UA77381C2 - Штам penicillium funiculosum, суміш ферментів, одержуваних з цього штаму, та композиції, що містять суміш ферментів для годівлі тварин - Google Patents

Штам penicillium funiculosum, суміш ферментів, одержуваних з цього штаму, та композиції, що містять суміш ферментів для годівлі тварин Download PDF

Info

Publication number
UA77381C2
UA77381C2 UA2000020609A UA2000020609A UA77381C2 UA 77381 C2 UA77381 C2 UA 77381C2 UA 2000020609 A UA2000020609 A UA 2000020609A UA 2000020609 A UA2000020609 A UA 2000020609A UA 77381 C2 UA77381 C2 UA 77381C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
activity
sequence
composition according
xylanase
items
Prior art date
Application number
UA2000020609A
Other languages
English (en)
Russian (ru)
Inventor
Ален Сабатьє
Невіл Маршал Фіш
Нігель Патерсон Ег
Original Assignee
Адіссео Франс Сас
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Адіссео Франс Сас filed Critical Адіссео Франс Сас
Publication of UA77381C2 publication Critical patent/UA77381C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungi isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/189—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K30/00—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs
    • A23K30/10—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs of green fodder
    • A23K30/15—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs of green fodder using chemicals or microorganisms for ensilaging
    • A23K30/18—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs of green fodder using chemicals or microorganisms for ensilaging using microorganisms or enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/30—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for swines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01073—Feruloyl esterase (3.1.1.73)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/80—Penicillium
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P60/00—Technologies relating to agriculture, livestock or agroalimentary industries
    • Y02P60/80—Food processing, e.g. use of renewable energies or variable speed drives in handling, conveying or stacking
    • Y02P60/87—Re-use of by-products of food processing for fodder production

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Birds (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Feed For Specific Animals (AREA)

Abstract

Даний винахід належить до нового мікроорганізму, Penicillum funicolosum, до одержаної із нього нової суміші ферментів і до їх послідовностей нуклеїнових кислот.

Description

Опис винаходу
Даний винахід відноситься до нового мікроорганізму, нових ферментів і нової суміші ферментів. Крім того, 2 цей винахід відноситься до композиції суміші ферментів, до її одержання і використання в харчовій промисловості, у виробництві кормів та в інших галузях промисловості, включаючи (але не обмежуючись ними) паперову і текстильну промисловість.
Протягом тривалого часу ферменти використовували для широкого кола різноманітних промислових застосувань. Відомими є приклади з хлібопекарської промисловості, виноробства і виробництва фруктових соків 70 (де ферменти використовують для руйнування пектинів і В-глюканів), текстильної промисловості (де целюлази використовують для одержання м'яких і гладеньких целюлозних тканин) і також, що аж ніяк не є останнім застосуванням, для приготування кормів для тварин. У цьому випадку ферменти покращують перетравлення кормів із рослинних джерел.
Останнє застосування забезпечує більш ефективне перетравлення корму тваринами. Цінність корму можна 72 визначити за ЕСВ (Геед Сопмегзіоп Каїйо або витрати корму на одиницю продукції), живильною цінністю, кількістю корму, який витрачають, по відношенню до збільшення маси тварини. Зниження величини ЕСК для корму вказує на пропорційне збільшення маси тварини, тобто на те, що тварина здатна використовувати корм більш ефективно.
Погана засвоюваність компонентів корму (крохмаль, жир, білок/амінокислоти) є відмінною особливістю кормів на основі злакових і, наприклад, особливо тих, в яких вміст ячменю або пшениці є високим. В цих випадках може виявитися необхідним підготовляти корми так, щоб вони містили більш високі рівні енергії з інших джерел та таких інших добавок, як амінокислоти. Ці ферменти підвищують величину очевидної обмінної енергії (Аррагепі
Меїабоїїгабіе Епегду) включених в корм злакових.
Іншим підходом до розв'язання цієї проблеми було уведення ферментних добавок, целюлаз, с ендо-1,3(4)-В-глюканаз(В-глюканази), ендо-1,4-В-ксиланаз (ксиланази) і т.д, або сумішей ферментних (39 активностей до таких кормів на основі злакових. Ферментні добавки можуть мати специфічне застосування для гідролізу В-глюканів або для гідролізу арабі-ноксиланів, які перебувають в злакових (звичайно в ячмені і пшениці). Додавання ферментів переслідує різноманітні цілі. Однією з переваг, яка, безумовно, забезпечує ефективність ферментних добавок до кормів, є зниження в'язкості матеріалів у травному тракті тварин, що -- одержують корм на основі злакових, який містить відповідну ферментну добавку. Вища в'язкість обумовлена, с частково, присутністю В-глюканів і арабіноксиланів у ячмені та пшениці. Нижча в'язкість, що є результатом дії ферментів, забезпечує більш легку абсорбцію живильних компонентів у травному тракті тварин. Іншою о перевагою є виділення живильних речовин, що містяться в стінках клітин злакових, що знижує необхідність в ї- інших дорогих кормових добавках. Загальним результатом є значне зниження вартості кормів з аналогічним або більш високим ефектом за вимірами ЕСК. в
Було розкрито, що ферментні препарати, отримані із широкого кола різноманітних мікроорганізмів, підвищують засвоюваність кормів.
З урахуванням відомого рівня, пов'язаного з використанням ферментів в кормах для тварин, автори вказують «4, європейську патентну заявку (ЕР, 06997621), в якій розкрито використання виділеної з Зспуаппіотусевз З оссідепіаїв фітази. Ця фітаза являє собою фітазу, отриману з генетично модифікованого організму, отриманого с шляхом вбудовування клонованого гену, чого автори хотіли б уникнути в даному винаході.
Із» Що стосується патентної заявки (МУО, 95/26398)|, там модифіковану целюлазу також одержують шляхом вбудовування чужорідної послідовності ДНК в клітину-хазяїна, яка модифікує природу вихідного штаму, що обраний із такого переліку мікроорганізмів: Васійй5, Зігеріотусез, Засспаготусев, Зспігозассп аготусев,
Авзрегайи5. Основною метою авторів даного винаходу було уникнути вбудовування чужорідного гена в і мікроорганізм, який продукує фермент. -І В патентній заявці (МО, 96/05739| суміш ферментів (ксиланази, протеази і необов'язково В-глюканази) одержують із різноманітних мікроорганізмів. Автори наводять приклад (суміші ферментів з відношенням о ксилазної активності до В-глюканазної активності порядку 1:5. Було виявлено, що коли ксилаза включена в о 20 раціон на основі злакових в оптимальній дозі або близько до цього, спільна присутність ферментів, які виявляють В-глюканазну активність, підвищує БСК корму, що, природно, невигідно. Відповідно, автори
З виступають проти присутності В-глюканази, вони рекомендують максимальне відношення ксиланазної активності до В-глюканазної активності як 1:(0-0,25).
В деяких випадках, для того, щоб забезпечити всі ферментні активності, пов'язані із застосуванням кормів, 29 доводиться одержувати препарати з препаратів, отриманих більш ніж з одного мікроорганізму. В ряді випадків
ГФ) ферментні препарати були отримані з мікроорганізмів, які піддавалися генетичним модифікаціям із використанням методик рекомбінантних ДНК. о Автори виявили новий мікроорганізм, що належить до класу РепісййшШт їипісоїозит, який містить нові ферменти, і розробили суміш ферментних активностей, яку з успіхом можна використовувати для підвищення, 60 головним чином, засвоюваності кормів для тварин на основі злакових.
Відповідно, даний винахід відноситься до нового мікроорганізму, отриманого з РепісйПит Типісоїозит, та до способу культивування цього мікроорганізму і виділення ферментів, які продукує цей мікроорганізм.
Крім того, згідно із даним винаходом, запропоновані нові ферменти, виділені з цього мікроорганізму, їх послідовності нуклеїнових кислот і нові композиції, що містять ці ферменти. бо Далі, відповідно до цього винаходу, запропоновано спосіб підвищення засвоюваності амінокислот і кормів для тварин на основі амінокислот і злакових.
Іншою метою даного винаходу є зменшення виділення фосфору і виділення аміаку з клітинної батареї, де годують тварин.
А. Новий штам Репісіїшт типісоїовит
Цей новий штам грибків РепісійшШт б7ипісоюзит депонований під реєстраційним номером ІМІЗ378536 в ізмасатному Міжнародному Депозитарії у відповідності із Будапешською Угодою (1977р.), Міжнародним
Інститутом Мікології (Іпіегпайопа! Мусоіодіса! Іпвійше (ІМІ), ВаКкепат іапе, Епдіейвій гееп, Еднпат,
Зигтеу, ТМУ209ТУ, ОК). 70 Походження
Новий штам отримано із РепісШПит Типісоїовит ІМІ 134756 після успішного УФ опромінення і В-опромінення спор, включно із скринуванням на селективному середовищі. Ніяких генетичних модифікацій не було отримано за допомогою методик рекомбінантних ДНК із використанням вбудовування чужорідних ДНК або РНК.
Ідентифікація і типування
Репісійшт 7ипісоїюозит ІМІ 134756 було охарактеризовано шляхом вирощування на Сгарек ох агарі при 259б0. Характеристики колонії і мікроморфологія є типовими для РепісійШт Типісоїозит. Ідентифікація мікроорганізму як РепісіїшШт Типісоїозит була підтверджена в Міжнародному Інституті Мікології (Іпіегпайопаї!
Мусоіодіса! Іпзійше (ІМІ), Вакепат іІапе, Епдієейеій Стгееп, Едпат, Зигеу, ТУМУ209ТУ, ОК). Ріст схожий на щільно базальну повстину, з аегральним ростом, у вигляді ниток або вузликів гіфів (Типісціозе), міцелій білого
Кольору з основою червоного кольору в субстраті, поля, навпаки, бліді, але пофарбовані червоним у напрямку до центрів, можуть ставати темно-ч-ервоними. Це типовий пеніцилін, він демонструє короткий кондіофорез, що виникає, головним чином, із Типісіез, БімепісіНа(е, голчастих, конідіогенних клітин, конідії еліптичні та гладенькі.
Мікроорганізм, використаний для одержання препарату ферментів даного винаходу, вирощують в аеробних умовах в середовищі, яке містить целюлозу, сироп від замочування кукурудзи, карбонат кальцію і сульфат Га р; амонію.
В. Процес ферментації і)
Ці нові грибки одержують шляхом ферментації депонованого штаму спочатку на засіяному середовищі, яке переважно складається з, мас. 9о: - розчин від замочування кукурудзи 1-4; агент, що перешкоджає піноутворенню щоб уникнути утворення піни; со води до 100; со
Ммаон (перед стерилізацією середовища) до рН 3,0-6,0. ча
Температура інкубування 27-3626. чн
Ферментаційне середовище переважно має такий склад, мас. 90: розчин від замочування кукурудзи 0-4; целюлоза (занурюють та подають) 0,8-14,0; « сіль кальцію 0-08; в сульфат амонію 0-1,0; с агент, що перешкоджає піноутворенню щоб уникнути утворення піни; :з» вода до 100;
Ммаон (перед стерилізацією середовища) до рН 3,0-6,0;
НгЗОХ для підтримання рН 3,0-6,0; -І аміак для підтримання рН 3,0-6,0. - Температура інкубування 27-36260.
Га Для ферментації у ферментер завантажують достатню кількість води, додають інгредієнти до води в 5р прийнятному контейнері із пристосуванням для перемішування, перемішують доти, поки інгредієнти не со розчиняться. Стерилізують, герметизуючи ферментер і підвищуючи температуру вмісту звичайно до 121 960. - М Вміст ферментера інокулюють за-травним ферментаційним середовищем.
Основним джерелом вуглецю, який додають в процесі ферментації, є целюлоза; із різноманітних джерел целюлози автори надають перевагу використанню АКВОСЕЇ, БОЇ КАРІ ОС СІ АКОСЕЇ, АІ РНАСЕЇ, РІВКАСЕЇ. різноманітних ступенів чистоти.
Величину рН в процесі ферментації переважно контролюють, додаючи сірчану кислоту або іншу кислоту й іФ) аміак у газоподібному або рідкому вигляді, чи іншу основу. ко У кінці ферментації тверді речовини видаляють фільтруванням або центрифугуванням, збирають і концентрують рідку фазу, наприклад, ультрафільтрацією або на органічних або мінеральних мембранах. во Ці ферменти можна також одержати за допомогою методик рекомбінантних ДНК, і таким чином вони будуть продукуватися рекомбінантними гомологічними або гетерологічними видами. Хазяїна для переносу гена, що кодує фермент, можна вибрати з видів грибків, бактеріальних клітин або рослинних клітин. Для вбудовування гену, кодуючого потрібний фермент, в такі клітини-хазяїни як плазміди (інтегративно або ні), вектори фагів та вектори вірусів, можна використовувати будь-які зручні способи. Репісішт Типісоїозут, що включає вставку б5 гетерологічних генів або модифікацію геному гомологічними генами за рахунок вставок, делецій або модифікацій зазначеного гомологічного гену, також є частиною даного винаходу.
Відповідно до даного винаходу, можна одержати фермент у вигляді виділеного чистого препарату ферменту або у вигляді неочищеного препарату, такого, як культуральне середовище, в якому вирощували РепісіПит
Типісоїовит.
Можна також включити цей фермент або ці ферменти в композиції, які містять ще один фермент, тип якого залежить від передбачуваного використання композиції. Добавлені ферменти можна вибрати, наприклад, серед карбогідраз, ліпаз та протеаз.
С. Композиції, що складаються з "суміші ферментних активностей" 1. Рідка композиція 70 Для рідкої композиції після додавання протимікробних агентів здійснюють вимір концентрації ферментів і розведення до потрібної концентрації. Кращим складом рідкого розчину є такий: мікробні продукти у вигляді всіх органічних твердих речовин /-4-1095 протимікробний агент 0-0,3590 сорбіт 20-5090 антифріз (необов'язково) 0-4095 концентрований відфільтрований бульйон" 0,3-7695 забуферений з доведенням рН 3-5.
Протимікробний агент вибирають із таких продуктів, як сорбінова кислота та її солі, бензойна кислота та її солі, метил-4-гідроксибензоат та н-пропіл-4-гідроксибензоат, фумарова кислота, солі та естери. Можна також використовувати такі солі, як хлорид натрію або хлорид калію.
Найкращими антифрізами є 1,2-пропандіол, етиленгліколь, гліцерин. 2. Порошкова композиція сч
Для одержання порошкових препаратів отриманий концентрований розчин сушать необов'язково у присутності носія. Порошок, отриманий в результаті сушіння концентрованого розчину без присутності носія, (о) можна згодом змішати з придатним носієм. Кращим складом порошкової форми композиції є такий, 9о: мікробні продукти у вигляді всіх органічних твердих речовин 1695-4095 носій 5995-8390 -
НИ ! ! інші висушені компоненти ферментаційного бульйону 190 (ее)
Кращі носії обирають з пшеничної муки, крохмалю, гіпсу, мальтодекстрину, твердих продуктів кукурудзи, о таких побічних продуктів, отриманих під час обробки злакових культур, як кукурудзяна крупа, другосортна ї- пшениця, пшеничні висівки, відходи під час обробки рису, суміш мінералів. і - « р. Характеристики ферментів - 70 Отримано нову суміш ферментів, продукованих РепісіПЧт Типісоїюовит. Ця суміш ферментів містить такі нові с ферменти, як целюлази, В-глюканази, ксиланази, такі супутні ксиланазні ферменти, як арабінофуранозидази та : з» ферулоїл-естерази. 1. Процедура
Ферментний препарат охарактеризовано в різноманітних аналізах що включають аналізи активностей целюлази, целобіогідролази, В-глюкозидази, ендо-1,3 (4)-В-глюканази, ламінариназо-ендо-1,4-р-ксиланази (із і використанням різноманітних субстратів), (В-ксилозидази, арабінофуранозидази і ферулоїлестерази (із -І використанням різноманітних субстратів). 1.1. ОМ5 СМС спосіб аналізу целюлази о Аналіз активності целюлази базується на ферментному гідролізі глікозидних зв'язків у
Ге | 20 карбоксиметилцелюлозі (СМС), В-1,4-глюкані. Продукти реакції, олігосахариди В-1,4-глюкану, визначають за ах збільшенням рівня відновлення (як глюкозу). 7" Розчин, що містить Тмл (195, мас./об.) розчину СМС у 0,1М натрій-ацетатному буфері, рН 5,0 (або інші значення рН); мл відповідним чином розведеного ферментного розчину інкубують при 502С протягом 10Охв.
Ферментну реакцію зупиняють, додаючи 2мл ОМ розчину (1905, мас./об. 3,5-динітросаліцилової кислоти, 1690 99 мас/об. гідроксиду натрію, З095 мас./об. калій-натрій (к)-тартрату в дистильованій воді). Цей розчин
ГФ) перемішують і поміщають в баню з киплячою водою (мінімум 952) на 5хв., потім охолоджують до 2590. До
ГФ розчину додають 1Омл дистильованої води, і поглинання вимірюють при 54О0нм, використовуючи скляну кювету товщиною 2см. во Отриманий результат перетворюють в мкмоль відновленого цукру (як глюкоза), порівнюючи зі стандартною кривою для 2мл 0,00-0,0490 (мас./об.) розчинів глюкози, оброблених аналогічним способом розчином ОМ.
У спостережуване поглинання для розчинів ферментних реакцій вносять поправку на неспецифічне поглинання, здійснюючи реакцію, в якій ОМЗ розчин добавляють до суміші перед додаванням ферментного розчину. Одну одиницю активності целюлази визначають як кількість ферменту, яке продукує мкмоль глюкозного еквіваленту в 1хв. в умовах аналізу (502С і рН 5,0 або при інших значеннях рН). 65 1.2. Аналіз целобіогідролази з використанням п-нітрофеніл-В-О-целобіопіранозиду
Аналіз целобіогідролази базується на ферментному гідролізі п-нітрофеніл-В-ЮО-целобіопіранозиду. Продукт реакції, п-нітрофенол, визначають колориметрично.
Розчин, що містить Імоль 0,195 (мас./об.) п-нітрофеніл-В-О-целобіопіранозиду в дистильованій воді; мл дистильованої води; 7мл 0,2М натрій-ацетатного буферу, рН 5,0; їмл відповідним чином розведеного ферментного розчину інкубують при 502С протягом ЗОхв. Ферментну реакцію зупиняють, додаючи 4мл 0,4М розчину гліцину. Цей розчин перемішують і охолоджують до 202С. Поглинання вимірюють на 4ООнм, використовуючи скляну кювету товщиною 1см.
Отриманий результат перетворюють у мкмоль п-нітрофенолу, порівнюючи з коефіцієнтом молярної екстинкції 70 п-нітрофенолу в цих же умовах.
У спостережуване поглинання для розчинів ферментних реакцій вносять поправку на неспецифічне поглинання, здійснюючи реакцію, в якій розчин гліцину добавляють до суміші перед додаванням ферментного розчину. Одну одиницю активності целобіогідролази визначають як кількість ферменту, що продукує 1мкмоль п-нітрофенолу з п-нітрофеніл-В-О-целобіопіранозиду в 1хв. в умовах аналізу (502С і рН 5,0). 1.3. Аналіз В-глюкозидази з використанням п-нітрофеніл-В-О-глюкопіранозиду
Аналіз р-глюкозидази базується на ферментному гідролізі п-нітрофеніл-В-О-глюкопіранозиду. Продукт реакції, п-нітрофенол, визначають колориметрично.
Розчин, що містить їмл 0,195 (мас./об.) п-нітрофеніл-В-ЮО-глюкопіранозиду в дистильованій воді; мл дистильованої води; 7мл 0,2М натрій-ацетатного буферу, рН 5,0; їмл відповідним чином розведеного ферментного розчину інкубують при 502 протягом ЗОхв. Ферментну реакцію зупиняють, додаючи 4мл 0,4М розчину гліцину. Цей розчин перемішують і охолоджують до 202С. Поглинання вимірюють на 4ООнм, використовуючи скляну кювету товщиною 1см.
Отриманий результат перетворюють у мкмоль п-нітрофенолу, порівнюючи з коефіцієнтом молярної екстинкції п-нітрофенолу в цих же умовах. с
В спостережуване поглинання для розчинів ферментних реакцій вносять поправку на неспецифічне о поглинання, здійснюючи реакцію, в якій розчин гліцину добавляють до суміші перед додаванням ферментного розчину. Одну одиницю активності р-глюкозидази визначають як кількість ферменту, що продукує 1мкмоль п-нітрофенолу з п-нітрофеніл-В-О-глюкопіранозиду в хв. в умовах аналізу (502С та рН 5,0). 1.4. Аналіз ендо-1,3(4)-В-глюканази із використанням ЮОМ5 та В-глюкану ячменя --
Аналіз активності ендо-1,3(4)-В--люканази базується на ферментному гідролізі глікозидних зв'язків у со
В-глюкані ячменя, В-1,3(4)-глюканази. Продукти реакції, олігосахариди В-1,3(4)--люкану, визначають за кінцевим збільшенням рівня відновлення (як глюкози). і)
Розчин, що містить мл 195 (мас./об.) розчину В-глюкану ячменя в 0,1М натрій-ацетатному буфері, рН 5,0 їм- (або при інших значеннях рН); мл відповідним чином розведеного ферментного розчину інкубують при 502С протягом 10хв. Ферментну реакцію зупиняють, додаючи 2мл ОМ5 розчину (1965, мас./об.) 3З,5-динітросаліцилової - кислоти, 1,695 (мас./об.) гідроксиду натрію, 3095 (мас./об. ) калій-натрій (ї)-тартрату в дистильованій воді).
Цей розчин перемішують і поміщають в баню з киплячою водою (мінімум 952С) на 5хв., потім охолоджують до 25960. До розчину добавляють 1Омл дистильованої води, і поглинання вимірюють при 54О0нм, використовуючи « скляну кювету товщиною 2см. З 70 Отриманий результат перетворюють в мкмоль відновленого цукру (як глюкози), порівнюючи із стандартною с кривою для 2мл 0,00-0,0490 (мас./об.) розчинів глюкози, оброблених аналогічним способом розчином ОМ. "з В спостережуване поглинання для розчинів ферментних реакцій вносять поправку на неспецифічне поглинання, здійснюючи реакцію, в якій ОМЗ розчин добавляють до суміші перед додаванням ферментного розчину. Одну одиницю активності ендо-1,3(4)-В--люканази визначають як кількість ферменту, що продукує 75 Амкмоль глюкозного еквіваленту в 1хв. в умовах аналізу (502С та рН 5,0 або при інших значеннях рН). їх 1.5. Аналіз ендо-1,3(4)-В-глюканази із використанням В-глюкану азо-ячменя -і Аналіз активності ендо-1,3(4)-В-глюканази базується на ферментному гідролізі В-глюкану ячменя, в якого є с зв'язаний хромофор (В-глюкан азо-ячменя). Продукти реакції, олігомери, які розчиняються після осадження етанолом, визначають за спостережуваним збільшенням поглинання при 59Онм. (ее) 20 Розчин, що містить 0,5мл субстрату В-глюкану азо-ячменя (в формі, що готова для використання) та 0,2мл ще розведення ферменту (який містить від 0,15 до О0,бОод/мл у СМС в 0,01М натрій-ацетатному буфері, рН 4,6), інкубують при 302С точно протягом 20хв. Ферментну реакцію зупиняють, додаючи 2,5мл осаджуючого розчину (що містить 18,1г ацетату натрію і З,Ог цинкової суміші, перемішаних в З0Омл стакані з дистильованою водою, 5 рН доводять до 5,0 соляною кислотою, переносять вміст у 1л мірну колбу і доводять до потрібного об'єму 9695 (об./06.) етанолом). Розчин перемішують і залишають при кімнатній температурі на 10хв. Розчин переносять у (Ф) центрифужну ампулу центрифугують при 1000г протягом 1Охв. у лабораторній центрифузі. Поглинання рідини
Ге над осадом вимірюють при 59Онм, використовуючи скляну кювету товщиною 1см.
В спостережуване поглинання для розчинів ферментних реакцій вносять поправку на неспецифічне до Поглинання, здійснюючи реакцію, в якій осаджуючий розчин добавляють до суміші перед додаванням ферментного розчину. Одну одиницю активності ендо-1,3(4)-В-глюканази визначають як кількість ферменту, що гідролізує субстрат, забезпечуючи величину поглинання 0,820од. при 59Онм, використовуючи стандартний субстрат в умовах аналізу (302 і рН 4,6). 1.6. Аналіз ламінаринази (ендо-1,3-В-глюканази) із використанням ОМ і ламінарину 65 Аналіз активності ламінаринази (ендо-1,3-В-глюканази) базується на ферментному гідролізі глікозидних зв'язків у ламінарині, В-1,3-глюкані. Продукти реакції, олігосахариди В-1,3-глюкану, визначають за кінцевим збільшенням рівня відновлення (як глюкози).
Розчин, що містить їмл 195 (мас./об.) розчину ламінарину в 0,1М натрій-ацетатному буфері, рН 5,0; Тмл відповідним чином розведеного ферментного розчину інкубують при 502 протягом 10хв. Ферментну реакцію Зупиняють, додаючи 2мл ОМ5 розчину (1905, мас./об.) 3З,5-динітро-саліцилової кислоти, 1,695 (мас./об.) гідроксиду натрію, З09о (мас./об.) калій-натрій (ї)-тартрату в дистильованій воді). Цей розчин перемішують і поміщають в баню з киплячою водою (мінімум 952) на 5Бхв., потім охолоджують до 252С. До розчину добавляють 10мл дистильованої води, і поглинання вимірюють при 54Онм, використовуючи скляну кювету товщиною 2см.
Отриманий результат перетворюють у мкмолі відновленого цукру (як глюкози), порівнюючи зі стандартною 70 кривою для 2мл 0,00-0,0490 (мас./об.) розчинів глюкози, оброблених аналогічним способом розчином ЮОМ5.
В спостережуване поглинання для розчинів ферментних реакцій вносять поправку на неспецифічне поглинання, здійснюючи реакцію, в якій ОМЗ розчин добавляють до суміші перед додаванням ферментного розчину. Одну одиницю активності ламінаринази визначають як кількість ферменту, що продукує 1мкмМмоль глюкозного еквіваленту в 1хв. в умовах аналізу (502С і рН 5,0). 1.7. Аналіз ендо-1,4-В-ксиланази із використанням ОМ5 та ксилану деревини берези
Аналіз активності ендо-1,4-В-ксиланази базується на ферментному гідролізі ксилозидних зв'язків в ксилані деревини берези, В-1,4 ксилані. Продукти реакції, олігосахариди В-1,4-ксилану, визначають за кінцевим збільшенням рівня відновлення (як ксилози).
Розчин, що містить мл 195 (мас./об.) розчину ксилану деревини берези в 0,1М натрій-ацетатному буфері, рН 5,0 (або при інших значеннях рН); мл відповідним чином розведеного ферментного розчину інкубують при 502 протягом 1Охв. Ферментну реакцію зупиняють, додаючи 2мл ЮМ5 розчину (190, мас./об.) 3,5-динітро-саліцилової кислоти, 1,695 (мас./об.) гідроксиду натрію, 3095 (мас./об.) калій-натрій (к)-тартрату в дистильованій воді).
Цей розчин перемішують і поміщають в баню з киплячою водою (мінімум 952С) на 5хв., потім охолоджують до 25960. До розчину добавляють 1Омл дистильованої води, і поглинання вимірюють при 54О0нм, використовуючи с скляну кювету товщиною 2см. о
Отриманий результат перетворюють в мкмоль відновленого цукру (як ксилози), порівнюючи зі стандартною кривою для 2мл 0,00 - 0,03 9о (мас./об.) розчинів ксилози, оброблених аналогічним способом розчином ЮОМ5.
В спостережуване поглинання для розчинів ферментних реакції вносять поправку на неспецифічне поглинання, здійснюючи реакцію, в якій ОМЗ розчин добавляють до суміші перед додаванням ферментного «- розчину. Одну одиницю активності ендо-1,4-В-ксиланази визначають як кількість ферменту, що продукує со 1мкмоль ксилозного еквіваленту в 1хв. в умовах аналізу (502 і рН 5,0 або при інших значеннях рН). 1.8. Аналіз ендо-1,4-В-ксиланази із використанням ЮОМ5 та арабіноксилану пшениці і,
Аналіз активності ендо-1,4-В-ксиланази базується на ферментному гідролізі ксилозидних зв'язків в ч- арабіноксилані пшениці, заміщеному арабінозою В-1,4-ксилані Продукти реакції, олігосахариди 3о арабіно-В-1,4-ксилану, визначають за кінцевим збільшенням рівня відновлення (як ксилози). -
Розчин, що містить мл 195 (мас./об.) розчину арабіноксилану в 0,1М натрій-ацетатному буфері, рН 5,0 (або при інших значеннях рН); їмл відповідним чином розведеного ферментного розчину інкубують при 502 протягом 1Охв. Ферментну реакцію зупиняють, додаючи 2мл ЮМ5 розчину (190, мас./об.) 3,5-динітро-саліцилової « кислоти, 1,695 (мас./об.) гідроксиду натрію, 3095 (мас./об.) калій-натрій (к)-тартрату в дистильованій воді). З
Цей розчин перемішують і поміщають в баню з киплячою водою (мінімум 952С) на 5хв., потім охолоджують до с 25960. До розчину добавляють 1Омл дистильованої води, і поглинання вимірюють при 54О0нм, використовуючи :з» скляну кювету товщиною 2см.
Отриманий результат перетворюють у мкмоль відновленого цукру (як ксилоза), порівнюючи зі стандартної кривою для 2мл 0,00-0,0395 (мас./об.) розчинів ксилози, оброблених аналогічним способом розчином ОМ. - 15 В спостережуване поглинання для розчинів ферментних реакцій вносять поправку на неспецифічне поглинання, здійснюючи реакцію, в якій ОМЗ розчин добавляють до суміші перед додаванням ферментного -і розчину. Одну одиницю активності ендо-1,4-В-ксиланази визначають як кількість ферменту, що продукує с 1мкмоль ксилозного еквіваленту в 1хв. в умовах аналізу (502 та рН 5,0; або при інших значеннях рН). 50 1.9. Аналіз ендо-1,4-В-ксиланази віскозиметричним способом із використанням арабіноксилану пшениці (ее) Аналіз активності ендо-1,4-В-ксиланази базується на ферментному гідролізі стандартного розчину ще арабіноксилану пшениці. Причому активність визначають за зменшенням відносної в'язкості залежно від часу.
Розчин, що містить мл 195 (мас./об.) розчину арабіноксилану пшениці в 0,1М натрій-ацетатному буфері, рН 5,5 (або при інших значеннях рН); Змл дистильованої води і Тмл відповідним чином розведеного ферментного 5 Возчину вводять у мікровіскозиметр НааКке (використовуючи золоту кульку, калібровану до 0,1-2,0мПа сс), та вимірюють час падіння кульки (Ттест) (в мс щодо визначеної висоти падіння) кожні ЗОс протягом 15-20хв. при (Ф, 302С. Середні часи падіння кульки вимірюють для води (5мл дистильованої води) і субстратного (мл, 190 ко (мас./об.) розчину арабіноксилану пшениці в 0,1М натрій-ацетатному буфері, рН 5,5 та 4мл дистильованої води) як і відповідно. Проводять контрольні виміри аналогічним способом. Відносну текучість ЩЕ 60 розраховують для кожного значення Богтняи у такий спосіб:
Нахил кривої ще залежно від часу (минулий час, під час якого проведено кожний вимір Я). розраховують бо як зміну відносної в'язкості в хвилину ФВ і воно є пропорційним концентрації ферменту.
Одну одиницю активності ендо-1,4-В-ксиланази визначають як кількість ферменту, що гідролізує субстрат, зменшуючи в'язкість розчину, забезпечуючи зміну відносної текучості в 1 (безвимірна одиниця) в 1хв. в умовах аналізу (302С і рН 5,5 або при інших значеннях рН). 1.10, Аналіз В-ксилозидази з використанням п-нітрофоніл-В-О-ксилопіранозиду
Анализ В-ксилозидази базується на ферментному гідролізі п-нітрофоніл-В-О-ксилопіранозиду. Продукт реакції, п-нітрофенол, визначають колометрично.
Розчин, що містить мл 0,195 (мас./об.) п-нітрофоніл-В-О-ксилопіранозиду в дистильованій воді; мл дистильованої води; 7мл 0,2М натрій-ацетатного буферу, рН 5,0; їмл відповідним чином розведеного 7/0 ферментного розчину інкубують при 5022 протягом ЗОхв. Ферментну реакцію зупиняють, додаючи 4мл 0,4М розчину гліцину. Цей розчин перемішують і охолоджують до 202С. Поглинання вимірюють при 4ООнм, використовуючи скляну кювету товщиною 1см.
Отриманий результат перетворюють у мкмоль п-нітрофенолу, порівнюючи із коефіцієнтом молярної екстинкції п-нітрофенолу в цих же умовах.
В спостережуване поглинання для розчинів ферментних реакцій вносять поправку на неспецифічне поглинання, здійснюючи реакцію, в якій розчин гліцину добавляють до суміші перед додаванням ферментного розчину. Одну одиницю активності ксилозидази визначають як кількість ферменту, що продукує 1мкмоль п-нітрофенолу з п-нітрофеніл-В-О-ксилопіранозиду в хвилину в умовах аналізу (502С і рН 5,0). 1.11. Аналіз 4-М-арабінофуранозидази з використанням п-нітрофеніл-о-І -арабінофуранозиду
Аналіз А-М-арабінофуранозидази (арабінофуранозиду) базується на ферментному гідролізі п-нітрофеніл-о-І -арабінофуранозиду. Продукт реакції, п-нітрофенол, визначають колориметрично.
Розчин, що містить їмл 0,195 (мас./об.) п-нітрофеніл-о-І -арабінофуранозиду в дистильованій воді; Тмл дистильованої води; 7мл 0,2М натрій-ацетатного буферу, рН 5,0; їмл відповідним чином розведеного ферментного розчину інкубують при 50 «С протягом ЗОхв. Ферментну реакцію зупиняють, додаючи 4мл 0,4М с 29 розчину гліцину. Цей розчин перемішують і охолоджують до 202С. Поглинання вимірюють на 4ООнм, Ге) використовуючи скляну кювету товщиною 1см.
Отриманий результат перетворюють у мкмоль п-нітрофенолу, порівнюючи з коефіцієнтом молярної екстинкції п-нітрофенолу в цих же умовах.
В спостережуване поглинання для розчинів ферментних реакцій вносять поправку на неспецифічне -- 3о поглинання, здійснюючи реакцію, в якій розчин гліцину добавляють до суміші перед додаванням ферментного (ее) розчину. Одну одиницю активності арабінофу-ранозидази визначають як кількість ферменту, що продукує 1мкмоль п-нітрофенола з п-нітрофеніл-о-І -арабінофуранозиду в 1хв. в умовах аналізу (509С і рН 5,0). о р р р ур У У У 1.12. Аналіз ферулоїл-естерази ЕАХХ методом - з Аналіз ферулоїл-естерази (естерази ферулової кислоти) базується на ферментному гідролізі М
О-І5-О-(транс-ферулоїл)- о-І-арабінофуранозил|-(1 -»3)-0-8-О-ксилопіранозил-(1.- 54)-О-ксилопіранози (РАХХ).
ЕАХХ одержують із ферментативно гідролізованих пшеничних висівок, очищують і характеризують за допомогою
ЯМР. ЕАХХ гідроліз визначають спектрофотометрично.
Ферментативну реакцію підтримують при довжині хвилі 325нм, використовуючи кювету товщиною 1см, у « 20 розчині, що містить О0,050ОМ РАХХ в 0,1М МОРЗ буфері, рН 6,0 при 3720. з с Одну одиницю активності ферулоїл-естерази на ГАХХ визначають як кількість ферменту, що перетворює 1мкмоль субстрату в продукт в 1хв. в умовах аналізу (372Сі рн 6,0). ;» 1.13. Аналіз ферулоїл-естерази за допомогою Агаоб
Аналіз ферулоїл-естерази (естерази ферулової кислоти) базується на ферментативному гідролізі Ага 2 (ферулова кислота, зв'язана по 1,2 з арабінозою). Ага» одержують із ферментативно гідролізованої пульпи -І цукрового буряка, очищують і характеризують за допомогою ЯМР. Гідроліз Ага об визначають спектрофотометрично. це. Ферментативну реакцію спостерігають при довжині хвилі 325нм, використовуючи кювету товщиною 1см, у г) розчині, що містить 0,050М Ага» у 0,1М МОРЗ буфері, рН 6,0 при 3726.
Одну одиницю активності ферулоїл-естерази на Агажє визначають як кількість ферменту, що перетворює со 1мкмоль субстрату в продукт в 1хв. в умовах аналізу (372Сі рн 6,0). - М 1.14. Аналіз ферулоїл-естерази з використанням гідролізу метилових естерів: метил-ферулової кислоти (МЕА); метилкофеїнової кислоти (МСА); метилсинаповой кислоти (М5А); метил-р-кумарової кислоти (МрСА)
Аналіз ферулоїл-естерази (естерази ферулової кислоти) базується на ферментативному гідролізі метилових естерів ферулової кислоти (МЕА); кофеїнової кислоти (МСА); синапової кислоти (М5А); і п-кумарової кислоти (МреСА). Гідроліз метилових естерів визначають у 0,01М МОР5 буфері, рН 6,0 при 372С. Аналіз базується на двох о різноманітних методиках. іме) У спектрофотометричному способі концентрація субстрату метилових естерів складає О,10мМ, і за гідролізом естерів спостерігають при довжині хвилі 325нм, використовуючи кювету товщиною см. У цьому способі бо початкова концентрація субстрату обмежена.
У способі з використанням ВЕРХ концентрація субстрату метилових естерів складає 1,0мМ, і за гідролізом естерів спостерігають, вимірюючи виділення вільної кислоти за допомогою ВЕРХ із 10-3Охв. інтервалами. У цьому способі немає обмеження за концентрацією субстрату, і вимірювані активності є значно вищими, ніж концентрації, які визначають спектрофотометрично. бБ Одну одиницю активності ферулоїл-естерази визначають як кількість ферменту, що перетворює 1мкмоль субстрату в продукт за 1хв. в умовах аналізу (372Сі рн 6,0).
1.15. Визначення концентрації білюу за допомогою модифікованого аналізу Вгадіога зв'язування білку з
Соотаззіе ріце
Аналіз концентрації білку базується на модифікованому аналізі Вгадіога зв'язування білку з Соотавззіє Біе із використанням Вгйапі Віше С (кумассі-діамантовий блакитний), що вимірюється спектрофотометрично при довжині хвилі 595нм, використовуючи кювету товщиною см. Цей спосіб (Зідта В 6916) стандартизований із використанням альбуміну бичачої сироватки (Зідта РОЗА). 1.16. Визначення ізоелектричної точки за допомогою ізоелектричного фокусування
Ізоелектричні точки білків визначають стандартними способами, використовуючи такі попередньо відлиті 70 Вертикальні 595 поліакриламидні гелі, як гелі від МОМЕХ 9 для інтервалу рН 3-10 (р1 інтервал 3,5-8,5) або рН 3-7 (рі інтервал 3,0-6,5) у кюветі МОМЕХ?У Хсеї! тм Міпі-Сеїї. Використовують МОМЕХУ катод, анод і ІГЕ зразкові буфери для рН 3-10 або рН 3-7. Використовують МОМЕХ? стандартний протокол для ізоелектричного фокусування, фіксування, фарбування барвником Соотазвзіе К-250 Віце і знесолення. 1.17. 58Ю5-РАСЕ (гель-електрофорез в натрійдодецилсульфат-поліакриламідномугелі)
Аналітичний поділ і визначення молекулярної маси білків здійснюють стандартними ЗО5-РАСЕ методами.
Попередньо відлиті МОМЕХ?У МиРАСЕ гелі (МІИРАСЕ м Вів-Тгіз гелі або МИРАСЕ:м Ттгіз-ацетатні гелі з МОМЕХ? рекомендованими робочими буферами використовують у МОМЕХ? Хсееї| Іїтм Міпі-Сеїї. Використовують МОМЕХУ зразкові препаративні і робочі буфери і стандарти молекулярних мас. Використовують МОМЕХ У стандартні 2о протоколи для 5О5Б-РАСЕ, фіксування, фарбування барвником Соотавззіє К-250 Віце і знесолення. 2. Результати аналізу суміші ферментів 2.1. Оптимальні значення рн 2.1.1. Активність ендо-1,3(4)-В-глюканази
Аналіз ендо-1,3(4)-В-глюканази з Репісіїйшт Типісоїозуит здійснюють у стандартних умовах при 502С, за с ов допомогою способу із використанням ЮМЗ і В-глюкану ячменя. Ферментативну активність вимірюють при значеннях рН між 3,0 та 7,0. Оптимальні значення рН для активності ферменту складають 4,0-5,0 (табл. 1). о - ендо-1,3(4)-В-глюканази з РепісіПшт пісоївит зо со о 11 м щі в 1111 т 2.1.2. Активність ендо-1,4-В-ксиланази «
Аналіз ендо-1,4-В-ксиланази з Репісійит Яипісоїозит здійснюють у стандартних умовах при 509С, за 7 с то допомогою способу з використанням ОМ і ксилану деревини берези (табл. 2). з ендо-1,4-В-ксиланази з РепісіПшт пісоїювит 5 я - -
Фо
Ге. й вияв зв о в 1-15 з 2.2. Оптимальна температура 60 2.2.1. Активність ендо-1,3(4)-В-глюканази
Аналіз ендо-1,3(4)-В-глюканази з РепісіШит Типісоюозит здійснюють у стандартних умовах при рН 5,0 (оптимальне значення рН для цього ферменту) за допомогою способу з використанням ЮОМ5 та В-глюкану ячменя. Ферментативну активність вимірюють при значеннях температури між 30-70 20. Значення оптимальних температур знаходяться між 50-60 «С, причому найвища активність спостерігається при 60 2С. Результати бо досліджень приведені в табл. 3.
на ферментативну активність ендо-1,3(4)-В-глюканази з РепісіПшт пісоївит о 111001, ою 1т вв 2.2.2. Активність ендо-1,4-В-ксиланази
Аналіз ендо-1,4-В-ксиланази з Репісішт 7ипісоїюозит здійснюють у стандартних умовах при рН 5,51 3,5 за допомогою способу з використанням ЮОМ5 і ксилану деревини берези. Ферментативну активність вимірюють при значеннях температури між 30- 7026.
Значення оптимальних температур знаходяться між 50-60 «С, причому найвища активність спостерігається при 502С для рН 5,5 і при 602С для рН 3,5. Результати досліджень приведені в табл. 4. на ферментативну активність ендо-1,4-В-ксиланази з РепісіПшт пісоїювит Ге
Температура, "С Активність Активність о шир ою 1яма о б6)вв ло - зо ряба 075)000леив6 лою со лю 1177вввіва) лото вв со
Ферменти, продуковані Репісіїйшт Яипісоїовит, відрізняються високими рівнями целюлази, - ендо-1,3(4)-В-глюканази та інших глюканолітичних активностей. Крім того, вони також характеризуються М високими рівнями ендо-1,4-В-ксиланази і активностями супутніх ферментів ксиланази. Широкий спектр геміцелюлолітичних ферментів є характеристикою ферментних препаратів, які отримують із цього мікроорганізму.
Кожну із вимірюваних активностей можна уявити як відношення до основної активності для цього препарату. « 20 Приклади отриманих результатів подані в табл. 5. Ці відношення можуть змінюватися в препаратах, отриманих із -о с різноманітних партій ферментації. хз» різноманітних субстратів й - і Типісоїовит щі о со з о і 117), рН 5,0 5 в
3.1 Способи очищення
Хроматографія гідрофобних взаємодій
Препарати, отримані після фільтрації і концентрування ферментаційного середовища до концентрації білку и5000112,вмг/мл, розводять 1/1 буфером для хроматографії гідрофобних взаємодій (НІС) (60ММ фосфатний буфер, рН 7,0 / 1,7М (МН)»ЗО, / 0,04965 азид натрію), заміняють на НІС буфер (РО-10 колонки; Рпагтасіа). Порції (по 1Омл) високоефективного НІС гелю (РІаптасіа) вводят в колонку (діаметр 10х5см, 200мл) РпепуІЗерпагоев м, і розділяють, використовуючи градієнт сульфату амонію (МН 4)250,4 із концентрацією, що знижується (1,7-0,0М) за 1Охв. Фракції (по 1Омл) збирають і аналізують на активність ксиланази. 70 НІС дає два основних піки активності ксиланази. Перший, названий А, елююється з колонки, коли концентрація (МН )250.4 знижується до приблизно 0,6М, тоді як другий, названий В, елююється при концентрації (МНАд»ЗО,) приблизно 0,25М. Фракції, що містять піки А та В, із кожного введення збирають окремо. Повна фракція А відповідає 2,890 від повної активності ксиланази, тоді як фракція В відповідає 97,295 від повної активності ксиланази. Вихід складає 77905.
Іонообмінна хроматографія
Об'єднані фракції піків А и В із НІС осаджують, підвищуючи концентрацію (МН4а)»5О4 до 10095 насичення з наступним центрифугуванням (10000худ протягом ЗО хв.). Осади знову розчиняють у суміші 20мл Ттгів-НСЇІ буфера, рН 8,0 / 0,0495 азид натрію та знесолюють до того ж самого буфера, використовуючи РО-10 колонку.
Зразки (5мл) вводять у МопоС) тм НЕК 10/10 аніонообмінну колонку (Ріагтасіа), попередньо урівноважену сумішшю 20мМ Тгтгіз-НСІ буферу рН 8,0 / 0,0495 азид натрію, і елююють із швидкістю 2мл/хв. із концентрацією хлориду натрію Масі (0-1М), що підвищується в тому ж самому буфері. Фракції (2мл) збирають і аналізують на активність ксиланази.
ПікА
Виділення піка А за допомогою аніонообмінної хроматографії призводить до одержання одного піку Га активності ксиланази, який елююють при приблизно 0,3М Масі. Найбільш активні фракції збирають і аналізують за допомогою ЗО5-РАСЕ (гель-електрофорез у натрійдодецилсульфат-поліакриламіді). Одержують одну і) основну смугу з молекулярною масою 48кДа. Виділення активності ксиланази після ІЕЕ (ізоелектричне фокусування підтверджує, що ця основна Соотазвіе-пофарбована смуга є ксиланазою.
Пік В «--
Виділення піку В за допомогою аніонообмінної хроматографії дає два основних піки активності ксиланази, один із яких елююється в піці матеріалу, що не сорбується (незв'язаний матеріал; пік В-І), а інший - при 01М со
Масі (пік В-ІЇ). Присутні також два невеликих піки, що елюються при 0,13М і 0,19М Масі. Активні фракції, що со відповідають кожному піку, збирають і аналізують за допомогою ЗБОЗ-РАСЕ, але жодний із зразків не є чистим.
Гель-фільтраційна хроматографія -
Об'єднані фракції, що містять В-Ї і В-ІЇ, сушать виморожуванням, знову розчиняють у воді й знесолюють ч- (використовуючи РО-10 колонки). Зразки (0,2мл) вводять у З,ирегдех тм 75 НК колонку (Рпагтасіа) і елююють при швидкості О,4мл/хв. буфером 20мМ Вів-Тгів, рН 6,0 / 0,2М Масі / 0,0495 азид натрію. Фракції (О0,4мл) збирають і аналізують на ксиланазну активність. « 3.2. Характеристики ксиланаз 3.2.1. Визначення ізоелектричної точки за допомогою ізоелектричного фокусування - с Ізоелектричні точки білків визначають стандартними способами, використовуючи попередньо відлиті ч вертикальні 595 поліакриламідні гелі від МОМЕХ? для рН 3-10 і рН 3-7. Використовують МОМЕХ?У катод, анод і я ІЕЕ зразкові буфери, і стандартні протоколи для ізоелектричного фокусування, фіксації, фарбування Соотазвззіеє
К-250 Віце барвником, і знебарвлення.
Для ксиланази А використовують зразок після Мопоо). - Для ксиланаз В-І і В-І використовують зразок після НІС, ксиланазу В. Для кожного з А і В невеликий -1 зразок (1Омкл) поміщають в окрему комірку, і великий зразок (5ХОмкл) поміщають у потрійну комірку. Після фокусування зразків гель розрізають на дві частини так, що одна частина містить два невеликих зразки (АВ) і і95) маркери молекулярної ваги (ця половина пофарбована Соотаззіє), тоді як інша частина містить два великих со 50 зразки. Частину гелю, що містить великі зразки, розрізають так, щоб розділити смуги двох зразків, а потім кожну зі смуг розділяють на ділянки по 2мм. Кожну із 2мм ділянок вимочують окремо протягом ночі в 100мММ "6 МОРЗ буфері, рН 6,0 / 0,0495 азид натрію. Фракції аналізують на активність ксиланази.
Для зразка А ксиланази пофарбований ІЕЕ гель демонструє одну основну смугу рі! 3,55 маркера і декілька невеликих примісних смуг. Ксиланазна активність виявлена тільки у фракції, що відповідає цій смузі, підтверджуючи, що основний пік відповідає ксиланазі. о Для зразка В пофарбований ІЕЕ гель демонструє декілька смуг в інтервалі значень рі. Ксиланазна активність мала місце в двох розділених фракціях непофарбованого гелю і відповідає білкам із рі 4,2 і 4,8. іме) 3.2.2. Визначення молекулярної маси за допомогою БО5-РАСЕ
Для підтвердження молекулярних мас ксиланаз у піку В з НІС фракції з ксиланазною активністю, елюйованої 60 з ЕЕ гелю, знесолюють, сушать виморожуванням і розділяють за допомогою 5БО5-РАСЕ. Денатурування РАСЕ здійснюють, використовуючи 10905 Тгіз-гліциновий гель (МОМЕХФ) із дітіотреїтолом (ОТ 50 мМ), включеним в зразковий буфер як відновлювальний агент.
Пофарбований гель показує, що обидві ксиланази виявилися чистими, з молекулярними масами ЗбкДа і 15кДа для ксиланази В-І і В-ІЇ, відповідно. 65 Усі три очищені ксиланази аналізують за допомогою 5О5-РАСЕ: фракцію ксиланази А після аніонообмінної хроматографічної обробки, фракції ксиланази В-І і В-ІЇ після гельфільтраційної хроматографічної обробки.
Ксиланаза А дає одну смугу з молекулярною масою 48кДа. Ксиланаза В-І| дає одну основну і чотири невеликі смуги після фарбування Соотаззіє. Підтверджується, що основна смуга відповідає ксиланазі, тому що її молекулярна маса дорівнює ЗбкДа. Ступінь чистоти оцінюють як 9095. Ксиланаза В-І дає основну смугу з Молекулярною масою 15кДа і 2-3 невеликі смуги. Ступінь чистоти цієї ксиланази приблизно 9595. Результати представлені у табл. 6. маси ксиланази за допомогою ЗОЗ-РАСЕ ді | ражж ІМолеюулярна маса, де Рі
Тести по вимірюванню активності ферментів були описані вище. 3.2.3.1. Аналіз ксиланази А
ІБілок) О,4мг/мл. Результати наведені у табл. 7 і 8. " різноманітних субстратів
Методи, використані під час тестування рн сч о - зо со о
ПН я КИ
Примітка: - 7) н/в - не визначали, н/п - не придатне. і - х ксиланази відносно ксилану деревини берези 4 З с . » 1 - т вв о о 50 3.2.3.2. Аналіз ксиланази В-Ї - й ІБілок) О,09бмг/мл. Результати наведені у табл. 9 і 10. ; різноманітних субстратів
ГФ) Методи, використані під час тестування рн ю
Целюлоза (ОМ СМС спосіб відно з процедурою 1) 11111110 БО 265 зо вв
Ендо-1,4-В-ксиланаза ( використанням ЮОМЗ та арабіноксилану пшениці згідно з процедурою 1.8) |3,5| 143,8 971 ксиланази відносно ксилану деревини берези рн з і в |в 20 3.2.3.3. Аналіз ксиланази В-ЇЇ (Білок) О,165мг/мл. Результати наведені у табл. 11 і 12.
З
25 різноманітних субстратів
Методи, використані під час тестування рн і) - зо со
Фо м зв М 4 40 - с и Вплив рН на ферментативну активність з рн - в с я. со з вт 3.2.4. Послідовності
Один із варіантів даного винаходу відноситься до послідовностей амінокислот і нуклеїнових кислот для
Ф) описаних вище білків або їхніх варіантів. ка Для цієї мети послідовності ксиланаз ідентифікують за амінокислотними послідовностями очищених білків (ксиланаза А, ксиланаза В-І і ксиланаза В-І0иІ) і при порівнянні послідовностей амінокислот і нуклеотидів із бо послідовностями відомих грибкових ксиланаз.
Слід розуміти, що в рамках даного винаходу термін "варіанти" відноситься до будь-якого поліпептиду або будь-якого аналогу білку фрагменту білку, похідного або білку-мутанту з нативного білку або поліпептиду і який має ті ж самі біологічні функції, що і зазначений нативний білок або поліпептид. У природному стані можуть існувати різноманітні варіанти. Такими варіантами можуть бути, наприклад, алельні варіанти, що 65 характеризуються відмінностями в послідовності генів, які кодують зазначений білок, або можуть бути результатом диференційного сплайсінгу або пост-трансдукціних модифікацій. Варіанти можна одержати шляхом заміщення, делеції, додавання і/або модифікації однієї або більше з амінокислот. Всі модифікації добре відомі і їх можна здійснити будь-якими відомими спеціалістам способами.
Варіантами є молекули, що мають, наприклад, велику спорідненість до їх субстрату; або які мають нові біологічні властивості.
Іншою метою даного винаходу є також застосування послідовностей для експресії описаних білків або поліпептидів у клітинах-хазяїнах одноклітинних або багатоклітинних організмів. Для цієї мети зазначені послідовності можуть бути введені в геном вектору. Зазначеним вектором може бути плазміда. фаг або вірус.
Тому іншим варіантом даного винаходу є клітина-хазяїн, виділена з одноклітинного або багатоклітинного 7/о організму, трансфікована або інфікована вектором, як описано вище. У кращому варіанті клітиною-хазяїном є бактерія.
Іншим варіантом даного винаходу є застосування зазначених векторів, що включають послідовність нуклеїнових кислот описаних вище білків для експресії зазначеного білку в будь-яку клітину-хазяїна. 3.2.4.1 Послідовності ксиланази С
Створення зондів базується на порівняннях амінокислотних і нуклеотидних послідовностей відомих грибкових ксиланаз. Визначають консервативні ділянки і використовують для створення ПЛР праймерів, продукти яких можна було б використовувати для скринування геномної бібліотеки Репісійшт ?7ипісоїовит.
Створюють дві пари дегенерованих праймерів. Першу пару створюють для ампліфікації 200п.о. (приблизно) продукту з гену ксилазьі типу В (або типу 2). Другу пару створюють для ампліфікації 250п.о. продукту з гену Ксиланази типу А (тип 1).
Полосу 258п.0о. одержують с праймерами З і 4. Після клонування в рРОЕМТ і секвенування було виявлено, що наявна значна схожість послідовності з послідовністю грибкової ксиланази типу А/1. Плазміду, що містить клонований продукт, називають РРЕХМУІ А.
Повна послідовність ксиланази С представлена на фіг. 1 і в послідовності з ідентифікаційним Мо 1 с (послідовність з ідент. Мо1). 3.2.4.2 Послідовності ксиланази В-Ї (8)
Для конструювання дегенеративних ПЛР праймерів (послідовність з ідент. Мо2 і Мо3) використовують внутрішню амінокислотну послідовність поряд із порівняннями послідовностей інших грибкових целобіогідролаз.
Продукт 290п.о. (послідовність з ідент. Мо4) ампліфікують і клонують в рРОЕМТ (Рготеда) для створення - зо РОЕМТСВА, і секвенують. На фіг. 2 видно, що праймерні послідовності підкреслені. Цей продукт ПЛР в даний час застосовують як зонд для скринування геномної бібліотеки Репісійшт ?типісоїозит ІМІ134756. со 3.2.4.3. Послідовність ксиланази В-ЇЇ с
Вся послідовність гену ксиланази В-ІЇ включає 1,3кп.о. 5 нетрансльованої і розташованої у зворотному напрямку ділянки і 0,85кп.о. З' нетрансльованої ділянки, 54п.о. інтрон і 66бОп.о., які кодують білок з 223 в. амінокислот. ї-
Для доказу існування 54п.0о. інтрону використовують ПЛР із зворотною транскриптазою (КТ-РСК). Повну РНК виділяють із міцелію культур РепісійШт ?ипісоїовит ІМІ134756, зібраних після 4 днів вирощування на 190 (мас./об. ) ксилані вівса. Конструюють праймери для ампліфікації аж до 195п.о. фрагменту з інформаційної РНК (249п.о. з геномної ДНК) і до 433п.о. (487п.о. з геномної ДНК). «
Секвенування Зкп.о. із З'їінця плазміди (РРЕХУМС2) виявило ген (позначений рег А), що містить два з с передбачуваних інтрони, і кодує поліпептид, який складається приблизно з 570 амінокислот. Цей поліпептид демонструє значну схожість послідовності із амінокислотними пермеазами грибків. з 3.2.4.4. Послідовність ксиланази А
Була отримана внутрішня послідовність ксиланази А, вона представлена такою послідовністю амінокислот:
ЛЕАІМУМОСУ
-І 3.3 Властивості ферулоїл-естераз 3.3.1. Очищення - Здійснюють таким же способом, що і для ксиланаз. 2) Суміш ферментів містить, принаймні, дві різні ферулоїл-естерази. У однієї з них (ГаеВ) молекулярна маса 5ор за даними мас-спектрометрії складає 38945-41051Да (35450Да з первинної амінокислотної послідовності та со З7кДа за даними 5О5-РАСЕ). РаевВ має значення рі 4,2, що відповідає ферулоїл-естеразі типу В и є специфічним шк для МрСА, і Ага» субстратів (активність по відношенню до МрСА, МСА, МРЕА і Ага»Е; але не по відношенню до
М5А і ГАХХ).
У іншої ферулоїл-естерази (ГаеА) молекулярна маса складає 29кКДа (за даними 505-РАСЕ). РаеА має ов Значення рі 4,65, що відповідає ферулоїл-естеразі типу А, і є специфічним для РАХХ і МЗА субстратів (активності по відношенню до М5А, МСА, МЕРА і РАХХ, але не по відношенню до МрСА Ага»).
Ф) 3.3.2. Визначення ізоелектричної точки за допомогою ізоелектричного фокусування ка Ізоелектричні точки білків визначають стандартними способами. Суміш ферментів наносять у вигляді широкої смужки (коло 20мм) в ІЕЕ гель та здійснюють електрофорез при зниженій температурі (523). Після фокусування бо і звуження смуги гель розрізають по середині смуги зразка. Одну частину смуги зразка і ІЕР стандарти фіксують, забарвлюють і знесолюють, використовуючи стандартний протокол. Іншу частину смуги нарізають на ділянки шириною 2мм в і кожну ділянку вимочують протягом ночі в мл 100мММ МОРБбуферу, рН 6,0. Активність ферулоїл-естерази визначають для кожної ділянки гелю, використовуючи МЕА, МреСА і М5А як субстрати.
Пофарбований ІЕЕ гель демонструє наявність дуже багатьох білків у целюлазі, рі значення для який 65 Варіюються в інтервалі від дуже кислотних (рі 2,4) до приблизно рі 7. Більшість білків є кислотними (інтервал рі 2,4-53. Два піки ферулоїл-естеразної активності виявляють у фракціях, вирізаних із гелю. Один, що відповідає РаевВ, має значення рі 4,2 і активність тільки по відношенню до МЕА і МрСА (але не М5А). Інший, що відповідає ЕРаеА, має значення рі 4,65 і активність відносно всіх трьох тестованих субстратів. 3.3.3 Молекулярна маса, визначена за допомогою 5О5-РАСЕ
Молекулярні маси визначають за допомогою ЗОЗ-РАСЕ, використовуючи 10905 Тгіз-гліцинові гелі. Одержують
ЗО5-РАСЕ гелі, фіксують, забарвлюють Соотазвззіе Віце барвником і знесолюють, використовуючи стандартний протокол.
Суміш ферментів містить, принаймні, дві різноманітні ферулоїл-естерази. В однієї з них, що відповідає
ЕаевВ (рі 4,2), молекулярна маса складає З37кДа. В іншій, що відповідає ЕаеА (рі 4,65), молекулярна маса 7/0 складає 29кДа.
Молекулярну масу РаеВ оцінюють як 3445О0Да з первинної амінокислотної послідовності і як 38945-41051Да за даними мас-спектрометрії. 3.3.4. Активність ферулоїл-естерази
Аналіз на активність ферулоїл-естераз здійснюють на суміші ферментів (табл. 13), використовуючи 7/5 спектрофотометричний метод. залежно від різноманітних субстратів
Методи, використані під час тестування я нд ідіоти ся 7 о
Суміш ферментів містить активності проти всіх тестованих субстратів. Для метилес-тераз найвищою - активністю є активність відносно МрСА, а самою низькою - відносно М5А.
Активності відносно АгагР і РАХХ вище, ніж відносно метилестераз, що є показником того, що активності 00 естераз зв'язані з істинними ферулоїл-естеразами, а не із загальними естеразами або побічними активностями с інших руйнуючих стінки клітин естераз (наприклад, ацетил-ксилан-естераза, пектин-естераза). 3.3.5. Послідовності ї- 3.3.5.1 Послідовність ЕЕА-А м
Відповідно до розщеплення очищених білків одержують внутрішні амінокислотні послідовності як:
Послідовність 1
ОХ ТІ РУЬМУМРМК
Послідовність 2 « дю АМАММ5ЗОАМІ. -
Послідовність З с ТЕМ5О (С/А) ОБЕНРУМУЛАБООР :з» Послідовність 4
ОТЕМКООНСТРТМРРАРААОЗОТНІКУМ
Конструюють декілька дегенеративних ПЛР праймерів з амінокислотних послідовностей, отриманих з - 15 очищеного білку. Багато з продуктів були клоновані в РОЕМТ (Рготеада) і секвеновані.
За допомогою ПЛР було виявлено, що плазміда, названа РЗЕМТО19 (180п.0.) (фіг. З містить послідовність, -і що розпізнається як пептидна послідовність 4, представлена вище. Я показано на фіг. З, праймерні сю послідовності підкреслені двічі, а раніше відома послідовність підкреслена ще один раз.
Послідовності нуклеїнової кислоти і амінокислот РАЕ-А подані в послідовності з ідент. Моб. 00700 33,52. Послідовність ЕЕА-В ще Праймери, сконструйовані із пептидної послідовності ЕАЕ-В, використовують для посилення зонду, який потім використовують для скринування геномної бібліотеки РепісіПШт Типісоїюзит. Клон 229п.о. виділяють і секвенують (послідовність з ідент. Моб). Ген, що кодує поліпептид із 304 амінокислот, має один передбачуваний інтрон. Передбачена амінокислотна послідовність представлена на фіг. 4, де зрілий білок (довжина зрілого 59 білку -338) зображений жирним шрифтом. Цей білок включає два різних домени, розділені в сильному ступені
ГФ) глікозилірованим лінкером. Як показано на фіг. 4, каталітичний домен зображений жирним шрифтом, тоді як
ГФ зв'язуючий домен зображений жирним шрифтом і підкреслений двічі, а лінкер представлений точечною жирною лінією.
Білок також відрізняється передбачуваним фрагментом активного сайта (серин-нуклеофіл), що показано бо підкресленням на фіг. 4, із такими передбаченими каталітичними тріадами: (1) 5136/0174/Н216 (2) 5136/0220/Н276.
ЕАЕ-В білок включає також послідовність секреції (353) і 10 цистеїнів. 3.4 Властивості глюканаз б5 й й не
Суміш ферментів обробляють за допомогою 20) гель-електрофорезу. ІЕЕЄ здійснюють, використовуючи попередньо відлиті вертикальні 590 поліакриламідні гели від МОМЕХОЯ для рН 3-7 (інтервал рі 3,0-6,5) у міні-комірці МОМЕХ? Хсеї тм Міпі-Сеїї. Використовують МОМЕХ? катод, анод і ІЕЕ зразкові буфери для рН 3-7, а також стандартний протокол МОМЕХ?У для ізоелектричного фокусування. Одну смугу відрізають, і обробляють електрофоретично в другому напрямку, використовуючи 1095 І аеттії 505-РАСЕ гель. З гелю виділяють другу смугу, розрізають на 35 фракцій, смужки гелю вимочують у буфері, і фракції аналізують на активність ферменту. Третю смугу лишають на гелі, фіксують, фарбують Соотазвіе К-250 Віце барвником і знесолюють, використовуючи МОМЕХ? стандартний протокол.
Значні активності ендо-1,3(4)-В-глюканази (спосіб ОМ5 і В-глюкану ячменя) і целюлази (спосіб ОМ5 і СМС) 70 виявлені у фракціях, що відповідають білкам із рі 4,2, молекулярною масою ЗбкДа і рі 5,4, молекулярною масою 27кДа. Для видалення ксиланази 6-1, що перебуває в одній з фракцій, фракції тестують на активність, використовуючи спосіб ЮОМ5 і ксилану деревини берези. У фракціях, що відповідають активностям В-глюканази або целюлази, активність ксиланази не виявлена.
Список малюнків
Фіг.1 - амінокислотна послідовність білку ксиланази С Репісійшт їТипісшовит.
Фіг.2 - нуклеотидна і амінокислотна послідовності продукту ПЛР ксиланази В-І (ХупВІ).
Фіг.З - нуклеотидна і амінокислотна послідовності ПЛР продукту ферулоїл-естерази А (ТаеА).
Фіг.4 - Амінокислотна послідовність білку (ГАЕ-М. або РАЕ-Ї) ферулоїл-естерази В (Тає) Репісійшт ?ипісцовит.
Е. Застосування суміші ферментів у кормах для тварин
Приклад 1: Оцінка ефективності препарату ферментів, продукованих Репісійшт ипісцовит відносно енергетичної цінності (АМЕу) корму із суміші пшениці і ячменя для бройлерів
Метою було продемонструвати ефективність ферментів (активність В-глюканази: 1О0бод./кг і активність ксиланази: 1100од./кг) на гадану обмінну енергію, скориговану за азотним балансом (АМЕк) корму, що містить 50965 пшениці і 2295 ячменя. с
Експерименти проводили за допомогою контрольних і ферментних препаратів (активність В-глюканази: Ге) 10бод./кг і активність ксиланази: 1100од./кг), використовуючи Європейський метод порівняння |Воигайоп еї а. Епгореап гегегепсе тео їТог (пе іп мімо де(ептіпайоп ої теїароїіїгарбіе епегду м/ййп айдш сосКеге!58: гергодисіїріїйу, епПесі ої аде, сотрагізоп м/йй ргедісіей маішев // Вгйіївй Рошйгу Зсіепсе. - 1990. - 31. -
Р. - 567-576) під час годівлі досхочу і повному зборі екскрету для віку між 18 і 21 днем. -- а. Матеріали і методи со
Птахи: Порода й умови вирощування
Одноденних півників бройлерів Козз утримують в клітинах колективної батареї до віку 12 днів. їм дають і) стандартний початковий корм. На 12-й день птахів зважують і рівномірно розподіляють на 10 окремих клітин для їм- кожної обробки, а потім їм дають експериментальний корм протягом періоду адаптації (мінімум 5 днів ).
Зо Підтримують стандартну температуру і вологість. Постійний світловий режим складає: 23 години світла і 1 в. годину темноти до кінця випробувань.
Корми: Птахи одержують початковий корм з одного дня життя до 12 днів, а потім одержують експериментальний корм. «
Експериментальні корми
Корми містять пшеницю і ячмінь у співвідношенні, 90 в) с т пшениця БО; "» ячмінь 22; мука канола 8; пташина мука 5; -і соєва мука 5; -і м'ясна мука 5; жир З; о вітаміни / мінерали 2. о 50
Ферментний препарат розпорошують на 20кг зерна. Характеристики експериментальних кормів наведені у -з табл. 14. ов о ю 60
Відновлення ферментів в кормах вимірюють віскозиметрично |Забрайег А.М., Різпй М.М. Меїпоа ої апаїувів ог
Теей епгутев: те(Пподоіодіса! ргоріепзв // доигпа! ої Арріїед Рошкгу Кезеагсп. - 1996. - 5. - Р. 408-413).
Вимір обмінної енергії
Баланс починають визначати з 18 дня (Д 18) у такий спосіб: 65 Д 17 - птахам не дають корму протягом ночі;
Д 18 - птахів зважують, очищають складальні лотки;
Д 19 - фекалії збирають і заморожують;
Д 20 - фекалії збирають і заморожують, уночі не дають корму;
Д 21 - фекалії збирають і заморожують, птахів зважують і знову годують.
Фекалії сушать виморожуванням і подрібнюють як корм (мм, подрібнювач Кеїзсі). Загальну енергію корму і екскрету визначають за допомогою адіабатичного колориметра ІКА С5000. Також визначають вміст білків (м"6,25, Кіеідай! метод 7130) і ліпідів (метод 7160). Коригування за азотним балансом вводять, використовуючи 1896 білок у збільшенні маси. р. Результати та обговорення 70 Очевидна обмінна енергія, скоригована за азотним балансом (АМЕм)
Зоотехнічні характеристики і величини обмінної енергії представлені в табл. 15 росту і очевидну обмінну енергію для бройлерів, що одержують експериментальний корм на основі пшениці Ії ячменя сч 2 о
Між обробками немає розходжень у зоотехнічних характеристиках.
При вирощуванні бройлерів ферментний препарат підвищує (АМЕм) корму на основі 5095 пшениці і 2290 -- ячменя на 6,296 (-204ккал/кг ОМ (Сухої Речовини)). с
Більш того, варіабельність енергетичної засвоюваності була знижена з 80 до б2ккал/кг ОМ.
Настільки значне збільшення демонструє користь обох активностей (ксиланази і В-глюканази), продукованих о
Репісійшт Типісоїовит відносно гідролізу розчинних не крохмалистих полісахаридів пшениці і ячменя. ча
Приклад 2: Вплив препарату ферментів, продукованих Репісійшт Т7ипісцовит, на засвоюваність корму
Зо бройлерами, що одержують як корм пшеницю -
Проводять випробування з метою визначити вплив препарату ферментів, продукованих РепісйШит
Типісціозит (активність В-глюканази; 1ООод./кг і активність ксиланази: 11Обод./кг) на очевидну обмінну енергію (АМЕ), на засвоюваність білків і ліпідів бройлерами, що одержують корм, який містить 5495 пшениці. «
Досліджують також залежність від ступеню здрібнювання корму. З 70 (1) Контроль 1 (5495 здрібненої пшениці). с (2) Контроль 1 ї- Препарат ферментів (активність В-глюканази 1О0бод./кг і активність ксиланази 1100од./кг).
Із» (3) Контроль 2 (3095 цілих зерен пшениці, 2495 здрібнених зерен пшениці). (4) Контроль 2 - Препарат ферментів (активність В-глюканази 1О0бод./кг і активність ксиланази 1100од./кг).
Відповідно до Європейського способу порівняння (корм ай Ірішт і повний збір екскрету для віку з 18 до 49 21 дня) (Воигайоп А. еї аІ. Еигореап гегегепсе теїйой ог (Ше іп мімо де(епгтіпайоп ої тегїароїїгаріе епегаду і м/йй адишй сосКегеїв: гергодисіїрійу, ейпесі ої аде, сотрагізоп м/йй ргедісіей маішез // Вій Рошкгу -І Зсіепсе. - 1990. - 31. Р. - 567-576). а. Матеріали і методи о Птиця: Порода й умови вирощування о 20 Одноденних півників бройлерів Козз утримують у клітинах колективної батареї до віку 12 днів. Потім їх переводять в індивідуальні клітини для визначення балансу засвоюваності. та Підтримують стандартну температуру і вологість. Постійний світловий режим складає: 2Згод. світла і год. темноти до 8-денного віку. Потім світловий режим змінюють на 15год. ЗОхв. світла і год. ЗОхв. темноти через випробування, які проводяться в тому ж приміщенні. 29 Корми: Птахи одержують стандартний початковий корм до 12-денного віку, а потім одержують
ГФ) експериментальні корми.
Експериментальні корми о Корми містять 5495 пшениці, що характеризується, 90: 60 суха речовина 86,2; сирий білок 10,87; ліпіди 1,65;
В-глюкани 0,77; пентозани 6,8; бо відносна в'язкість при рН 4,5, мПасс 1,34;
відносна в'язкість при рН 1,5, мПасс 1,29.
Склад корму поданий у табл. 16, а його характеристики у табл. 17. основі пшениці
Інгредієнт пшениця "пшениця
Цеатшенщя || ою і кормів на основі пшениці о
Здрібнена (Ціла о же 77777711 85 вв. - зо со
Малій | ою | ово не ча 7) Обмінна енергія - 317Зккал/кг. 7") Обмінна енергія -- 3188ккал/кг. 2.2. Вимір очевидної обмінної енергії «
Баланс починають визначати з 17-го дня за такою схемою: - 70 Д 17 - птахам не дають корму протягом ночі; с Д 18 - птахів зважують, очищають складальні.лотки; з» Д 19 - фекалії збирають і заморожують;
Д 20 - фекалії збирають і заморожують, уночі не дають корму;
Д 21 - фекалії збирають і заморожують, птахів зважують і знову годують.
Фекалії сушать виморожуванням і подрібнюють як корм (мм, подрібнювач Кеїзсі). Загальну енергію корму і і екскрету визначають за допомогою адіабатичного колориметра ІКА С5000. Визначають також вміст білків -І (М"6,25, Кіеідан! метод 72130 для кормів і 7135 для фекалій) і ліпідів (метод 7160). о Склад амінокислот також визначають, використовуючи ВЕРХ (метод 7100 для кормів і 2080 для фекалій).
Вміст фосфору в кормах і екскретах визначають, використовуючи АЕМОК метод (МЕМ18-106). о 20 р. Результать й обговорення ах Очевидна обмінна енергія (АМЕ) 7" Характеристики росту і дані про обмінну енергію представлені в табл. 18.
І о ксиланази 110бод./кг) на АМЕМ кормів на основі пшениці (Ба здрібнених або 2495 здрібнених і 3095 цілих зерен) для зростаючих бройлерів во цілих зерен і ферментів 65 Очевидна засвоюваність білків, 95 83,8--1,082 85,941,146 86,5-0,77 бо 87,0-0,809
1. Одинарний спосіб аналізу відхилень, ефект корму, н-47; а, Б: значення з однаковими верхніми індексами не відрізняються при р «0,05. 2. Подвійний спосіб аналізу відхилень, н-47 (пшениця: 5495 здрібненої або 2495 здрібнених ї 3095 цілих зерен пшениці; фермент; з 0,214 ксилану або без нього.
З. СК - показник перетворення корму, (г корму)(г збільшення маси)
Характеристики (збільшення маси, споживання корму), що вимірюються протягом триденного періоду, не відрізняються для обробок. АМЕ контрольного корму, що містить 5495 здрібненої пшениці, складає 317Зккал/кг.
Обмінна енергія корму, що містить ту ж саму кількість пшениці, але 30905 якого складають цілі зерна, підвищується на 100Оккал/кг у порівнянні з теоретичним значенням. Більше того, варіабельність, оцінена за 75 стандартним обмірюванням різноманітних критеріїв, також зменшується під час використання цілих зерен пшениці.
Ферменти, продуковані Репісійшт Типісшовит (активність В-глюканази 1ООбод./кг і активність ксиланази 110бод./кг) підвищують величину обмінної енергії для корму на основі 5495 пшениці на «3,495 (122ккал/кг ОМ), якщо пшениця здрібнена, і на 2,795 (101ккал/кг ОМ), якщо 3095 пшениці включені у вигляді цілих зерен.
Очевидна засвоюваність живильних речовин (ліпіди, білки та амінокислоти).
Якщо здрібнена вся пшениця, очевидна засвоюваність ліпідів і білків підвищується на 7 і 2,795 відповідно, під час додавання препарату ферментів Репісіїшт Типісоїюозут. Якщо частина пшениці представлена у вигляді цілих зерен, таке збільшення менше: 395 і 0,695, відповідно, за рахунок загальної підвищеної засвоюваності живильних речовин. Дійсно, засвоюваність живильних речовин для контрольного корму, який містить цілі зерна су пшениці, схожа із засвоюваністю експериментального корму, що містить тільки здрібнену пшеницю, але з добавкою препарату ферментів. о
Вплив препарату ферментів на очевидну засвоюваність амінокислот показано в табл. 19. - " на основі пшениці 5495 для зростаючих бройлерів (ге) (один зразок змішаного екскрети для обробки) м з т « й З
Рв | вв 0000 вв - ї» 4 - в о не з
Поліпшення під час використання препарату ферментів досягає в середньому 2,995 для здрібненої пшениці і
Ф) 1,195 для пшениці у вигляді цілих зерен, що підтверджує вплив на очевидну засвоюваність білків. Очевидне ка утримання фосфору і екскреція фосфору
Вплив препарату ферментів на очевидне утримання фосфору поданий в табл. 20. 60 зростаючих бройлерів бо Очевидне утримання фосфору, 95 37,9-3,0 40,5-2,8 0,047
Очевидне утримання фосфору значно підвищується під час додавання препарату ферментів: 8,090. Таке підвищення більше, ніж те, яке спостерігається для інших живильних речовин (42,9 до 3,595 залежно від критеріїв: АМЕ, білки, ліпіди, амінокислоти). Таке підвищення може бути результатом підвищеної засвоюваності живильних речовин (безпосередній ефект ксиланази і В-глюканази), але також і результатом посиленої дії фітази пшениці. В результаті гідролізу не крохмалистих полісахаридів ксиланаза і В-глюканаза забезпечують підвищену 70 доступність до фітової кислоти для ендогенної фітази пшениці.
Така поліпшена засвоюваність фосфору призводить до зниження екскреції фосфору: -89о, якщо виразити в г фосфору на кг збільшення маси.
Приклад 3. Оцінка препарату ферментів відносно АМЕ,У) кормів на основі пшениці для зростаючих індичок
Метою цього експерименту є демонстрація ефективності препарату ферментів із РепісйШит "пісоїювит (активність В-глюканази 1О00од./кг і активність ксиланази 1100од./кг) відносно очевидної обмінної енергії (АМЕМ) кормів на основі пшениці відповідно до такої схеми експерименту: (1) - контроль (2) - ЕР 1: препарат ферментів (активність В-глюканази 1Обод./кг і активність ксиланази 1100од./кг) (3) - ЕР 2: препарат ферментів (активність В-глюканази 150од./кг і активність ксиланази 1650од./кг)
Відповідно до Європейського способу порівняння |Воигаййоп еї аїЇ.,, 1990)| корм ай ІПрішт і повний збір екскрету для віку з 33 до 37 дня. а. Матеріали і методи
Птахи: Порода й умови вирощування
Одноденних індиків ВОТ 9 утримують у клітинах загальної батареї до віку 20 днів. Потім їх перекладають в с індивідуальні клітини для визначення балансу засвоюваності після адаптаційного періоду, принаймні, в 7 днів.
Підтримують стандартну температуру і вологість. Постійний світловий режим складає: 2Згод. світла і год. о темноти протягом перших двох тижнів, а потім світловий режим зменшують до 15год. світла і 9Угод. темноти до кінця випробувань.
Корми: Птахи одержують стандартний повний початковий корм з першого до 21 дня життя, а потімодержують (де зо експериментальні корми.
Експериментальні корми со
Корми містять на основі пшениці і соєвої муки містять, 90 с пшениця 47,55; - екструдована соя 5,00; ча м'ясна мука 6,00; жир 4,00; дикальційфосфат 2,30; карбонат кальцію 0,85; « вітаміни / мінерали 1,30. шщ с Розпилення ферментів здійснюють на 20 кг часток контрольних кормів. Характеристика кормів наведена у :з» табл. 21. 5 т -
В
Жив 111вя 111 о 50
Вимір обмінної енергії та На 21 день (Д 21) птахів зважують, і рівномірно розподіляють у 10 окремих клітин для кожної обробки, і дають експериментальні корми.
Баланс починають визначати з 33 дня за такою схемою: 29 Д 32 - птахам не дають корму протягом ночі;
ГФ) Д 33 - птахів зважують, очищають складальні лотки; юю Д 34 і Д 35 - фекалії збирають і заморожують;
Д 36 - фекалії збирають і заморожують, уночі не дають корму;
Д 37 - фекалії збирають і заморожують, птахів зважують і знову годують. 60 Фекалії сушать виморожуванням і подрібнюють як корм (мм, подрібнювач Кеїзсі). Загальну енергію корму і екскрету визначають за допомогою адіабатичного калориметру ІКА С5000.
Величину АМЕх корегують за азотним балансом, з огляду на збільшення маси тіла (г) і вміст азоту (2190 сирого білку).
Фекалії сушать виморожуванням і подрібнюють як корм (мм, подрібнювач Кеїзсі). Загальну енергію корму і бо екскрету визначають за допомогою адіабатичного калориметру ІКА С5000. Визначають також вміст білків
(М"6,25, Ківідай! метод 72130 для кормів і 7135 для фекалій). Склад амінокислот також визначають, використовуючи ВЕРХ (метод 7100 для кормів і 2080 для фекалій). р. Результати й обговорення
Очевидна обмінна енергія (АМЕ М)
Зоотехнічні характеристики і величини обмінної енергії показані в табл. 22.
ІНДИКІВ й Показник
Загальна енергія, жалгОМ 1яввеЮ яв 1ява111 ів
Показник перетворення корму 1,63-0,09 1,60-0,12 1,5940,17 Ме Ме песен ПО ПО ПО НО НО 2 індексами, значно відрізняється при р «0,05. Ефект дози: 0, 0,2, 0,3 ІЙ.
В характеристиках росту немає значних розходжень при балансі між обробками. см
Під час вирощування індиків ферментний препарат підвищує АМЕп корму на основі пшениці на 2,2 і 5,495 для (о)
ЕР 1 ЕР 2, відповідно.
Настільки значне спостережуване збільшення демонструє користь обох активностей (ксиланази і
В-глюканази), які містяться в препараті ферментів, по відношенню до гідролізу не крохмалистих полісахаридів - пшениці для збільшення енергетичної цінності цього злаку під час вирощування індиків.
Приклад 4. Оцінка впливу препарату ферментів, продукованих Репісійшт Типісоїозит, на ефективність 00 повного корму на основі пшениці для зростаючих свиней
Мета полягає в оцінці впливу добавок ферментів до кормів на основі пшениці на засвоюваність енергії в со тонкому кишечнику зростаючих свиней. Нормальні рівні активності препарату ферментів складають 1100од./кг 0 для ксиналази і 100бод./кг для В-глюканази. а. Матеріал та методи -
Тварини
Контрольні обробки проводять у відповідності із схемою І аїїп здиаге для трьох кормів і трьох періодів та двох свиней для кожного з режимів годування. Корми дають у фіксованих кількостях відповідно до маси свиней « дю протягом періоду тестування. -
Експериментальні корми с Шести зростаючим свиням дають збалансовані за рахунок інших типових кормових інгредієнтів корми на :з» основі пшениці поганої якості, 90: пшениця 60,00; ячмінь 9,70;
Ше горох 11,40; -І рибна мука 5,00; сю мука соняшника (30) 10,00; лізин 0,15; (ее) 50 вітаміни / мінерали 3,75. -ь - . шо Я
Такий корм характеризувався З150ккал/кг засвоюваної енергії і містив живильні речовини, 9о: білок 14,90; 22 суха речовина 84,90;
ГФ) волокна 5,10; засвоюваний лізин 0,80. іме)
Схема експерименту: 60 1. - Корм без добавок (основний); 2. Корм із добавками (1): із препаратом ферментів 1 (активність В-глюканази 1ООбод./кг і активність ксиланази 1100од./кг).
З. Корм із добавками (2): із препаратом ферментів 2 (активність В-глюканази 200од./кг і активність ксиланази 2200од./кг). 65 Точні дози кормів одержують, розводячи препарат ферментів кукурудзяним крохмалем для створення попередньої суміші, яку потім додають до корму за необхідністю.
Збір зразків
Соки клубової кишки збирають протягом 48год. щотижня у відповідності зі стандартними процедурами в
КРМА лабораторіях. Енергію зразків соку клубової кишки і тестованого корму аналізують за допомогою калориметричної бомби за Сандерсом (Запдегв) для визначення засвоєної енергії. Аліквоти зразків бережуть для подальших аналізів за необхідністю.
Статистичний аналіз
Засвоюваність сирої енергії розраховують із результатів для соків здухвинної кишки, отриманих за допомогою калориметричної бомби, для кормів і споживання кормів. Аналіз відхилень починають по відношенню 7/0 до розрахунків засвоюваності. р. Результати й обговорення
Добавки ксиланази до корму свиней підвищують засвоюваність енергії, принаймні, на 69». Це вказує на те, що фермент посилює руйнацію стінок клітин сирого матеріалу (зокрема, пшениці) і вивільнює додаткову енергію в тонкому кишечнику (табл. 23). на основі пшениці, якими годують свиней 2
Засвоюваніст снерії 080 | 049051
Поліпшення 61711111
Приклад 5. Вплив препарату ферментів, продукованих Репісіїйшт Типісоїюозит, на характеристики кормів із с 22 соломи, кукурудзяного силосу, сіна і трав'яного силосу у жуйних тварин. Го)
НЕТ тест |Мепке еї аїІ. Нопеппеїтег РиКегпглмегпевзіеп. - 1979, 1988) являє собою іп міїго інкубаційний тест, що дозволяє визначати розклад сирого матеріалу шляхом виміру об'єму газу, що виділяється під час ферментації цих кормів в забуференому соці рубця. а. Матеріал і методи - 200мг висушеного і здрібненого субстрату інкубують із 1О0мл соку рубця плюс 20мл буфера в шприцах, вміст о яких обережно перемішують на роторі в інкубаторі з контрольованою температурою (3922). Об'єм газу, що виділився, реєструють через 24год. Для внесення поправок в результати проводять холостий (без субстрату) і Шк стандартний контроль із сіном і стандартний контроль з концентратом (із відомою кількістю вироблюваного /-|че об'єму газу), і розраховують повний об'єм газу, вироблюваного за 24год. Енергетичну цінність (ОМ)
Зо (засвоюваність органічної речовини) субстратів розраховують, використовуючи об'єм газу, що виділився за т 24год., і використовуючи прогнозуючі рівняння, запропоновані Мепке із співробітниками (1988).
Сік рубця збирають у 2 ялових корів, в рубець уводять канюлю і годують о 8 ранку і о 7 вечора кормом, що складається з бкг сіна і 2кг концентрату (відношення 75/25). Сік рубця збирають безпосередньо перед ранковою « годівлею. Сік рубця фільтрують, щоб уникнути проникнення харчових часток, і утримують в суворих анаеробних 70 умовах. н- с Метою цього випробування є перевірка впливу добавки препарату ферменту на фураж за 15год. перед НЕТ "з інкубуванням.
Попередня обробка препаратом ферменту: розчин ферменту розпорошують на фураж, розкладений на підлозі, на солому, на кукурудзяний силос, на сіно і трав'яний силос. Розпилення здійснюють, використовуючи -І 75 Амл препарату ферментів на 2кг сухої речовини фуражу. Фураж із країв (біля 10см) видаляють, щоб підвищити однорідність зразка Після обробки фураж змішують вручну і лишають при кімнатній температурі на 15год. після -І обприскування. НЕТ інкубування здійснюють після 15год. контакту з препаратом ферментів для однієї серії і 6 повторів для кожної обробки. о р. Результати й обговорення (о) 250 Повний об'єм газу, що виділився за 24год., показаний в табл. 24 для соломи, кукурудзяного силосу, сіна і щк трав'яного силосу. о ще :
Кукурудзяний силос «0,05 нини яю бо Застосування целюлази для соломи в результаті попередньої обробки дає збільшення повного об'єму газу на
1896 в порівнянні з контролем. Для кукурудзяного силосу таке збільшення складає 895, для сіна 9,595 і для трав'яного силосу 9905.
ОМО приведене в табл. 25 для різноманітних типів фуражу до і після попередньої обробки. до і після попередньої обробки
Симй метрах | Обов (МО, о. |Статистичне значення.
Солома «0,05 й
Кукурудзяний силос «0,05 ів
Трав'яний силос
ТТ лов
ОМ-засвоюваність відповідно підвищується для соломи, кукурудзяного силосу, сіна і трав'яного силосу в порівнянні з контролем на 8,595 для соломи, 595 для кукурудзяного силосу, 5,495 для сіна і 5906 для трав'яного 720 силосу.
Попередня обробка фуражу (соломи, кукурудзяного силосу, сіна і трав'яного силосу) препаратом ферментів протягом 15год. підвищує інтенсивність інкубування субстрату рубця і ОМ-засвоюваність субстрату.
Приклад 6: Вплив Препарату ферментів, продукованих Репісійит Яипісоїозвит, на продуктивність несучок, яких годують пшеницею або ячменем см
Цей експеримент здійснюють з метою визначити вплив додавання препарату ферментів на параметри (о) продуктивності курок-несучок, яких годують пшеницею або ячменем. а. Матеріал і методи
Схема експерименту: 4 обробки х 8 повторів х 5 клітин х З курки. -
Обробки: 1. Контроль 1:6095 пшениці; (ее) 2. Контроль 1 ї- препарат ферментів;
З. Контроль 2:6095 ячменя; о 4. Контроль 2 ї- препарат ферментів. -
Тварини, утримання та експеримент
Експерименти проводять на 480 коричневих курках породи Ну-І іпе. Кожний повтор здійснюють для 5 курок із ге звичайними годівницями, тобто усього 32 повтори для 15 курок кожний.
Розподілені в двох ідентичних приміщеннях, ці повтори одержують програмоване освітлення і вентиляцію.
Програма освітленості складає 14год. світла в день після прибуття курок віком 17 тижнів і підвищується кожні « дю 2 тижні на ЗОхв. аж до максимального значення 17год. світла на день. -
Вік курок на початку експерименту 22 тижні, що продовжується протягом 5 місяців періоду яйценосності. с Корми і годівля :з» Наявні два види експериментального корму на основі 6095 пшениці (корм 1) і 6095 ячменя (корм 2), і 1095 муки соняшнику. Їхній склад приведений у табл. 26, а характеристики злаків - в табл. 27. з ь -І для несучок
Я п шишок со 5 пе 00000000 вм яме 111101 -з о ю свині 00111110 м бо вітамін В2 - 4мг; вітамін Вб - Змг; вітамін В12 - 11,8мг; фолієва кислота - 0,35мг; біотин - 15Омкг; пантотенат кальцію - 1Омг; 65 нікотинова кислота - 20мг; Мп - ЗОмг; 7п - 5Омг; І - О,Змг; Ре - 5Омг; Си - бмг; Зе - О,1мг; токсикоза - 125мг.
Встановлена поживна цінність, Фр Вміст й 00000 ю
Мптоннтцютно 01270031 06705
Шшнння
Примітки: 7) Обмінна енергія пшеничного корму -- 280Оккал/кг. "ху Обмінна енергія ячмінного корму - 260Оккал/кг.
Контроль 20 Хімічний аналіз:
Зразки корму
Контроль за якістю експериментальних кормів здійснюють, аналізуючи суху речовину, сирий білок, сирий жир і золу.
Активність ксиланази (Т-1, 1-2) і активність В-глюканази (Т-3 і Т-4) визначають у змішаних кормах. с 25 Вимірювання о
Витрати корму та ефективність корму реєструють кожні 4 тижні. Курок зважують на початку і наприкінці експерименту. Кількість знесених яєць, масу яєць і відсоток сухої речовини і жиру в яйцях записують щодня протягом 5 періодів по 4 тижні кожний. Смертність контролюють і реєструють щодня, включаючи її причину. р. Результать і обговорення -- 30 Проведення експерименту со
Отримані параметри продуктивності протягом експерименту представлені в табл. 28-30. В перші два періоди (тижні 22-30) у всьому експерименті статистично обробляється відсоток брудних яєць (Р 20,005). Птахи, яким ме) дають корм без ферментів, несуть більше брудних яєць. Статистична значима різниця між обробками була ї- виявлена для відсотка знесених яєць (Р 20,05) і для маси яєць (Р 20,005), починаючи із другого періоду до 3о кінця експерименту. Курки, яких годували кормом на основі ячменя, демонструють великий відсоток знесених - яєць, і вони несли більш важкі яйця, ніж курки, яких годували пшеницею. Препарат ферментів, очевидно, підвищує ці параметри, але не значно, із величиною 0,05 рівня можливості. їх " й с (повний протокол експерименту) и Обробка Яйценосність, 957) Брудні Дефектні Маса яєць, Витрати Ефект Збільшення маси Смертність, 90 ре ню ди ик т вд ше яв 000тяя1ов000волео | мб м) ж 17721111 ль вв | лм0000баюьо 00 2лою 00000008 -
МО81041981 0415 0ов 6801 но со 50 обробки, Р : курок. Всередині колонок значення з наступними різноманітними індексами значно відрізняються.
У всіх експериментальних періодах споживання корму птахами для 1-3 і Т-4 обробок (ячмінний корм) було вище, ніж споживання птахами, яким давали пшеницю, через енергетичні рівні обох кормів (ячмінний корм
Ге! відповідає 26бООккал/кг енергії, тоді як пшеничний корм відповідає 280О0Оккал/кг). Враховуючи різні енергії кормів обох типів і споживання птахами корму, у весь період для всіх птахів щоденне споживання енергії було ко однаковим.
Ефективність корму (виражена як (г корму)/г яєць) для експериментальних кормів протягом першого періоду 60 була дуже висока через малу кількість яєць для кожної курки протягом цього відрізка часу. У перші два періоди ефективність корму з пшениці була вище ефективності корму з ячменя; але в третьому періоді, коли був зареєстрований більш високий відсоток знесених яєць, обидва типи кормів надали подібної ефективності.
Починаючи з 34 тижня до кінця експерименту, ячмінні корми демонстрували більш високу кормову ефективність, ніж пшеничні корми. Ферменти виявили тенденцію поліпшити кормову ефективність (Р 20,05). У всі періоди б5 В-глюканаза підвищувала кормову ефективність ячмінного корму (с-0,066).
В табл. 29 показано, що несучки, яких годували пшеницею з добавкою препарату ферментів, мали тенденцію до демонстрації більш високих значень яйценосності (41,5 абс. точок) в середньому більш важких яєць (0,37г) і більш низький показник перетворення корму (-2,790) у порівнянні з кормами без добавок. пшеничним кормом
Період, тижні Рівень яйценосності, 90 Маса яєць, г 7
Ів
Табл. 30 демонструє, що додавання препарату ферментів до ячмінного корму для несучок підвищує яйценосність (1495) середню масу яєць (0,795) і показник перетворення корму (-5,795) у порівнянні із контрольними ячмінними кормами. ячмінним кормом се 7 о ши нн и шити ше НИ юм 171114800001100ю851 006 ов - зо со о патч жеча наааав'Іннн й
Примітка: - У Для періоду 22-42 тижні. і -

Claims (1)

  1. Формула винаходу « 40 1. Штам Репісіййшт 7ипісшозут, депонований відповідно до Будапештської угоди у Міжнародному інституті - с Мікології під Мо ІМІ Мо 378536, що застосовується для одержання суміші ферментів для годівлі тварин.
    а 2. Суміш ферментів, одержуваних з Репісіїййшт типісшовит за п. 1. "» 3. Суміш ферментів за п. 2, що містить принаймні активність ксиланази та активність глюканази.
    4. Суміш ферментів за оп. 3, що містить принаймні активності ендо-1,3(4)-й --люканази та 45 ендо-1,4-Й-ксиланази.
    - 5. Суміш ферментів за будь-яким з пунктів 2-4, що застосовується для годівлі утримуваних на фермах - тварин, таких як птиці, свині і жуйні.
    6. Суміш ферментів за пунктом 5, що застосовується для підвищення засвоюваності злакових, таких як о пшениця, ячмінь, жито, тритикале, овес, рис, насіння таких олійних як соя, соняшник, рапс; і побічних о 50 продуктів обробки зернових, таких як пшеничні висівки.
    7. Суміш ферментів за будь-яким з пунктів 2-4, що застосовується для зниження екскреції фосфору. "6 8. Суміш ферментів за будь-яким з пунктів 2-4, що застосовується для підвищення засвоюваності фосфору.
    9. Суміш ферментів за будь-яким з пунктів 2-4, що застосовується для підвищення засвоюваності амінокислот. 22 10. Суміш ферментів за будь-яким з пунктів 2-4, що застосовується для зменшення вмісту аміаку в повітрі о батареї клітин.
    11. Рідка композиція, що містить: іме) мікробні продукти як повний вміст органічних твердих речовин з Репісйшт пісшовит ІМІ 378536 4 95-10 96 во протимікробний агент 0,005 95-0,35 90 сорбіт 20 95-50 90 концентрований відфільтрований ферментаційний бульйон з Репісіїййшт Топісцовит ІМІ 378536 О,З до 76 95 забуферена й доведена до рН З - 5 композиція. 65 12. Рідка композиція, за п.11, яка додатково містить антифриз до 40 мас. 9о композиції.
    13. Рідка композиція за п. 12, де антифриз складає 15-40 мас. 95 композиції.
    14. Рідка композиція за пп. 11, 12, де згаданий протимікробний агент складає 0,01-0,25 мас. 95 композиції.
    15. Рідка композиція за пп. 171, 12, де протигрибкові і/або протибактеріальні агенти вибирають із сорбінової кислоти та її солей, бензойної кислоти та її солей, метил-4-гідроксибензоату, н-пропіл-4-гідроксибензоату, фумарової кислоти, солей та естерів.
    16. Рідка композиція за п. 15, де згадані солі являють собою хлорид натрію або хлорид калію.
    17. Рідка композиція за п. 15 або 16, де антифризи вибирають з групи, що складається з 1,2-пропандіолу, етиленгліколю та гліцерину.
    18. Рідка композиція за будь-яким з пунктів 11-17, що застосовується для годівлі утримуваних на фермах /о тварин, таких як птиці, свині і жуйні.
    19. Рідка композиція, за п. 18, що застосовується для підвищення засвоюваності злакових, таких, як пшениця, ячмінь, жито, тритикале, овес, рис, насіння таких олійних як соя, соняшник, рапс; і побічних продуктів обробки зернових, таких як пшеничні висівки.
    20. Рідка композиція за будь-яким з пунктів 11-17, що застосовується для зниження екскреції фосфору.
    21. Рідка композиція за будь-яким з пунктів 11-17, що застосовується для підвищення засвоюваності фосфору.
    22. Рідка композиція за будь-яким з пунктів 11-17, що застосовується для підвищення засвоюваності амінокислот. 23 Рідка композиція за будь-яким з пунктів 11-17, що застосовується для зменшення вмісту аміаку в повітрі батареї клітин.
    24. Порошкова композиція, що має такий склад: мікробні продукти як повний вміст твердих органічних речовин з ферментаційного бульйону Репісіїййшт Япісцовит ІМІ 378536 16 95-40 95 носій 59 95-83 90 с інші висушені компоненти ферментаційного бульйону з ферментаційного бульйону Репісіййшт Япісцовит ІМІ 378536 1 95. о
    25. Порошкова композиція за п. 24, де носії вибирають з групи, що складається зі пшеничної муки, крохмалю, гіпсу, мальтодекстрину, твердих продуктів обробки кукурудзи, побічних продуктів обробки олійних, таких як соя, соняшник, насіння рапсу; і побічних продуктів обробки зернових, таких як пшеничні висівки.
    26. Порошкова композиція за будь-яким з пунктів 24, 25, що застосовується для годівлі утримуваних на - фермах тварин, таких як птиці, свині і жуйні. (ее)
    27. Порошкова композиція за п. 26, що застосовується для підвищення засвоюваності злакових, таких як пшениця, ячмінь, жито, тритикале, овес, рис, насіння таких олійних як соя, соняшник, рапс; і побічних о продуктів обробки зернових, таких як пшеничні висівки. -
    28. Порошкова композиція за будь-яким з пунктів 24, 25, що застосовується для зниження екскреції фосфору.
    29. Порошкова композиція за будь-яким з пунктів 24, 25, що застосовується для підвищення засвоюваності - фосфору.
    30. Порошкова композиція за будь-яким з пунктів 24, 25, що застосовується для підвищення засвоюваності амінокислот. « дю 31. Порошкова композиція за будь-яким з пунктів 24, 25, що застосовується для зменшення вмісту аміаку в -о повітрі батареї клітин. с 32. Спосіб одержання суміші ферментів для годівлі тварин, що включає наступні етапи: :з» (а) ферментацію Репісіййшт 7ипісціозуит за п. 1, (Б) видалення твердих речовин шляхом поділу на тверду та рідку фази, (с) збирання рідкої фази, та -1 395 (а) концентрацію рідкої фази, що містить суміш ферментів.
    33. Поліпептид, що має активність ксиланази С, послідовність якого представлена як послідовність з ідент. - | Мо 1 і на Фіг. 1, одержаний зі штаму Репісіййшт 7ипісшовит ІМІ Мо 378536. о 34. Поліпептид або його варіант, що має активність ксиланази С та кодується нуклеїновою кислотою, виділеною зі штаму РепісіШит Яипісцовит ІМІ Мо 378536, що включає послідовність нуклеїнових кислот, (ее) 50 представлену як послідовність з ідент. Мо 1. що З5. Поліпептид, що має активність ксиланази Ві, послідовність якого представлена як послідовність з ідент. Мо 4 і на Фіг. 2, одержаний зі штаму РепісшШіит 7ипісшовит ІМІ Мо 378536.
    36. Поліпептид або його варіант, що має активність ксиланази ВІ та кодується нуклеїновою кислотою, виділеною зі штаму РепісіШит Яипісцовит ІМІ Мо 378536, що включає послідовність нуклеїнових кислот, 99 представлену як послідовність з ідент. Мо 4. ГФ) 37. Поліпептид, що має активність ферулоїлестерази А, послідовність якого представлена як послідовність з 7 ідент. Мо 5 і на Фіг. 3, одержаний зі штаму РепісшШіит 7ипісшовит ІМІ Мо 378536.
    38. Поліпептид або його варіант, що має активність ферулоїлестерази А та кодується нуклеїновою кислотою, виділеною зі штаму РепісіШит Яипісцовит ІМІ Мо 378536, що включає послідовність нуклеїнових кислот, 60 представлену як послідовність з ідент. Мо 5.
    39. Поліпептид, що має активність ферулоїлестерази В, послідовність якого представлена як послідовність з ідент. Мо 6 та на Фіг. 4, одержаний зі штаму Репісіййшт ?ипісшовит ІМІ Мо 378536.
    40. Поліпептид, що має активність ксиланази А, внутрішня амінокислотна послідовність якого представлена дБ як АЕАІМУМОЮУ, одержаний зі штаму Репісіййшт ?ипісшовит ІМІ Мо 378536.
UA2000020609A 1998-05-06 1999-06-05 Штам penicillium funiculosum, суміш ферментів, одержуваних з цього штаму, та композиції, що містять суміш ферментів для годівлі тварин UA77381C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP98401101A EP0976838A1 (en) 1998-05-06 1998-05-06 Enzymes mixture
PCT/IB1999/000856 WO1999057325A2 (en) 1998-05-06 1999-05-06 Enzymes mixture

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA77381C2 true UA77381C2 (uk) 2006-12-15

Family

ID=8235360

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UA2000020609A UA77381C2 (uk) 1998-05-06 1999-06-05 Штам penicillium funiculosum, суміш ферментів, одержуваних з цього штаму, та композиції, що містять суміш ферментів для годівлі тварин

Country Status (21)

Country Link
US (3) US6534101B1 (uk)
EP (2) EP0976838A1 (uk)
JP (2) JP3907410B2 (uk)
KR (2) KR100856364B1 (uk)
CN (2) CN1321178C (uk)
AR (1) AR019272A1 (uk)
AT (1) ATE446389T1 (uk)
AU (1) AU769386C (uk)
BR (1) BRPI9906426B1 (uk)
CA (1) CA2295570C (uk)
CO (1) CO4990991A1 (uk)
DE (1) DE69941559D1 (uk)
DK (1) DK1007743T3 (uk)
ES (1) ES2335721T3 (uk)
MY (1) MY131016A (uk)
NZ (1) NZ502519A (uk)
RU (1) RU2261910C2 (uk)
TW (1) TWI230736B (uk)
UA (1) UA77381C2 (uk)
WO (1) WO1999057325A2 (uk)
ZA (1) ZA200000075B (uk)

Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0976838A1 (en) * 1998-05-06 2000-02-02 Rhone-Poulenc Nutrition Animale Enzymes mixture
WO2000068401A1 (en) * 1999-05-06 2000-11-16 Aventis Animal Nutrition S.A. Recombinant penicillium funiculosum for homologous and heterologous protein production
US7138262B1 (en) * 2000-08-18 2006-11-21 Shire Human Genetic Therapies, Inc. High mannose proteins and methods of making high mannose proteins
WO2003028476A1 (en) * 2001-09-11 2003-04-10 Meiji Seika Kaisha, Ltd. Novel enzyme compositions for poultry
CN103484486B (zh) 2003-07-02 2018-04-24 维莱尼姆公司 葡聚糖酶，编码它们的核酸以及制备和使用它们的方法
ATE527362T1 (de) * 2004-03-25 2011-10-15 Iogen Bio Products Corp Verbesserte expression zeigendemodifizierte xylanasen
MX300732B (es) * 2005-03-15 2012-06-28 Verenium Corp Celulasas, acidos nucleicos que las codifican y metodos para hacerlas y usarlas.
FR2885365B1 (fr) * 2005-05-04 2007-06-08 Adisseo France Sas Soc Par Act Gene abfb-2 de penicillium funiculosum
FR2885366B1 (fr) 2005-05-04 2007-06-15 Adisseo France Sas Soc Par Act Gene abfb-1 de penicillium funiculosum
FR2888250B1 (fr) 2005-07-08 2007-08-17 Adisseo France Sas Soc Par Act Phytase de debaryomyces castellii
CN100443582C (zh) * 2005-11-14 2008-12-17 云南省微生物研究所 一种小刺青霉
WO2007075343A2 (en) * 2005-12-15 2007-07-05 Chemgen Corporation Enzymes for reduced immunological stress
HRP20120994T1 (hr) 2006-02-07 2012-12-31 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Stabilizirana smjesa glukocerebrozidaze
WO2007094852A2 (en) 2006-02-10 2007-08-23 Verenium Corporation Cellulolytic enzymes, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
CN104938794A (zh) * 2006-09-29 2015-09-30 诺维信公司 用于动物饲料的木聚糖酶
MX2009012844A (es) * 2007-05-31 2009-12-15 Novozymes Inc Composiciones para degradar material celulosico.
FR2918844B1 (fr) * 2007-07-20 2012-11-02 Adisseo France Sas Composition thermoresistante pour animaux comprenant un melange enzymatique
EP2225381A2 (en) * 2007-12-05 2010-09-08 Adisseo France S.A.S. Biocarburant preparation using penicillium funiculosum imi 378536 enzymes
WO2009097285A1 (en) * 2008-01-28 2009-08-06 Archer-Daniels-Midland Company Compositions for feeding animals
BRPI0908968A8 (pt) * 2008-03-21 2016-06-28 Danisco Us Inc composição enriquecidas com hemicelulase para potencializar a hidrólise de biomassa
RU2378869C1 (ru) * 2008-07-02 2010-01-20 Государственное научное учреждение Красноярский научно-исследовательский и проектно-технологический институт животноводства Сибирского отделения Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ КрасНИПТИЖ СО Россельхозакадемии) Способ снижения содержания вредных примесей в воздухе птичников
US20100093047A1 (en) * 2008-10-09 2010-04-15 Menon & Associates, Inc. Microbial processing of cellulosic feedstocks for fuel
BRPI0805560B1 (pt) * 2008-12-29 2016-12-06 Petroleo Brasileiro Sa processo de produção de um preparado enzimático para hidrólise de celulose de resíduos lignocelulósicos e sua aplicação na produção de etanol
CA2761008C (en) 2009-05-07 2019-06-25 Danisco A/S Enzyme complex from trichoderma reesei and p. funiculosum enzymes
JP5317828B2 (ja) * 2009-05-21 2013-10-16 協和化成株式会社 植物組織の可溶化方法及び混合酵素製剤
AU2010281403B2 (en) 2009-07-28 2016-03-10 Takeda Pharmaceutical Company Limited Compositions and methods for treating Gaucher disease
US20110053228A1 (en) * 2009-08-25 2011-03-03 Menon & Associates, Inc. Microbial processing of cellulosic feedstocks for fuel
JP2011248323A (ja) * 2010-04-30 2011-12-08 Canon Inc 画像処理装置及びその制御方法
US20120034344A1 (en) 2010-05-07 2012-02-09 Menon & Associates, Inc. Bioreactors comprising fungal strains
WO2012012461A2 (en) 2010-07-19 2012-01-26 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mannose receptor c type 1 (mrc1) codon optimized cell line and uses thereof
WO2012021735A2 (en) * 2010-08-11 2012-02-16 Menon & Associates, Inc. Pharmaceutical products from gungal strains
US8932602B2 (en) * 2010-08-11 2015-01-13 Menon Renewable Products, Inc. Pharmaceutical products from fungal strains
BR112014005873B1 (pt) 2011-09-14 2021-11-16 Dupont Nutrition Biosciences Aps Composição, uso de uma composição, método de alteração da filtrabilidade, método de redução da pressão acumulada, método para a produção de um alimento, método para a produção de uma pasta de brassagem e método para a produção de um biocombustível
WO2013130963A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Compositions and methods for treating type iii gaucher disease
AU2012387042A1 (en) 2012-08-03 2015-02-19 Dupont Nutrition Biosciences Aps Enzymes
JP6056870B2 (ja) * 2012-10-19 2017-01-11 国立研究開発法人産業技術総合研究所 新規キシラナーゼ
US8759041B1 (en) * 2013-02-12 2014-06-24 Novozymes Inc. Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
GB201308843D0 (en) * 2013-03-14 2013-07-03 Verenium Corp Phytase formulation
CN105517450A (zh) * 2013-06-21 2016-04-20 杜邦营养生物科学有限公司 提高木质纤维素生物质营养价值的方法和组合物
JP5978175B2 (ja) * 2013-07-08 2016-08-24 協和化成株式会社 植物組織の可溶化方法及び混合酵素製剤
RU2550044C2 (ru) * 2013-09-10 2015-05-10 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук (ИНБИ РАН) ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ФЬЮЖН-КОНСТРУКЦИЯ ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ МУЛЬТИФЕРМЕНТНОГО КОМПЛЕКСА КАРБОГИДРАЗ В КЛЕТКАХ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА Penicillium verruculosum, ИСПОЛЬЗУЕМОГО В КАЧЕСТВЕ ХОЗЯИНА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ШТАММА ГРИБА Penicillium verruculosum И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА НА ЕГО ОСНОВЕ
US20150118361A1 (en) 2013-10-25 2015-04-30 Kemin Industries, Inc. Use of Ferulic Acid Esterase to Improve Performance in Monogastric Animals
EP3216864A4 (en) * 2014-11-05 2018-05-02 Toray Industries, Inc. Endoxylanase mutant, enzyme composition for biomass decomposition, and method for producing sugar solution
CN105087524B (zh) * 2015-09-11 2018-06-08 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一种酸性木聚糖酶突变体
CN105087525B (zh) * 2015-09-11 2018-06-12 青岛蔚蓝生物集团有限公司 木聚糖酶突变体
CN107937282B (zh) * 2017-12-08 2019-02-19 青岛农业大学 一株绳状青霉及其用途
WO2019121930A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Dsm Ip Assets B.V. Animal feed compositions and uses thereof
EP3852547A1 (en) 2018-09-17 2021-07-28 DSM IP Assets B.V. Animal feed compositions and uses thereof
US11149261B2 (en) 2018-11-28 2021-10-19 Indian Oil Corporation Limited Provident method of cellulases enzymes production by Penicillium funiculosum MRJ-16 using low cost media components
US12252726B2 (en) 2018-11-28 2025-03-18 Indian Oil Corporation Limited Process for simultaneous production of citric acid and cellulolytic enzymes
EP4014748A1 (en) 2020-12-21 2022-06-22 Adisseo France S.A.S. Secretomes of aspergillus strains for the degradation of soybean meal
CN114457059B (zh) * 2022-01-21 2024-03-19 青岛尚德生物技术有限公司 一种含木聚糖酶的酶制剂及其在用于生产低聚木糖中的应用
FR3133726B1 (fr) 2022-03-25 2025-12-12 Adisseo France Sas Additif zootechnique pour insectes
WO2023180551A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 Adisseo France S.A.S. Zootechnical additive for insects

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB230103A (en) * 1924-03-03 1925-11-19 Isamu Hosoi Improvements in phonographic machines
NL6913603A (uk) * 1968-09-06 1970-03-10
US4742005A (en) * 1985-01-07 1988-05-03 Agency Of Industrial Science & Technology, Ministry Of International Trade & Industry Method for production of cellulolytic enzymes and method for saccharification of cellulosic materials therewith
DK30991D0 (da) * 1991-02-22 1991-02-22 Novo Nordisk As Hidtil ukendte enzymer
RU2017433C1 (ru) * 1992-06-17 1994-08-15 Акционерное общество "Биотехнология" Способ приготовления комбикорма для цыплят-бройлеров
JPH0790300A (ja) * 1993-09-24 1995-04-04 Nippon Kemushisu Kk 洗濯すすぎ剤及び洗濯すすぎ方法
FR2715802B1 (fr) * 1994-02-04 1996-03-15 Rhone Poulenc Nutrition Animal Utilisation d'enzymes dans l'alimentation des animaux pour réduire les rejets azotés.
GB9416841D0 (en) * 1994-08-19 1994-10-12 Finnfeeds Int Ltd An enzyme feed additive and animal feed including it
US5585251A (en) * 1995-01-10 1996-12-17 Abbott Laboratories Fungal isolates, fusacandins
GB2301103B (en) 1995-05-23 1999-12-22 Danisco An enzyme system comprising ferulic acid esterase
US5720971A (en) * 1995-07-05 1998-02-24 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Department Of Agriculture And Agri-Food Canada Enzyme additives for ruminant feeds
JPH10510720A (ja) 1995-10-13 1998-10-20 ギスト ブロカデス ベスローテン フェンノートシャップ タンパク質検出法
EP0976838A1 (en) * 1998-05-06 2000-02-02 Rhone-Poulenc Nutrition Animale Enzymes mixture

Also Published As

Publication number Publication date
WO1999057325A3 (en) 2000-04-06
CA2295570A1 (en) 1999-11-11
ZA200000075B (en) 2000-08-01
KR100856364B1 (ko) 2008-09-04
TWI230736B (en) 2005-04-11
EP1007743A2 (en) 2000-06-14
JP4421596B2 (ja) 2010-02-24
AU769386B2 (en) 2004-01-22
US6534101B1 (en) 2003-03-18
JP2007061105A (ja) 2007-03-15
JP2002513595A (ja) 2002-05-14
ATE446389T1 (de) 2009-11-15
KR20070105387A (ko) 2007-10-30
AU3530699A (en) 1999-11-23
ES2335721T3 (es) 2010-03-31
AR019272A1 (es) 2002-02-13
US7374925B2 (en) 2008-05-20
US20030108642A1 (en) 2003-06-12
WO1999057325A2 (en) 1999-11-11
CN1273601A (zh) 2000-11-15
BR9906426A (pt) 2000-07-11
KR100877086B1 (ko) 2009-01-07
EP1007743B1 (en) 2009-10-21
CN1944639A (zh) 2007-04-11
MY131016A (en) 2007-07-31
CN100593570C (zh) 2010-03-10
US8043844B2 (en) 2011-10-25
EP0976838A1 (en) 2000-02-02
CO4990991A1 (es) 2000-12-26
CN1321178C (zh) 2007-06-13
AU769386C (en) 2007-08-09
DE69941559D1 (de) 2009-12-03
BRPI9906426B1 (pt) 2015-08-18
JP3907410B2 (ja) 2007-04-18
DK1007743T3 (da) 2010-03-01
CA2295570C (en) 2011-04-26
US20050227344A1 (en) 2005-10-13
KR20010021555A (ko) 2001-03-15
NZ502519A (en) 2002-12-20
RU2261910C2 (ru) 2005-10-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA77381C2 (uk) Штам penicillium funiculosum, суміш ферментів, одержуваних з цього штаму, та композиції, що містять суміш ферментів для годівлі тварин
JPH10510997A (ja) キシラナーゼを含有する物動飼料添加剤
MXPA06006670A (es) Xilanasas expresadas microbialmente y su uso como aditivos de forraje y otros usos.
CN102669443A (zh) 用于促进肉型家禽生长的方法和组合物
WO2001042433A2 (en) Talaromyces emersonii xylanase
JP2016104023A (ja) ペプシン耐性αアミラーゼの同定方法
AU2020203266A1 (en) Protein
US10612014B2 (en) Xylanases for solubilising arabinoxylan-containing material
Colombatto et al. In vitro evaluation of fibrolytic enzymes as additives for maize (Zea mays L.) silage: II. Effects on rate of acidification, fibre degradation during ensiling and rumen fermentation
US6558693B1 (en) Animal feed additives
Sinitsyn et al. Construction of recombinant producers of enzyme preparations for feed production with an expression system based on Penicillium verruculosum fungus
KR20190138865A (ko) 동물 사료 조성물 및 사용 방법
RU2819918C1 (ru) ШТАММ ГРИБА PENICILLIUM VERRUCULOSUM ПРОДУЦЕНТ КОМПЛЕКСА ФИТАЗЫ А И ЭНДО-1,4-β-КСИЛАНАЗЫ Е И ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ НА ЕГО ОСНОВЕ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В КАЧЕСТВЕ ДОБАВКИ В КОРМАХ
MXPA00000279A (en) Enzymes mixture
MXPA98003507A (en) Food additives for anima