ES2335721T3 - Mezcla de encimas. - Google Patents

Abstract

Penicillium funiculosum depositado bajo el Tratado de Budapest en el International Mycological Institute con el número IMI 378536.

Description

Mezcla de enzimas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un nuevo microorganismo, y a una nueva mezcla de enzimas. Además, la presente invención se refiere a la composición de la mezcla de enzimas, a su preparación y a su uso en las industrias de pienso, alimentación y en otras industrias, incluyendo, pero sin limitarse a, la industria del papel y la industria textil.

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Antecedentes de la invención

Las enzimas se han usado durante mucho tiempo para una variedad de aplicaciones industriales diferentes. Se conocen ejemplos en la industria panadera, en la industria del vino y de zumos de frutas (en la que las enzimas se usan para romper pectinas y \beta-glucanos), en la industria textil (en la que se usan celulasas para obtener tejidos celulósicos suaves y lisos), y también, que no es la aplicación menos importante, para piensos para animales. En este caso, las enzimas mejoran la digestibilidad de las fuentes vegetales.

Este último uso permite que el ganado digiera el pienso más eficazmente. El valor de un pienso se puede medir mediante la FCR (relación de conversión del pienso), una relación nutritiva de la cantidad de pienso consumido con relación a la ganancia de peso del animal. Una disminución en la FCR, para un pienso, indica que el animal gana proporcionalmente más peso para una cantidad dada de pienso: es decir, el animal es capaz de utilizar más eficazmente el pienso.

La mala digestibilidad de los componentes del pienso (almidón, grasa, proteína/aminoácidos) es una característica observada de piensos a base de cereales, y, por ejemplo, particularmente aquellos que tienen un contenido elevado de cebada o trigo. En estos casos, puede ser necesario formular el pienso para que contenga mayores niveles de energía procedente de otras fuentes, y de otros suplementos tales como aminoácidos. Estas enzimas incrementan el valor de Energía Metabolizable Aparente de los cereales incorporados en el pienso.

Otro enfoque para resolver este inconveniente ha sido añadir suplementos enzimáticos, celulasas, endo-1,3(4)-\beta-glucanasas (\beta-glucanasas), endo-1,4-\beta-xilanasas (xilanasas), etc., o mezclas de actividades enzimáticas, a estos piensos a base de cereales. Los suplementos enzimáticos pueden tener un uso específico para hidrolizar los \beta-glucanos, o para hidrolizar los arabinoxilanos, encontrados en los cereales (típicamente cebada y trigo). La adición de enzimas tiene objetivos diferentes. Una ventaja que demuestra claramente la eficacia de suplementos enzimáticos para el pienso es la reducción de la viscosidad de materiales en el intestino de los animales que reciben pienso a base de cereales que contiene el suplemento enzimático apropiado. La mayor viscosidad es debida, en parte, a \beta-glucanos y arabinoxilanos encontrados en la cebada y el trigo. La menor viscosidad, que resulta de la acción enzimática, permite una absorción más fácil de los componentes nutricionales en el intestino del animal. La otra ventaja es la liberación de nutrientes atrapados por las paredes celulares de los cereales, disminuyendo el requisito de otros suplementos costosos del pienso. En conjunto, el resultado es una reducción significativa en el coste del pienso, con un efecto similar o beneficioso según se mide mediante la FCR.

Se han descrito preparaciones enzimáticas originadas a partir de un intervalo de diferentes microorganismos para mejorar la digestibilidad de los piensos.

Si se tiene en cuenta la técnica anterior relacionada con el uso de enzimas en el pienso para animales, se puede mencionar la patente europea nº 0.699.762, que describe el uso de una fitasa originada de Schwanniomyces occidentalis. Esta fitasa es una fitasa obtenida a partir de un microorganismo genéticamente modificado obtenido incluyendo un gen clonado que se desearía evitar en la presente invención.

Si se tiene en cuenta la solicitud de patente WO 95/26398, nuevamente se obtiene una celulasa modificada mediante inclusión de una secuencia de ADN extraña en una célula hospedante que modifica la naturaleza de la cepa original que se escoge de la siguiente lista de microorganismos: Bacillus, Streptomyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Aspergillus. En la presente invención, el principal objetivo fue evitar la inclusión de genes extraños en el microorganismo productor de la enzima.

En la solicitud de patente WO 96/05739, se obtiene una mezcla de enzimas (xilanasa, proteasa y, opcionalmente \beta-glucanasa) a partir de diferentes microorganismos. Los autores dan ejemplo (página 5) de mezcla de enzimas, con una relación de actividad de xilanasa a actividad de \beta-glucanasa del orden de 1:5. Se ha encontrado que cuando se incluye una xilanasa en una dieta a base de cereal a su nivel de dosificación óptimo o próximo a él, la copresencia de enzimas que poseen actividad de \beta-glucanasa incrementa la FCR del pienso, lo que por supuesto es desventajoso. En consecuencia, los autores advierten de la presencia de \beta-glucanasa; recomiendan una relación máxima de actividad de xilanasa a actividad de \beta-glucanasa de 1:0-0,25.

En algunos casos, a fin de asegurar que todas las actividades enzimáticas relevantes para la aplicación del pienso estén presentes, las preparaciones se obtienen a partir de preparaciones de más de un microorganismo. En un número de casos, las preparaciones enzimáticas se han obtenido a partir de microorganismos sometidos a modificación genética usando técnicas de ADN recombinante.

Se ha descubierto y desarrollado un nuevo microorganismo que pertenece a la clase de Penicillium funiculosum, que contiene nuevas enzimas y una mezcla de actividades enzimáticas que se pueden usar con éxito para incrementar principalmente la digestibilidad de piensos para animales a base de cereales.

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Sumario de la invención

En consecuencia, la presente invención se refiere a un nuevo microorganismo derivado de Penicillium funiculosum; un método para cultivar este microorganismo y para recuperar las enzimas producidas por este microorganismo; y nuevas composiciones que contienen esas enzimas.

Además, según la presente invención, se proporciona un método para mejorar la digestibilidad de piensos para animales a base de aminoácidos y cereales, y de aminoácidos.

Otro objeto de la presente invención es la reducción de la excreción de fósforo y la excreción de amoníaco de la batería en la que se alimentan los animales.

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Descripción detallada de la invención A. La nueva cepa Penicillium funiculosum

Esta nueva cepa del hongo Penicillium funiculosum está depositada con el número IMI 378536 en una Autoridad Depositaria Internacional bajo el Tratado de Budapest (1977), el International Mycological Institute (IMI), Bakeham Lane, Englefield Green, Egham, Surrey, TVV20 9TY, UK.

Filiación

La nueva cepa se ha obtenido a partir de IMI 134756 de Penicillium funiculosum tras tratamiento con irradiaciones sucesivas de UV y \beta de esporas, incluyendo el cribado en medio selectivo. No se ha obtenido ninguna modificación genética mediante técnicas de ADN recombinante usando la inclusión de ADN o ARN extraño.

Identificación y tipado

Penicillium funiculosum IMI 378536 se ha caracterizado mediante crecimiento en agar de Czapek Dox a 25ºC. Las características de la colonia y la micromorfología son típicas de Penicillium funiculosum. La identificación del microorganismo como Penicillium funiculosum se ha confirmado en el International Mycological Institute, Bakeham Lane, Englefield Green, Egham, Surrey, TVV20 9TY, UK. El crecimiento es como un fieltro basal duro, con crecimiento aéreo, como cuerdas o haces de micelios (funiculosos), el micelio es blanco con una coloración roja subyacente en el sustrato, los márgenes son pálido inverso pero coloreados en rojo hacia los centros y se pueden hacer de un color rojo oscuro. Este penicillium es típico, muestra conidióforos cortos que surgen mayoritariamente de funículos, biverticilados, células conidiógenas acerosas, y las conidias con elípticas y lisas.

El microorganismo usado para la producción de la preparación de enzimas de esta invención se hace crecer en condiciones aerobias en un medio que contiene celulosa, licor de maíz fermentado, carbonato de calcio y sulfato de amonio.

B. Proceso de fermentación

Este nuevo hongo se fabrica mediante fermentación de la cepa depositada, primero en un medio de siembra constituido preferentemente de (en peso):

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Temperatura de incubación 27ºC a 36ºC.

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El medio de producción tiene preferentemente la siguiente constitución (en peso):

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Temperatura de incubación 27ºC a 36ºC.

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Para la fermentación, cárguese el fermentador con suficiente agua, añádanse los ingredientes al agua en un recipiente agitado adecuado, agítese hasta que los ingredientes se hayan disuelto. Esterilícese cerrando herméticamente el fermentador y elevando la temperatura del contenido hasta típicamente 121ºC. La vasija de fermentación se inocula con el fermentador de siembra.

La fuente principal de carbono que se añade durante el proceso de fermentación es celulosa; entre las diferentes fuentes de células, se prefiere usar ARBOCEL, SOLKAFLOC, CLAROCEL, ALPHACEL, FIBRACEL con diferentes grados.

El pH durante la fermentación se controla preferentemente mediante la adición de ácido sulfúrico, u otro ácido, y amoníaco en forma gaseosa o líquida, u otra base.

Al final del tiempo de fermentación, elimínense los sólidos mediante separación sólido-líquido tal como filtración o centrifugación, recójase la fase líquida y concéntrese, por ejemplo, mediante ultrafiltración sobre membrana orgánica o mineral.

Estas enzimas también se pueden fabricar por medio de tecnología de ADN recombinante, y de este modo se pueden producir mediante especies homólogas o especies heterólogas recombinantes. El hospedante para la transferencia del gen que codifica la enzima se puede seleccionar de una especie fúngica, una célula bacteriana o una célula vegetal. Se puede usar cualquier técnica convencional para insertar el gen que codifica la enzima de interés en la célula hospedante tal como plásmidos (integrantes o no), vectores fágicos y vectores víricos.

Según la invención, la enzima se puede proporcionar como una preparación bruta, tal como el medio de cultivo en el que se ha hecho crecer Penicillium funiculosum.

También es posible incluir esta o aquellas enzimas en composiciones que contienen una enzima adicional, dependiendo su tipo del uso pretendido de la composición. Las enzimas añadidas se pueden seleccionar de, por ejemplo, carbohidrasas, lipasas y proteasas.

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C. Composiciones de la "mezcla de actividades enzimáticas" 1. Composición líquida

Para la composición líquida, tras la adición de agentes antimicrobianos, se lleva a cabo la medida de la concentración de enzimas y se corrige la dilución hasta la fuerza del producto.

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La composición preferida de la composición líquida en peso es la siguiente:

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Los antimicrobianos se escogen de productos tales como ácido sórbico y sales, ácido benzoico y sales, 4-hidroxibenzoato de metilo y 4-hidroxibenzoato de n-propilo, ácido fumárico, sales y ésteres. También se podrían usar sales tales como cloruro de sodio o cloruro de potasio.

Los agentes anticongelantes más preferidos son 1,2-propanodiol, etilenglicol, glicerol.

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2. Composición en polvo

Para preparaciones en polvo, la disolución concentrada obtenida se seca con eventualmente la presencia de un vehículo. El polvo obtenido tras secar la disolución concentrada en ausencia de un vehículo se puede mezclar adicionalmente con un vehículo adecuado.

La composición preferida de la forma de polvo es la siguiente:

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Los vehículos preferidos se seleccionan de entre harina de trigo, almidón, yeso, maltodextrina, sólidos de maíz, subproductos del procesamiento de cereales tales como maíz molido, harinillas de trigo, salvado de trigo, granzas de centeno, mezcla de minerales.

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D. Características enzimáticas

Se obtiene una nueva mezcla de enzimas producida mediante Penicillium funiculosum. Esta mezcla de enzimas contiene nuevas enzimas tales como celulasas, \beta-glucanasas, xilanasas, enzimas secundarias de xilanasa tales como arabinofuranosidasa y feruloil esterasas.

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1. Procedimiento

La preparación de enzimas se caracteriza mediante ensayos que incluyen ensayos para determinar las actividades de celulasa, celobiohidrolasa, \beta-glucosidasa, endo-1,3(4)-\beta-glucanasa, laminarinasa, endo-1,4-\beta-xilanasa (usando diferentes sustratos), \beta-xilosidasa, arabinofuranosidaasa y feruloil esterasa (usando diferentes sustratos).

1.1 Celulasa mediante el método de CMC en DNS

El ensayo para determinar la actividad de celulasa se basa en la hidrólisis enzimática de los enlaces glucosídicos en carboximetilcelulosa (CMC), un \beta-1,4-glucano. Los productos de la reacción, oligosacáridos de \beta-1,4-glucano, se determinan mediante el incremento resultante del valor reductor (como glucosa).

Una disolución que contiene 1 ml de una disolución de CMC al 1% (p/v) en tampón de acetato de sodio 0,1 M, pH 5,0 (o a diferentes valores de pH) y 1 ml de disolución enzimática apropiadamente diluida se incubó a 50ºC durante 10 minutos. La reacción enzimática se detuvo mediante adición de 2 ml de una disolución de DNS (1% (p/v) de ácido 3,5-dinitrosalicílico, 1,6% (p/v) de hidróxido sódico, 30% (p/v) de (+)-tartrato sódico potásico, en agua destilada). La disolución se mezcló y se colocó en un baño de agua hirviendo, 95ºC mínimo, durante 5 minutos, y después se enfrió hasta 25ºC. Se añadieron 10 ml de agua destilada a la disolución, y la absorbancia se midió a 540 nm usando una cubeta de vidrio de 2 cm de longitud de recorrido.

El resultado se convirtió en \mumoles de azúcar reductor (como glucosa) mediante comparación con una curva patrón para 2 ml de disoluciones de glucosa 0,00-0,04% (p/v) tratadas con disolución de DNS de manera equivalente.

La absorbancia observada de la reacción enzimática se corrigió para la absorbancia no específica llevando a cabo una reacción en la que se añadió la disolución de DNS a la mezcla antes de la disolución enzimática. Una unidad de actividad de celulasa se define como la cantidad de enzima que produce 1 \mumol de equivalentes.min^{-1} de glucosa en las condiciones del ensayo (50ºC y pH 5,0 u otro pH).

1.2 Celobiohidrolasa mediante el método de \beta-D-celobiopiranósido de p-nitrofenilo

El ensayo de celobiohidrolasa se basa en la hidrólisis enzimática de \beta-D-celobiopiranósido de p-nitrofenilo. Como producto de la reacción, el p-nitrofenol se determina colorimétricamente.

Una disolución que contiene 1 ml de una disolución al 0,1% (p/v) de \beta-D-celobiopiranósido de p-nitrofenilo en agua destilada; 1 ml de agua destilada; 1 ml de tampón de acetato de sodio 0,2 M, pH 5,0; 1 ml de disolución enzimática apropiadamente diluida se incubó a 50ºC durante 30 minutos. La reacción enzimática se detuvo por adición de 4 ml de disolución de glicina 0,4 M. La disolución se mezcló y se enfrió hasta 20ºC. La absorbancia se midió a 400 nM usando una cubeta de vidrio de 1 cm de longitud de recorrido.

El resultado se convirtió en \mumoles de p-nitrofenol mediante comparación con el coeficiente de extinción molar de p-nitrofenol en estas condiciones.

La absorbancia observada de la reacción enzimática se corrige para la absorbancia no específica llevando a cabo una reacción en la que se añade la disolución de glicina a la mezcla antes de la disolución enzimática. Una unidad de actividad de celobiohidrolasa se define como la cantidad de enzima que produce 1 \mumol de p-nitrofenol a partir de \beta-D-celobiopiranósido de p-nitrofenilo por minuto en las condiciones del ensayo (50ºC y pH 5,0).

1.3\beta-Glucosidasa mediante el método de \beta-D-glucopiranósido de p-nitrofenilo

El ensayo de \beta-glucosidasa se basa en la hidrólisis enzimática de \beta-D-glucopiranósido de p-nitrofenilo. Un producto de la reacción, p-nitrofenol se determina colorimétricamente.

Una disolución que contiene 1 ml de una disolución al 0,1% (p/v) de \beta-D-glucopiranósido de p-nitrofenilo en agua destilada; 1 ml de agua destilada; 1 ml de tampón de acetato de sodio 0,2 M, pH 5,0; 1 ml de disolución enzimática apropiadamente diluida se incubó a 50ºC durante 30 minutos. La reacción enzimática se detuvo por adición de 4 ml de disolución de glicina 0,4 M. La disolución se mezcló y se enfrió hasta 20ºC. La absorbancia se midió a 400 nM usando una cubeta de vidrio de 1 cm de longitud de recorrido.

El resultado se convirtió en \mumoles de p-nitrofenol mediante comparación con el coeficiente de extinción molar de p-nitrofenol en estas condiciones.

La absorbancia observada de la reacción enzimática se corrige para la absorbancia no específica llevando a cabo una reacción en la que se añade la disolución de glicina a la mezcla antes de la disolución enzimática. Una unidad de actividad de \beta-glucosidasa se define como la cantidad de enzima que produce 1 \mumol de p-nitrofenol a partir de \beta-D-glucopiranósido de p-nitrofenilo por minuto en las condiciones del ensayo (50ºC y pH 5,0).

1.4 Endo-1,3(4)-\beta-glucanasa mediante el método de \beta-glucano de cebada en DNS

Un ensayo para determinar la actividad de endo-1,3(4)-\beta-glucanasa se basa en la hidrólisis enzimática de los enlaces glucosídicos en \beta-glucano de cebada, un \beta-1,3(4)-glucano. Los productos de la reacción, oligosacáridos de \beta-1,3(4)-glucano, se determinan mediante el incremento resultante del valor reductor (como glucosa).

Una disolución que contiene 1 ml de una disolución de \beta-glucano de cebada al 1% (p/v) en tampón de acetato de sodio 0,1 M, pH 5,0 (o a diferentes valores de pH) y 1 ml de disolución enzimática apropiadamente diluida se incubó a 50ºC durante 10 minutos. La reacción enzimática se detuvo mediante adición de 2 ml de una disolución de DNS (1% (p/v) de ácido 3,5-dinitrosalicílico, 1,6% (p/v) de hidróxido sódico, 30% (p/v) de (+)-tartrato sódico potásico, en agua destilada). La disolución se mezcló y se colocó en un baño de agua hirviendo, 95ºC mínimo, durante 5 minutos, y después se enfrió hasta 25ºC. Se añadieron 10 ml de agua destilada a la disolución, y la absorbancia se midió a 540 nm usando una cubeta de vidrio de 2 cm de longitud de recorrido.

El resultado se convirtió en \mumoles de azúcar reductor (como glucosa) mediante comparación con una curva patrón para 2 ml de disoluciones de glucosa 0,00-0,04% (p/v) tratadas con disolución de DNS de manera equivalente.

La absorbancia observada de la reacción enzimática se corrigió para la absorbancia no específica llevando a cabo una reacción en la que se añadió la disolución de DNS a la mezcla antes de la disolución enzimática. Una unidad de actividad de endo-1,3(4)-\beta-glucanasa se define como la cantidad de enzima que produce 1 \mumol de equivalentes.min^{-1} de glucosa en las condiciones del ensayo (50ºC y pH 5,0 u otro pH).

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1.5 Endo-1,3(4)-\beta-glucanasa mediante el método de azo-\beta-glucano de cebada

Un ensayo para determinar la actividad de endo-1,3(4)-\beta-glucanasa se basa en la hidrólisis enzimática de un \beta-glucano de cebada que tiene un cromóforo unido (azo-\beta-glucano de cebada). Los productos de la reacción, oligómeros que son solubles tras la precipitación con etanol, se determinan mediante el incremento resultante de la absorbancia a 590 nm.

Una disolución que contiene 0,5 ml de sustrato azo-\beta-glucano de cebada (forma lista para usar) y 0,2 ml de dilución enzimática (que contiene entre 0,15 y 0,60 unidades.ml^{-1} en tampón de acetato de sodio 0,01 M, pH 4,0) se incubó a 30ºC durante 20 minutos exactamente. La reacción enzimática se detuvo mediante adición de 2,5 ml de disolución de Disolución de Precipitación (que contiene 18,1 g de acetato de sodio y 3,0 g de cinc mezclado en 300 ml de agua destilada en vidrio, pH ajustado a pH 5,0 con ácido clorhídrico, los contenidos se transfieren a un matraz volumétrico de 1 l y se completan hasta el volumen con etanol al 96% v/v). La disolución se mezcló y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos. La disolución se transfirió a un tubo de centrifugadora y se centrifugó a 1000 g durante 10 minutos en una centrifugadora de laboratorio. La absorbancia del sobrenadante se midió a 590 nm usando una cubeta de vidrio de 1 cm de longitud de recorrido.

La absorbancia observada de la reacción enzimática se corrigió para la absorbancia no específica llevando a cabo una reacción en la que la Disolución de Precipitación se añadió a la mezcla antes de la disolución enzimática. Una unidad de actividad de endo-1,3(4)-\beta-glucanasa se define como la cantidad de enzima que hidroliza el sustrato para dar una absorbancia de 0,820 unidades a 590 nm, usando un sustrato patrón, en las condiciones del ensayo (30ºC y pH 4,6).

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1.6. Laminarinasa (endo-1,3-\beta-glucanasa) mediante el método de laminarina en DNS

El ensayo para determinar la actividad de laminarinasa (endo-1,3(4)-\beta-glucanasa) se basa en la hidrólisis enzimática de los enlaces glucosídicos en laminarina, un \beta-1,3-glucano. Los productos de la reacción, oligosacáridos de \beta-1,3-glucano, se determinan mediante el incremento resultante del valor reductor (como glucosa).

Una disolución que contiene 1 ml de una disolución de laminarina al 1% (p/v) en tampón de acetato de sodio 0,1 M, pH 5,0 y 1 ml de disolución enzimática apropiadamente diluida se incubó a 50ºC durante 10 minutos. La reacción enzimática se detuvo mediante adición de 2 ml de una disolución de DNS (1% (p/v) de ácido 3,5-dinitrosalicílico, 1,6% (p/v) de hidróxido sódico, 30% (p/v) de (+)-tartrato sódico potásico, en agua destilada). La disolución se mezcló y se colocó en un baño de agua hirviendo, 95ºC mínimo, durante 5 minutos, y después se enfrió hasta 25ºC. Se añadieron 10 ml de agua destilada a la disolución, y la absorbancia se midió a 540 nm usando una cubeta de vidrio de 2 cm de longitud de recorrido.

El resultado se convirtió en \mumoles de azúcar reductor (como glucosa) mediante comparación con una curva patrón para 2 ml de disoluciones de glucosa 0,00-0,04% (p/v) tratadas con disolución de DNS de manera equivalente.

La absorbancia observada de la reacción enzimática se corrigió para la absorbancia no específica llevando a cabo una reacción en la que la disolución de DNS se añadió a la mezcla antes de la disolución enzimática. Una unidad de actividad de laminarinasa se define como la cantidad de enzima que produce 1 \mumol de equivalentes.min^{-1} de glucosa en las condiciones del ensayo (50ºC y pH 5,0).

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1.7. Endo-1,4-\beta-xilanasa mediante el método de xilano de madera de abedul en DNS

Un ensayo para determinar la actividad de endo-1,4-\beta-xilanasa se basa en la hidrólisis enzimática de los enlaces xilosídicos en xilano de madera de abedul, un \beta-1,4-xilano. Los productos de la reacción, oligosacáridos de \beta-1,4-xilano, se determinan mediante el incremento resultante del valor reductor (como xilosa).

Una disolución que contiene 1 ml de una disolución de xilano de madera de abedul al 1% (p/v) en tampón de acetato de sodio 0,1 M, pH 5,0 (o a valores de pH diferentes) y 1 ml de disolución enzimática apropiadamente diluida se incubó a 50ºC durante 10 minutos. La reacción enzimática se detuvo mediante adición de 2 ml de una disolución de DNS (1% (p/v) de ácido 3,5-dinitrosalicílico, 1,6% (p/v) de hidróxido sódico, 30% (p/v) de (+)-tartrato sódico potásico, en agua destilada). La disolución se mezcló y se colocó en un baño de agua hirviendo, 95ºC mínimo, durante 5 minutos, y después se enfrió hasta 25ºC. Se añadieron 10 ml de agua destilada a la disolución, y la absorbancia se midió a 540 nm usando una cubeta de vidrio de 2 cm de longitud de recorrido.

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El resultado se convirtió en \mumoles de azúcar reductor (como xilosa) mediante comparación con una curva patrón para 2 ml de disoluciones de xilosa 0,00-0,03% (p/v) tratadas con disolución de DNS de manera equivalente.

La absorbancia observada de la reacción enzimática se corrigió para la absorbancia no específica llevando a cabo una reacción en la que la disolución de DNS se añadió a la mezcla antes de la disolución enzimática. Una unidad de actividad de endo-1,4-\beta-xilanasa se define como la cantidad de enzima que produce 1 \mumol de equivalentes.min^{-1} de xilosa en las condiciones del ensayo (50ºC y pH 5,0 u otro pH).

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1.8. Endo-1,4-\beta-xilanasa mediante el método de arabinoxilano de trigo en DNS

Un ensayo para determinar la actividad de endo-1,4-\beta-xilanasa se basa en la hidrólisis enzimática de los enlaces xilosídicos en arabinoxilano de trigo, un \beta-1,4-xilano sustituido de arabinosa. Los productos de la reacción, oligosacáridos de arabino-\beta-1,4-xilano, se determinan mediante el incremento resultante del valor reductor (como xilosa).

Una disolución que contiene 1 ml de una disolución de arabinoxilano de trigo al 1% (p/v) en tampón de acetato de sodio 0,1 M, pH 5,0 (o a valores de pH diferentes) y 1 ml de disolución enzimática apropiadamente diluida se incubó a 50ºC durante 10 minutos. La reacción enzimática se detuvo mediante adición de 2 ml de una disolución de DNS (1% (p/v) de ácido 3,5-dinitrosalicílico, 1,6% (p/v) de hidróxido sódico, 30% (p/v) de (+)-tartrato sódico potásico, en agua destilada). La disolución se mezcló y se colocó en un baño de agua hirviendo, 95ºC mínimo, durante 5 minutos, y después se enfrió hasta 25ºC. Se añadieron 10 ml de agua destilada a la disolución, y la absorbancia se midió a 540 nm usando una cubeta de vidrio de 2 cm de longitud de recorrido.

El resultado se convirtió en \mumoles de azúcar reductor (como xilosa) mediante comparación con una curva patrón para 2 ml de disoluciones de xilosa 0,00-0,03% (p/v) tratadas con disolución de DNS de manera equivalente.

La absorbancia observada de la reacción enzimática se corrigió para la absorbancia no específica llevando a cabo una reacción en la que la disolución de DNS se añadió a la mezcla antes de la disolución enzimática. Una unidad de actividad de endo-1,4-\beta-xilanasa se define como la cantidad de enzima que produce 1 \mumol de equivalentes.min^{-1} de xilosa en las condiciones del ensayo (50ºC y pH 5,0 u otro pH).

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1.9 Endo-1,4-\beta-xilanasa mediante el método de araboxilano de trigo viscométrico

Un ensayo para la actividad de endo-1,4-\beta-xilanasa se basa en la hidrólisis enzimática de una disolución patrón de arabinoxilano de trigo, determinándose la actividad mediante la reducción de la viscosidad relativa frente al tiempo.

Una disolución que contiene 1 ml de una disolución de arabinoxilano de trigo al 1% (p/v) en tampón de acetato de sodio 0,1 M, pH 5,5 (o a diferentes valores de pH), 3 ml de agua destilada y 1 ml de disolución enzimática apropiadamente diluida se inyectó en un microviscómetro de Haake (usando una bola de oro calibrada a 0,1-2,0 mPa.s), y se midió el tiempo de la caída de bola (T_{ensayo}) (en ms durante la longitud de la caída definida) cada 30 segundos a lo largo de un período de 15-20 minutos a 30ºC. Los tiempos medios de caída de la bola se midieron para agua (5 ml de agua destilada) y sustrato (1 ml de una disolución de arabinoxilano de trigo al 1% (p/v) en tampón de acetato de sodio 0,1 M, pH 5,5 y 4 ml de agua destilada) como T_{agua} y T_{sustrato}, respectivamente. Los controles se midieron de manera equivalente. La fluidez relativa (F_{r}) se calculó para cada valor de T_{ensayo} según lo siguiente:

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La pendiente de una gráfica de F_{r} frente al tiempo (el tiempo transcurrido en el que se realiza cada medida de T_{ensayo}) se calcula en cambio de fluidez relativa por minuto (\DeltaFr.min^{-1}), y es proporcional a la concentración enzimática. Una unidad de actividad de endo-1,4-\beta-xilanasa se define como la cantidad de enzima que hidrolizará el sustrato, reduciendo la viscosidad de la disolución, para dar un cambio en la fluidez relativa de 1 (unidad adimensional).min^{-1} en las condiciones del ensayo (30ºC y pH 5,5 u otro pH).

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1.10\beta-xilosidasa mediante el método de \beta-D-xilopiranósido de p-nitrofenilo

El ensayo de \beta-xilosidasa se basa en la hidrólisis enzimática de \beta-D-xilopiranósido de p-nitrofenilo. Un producto de la reacción, p-nitrofenol se determina colorimétricamente.

Una disolución que contiene 1 ml de \beta-D-xilopiranósido de p-nitrofenilo al 0,1% (p/v) en agua destilada; 1 ml de agua destilada; 1 ml de tampón de acetato de sodio 0,2 M, pH 5,0; 1 ml de disolución enzimática apropiadamente diluida se incubó a 50ºC durante 30 minutos. La reacción enzimática se detuvo mediante adición de 4 ml de disolución 0,4 M de glicina. La disolución se mezcló y se enfrió hasta 20ºC. La absorbancia se midió a 400 nM usando una cubeta de vidrio de 1 cm de longitud de recorrido.

Los resultados se convirtieron en \mumoles de p-nitrofenol mediante comparación con el coeficiente de extinción molar de p-nitrofenol en estas condiciones.

La absorbancia observada de la reacción enzimática se corrige para la absorbancia no específica llevando a cabo una reacción en la que la disolución de glicina se añade a la mezcla antes de la disolución enzimática. Una unidad de actividad de xilosidasa se define como la cantidad de enzima que produce 1 \mumol de p-nitrofenol a partir de \beta-D-xilopiranósido de p-nitrofenilo por minuto en las condiciones del ensayo (50ºC y pH 5,0).

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1.11\alpha-N-Arabinofuranosidasa mediante el método de \alpha-L-arabinofuranósido de p-nitrofenilo

El ensayo de \alpha-N-arabinofuranosidasa (arabinofuranosidasa) se basa en la hidrólisis enzimática de \alpha-L-arabinofuranósido de p-nitrofenilo. Un producto de la reacción, p-nitrofenol se determina colorimétricamente.

Una disolución que contiene 1 ml de \alpha-L-arabinofuranósido de p-nitrofenilo al 0,1% (p/v) en agua destilada; 1 ml de agua destilada; 1 ml de tampón de acetato de sodio 0,2 M, pH 5,0; 1 ml de disolución enzimática apropiadamente diluida se incubó a 50ºC durante 30 minutos. La reacción enzimática se detuvo mediante adición de 4 ml de disolución 0,4 M de glicina. La disolución se mezcló y se enfrió hasta 20ºC. La absorbancia se midió a 400 nM usando una cubeta de vidrio de 1 cm de longitud de recorrido.

Los resultados se convirtieron en \mumoles de p-nitrofenol mediante comparación con el coeficiente de extinción molar de p-nitrofenol en estas condiciones.

La absorbancia observada de la reacción enzimática se corrige para la absorbancia no específica llevando a cabo una reacción en la que la disolución de glicina se añade a la mezcla antes de la disolución enzimática. Una unidad de actividad de arabinofuranosidasa se define como la cantidad de enzima que produce 1 \mumol de p-nitrofenol a partir de \alpha-L-arabinofuranósido de p-nitrofenilo por minuto en las condiciones del ensayo (50ºC y pH 5,0).

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1.12 Feruloil esterasa mediante el método de FAXX

Un ensayo de feruloil esterasa (esterasa del ácido ferúlico) se basa en la hidrólisis enzimática de O-[5-O-(trans-feruloi1)-\alpha-L-arabinofuranosil]-(1\rightarrow3)-O-\beta-D-xilopiranosil-(1\rightarrow4)-D-xilopiranosa (FAXX). FAXX se prepara a partir de salvado de trigo hidrolizado con enzimas, se purifica y se caracteriza mediante RMN. La hidrólisis de FAXX se mide espectrofotométricamente.

La reacción enzimática es seguida a 325 nm, usando una cubeta de 1 cm de longitud de recorrido, en disolución que contiene 0,050 mM de FAXX en tampón MOPS 0,1 M, pH 6,0 a 37ºC.

Una unidad de actividad de feruloil esterasa en FAXX se define como la cantidad de enzima que convierte 1 \mumol de sustrato en producto por minuto en las condiciones del ensayo (37ºC y pH 6,0).

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1.13 Feruloil esterasa mediante el método de Ara_{2}F

Un ensayo de feruloil esterasa (esterasa del ácido ferúlico) se basa en la hidrólisis enzimática de Ara_{2}F (ácido ferúlico enlazado 1,2 a arabinosa). Ara_{2}F se prepara a partir de pulpa de remolacha de azúcar hidrolizada con enzimas, se purifica y se caracteriza mediante RMN. La hidrólisis de Ara_{2}F se mide espectrofotométricamente.

La reacción enzimática es seguida a 325 nm, usando una cubeta de 1 cm de longitud de recorrido, en disolución que contiene 0,050 mM de Ara_{2}F en tampón MOPS 0,1 M, pH 6,0 a 37ºC.

Una unidad de actividad de feruloil esterasa en Ara_{2}F se define como la cantidad de enzima que convierte 1 \mumol de sustrato en producto por minuto en las condiciones del ensayo (37ºC y pH 6,0).

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1.14 Feruloil esterasa mediante la hidrólisis de ésteres metílicos: métodos del ácido metilferúlico (MFA); ácido metilcafeico (MCA); ácido metilsináptico (MSA); ácido metil p-cumárico (MpCA)

Un ensayo de feruloil esterasa (esterasa del ácido ferúlico) se basa en la hidrólisis enzimática de ésteres metílicos del ácido ferúlico (MFA), ácido cafeico (MCA), ácido sináptico (MSA) y ácido p-cumárico (MpCA). La hidrólisis del éster metílico se mide en tampón MOPS 0,1 M, pH 6,0 a 37ºC. Los ensayos se basan en dos técnicas diferentes.

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En el método espectrofotométrico, la concentración de sustrato de éster metílico es 0,10 mM, y la hidrólisis del éster es seguida a 325 nM usando una cubeta de 1 cm de longitud de recorrido. En este método, la concentración de sustrato inicial está limitada.

En el método mediante HPLC, la concentración del sustrato de éster metílico es 1,0 mM, y la hidrólisis del éster es seguida midiendo la liberación de ácido libre mediante HPLC tras intervalos de 10-30 minutos. En este método, no hay ningún límite de la concentración del sustrato, y las actividades medidas son considerablemente mayores que aquellas para el método espectrofotométrico.

Una unidad de actividad de feruloil esterasa se define como la cantidad de enzima que convierte 1 \mumol de sustrato en producto por minuto en las condiciones del ensayo (37ºC y pH 6,0).

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1.15 Concentración proteínica mediante ensayo de Bradford modificado de proteína que se une a azul de Coomassie

El ensayo de la concentración proteínica se basa en el ensayo de Bradford modificado de proteína que se une a azul de Coomassie usando Azul Brillante G (azul de Coomassie) medido en un espectrofotómetro a 595 nm usando cubetas de vidrio de 1 cm de recorrido de luz. El método (Sigma B 6916) está estandarizado usando seroalbúmina bovina (Sigma P 0914).

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1.16 Punto isoeléctrico mediante enfoque isoeléctrico

Los puntos isoeléctricos de las proteínas se determinan mediante métodos estándar usando geles de poliacrilamida al 5% verticales premoldeados, tales como geles de NOVEX® para pH 3-10 (intervalo de comportamiento de pI 3,5-8,5) o pH 3-7 (intervalo de comportamiento de pI 3,0-6,5) en la minicubeta NOVEX® XCell II^{TM}. Se usan el cátodo y ánodo de NOVEX® y tampones de muestra de IEF para pH 3-10 o pH 3-7. Se usa el protocolo estándar de NOVEX® para el enfoque isoeléctrico, la fijación, la tinción con tinción con azul de Coomassie R-250, y eliminación de la tinción.

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1.17 SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio)

La separación analítica y la determinación de pesos moleculares de las proteínas se llevan a cabo mediante métodos estándar de SDS-PAGE. Se usan geles premoldeados NOVEX® NuPAGE^{TM} (geles de bis-tris NuPAGE^{TM} o geles de tris-acetato NuPAGE^{TM} con los tampones del experimento recomendados por NOVEX®) en la minicubeta NOVEX® XCell II^{TM}. Se usa la preparación de muestras de NOVEX® y los tampones del experimento, y patrones de peso molecular. Se usa el protocolo estándar de NOVEX® para SDS-PAGE, la fijación, la tinción con tinción con azul de Coomassie R-250, y eliminación de la tinción.

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2. Resultados en la mezcla de enzimas 2.1. pH óptimo 2.1.1. Actividad de endo-1,3(4)-\beta-glucanasa

El ensayo de endo-1,3(4)-\beta-glucanasa de Penicillium funiculosum se llevó a cabo en condiciones estándar a 50ºC usando el método de \beta-glucano de cebada en DNS. La actividad enzimática se midió entre pH 3,0 y pH 7,0. El pH óptimo para la actividad enzimática es pH 4,0-5,0.

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2.1.2. Actividad de endo-1,4-\beta-xilanasa

El ensayo de endo-1,4-\beta-xilanasa de Penicillium funiculosum se llevó a cabo en condiciones estándar a 50ºC usando el método de xilano de madera de abedul en DNS.

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2.2. Temperatura óptima 2.2.1. Actividad de endo-1,3(4)-\beta-glucanasa

El ensayo de endo-1,3(4)-\beta-glucanasa de Penicillium funiculosum se llevó a cabo en condiciones estándar a pH 5,0 (el pH óptimo para esta enzima) usando el método de \beta-glucano de cebada en DNS. La actividad enzimática se midió entre 30 y 70ºC. La temperatura óptima está entre 50 y 60ºC, midiéndose la actividad más elevada a 60ºC. Los resultados se dan con detalle en forma de una tabla frente a la temperatura.

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2.2.2. Actividad de endo-1,4-\beta-xilanasa

El ensayo de endo-1,4-\beta-xilanasa de Penicillium funiculosum se llevó a cabo en condiciones estándar a pH 5,5 y pH 3,5 usando el método de xilano de madera de abedul en DNS. La actividad enzimática se midió entre 30 y 70ºC. La temperatura óptima está entre 50 y 60ºC, midiéndose la actividad más elevada a 50ºC para pH 5,5, y a 60ºC para pH 3,5. Los resultados se dan con detalle en forma de una tabla frente a la temperatura.

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Las enzimas producidas mediante Penicillium funiculosum tienen niveles elevados de actividades de celulasa, de endo-1,3(4)-\beta-glucanasa y de otras actividades glucanolíticas. Además, también se caracterizan por niveles elevados de actividades de endo-1,4-\beta-xilanasa y de enzimas accesorias de xilanasa. El amplio espectro de enzimas hemicelulolíticas es una característica de las preparaciones enzimáticas de este microorganismo.

Cada actividad medida se da como una relación con respecto a la actividad principal para esa preparación. En la tabla A se muestra un ejemplo de los resultados obtenidos. Estas relaciones pueden cambiar en preparaciones procedentes de diferentes lotes de fermentación.

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TABLA A Actividades relativas frente a sustratos diferentes relevantes

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3. Propiedades de componentes en la mezcla enzimática 3.1. Métodos de purificación Cromatografía de interacción hidrófoba

La preparación obtenida tras la filtración y concentración del medio de fermentación, hasta una concentración de proteína de 112,6 mg/ml, se diluyó 1/1 con tampón de Cromatografía de Interacción Hidrófoba (HIC) (tampón de fosfato 50 mM, pH 7,0/1,7 M de (NH_{4})_{2}SO_{4}/0,04% de azida sódica), intercambiado en tampón de HIC (columnas PD-10; Pharmacia). Se aplicaron porciones (10 ml) a una columna (10 x 5 cm de diámetro, 200 ml) de gel de HIC de altas prestaciones PhenylSepharose^{TM} (Pharmacia), y se separaron usando un gradiente de concentración de sulfato de amonio ((NH_{4})_{2}SO_{4}) reductor (1,7-0,0 M) a 10 ml/min. Las fracciones (10 ml) se recogieron y se evaluaron para determinar la actividad de xilanasa.

HIC dio dos picos principales de actividad de xilanasa. El primero, denominado A, eluyó de la columna cuando la concentración de (NH_{4})_{2}SO_{4} se redujo hasta aproximadamente 0,6 M, mientras que el segundo, denominado B, eluyó a una concentración de (NH_{4})_{2}SO_{4} de aproximadamente 0,25 M. Las fracciones que comprenden los picos A y B de cada inyección se reunieron separadamente. En total, la fracción A correspondió a 2,8% de la actividad total de xilanasa, mientras que la fracción B correspondió a 97,2% de la actividad total de xilanasa. El rendimiento fue 77%.

Cromatografía de intercambio iónico

Las fracciones reunidas para el pico A y B procedentes de HIC se hicieron precipitar incrementando la concentración de (NH_{4})_{2}SO_{4} hasta una saturación de 100%, seguido de centrifugación (10.000 xg durante 30 minutos). Los peletes se redisolvieron en tampón de Tris-HCl 20 mM, pH 8,0/0,04% de azida sódica, y se desalaron hasta el mismo tampón usando columnas PD-10. Se aplicaron muestras (5 ml) a una columna de intercambio aniónico MonoQ^{TM} HR 10/10 (Pharmacia) previamente equilibrada con tampón de Tris-HCI 20 mM, pH 8,0/0,04% de azida sódica, y se eluyeron hasta 2 ml/min con concentración creciente de cloruro de sodio (NaCl (0-1 M)) en el mismo tampón. Las fracciones (2 ml) se recogieron y se ensayaron para determinar la actividad de xilanasa.

Pico A:

La separación del pico A mediante cromatografía de intercambio aniónico dio un único pico de actividad de xilanasa que eluyó a aproximadamente 0,3 M de NaCl. Las fracciones más activas se reunieron y se analizaron mediante SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio). Esto mostró una única banda principal de peso molecular 48 kDa. La recuperación de la actividad de xilanasa tras IEF (enfoque isoeléctrico) confirmó que esta banda principal teñida con Coomassie era una xilanasa.

Pico B:

La separación del pico B mediante cromatografía de intercambio aniónico dio dos picos principales de actividad de xilanasa, uno de los cuales eluyó en vacío (material no unido; pico B-I) y el otro a 0,1 M de NaCl (pico B-II). También hubo dos picos minoritarios que eluyen a 0,13 M y 0,19 M de NaCl. Las fracciones activas que corresponden a cada pico se reunieron y se analizaron mediante SDS-PAGE, pero ninguna de las muestras fue pura.

Cromatografía de filtración en gel

Las fracciones reunidas que comprenden B-I y B-II se liofilizaron, se redisolvieron en agua, y se desalaron (usando columnas PD-10). Se aplicaron muestras (0,2 ml) a una columna Superdex^{TM} 75 HR (Pharmacia) y se eluyeron a 0,4 ml/minuto con tampón de Bis-Tris 20 mM, pH 6,0/0,2 M de NaCl/0,04% de azida sódica. Las fracciones (0,4 ml) se recogieron y se ensayaron para determinar la actividad de xilanasa.

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3.2. Propiedades de xilanasas 3.2.1. Punto isoeléctrico mediante enfoque isoeléctrico

Los puntos isoeléctricos de las proteínas se determinan mediante métodos estándar usando geles de poliacrilamida al 5% verticales premoldeados de NOVEX® para pH 3-10 y pH 3-7. Se usa el cátodo, ánodo y tampones de muestra de IEF de NOVEX®, y un protocolo estándar para el enfoque isoeléctrico, fijando y tiñendo con tinción con azul de Coomassie R-250 y destiñendo.

Para xilanasa A, se usó una muestra tras MonoQ. Para las xilanasas B-I y B-II, se usó una muestra tras HIC, xilanasa B. Para cada uno de A y B, se cargó una pequeña muestra (10 \mul) en un pocillo individual, y se cargó una gran muestra (50 \mul) en un pocillo triple. Tras enfocar las muestras, el gel se cortó a la mitad, de forma que una mitad contenía las dos muestras pequeñas (A+B) y los marcadores de pesos moleculares (esa mitad se tiñó con Coomassie), mientras que la otra mitad contenía las dos muestras grandes. La mitad del gel que contiene las muestras grandes se cortó para separar las dos líneas de muestras, y subsiguientemente cada línea se fraccionó en trozos de 2 mm. Cada trozo de 2 mm se empapó separadamente toda la noche en tampón MOPS 100 mM, pH 6,0/0,04% de azida sódica. Las fracciones se ensayaron para determinar la actividad de xilanasa.

Para la muestra A de xilanasa, el gel de IEF teñido mostró una única banda principal de marcador de pI 3,55, y unas pocas bandas minoritarias contaminantes. La actividad de xilanasa se encontró sólo en la fracción que corresponde a esta banda, confirmando la banda principal de xilanasa.

Para la muestra B de xilanasa, el gel de IEF teñido indica varias bandas a lo largo de un intervalo de valores de pI. La actividad de xilanasa apareció en dos fracciones separadas del gel sin teñir, y corresponden a las proteínas de pI 4,2 y 4,8.

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3.2.2. Peso molecular mediante SDS-PAGE

Para confirmar los pesos moleculares de xilanasas en el pico B de HIC, las fracciones con actividad de xilanasa eluídas del gel de IEF se desalaron, se liofilizaron, y se separaron mediante SDS-PAGE. Se llevó a cabo PAGE desnaturalizante usando geles de Tris-glicina al 10% (NOVEX®) con ditiotreitol (DTT 50 mM) incluido en el tampón de muestra como agente reductor.

El gel teñido indicó que ambas xilanasas eran puras, con pesos moleculares de 36 kDa y 15 kDa para xilanasa B-I y xilanasa B-II, respectivamente.

Las tres xilanasas purificadas se sometieron a análisis de SDS-PGE: la fracción de xilanasa A tras cromatografía de intercambio aniónico, las fracciones de xilanasa B-I y B-II tras la cromatografía de filtración en gel. La xilanasa A dio una única banda de peso molecular 48 kDa. La xilanasa B-I dio una banda principal y cuatro bandas minoritarias tras la tinción con Coomassie. La banda principal se confirmó como la xilanasa, puesto que tenía un peso molecular de 36 kDa. Se estimó que la pureza era 90%. La xilanasa B-II dio una banda principal de peso molecular 15 kDa, y 2-3 bandas minoritarias. Esta xilanasa tenía una pureza de aproximadamente 95%.

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3.2.3. Actividad enzimática

Los ensayos para la medida de la actividad enzimática se describen previamente.

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3.2.3.1. Análisis de xilanasa A

[Proteína] 0,4 (mg/ml)

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Actividad de xilanasa en xilano de madera de abedul frente a pH

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3.2.3.2 Análisis de xilanasa B-I

[Proteína] 0,096 (mg/ml)

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Actividad de xilanasa en xilano de madera de abedul frente a pH

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3.2.3.3 Análisis de xilanasa B-II

[Proteína] 0,165 (mg/ml)

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Actividad de xilanasa en xilano de madera de abedul frente a pH

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3.2.4 Secuencias

Se describen aquí las secuencias de aminoácidos y de ácido nucleico de las proteínas descritas anteriormente o sus variantes.

Para esto, las secuencias para xilanasas se identificaron a partir de secuencias de aminoácidos de proteínas purificadas (xilanasa A, xilanasa B-I y xilanasa B-II) y a partir de comparaciones de secuencias de aminoácidos y nucleotídicas de xilanasas fúngicas conocidas.

Se entiende que estas variantes se refieren a cualquier polipéptido o a cualquier análogo proteínico, fragmento proteínico, proteína derivada o mutada, de la proteína o polipéptido natural, y que tienen las mismas funciones biológicas que dicha proteína o polipéptido natural. Las diferentes variantes pueden existir en estado natural. Esas variantes pueden ser, por ejemplo, variaciones alélicas caracterizadas por diferencias en la secuencia de genes que codifican la mencionada proteína, o pueden resultar de corte y empalme diferencial o de modificaciones postraduccionales. Las variantes son obtenibles mediante sustitución, supresión, adición y/o modificación de uno o más aminoácidos. Todas las modificaciones son bien conocidas, y se pueden llevar a cabo mediante cualquier método conocido por un experto en la materia.

Las variantes son moléculas que tienen por ejemplo más afinidad por su sustrato, o que tienen nuevas propiedades biológicas.

También se describe aquí el uso de las secuencias para la expresión de las proteínas o polipéptidos descritos en células hospedantes de organismos uni- o pluricelulares. Para este fin, dichas secuencias pueden estar comprendidas en el genoma de un vector. El mencionado vector puede ser un plásmido, un fago o un virus. Por tanto, otra realización de la invención es una célula hospedante aislada procedente de un organismo uni- o pluricelular, transfectada o infectada mediante un vector como se describe anteriormente. En un ejemplo preferido, la célula hospedante es una bacteria.

El uso de dichos vectores que comprenden la secuencia de ácido nucleico de las proteínas descritas para la expresión de dicha proteína en cualquier célula hospedante es otro aspecto descrito aquí.

3.2.4.1 Secuencias de xilanasa C

La producción de sondas se basó en comparaciones de secuencias de aminoácidos y nucleotídicas de xilanasas fúngicas conocidas. Las regiones conservadas se identificaron y se usaron para diseñar cebadores de PCR, cuyos productos se usarían para identificar una genoteca de Penicillium funiculosum.

Se obtuvieron dos pares de cebadores degenerados. El primer par se diseñó para amplificar un producto de 200 pb (aproximado) procedente de un gen de xilanasa tipo B (o tipo 2). El segundo par se diseñó para amplificar un producto de 250 pb procedente de un gen de xilanasa de tipo A (o tipo 1).

Se produjo una banda de 258 pb con los cebadores 3 y 4. Después de clonar en pGEMT y secuenciar, se encontró que esta tiene una similitud significativa de secuencia con la xilanasa fúngica tipo A/1. El plásmido que contiene el producto clonado se denominó pPFXYLA.

La secuencia completa de xilanasa C se muestra en la Figura 1 y en SEQ ID nº1.

3.2.4.2 Secuencias de xilanasa BI

Se usó la secuencia interna de aminoácidos, junto con los alineamientos de secuencias de otras celobiohidrolasas fúngicas, para diseñar cebadores de PCR degenerados (SEC ID nº 2 y nº 3). Un producto de 290 pb (SEC ID nº 4) se amplificó y se clonó pGEMT (Promega) para crear pGEMTCB2, y se secuenció. Como se muestra en la Figura 2, se subrayan las secuencias del cebador. Este producto de PCR se está usando actualmente como una sonda para identificar una genoteca de Penicillium funiculosum IMI134756.

3.2.4.3 Secuencias de xilanasa BII

Toda la secuencia del gen de xilanasa BII incluye 1,3 kb de una región no traducida en 5' y en dirección 5', y 0,85 kb de una región no traducida en 3', un intrón de 54 pb y 669 pb que codifican una proteína de 223 aminoácidos.

Se usó PCR en transcripción inversa (RT-PCR) para demostrar la existencia del intrón de 54 pb. Se aisló ARN total de micelios de cultivos de Penicillium funiculosum IMI-134756, se cosecharon después de 4 días de crecimiento en xilano de avena al 1% (p/v). Los cebadores se diseñaron para amplificar un fragmento de hasta 195 pb a partir de ARN mensajero (249 pb a partir de ADN genómico) y hasta 433 pb (487 pb con ADN genómico).

La secuenciación de 3 kb en el extremo 3' del plásmido (pPFXYNC2) reveló un gen (denominado perA) que contiene dos intrones putativos y codifica un polipéptido de aproximadamente 570 aminoácidos. El polipéptido mostró una similitud significativa de secuencia con aminoácido permeasas fúngicas.

3.2.4.4 Secuencia de xilanasa A

Se obtuvo la secuencia interna de xilanasa A, y se representa mediante la siguiente secuencia de aminoácidos:

AEAINYNQDY

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3.3. Propiedades de feruloil esterasas 3.3.1 Purificación

Se llevó a cabo siguiendo el mismo proceso que para las xilanasas.

La mezcla de enzimas contiene por lo menos dos feruloil esterasas distintas. Una de estas (FaeB) tiene un peso molecular de 38.945-41.051 Da mediante espectrometría de masas (35.450 Da de la secuencia de aminoácidos primaria y 37 kDa mediante SDS-PAGE). FaeB tiene un pI de 4,2, es una feruoil esterasa de tipo B y es específica para los sustratos MpCA y Ara_{2}F (actividad frente a MpCA, MCA, MFA y Ara_{2}F; pero no frente a MSA ni FAXX).

La otra feruloil esterasa (FaeA) tiene un peso molecular de 29 kDa (mediante SDS-PAGE). FaeA tiene un pl de 4,65, es una feruloil esterasa de tipo A y es específica para los sustratos FAXX y MSA (actividad frente a MSA, MCA, MFA y FAXX, pero no frente a MpCA ni Ara_{2}F).

3.3.2. Punto isoeléctrico mediante enfoque isoeléctrico

Los puntos isoeléctricos de las proteínas se determinaron mediante los métodos estándar. La mezcla de enzimas se aplicó como una tira ancha (aproximadamente 20 mm) a un gel de IEF y se sometió a electroforesis a temperatura reducida (5ºC). Después de enfocar y de afinar la banda, el gel se cortó por la mitad de la línea de la muestra. Una mitad de la línea de la muestra y los patrones de IEF se fijaron, se tiñeron y se destiñeron usando el protocolo estándar. La línea de la otra mitad se cortó en secciones de 2 mm de ancho, y cada sección se empapó toda la noche en 1 ml de tampón MOPS 100 mM, pH 6,0. La actividad de feruloil esterasa se determinó para cada sección del gel usando como sustratos MFA, MpCA y MSA.

El gel de IEF teñido indica la presencia de muchas proteínas en celulasa con pl que oscilan desde muy ácidos (pl 2,4) hasta aproximadamente pI 7. La mayoría de las proteínas son ácidas (intervalo de pI 2,4-5). Se detectaron dos picos de actividad de feruloil esterasa en fracciones cortadas del gel. Uno, que corresponde a FaeB, tuvo un pl de 4,2 y actividad sólo frente a MFA y MpCA (no MSA). El otro, que corresponde a FaeA, tuvo un pl de 4,65 y actividad frente a los tres sustratos ensayados.

3.3.3 Peso molecular mediante SDS-PAGE

Los pesos moleculares se analizaron mediante SDS-PAGE usando geles de Tris-Glicina al 10%. Los geles de SDS-PAGE se operaron, se fijaron, se tiñeron con Tinción de Azul de Coomassie y se destiñeron usando el protocolo estándar.

La mezcla de enzimas contiene por lo menos dos feruloil esterasas distintas. Una, que corresponde a FaeB (pl 4,2), tiene un peso molecular de 37 kDa. La otra, que corresponde a FaeA (pl 4,65), tiene un peso molecular de 29 kDa.

El peso molecular de FaeB se estima a 34.450 Da a partir de la secuencia de aminoácidos primaria, y a 38.945-41.051 Da mediante espectrometría de masas.

3.3.4 Actividad de feruloil esterasa

Ensayos para determinar la actividad de feruloil esterasa llevados a cabo sobre la mezcla de enzimas usando el método espectrofotométrico

15

La mezcla de enzimas contiene actividad frente a todos los sustratos ensayados. Con los ésteres metílicos, la actividad más elevada es aquella frente a MpCA, y la más baja frente a MSA. Las actividades frente a Ara_{2}F y FAXX son mayores que frente a los ésteres metílicos, lo que indica que las actividades de esterasa son debidas a feruloil esterasas verdaderas, y no a esterasas generales o a actividades secundarias de otras esterasas que degradan la pared celular (por ejemplo, acetil xilano esterasa, pectina esterasa).

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3.3.5 Secuencias 3.3.5.1 Secuencia de FEA-A

De acuerdo con las digestiones con tripsina de la proteína purificada, se obtuvieron secuencias de aminoácidos internas como se muestran a continuación

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Secuencia 1

QYTLTLPSNYNPNK

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Secuencia 2

AVAVMSGANL

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Secuencia 3

TEYSG(C/A)DSEHPVWWIAFDGP

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Secuencia 4

DTFVKDDHCTPTNPPAPAAGSGTHIKYV

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Se diseñaron varios cebadores de PCR degenerados a partir de secuencias de aminoácidos obtenidas a partir de la proteína purificada. Muchos productos se clonaron en pGEMT (Promega) y se secuenciaron.

Se encontró mediante PCR que un plásmido denominado pGEMTD19 (180 pb) (Figura 3) contiene la secuencia que fue reconocible como la secuencia peptídica 4 mostrada más arriba. Como se muestra en la Figura 3, las secuencias de los cebadores se han subrayado doblemente a la secuencia previamente conocida, subrayada una sola vez.

Las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos de FAE-A se describen en SEC ID nº 5.

3.3.5.2 secuencia de FEA-B

Los cebadores diseñados a partir de la secuencia peptídica de FAE-B se usaron para amplificar una sonda, que se usó subsiguientemente para identificar una genoteca de Penicillium funiculosum. Se aisló y se ha secuenciado un clon de 2291 pb (SEQ ID nº 6). El gen codifica un polipéptido de 304 aminoácidos y tiene un intrón putativo. En la Figura 4 se muestra la secuencia de aminoácidos predicha, en la que la proteína madura (longitud de la proteína madura = 338) está en negrita. Esta proteína comprende dos dominios distintos, separados por un ligador muy glucosilado. Como se muestra en la Figura 4, el dominio catalítico está en negrita, mientras que el dominio de unión está doblemente subrayado en negrita, y el ligador está representado en línea negrita discontinua.

La proteína también está caracterizada por un motivo de sitio activo putativo (serina=nucleófilo) como se muestra subrayado en la Figura 4 con las siguientes tríadas catalíticas putativas:

(1) S136/D174/H216

(2) S136/D220/H276.

La proteína de FAE-B también comprende una secuencia de secreción (353) y 10 cisteínas.

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3.4 Propiedades de glucanasas

La mezcla de enzimas se sometió a electroforesis en gel de 2D. Se llevó a cabo un IEF usando geles de poliacrilamida al 5% verticales premoldeados de NOVEX® para pH 3-7 (intervalo de comportamiento del pl 3,0-6,5) en la minicubeta NOVEX® XCell II^{TM} Mini-Cell. Se usaron el cátodo, ánodo y tampones de muestras de IEF para pH 3-7 de NOVEX®, y el protocolo estándar de NOVEX® para el enfoque isoeléctrico. Una línea se cortó y se sometió a electroforesis en la segunda dimensión usando gel de SDS-PAGE de Laemmli al 10%. Se separó una segunda línea del gel, se cortó en 35 fracciones, las tiras de gel se empaparon en tampón, y las fracciones se ensayaron para determinar la actividad enzimática. La tercera línea se dejó en el gel, se fijó, se tiñó con Tinción de Azul de Coomassie R-250 y se destiñó usando el protocolo estándar de NOVEX®.

Se encontraron actividades significativas de endo-1,3(4)-\beta-glucanasa (método de \beta-glucano de cebada en DNS) y celulasa (método de CMC en DNS) en fracciones que corresponden a proteínas con pI 4,2, P.m. 36 kDa y pI 5,4, P.m. 27 kDa. Para eliminar la posibilidad de que la xilanasa B-I sea una de las fracciones, las fracciones se ensayaron para determinar la actividad usando el método de xilano de madera de abedul en DNS. No se detectó actividad de xilanasa en las fracciones correspondientes a las actividades de \beta-glucanasa o celulasa.

Listado de dibujos

Figura 1: Secuencia de aminoácidos de la proteína de xilanasa C de Penicillium funiculosum

Figura 2: Secuencias nucleotídica y de aminoácidos del producto de PCR de xilanasa BI (XynBI)

Figura 3: Secuencias nucleotídica y de aminoácidos del producto de PCR de feruloil esterasa A (faeA)

Figura 4: Secuencia de aminoácidos de la proteína (FAE-V or FAE-I) de feruloil esterasa B (faeB) de Penicillium funiculosum

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E. Usos de mezcla de enzimas para alimentar animales Ejemplo 1 Evaluación de la eficacia de la Preparación de Enzimas producida mediante Penicillium funiculosum sobre el valor energético (AMEN) de una dieta mixta de trigo-cebada en pollos

El objetivo es demostrar la eficacia de las enzimas (actividad de \beta-glucanasa: 100 U.kg^{-1}, y actividad de xilanasa: 1100 U.kg^{-1}) sobre la Energía Metabolizable Aparente corregida para el balance de nitrógeno (AMEN) de una dieta que contiene 50% de trigo y 22% de cebada.

Los experimentos se llevan a cabo sobre una Preparación de Control y de Enzimas (actividad de \beta-glucanasa: 100 U.kg^{-1}, y actividad de xilanasa: 1100 U.kg^{-1}) usando el método de referencia europeo (Bourdillon et al., 1990), con alimentación a voluntad y recogida de excreciones totales entre los 18 y 21 días.

a. Material y Métodos Pájaros: raza y condiciones de crianza

Se crían pollos Ross machos de un día en jaulas en batería colectivas hasta los 12 días. Se les alimenta con una dieta de iniciación para recién nacidos estándar. En el día 12, los pájaros se pesan y se distribuyen por igual en 10 jaulas individuales por tratamiento, y entonces se alimentaron con las dietas experimentales para el periodo de adaptación (mínimo 5 días).

Se aplicaron programas de temperatura y humedad estándar. El programa de luz se mantiene constante, 23 horas de luz y 1 hora de oscuridad hasta el final del ensayo.

Piensos: Los pájaros recibieron una dieta de iniciación para recién nacidos desde el primer día de vida hasta los 12 días, y después los piensos experimentales.

Dietas experimentales

Los piensos contenían 50% de trigo y 22% de cebada (Tabla 1.1). La Preparación de Enzimas se pulverizó sobre 20 kg de migajas.

Las recuperaciones enzimáticas en el pienso se miden mediante el método viscométrico (Sabatier and Fish, 1996).

Medida de la energía metabolizable

El balance comienza el D18 según el siguiente procedimiento:

D 17, los pájaros se dejaron en ayunas toda la noche;

D 18, se pesan los pájaros, se limpian las bandejas de recogida;

D 19, se recogen las heces y se congelan;

D 20, se recogen las heces y se congelan, ayuno toda la noche;

D 20, se recogen las heces y se congelan, se pesan los pájaros y se vuelven a alimentar.

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Las heces se liofilizan entonces y se muelen como pienso (1 mm, trituradora de Retsch). La energía bruta del pienso y de las excreciones se mide en un calorímetro adiabático IKA C5000. También se determinan los contenidos de proteína (N*6.25, método de Kjeldahl Z130) y de lípido (método Z160). Se aplicó la corrección para el balance de nitrógeno usando 18% de proteína en la ganancia de peso.

b. Resultados y discusión Energía Metabolizable Aparente corregida para el balance de nitrógeno (AMEN)

En la Tabla 1.2 se presentan los comportamientos zootécnicos y la Energía Metabolizable. No hubo ninguna diferencia en los comportamientos zootécnicos entre tratamientos.

En pollos en crecimiento, la Preparación de Enzimas mejora la AMEN de una dieta a base de 50% de trigo y 22% de cebada en 6,2% (+ 204 kcal/kg DM (Materia Seca)).

Además, la variabilidad en la digestibilidad de la energía disminuyó de 80 a 62 kcal.kg de DM.

Esta elevada mejora demuestra el interés de ambas actividades (xilanasa y \beta-glucanasa) producidas por Penicillium funiculosum al polisacárido soluble hidrolizado sin almidón de trigo y cebada.

TABLA 1.1 Ingredientes principales y características analizadas de dietas experimentales

16

TABLA 1.2 Efecto de la Preparación de Enzimas producido por Penicillium funiculosum sobre el comportamiento del crecimiento y sobre la energía metabolizable aparente en pollos que reciben una dieta a base de 50% de trigo y 22% de cebada

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Ejemplo 2 Efecto de la Preparación de Enzimas producida por Penicillium funiculosum sobre la digestibilidad de piensos en pollos alimentados con trigo

El ensayo se llevó a cabo para determinar el efecto de la Preparación de Enzimas producida mediante Penicillium funiculosum (actividad de \beta-glucanasa: 100 U.kg^{-1} y actividad de xilanasa: 1100 U.kg^{-1}) sobre la Energía Metabolizable Aparente (AME), sobre las digestibilidades de proteínas y de lípidos en pollos alimentados con una dieta que contiene 54% de trigo. También se investigó la interacción con la molienda.

(1)

Control 1 (54% de trigo molido)

(2)

Control 1 + Preparación de Enzimas (actividad de \beta-glucanasa: 100 U.kg^{-1} y actividad de xilanasa: 1100 U.kg^{-1})

(3)

Control 2 (30% de trigo completo, 24% de trigo molido)

(4)

Control 2 + Preparación de Enzimas (actividad de \beta-glucanasa: 100 U.kg^{-1} y actividad de xilanasa: 1100 U.kg^{-1})

según el método de Referencia Europea (alimentación a voluntad y recogida de excreciones totales desde el día 18 al 21) (Bourdillon et al., 1990).

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a. Material y Métodos Pájaros: raza y condiciones de cría

Se criaron pollitos macho Ross de un día en jaulas en batería colectivas hasta 12 días. Entonces se transfirieron a jaulas en batería individuales para el balance digestivo.

Se aplicaron programas estándar de temperatura y humedad. El programa de luz fue 23 horas de luz y 1 h de oscuridad, hasta 8 días. Entonces se modificó a 15h30 de luz, 8h30 de oscuridad debido a un experimento de ensayo de puesta de huevos en el mismo edificio.

Piensos: los pájaros recibieron una dieta de iniciación para recién nacidos estándar hasta 12 días, y después los piensos experimentales.

Dietas experimentales

Las dietas experimentales contenían 54% de trigo. En la Tabla 2.1 se dan las características. En la Tabla 2.2 se da la composición de la dieta.

Medida de la energía metabolizable aparente

El balance comienza en el Día 17 según el siguiente programa:

D 17, los pájaros ayunan toda la noche;

D 18, se pesa a los pájaros, se limpian las bandejas de recogida;

D 19, se recogen las heces y se congelan;

D 20, se recogen las heces y se congelan, ayuno toda la noche;

D 21, se recogen las heces y se congelan, se pesa a los pájaros y se vuelven a alimentar.

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Las heces se liofilizan entonces y se muelen como pienso (1 mm, trituradora de Retsch). La energía bruta del pienso y de las excreciones se mide en un calorímetro adiabático IKA C5000. También se determinan los contenidos de proteína (N*6.25, método de Kjeldahl Z130 para piensos y Z135 para heces) y de lípido (método Z160).

También se lleva a cabo un perfil de aminoácidos mediante HPLC (método Z100 para piensos y Z080 para heces). El contenido de fósforo de los piensos y de las excreciones se midió usando el método de AFNOR (NFV18-106).

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b. Resultados y discusión Energía Metabolizable Aparente (AME)

En la Tabla 2.3 se presentan los datos de comportamiento del crecimiento y de la energía metabolizable. El comportamiento (ganancia de peso, ingesta de pienso), medido durante el período de tres días, no difirió entre tratamientos. La AME de la dieta de control que contiene 54% de trigo molido fue 3173 kcal/kg. La energía metabolizable de la dieta que contiene la misma cantidad total de trigo, pero de la cual el 30% es grano completo, aumentó en 100 kcal/kg en comparación con el valor teórico. Además, la variabilidad apreciada por la desviación estándar de los diferentes criterios medidos también se redujo con trigo completo.

Las enzimas producidas por Penicillium funiculosum (actividad de \beta-glucanasa: 100 U.kg^{-1} y actividad de xilanasa: 1100 U.kg^{-1}) potencian el valor de la energía metabolizable de una dieta a base de 54% de trigo en +3,4% (122 kcal/kg DM) si todo el trigo está molido, y en +2,7% (101 kcal/kg DM) si se incluye 30% del trigo como granos completos.

Digestibilidad aparente de nutrientes (lípidos, proteínas y aminoácidos)

Cuando se muele todo el trigo, las digestibilidades aparentes de lípidos y proteínas aumentan en 7 y 2,7%, respectivamente, con la Preparación de Enzimas de Penicillium funiculosum. Con parte del trigo como granos completos, el incremento es menor: +3 y +0,6%, respectivamente, debido a una digestibilidad potenciada global de los nutrientes. De hecho, la digestibilidad de los nutrientes con la dieta de control que contiene trigo completo fue similar a la de la dieta experimental que sólo contiene trigo molido pero suplementada con la Preparación de Enzimas.

En la Tabla 2.4 se presentan los efectos de la Preparación de Enzimas sobre la digestibilidad aparente de aminoácidos. La mejora con la Preparación de Enzimas alcanza de media +2,9% con todo el trigo como trigo molido, y +1,1% con granos completos, confirmando el efecto sobre la digestibilidad aparente de las proteínas.

Retención aparente del fósforo y excreción del fósforo

En la Tabla 2.5 se presenta el efecto de la Preparación de Enzimas sobre la retención aparente de fósforo. La retención aparente de fósforo aumenta significativamente con la adición de la Preparación de Enzimas: +8,0%. Este incremento es mayor que los observados para los otros nutrientes (+2,9 a +3,5% dependiendo del criterio: AME, proteínas, lípidos, aminoácidos). De este modo, tal incremento puede resultar de una digestibilidad de nutrientes mejorada (efecto directo de xilanasa y \beta-glucanasa), pero también de una mejor acción de la fitasa de trigo. Cuando se hidrolizan polisacáridos sin almidón, la xilanasa y la \beta-glucanasa dan más accesibilidad al ácido fítico para la fitasa de trigo endógena.

Esta mejor utilización digestiva del fósforo reduce así la excreción del fósforo: -8% cuando se expresa como g de fósforo por kg de ganancia de peso.

TABLA 2.1 Características del trigo (%)

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TABLA 2.2 Composición y características de dietas experimentales

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TABLA 2.3 Efecto de la Preparación de Enzimas (actividad de \beta-gtucanasa: 100 U.kg^{-1} y actividad de xilanasa: 1100 U.kg^{-1}) sobre AME de una dieta a base de trigo (54% de trigo molido o 24% de trigo molido + 30% de trigo completo) en pollos en crecimiento

20

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TABLA 2.4 Efecto de la Preparación de Enzimas sobre la digestibilidad aparente de aminoácidos (%) de una dieta a base de 54% de trigo en pollos en crecimiento (una muestra de excreciones mixtas per tratamiento)

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TABLA 2.5 Efecto de la Preparación de Enzimas sobre la excreción de fósforo (P) y sobre la retención aparente de fósforo de la dieta a base de trigo (54% de trigo molido) en pollos en crecimiento (n=12)

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Ejemplo 3 Evaluación de la Preparación de Enzimas sobre AMEN de una dieta a base de trigo en pavos en crecimiento

El objetivo de este ensayo es demostrar la eficacia de la Preparación de Enzimas de Penicillium funiculosum (actividad de \beta-glucanasa: 100 U.kg^{-1} y actividad de xilanasa: 1100 U.kg^{-1}) sobre la Energía Metabolizable Aparente (AME) de una dieta a base de trigo según el siguiente diseño experimental:

(1)

Control;

(2)

PE 1: Preparación de Enzimas (actividad de \beta-glucanasa: 100 U.kg^{-1} y actividad de xilanasa: 1100 U.kg^{-1});

(3)

PE 2: Preparación de Enzimas (actividad de \beta-glucanasa: 150 U.kg^{-1} y actividad de xilanasa: 1650 U.kg^{-1});

usando el método de Referencia Europea (Bourdillon et al., 1990) con alimentación a voluntad y recogida de excreciones totales entre 33 y 37 días.

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a. Material y Métodos Pájaros: raza y condiciones de cría

Se criaron pavos BUT9 machos de un día en jaulas en batería colectivas hasta 20 días. Entonces se transfirieron a jaulas en batería individuales para determinar el balance de la digestibilidad tras un período de adaptación de por lo menos 7 días.

Se aplicaron programas estándar de temperatura y humedad. El programa de luz se mantuvo constante 23 horas de luz y 1 hora de oscuridad durante las 2 primeras semanas, y después se redujo a 15 horas de luz durante 9 horas de oscuridad hasta el final del ensayo.

Piensos: los pájaros recibieron una dieta de iniciación para recién nacidos completa estándar desde el primer día hasta los 21 días, y después los piensos experimentales.

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Dietas experimentales

Los piensos contenían 47% de trigo y 33% de harina de haba de soja (Tabla 3.1). La pulverización de las enzimas se llevó a cabo sobre peletes de 20 kg de dietas de control.

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Medida de la energía metabolizable

En el D 21 los pájaros se pesaron y se distribuyeron por igual en 10 jaulas individuales por tratamiento, y entonces se alimentaron con las dietas experimentales.

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El balance comienza en el D 33 según el siguiente procedimiento:

D 32, los pájaros ayunaron toda la noche;

D 33, se pesó a los pájaros, se limpiaron las bandejas de recogida;

D 33 y D 35, las heces se recogieron y se congelaron;

D 36, las heces se recogieron y se congelaron, ayuno toda la noche;

D 37, las heces se recogieron y se congelaron, los pájaros se pesaron y se volvieron a alimentar.

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Las heces se liofilizaron entonces y se molieron como pienso (1 mm, trituradora de Retsch). La energía bruta del pienso y de las excreciones se midió en un calorímetro adiabático IKA C5000.

La AME se corrige para el balance de nitrógeno teniendo en cuenta la ganancia de peso corporal (g) y su contenido de nitrógeno (21% de proteína bruta).

Las heces se liofilizaron entonces y se molieron como pienso (1 mm, trituradora de Retsch). La energía bruta del pienso y de las excreciones se midió en un calorímetro adiabático IKA C 5000. También se determinó la proteína (N*6.25, método de Kjeldahl Z130 para piensos y Z135 para heces), y se llevó a cabo un perfil de aminoácidos mediante HPLC (método Z100 para piensos y Z080 para heces).

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b. Resultados y discusión Energía Metabolizable Aparente (AME)

En la Tabla 3.2 se presentan los comportamientos zootécnicos y la Energía Metabolizable. No hubo ninguna diferencia significativa en el comportamiento del crecimiento durante el balance entre tratamientos.

En pavos en crecimiento, la Preparación de Enzimas mejora AMEN de una dieta a base de trigo en 2,2 y 5,4% para PE 1 y PE 2, respectivamente.

La elevada mejora observada demuestra el interés de ambas actividades (xilanasa y \beta-glucanasa) contenidas en la Preparación de Enzimas para el polisacárido de trigo hidrolizado sin almidón para mejorar el valor energético de este cereal en pavos en crecimiento.

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TABLA 3.1 Ingredientes principales y características analizadas de dietas experimentales

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TABLA 3.2 Efecto de la Preparación de Enzimas sobre la energía aparente metabolizable corregida para el balance de nitrógeno (AMEN) de una dieta a base de trigo en pavos en crecimiento (32 a 37 días). (medias \pm SD)

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Ejemplo 4 Evaluación de la eficacia de la Preparación de Enzimas producida por Penicillium funiculosum de la dieta de pienso completo a base de trigo en cerdos en crecimiento

El objetivo es evaluar el efecto de la suplementación enzimática de dietas a base de trigo sobre la digestión energética en el intestino delgado de cerdos en crecimiento. La actividad normal de la Preparación de Enzimas es 1100 U.kg^{-1} para xilanasa y 100 U.kg^{-1} para \beta-glucanasa.

a. Material y Métodos Animales

Los tratamientos se ensayaron según un diseño de cuadrado latino con tres dietas y tres períodos y dos cerdos por período de dieta*. Las dietas se alimentaron a niveles fijos según el peso del cerdo durante el período del ensayo.

Dieta experimental

Se alimentó una dieta a base de trigo de mala calidad y balanceada con otros ingredientes típicos de piensos a seis cerdos en crecimiento (véase la tabla 4.1.). La dieta se alimentó:

1.

Sin suplementar (basal);

2.

Suplementada (1): con Preparación de Enzimas a un nivel 1x (actividad de \beta-glucanasa: 100 U.kg^{-1} y actividad de xilanasa: 1100 U.kg^{-1});

3.

Suplementada (2): con Preparación de Enzimas a nivel 2x (actividad de \beta-glucanasa: 200 U.kg^{-1} y actividad de xilanasa: 2200 U.kg^{-1}).

La dosificación exacta de la dieta se logró diluyendo la Preparación de Enzimas con almidón de maíz para crear una premezcla que entonces se añadió a la dieta según fuese apropiado.

Recogida de muestras

Se recogieron los jugos ileales durante un período de 48 horas cada semana según procedimientos estándar en los laboratorios de RPNA. Una muestra del jugo ileal y de las dietas de ensayo se analizó para determinar la energía mediante calorimetría en bomba mediante Sanders, para determinar la energía digestible. Se almacenaron alícuotas de las muestras para análisis posterior si es necesario.

Análisis estadístico

La digestibilidad de la energía bruta se calculó a partir de los resultados de la calorimetría en bomba de los jugos ileales, del pienso y de las ingestas de pienso. Se llevó a cabo un análisis de varianza en los cálculos de la digestibilidad.

TABLA 4.1 Especificación de los ingredientes y nutrientes de la dieta basal

25

b. Resultados y discusión

La suplementación de dietas de cerdos con xilanasa incrementó la digestibilidad de la energía en por lo menos seis por ciento. Esto indica que la enzima aumenta la ruptura de las paredes celulares del material de partida (en particular, trigo) y la liberación de energía adicional en el intestino delgado.

TABLA 4.2 Efecto de la suplementación con la Preparación de Enzimas de dietas a base de trigo sobre la digestibilidad de la energía de piensos dados a cerdos en crecimiento

26

Ejemplo 5 Efecto de la Preparación de Enzimas producida mediante Penicillium funiculosum sobre el comportamiento de dietas de paja, de silaje del maíz, de heno y de silaje de hierba en rumiantes

El ensayo de HFT (Hohenheimer Futterwertesten, Menke et al., 1979, 1988) es un ensayo de incubación in vitro que permite la medida de la degradación del material de partida a través del volumen de gas producido mediante la fermentación de estos alimentos en un jugo de rumen tamponado.

a. Material y Métodos

Se incubaron 200 mg de sustrato seco y molido con 10 ml de jugo de rumen más 20 ml de ampón en jeringuillas que se agitaron suavemente en un rotor en una incubadora de temperatura controlada (39ºC). El volumen de gas producido se registra a las 24 horas. Para corregir los resultados y calcular el volumen neto de gas producido en 24 horas, se usa un blanco (sin sustrato), un control de heno estándar y un control de concentrado estándar (con valor conocido de producción neta de volumen de gas). El valor energético y la OMD (Digestibilidad de Materia Orgánica) de los sustratos se calculan usando el volumen de gas producido en 24 horas y las ecuaciones predictivas propuestas por Menke et al. (1988).

El jugo de rumen se recoge en 2 rumen secos de vacas canuladas y alimentadas a 8 a.m. y 7 pm con una ración compuesta de 6 kg de heno y 2 kg de concentrado (relación 75/25). La recogida del jugo de rumen se lleva a cabo justo antes de la alimentación matutina. El jugo de rumen se filtra para evitar el paso de partículas alimentarias, y se mantiene en condiciones anaerobias estrictas.

El objetivo de este ensayo fue ensayar el efecto de la aplicación de la Preparación de Enzimas en el forraje 15 horas antes de la incubación de HFT.

Pretratamiento con la Preparación de Enzimas: la disolución enzimática se pulveriza sobre el forraje en el suelo sobre paja, silaje de maíz, heno y silaje de hierba. La pulverización se realiza con 1 ml de Preparación de Enzimas sobre 2 kg de materia seca de forraje. El forraje en el borde (aproximadamente 10 cm) se rechaza para mejorar la homogeneidad de la muestra. Después del tratamiento, el forraje se mezcla manualmente y se deja a temperatura ambiente durante 15 horas antes de la pulverización. La incubación de HFT se lleva a cabo después de 15 horas de contacto con la Preparación de Enzimas durante una serie y 6 réplicas por tratamiento.

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b. Resultados y discusión

En la tabla 5.1 se da la producción neta de volumen de gas a las 24 horas para paja, silaje de maíz, heno y silaje de hierba.

La aplicación de celulasa sobre paja durante el pretratamiento da una mejora de 18% del volumen neto de gas frente al control. Para el silaje de maíz, esta mejora es 8%, para heno 9,5%, y para silaje de hierba 9%.

La OMD se da en la tabla 5.2. para el diferente forraje antes y después del pretratamiento.

La digestibilidad de OM mejora respectivamente para paja, silaje de maíz, heno y silaje de hierba frente al control: 8,5% para paja, 5% para silaje de maíz, 5,4% para heno y 5% para silaje de hierba.

El pretratamiento durante 15 horas de los forrajes (paja, silaje de maíz, heno, silaje de hierba) con la Preparación de Enzimas mejora la intensidad de la incubación del sustrato del rumen y la digestibilidad de OM del sustrato.

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TABLA 5.1 Producción neta de volumen de gas a las 24 horas

27

TABLA 5.2 OMD

28

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Ejemplo 6 Efecto de la Preparación de Enzimas producida mediante Penicillium funiculosum sobre el comportamiento de gallinas ponedoras alimentadas con trigo o cebada

El fin de este experimento fue evaluar los efectos de la adición de la Preparación de Enzimas sobre los parámetros productivos de gallinas ponedoras alimentadas con dietas a base de trigo o de cebada.

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a. Material y métodos

Diseño del experimento:

4 tratamientos x 8 réplicas x 5 jaulas x 3 gallinas

Tratamientos:

1. Control 1: 60% de trigo

\quad

2. Control 1 + Preparación de Enzimas

\quad

3. Control 2: 60% de cebada

\quad

4. Control 2 + Preparación de Enzimas

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Animales, enjaulado y manejo

El ensayo se llevó a cabo en cuatrocientos ochenta gallinas marrones de la raza Hy-Line. Cada réplica estaba formada por cinco corrales, con un comedero común, es decir, un total de treinta y dos réplicas de quince pájaros cada una.

Distribuidas en dos habitaciones idénticas, las réplicas tuvieron luz y ventilación programables. El programa de luz comenzó con 14 horas de luz por día a la llegada de las gallinas a las 17 semanas de edad, incrementando cada dos semanas 30 minutos hasta un máximo de 17 horas de luz por día.

Las gallinas tenían 22 semanas al comienzo del experimento, que duró los cinco primeros meses del período de puesta.

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Dietas y alimentación

Había dos dietas experimentales basadas en 60% de trigo (dieta 1) y 60% de cebada (dieta 2), y 10% de harina de girasol. En la Tabla 6.1 se muestra su composición.

En la Tabla 6.2 se presentan las características de los cereales.

\newpage

Controles Análisis químico: \bullet Muestras de pienso

Se llevó a cabo un control de calidad de los piensos experimentales analizando la materia seca, la proteína bruta, grasa bruta y ceniza. La actividad de xilanasa (T-1, T-2) y la actividad de \beta-glucanasa (T-3, T-4) se determinaron en piensos molidos.

\bullet Mediciones

El consumo de pienso y la eficacia del pienso se registraron cada cuatro semanas. Las gallinas se pesaron al comienzo y al final del experimento. Se registró diariamente, durante cinco períodos de cuatro semanas cada uno, la producción de huevos, el peso de los huevos y el porcentaje de huevos sucios y fallidos. Se comprobó la mortalidad y se registró diariamente, incluyendo la causa de la muerte.

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b. Resultados y discusión Ensayo de comportamiento

En la Tablas 6.3 a 6.5 se muestran los parámetros productivos obtenidos durante el ensayo. En los primeros dos períodos (de la semana 22 a 30) y en el conjunto del experimento, el porcentaje de huevos sucios se vio afectado estadísticamente por el tratamiento (P>0,005). Los animales alimentados con la dieta de trigo sin enzima produjeron más huevos sucios. Se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos en el porcentaje de puesta de huevos (P>0,05) y en el peso de los huevos (P>0,005) desde el segundo período hasta el final del experimento. Los animales alimentados con dietas de cebada presentaron un mayor porcentaje de puesta de huevos y produjeron huevos más pesados que los animales alimentados con las dietas de trigo. La Preparación de Enzimas parece que incrementa estos parámetros, pero no significativamente al nivel de probabilidad de 0,05. En todos los períodos experimentales, la ingesta de piensas de los animales de los tratamientos T-3 y T-4 (dietas de cebada) fue mayor que el consumo de los animales alimentados con dietas de trigo, debido a los niveles energéticos de ambas dietas (las dietas de cebada se formularon a 2600 kcal/kg de energía, mientras que las dietas de trigo contenía 2800 kcal/kg). Teniendo en cuenta los diferentes valores energéticos de ambos tipos de dietas y el consumo de piensos de los animales, en el período global todos los animales presentaron el mismo consumo energético diario.

La eficacia de los piensos (expresada como g de pienso/g de huevo) de las dietas experimentales durante el primer período fue muy elevada debido a la baja tasa de puesta de huevos de las gallinas durante este período de tiempo. En los dos primeros períodos, la eficacia de los piensos para los tratamientos con trigo fue mejor que la obtenida con tratamientos de cebada; pero en el tercer período, cuando se registraron los porcentajes más elevados de puesta de huevos, ambos tipos de dietas presentaron eficacias similares. Desde la semana 34 hasta el final del experimento, las dietas de cebada presentaron mejores eficacias de piensos que los tratamientos con trigo. La enzima tiende a mejorar la eficacia del pienso (P>0,05). En el período en conjunto, la \beta-glucanasa mejoró la eficacia del pienso de la dieta de cebada (con una P = 0,066).

La Tabla 6.4 muestra que las ponedoras alimentadas con trigo suplementadas con Preparación de Enzimas tienden a mostrar mayores tasas de puesta (+1,5 puntos absolutos), un mayor peso medio de los huevos (+0,37 g) y una menor Relación de Conversión del Pienso (-2,7%) que las no suplementadas.

La Tabla 6.5 muestra que la adición de la Preparación de Enzimas a ponedoras alimentadas con cebada mejoró la tasa de puesta (+4%), el peso medio de los huevos (+ 0,7%) y la Relación de Conversión del Pienso (-5,7%), en comparación con dietas de cebada de control.

TABLA 6.1 Composición de dietas experimentales para ponedoras

29

TABLA 6.2 Composición analítica de cereales

30

TABLA 6.3 Parámetros productivos desde 22 a 42 semanas (protocolo experimental completo)

31

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TABLA 6.4 Efecto de xilano en el comportamiento ponedor de gallinas ponedoras alimentadas con trigo (en valores absolutos^{1} y porcentaje^{2} en comparación con el control)

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TABLA 6.5 Efecto de la Preparación de Enzimas en el comportamiento ponedor de gallinas ponedoras alimentadas con cebada (en valores absolutos^{1} y porcentaje^{2} en comparación con el control)

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Bibliografía

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Claims (20)

1. Penicillium funiculosum depositado bajo el Tratado de Budapest en el International Mycological Institute con el número IMI 378536.

2. Uso de Penicillium funiculosum según la reivindicación 1, para producir una mezcla enzimática para pienso para animales.

3. Procedimiento para la producción de una mezcla enzimática para pienso para animales, que comprende las siguientes etapas:

(a)

fermentar Penicillium funiculosum según la reivindicación 1;

(b)

eliminar los sólidos mediante separación sólido-líquido;

(c)

recoger la fase líquida; y

(d)

concentrar la fase líquida que contiene la mezcla enzimática.

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4. Mezcla enzimática obtenida de Penicillium funiculosum según la reivindicación 1, que contiene por lo menos una actividad de endo-1,3(4)-\beta-glucanasa y una actividad de endo-1,4-\beta-xilanasa.

5. Composición líquida que contiene:

105

en la que dicha composición líquida comprende 4 a 10% de productos microbianos procedentes de caldo de fermentación de Penicillium funiculosum IMI 378536 como sólidos orgánicos totales.

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6. Composición líquida según la reivindicación 5, en la que dicho agente antimicrobiano comprende 0,01 a 0,25% en peso de la composición.

7. Composición líquida según la reivindicación 5, en la que dicho agente anticongelante comprende 15 a 40% en peso de la composición.

8. Composición líquida según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en la que el agente antifúngico y/o antibacteriano se selecciona de entre el grupo que consiste en ácido sórbico y sales, ácido benzoico y sales, 4-hidroxibenzoato de metilo, 4-hidroxibenzoato de n-propilo, ácido fumárico, sales y ésteres.

9. Composición líquida según la reivindicación 8, en la que dichas sales son cloruro de sodio o cloruro de potasio.

10. Composición líquida según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en la que los agentes anticongelantes se seleccionan de entre el grupo que consiste en 1,2-propanodiol, etilenglicol y glicerol.

11. Composición en polvo que tiene la siguiente composición:

106

12. Composición en polvo según la reivindicación 11, en la que los vehículos se seleccionan de entre el grupo que consiste en harina de trigo, almidón, yeso, maltodextrina, sólidos de maíz, subproductos del procesamiento de cereales tales como maíz molido, harinillas de trigo, salvado de trigo, y granzas de centeno.

13. Uso del producto según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 12, para alimentar animales de granja tales como aves, cerdos, rumiantes.

14. Uso del presente invención según la reivindicación 13, para mejorar la digestibilidad de cereales, tales como trigo, cebada, centeno, triticale, avena, arroz; semillas oleaginosas tales como soja, girasol, colza; y subproducto de cereales, tal como salvado de trigo.

15. Uso del producto según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 12, para disminuir la excreción de fósforo.

16. Uso del producto según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 12, para incrementar la utilización digestiva de fósforo.

17. Uso del producto según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 12, para mejorar la digestibilidad de aminoácidos.

18. Uso del producto según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 12, para reducir el amoníaco en el aire de las baterías en las que se alimenta a los animales.

19. Uso del producto según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 12, para disminuir la relación de conversión de piensos.

20. Uso del producto según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 12, para incrementar la energía metabolizable aparente.