendo al PRP, éste es sometido en primer lugar a segmentación oxidante usando peryodato. Entonces se crean grupos aldehído en ambos extremos. Después el PRP oxidado se acopla con los grupos amino de la proteína y el péptido. En ambos casos, se crea una estructura "Sun".

En Könen-Waisman et al., el polisacárido VI y los péptidos (ninguno de los cuales contiene un resto de cisteína) o las proteínas se acoplan directamente en presencia de hidrocloruro de (3-dimetilaminopropil)-3-etil carbodiimida (EDAC): los grupos carboxilo del polisacárido y los grupos amino de la proteína o los péptidos están implicados en la conjugación. Como resultado, se crea una estructura "Lattice" cuando se usa la proteína. Cuando se usan péptidos, la estructura depende del número de restos de aminoácido que llevan grupos amino. Puede ser una estructura "Lattice" simple o una estructura "Rake".

Como se comprenderá fácilmente, cuando la conjugación implica grupos funcionales presentes a lo largo de toda la cadena de polisacárido, esto conduce a un conjugado entrecruzado si el portador es una proteína (varios grupos amino o carboxilo en la proteína están disponibles para la unión). Si el portador de polipéptido contiene un sitio de unión shingle (esta situación es muy frecuente cuando es suficientemente pequeño), su conjugado muestra una estructura "Rake" (que también puede conseguirse si el polipéptido contiene unos pocos sitios de unión y la conjugación se lleva a cabo bajo un control estrecho no fácil, de forma que reacciona un único grupo funcional en el polipéptido). Cuando el método de conjugación usa grupos carboxilo o amino de un polipéptido de origen natural (o un fragmento del mismo), este último deber ser más bien pequeño para que se consiga una estructura "Rake", ya que frecuentemente se encuentran grupos carboxilo o amino en los polipéptidos.

El documento EP 471 543 describe un procedimiento para preparar un conjugado de polisacárido en el que el polisacárido (polisacárido pneumo 6B) está acoplado tanto con un péptido cíclico (cPND9) como con un portador (OmpC). El conjugado polisacárido-péptido producido como producto intermedio es como sigue: PS-O-CO-NH-R-NH-CO-S-péptido.

El conjugado se usa para inducir una respuesta inmunitaria contra el péptido, usando un polisacárido como portador inmunógeno.

El documento EP 186 576 describe un procedimiento caracterizado porque tanto el polisacárido como el péptido son primero derivatizados entes de la conjugación, siendo introducido un grupo tiol reactivo en la cadena de la proteína.

Se ha encontrado ahora un nuevo método de conjugación que puede producir fácilmente una estructura "Rake", pero usando el grupo tiol de un resto de cisteína. Dado que los restos cisteína son menos frecuentes que la lisina y el ácido aspártico, este método es por consiguiente adecuado para conjugar péptidos mayores.

Como portador, los péptidos tienen ciertas ventajas sobre las proteínas ya que pueden ser purificados fácilmente cuando se producen biológicamente o son sintetizados, y por consiguiente son más puros y mejor definidos. Contrariamente a las proteínas portadoras que pueden tener también propiedades perjudiciales (toxicidad), los péptidos pueden derivarse de esas proteínas de forma que muestren solamente la propiedad de portador.

Sin embargo, los conjugados polisacárido-péptido conocidos en la técnica son menos inmunógenos que sus contrapartidas de polisacárido-proteína y en definitiva requieren la presencia de un coadyuvante. Sorprendentemente, el conjugado polisacárido-péptido preparado por el nuevo método tiene una buena inmunogenicidad. Una de las razones para ello estriba en el hecho de que el resto de péptido tiene un tamaño suficiente.

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La presente invención se refiere a un procedimiento para conjugar (i) un péptido que contiene al menos seis restos aminoácido, al menos uno de los cuales es un resto de cisteína, con (ii) un polisacárido que comprende al menos cuatro unidades repetitivas, comprendiendo dicho procedimiento:

A

(i) Activar el polisacárido con un enlazador bifuncional de fórmula R1-A-R2 en la que R1 es un grupo maleimidilo, A es una cadena carbonada aromática o alifática sustituida o no sustituida, y R2 es un grupo succinimidilo, de forma que R2 reacciona con los grupos amino del polisacárido y se obtiene un polisacárido activado; y

(ii) conjugar el polisacárido activado con el péptido, de forma que R1 reacciona con el grupo tiol del resto de cisteína y se obtiene un conjugado, en el que se introduce al azar una diversidad de entidades de péptido todo a lo largo de la cadena de polisacárido por unión covalente; o

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B

(i) Derivatizar el polisacárido con un espaciador de fórmula (II) R3-B-R4 en la que R3 es un grupo funcional capaz de reaccionar con grupos amino, carboxilo o hidroxilo, B es una cadena carbonada aromática o alifática y R4 es un grupo amino, de forma que R3 reacciona con los grupos amino, carboxilo o hidroxilo del polisacárido y se obtiene un polisacárido derivatizado, en el que se introduce al azar una diversidad de entidades de espaciador todo a lo largo de la cadena de polisacárido;

(ii) activar el polisacárido derivatizado con un enlazador bifuncional de fórmula R1-A-R2 en la que R1 es un grupo maleimidilo. A es una cadena carbonada aromática o alifática sustituida o no sustituida, y R2 es un grupo succinimidilo, de forma que R2 reacciona con R4 y se obtiene un polisacárido activado; y

(iii) conjugar con el péptido el polisacárido activado de forma que R1 reacciona con el grupo tiol del resto de cisteína del péptido y se obtiene un conjugado, en el que una diversidad de entidades de péptido se introduce al azar todo a lo largo de la cadena de polisacárido por unión covalente.

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La cadena A no debe ser ni demasiado corta (para evitar el impedimento estérico) ni demasiado larga (para evitar la interferencia con las partes inmunógenas). Así pues, la cadena A comprende de 1 a 12, preferentemente de 3 a 8 átomos de carbono y más preferentemente se elige entre alquileno C_{2} - C_{8}, fenileno, aralquileno C_{7} - C_{12}, alquilo C_{2} - C_{8}, fenilo, aralquilo C_{7} - C_{12}, alcanoiloxi C_{6} y bencilcarboniloxi, en donde los grupos alquilo, fenilo, alquileno y fenileno pueden estar sustituidos o no.

Como se expuso anteriormente en el presente texto, el polisacárido puede ser derivatizado con un espaciador antes de la conjugación. Así, el polisacárido puede hacerse reaccionar primeramente con un espaciador de fórmula (II) R3-B-R4, en la que R3 es un grupo funcional capaz de reaccionar con grupos amino, carboxilo o hidroxilo. B es una cadena aromática o alifática, y R4 es un grupo amino capaz de reaccionar con el grupo succinimidilo R2 del enlazador usado en la posterior etapa de conjugación.

La cadena B puede ser una cadena carbonada, preferentemente carbonilo, alquilo o alquileno C_{1} - C_{12}, o dicarbonilo.

Preferentemente, R3 es un grupo amino o un resto químico portador de un grupo amino, por ejemplo un grupo hidrazida, es decir, NH_{2}-NH-CO-.

Otro aspecto de la invención se refiere al conjugado producido por el anterior procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria contra el resto polisacárido del conjugado.

Dado que los grupos amino, hidroxilo o carboxilo nativos u originales se encuentran en las unidades repetitivas y por tanto están presentes todo a lo largo de la cadena de polisacárido, un conjugado de la invención mostrará típicamente una estructura rake como se describe anteriormente en el presente texto. En consecuencia, puede proporcionarse una definición alternativa y equivalente para el conjugado de la invención de la forma siguiente.

Dicho de otra forma, un conjugado de la invención comprende una cadena de polisacárido compuesta por unidades repetitivas y una diversidad de restos de péptido, conteniendo cada uno de los restos un resto de cisteína y estando unido covalentemente al azar a lo largo de la cadena de polisacárido, a través de un enlace indirecto que implica al grupo tiol del resto de cisteína y un grupo amino, hidroxilo o carboxilo del polisacárido, lográndose dicho enlace directo o indirecto a través de un enlazador o un resto espaciador-enlazador con la condición de que la entidad espaciadora del resto espaciador-enlazador esté unida al grupo amino, hidroxilo o carboxilo del polisacárido.

Por "péptido" se entiende una cadena de aminoácido que tiene al menos 6 restos de aminoácido, y ventajosamente no más de aproximadamente 200 restos de aminoácido, ventajosamente el péptido contiene al menos 10, preferentemente al menos aproximadamente 15, más preferentemente al menos aproximadamente 20 restos de aminoácido. Ventajosamente contiene como mucho aproximadamente 150, preferentemente como mucho aproximadamente 100, o como mucho aproximadamente 50 restos de aminoácido. Un péptido preferido contiene de aproximadamente 50 a 150 restos de aminoácido.

Para su uso en la presente invención, el péptido puede contener uno o varios restos de cisteína. Los restos de cisteína proporcionan la unión del enlazador con el péptido. El uso de un resto de cisteína para el acoplamiento mejora la selectividad del mismo, ya que la cantidad de restos de cisteína de un péptido es normalmente baja. El resto o los restos de cisteína pueden localizarse en cualquier extremo del péptido o ser internos respecto de la cadena del péptido, con la condición de que la unión en este sitio no interfiera con la estructura y las propiedades del péptido. Al margen de la cantidad de cisteína, se prefiere que un resto de cisteína esté situado en el extremo terminal N o C.

Más preferentemente, el péptido contiene dos restos de cisteína, estando cada uno de ellos localizado en un extremo, o un único resto de cisteína localizado en cualquiera de los extremos, siendo la más preferida esta última alternativa.

La secuencia completa de aminoácidos del péptido puede presentarse naturalmente como tal o como parte de un polipéptido más grande. También puede estar constituida por una secuencia natural que se prolonga en el extremo N- o C-terminal o ambos extremos por un resto adicional de cisteína.

Para su uso como portador en el conjugado para vacuna, el péptido contiene ventajosamente al menos un epítopo dependiente de las células T y por tanto permitirá el desarrollo de una respuesta inmunitaria protectora contra el polisacárido que es un antígeno T-dependiente, al tener lugar la administración del conjugado, p. ej. a un mamífero.

Para el uso en la presente invención, el péptido puede ser sintetizado químicamente o producido por medios recombinantes. Cualquiera de los métodos puede realizarse convencionalmente.

Un conjugado de la invención puede comprender un único péptido; en este caso los restos de péptido presentes todo a lo largo de la cadena de polisacárido son idénticos entre sí. También puede comprender varios péptidos, p. ej. que llevan diferentes epítopos. Sin embargo se prefiere un número limitado de péptidos: no más de 6 y, más preferentemente, 2 ó 3. Aunque un primer péptido lleva un epítopo T-dependiente, un segundo péptido puede llevar un epítopo B.

Los polisacáridos usados en los conjugados de la presente invención pueden ser de cualquier tipo. En una realización de la invención, los conjugados se preparan para vacunas y por consiguiente los polisacáridos apropiados incluyen polisacáridos capsulares, polisacáridos derivados de lipopolisacáridos (LPS o LOS) de la pared celular de bacterias gram-negativas, tales como la cadena lateral O-específica, y también polisacáridos de la pared celular de hongos. Por ejemplo, los polisacáridos pueden derivar de bacterias entre las que se incluyen Pseudomonas, tales como P. aeruginosa; Staphylococci, Streptococci, en particular S. pneumoniae, Klebsiellas, p. ej. K. pneumoniea, Salmonelas, p. ej. S. typhi y paratyphi, Escherichia coli K1, K100, 0157:H7, Neisseriae, p. ej. N. meningitidis, Shigellae, p. ej. S. dysenteriae, somnei y flexneri, Haemophilus, p. ej. H. influenzae tipo b, y de hongos tales como Candida, Cryptococcus neoformans, y Hansenula.

Los polisacáridos están compuestos de unidades repetitivas. Para su uso en los conjugados de la invención, un polisacárido comprende al menos 4 unidades repetitivas, preferentemente hasta 3.000. Especialmente para su uso como ingrediente de una vacuna, un polisacárido se compone preferentemente de 4 a 1.000 unidades repetitivas, más preferentemente de 7 a 700 unidades repetitivas, lo más preferentemente de 50 a 200 unidades repetitivas.

Una unidad repetitiva es característica de un polisacárido dado, y por tanto la composición y el peso molecular de la unidad repetitiva varía en gran medida de unos polisacáridos a otros. Por ejemplo, mientras que la unidad repetitiva de la mayor parte de los polisacáridos capsulares comprende grupos hidroxilo y carboxilo, algunos de ellos contienen grupos amino (p. ej. Streptococcus pneunomiae serotipo 1), y otros no (p. ej. Streptococus pneunomiae serotipo 14); algunos de ellos contienen N-acetilo (p. ej. Streptococcus pneunomiae serotipo 14), y otros no (p. ej. Streptococcus pneumoniae serotipo 6B). También a título de ejemplo, el peso molecular de los polisacáridos capsulares de Streptococcus pneunomiae tipos 3 y 4 es respectivamente 360 y 847. Así, no hay una correspondencia general entre la cantidad de unidades repetitivas y el peso molecular del polisacárido que pueda ser aplicada globalmente, al margen de la composición del polisacárido. Sin embargo, se puede indicar independientemente que un polisacárido para ser usado en la presente invención tienen un peso molecular preferido en el intervalo medio de 10.000 a 500.000. El peso molecular de un polisacárido se expresa siempre como valor medio, ya que un polisacárido está constituido por una población de moléculas de un tamaño heterogéneo.

Los polisacáridos pueden ser sintetizados químicamente o bien purificados a partir de una fuente natural, si no existen, de acuerdo con métodos convencionales. Por ejemplo, en el caso de polisacáridos bacterianos o fúngicos, estos últimos pueden ser extraídos de los microorganismos y tratados para eliminar los restos tóxicos, si es necesario. Un método particularmente útil se describe en Gotschlich et al., J. Exp. Med. (1969) 129 : 1349.

Los polisacáridos pueden usarse tal como se sintetizan o pueden purificarse. También pueden ser despolimerizados antes de ser usados. En realidad, los polisacáridos capsulares nativos suelen tener un peso molecular superior a 500.000. Cuando se prefiere usar polisacáridos capsulares de peso molecular más bajo, p. ej. 10.000 a 20.000 por término medio, los polisacáridos tal como se purifican pueden ser sometidos a fragmentación. Con este fin, se dispone de métodos convencionales; p. ej. el documento WO 93/7178 describe un método de fragmentación por oxidación reductora.

Los grupos hidroxilo, carboxilo o amino del polisacárido, que están implicados en la unión, pueden ser grupos funcionales nativos. Alternativamente, pueden haber sido introducidos artificialmente mediante un tratamiento específico.

Los grupos amino pueden haber sido creados en la hidrólisis ácida o básica controlada de grupos N-acilo nativos, p. ej. grupos V-acetilo.

Los grupos funcionales amino pueden también haber sido introducidos en la derivatización con un resto espaciador unido a los grupos amino, hidroxilo o carboxilo nativos, siendo preferidos con este fin los dos últimos. Típicamente, el espaciador es una molécula bifuncional que es estable para reaccionar en un extremo con los grupos hidroxilo, carboxilo o amino nativos del polisacárido y en el otro extremo del enlazador. Así pues el espaciador proporciona un grupo amino funcional.

Los compuestos que se van a usar como espaciadores o enlazadores se definen más adelante con más detalle en el presente texto. Sin embargo, se señala ahora que el enlazador es una molécula bifuncional que tiene una longitud apropiada para que los restos de péptido y polisacárido no interfieran entre sí, p. ej. cuando se presentan al sistema inmunitario. El resto enlazador se enlaza ventajosamente con el resto de cisteína del péptido a través de un enlace tioéter con los grupos hidroxilo del polisacárido a través de un enlace éter o éster, con los grupos amino a través de un enlace amida o carbamato, con los grupos carboxilo a través de un enlace éster, amida o carbamato.

La naturaleza e intensidad de la respuesta inmunitaria que puede ser provocada por un conjugado para vacuna de la invención puede verse influenciada en gran medida por la relación péptido : polisacárido. Es esencial que los epítopos B presentes en el polisacárido y los epítopos T-dependientes portados por el péptido estén disponibles y sean presentados correctamente al sistema inmunitario. Así pues, ambos tipos de epítopos deben estar presentes en una cantidad suficiente y equilibrada para evitar, por ejemplo, el impedimento estérico de los epítopos del polisacárido por los restos de péptido. Con el fin de optimizar la respuesta inmunitaria, se indica que es adecuada una relación de 1 mol de péptido por 1 a 50 moles de unidades repetitivas. Preferentemente, esta relación es de 1 mol de péptido por 3 a 30 moles de unidades repetitivas; más preferentemente, esta relación es de 1 mol de péptido por 5 a 20 moles de unidades repetitivas.

Los conjugados de la invención son útiles en particular en el campo de las vacunas para desencadenar una respuesta inmunitaria protectora a largo plazo contra un microorganismo patógeno del que se deriva el polisacárido inmunógeno.

Por consiguiente, la invención proporciona también una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva de un conjugado de la invención junto con un diluyente o vehículo aceptable farmacéuticamente. Tal composición puede prepararse convencionalmente. También puede contener otros ingredientes tales como un coadyuvante, p ej. un compuesto de aluminio. Los compuestos de aluminio adecuados incluyen hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio. En una realización preferida, no es necesario usar un coadyuvante para mejorar la inmunogenicidad de un conjugado de la invención. Una composición de acuerdo con la invención puede ser administrada por cualquier vía convencional que se use en el campo de las vacunas. La elección de la vía de administración depende de varios parámetros tales como el coadyuvante utilizado.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para conjugar un péptido que tiene al menos seis restos de aminoácido, al menos uno de los cuales es un resto de cisteína, con una cadena de polisacárido, entre otros, una cadena de polisacárido inmunógeno, que comprende al menos cuatro unidades repetitivas, el cual procedimiento comprende acoplar el péptido a un enlazador a través del grupo tiol del resto de cisteína y acoplar el polisacárido con dicho enlazador a través de (a) los grupos amino, hidroxilo o carboxilo nativos de la cadena de polisacárido o (b) los grupos amino creados en la hidrólisis de los grupos N-acilo nativos de la cadena de polisacárido o (c) los grupos funcionales introducidos en la cadena de polisacárido en la derivatización con un resto espaciador unido a los grupos amino, hidroxilo o carboxilo nativos de la cadena de polisacárido.

Un procedimiento preferido es hacer reaccionar en primer lugar el enlazador con el polisacárido o un polisacárido derivatizado que proporciona un polisacárido activado, esto es, un polisacárido que porta la molécula de enlazador proporcionando un grupo funcional para el acoplamiento del péptido. En una segunda etapa, este polisacárido activado se hace reaccionar con el péptido, en donde el grupo funcional del enlazador, es decir R1, reacciona con el grupo tiol de un resto de cisteína del péptido.

Un procedimiento ventajoso de acuerdo con la invención comprende hacer reaccionar el polisacárido con un enlazador bifuncional bajo condiciones que permitan la introducción de restos de enlazador en el polisacárido en una cantidad suficiente para que en la etapa (ii) del procedimiento se produzca un conjugado que contiene un mol de péptido por 1 a 50 moles de unidades repetitivas, preferentemente un mol de péptido por 3 a 30 moles de unidades repetitivas, más preferentemente un mol de péptido por 5 a 20 moles de unidades repetitivas. De una manera similar, el procedimiento alternativo comprende hacer reaccionar el polisacárido con un péptido activado bajo condiciones que permitan la introducción de restos de péptido activado en el polisacárido en cantidad suficiente para que en la etapa (iv) del procedimiento se produzca un conjugado que tiene las características citadas anteriormente.

Los compuestos que son útiles como enlazador incluyen succinimidil-4-(N-maleiimidometil)ciclohexan-1-carboxilato, N-succinimidil-4-(4-maleiimidofenil)butirato, N-succinimidil-4-maleiimido-butirato, N-succinimidil-3-maleiimido-benzoato.

Los compuestos útiles como espaciador en la presente invención incluyen cisteamina, cisteína, diaminas p. ej. diaminohexano, dihidrazida del ácido adípico (ADH), urea, semicarbazida, y cistamina.

Cuando se usa como espaciador cisteamina o cisteína, se introducen grupos tiol en el polisacárido. En este caso, los enlazadores útiles a usar en combinación incluyen por ejemplo compuestos bis maleimidilo tales como bis maleimido hexano.

Para obtener un conjugado que muestre una relación de péptido: polisacárido apropiada como se describió anteriormente en el presente texto, forma parte de los conocimientos normales de un experto en la técnica ensayar y ajustar las condiciones de reacción, p. ej. la concentración de los reactivos implicados en las etapas de derivatización y/o activación. Se ofrecen otras guías de la forma que sigue:

Cuando se hacen reaccionar grupos amino del polisacárido, la reacción se realiza preferentemente en presencia de un compuesto carbodiimida, p. ej. (3-dimetilaminopropil)-3-etil carbodiimida hidrocloruro (EDAC) a un pH de 4 a 7, siempre y cuando el grupo funcional del enlazador o el espaciador que está implicado en la reacción sea carboxilo.

Cuando se hacen reaccionar grupos carboxilo del polisacárido, la reacción se realiza preferentemente en presencia de un compuesto carbodiimida como anteriormente, siempre y cuando el grupo funcional del enlazador o el espaciador que está implicado en la reacción sea un grupo amino.

La relación molar de unidades repetitivas de polisacárido: carbodiimida está ventajosamente en el intervalo de 0,1 a 2, preferentemente en el intervalo de 0,1 a 1, más preferentemente en el intervalo de 0,2 a 0,6. Como es fácil de entender, ajustando esta relación puede controlarse la cantidad de restos de péptido por unidades repetitivas.

Cuando se hacen reaccionar grupos amino del polisacárido con succinimidilo, la reacción se realiza ventajosamente a un pH de 6 a 9, preferentemente aproximadamente 7,5. Cuando se usan unas condiciones experimentales apropiadas (p. ej., exceso de enlazador), la reacción es casi inmediata, es decir, dentro de aproximadamente 5 min. Si el polisacárido usado en la reacción es un polisacárido nativo que lleva grupos amino, la única posibilidad de controlar la cantidad de sustitución por grupos succinimidilo es usar condiciones experimentales adversas (de otra forma la reacción ocurre inmediatamente y se sustituyen todos los grupos amino), tales como aumentar la dilución del medio de reacción o utilizar una baja cantidad de enlazador. Esto permite ajustar la relación de péptido a unidad repetitiva en el intervalo apropiado. Si se usa hidrólisis o derivatización para introducir grupos amino en el polisacárido, esta relación puede ser controlada fácilmente controlando la aparición de grupos amino en el polisacárido.

Cuando se hacen reaccionar grupos hidroxilo del polisacárido, la reacción se realiza preferentemente en presencia de un compuesto de cianógeno; a un pH de 8 a 12, si este compuesto es bromuro de cianógeno, o a un pH de 6 a 10, preferentemente de 6 a 8, si el compuesto es tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetil aminopiridinio. La relación molar de unidades repetitivas de polisacárido: compuesto de cianógeno está ventajosamente en el intervalo de 0,1 a 3, preferentemente en el intervalo de 0,1 a 2.

Llevando a cabo el método de la invención, se obtiene un conjugado en el que los restos de polisacárido y péptido se unen a través de un enlazador o una combinación de espaciador y enlazador, en donde el enlazador o el resto enlazador/espaciador tienen una longitud óptima y en donde el enlace polisacárido-péptido es estable. Además, se obtiene un conjugado en el que la relación de péptido a unidades repetitivas de polisacárido es óptima para el propósito de la inmunización.

La invención se ilustra con más detalle de la forma siguiente:

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Ejemplo 1

Preparación de un péptido 105mero sintético que tiene la secuencia siguiente

100

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El péptido fue sintetizado usando química FastMoc con un sintetizador de péptidos automático (modelo 431A, Applied Biosystems). La fase sólida era una resina Rink (0,13 mM TentaGel S RAM Spezial, 0,15 mM g-1, Rapp Polymer, Tübingen, Alemania) que da un péptido rematado con amida C-terminal. La síntesis usa aminoácidos protegidos con Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonilo) con protección lateral de O-t-butilo- (para grupos carboxilo o hidroxilo de ácido aspártico, ácido glutámico, serina, treonina y tirosina); tritilo- (para el grupo amino o imino de histidina, asparagina y glutamina)butiloxicarbonilo- (para el amino grupo de lisina); o PMC (pentametilcroman-6-sulfonilo) (para el grupo imino de arginina).

La activación y el acoplamiento se realizaron en presencia de hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-3, 3, 3-tetrametiluronio (HBTU)/diisopropiletilamina. En los ciclos 1-2, 4, 10-13, 17, 27, 32, 49, 59, 66, 75-78, 84-85, 88, 96-97 y 104-105, se llevó a cabo un doble acoplamiento y los grupos amino libres fueron bloqueados por acetilación con anhídrido acético. Después del último ciclo, el péptido fue desprotegido con piperidina y el producto final fue acetilado N-terminalmente usando anhídrido acético.

La desprotección de la cadena lateral y la segmentación del soporte de resina se llevaron a cabo con 2,1% (v/v) de 1,2-etanoditiol, 4,2% (v/v) de tioanisol, 4,2% (v/v) de agua, 6,2% de fenol (v/v) y 83% (v/v) de ácido trifluoroacético (TFA) durante 3 horas a temperatura ambiente. La resina se eliminó por filtración y se añadió gota a gota trietilsilano hasta que la solución era incolora. La solución se incubó después durante 3 horas a temperatura ambiente. Se recuperaron 360 mg de péptido crudo después de la precipitación con t-butilmetiléter seguida por centrifugación y liofilización. Se disolvieron 130 mg del péptido crudo en 40 ml de etilmorfolina 50 mM, pH 8,3, que contiene ditiotreitol 50 mM y se incubó durante la noche a temperatura ambiente. El pH se ajustó en 3,5 con TFA al 10% y el péptido se purificó mediante HPLC en fase inversa (Pep-S, C2/C18, 100 \ring{A} de tamaño de poro, 12 Pm 22,5 mm x 25 cm, Pharmacia) usando un gradiente (25 a 45% (v/v) de acetonitrilo, TFA al 0,1% (10 ml min^{-1}, gradiente de 0,33% min^{-1}. El péptido eluyó como un pico a aproximadamente 25% de acetonitrilo, y el pico fue liofilizado (73 mg) antes de seguir usándolo. Un análisis mediante HPLC y espectrometría de masas indicó que más del 65% del producto final correspondía a la secuencia deseada. La secuencia N-terminal fue confirmada mediante secuenciación de Edman N-terminal de la muestra retirada antes de la acetilación N-terminal.

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Ejemplo 2

Conjugado polisacárido de N. meningitidis serogrupo C - péptido

Un polvo seco de polisacárido capsular procedente de Neisseria meningitidis serogrupo C, que en adelante se denomina polisacárido C, fue obtenido mediante un procedimiento de extracción como se describe en Gotschlich et al., J. Exp. Med. (1969) 129 : 1349. Se disolvieron cien mg de polisacárido C en NaCl 0,2 M hasta una concentración final de 11,1 mg/ml (solución A). Al mismo tiempo, se preparó una solución de dihidrazida de ácido adípico 0,2 M (ADH) en NaCl 0,2 M (solución B). Se preparó también una solución 0,5 M de etil dimetil aminopropil carbodiimida (EDAC) en NaCl 0,2 M (solución C). Se mezclaron nueve ml de solución A, 10 ml de solución B y 1 ml de solución C para dar un preparado que contiene 5 mg/ml de polisacárido C, 0,125 M ADH y 0,025 M EDAC. Se añadió HCl 0,1 M para ajustar el pH en 6,5; este pH se mantuvo durante todo el periodo de reacción de 45 minutos. La temperatura era aproximadamente 20ºC.

La reacción se paró mediante 40 \mul de NaOH 0,1 N que subieron el pH a 7,1. La mezcla de reacción se dializó frente a NaCl 0,5 M, fosfato 10 mM y después agua, y a continuación se liofilizó.

El tamaño del polisacárido C derivatizado fue controlado en una columna de HPLC de exclusión TSK 4000 (fabricante Tosohaas). Los resultados demostraron que no había tenido lugar despolimerización en el curso de la derivatización.

Durante la derivatización, aproximadamente el 3,4% de unidades repetitivas fueron derivatizadas con un grupo NH_{2}.

El producto liofilizado se disolvió en tampón de fosfato 0,02 M, pH 7, a una concentración de 6,25 mg/ml, y se desgasificó. Se disolvió éster de N-(\gamma-maleimidobutiriloxi)succinimida (GBMS) en dimetilsulfóxido (DMSO) bajo nitrógeno a una concentración de 25 mg/ml, y después se añadió al polisacárido C derivatizado en igual cantidad. La mezcla de reacción se agitó durante 90 minutos a temperatura ambiente bajo nitrógeno. El polisacárido C activado se purificó mediante cromatografía en columna de exclusion de Sephadex G50. La fracción excluida fue recuperada y concentrada a aproximadamente 7,5 mg/ml mediante ultrafiltración (membrana 30K Amicon). La solución concentrada se degasificó.

Se disolvieron en agua veinte mg del péptido obtenido en el Ejemplo 1 a una concentración de 10 mg/ml bajo nitrógeno. Se añadieron 1,5 ml de la solución de péptido a 1,2 ml del preparado que contiene el polisacárido C activado, de manera que la relación (restos maleiimido)/(restos tiol) fuese 2. Las mezclas de reacción se mantuvieron durante la noche bajo agitación a temperatura ambiente. Después los restos maleiimido no reaccionados fueron inactivados añadiendo 0,010 ml de mercaptoetanol.

El producto conjugado se purificó en una columna de Sepharose 4BCL. Las fracciones eluidas fueron ensayadas en cuanto a la presencia de sacáridos (ácido siálico) y péptidos. Las fracciones que responden positivamente en los dos ensayos fueron agrupadas.

La cantidad de restos de ácido siálico fue determinada de acuerdo con el método de dosificación descrito en Svennerholm L., Biochem. Biophys. Acta (1957) 24 : 604, y la cantidad de péptido fue determinada de acuerdo con el método de Lowry et al., J. Biol. Chem. (1951) 193 : 265. Se mostró que la relación (péptido)/(unidades repetitivas de polisacárido C) mol/mol era 1:18 (correspondiente a una relación peso/peso de 1,8:1).

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Ejemplo 3

Conjugado polisacárido de S. pneumoniae - péptido

Un polvo seco de polisacárido capsular procedente de Streptococcus pneumoniae tipo 4, que se denomina en adelante polisacárido Pneumo 4, se obtiene mediante un procedimiento de extracción como se describe en la solicitud de patente WO 82/01995 "Procédé de purificación de polyosides de Streptococcus pneumoniae et vaccins à base de polyosides ainsi purifiés" (Procedimiento de purificación de poliósidos de Streptococcus pneumoniae y vacunas a base de los poliósidos así purificados). Se disolvieron cien mg de polisacárido Pneumo 4 en NaCl 0,2 M hasta una concentración final de 11,1 mg/ml (solución A). Al mismo tiempo, se preparó una solución de dihidrazida del ácido adípico (ADH) en NaCl 0,2 M en una concentración de 0,25 M (solución B). También se preparó una solución de etil dimetil aminopropil carbodiimida (EDAC) en 0,2 M NaCl a una concentración de 0,5 M (solución C). Se mezclaron nueve ml de solución A, 10 ml de solución B y 1 ml de solución C para dar un preparado que contiene 5 mg/ml de polisacárido Pneumo 4, ADH 0,125 M y EDAC 0,025 M. Se añadió HCl 1 N a pH 4,9; este pH se mantuvo durante todo el periodo de reacción de 30 minutos. La temperatura era aproximadamente 25ºC.

La reacción se paró mediante 0,28 ml de NaOH 1 N. El pH fue aumentado a 7,5. La mezcla de reacción se dializó frente a NaCl 0,5 M y después agua, y a continuación se liofilizó.

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El tamaño del polisacárido Pneumo 4 derivatizado fue controlado en una columna de HLPC de exclusión TSK 4000 (fabricante Tosohaas). No tuvo lugar despolimerización en el curso de la derivatización.

Durante la derivatización, aproximadamente el 8,2% de unidades repetitivas del polisacárido Pneumo 4 fueron derivatizadas con un grupo -NH2.

El producto liofilizado se disolvió en NaCl 0,05 M a una concentración de 2,76 mg/ml y se desgasificó. Se disolvió éster N-(\gamma-maleimidobutiriloxi)succinimida (GBMS) en dimetilsulfóxido (DMSO) bajo nitrógeno a una concentración de 25 mg/ml. Se añadieron 1,75 ml de la solución de GMBS a 16 ml de la solución de polisacárido bajo nitrógeno. La mezcla de reacción se dejó agitando durante 5 horas a temperatura ambiente bajo nitrógeno. El polisacárido Pneumo 4 activado fue purificado en una columna de exclusión Sephadex G50. La fracción excluida se recuperó y se concentró a aproximadamente 7 mg/ml sobre una membrana 30K (Amicon). La solución concentrada fue desgasifi-
cada.

Se disolvieron 20 mg de péptido como se obtiene en el Ejemplo 1, en NaCl 0,1 M, tampón de fosfato 0,01 M, pH 7,5, a una concentración de 4,6 mg/ml, bajo nitrógeno. Por una parte, se añadieron 2,2 ml de la solución de péptido a 1,25 ml del preparado que contiene el polisacárido Pneumo 4 activado, de forma que la relación (restos maleiimidilo)/(grupos tiol) fuese igual a 1 (conjugado Pneumo 4-péptido-1). Las mezclas de reacción se mantuvieron 6 horas bajo agitación a temperatura ambiente bajo nitrógeno, y después durante la noche a +4ºC. Luego, los restos maleiimidilo no reaccionados fueron inactivados mediante la adición de 0,005 ml de mercaptoetanol a cada mezcla de reacción.

Los conjugados fueron purificados en una columna de Sepharose 4BCL. Las fracciones eluidas fueron analizadas en cuanto a la presencia de azúcares y péptidos. Las fracciones que responden positivamente en ambos ensayos fueron agrupadas.

La cantidad de azúcar se determinó de acuerdo con el método de dosificación que se describe en Dubois et al., Anal. Chem. (1956) 3 : 350, y la cantidad de péptido se determinó de acuerdo con el método de Lowry et al., J. Biol. Chem. (1951) 193 : 265. La relación (unidades repetitivas de (péptido/polisacárido) mol/mol es 1:30 para el conjugado Pn 4-péptido-1 (correspondiente a una relación p/p de 0,4:1).

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Ejemplo 4

Conjugado de polisacárido de N. meningitidis serogrupo A - péptido

Un polvo seco de polisacárido capsular procedente de Neisseria meningitidis serogrupo A, denominado en adelante polisacárido A en el texto que sigue, se obtiene por un procedimiento de extracción como se describe en Gottschlich et al., J. Exp. Med. (1969) 129 : 1349. Se disolvieron en agua 100 mg de polisacárido A hasta una concentración final de 5 mg/ml (solución A). Al mismo tiempo, se preparó una solución de bromuro de cianógeno (CNBr) en agua a una concentración de 67 mg/ml (solución B). También se preparó una solución de dihidrazida del ácido adípico (ADH) en NaHCO_{3} 0,5 M, a una concentración de 150 mg/ml (solución C). Se mezclaron veinte mg de solución A y 0,75 ml de solución C para dar un preparado con una relación polisacárido/CNBr p/p que asciende a 1. Se añadió NaOH 0,1 N hasta un pH de 10,8; este pH se mantuvo durante todo el periodo de reacción de 60 minutes. La temperatura era aproximadamente 20ºC.

Después se bajó el pH a 8,5 mediante la adición de 0,15 ml de HCl 0,1 N. 1. Se añadieron 17 ml de solución C de forma que la relación ADH/polisacárido p/p fuese 3,5. El pH se mantuvo durante 15 minutos. Después la mezcla de reacción se dejó agitando durante la noche a +4ºC. Se añadieron 0,1 ml de HCl 1 N para reducir el pH a 7. La mezcla de reacción se dializó frente a NaCl 0,5 M y luego agua, y a continuación se liofilizó.

El tamaño del polisacárido A derivatizado fue controlado en una columna de HLPC de exclusión TSK 4000 (fabricante Tosohaas). No tuvo lugar despolimerización en el curso de la derivatización.

Durante la derivatización, aproximadamente el 2,5% de unidades repetitivas de polisacárido A fueron derivatizadas con un grupo -NH_{2}.

Después se usó el procedimiento del Ejemplo 2 para activar el polisacárido A derivatizado y para conjugar el polisacárido A activado con el péptido como se obtiene en el Ejemplo 1.

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Ejemplo 5

Estudios de inmunogenicidad con el conjugado de N. meningitidis serogrupo C como se obtiene en el Ejemplo 2

La utilidad del péptido del Ejemplo 1 como portador en un conjugado de polisacárido se demuestra de la forma que sigue.

Ratones NMRI de seis semanas de edad recibieron a través de la vía subcutánea una de las siguientes composiciones en un volumen de 0,5 ml (cada inyección) y a través de la vía intraperitoneal, en caso de usarse un cosdyuvante:

a) 5 \mug de polisacárido C (sin péptido) en los días 1, 15 y 29, en ausencia de coadyuvante;

b) 5 \mug de polisacárido C (sin péptido) junto con coadyuvante de Freund completo en el día 1, y en los días 15 y 29 junto con coadyuvante de Freund incompleto;

c) 5 \mug de polisacárido C y 9 \mug de péptido junto con coadyuvante de Freund completo el día 1, y en los días 15 y 29 junto con coadyuvante de Freund incompleto;

d) el conjugado obtenido en el Ejemplo 2 que contiene 1 \mug de polisacárido C y 1,8 \mug de péptido en los días 1, 15 y 29 en ausencia de coadyuvante;

(e) el conjugado obtenido en el Ejemplo 2 que contiene 5 \mug de polisacárido C y 9 \mug de péptido en los días 1, 15 y 29 en ausencia de coadyuvante;

(f) el conjugado obtenido en el Ejemplo 2 que contiene 5 \mug de polisacárido C y 9 \mug de péptido junto con coadyuvante de Freund completo en el día 1, y en los días 15 y 29 el conjugado obtenido en el Ejemplo 2 junto con coadyuvante de Freund incompleto; y

g) un conjugado de 5 \mug de polisacárido C junto con anatoxina diftérica (DT).

En los días 15, 29 y 43 (calculados a partir del día de la primera inmunización), se toma una muestra de sangre y se valoran mediante un ELISA los anticuerpos antipolisacárido C. Los resultados se resumen en la tabla siguiente.

TABLA 1

1

La respuesta del anticuerpo al polisacárido C no conjugado es extremadamente débil en cada caso y no aumenta a lo largo del tiempo, mientras que la respuesta al polisacárido C conjugado bien sea con la DT o bien con el péptido es satisfactoria. Con el conjugado de la presente invención se obtiene un efecto booster o de refuerzo después de la segunda inyección, lo que es una indicación de una respuesta inmunitaria persistente. La respuesta del conjugado de polisacárido C - péptido es equivalente a la respuesta obtenida con el conjugado de polisacárido C - DT.

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Ejemplo 6

Estudios de inmunogenicidad con el conjugado de S. pneumoniae como se obtiene en el Ejemplo 3

El conjugado preparado en el Ejemplo 3 con una relación (p/p) de péptido a polisacárido de 0,4 : 1 (correspondiente a una relación de péptido por unidades repetitivas de 1 : 30 (mol/mol)) fue ensayado en ratones usando el protocolo del Ejemplo 5. Fue inmunógeno en ratones en presencia de coadyuvante y tuvo por resultado un efecto de refuerzo después de la segunda inyección. Los resultados pueden verse a continuación en la Tabla 2.

TABLA 2

2

Claims

1. Un procedimiento para conjugar (i) un péptido que contiene al menos seis restos de aminoácido, al menos uno de los cuales es un resto de cisteína, con (ii) un polisacárido que comprende al menos cuatro unidades repetitivas, comprendiendo dicho procedimiento:

A

(i) Activar el polisacárido con un enlazador bifuncional de fórmula (I) R1-A-R2 en la que R1 es un grupo maleimidilo, A es una cadena carbonada aromática o alifática sustituida o no sustituida, y R2 es un grupo succinimidilo, de forma que R2 reacciona con los grupos amino del polisacárido y se obtiene un polisacárido activado; y

(ii) conjugar con el péptido el polisacárido activado, de forma que R1 reacciona con el grupo tiol del resto de cisteína y se obtiene un conjugado, en el que se introduce al azar una diversidad de entidades de péptido todo a lo largo de la cadena de polisacárido por unión covalente; o

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B

(ii) activar el polisacárido derivatizado con un enlazador bifuncional de fórmula (I) R1-A-R2 en la que R1 es un grupo maleimidilo, A es una cadena carbonada aromática o alifática sustituida o no sustituida, y R2 es un grupo succinimidilo, de forma que R2 reacciona con R4 y se obtiene un polisacárido activado; y

(iii) conjugar con el péptido el polisacárido activado de forma que R1 reacciona con el grupo tiol del resto de cisteína del péptido y se obtiene un conjugado, en el que una diversidad de entidades de péptido se introduce al azar todo a lo largo de la cadena de polisacárido, por unión covalente.

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2. Un procedimiento según la reivindicación 1ª, en el que el péptido contiene de seis a doscientos restos de aminoácido, incluyendo el resto de cisteína.

3. Un procedimiento según la reivindicación 2ª, en el que el péptido contiene de quince a cien restos de aminoácido, incluyendo el resto de cisteína.

4. Un procedimiento según la reivindicación 3ª, en el que el péptido contiene de veinte a cincuenta restos de aminoácido, incluyendo el resto de cisteína.

5. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 4ª, en el que el resto de cisteína está situado en el extremo N- o C-terminal del péptido.

6. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 5ª, en el que el péptido contiene un epítopo T-dependiente.

7. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 6ª, en el que el polisacárido es un polisacárido nativo elegido entre la cadena O-específica de lipopolisacáridos bacterianos, lipopolisacáridos bacterianos destoxificados, y polisacáridos capsulares.

8. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 7ª, en el que el polisacárido se deriva de un polisacárido nativo que comprende grupos N-acetilo, por hidrólisis ácida o básica controlada.

9. Un procedimiento según la reivindicación 7ª o 8ª, en el que el polisacárido se deriva de un polisacárido nativo elegido entre un polisacárido capsular.

10. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 9ª, en el que el polisacárido se compone de 4 a 3000 unidades repetitivas.

11. Un procedimiento según la reivindicación 10ª, en el que el polisacárido se compone de 4 a 1000 unidades repetitivas.

12. Un procedimiento según la reivindicación 11ª, en el que el polisacárido se compone de 7 a 700 unidades repetitivas.

13. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 12ª, en el que el enlazador de fórmula (I) se elige entre el grupo consistente en succinimidil-4-(N-maleiimidometil)ciclohexan-1-carboxilato, N-succinimidil-4-(4-maleiimidofenil)butirato, N-succinimidil-4-maleiimido-butirato, N-succinimidil-3-maleiimido-benzoato y éster N-(g-maleimidobutiriloxi)succinimida (GMBS).

14. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 13ª, en el que el espaciador de fórmula (II) es dihidrazida de ácido adípico (ADH).

15. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 14ª, en el que la conjugación se realiza de forma que el conjugado obtenido de la misma contiene de un mol de péptido por cada cincuenta moles de unidades repetitivas (1 : 50) a un mol de péptido por cada mol de unidades repetitivas (1 : 1).

16. Un procedimiento según la reivindicación 15ª, en el que la conjugación se realiza de forma que el conjugado obtenido de la misma contiene de un mol de péptido por cada treinta moles de unidades repetitivas (1 : 30) a un mol de péptido por cada tres moles de unidades repetitivas (1 : 3).

17. Un procedimiento según la reivindicación 16ª, en el que la conjugación se realiza de forma que el conjugado obtenido de la misma contiene de un mol de péptido por cada veinte moles de unidades repetitivas (1 : 20) a un mol de péptido por cada cinco moles de unidades repetitivas (1 : 5).

18. Una composición farmacéutica que comprende un conjugado producido por el procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 17ª, junto con un diluyente o vehículo aceptable farmacéuticamente.

19. Una composición según la reivindicación 18ª, que no comprende ningún coadyuvante.

20. Un conjugado producido por el procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 17ª, para inducir una respuesta inmunitaria contra el resto de polisacárido del conjugado.