ES2325528T3 - Conjugado de polisacarido/polipeptido. - Google Patents

Conjugado de polisacarido/polipeptido. Download PDF

Info

Publication number
ES2325528T3
ES2325528T3 ES01914811T ES01914811T ES2325528T3 ES 2325528 T3 ES2325528 T3 ES 2325528T3 ES 01914811 T ES01914811 T ES 01914811T ES 01914811 T ES01914811 T ES 01914811T ES 2325528 T3 ES2325528 T3 ES 2325528T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
polypeptide
polysaccharide
conjugate
antibody
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES01914811T
Other languages
English (en)
Inventor
Hans Loibner
Helmut Eckert
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Application granted granted Critical
Publication of ES2325528T3 publication Critical patent/ES2325528T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)

Abstract

Procedimiento para la preparación de un conjugado de polisacárido/polipéptido por reacción de un polisacárido con un polipéptido que contiene por lo menos un grupo amino libre, caracterizado porque un portador de polisacárido que presenta grupos hidroxi vicinales se oxida parcialmente, preferentemente por lo menos en un 20%, con una cantidad del oxidante de menos de la estequiométrica con la abertura de anillo para crear grupos aldehído vicinales y el producto obtenido se hace reaccionar con uno o varios polipéptido(s) antígenos lábiles a bases que contienen por lo menos un grupo amino libre, uniendo el o los polipéptido(s) directamente al portador de polisacárido a través de un enlace de azometina.

Description

Conjugado de polisacárido/polipéptido.
La presente invención se refiere a una nueva utilización de polisacáridos oxidados como material de soporte para los componentes de vacunas, en particular a un procedimiento para la preparación de un conjugado de polisacárido/polipéptido por reacción de un polisacárido con un polipéptido que contiene por lo menos un grupo amino libre así como a la utilización de un conjugado de este tipo como vacuna.
Las vacunas están caracterizadas porque uno o más antígenos se administran en una formulación inmunógena en pequeñas cantidades, por lo general por vía parenteral (subcutánea o intramuscular), con el fin de disparar una respuesta inmune fuerte y protectora. La mayoría de las vacunas se preparan en la actualidad como protección contra las infecciones microbianas. Los antígenos utilizados constituyen en estos casos microorganismos desactivados y modificados, o partes de los mismos, o proteínas definidas constituidas por microorganismos de este tipo, que son aptas para disparar una respuesta inmune contra el microorganismo en cuestión.
Desde hace años, se está investigando también la eficacia de muchas vacunas experimentales contra otras enfermedades. Entre éstas, se incluyen asimismo vacunas contra el cáncer. Su objetivo es activar selectivamente el sistema inmune de los pacientes de cáncer para combatir células malignas. Esto se intenta por medio de una amplia gama de planteamientos. Ente los mismos, se incluyen las vacunaciones con células tumorales autólogas o alógenas, células tumorales autólogas o alógenas modificadas por métodos químicos o de biología molecular, antígenos asociados a tumores (TAA) aislados o preparados con ayuda de métodos químicos o de biología molecular, péptidos derivados de los mismos, anticuerpos anti-idiotípicos como suplente de un TAA, más recientemente también vacunaciones con ADN, que codifican para TAA o para las estructuras derivadas de las mismas, etc. En principio, para inducir una inmunidad durante meses hasta años, son suficientes cantidades muy pequeñas de una vacuna apropiada, que, al disminuirse, puede reactivarse por vacunaciones de recuerdo. Además de esto, con una inmunización activa, pueden inducirse tanto una inmunidad humoral como celular, cuya interacción puede dar lugar a una acción protectora eficaz contra el
cáncer.
Con el fin conseguir una fuerte inmunidad, los antígenos se administran normalmente juntos con un adyuvante. Entre los ejemplos de adyuvantes que pueden mencionarse, sin ser limitados a los mismos, se incluyen: hidróxido de aluminio (gel de aluminio), derivados de lipopolisacárido, Bacillus Calmette Guerin (BCG), preparaciones de liposomas, formulaciones que contienen antígenos adicionales, contra los que el sistema inmune ya ha producido una fuerte respuesta inmune, tales como por ejemplo toxoide tetánico, Pseudomonas Extoxin, o componentes de los virus de influenza, si se desea, en una preparación de liposoma. Es conocido también que la respuesta inmune puede ser reforzada por la administración simultánea de proteínas endógenas, que son importantes en la elaboración de una respuesta inmune, tales como por ejemplo el factor estimulador de los macrófagos de granulocitos (GM-CSF), interleucina 2 (IL-2), interleucina 12 (IL-12) o gamma-interferona (IFN\gamma).
La patente US nº 5.554.730-B se refiere a conjugados de polisacárido/proteína, que tiene por fin la producción de una vacuna en forma de partículas. A tal fin, se produce en primer lugar un conjugado de polisacárido/proteína como base de Schiff (azometina) por reacción de un portador de proteína con un antígeno de polisacárido oxidado en presencia de un "crowding agent" (agente de desplazamiento de agua), en el que el portador de proteína se ve desnaturalizado inmediatamente debido a la presencia del "crowding agent" y el conjugado es precipitado en forma de micropartículas. La disolución de las micropartículas precipitadas en un medio fuertemente básico (NaOH 0,1 n), con el fin de obtener una solución de vacuna, es posible en principio y también ha sido divulgado, pero sólo tiene sentido en caso de utilizar un antígeno de polisacárido, puesto que, debido a la desnaturalización, una proteína posiblemente antígena habría perdido sus determinantes antígenos y por lo tanto ya no sería eficaz.
El documento WO 99/55715 describe conjugados de polisacárido/antígeno, en los que el antígeno está unido al polisacárido o bien a través de un ligador bivalente adecuado o bien a través de un grupo aldehído terminal. Por tanto, la unión directa del antígeno al polisacárido a través de un enlace de azometina está limitada al número de grupos aldehído terminales presentes en el polisacárido.
El documento DE 198 21 859-A1 describe asimismo conjugados de polisacárido/antígeno, en los que un crosslinker adecuando se une a la función aldehído obtenida por medio de oxidación con periodato a través de un enlace de azometina. En el crosslinker, está prevista adicionalmente una función maleinimido a la que puede adicionarse un grupo SH de cisteína. A continuación, los antígenos utilizados se proveen de un cis adicional por el término N o C para permitir la adición de la función SH terminal con el crosslinker y por ello la obtención de los conjugados de polisacárido/antígeno descritos.
Finalmente, la patente US nº 5.846.951 se refiere a polisacáridos con por lo menos 5 radicales de ácido sialínico, cuyos polisacáridos pueden ser provistos de grupos aldehído terminales en los términos no reductores de los ácidos polisialínicos por oxidación con periodato sódico. Los grupos aldehído terminales así creados pueden ser unidos a continuación a medicamentos que contienen grupos amino, por ejemplo proteínas, por medio de un enlace de azometina.
\newpage
La mayoría de los antígenos utilizados para vacunas incluyen estructuras con grupos amino. En particular, todos los antígenos de proteínas presentan normalmente por lo menos una, pero en la mayoría de los casos varias lisinas en su secuencia de aminoácidos. Los grupos amino en dichas lisinas están presentes en forma libre.
Es conocido desde hace mucho tiempo que las aminas primarias pueden hacerse reaccionar con aldehídos. El producto de esta reacción es denominado base de Schiff. Las bases de Schiff no son compuestos completamente estables, puesto que pueden ser hidrolizadas en condiciones adecuadas, convirtiéndose en sus materiales de partida.
Es conocido asimismo que los compuestos que contienen grupos hidroxi vicinales pueden ser oxidados con la ayuda de oxidantes adecuados, en particular con ácido periódico o sales del ácido periódico tal como metaperiodato sódico, de tal forma que se forman dos funciones aldehído con la ruptura del enlace C-C, en el que se encuentran los grupos hidroxi vicinales.
Un gran número de polisacáridos de alto peso molecular se componen de unidades de azúcar monoméricas, que llevan grupos hidroxi vicinales. Dos ejemplos que pueden citarse, aunque no están limitados a los mismos, son dextrano y manano. Por tanto, los polisacáridos de este tipo pueden ser oxidados con periodato de la manera descrita anteriormente, sin que se rompan los enlaces entre los monómeros. Si se utiliza una cantidad de periodato menos que la estequiométrica, relativo al número de las unidades monoméricas, la oxidación es sólo parcial, es decir, el número de monómeros oxidados según el principio al azar corresponde a la cantidad de periodato.
Por la patente US nº 6.011.008, se conoce un procedimiento para la preparación de un conjugado de polisacárido soluble en agua, en el cual se prevé forzosamente una etapa de purificación entre la activación del polisacárido para dar un dialdehído por oxidación con periodato y la formación de la base de Schiff (del conjugado), con el fin de eliminar los aniones de interferencia y productos secundarios del dialdehído. Según la columna 1, líneas 49-60, la invención según la patente US nº 6.011.008 radica precisamente en dicha etapa de purificación.
El objetivo de la presente invención es proporcionar unos medios y unos métodos adicionales que dan lugar a formulaciones inmunógenas de vacunas.
Dicho objetivo se alcanza en un procedimiento del tipo citado al principio, oxidando un portador de polisacárido que presenta grupos hidroxi vicinales parcialmente, por lo menos en un 20%, con una cantidad del oxidante de menos de la estequiométrica con la abertura del anillo para crear grupos aldehído vicinales y haciendo reaccionar el producto obtenido con uno o varios polipéptido(s) antígenos que son lábiles a bases y contienen por lo menos un grupo amino libre, en cuyo procedimiento el o los polipéptido(s) se unen directamente al portador de proteína a través de un enlace de azometina. Por tanto, los polisacáridos parcialmente oxidados constituyen un material portador adecuado para la formulación de vacunas, si los polipéptidos utilizados que son lábiles a bases contienen uno o más grupos amino libres y pueden unirse de esta manera a los grupos a los grupos aldehído creados en el material portador por la abertura de anillo a través de un enlace de azometina. Preferentemente, los polipéptidos antígenos lábiles a bases, utilizados según la invención, son estables hasta un valor pH de aproximadamente 11, preferentemente hasta un valor pH de aproximadamente 10, de forma aún más preferida hasta un valor pH de aproximadamente 9, de la forma más preferida hasta un valor pH de aproximadamente 8. Cuando se citan polipéptidos en conexión con la presente invención, por polipéptidos se entienden proteínas con por lo menos 6 aminoácidos en la cadena. Igualmente, por polisacáridos se entienden oligosacáridos con por lo menos 3 unidades monoméricas en la cadena. Los polisacáridos utilizados preferentemente son manano, por ejemplo con un peso molecular de por lo menos 70 kDa, y dextrano, por ejemplo con un peso molecular de por lo menos 70 kDa, de forma particularmente preferida con un peso molecular de aproximadamente 2.000 kDa.
El control del grado de oxidación, por ejemplo por medio de una cantidad de oxidante menos que la estequiométrica, permite ajustar fácilmente la cantidad de los grupos aldehído disponibles para un enlace de azometina entre el portador y el polipéptido.
Por tanto, el polipéptido lábil a antígenos es preferentemente un antígeno de una vacuna, de forma particularmente preferida un anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo monoclonal, tal como el anticuerpo monoclonal murino HE2. Un nuevo método de la vacunación contra el cáncer se ha descrito en la solicitud de patente PCT/EP00/00174 (prioridad 13.1.1999) "Utilización de anticuerpos para la vacunación contra el cáncer", cuya divulgación se ha incorporado en la presente memoria de patente por referencia. El anticuerpo monoclonal HE2 descrito en la misma, que se utiliza como antígeno de una vacuna en una vacunación contra el cáncer, sirve como ejemplo, no estando limitado, sin embargo, al mismo, de una formulación de una vacuna según el método descrito aquí de la conjugación con un polisacárido parcialmente oxidado de alto peso molecular.
Según otra forma de realización preferida de la invención, el polisacárido antígeno lábil a bases presenta la misma especificidad fina de enlace que el anticuerpo HE2.
También es ventajoso si además del polipéptido antígeno lábil a bases particular se conjuguen también sustancias que provocan un refuerzo de la respuesta inmune, por ejemplo GM-CSF, IL-2, IL-12 o gamma-interferona o una mezcla de dichas sustancias.
\newpage
Además es preferido si el conjugado de polisacárido/polipéptido según la invención se adsorbe adicionalmente en hidróxido de aluminio y/o se mezcla con vehículos farmacéuticamente aceptables.
Finalmente, es preferido si el conjugado de polisacárido/polipéptido obtenido según la invención se formula como una formulación de vacuna para administrarla por medio de inyecciones subcutáneas, intradermales o intramusculares, por ejemplo disolviendo o suspendiendo el conjugado absorto o no absorto sobre por ejemplo hidróxido de aluminio en un tampón fisiológico adecuado y similares.
Por lo general, pueden citarse las siguientes ventajas y propiedades específicas del conjugado según la invención:
\bullet
Los componentes (conjugado y sustancias auxiliares o adicionales) acoplados a los polisacáridos oxidados a través de aminas primarias se desligan lentamente en presencia de un exceso de moléculas con aminas primarias libres, tales como por ejemplo proteínas de suero. El efecto "Show Release" resultante es deseable para las vacunas, puesto que permite a las células que presentan antígenos de absorber los antígenos de la vacuna localmente en el punto de vacunación durante más tiempo.
\bullet
La selección del polisacárido puede afectar a las propiedades del conjugado. Esto se refiere tanto al tamaño molecular del polisacárido como a su composición química. Por ejemplo, si el polisacárido seleccionado es manano, el conjugado correspondiente será absorto preferentemente por las células del sistema inmune que llevan el receptor de manosa. Entre ellos, se incluyen en particular macrófagos y células dendríticas como células profesionales que presentan el antígeno. Con esto se consigue una respuesta inmune incrementada.
\bullet
Es posible unir a los polisacáridos parcialmente oxidados simultáneamente varios componentes. Estos pueden ser varios antígenos de vacuna distintos o bien antígenos de vacuna juntos con componentes que refuerzan la respuesta inmune, tales como por ejemplo GM-CSF, IL-2, IL-12 o gamma-interferona.
La Fig. 1 adjunta muestra la comparación de dos formulaciones con relación a la inducción de anticuerpos contra HE2 (ELISA) en macacos rhesus.
Ejemplo
En primer lugar, se procede a oxidar dextrano con un peso molecular de 2.000 kDa (SIGMA D-5376) con metaperiodato sódico hasta un 20%. A tal fin, 324 mg de dextrano se disuelven en 4 ml de agua destilada con agitación. A esta solución, se adicionan 86 mg de metaperiodato sódico previamente disuelto en 0,6 ml de agua destilada, y la mezcla resultante se incuba a 37ºC en la oscuridad durante 30 min. 25 mg del anticuerpo HE2 (PCT/EP00/00174) se llevan a un valor pH de 7,4 con Na_{2}HPO_{4} 1 M y se adicionan 45 \mul de una solución de timerosal (10 mg/ml).
A esta solución, se adicionan 1,675 ml de la solución de dextrano oxidada obtenida anteriormente, y la solución resultante se incuba a 37ºC en la oscuridad durante 2 días. La conversión total de los reactantes se verifica analíticamente por cromatografía en una columna de peso molecular (Zorbax 450). La señal que corresponde a un peso molecular 150 kDa (HE2 monomérico) ha desaparecido y en su lugar aparece una señal en el volumen de exclusión de la columna, que corresponde a un peso molecular de >2.000 kDa.
La solución obtenida se cromatografía en una columna del peso molecular preparativa equilibrada con el tampón final (tampón de fosfato 1 mM en una solución de sal común fisiológica, pH = 5,5). El material obtenido en el volumen de exclusión se compone del conjugado del anticuerpo HE2 de alto peso molecular con dextrano parcialmente oxidado. El contenido en HE2 conjugado puede determinarse por integración de la señal tras la cromatografía analítica en una columna del peso molecular en comparación con HE2 monomérico. La solución obtenida se mezcla con un hidróxido de aluminio acuoso de tal manera que la concentración final es de 0,5 mg de HE2 en 1,67 mg de hidróxido de aluminio en 0,5 ml de tampón.
Cuatro macacos rhesus se inmunizaron en los días 1, 15, 29 y 57 por vía subcutánea con 0,5 ml de la formulación citada anteriormente. Los sueros se ensayaron en tiempos distintos por medio de ELISA con relación a su inducción de anticuerpos contra HE2 monomérico. Para fines de comparación, se vacunaron cuatro macacos rhesus de la misma manera con una formulación estándar de 0,5 mg de HE2 monomérico adsorbido en 1,67 mg de hidróxido de aluminio.
El ensayo ELISA se realizó de la siguiente manera:
Alícuotas de 100 \mul del AcM (anticuerpo monoclonal) HE2 (solución que contiene 10 \mug/ml en un tampón de acoplamiento) se incubaron en los pozos de una placa de microtítulo a 37ºC durante 1 hora. Después de lavar la placa seis veces con el tampón de lavado A, se adicionaron 200 \mul del tampón de bloqueo A a cada pozo y se incubaron a 37ºC durante 30 min. Después de lavar la placa tal como se ha descrito anteriormente, se incubaron alícuotas de 100 \mul de cada suero de macaco a ensayar en diluciones comprendidas entre 1:100 y 1:1.000.000 en el tampón de dilución A a 37ºC durante 1 hora. Después de lavar la placa tal como se ha descrito anteriormente, se adicionaron 100 \mul del anticuerpo anti-Ig humana conjugado con peroxidasa de cabra (Zymed) en una dilución de 1:1.000 en el tampón de dilución A a cada pozo y se incubaron a 37ºC durante 30 min. La placa se lavó cuatro veces con el tampón de lavado A y dos veces con el tampón de coloración. La unión del anticuerpo se verificó adicionando 100 \mul de cada substrato específico, y la reacción de coloración se paró después de aproximadamente 10 min, adicionando cada vez 50 \mul de una solución de parada. La evaluación se realizó midiendo la densidad óptica (DO) a 490 nm (la longitud de onda de la medición de referencia es de 620 nm).
Los resultados del ensayo ELISA se han representado en la Figura 1. Los animales vacunados con el conjugado de HE2 con dextrano desarrollaban títulos de anticuerpos contra HE2 comparables con los de macacos vacunados con la formulación estándar.
Además, se investigó hasta qué punto HE2 puede encontrarse en el suero de los macacos después de su aplicación. A tal fin, se volvió a utilizar el ensayo ELISA, realizado de la siguiente manera:
Alícuotas de 100 \mul de un anticuerpo policlonal anti-idiotípico purificado de cabra contra HE2 (solución que contiene 10 \mug/ml en un tampón de acoplamiento) se incubaron en los pozos de una placa de microtítulo a 37ºC durante 1 hora. Después de lavar la placa seis veces con el tampón de lavado A, se adicionaron 200 \mul del tampón de bloqueo A a cada pozo y se incubaron a 37ºC durante 30 min. Después de lavar la placa tal como se ha descrito anteriormente, se incubaron alícuotas de 100 \mul de cada suero de macaco a ensayar en diluciones comprendidas entre 1:4 y 1:100.000 en el tampón de dilución A a 37ºC durante 1 hora. Después de lavar la placa tal como se ha descrito anteriormente, se adicionaron 100 \mul del anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa de cabra (Zymed) en una dilución de 1:1.000 en el tampón de dilución A a cada pozo y se incubaron a 37ºC durante 30 min. La placa se lavó cuatro veces con el tampón de lavado y dos veces con el tampón de coloración. La unión del anticuerpo se verificó adicionando 100 \mul de cada substrato específico, y la reacción de coloración se paró después de aproximadamente 10 min, adicionando cada vez 50 \mul de una solución de parada. La evaluación se realizó midiendo la densidad óptica (DO) a 490 nm (la longitud de onda de la medición de referencia es de 620 nm).
Los resultados se han representado en la siguiente tabla:
1
Después de 24 h, en los animales que habían sido vacunados, se podía detectar una indicación de una concentración de HE2 en el suero, que, sin embargo, es por debajo del limite de detección de aproximadamente 10 ng de HE2/ml de suero. Obviamente, la desorción del antígeno de la vacuna ha sido disminuida considerablemente por la conjugación con dextrano parcialmente oxidado en comparación con la formulación estándar. Esto hace probable que, para conseguir un título comparable, sean suficientes menos vacunaciones que con una formulación estándar basada en hidróxido de aluminio.
Materiales utilizados
Placas de microtítulo:
Immuno Plate F96 MaxiSorp (Nunc) para ELISA
Tampón de acoplamiento:
Na_{2}CO_{3} 15 mM
\quad
NaHCO_{3} 35 mM
\quad
NaN_{3} 3 mM
\quad
Valor pH: 9,6
PBS deficient:
NaCl 138 mM
\quad
KH_{2}PO_{4} 1,5 mM
\quad
KCl 2,7 mM
\quad
Na_{2}HPO_{4} 6,5 mM
\quad
Valor pH: 7,2
Tampón de lavado:
Tween 20 al 0,05% en PBS deficient
Tampón de bloqueado:
Suero de ternero fetal al 5% (desactivado por calor) en PBS deficient
Tampón de dilución:
Suero de ternero fetal al 2% (desactivado por calor) en PBS deficient
Tampón de coloración:
Ácido cítrico 24,3 mM
\quad
Na_{2}HPO_{4} 51,4 mM
\quad
Valor pH: 5,0
Substrato:
40 mg de o-fenilendiamina dihidrocloruro
\quad
100 ml de tampón de coloración
\quad
20 \mul de H_{2}O_{2} (al 30%)
Solución de parada:
H_{2}SO_{4} 4 N

Claims (18)

1. Procedimiento para la preparación de un conjugado de polisacárido/polipéptido por reacción de un polisacárido con un polipéptido que contiene por lo menos un grupo amino libre, caracterizado porque un portador de polisacárido que presenta grupos hidroxi vicinales se oxida parcialmente, preferentemente por lo menos en un 20%, con una cantidad del oxidante de menos de la estequiométrica con la abertura de anillo para crear grupos aldehído vicinales y el producto obtenido se hace reaccionar con uno o varios polipéptido(s) antígenos lábiles a bases que contienen por lo menos un grupo amino libre, uniendo el o los polipéptido(s) directamente al portador de polisacárido a través de un enlace de azometina.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el (los) polipéptido(s) es (son) estable(s) hasta un valor pH de aproximadamente 11.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el (los) polipéptido(s) es (son) estable(s) hasta un valor pH de aproximadamente 10.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el (los) polipéptido(s) es (son) estable(s) hasta un valor pH de aproximadamente 9.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el (los) polipéptido(s) es (son) estable(s) hasta un valor pH de aproximadamente 8.
6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el polisacárido utilizado es manano, preferentemente con un peso molecular de por lo menos 70 kDa.
7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el polisacárido utilizado es dextrano, preferentemente con un peso molecular de por lo menos 70 kDa, de forma particularmente preferida con un peso molecular de aproximadamente 2.000 kDa.
8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el polipéptido antígeno lábil a bases utilizado es un antígeno de una vacuna.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque el antígeno de vacuna es un anticuerpo.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque el anticuerpo utilizado es un anticuerpo monoclonal.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal utilizado es el anticuerpo HE2.
12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque el anticuerpo presenta la misma especificidad fina de unión que el anticuerpo HE2.
13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque además de cada polipéptido antígeno lábil a bases se conjugan asimismo sustancias que provocan un refuerzo de la respuesta inmune.
14. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque dichas sustancias son GM-CSF, IL-2, IL-12 o gamma-interferón o una mezcla de dichas sustancias.
15. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque el conjugado está adsorbido adicionalmente en hidróxido de aluminio.
16. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque el conjugado se mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
17. Conjugado que se puede obtener según una de las reivindicaciones 1 a 16.
18. Conjugado según la reivindicación 17, caracterizado porque se ha formulado para ser administrado como inyección subcutánea, intradermal o intramuscular.
ES01914811T 2000-03-21 2001-03-21 Conjugado de polisacarido/polipeptido. Expired - Lifetime ES2325528T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ATA471/2000 2000-03-21
AT4712000 2000-03-21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2325528T3 true ES2325528T3 (es) 2009-09-08

Family

ID=3674758

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES01914811T Expired - Lifetime ES2325528T3 (es) 2000-03-21 2001-03-21 Conjugado de polisacarido/polipeptido.

Country Status (10)

Country Link
EP (1) EP1267937B1 (es)
AT (1) ATE429251T1 (es)
AU (1) AU2001242084A1 (es)
CA (1) CA2404111C (es)
DE (1) DE50114852D1 (es)
DK (1) DK1267937T3 (es)
ES (1) ES2325528T3 (es)
MX (1) MXPA02008247A (es)
SI (1) SI1267937T1 (es)
WO (1) WO2001070272A1 (es)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10209821A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
AT502293B1 (de) * 2002-05-15 2008-03-15 Igeneon Krebs Immuntherapie Immunogener, monoklonaler antikörper
ATE409048T1 (de) 2002-10-08 2008-10-15 Fresenius Kabi De Gmbh Pharmazeutisch aktive oligosaccharid-conjugate
WO2005014655A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
WO2005044861A1 (en) * 2003-10-31 2005-05-19 Wyeth Holdings Corporation Polysaccharides of helicobacter pylori
ES2390885T3 (es) * 2004-03-11 2012-11-19 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugados de hidroxialquilalmidón y una proteína
DE102006035899A1 (de) 2006-07-31 2008-02-07 Dade Behring Marburg Gmbh Polysacharid-Peptid-Konjugate zur Verwendung als Thrombinsubstrate

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU730694A1 (ru) * 1976-07-05 1980-04-30 Всесоюзный Научно-Исследовательский Технологический Институт Антибиотиков И Ферментов Медицинского Назначения Модифицированный террилитином декстран, обладающий фибринолитической активностью
WO1996020012A2 (en) * 1994-12-23 1996-07-04 Middlesex Sciences, Inc. Methods for preparing and purifying macromolecular conjugates
US6011008A (en) * 1997-01-08 2000-01-04 Yissum Research Developement Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Conjugates of biologically active substances
CA2233725A1 (en) * 1998-03-31 1999-09-30 Hemosol Inc. Hemoglobin-hydroxyethyl starch complexes

Also Published As

Publication number Publication date
DE50114852D1 (de) 2009-06-04
EP1267937A1 (de) 2003-01-02
EP1267937B1 (de) 2009-04-22
MXPA02008247A (es) 2004-04-05
AU2001242084A1 (en) 2001-10-03
SI1267937T1 (sl) 2009-10-31
DK1267937T3 (da) 2009-08-03
WO2001070272A1 (de) 2001-09-27
CA2404111C (en) 2010-05-25
CA2404111A1 (en) 2002-09-19
ATE429251T1 (de) 2009-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2335557T3 (es) Conjugados de peptido-polisacarido.
Heegaard et al. Dendrimers for vaccine and immunostimulatory uses. A review
ES2658851T3 (es) Vacunas de matriz de proteína y métodos de preparación y administración de tales vacunas
CN1688606B (zh) 含有辅助t细胞和b细胞表位的新的免疫原性脂肽
KR100290632B1 (ko) 면역성이약한항원공액체와이를포함하는합성펩티드담체와백신
EP0191536B1 (en) Synthetic immunogen
ES2363735T3 (es) Composición que comprende micropartículas inmunogénicas.
Lockner et al. Flagellin as carrier and adjuvant in cocaine vaccine development
JP3872813B2 (ja) ヘテロダイマーポリペプチド免疫原キャリア組成物および方法
US7097837B2 (en) Synthetic vaccine agents
ES2230687T3 (es) Copulacion de proteinas nomodificadas con polisacaridos derivados de haloacilo o de dihaloacilo para la preparacion de vacunas que incluyen proteinas-polisacaridos.
EP0584279A1 (en) Targeted delivery of genes encoding immunogenic proteins
JPS6345228A (ja) 抗原の免疫原性の増強
Watson et al. Antibody response to polyhistidine-tagged peptide and protein antigens attached to liposomes via lipid-linked nitrilotriacetic acid in mice
JP2005162761A (ja) 合成ペプチド免疫原のための免疫刺激因子としての人工的ｔヘルパー細胞エピトープ
TW201210617A (en) IgE CH3 peptide vaccine
Boeckler et al. Design of highly immunogenic liposomal constructs combining structurally independent B cell and T helper cell peptide epitopes
ES2237210T3 (es) Metodo para preparar vacunas conjugadas en fase solida.
JPS58208237A (ja) 免疫原活性を付与されたハプテンとムラムル―ペプチドとの組成物
ES2325528T3 (es) Conjugado de polisacarido/polipeptido.
Badten et al. Protein nanoparticle-mediated delivery of recombinant influenza hemagglutinin enhances immunogenicity and breadth of the antibody response
US20040191264A1 (en) Synthetic vaccine agents
US6956119B2 (en) Polysaccharide-polypeptide conjugate
JP2837866B2 (ja) 口蹄疫に対する合成ワクチンおよびその製造方法
AU2002233166B2 (en) Synthetic vaccines comprising polyhydroxypolymer carriers