ES2335891T3

ES2335891T3 - Vacuna contra piroplasmidos.

Info

Publication number: ES2335891T3
Application number: ES04787138T
Authority: ES
Inventors: Erik De Vries; Fasilla Razzia Gaffar; Ana Patricia Yatsuda; Theodorus Cornelis Schaap
Original assignee: Universiteit Utrecht Holding BV
Current assignee: Universiteit Utrecht Holding BV
Priority date: 2003-09-14
Filing date: 2004-09-14
Publication date: 2010-04-06
Anticipated expiration: 2024-09-14
Also published as: EP1664097A2; US7799330B2; US20090191236A1; PL1664097T3; AU2004272312B2; BRPI0414353A; PT1664097E; WO2005026199A2; US20070253974A1; CA2536652A1; AU2004272312A1; DK1664097T3; WO2005026199A3; JP2007527707A; ZA200602107B; EP1664097B1; US7465459B2; ATE448245T1; DE602004024085D1

Abstract

Proteína de Piroplásmido, caracterizada por que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una similitud de al menos el 70% con la secuencia de aminoácidos ilustrada en la SEC ID Nº: 2, o un fragmento antigénico que contienen epítopo de dicha proteína.

Description

Vacuna contra piroplásmidos.

La invención se refiere a una proteína de Piroplásmido o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, a un ácido nucleico que codifica dicha proteína de Piroplásmido o dicho fragmento inmunogénico, a fragmentos de ADNc, moléculas de ADN recombinante y vehículos recombinantes vivos que comprenden dicho ácido nucleico, a células hospedadoras que comprenden dichos fragmentos de ADNc, moléculas de ADN recombinante y vehículos recombinantes vivos, a vacunas que comprenden una proteína de Piroplásmido o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, a métodos para la preparación de tales vacunas, al uso de tales proteínas o fragmentos y a ensayos de diagnóstico.

La babesiosis es una enfermedad que tiene una existencia geográficamente focal. El motivo de esto es que el patógeno se transmite por garrapatas que alimentan un cierto reservorio de parásitos presente en una población de vertebrados. Solamente donde existen garrapatas puede aparecer la Babesiosis. Teniendo en cuenta todos los factores, particularmente en animales autóctonos, el parásito coexiste con el hospedador sin provocar enfermedad significativa. En muchos casos, la Babesiosis se convierte en un problema debido a actividades del ser humano por endogamia de rasgos genéticos y/o transporte de animales a entornos no familiares en los que la Babesiosis es endémica (Callow, L. L. y Dalgliesh, R. J., 1982, en: "Immunology of Parasitic Infections", Cohen, S. y Warren, K. S. eds., págs. 475-526, Blackwell Scientific).

La babesiosis también representa un reto como agente zoonótico para seres humanos, no solamente para seres humanos inmunocomprometidos (Gray et al., 2002, int. J. Med. Microbiol., vol. 291, págs. 108-11).

Los signos de enfermedad en Babesiosis adquirida de forma natural comienzan habitualmente 7-21 días después de la infección. Estos síntomas incluyen: fiebre, anorexia, depresión, anemia, hemoglobinuria y debilidad de desarrollo rápido. Aparecen de forma común lagrimeo aumentado, salivación y temblor muscular. Se pueden desarrollar signos nerviosos en infecciones terminales y puede ocurrir la muerte cuando no se trata la enfermedad. Las alteraciones de la coagulación conducen a adhesividad aumentada de eritrocitos. Como resultado, el paso de la sangre a través de la microvasculatura está impedido, dando como resultado congestión de órganos internos y hematocritos (PCV) disminuidos. También la ruptura de eritrocitos infectados provoca pérdida de grandes números de eritrocitos. Estos efectos alteran al suministro de oxígeno a varios tejidos y, posteriormente, conducen a lesión tisular como resultado de anoxia.

Ahora se ha detectado que especies de los Babesiidae infectan la mayor parte de las especies de mamífero de importancia veterinaria (Kuttler, K. L., en M. Risticed.: "Babesiosis of domestic animals and man". CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1988): Vaca (B. divergens, B. bovis, B. bigemina), Cerdo (B. trautmanni, B. perroncitoi), Oveja (B. ovis, B. motasi), Caballo (B. equi, B. caballi), Perro (B. canis, B. rossi, B. vogeli) y Gato (B. felis, B. cati). En todas estas especies, la muerte o pérdidas económicas más o menos graves (reducción en la calidad o cantidad de carne, leche, lana o descendencia) o una reducción grave en el bienestar están provocadas como resultado de la infección por Babesia directamente o por facilitación de infecciones secundarias.

Los parásitos Theileria están estrechamente relacionados con Babesia. Estos también pertenecen al grupo taxonómico de los Piroplásmidos y muestran muchas relaciones biológicas y epidemiológicas con Babesia. Son especies de Theileria bien conocidas de importancia veterinaria T. parva, T. annulata y T. sergenti.

Existen medicaciones para curar una infección establecida por Babesia o Theileria, por ejemplo, los perros, caballos y vacas se pueden tratar con dipropionato de imidocarb. Sin embargo, tal inyección es dolorosa debido a la irritación tisular. Adicionalmente, adolece de los inconvenientes comunes de tales antiparasitarios: la prevención de una generación de memoria inmunológica, potencial toxicidad y posible generación de resistencia.

Se ha demostrado que la Babesiosis y Theileriosis se pueden controlar por vacunación con vacunas vivas (revisado en: Jenkins, M. 2001, Vet Parasitol., vol. 101, págs. 291-310). Tales vacunas se producen recogiendo eritrocitos de animales infectados. Para algunas, pero no todas las especies de Babesia se han desarrollado cultivos de eritrocitos in vitro para aumentar el número de parásitos. Los eritrocitos infectados del animal o los cultivos, también conocidos como "productos estabilizados", después se usan para vacunar animales.

Los productos estabilizados para Theileria se producen de un modo similar. De hecho, debido a que la necesidad de una vacuna eficaz es tan alta, se han producido incluso productos estabilizados de Theileria a partir de las glándulas salivales de garrapatas infectadas.

Las desventajas generales de tales vacunas parasitarias vivas son que el material de inoculación está en gran medida incontrolado, es altamente variable en su composición, es biológicamente inseguro y que todo el proceso no es ético por el uso de un gran número de animales de experimentación. Adicionalmente, los parásitos Piroplásmidos son muy inestables; se tienen que alejar de oxígeno libre o morirán rápidamente.

Alternativamente, los propios eritrocitos infectados por parásitos no se usan para la vacunación, sino el suero del hospedador infectado o el sobrenadante de un cultivo in vitro. Tales líquidos circundantes de eritrocitos infectados contienen los denominados Antígenos Parasitarios Solubles (SPA). Se conoce poco acerca de la composición de estas preparaciones. Se ha sugerido que la actividad protectora se debe a la capacidad inmunizante de antígenos de la cubierta superficial del merozoito en el suero o medio, una estructura que se deja atrás durante el proceso de invasión del eritrocito (Ristic, M. y Montenegro-James, S., 1988, en: "Babesiosis of Domestic Animals and Man", Ristic, M. ed., págs. 163-190, CRC Press). Además, durante el cultivo in vitro varios parásitos mueren, por lo tanto, se liberan antígenos parasitarios (internos) al medio de cultivo.

Tales preparaciones de SPA son capaces de inducir una respuesta inmune que, aunque no afecta necesariamente al parásito, reduce suficientemente las manifestaciones clínicas de la infección (Schetters y Montenegro-James, S., 1995, Parasitology Today, vol. 11, págs. 456-462). Por ejemplo, los SPA del sobrenadante de cultivo de un cultivo in vitro de eritrocitos infectados por el parásito Babesia canis (Pirodog®) induce inmunidad contra infección de exposición homóloga (pero no heteróloga).

En general, las vacunas basadas en SPA conllevan las mismas desventajas que vacunas parasitarias vivas, porque están en gran medida no caracterizadas, son altamente variables y requiere muchas precauciones para que sean biológicamente seguras. Adicionalmente, la producción de tales vacunas es muy difícil de aumentar de escala, ya que eso requiere la infección, alojamiento y recogida de muestras de animales de experimentación para proporcionar parásitos, eritrocitos y/o suero.

El documento publicado como documento WO 90/11776 describe proteínas de Babesia bovis, que se expresan sobre la superficie del merozoito de Babesia bovis. Estas proteínas, que son diferentes de las de la presente invención, se describen para el uso en vacunación y diagnóstico.

Es un objeto de la invención proporcionar proteínas y fragmentos de las mismas que pueden servir en vacunas eficaces para la prevención o mitigación de infección con un organismo Piroplásmido, que estén bien definidas, sean seguras, estables y con una producción que sea fácil de aumentar de escala.

Ahora se ha observado sorprendentemente que una vacuna que comprende una proteína de Piroplásmido novedosa o un fragmento inmunogénico de dicha proteína incorpora todas estas características ventajosas.

Ahora se pueden superar muchas desventajas de vacunas de parásitos vivas y SPA mediante el uso de tal proteína de Piroplásmido o un fragmento inmunogénico de dicha proteína en vacunas. Tal proteína está altamente definida, es biológicamente segura, el producto se puede estabilizar mucho mejor que parásitos vivos completos y su producción se puede aumentar de escala de manera sencilla.

Se observó sorprendentemente que los anticuerpos generados contra proteínas de Piroplásmido o fragmentos inmunogénicos de dichas proteínas inhibieron de forma eficaz la invasión de parásitos en células hospedadoras y, de este modo, interfirieron con el ciclo de infección del parásito. Por lo tanto, las proteínas se denominan: antígeno inhibidor de la invasión (IIA).

El proceso de la invasión por un parásito Piroplásmido de su célula hospedadora es una de las etapas críticas en el establecimiento de la infección parasitaria. Al interferir a este nivel mediante la inducción de anticuerpos que interfieren con esta etapa, se inhibe la entrada inicial de parásitos en las células del hospedador. Esto evita, o al menos disminuye, el nivel de infección o los signos clínicos de enfermedad en un hospedador y, por consiguiente, la gravedad de la enfermedad. También se detiene o disminuye la propagación adicional de la enfermedad en el entorno debido a que menos garrapatas se convertirán en portadores cuando se alimentan en hospedadores vacunados, por tanto, la presión de infección en el entorno disminuye.

Los IIA de Piroplásmido, que pueden inducir respuestas inmunes protectoras que conducen a anticuerpos que inhiben la invasión por el parásito Piroplásmido, se pueden detectar en parásitos Piroplásmidos, en cultivos de parásitos en proliferación y en células infectadas por antisueros específicos. Estos antisueros específicos reconocen estos IIA también en transferencias de Western 1-D y 2-D (bidimensionales) de lisados de células infectadas de parásitos o sus cultivos.

Los IIA de Piroplásmido se pueden expresar en un sistema de expresión. Las proteínas, o sus fragmentos, expresadas de este modo se pueden usar para formular una vacuna que proteja a los mamíferos contra enfermedad o sus signos clínicos después de la infección por un organismo Piroplásmido, por la inducción de anticuerpos específicos o linfocitos específicos de antígeno.

Por lo tanto, la invención proporciona una proteína de Piroplásmido caracterizada por que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una similitud de al menos el 70%, preferiblemente el 75%, más preferiblemente el 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o el 100% de similitud en ese orden de preferencia, con la secuencia de aminoácidos ilustrada en la SEC ID Nº: 2, o un fragmento antigénico que contiene epítopo de dicha proteína.

Un ejemplo típico de la proteína de Piroplásmido de la invención es:

-: IIA de Piroplásmido número 1 de Babesia bovis (BlIA1), cuya secuencia de aminoácidos se presenta en la SEC ID Nº: 2.

Se quiere decir que el término "proteína" incorpora una cadena molecular de aminoácidos. Una proteína no tiene una longitud, estructura o forma específica y, si se requiere, se puede modificar in vivo o in vitro, por ejemplo, por glucosilación, amidación, carboxilación, fosforilación o cambios en el plegamiento espacial. Entre otros, los péptidos, oligopéptidos y polipéptidos se incluyen dentro de la definición de proteína. Una proteína puede ser de origen biológico y/o sintético.

Una "proteína de Piroplásmido" de acuerdo con la invención es una proteína que se puede obtener a partir de un organismo de los Piroplásmidos.

Preferiblemente, la proteína de Piroplásmido se puede obtener de un organismo seleccionado entre el grupo que consisten en las especies Babesia divergens, B. bovis, B. motasi, B. caballi, B. equi, B. canis, B. rossi, B. vogeli, B. felis, B. cati, B. ovis, B. trautmanni, B. bigemina, B. microti y B. gibsoni.

Más preferiblemente, la proteína de Piroplásmido se puede obtener de un organismo seleccionado entre el grupo constituido por las especies Babesia bovis, B. caballi, B. equi, B. canis, B. rossi y B. bigemina.

Más preferiblemente, la proteína de Piroplásmido se puede obtener de Babesia bovis.

Con respecto a la clasificación taxonómica actual, el especialista entenderá que esto puede cambiar a lo largo del tiempo cuando nuevos conocimientos conduzcan a la reclasificación en nuevos u otros grupos taxonómicos. Sin embargo, ya que esto no cambia el repertorio de proteína del organismo implicado, solamente su clasificación, se considera que tales organismos re-clasificados pertenecen al alcance de la invención. Esto es especialmente pertinente para familias estrechamente relacionadas tales como Babesiidae y Theilerildae. Por ejemplo: Babesia equi se reclasificó recientemente como Theileria equi.

Para que sea antigénico, un fragmento de una proteína tiene que tener una cierta longitud; los fragmentos demasiado pequeños no se procesarán por células presentadoras de antígenos hasta fragmentos que sean capaces como tales de asociarse con moléculas de MHC, asociación que se requiere para la presentación de antígenos apropiada a linfocitos. Para la unión a receptor de MHC I, un fragmento antigénico que incluye el epítope consiste en al menos 8-11 aminoácidos y para unión a receptor de MHC II, al menos 11-15 aminoácidos (revisado, por ejemplo, por R. N. Germain & D. H. Margulies, 1993, Annu. Rev. Immunol., vol. 11, págs. 403-450, en: "The biochemistry and cell biology of antigen processing and presentation"). Los fragmentos de proteína más cortos que esto pueden no ser antigénicos como tales: se necesitan acoplar a un vehículo, tal como KLH, BSA o similares, usando técnicas conocidas en la técnica. Cuando están acoplados, tales fragmentos cortos pueden ser bastante capaces de inducir una respuesta inmune que pertenezca al alcance de la invención.

Para la invención, un "epítopo" es la parte de una molécula antigénica que reacciona con el receptor antigénico de un linfocito T y/o B. Por lo tanto, un epítopo de acuerdo con la invención inducirá y/o activará células T y/o B específicas de tal forma que estas células dan lugar a una reacción inmune que interfiere con el desarrollo de una infección o enfermedad. Por tanto, por tales epítopos, una proteína puede inducir anticuerpos y/o generar una respuesta inmune.

Se comprende que un "fragmento inmunogénico" es un fragmento antigénico que contiene epítopo de una proteína de Piroplásmido que tiene la capacidad de inducir respuestas inmunes dirigidas contra tales proteínas de Piroplásmido, a condición de que tales anticuerpos sean capaces de interferir con el proceso de invasión. A continuación se explicará cómo se pueden hallar tales fragmentos inmunogénicos.

Un fragmento inmunogénico de una proteína de Piroplásmido de acuerdo con la invención comprende al menos 10 aminoácidos tomados de la secuencia de aminoácidos de una proteína de Piroplásmido de acuerdo con la invención.

Preferiblemente, tal fragmento comprende 12, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200 ó 300 aminoácidos, en ese orden de preferencia, tomados de la secuencia de aminoácidos de una proteína de Piroplásmido de acuerdo con la invención.

Por ejemplo, un fragmento inmunogénico de una proteína de Piroplásmido de acuerdo con la invención se forma por una parte de la proteína que carece de la secuencia señal N-terminal y/o la secuencia C-terminal. Otros fragmentos, por ejemplo, son los que comprenden un epítopo específico de una proteína IIA de Piroplásmido. Tales epítopos se pueden determinar por los métodos resumidos más adelante. Todos estos fragmentos inmunogénicos pertenecen al alcance de la invención.

La identificación de fragmentos inmunogénicos y/o epítopos de una proteína de Piroplásmido de acuerdo con la invención se puede realizar de forma sencilla por una diversidad de técnicas directas, por ejemplo, por el denominado método PEPSCAN o por algoritmos informáticos que realizan comparaciones con fragmentos y/o epítopos conocidos.

El método PEPSCAN (documento WO 84/03564 y documento WO 86/06487, y H. Geysen et al., Proc. Natl. Acad. USA. 1984, vol. 81, págs. 3998-4002 y J. of Immunol, meth. 1987, vol. 102, págs. 259-274) es un método sencillo de realizar, rápido y bien establecido para la detección de determinantes inmunológicos de una proteína. Comprende la síntesis de una serie de fragmentos peptídicos que se solapan progresivamente con la proteína en estudio y el ensayo posterior de estos polipéptidos con anticuerpos específicos para la proteína para identificar cuáles de estos son capaces de unirse al receptor de antígeno de linfocitos T y/o B. Tales anticuerpos para las proteínas de acuerdo con la invención se pueden obtener preparando anticuerpos policlonales o monoclonales, usando técnicas bien conocidas en la
técnica.

El uso de algoritmos informáticos en la designación de fragmentos de proteína específicos como los epítopos inmunológicamente importantes basándose en su concordancia secuencial y/o estructural con epítopos que se conocen también es una técnica bien conocida. La determinación de estas regiones se puede basar en una combinación de criterios de hidrofilicidad de acuerdo con Hopp y Woods (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1981, vol. 78, págs. 3824-3828) y los aspectos de estructura secundaria de acuerdo con Chou y Fasman (Advances in Enzymology 1987, vol. 47, págs. 45-148 y Patente de Estados Unidos Nº 4.554.101). Los epítopos inmunogénicos se pueden predecir así mismo a partir de la secuencia de aminoácidos de la proteína por ordenador con la ayuda del criterio de anfifilicidad de Berzofsky (Science 1987, vol. 235, págs. 1059-1062 y Solicitud de Patente de Estados Unidos NTIS US 07/005.885). Se encuentra un resumen condensado del uso de estos métodos en Shan Lu (common principles: Tibtech 1991, vol. 9, págs. 238-242), Lu (revisado: Vaccine 1992, vol. 10, págs. 3-7) y Berzofsky (HIV-epitopes; 1991, The FASEB Journal, vol. 5, págs. 2412-2418).

Una ilustración de la eficacia del uso de estos métodos se publicó por H. Margalit et al. (J. of Immunol. 1987, vol. 138, págs. 2213-2229) que describe tasas de éxito del 75% en la predicción de epítopos de células T usando tales métodos. Una prueba adicional más es la predicción exitosa de los 3 péptidos antigénicos de BIIA1, como se resume en el Ejemplo 1, sección 1.1.5.

Posteriormente, se tiene que determinar si un epítopo encontrado usando los métodos que se han descrito anteriormente de hecho es capaz de interferir con el proceso de invasión. Sin embargo, esto se puede realizar muy rápida y sencillamente en un experimento de inhibición de invasión in vitro simple. Tal experimento se describe en el Ejemplo 1.1.11.

El porcentaje de similitud de una secuencia de aminoácidos con una proteína de acuerdo con la invención se tiene que determinar por alineamiento de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8 ó 10.

El porcentaje de similitud con una proteína de acuerdo con la invención se tiene que determinar con el programa informático "BLAST 2 SEQUENCES" seleccionando subprograma: "BlastP" (T. Tatusova & T. Madden, 1999, FEMS Microbiol. Letters, vol. 174, págs. 247-250), que se puede encontrar en www.ncbi.nlm.nih.goviblast/bl2seq/bl2.htmi. La matriz de comparación que se usa es: "Blosum62", con los parámetros por defecto: penalización por hueco abierto: 11; penalización por extensión de hueco: 1; y disminución x de hueco: 50.

Este programa enumera el porcentaje de aminoácidos que son idénticos como "Identidades" y el porcentaje de aminoácidos que son similares como "Positivos". Los aminoácidos "Similares" son los aminoácidos que son idénticos más los que son equivalentes; los aminoácidos "equivalentes" se describen más adelante.

Se entenderá que, para una proteína de Piroplásmido particular, existen variaciones naturales entre las proteínas asociadas con cepas individuales de especies de Piroplásmidos. Estas variaciones se pueden demostrar por una diferencia o diferencias de aminoácidos en la secuencia global por deleciones, sustituciones, inserciones, inversiones o adiciones de un aminoácido o aminoácidos en dicha secuencia. Las sustituciones de aminoácidos, que no alteran esencialmente las actividades biológicas e inmunológicas, se han descrito, por ejemplo, por Neurath et al. (1979, en: "The Proteins", Academic Press New York). Las sustituciones de aminoácidos entre aminoácidos relacionados o sustituciones que han tenido lugar frecuentemente en la evolución son, entre otras, Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, IIe/Val (véase Dayhof, M. D., 1978, "Atlas of protein sequence and structure". Nat. Biomed. Res. Found., Washington D. C. vol. 5, supl. 3). Otras sustituciones de aminoácidos comunes incluyen Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Leu/Ile Leu/Val y Ala/Glu. Tales aminoácidos relacionados y comúnmente sustituidos se denominan "equivalentes". Basándose en esta información, Lipman y Pearson desarrollaron un método para una comparación de proteína rápida y sensible (Science, 1985, vol. 227, págs. 1435-1441) y para determinar la similitud funcional entre proteínas. Tales sustituciones de aminoácidos de las realizaciones ilustrativas de esta invención, así como variaciones que tienen deleciones y/o inserciones pertenecen al alcance de la invención siempre que las proteínas resultantes conserven la capacidad de inducir respuestas inmunes que inhiban la proliferación del parásito Piroplásmido, por ejemplo, anticuerpos que inhiben la invasión por el parásito Piroplásmido. Tales variaciones en la secuencia de aminoácidos de una cierta proteína de Piroplásmido de acuerdo con la invención se consideran "homólogos biológicos o funcionales" y pertenecen todas al alcance de la invención.

Esto explica por qué una proteína de Piroplásmido de acuerdo con la invención, cuando se aísla de diferentes especies de Piroplásmido, puede tener una similitud de hasta el 70% con, por ejemplo, las secuencias de aminoácidos ilustradas en la SEC ID Nº: 2, mientras que todavía representa la misma proteína con las mismas características, en el ejemplo presentado: ser capaz de inducir anticuerpos que inhiben la invasión por el parásito Piroplásmido.

Cuando se comparan proteínas de Piroplásmido de acuerdo con la invención entre sí mismas, las proteínas de Piroplásmido de acuerdo con la invención obtenidas de diferentes organismos de Piroplásmido tienen típicamente más del 50% de similitud de aminoácidos; cuando se obtienen de diferentes especies de Babesia, tales proteínas tienen típicamente más del 85% de similitud de aminoácidos y cuando se obtienen de diferentes aislados de B. bovis, tales proteínas tienen típicamente más del 95% de similitud de aminoácidos.

El modo preferido de producir las proteínas de Piroplásmido de acuerdo con la invención es mediante el uso de técnicas de ingeniería genética y sistemas de expresión recombinantes. Estos pueden comprender el uso de ácidos nucleicos, fragmentos de ADNc, moléculas de ADN recombinante, vehículos recombinantes vivos y/o células hospedadoras.

Por lo tanto, otro aspecto de la invención se refiere a un ácido nucleico, caracterizado por que dicho ácido nucleico codifica una proteína de Piroplásmido de acuerdo con la invención o un fragmento antigénico que contiene epítopo de dicha proteína.

En una realización, el ácido nucleico de acuerdo con la invención comprende la secuencia de ácido nucleico ilustrada en la SEC ID Nº: 1.

La expresión "ácido nucleico" quiere decir que incorpora una cadena molecular de ácidos desoxi- o ribonucleicos. Un ácido nucleico no tiene ninguna longitud específica, por lo tanto, se incluyen polinucleótidos, genes, fases de lectura abierta (ORF), sondas, cebadores, enlazadores, espaciadores y adaptadores, que consisten en ADN y/o ARN, en la definición de ácido nucleico. Un ácido nucleico puede ser de origen biológico y/o sintético. El ácido nucleico puede estar de una forma monocatenaria o bicatenaria. La cadena única puede estar en orientación con sentido o anti-sentido. También se incluyen en la definición ARN o ADN modificados. Se pueden realizar modificaciones en las bases del ácido nucleico y se pueden incorporar bases tales como inosina. Otras modificaciones pueden implicar, por ejemplo, modificaciones en la cadena principal.

El término "codifica" quiere decir que incorpora: proporcionar la posibilidad de expresión de proteína, entre otros, por transcripción y/o traducción cuando se pone en el contexto adecuado.

Un ácido nucleico de acuerdo con la invención codifica una proteína de Piroplásmido de acuerdo con la invención o codifica un fragmento inmunogénico de dicha proteína.

Un ácido nucleico de acuerdo con la invención tiene una longitud mínima de 30 nucleótidos. Preferiblemente, un ácido nucleico de acuerdo con la invención comprende 40, 50, 100, 250, 500, 1000 ó 1500 nucleótidos en ese orden de preferencia.

Un ácido nucleico de acuerdo con la invención, por ejemplo, es un ácido nucleico que codifica una proteína de Piroplásmido de acuerdo con la invención que carece de la secuencia señal N-terminal y/o la secuencia C-terminal. Otros ácidos nucleicos pueden comprender una secuencia que codifica un epítopo específico de una proteína de Piroplásmido. Tales ácidos nucleicos pertenecen todos al alcance de la invención.

De los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención se excluyen las siguientes secuencias:

\bullet Con respecto a BIIA1 (SEC ID Nº: 1), las secuencias EST:

\medcirc: B_bovis-11e05.plc

\medcirc: B_bovis-344e09.qlc

\medcirc: B_bovis-384f06.qlc

\medcirc: B_bovis-261d05.qlc

\medcirc: B_bovis-5e5.plc

\medcirc: B_bovis-373g01.qlc

\medcirc: B_bovis-418b06.qlc

\medcirc: B_bovis-375d02.qlc

\medcirc: B_bovis-407d03.qlc

\medcirc: B_bovis-284-f07.qlc

\bullet Con respecto a BIIA1 (SEC ID Nº: 1), los contigs ensamblados:

\medcirc: Bbovis.C0NTIG.1029

\medcirc: Bbovis.CONTIG.227

Las secuencias EST y de contig relacionadas con BIIA1 están disponibles por la página web de Internet:
www.sanger.ac.uk/projects/b bovis/.

El porcentaje de identidad entre ácidos nucleicos de acuerdo con la invención se determina por el programa informático "BLAST2 SEQUENCES" seleccionando el subprograma: "BlastN" (T. Tatusova & T. Madden, 1999, FEMS Microbiol. Letters, vol. 174, págs. 247-250), que se puede encontrar en www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html. Los parámetros que se usan son los parámetros por defecto: recompensa por una coincidencia: +1; penalización por un apareamiento erróneo: -2; penalización por abertura de hueco: 5; penalización por extensión de hueco: 2; y disminución x de hueco: 50. A diferencia de la salida del programa BlastP que se ha descrito anteriormente, el programa BlastN no enumera similitudes, solamente identidades: el porcentaje de nucleótidos que son idénticos se indican como "Identidades".

Se conoce bien en la técnica que muchos ácidos nucleicos diferentes pueden codificar la misma proteína. Esto es resultado de lo que se conoce en biología molecular como "titubeo" o la "degeneración del código genético", donde varios codones o tripletes de ARNm provocarán que el mismo aminoácido se una a la cadena de aminoácidos que crece en el ribosoma durante la traducción. Es mucho más prevalente en la segunda y especialmente en la tercera base de cada triplete que codifica un aminoácido. Este fenómeno puede dar como resultado una heterología de aproximadamente el 30% para dos ácidos nucleicos diferentes que todavía codifican la misma proteína. Por lo tanto, dos ácidos nucleicos que tienen una identidad de secuencia de nucleótidos de aproximadamente el 70% todavía pueden codificar la misma proteína.

Otra estrategia para decidir si una cierta secuencia de ácido nucleico es o no una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención, se refiere a la cuestión de si ciertas secuencias de ácido nucleico hibridan en condiciones rigurosas con las secuencias de nucleótidos ilustradas en la SEC ID Nº: 1.

Si una secuencia de ácido nucleico hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos como se ilustra en la SEC ID Nº: 1, se considera que es una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención.

La definición de condiciones rigurosas se deduce de la fórmula para la temperatura de fusión Tm de Meinkoth y Wahl (1984, Anal. Biochem., vol. 138, págs. 267-284):

Tm = [81,5ºC + 16,6(log M) + 0,41(% GC) - 0,61(% formamida) - 500/L] -1ºC/ 1% apareamiento erróneo

En esta fórmula, M es la molaridad de cationes monovalentes; % GC es el porcentaje de nucleótidos guanosina y citosina en el ADN; L es la longitud del híbrido en pares de bases; y apareamiento erróneo es la ausencia de un apareamiento idéntico.

Las condiciones rigurosas son las condiciones en las que las secuencias de ácido nucleico o fragmentos de las mismas todavía hibridan, si tienen un apareamiento erróneo del 30% (es decir, si tienen una identidad de sólo el 70%) con la secuencia de ácido nucleico como se ilustra en la SEC ID Nº: 1.

Los ácidos nucleicos que codifican las proteínas de Piroplásmido de acuerdo con la invención se pueden obtener de especies miembros de los Piroplásmidos.

Sin embargo, en una realización más preferida, los ácidos nucleicos que codifican una proteína de Piroplásmido o fragmentos inmunogénicos de dicha proteína de acuerdo con la invención se caracterizan por que se pueden obtener de un organismo seleccionado entre el grupo que consiste en las especies Babesia divergens, B. bovis, B. motasi, B. caballi, B. equi, B. canis, B. rossi, B. vogeli, B. felis, B. cati, B. ovis, B. trautmanni, B. bigemina, B. microti y B. gibsoni.

Más preferiblemente, los ácidos nucleicos se pueden obtener de un organismo seleccionado entre el grupo que consiste en las especies Babesia bovis, B. caballi, B. equi, B. canis, B. rossi y B. bigemina.

La posibilidad de que las especies se re-clasifiquen taxonómicamente o se describan como nuevas especies ya se ha discutido anteriormente. Ya que esto no cambia el genoma del organismo, tales organismos reclasificados también pertenecen al alcance de la invención.

También pertenecen al alcance de la invención las proteínas de Piroplásmido, fragmentos inmunogénicos de dichas proteínas y ácidos nucleicos que codifican tales proteínas de Piroplásmido o fragmentos de las mismas de Piroplásmidos que no son de mamífero, debido a la alta conservación de los genes y proteínas de la proteína de Piroplásmido de acuerdo con la invención. Tales proteínas relacionadas o sus genes se pueden denominar parálogos u ortólogos.

Los ácidos nucleicos que codifican una proteína de Piroplásmido de acuerdo con la invención se puede obtener, manipular y expresar mediante técnicas de biología molecular convencionales que se conocen bien por el especialista y se explican con mucho detalle en libros de texto convencionales como Sambrook y Russell: "Molecular cloning: a laboratory manual" (2001, Cold Spring Harbour Laboratory Press, ISBN: 0879695773). Uno de estos tipos de manipulaciones es la síntesis de un fragmento de ADNc a partir de ARN, preferiblemente a partir de ARNm que se puede aislar de parásitos o células u organismos infectados por parásitos mediante técnicas conocidas en la técnica.

Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un fragmento de ADNc de acuerdo con la invención.

El método preferido para obtener un fragmento de ADNc por transcripción inversa es mediante una técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se describen técnicas y protocolos convencionales para realizar PCR, por ejemplo, de forma extensa en C. Dieffenbach & G. Dveksler: "PCR primers: a laboratory manual" (1995, CSHL Press, ISBN 879694473).

En una realización preferida, la invención se refiere a una molécula de ADN recombinante que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la invención o un fragmento de ADNc de acuerdo con la invención, estando dicho ácido nucleico o dicho fragmento de ADNc bajo el control de un promotor ligado funcionalmente.

Para construir una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la invención se emplean preferiblemente plásmidos de ADN. Tales plásmidos son útiles, por ejemplo, para mejorar la cantidad de inserto de ADN, como una sonda, y como una herramienta para manipulaciones adicionales. Son ejemplos de tales plásmidos para clonación los plásmidos de las series pBR, pUC y pGEM; todos estos están disponibles en varios proveedores comerciales.

El ácido nucleico que codifica una proteína de Piroplásmido de acuerdo con la invención o un fragmento inmunogénico de dicha proteína se puede clonar en plásmidos separados y se puede modificar para obtener la conformación deseada usando técnicas bien conocidas en la técnica. Sin embargo, también se puede combinar en una construcción para propósitos de clonación o expresión mejorada.

Se pueden realizar modificaciones de las secuencias codificantes que codifican una proteína de Piroplásmido de acuerdo con la invención o un fragmento inmunogénico de la misma, por ejemplo, usando digestión con enzimas de restricción, por mutaciones dirigidas o mediante técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Para el propósito de purificación o detección de proteína, o mejora del nivel de expresión, se pueden añadir ácidos nucleicos adicionales. Esto puede dar como resultado el ácido nucleico final comprendido en el fragmento de ADNc o que la molécula de ADN recombinante sea mayor que las secuencias requeridas para codificar una proteína de Piroplásmido. Cuando tales elementos adicionales se insertan en fase, estos se convierten en una parte integral de la proteína de Piroplásmido que se expresa. Tales proteínas fusionadas también pertenecen al alcance de la invención Un requisito esencial para la expresión de un ácido nucleico, fragmento de ADNc o molécula de ADN recombinante es que estos estén unidos operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción de tal forma que ésta sea capaz de controlar la transcripción del ácido nucleico, ADNc o ADN recombinante. Las secuencias reguladoras de la transcripción se conocen bien en la técnica y comprenden, entre otros, promotores y potenciadores. Es evidente para los especialistas en la técnica que la elección de un promotor se extiende a cualquier promotor eucariota, procariota o vírico capaz de dirigir la transcripción génica, suponiendo que el promotor sea funcional en el sistema de expresión usado.

En una realización más preferida, la invención se refiere a un microorganismo portador recombinante vivo que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la invención o un fragmento de ADNc de acuerdo con la invención, estando dicho ácido nucleico o dicho fragmento de ADNc bajo el control de un promotor unido funcionalmente o una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la invención.

Tales vehículos recombinantes vivos (LRC) son, por ejemplo, microorganismos tales como bacterias, parásitos y virus en los que se ha clonado información genética adicional, en este caso, un ácido nucleico, un ADNc o una molécula de ADN recombinante, que codifica una proteína de Piroplásmido de acuerdo con la invención o un fragmento inmunogénico de la misma. Los mamíferos diana a los que se han inoculado tales LRC producirán una respuesta inmunogénica no solamente contra los inmunógenos del vehículo, sino también contra la proteína o las proteínas heterólogas o el fragmento o los fragmentos inmunogénicos para los que el código genético se clona adicionalmente en el LRC, por ejemplo, una secuencia que codifica una proteína de Piroplásmido de acuerdo con la invención o un fragmento inmunogénico de la misma.

Como un ejemplo de LRC bacterianos se pueden usar de forma atractiva cepas atenuadas de Salmonella conocidas en la técnica.

Alternativamente, los parásitos portadores recombinantes vivos se han descrito, entre otros, por Vermeulen, A. N. (Int. Journ. Parasitol. 1998, vol. 28, págs. 1121-1130).

Se pueden usar virus LRC como un modo de transportar un ácido nucleico al interior de una célula diana. Los virus portadores recombinantes vivos también se denominan virus vectores. Los virus usados con frecuencia como vectores son virus Vaccinia (Panicali et al. 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 79, págs. 4927), virus herpes (documento EP 0473210-A2) y retrovirus (Valerio, D. et al. 1989, en: Baum, S. J., Dicke, K. A., Lotzova, E. y Pluznik, D. H. (Eds.), "Experimental Haematology today", Springer Verlag, New York, págs. 92-99).

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La técnica de recombinación homóloga in vivo, bien conocida en la técnica, se puede usar para introducir un ácido nucleico recombinante de acuerdo con la invención en el genoma de una bacteria, parásito o virus LRC de elección, capaz de inducir la expresión del ácido nucleico, ADNc o ADN recombinante insertado de acuerdo con la invención en el animal hospedador.

Se usan sistemas de expresión de células bacterianas, de levadura, fúngicas, de insecto y de vertebrados como células hospedadoras para propósitos de expresión muy frecuentemente. Tales sistemas de expresión se conocen bien en la técnica y están disponibles de forma general, por ejemplo, en el mercado, en Invitrogen (Países Bajos).

Por lo tanto, en una realización aún más preferida, la invención se refiere a una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la invención, un fragmento de ADNc de acuerdo con la invención, estando dicho ácido nucleico o dicho fragmento de ADNc bajo el control de un promotor unido funcionalmente, una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la invención o un microorganismo portador recombinante vivo de acuerdo con la invención.

Una célula hospedadora a usar para la expresión de una proteína de Piroplásmido de acuerdo con la invención puede ser una célula de origen bacteriano, por ejemplo, de Escherichia coli, Bacillus subtilis, Lactobacillus sp. o Caulobacter crescentus, en combinación con el uso de plásmidos obtenidos de bacterias o bacteriófagos para expresar la secuencia que codifica una proteína de Piroplásmido. La célula hospedadora también puede ser de origen eucariota, por ejemplo, células de levadura en combinación con moléculas de vector específicas de levadura o células eucariotas superiores, como células de insecto (Luckow et al., 1988, Bio-tecnology, vol. 6, págs. 47-55) en combinación con vectores o baculovirus recombinantes; células vegetales en combinación con, por ejemplo, vectores basados en plásmido Ti o vectores víricos de plantas (Barton, K. A. et al., 1983, Cell, vol. 32, pág. 1033); o células de mamífero como células Hela, células de ovario de hámster chino o células de riñón felino Crandell-Rees, también con vectores o virus recombinantes apropiados.

Además de estos sistemas de expresión, los sistemas de expresión basados en células vegetales o parásitos son sistemas de expresión atractivos. Los sistemas de expresión de parásitos se describen, por ejemplo, en la Solicitud de Patente Francesa, número de publicación 2 714 074 y en la publicación US NTIS Nº 08/043109 (Hoffman, S. & Rogers, W., 1993). Los sistemas de expresión de células vegetales para polipéptidos para aplicación biológica se analizan, por ejemplo, en R. Fischer et al. (Eur. J. of Biochem. 1999, vol. 262, págs. 810-816) y J. Larrick et al. (Biomol. Engin. 2001, vol. 18, págs. 87-94).

La expresión también se puede realizar en denominados sistemas de expresión sin células. Tales sistemas comprenden todos los factores esenciales para la expresión de un ácido nucleico recombinante apropiado, unido operativamente a un promotor que funcionará en ese sistema particular. Son ejemplos el sistema de lisado de E. coli (Roche, Basel, Suiza) o el sistema de lisado de reticulocitos de conejo (Promega corp., Madison, EE.UU.).

La proteína de Piroplásmido de acuerdo con la invención o fragmentos inmunogénicos de dicha proteína son bastante adecuados para la producción de una vacuna. Tales proteínas o fragmentos se pueden obtener de parásitos o de animales o células infectadas con parásitos de Piroplásmido. Sin embargo, es mucho más conveniente el uso de ácidos nucleicos que codifican la proteína de Piroplásmido de acuerdo con la invención o un fragmento inmunogénico de dicha proteína en un sistema de expresión. Esto va seguido de recoger las proteínas o fragmentos producidos y formular estos en una vacuna de subunidades de proteína, por ejemplo, mezclando una proteína de Piroplásmido de acuerdo con la invención o un fragmento inmunogénico de dicha proteína y un vehículo farmacéuticamente
aceptable.

Por lo tanto, otro aspecto más de la invención se refiere a una vacuna que comprende una proteína de acuerdo con la invención o un fragmento antigénico que contiene epítopo de dicha proteína, un ácido nucleico, un fragmento de ADNc, una molécula de ADN recombinante, un microorganismo portador recombinante vivo o una célula hospedadora de acuerdo con la invención, o una combinación de los mismos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Como se ha descrito anteriormente, una proteína de Piroplásmido o un fragmento inmunogénico de dicha proteína puede usarse ventajosamente para la vacunación. Sirve para interferir con la proliferación del parásito Piroplásmido (por ejemplo: inhibición de la invasión de célula hospedadora) o inducirá respuestas inmunes protectoras (por ejemplo, anticuerpos específicos o linfocitos activados) que interfieren con la proliferación de parásitos o los signos clínicos que produce.

Si tales proteínas o fragmentos no producen la respuesta deseada por sí mismos, se pueden acoplar a un vehículo tal como KLH, BSA o similares, usando técnicas conocidas en la técnica.

El acoplamiento de proteína o fragmentos de la misma también se puede realizar para mejorar o modificar la respuesta inmune inducida. Por ejemplo, es una práctica común acoplar un fragmento o fragmentos de proteína a toxoide de tétanos para mejorar la respuesta de células T. También se pueden añadir moléculas efectoras específicas, tales como una toxina, para mejorar la destrucción de células diana.

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Tales acoplamientos se pueden realizar

-: químicamente, por acoplamiento, conjugación o reticulación, por deshidratación, esterificación, etc., de las secuencias de aminoácidos directamente o por una estructura intermedia.

-: físicamente, acoplando por captura en o sobre una estructura macromolecular o preferiblemente

-: por fusión biológica molecular, por la combinación de moléculas de ácido nucleico recombinante que comprende fragmentos de ácido nucleico capaces de codificar cada una de las dos, de tal forma que se produce finalmente un único producto de expresión continuo. Se prefieren tales técnicas de ingeniería molecular.

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Un modo alternativo y eficaz de vacunación es por vacunación directa con ADN que codifica el antígeno o epítopo pertinente. La vacunación directa con ADN que codifica proteínas ha sido exitosa para muchas proteínas diferentes, como se revisa, por ejemplo, en Donnelly et al. (The Immunologist 1993, vol. 2, págs. 20-26). Por ejemplo, en el campo de las vacunas antiparasitarias, se ha obtenido protección contra, por ejemplo, Plasmodium yoelii con vacunación de ADN con el gen de circumsporozoite de P. yoelii (Hoffman, S. et al. 1994, Vaccine, vol. 12, págs. 1529-1533), y se ha obtenido protección contra Leishmania major con vacunación de ADN con el gen gp63 de glucoproteína de superficie de L. major (Xu & Liew 1994, Vaccine, vol. 12, págs. 1534-1536).

Tal vacunación con ADN se puede realizar con un ácido nucleico, un fragmento de ADNc o preferiblemente con una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la invención.

Por lo tanto, una realización preferida se refiere a una vacuna de acuerdo con la invención, caracterizada por que comprende un ácido nucleico, un fragmento de ADNc o una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la invención.

Alternativamente, una vacuna de acuerdo con la invención puede comprender vehículos recombinantes vivos como se ha descrito anteriormente, capaces de expresar la proteína de Piroplásmido de acuerdo con la invención o fragmentos inmunogénicos de dicha proteína. Tales vacunas, por ejemplo, basadas en un vehículo o vector bacteriano, parasitario o vírico tienen la ventaja con respecto a vacunas de subunidades que imitan mejor el modo natural de infección por Piroplásmidos. También la presentación de los antígenos por células infectadas con los vehículos se parece a la ruta de una proteína de Piroplásmido de acuerdo con la invención o fragmentos inmunogénicos de dicha proteína se presentan al sistema inmune en una infección natural. Además, su auto-propagación es una ventaja ya que se necesitan solamente pequeñas cantidades del vehículo recombinante para la inmunización.

Por tanto, otra realización preferida se refiere a una vacuna de acuerdo con la invención, que comprende un microorganismo portador recombinante vivo y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Las células hospedadoras como se han descrito anteriormente se pueden usar para expresar una proteína de Piroplásmido de acuerdo con la invención o un fragmento inmunogénico de dicha proteína como un sistema de expresión. Después de la expresión, el producto proteináceo se puede recoger, pero alternativamente, el medio de cultivo o las propias células hospedadoras en su totalidad se pueden usar en una vacuna. Esto tiene el beneficio de omitir etapas de purificación, pero, por supuesto, requiere cierta tolerancia por los mamíferos diana a los componentes del medio y/o componentes de las células hospedadoras.

También pertenece al alcance de la invención una vacuna de acuerdo con la invención que comprende una combinación de dos o más tipos de moléculas de la proteína de Piroplásmido de acuerdo con la invención o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, o un ácido nucleico, ADNc, molécula recombinante, vehículo recombinante vivo o células hospedadoras de acuerdo con la invención. Para tales vacunas de acuerdo con la invención, los componentes se pueden combinar en una única dosis o en dosis separadas y éstas se pueden administrar al mismo tiempo o secuencialmente.

Por ejemplo, se puede usar ventajosamente una vacunación de combinación de una sensibilización inicial con un plásmido de ADN recombinante que lleva la secuencia codificante de una proteína de Piroplásmido, seguido cierto tiempo después de una vacunación de refuerzo con una proteína de Piroplásmido.

Las vacunas de acuerdo con la invención se pueden administrar en cantidades que contienen entre 0,1 y 1000 \mug de una proteína de Piroplásmido de acuerdo con la invención o un fragmento inmunogénico de dicha proteína por diana de mamífero. En principio se pueden usar dosis menores o mayores; preferiblemente se usa una dosis entre 50 y
200 \mug de una proteína de Piroplásmido o un fragmento inmunogénico de la misma.

Para vacunas de vector vírico vivo, la tasa de dosis por animal puede variar de 1 a 10^{10} ufp, preferiblemente se usan 10-10^{5} ufp.

Se entiende que un vehículo farmacéuticamente aceptable es un compuesto que no afecta de forma adversa a la salud del animal a vacunar, al menos no en el sentido de que el efecto adverso es peor que los efectos observados cuando el animal no se vacuna. Un vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser, por ejemplo, agua estéril o una solución salina fisiológica estéril. En una forma más compleja, el vehículo puede ser, por ejemplo, un tampón.

Con frecuencia, una vacuna se mezcla con estabilizantes, por ejemplo, para proteger componentes con tendencia a degradación de ser degradados, para aumentar la vida útil de la vacuna o para mejorar la eficacia de secado por congelación. Son estabilizantes útiles, entre otros, SPGA (Bovarnik et al. 1950, J. Bacteriology, vol. 59, pág. 509), leche desnatada, gelatina, albúmina sérica bovina, hidratos de carbono, por ejemplo, sorbitol, manitol, trehalosa, almidón, sacarosa, dextrano o glucosa, proteínas tales como albúmina o caseína o productos de degradación de los mismos y tampones, tales como fosfatos de metal alcalino.

La vacuna de acuerdo con la invención puede comprender adicionalmente un denominado "vehículo". Un vehículo es un compuesto al que las proteínas, fragmentos de proteína, ácidos nucleicos o partes de los mismos, ADNc, moléculas recombinantes, portadores recombinantes vivos y/o células hospedadoras de acuerdo con la invención se adhieren, sin unirse covalentemente al mismo. Tales vehículos son, entre otros, bio-microcápsulas, micro-alginatos, liposomas, macrosoles, hidróxido, fosfato, sulfato u óxido de aluminio, sílice, Kaolin® y Bentonite®, todos conocidos en la técnica.

Un ejemplo es un vehículo en el que el antígeno se incluye parcialmente en un complejo inmunoestimulante, el denominado ISCOM® (documentos EP 109.942, EP 180.564, EP 242.380).

Además, la vacuna de acuerdo con la invención puede comprender uno o más compuestos con actividad superficial o emulsionantes adecuados, por ejemplo, Span® o Tween®.

Los objetos diana para la vacuna de acuerdo con la invención son preferiblemente animales mamíferos, por ejemplo, seres humanos o animales mamíferos de importancia veterinaria. La diana puede estar sana o enferma y puede ser seropositiva o -negativa para parásitos Piroplasmídicos o para anticuerpos contra parásitos Piroplasmídicos. El sujeto diana puede tener cualquier edad a la que sea susceptible a la vacunación.

Los mamíferos diana más preferidos para la vacuna de acuerdo con la invención son bovinos, equinos, caninos y felinos.

La vacuna de acuerdo con la invención se puede usar igualmente como tratamiento profiláctico y terapéutico e interfiere con el establecimiento y/o con la progresión de una infección o sus síntomas clínicos de enfermedad.

Por lo tanto, un aspecto de la invención se refiere al uso de una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención, un fragmento de ADNc de acuerdo con la invención, una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la invención, un microorganismo portador recombinante vivo de acuerdo con la invención o una célula hospedadora de acuerdo con la invención para la fabricación de una vacuna para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una infección o sus signos clínicos provocados por un organismo de Piroplásmido.

La vacuna de acuerdo con la invención evita o reduce la propagación de la infección por Piroplásmido a lo largo de la población o al entorno.

La vacuna de acuerdo con la invención puede estar en varias formas, por ejemplo: un líquido, un gel, una pomada, un polvo, un comprimido o una cápsula, dependiendo del método de aplicación deseado a la diana.

Preferiblemente, la vacuna está en forma de un líquido inyectable.

La vacuna de acuerdo con la invención se puede administrar a la diana mamífero de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, por aplicaciones parenterales tales como a través de todas las vías de inyección en o a través de la piel: por ejemplo, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, submucosal o subcutánea. Las vías de aplicación alternativas que son factibles son por aplicación tópica como una gota, pulverizador, gel o pomada al epitelio de la mucosa del ojo, nariz, boca, ano o vagina o sobre la epidermis de la piel externa en cualquier parte del cuerpo; por pulverizador como aerosol o polvo. Alternativamente, la aplicación puede ser por la vía alimentaria, por combinación con el alimento, pienso o agua de bebida, por ejemplo, como un polvo, un líquido o comprimido o por adminis-
tración directamente a la boca como un líquido, un gel, un comprimido o una cápsula o al ano como un supositorio.

La vía de aplicación preferida es por inyección intramuscular o subcutánea. No es necesario decir que la vía de aplicación óptima dependerá de las particularidades específicas de la infección parasitaria o la enfermedad clínica que se tiene que evitar o mitigar, de las características de la formulación de vacuna que se usa y de características particulares de las especies diana.

El esquema de la aplicación de la vacuna de acuerdo con la invención al mamífero diana puede ser en dosis únicas o múltiples, que se pueden dar al mismo tiempo o secuencialmente, de un modo compatible con la dosificación y formulación y en tal cantidad que sea inmunológicamente eficaz.

Las vacunas de la invención se aplican ventajosamente en una única dosis anual.

En una realización preferida, la vacuna de acuerdo con la invención se caracteriza por que comprende un adyuvante.

Un adyuvante, en general, es una sustancia que refuerza la respuesta inmune de la diana de un modo no específico. En la técnica se conocen muchos adyuvantes diferentes. Son ejemplos de adyuvantes el adyuvante completo e incompleto de Freund, vitamina E, polímeros de bloque no iónicos y poliaminas tales como sulfato de dextrano, carbopol y pirano. También son muy adecuadas las saponinas, que son los adyuvantes preferidos. Las saponinas se añaden preferiblemente a la vacuna a un nivel entre 10 y 10.000 \mug/ml. Dentro del grupo de las saponinas, la saponina Quil A® es el adyuvante más preferido. La saponina y los componentes vacunales se pueden combinar en un ISCOMS® (documentos EP 109.942, EP 180.564, EP 242.380).

Además, con frecuencia se usan péptidos tales como dipéptidos de muramilo, dimetilglicina, tuftsina como un adyuvante y se pueden usar ventajosamente aceite mineral, por ejemplo, Bayol® o Markol®, aceites vegetales o emulsiones de los mismos y DiluvacForte®.

No es necesario decir que otros modos de potenciación con adyuvante, adición de compuestos de vehículo o diluyentes, emulsión o estabilización de una vacuna también pertenecen al alcance de la invención. Tales adiciones se describen, por ejemplo, en manuales bien conocidos tales como: "Remington: the science and practice of pharmacy" (2000, Lippincot, USA, ISBN: 683306472) y: "Veterinary vaccinology" (P. Pastoret, et al. ed., 1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN 0444819681).

La vacuna de acuerdo con la invención se puede combinar ventajosamente con otro antígeno o con un componente inmunoactivo. Esto también se puede añadir en forma de su ácido nucleico codificante.

Por lo tanto, en una realización más preferida, la vacuna de acuerdo con la invención se caracteriza por que comprende un componente inmunoactivo adicional o un ácido nucleico que codifica dicho componente inmunoactivo adicional.

El componente o los componentes inmunoactivos adicionales pueden ser un antígeno, una sustancia que mejora el sistema inmune y/o una vacuna; cualquiera de estos puede comprender un adyuvante.

El componente o los componentes inmunoactivos adicionales, cuando están en forma de un antígeno, pueden consistir en cualquier componente antigénico de importancia humana o veterinaria. Por ejemplo, puede comprender una molécula biológica o sintética tal como una proteína, un hidrato de carbono, un lipopolisacárido, un ácido nucleico que codifica un antígeno proteináceo o una molécula de ácido nucleico recombinante que contiene tal ácido nucleico unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción. También una célula hospedadora que comprende tal ácido nucleico, una molécula de ácido nucleico recombinante o un LRC que contiene tal ácido nucleico puede ser un modo de suministrar el ácido nucleico o el componente inmunoactivo adicional. Alternativamente puede comprender un microorganismo fraccionado o inactivado tal como un parásito, bacteria o virus.

El componente o los componentes inmunoactivos adicionales pueden estar en forma de una sustancia que mejora el sistema inmune, por ejemplo, una quimiocina o un ácido nucleico inmunoestimulante, por ejemplo, un motivo CpG. Alternativamente, la vacuna de acuerdo con la invención por sí misma se puede añadir a una vacuna.

Por ejemplo, una vacuna de acuerdo con la invención se puede combinar con una preparación de una proteína de vacuna de subunidades de Babesia, que no es una proteína de Piroplásmido de acuerdo con la invención o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, para formar una vacuna de subunidades de combinación contra infección Piroplasmídica o signos clínicos asociados de enfermedad.

Alternativamente, la vacuna de acuerdo con la invención se puede combinar ventajosamente con un componente farmacéutico tal como un antibiótico, una hormona o un fármaco antiinflamatorio.

En una realización aún más preferida, la vacuna de acuerdo con la invención se caracteriza por que dicho componente inmunoactivo adicional o ácido nucleico que codifica dicho componente inmunoactivo adicional se obtiene de un organismo infeccioso para:

\quad: \underline{caninos}: complejo de Ehrlichia canis, Babesia gibsoni, B. vogeli, B. rossi, Leishmania donovani, parvovirus canino, virus del moquillo canino, Leptospira interrogans serovar canicola, icterohaemorrhagiae, pomona, grippotyphosa, bratislava, virus de la hepatitis canina, virus de parainfluenza canina, virus de la rabia, Hepatozoon canis y Borrelia burgdorferi; para \underline{bovinos}: virus del herpes bovino, virus de la diarrea vírica bovina, virus de parainfluenza tipo 3, paramixovirus bovino, virus de la glosopeda, Pasteurella haemolytica, Virus Sincitial Respiratorio Bovino, Theileria sp., Babesia sp., Trypanosoma sp. Anaplasma sp., Neospora caninum, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Mycoplasma, E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Cryptosporidium, Salmonella y Streptococcus dysgalactiae; y para \underline{equinos}: Streptococcus equi, Streptococcus zooepidemicus, Rhodococcus equi, Corynebacterium pseudotuberculosis, Pseudomonas mallei, Actinobacillus equili y Pasteurella multocida, agente de fiebre de Potomac, Clostridium tetanii, Mycobacterium pseudomallei, virus de la estomatitis vesicular, virus de la enfermedad de Borna, virus de la gripe equina, virus de la peste equina africana, virus de la arteritis equina, virus herpes equino 1-4, virus de la anemia infecciosa, virus de la encefalomielitis equina y virus de la encefalitis japonesa B.

La proteína de Piroplásmido de acuerdo con la invención, o el fragmento inmunogénico de dicha proteína, el ácido nucleico, ADNc, molécula recombinante, vehículo recombinante vivo y/o las células hospedadoras de acuerdo con la invención por primera vez permiten la generación eficaz de anticuerpos específicos contra una proteína de Piroplásmido, o un fragmento inmunogénico de dicha proteína. Esto hace que la vacuna de acuerdo con la invención sea adecuada como una vacuna marcadora, ya que permite la diferenciación entre dianas mamífero infectadas por parásito y vacunadas, mediante métodos conocidos en la técnica.

Alternativamente, estos anticuerpos específicos se pueden usar como una vacuna por sí mismos, para la denominada "vacunación pasiva".

Por lo tanto, otro aspecto de la invención se refiere a una vacuna, caracterizada por que comprende un anticuerpo contra una proteína de acuerdo con la invención o un anticuerpo contra un fragmento antigénico que contiene epítopo de dicha proteína o una combinación de los mismos y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

El anticuerpo puede ser de origen natural o sintético. El anticuerpo puede estar en forma de un antisuero o un anticuerpo purificado. Tales anticuerpos purificados se pueden obtener ventajosamente de un sistema de expresión.

Los métodos para la producción a gran escala de anticuerpos de acuerdo con la invención también se conocen en la técnica. Tales métodos dependen de la clonación de (fragmentos de) la información genética que codifica la proteína de acuerdo con la invención en un fago filamentoso para la presentación en fagos. Tales técnicas se describen, entre otros, en la "Antibody Engineering Page" bajo "filamentous phage display" en http://aximtl.imt.uni-marburg.de/-rek/aepphage.html. y en artículos de revisión de Cortese, R. et al., (1994) en Trends in Biotechn., Vol. 12, págs. 262-267; de Clarckson, T. & Wells, J. A. (1994), en Trends in Biotechn., vol. 12, págs. 173-183; Marks, J. D. et al., (1992) J. Biol. Chem., vol. 267, págs. 16007-16010; Winter, G. et al., (1994) Annu. Rev. Immunol., Vol. 12, págs. 433-455 y de Little, M. et al., (1994) Biotechn. Adv., Vol. 12, págs. 539-555.

Los fagos se usan posteriormente para explorar bibliotecas de expresión de camélido que expresan anticuerpos de cadena pesada de camélido. (Muyldermans, S. y Lauwereys, M., Journ. Molec. Recogn., vol. 12, 131-140 (1999) y Ghahroudi, M. A., et al., FEBS Letters, vol. 414, págs. 512-526 (1997)). Las células de la biblioteca que expresan los anticuerpos deseados se pueden replicar y se pueden usar posteriormente para expresión a gran escala de anticuerpos.

Una combinación en una vacuna de un antígeno "cargado" con anticuerpos contra ese antígeno se conoce en la técnica como una vacuna "compleja". Tales vacunas de acuerdo con la invención se pueden usar ventajosamente.

Por razones de, por ejemplo, estabilidad o economía, la proteína de Piroplásmido de acuerdo con la invención o fragmentos inmunogénicos de dicha proteína, o ácidos nucleicos, ADNc, moléculas recombinantes, vehículos recombinantes vivos, células hospedadoras o vacunas de acuerdo con la invención se pueden secar por congelación. Esto, en general, permitirá el almacenamiento prolongado a temperaturas superiores a 0ºC, por ejemplo, a 4ºC.

Los procedimientos para el secado por congelación se conocen por los especialistas en la técnica; el equipamiento para el secado por congelación a diferentes escalas está disponible en el mercado.

Por lo tanto, en una realización más preferida, las vacunas de acuerdo con la invención se caracterizan por que dichas vacunas están en una forma secada por congelación.

Para reconstituir una vacuna secada por congelación, se puede suspender en un diluyente fisiológicamente aceptable. Tal diluyente puede ser, por ejemplo, tan simple como agua estéril, o una solución salina fisiológica. En una forma más compleja se puede suspender en una emulsión como se resume en el documento PCT/EP99/10178.

Otro aspecto más de la invención se refiere a un método para la preparación de una vacuna de acuerdo con la invención, comprendiendo dicho método la mezcla de una proteína de acuerdo con la invención o un fragmento antigénico que contiene epítope de dicha proteína, un ácido nucleico, un fragmento de ADNc, una molécula de ADN recombinante, un microorganismo portador recombinante vivo o una célula hospedadora de acuerdo con la invención, o una combinación de los mismos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto más de la invención se refiere a un método para la preparación de una vacuna de acuerdo con la invención, comprendiendo dicho método la mezcla de un anticuerpo contra una proteína de acuerdo con la invención o un anticuerpo contra un fragmento antigénico que contiene epítopo de dicha proteína, o una combinación de los mismos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Como se ha resumido anteriormente, una vacuna que se puede obtener por los métodos de acuerdo con la invención se puede usar igualmente como tratamiento profiláctico y terapéutico e interferirá con el establecimiento y/o con la progresión de una infección o sus signos clínicos de enfermedad.

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Por lo tanto, un aspecto adicional de la invención se refiere al uso de una proteína de acuerdo con la invención o un fragmento antigénico que contiene epítopo de dicha proteína para la fabricación de una vacuna para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una infección o sus signos clínicos provocados por un organismo de los Piroplásmidos.

De nuevo, un aspecto adicional de la invención se refiere a un ensayo de diagnóstico para la detección de un ácido nucleico asociado con un organismo Piroplásmido, caracterizado por que el ensayo comprende un ácido nucleico, siendo dicho ácido nucleico al menos el 70%, preferiblemente el 75%, más preferiblemente el 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o el 100% en ese orden de preferencia similar a la secuencia de ácido nucleico ilustrada en la SEC ID Nº: 1 o un ácido nucleico que es complementario a dicho ácido nucleico, donde cualquiera de los ácidos nucleicos tienen una longitud de al menos 15 nucleótidos, preferiblemente 17, más preferiblemente 18, 19, 20, 24, 28, 32, 35 ó 40 nucleótidos, en ese orden de preferencia.

Otro aspecto más de la invención se refiere a un ensayo de diagnóstico para la detección de anticuerpos contra un organismo Piroplásmido, caracterizado por que dicho ensayo comprende una proteína de acuerdo con la invención o un fragmento antigénico que contiene epítopo de dicha proteína o una combinación de los mismos.

Por ejemplo, BIIA1 o un fragmento inmunogénico del mismo se acopla a un vehículo de fase sólida, esto se incuba con una muestra a ensayar, se lava y se detecta la presencia de anticuerpos unidos. El método de diagnóstico preferido es por ELISA.

Otro aspecto más de la invención se refiere a un ensayo de diagnóstico para la detección de material antigénico de un organismo Piroplásmido, caracterizado por que dicho ensayo comprende un anticuerpo contra una proteína de acuerdo con la invención o un anticuerpo contra un fragmento antigénico que contiene epítopo de dicha proteína o una combinación de los mismos.

Por ejemplo, los anticuerpos contra BlIA1 o un fragmento inmunogénico del mismo se acoplan a un vehículo de fase sólida, esto se incuba con una muestra a ensayar, se lava y se detecta la presencia de proteína unida. El método de diagnóstico preferido es por ELISA.

Ejemplos Ejemplo I 1.1. Técnicas usadas 1.1.1. Cultivo de B. bovis in vitro

Se cultivó un aislado de Israel de B. bovis (línea clonal C61411) in vitro como se ha descrito previamente (Levy & Ristic 1980, Science, vol. 207, págs. 1218-1220). En resumen, se mantuvieron cultivos de B. bovis en placas de 24 pocillos (volumen total de 1,2 ml) o en frascos de 25 cm^{2} (volumen total de 15 ml) que contenía medio M199 (Cambrex Bioscience, Bélgica) con suero bovino al 40% (de una vaca donante adulta), 50 \mugml^{-1} de gentamicina (Gibco BRL), bicarbonato sódico 25 mM y eritrocitos bovinos con un hematocrito (PCV) del 5%. Los cultivos se incubaron a 37ºC, CO_{2} al 5% en aire y la parasitemia se mantuvo entre el 1% y el 12% por dilución diaria.

Se cultivó un aislado de México de B. bovis (línea clonal C9.1) de acuerdo con el mismo protocolo que el usado para la línea clonal C61411 (aislado de Israel), excepto porque los cultivos se mantuvieron en N_{2} al 90%, CO_{2} al 5%, O_{2} al 5% en lugar de CO_{2} al 5% en aire.

1.1.2. Construcción de biblioteca genómica y de ADNc de B. bovis

Se construyó una biblioteca de ADNc a partir de 5 \mug de ARNm de B. bovis usando el Kit de Síntesis \lambdaZAP-cDNA® (Stratagene), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se recogieron fragmentos de ADNc de 0,5 a 4 kb por filtración en gel en una columna de sepharose CL4B y se ligaron en el sitio EcoRI/XhoI del vector \lambda uniZAP-XR Express. Se usó Giga Pack III Gold para el empaquetamiento en partículas de fago seguido de transformación de células de Escherichia coli XL-1 Blue MRF'. Se obtuvieron 1,2 x 10^{6} placas a partir de las cuales se preparó una biblioteca amplificada.

Se realizaron procesos de secuencia de un solo pase en 15000 clones de ADNc que se seleccionaron automáticamente de forma aleatoria de la biblioteca de ADNc sembrada para establecer un conjunto de datos de EST. A partir de este conjunto de datos de EST se construyó una base de datos que consistía en 12892 secuencias de alta calidad (476 pb de longitud promedio).

Para construir la biblioteca genómica, 600 \mug de ADN de B. bovis se digirieron parcialmente con EcoRI (150 unidades o 250 unidades) durante 1 h a 37ºC. El ADN digerido se fraccionó por tamaño en una columna de Sepharose CL-4B. Los fragmentos de 0,5 kb a 8 kb se ligaron en el sitio EcoRI de \lambda-ZAPII-Express, se empaquetaron usando el extracto de empaquetamiento Gigapack III Gold y se introdujeron por transformación en células competentes de E. coli XL1-Blue MRF'. Se obtuvieron 2,5 x 10^{6} placas a partir de las cuales se preparó una biblioteca amplificada.

Las bibliotecas de ADNc se exploraron con una sonda producida mediante PCR con cebadores específicos para BIIA1 o para BIIA2.

1.1.3. Exploración de biblioteca genómica y de ADNc de B. bovis para los genes para BIIA1 y BIIA2

Se exploraron las bibliotecas genómica y de ADNc de B. bovis para aislar clones para los genes de BIIA1 y BIIA2 con una sonda específica preparada por PCR. Los cebadores específicos usados fueron:

para el gen de BIIA1:

cebador: 1: 5'-CCACGGCTCTGGAATCTATGTC-3' (SEC ID Nº: 11)

cebador: 2: 5'-CAAAAGGATACCTATATTTGGTAC-3' (SEC ID Nº: 12),

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y para el gen BIIA2:

cebador: 3: 5'-TGTGGTAGATGAATCTGCTAGTATATC-3 '(SEC ID Nº: 13)

cebador: 4: 5'-CTATGCCACGGCATTCAGCAACATTTA-3 '(SEC ID Nº: 14).

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Ambos pares de cebadores se usaron para amplificar un fragmento de un clon de la base de datos de EST de B. bovis, por PCR en un volumen de 50 \mul que contenía dNTP 0,2 mM, 20 pmol/\mul de cada cebador, 100 ng de ADN genómico total de B. bovis y 0,5 U de ADN polimerasa de Taq en tampón convencional (Promega). La amplificación se realizó durante 30 ciclos con las condiciones para la sonda de BIIA1 en: 92ºC durante 30 s, 58ºC durante 30 s y 72ºC durante 30 s y para la sonda de BIIA2 en: 95ºC durante 1 min, 58ºC durante 1 min y 72ºC durante 10 min. Estos ciclos estaban precedidos por una desnaturalización inicial de 3 min a 95ºC y una elongación final a 72ºC durante 10 min.

Ambas sondas se purificaron de gel de agarosa y se marcaron con 50 \muCi de ^{32}P-dATP (3000 Ci/mmol), usando un kit de marcado con cebador aleatorio (Roche). En total se exploraron 4 x 10^{6} placas de biblioteca de ADNc y 4 x 10^{5} de ADN genómico por procedimientos convencionales (Sambrook y Russell, anteriormente) para clonar el ADNc de BIIA1; mientras que se exploraron 5 x 10^{5} placas de biblioteca de ADNc y un número igual de ADN genómico para clonar el ADNc de BIIA2. Después de 2 ciclos de purificación en placa, todos los clones se separaron in vivo para el aislamiento de los insertos de fagémido como se describe en las instrucciones del fabricante (Stratagene) y se secuenciaron en ambas cadenas usando secuenciado de ciclo automatizado con el método de terminador con colorante (Kit de terminador con colorante ABI PRISM®, Pharmacia).

Para obtener los ADNc de longitud completa de BIIA1 y BIIA2, se identificaron los extremos 5' no codificantes con 5'-RACE (kit GeneRacer^{TM} Invitrogen; L1502-01, de acuerdo con las instrucciones del fabricante). Los clones de longitud completa obtenidos se insertaron en plásmidos de clonación pCR2.1 y se secuenciaron en ambas cadenas, como se ha descrito anteriormente. Las secuencias resultantes se presentan en la SEC ID Nº: 1 (BIIA1) y la SEC ID Nº: 5 (BIIA2).

1.1.4. Expresión de BIIA1 recombinante en E. coli

Los clones de BIIA1 y BIIA2 se subclonaron por PCR a partir de los plásmidos de clonación pCR2.1.

Los cebadores usados para subclonar BIIA1 fueron:

cebador: 5: 5'-CCCGGATCCATGCAGTTACATAACAAA-3' (SEC ID Nº: 15)

cebador: 6: 5'-GGGAAGCTTCTGAGCAAAGGAAATAGG-3' (SEC ID Nº: 16).

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Estos cebadores para BIIA1 introdujeron un sitio de enzima de restricción BamHI delante de la base 1 (numerada desde la primera base del codón de inicio) y un sitio HindIII detrás de la base 1504.

Los cebadores usados para subclonar BIIA2 fueron:

cebador: 7: 5'-CCCGAATTCGTGGTAGATGAATCTGCT-3' (SEC ID Nº: 17)

cebador: 8: 5'-CCCGTCGACTGCCTCGCCCCAAATGTTGT-3' (SEC ID Nº: 18).

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Estos cebadores para BIIA2 introdujeron un sitio Eco RI y un sitio Sal I.

Después de la PCR (30 ciclos de 1 min 94ºC, 1 min 55ºC, 1 min 72ºC), los fragmentos se purificaron en gel, se hibridaron con el vector PET-32a y se usaron para la introducción por transformación en la cepa de E. coli NovaBlue®. Los plásmidos que contenían el inserto apropiado se usaron para la introducción por transformación en cepas hospedadoras de expresión, BL21 (DE3). Se obtuvieron proteínas de fusión con tiorredoxina con un rendimiento máximo después de la inducción con 1 mM de isopropil-\beta-D tiogalactosidasa (IPTG) durante 4 h a 37ºC como se muestra por análisis de muestras de células totales 0 y 4 h después de la inducción. Los sedimentos bacterianos se llevaron a ebullición a 95ºC en tampón de muestra de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) que contenía \beta-mercaptoetanol al 2% (v/v), se procesaron en minigeles de SDS-PAGE al 10% y se tiñeron con Azul Brillante de Coomassie para confirmar la expresión (Figuras 1 y 2).

1.1.5. Selección de péptidos y generación de antisuero monoespecífico

Después de que se hubieran secuenciado completamente los genes de BIIA1 y BIIA2, los péptidos se seleccionaron de secuencias traducidas por ordenador para la inducción de anticuerpos policlonales específicos mediante inmunización de animales de ensayo.

Se usó el programa de análisis de secuencia Protean de DNA Star® para seleccionar regiones peptídicas que tienen una buena probabilidad de superficie y que contenían regiones anfipáticas alfa cargadas.

Los péptidos seleccionados de BIIA1 (SEC ID Nº: 2) fueron:

péptido: 1: números de aa 46-60: cisteína-AFHKEPNNRRLTKRS,

péptido: 2: números de aa 395-409: cisteína-RGVGMNWATYDKDSG,

péptido: 3: números de aa 453-467: cisteína-YVEPRAKNTNKYLDV.

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Los péptidos seleccionados de BIIA2 (SEC ID Nº: 6) fueron:

péptido: 4: números de aa 255-269 cisteína-PGKRTRALLDLRMIE,

péptido: 5: números de aa 424-439 cisteína-RVGNTDEEHNHRKDMD,

péptido: 6: números de aa 547-561 cisteína-VYDDHPEESENTGIN.

Después de la síntesis de los péptidos, se acoplaron a una proteína transportadora: hemocianina de lapa californiana (KLH) activada por maleimida (Pierce, 77605) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El conjugado de péptido-vehículo se usó para generar antisueros policlonales de conejo.

Para ese propósito, tres grupos de conejos NZW (cada grupo contenía 2 conejos) se inmunizaron cinco veces por vía subcutánea con un intervalo de 3 semanas entre inmunizaciones consecutivas. Antes de la inmunización se recogió suero sanguíneo de cada conejo, que se usó como control negativo. A cada conejo se inyectaron 250 \mug de péptido acoplado a KLH que se captó en un volumen igual de adyuvante Stimune® (ID-DLO, Lelystad, Países Bajos). El volumen total que se inyectó en cada conejo fue 1000 \mul. Los sueros se ensayaron periódicamente para reactividad por ELISA. Se realizaron plasmaféresis una semana después de la última inmunización y se recogieron los sueros.

1.1.6. ELISA

La respuesta de anticuerpos se evaluó por ELISA. Se recubrieron placas de microtitulación de noventa y seis pocillos con 150 ng de péptido 1 o péptido 2 por pocillo, se incubaron 30 min a 37ºC, se bloquearon durante 1 h con PBS/BSA. Las diluciones consecutivas (de 1:50 a 1:50.000) de sueros individuales de conejo se incubaron durante 1 h a 37ºC. Las placas se lavaron y se incubó anticuerpo secundario de cerdo anti conejo conjugado con HRP diluido 1:2000 durante 1 h. Las placas se lavaron y se revelaron durante 45 min con sustrato de ABTS [ácido 2,2'-azinobis(3-etilbenztiazolinosulfónico)]-peroxidasa (Roche biochemicals). Se registró la DO_{405} y se calcularon los títulos comparativos de ELISA.

1.1.7. Ensayo de inmunofluorescencia

El reconocimiento de merozoitos de B. bovis por anti-sueros contra péptidos de BIIA1 y BIIA2 se ensayó por el ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFA). Se fijaron frotis sanguíneos delgados con metanol enfriado. La incubación primaria con anti-BIIA1 de conejo policlonal (1:40) o anti-BIIA1 de ratón policlonal (de 1:5 a 1:160) durante 30 min estaba seguida por tres etapas de lavado de 5 min. Los portaobjetos se incubaron con anticuerpos de cabra anti-inmunoglobulina G (IgG) de conejo marcados con isotiocianato de fluoresceína 1:80 (Nordic) durante 30 min. Los portaobjetos se volvieron a lavar y se aplicó solución Vectashield® (Vector Laboratories), los objetos se cubrieron con un cubreobjetos y se visualizaron en un microscopio de fluorescencia de UV con filtros de FITC (450-480/515-565 nm). Los títulos de IFA se determinaron como la ultima dilución sérica con un reconocimiento positivo del parásito en comparación con el suero pre-inmune negativo diluido 1:5.

1.1.8. Preparación de extractos de proteína de merozoito total y proteínas solubilizadas después de la invasión

Se separaron muestras de 800 \mul de merozoitos, preparadas como se ha descrito anteriormente para la invasión in vitro, parcialmente de restos de eritrocitos por filtración por prefiltros de polipropileno 1,2 \muM (Millipore, AN1202500). Los merozoitos filtrados se combinaron y se lavaron dos veces en 20 volúmenes de PBS que contenía bicarbonato sódico 25 mM (pH 8,0) seguido de centrifugación a 2000 g durante 20 min a 4ºC. Después del segundo lavado, el sedimento se resuspendió en un volumen igual de PBS (pH 8,0) y se dividió en alícuotas de 200 \mul que se centrifugaron (10.000 xg, 5 min a 4ºC) y se almacenaron como 100 \mul de sedimentos celulares (2 x 10^{9} de merozoitos) a -20ºC después de la retirada del sobrenadante. Los sedimentos de merozoitos congelados se descongelaron justo antes del uso y se lisaron, redujeron y alquilaron usando un kit de extracción de membrana Proteoprep® (Sigma) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y finalmente se obtuvieron en 1,7 ml de tampón compatible con aplicación directa en geles de SDS-poliacrilamida o tiras de iso-electroenfoque (IEF). El material insoluble se eliminó por centrifugación a 16.000 xg durante 3 min a 4ºC. La concentración de la proteína se determinó por el método de Bradford (Anal. Biochem. 1976, vol. 72, págs. 248-254). Ya que los extractos contenían cantidades considerables de proteínas eritrocitarias, se prepararon extractos de control del mismo modo pero comenzando con un cultivo de eritrocitos no infectados.

Se obtuvieron proteínas solubilizadas después de la invasión retirando cuidadosamente el tampón de cubrición después de 1 h de invasión in vitro como se ha descrito anteriormente. Las muestras se centrifugaron (2000 xg, 10 min, 4ºC), después de lo cual el sedimento (que era invisible) se desechó y el sobrenadante se centrifugó de nuevo a alta velocidad para la retirada de fragmentos de membrana (20 min, 12.000 x, 4ºC). El sobrenadante final se dializó (tubos de diálisis plegados Snakeskin®; Pierce, 68035) durante una noche frente a KHPO_{4} 10 mM, pH 7,5. La hemoglobina residual se retiró por lotes incubando 50 ml del sobrenadante dializado con 6,5 ml de DEAE sepharose fast flow (Amersham Biosciences) equilibrado en tampón de diálisis durante 90 min a 4ºC en una plataforma rotatoria. La suspensión se centrifugó durante 5 min a 3000 xg min a 4ºC, después de lo cual la DEAE sepharose se lavó 4 veces por adición de 50 ml de tampón de diálisis seguido de centrifugación durante 5 min a 3000 xg a 4ºC. Las proteínas unidas se eluyeron por adición de 6 ml de tampón de elución (KCI 350 mM, KHPO4 10 mM, pH 7,5) e incubación durante 5 min seguido de centrifugación durante 5 min a 3000 xg a 4ºC. El sobrenadante se concentró y se sometió a precipitación salina por filtros de 10 kDa (YM-10, Millipore).

1.1.9. Electroforesis en SDS-poliacrilamida y transferencia de Western

Las proteínas se separaron en presencia o ausencia de \beta-mercaptoetanol y se separaron en un SDS-PAGE al 10% y se transfirieron electroforéticamente a una membrana lmmobilon^{TM}-P (Millipore). La transferencia se bloqueó con leche desnatada al 5% diluida en Tween® 20 al 0,5% que contenía solución salina tamponada con fosfato (PBST) durante 1 h a 37ºC. Una dilución apropiada (1:500) de anticuerpo primario en leche desnatada al 2% en PBST se incubó durante 1 h durante una noche. La transferencia se lavó con PBST y después se incubó con una dilución 1:10.000 de anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano rusticano (HRP) (DAKO) durante 1 h a 37ºC. Después de lavarse con PBST, la transferencia se desarrolló con kit de sustrato TMB MB (Lucron Bioproducts BV; KPL 50-77-00) o con quimioluminiscencia aumentada (ECL) + (Amersham; RPN2132).

1.1.10. Iso-electroenfoque

El extracto de merozoito total, sobrenadante de invasión y muestras de proteína BIIA1 se resuspendieron en solución de rehidratación (urea 7 M, tiourea 2 M, CHAPS al 4%, mezcla de anfólito de vehículo al 2% pH 4-7 NL (tampón IPG y DTT 20 mM). Las muestras de proteína BIIA2 se separaron en la primera dimensión usando mezcla de anfólito de vehículo pH 3-10 NL. La instrumentación de IEF, geles de IPG y reactivos usados eran de Amersham Biosciences, a menos que se indique de otro modo. Se cargaron 35 \mug de proteína de merozoito total o 35 \alphag de sobrenadante de invasión con inhibidor de proteasa (Complete, Roche) en tiras de 7 cm (pH 4-7NL). Para tiras de 13 cm se cargaron 150 \mug de proteínas de merozoito total o 150 \mug de sobrenadante de invasión. Las tiras se rehidrataron (10-14 h) y se enfocaron durante una noche (14-17 h) en un proceso automatizado (1 min 300 V, 90 min durante los cuales la tensión aumentó hasta 3500 V, seguido de enfoque continuado a 3500 V, hasta un total de 35-40 KVh, en IPGPhor^{TM}).

Después del iso-electroenfoque, las proteínas se redujeron y se unieron a SDS equilibrando cada tira durante 15 minutos en 10 ml de tampón de equilibrado SDS (Tris 50 mM, urea 6 M, SDS al 2%, glicerol al 30%, pH 8,8) que contenía DTT 30 mM (añadido reciente antes del uso). Se realizó una segunda etapa de equilibrado en tampón de equilibrado SDS que contenía yodoacetamida al 2,5% (también añadido recientemente) en lugar de ditiotreitol para evitar la re-oxidación de proteína y para minimizar las reacciones de restos de cisteína.

El gel de electroforesis gel SDS bidimensional se realizó en un sistema Hoefer SE600. Se usó la tinción con plata para visualizar proteínas después de electroforesis 2-D. Se adquirieron imágenes de los geles usando el software LabScan® v3.0 en un escáner Umax flatbed y se analizaron usando el software ImageMaster® 2D v3.01 (Amersham Biotech). Para transferencia inmune, las proteínas en las tiras de 7 cm se separaron en un gel de SDS-PAGE al 10% o las tiras de 13 cm se separaron en un gel de proteína 2-D y se transfirieron a una membrana lmmobilon^{TM}-P (Millipore; IPVH00010). El procedimiento seguido para las transferencias bidimensionales era igual que el de para las transferencias 1-D.

1.1.11. Ensayo de invasión in vitro de B. bovis

La invasión se realizó como se ha descrito previamente (Fransen et al. 2003, Microbes Infect, vol. 5, págs. 365-372), con ligeras modificaciones. Los glóbulos rojos infectados por B. bovis con una parasitemia del 6 al 8% se centrifugaron a 2000 xg, 10 min, 15ºC y se resuspendieron en un volumen igual de tampón VyMs (Vega y Martínez, véase Fransen, anteriormente). Se sometieron muestras de 800 \mul a cinco pulsos intermitentes (10 segundos, a 0ºC entre pulso) de alta tensión (2,5 kV, 200 \Omega, 25 \muF) en cubetas de 4 mm BioRad (165-2088) usando un BioRad Gene Pulser® con controlador de pulso.

Se añadieron 8 ml de PBS que contenía bicarbonato sódico 25 mM (pH 8,0, 20ºC) a cada muestra de 800 \mul seguido de centrifugación (1800 xg) durante 10 min a 15ºC. Se realizó un segundo lavado idéntico, excepto porque la centrifugación se realizó a 1300 xg después lo cual el sedimento de merozoito se resuspendió en 800 \mul de PBS que contenía bicarbonato sódico 25 mM (pH 8,0, 20ºC). La invasión se inició por adición de 1 volumen de merozoitos resuspendidos a 9 volúmenes de eritrocitos bovinos suspendidos (PCV del 5,5% en PBS pH 8,0 que contenía bicarbonato sódico 25 mM, pre-incubados durante 30 min a 37ºC en CO_{2} en aire) y se realizó en placas de 24 pocillos (volumen final 1,2 ml), en matraces de 25 cm^{2} (15 ml) o en matraces de 80 cm^{2} (50 ml) a 37ºC, CO_{2} al 5% en aire. Se prepararon portaobjetos teñidos con Giemsa después de 1 h y se recontaron los eritrocitos parasitados de un total de 5000 eritrocitos.

1.1.12. Inhibición in vitro de invasión por antisueros de conejo policlonales

Se incubaron 200 \mul de merozoitos de B. bovis, liberados por pulso de alta tensión y resuspendidos en PBS que contenía bicarbonato sódico 25 mM (pH 8,0) como se ha descrito anteriormente, con 40 \mul de antisueros de conejo durante 1 h a 20ºC. Después de 1 h, se añadieron 960 \mul de eritrocitos bovinos suspendidos (PCV del 6,25% en PBS pH 8,0 que contenía bicarbonato sódico 25 mM, pre-incubado durante 30 min a 37ºC en CO_{2} en aire) seguido de 1 h de incubación, después de lo cual se prepararon portaobjetos teñidos con Giemsa y se recontaron para determinar el nivel de invasión. Los antisueros de conejo usados se generaron contra péptidos sintéticos obtenidos de la secuencia de aminoácidos de BIIA1 y BIA2 y un suero de control generado contra un péptido de control no relacionado (YAGRLFSKRTAATAYKLQ). Los péptidos se habían unido a hemocianina de lapa californiana (KLH) antes de la inmunización. También se incluyeron sueros pre-inmunes en el ensayo.

1.2. Resultados del Ejemplo 1 1.2.1. Identificación y clonación de un ADNc de longitud completa que codifica BIIA1 y BIIA2

El sondaje de la biblioteca de ADNc de B. bovis con sondas de PCR (350 pb para BIIA1 y 450 pb para BIIA2) dio como resultado la clonación y secuenciación de un ADNc de 2181 pb para BIIA1 y de 2385 pb para BIIA2. Ambos contenían una fase de lectura abierta y una región no codificante 3' que terminaba en una cola poli-A. Para determinar el extremo protegido 5' de los ARNm de longitud completa, el ARNm total se desfosforiló, después de lo cual las protecciones 5', que se dejaron intactas, se retiraron por pirofosfatasa ácida de tabaco seguido de ligación de un oligonucleótido de ARN específico. Posteriormente, la PCR anidada en la primera cadena de ADNc permitió la clonación y secuenciación de un fragmento que representaba el extremo 5' del ARNm de B. bovis para BIIA1 y BIIA2.

La traducción por ordenador de la ORF de 1815 pb de BIIA1 predijo una proteína de 67,2 kDa; la traducción de la ORF de 1965 pb para BIIA2 predijo una proteína de 65,6 kDa.

1.2.2. Reconocimiento de BIIA1 y BIIA2 recombinante por antisueros contra péptidos derivados

Para permitir estudios adicionales sobre las proteínas BIIA, los conejos se inmunizaron con péptidos sintéticos 1-6 unidos a KLH (anteriormente). Todos los antisueros reconocieron específicamente un producto de fusión recombinante de tiorredoxina y la parte de las proteínas BIIA que se expresó en células de E. coli BL21 (Figuras 1 y 2). La electroforesis en gel de poliacrilamida de los lisados celulares totales obtenidos antes (carril 1) y después (carril 2) de la inducción con IPTG identificó el producto de fusión recombinante para BIIA1 y para BIIA2. Tanto BIIA1 como BIIA2 Rec se reconocen por los tres sueros inmunes (carriles 5, 8, 11) y no por sueros pre-inmunes (carriles 6, 9, 12) en inmunotransferencias. El reconocimiento inmune era específico para la parte de BIIA del producto de fusión como una proteína de control, un producto de fusión recombinante de rab5 de B. bovis (carril 3, Asp-5 a Lys-208, Nº de acceso de GenBank 324137.1) expresado en PET32a no se reconoció (carriles 7, 10, 13) por estos sueros. Además, el reconocimiento inmune era específico de péptido y no debido a anticuerpos inducidos por la proteína transportadora de KLH usada para la inmunización ya que el antisuero generado contra un péptido sintético unido a KLH no relacionado con BIIA1 o BIIA2 no reconoció el producto de fusión recombinante BIIA1 (carril 13).

1.2.3. Microscopía de Inmunofluorescencia

Para localizar las proteínas BIIA en el parásito, se realizaron estudios de inmunofluorescencia usando antisueros de conejo contra los seis péptidos ligados a KLH de BIIA1 y BIIA2 en cultivos in vitro de B. bovis unidos a portaobjetos de vidrio por fijación con metanol (Figuras 3 y 4). La incubación con suero preinmunes (paneles A, C, E) no dio como resultado ninguna tinción específica de parásitos por encima de una señal de fondo de fluorescencia débil procedente de eritrocitos infectados así como de no infectados. A diferencia de esto, los sueros inmunes dieron como resultado una tinción específica de parásitos en cualquier campo de microscopio examinado (paneles B, D, F). Los parásitos fluorescentes eran detectables con antisueros contra los tres péptidos a una dilución de 1:5. Aunque los parásitos de B. bovis intra-eritrocitarios y los merozoitos libres son pequeños (\pm 1 por 2 \mum), un aumento máximo permitió una visualización clara del patrón de tinción.

1.2.4. Inhibición de invasión in vitro por antisueros específicos de péptidos

Se usó un ensayo de invasión in vitro de B. bovis que permite el estudio de la invasión de eritrocitos por merozoitos libres en un tampón sin proteína con un intervalo de tiempo de 1 h para evaluar el efecto de antisueros dirigidos contra los 6 péptidos procedentes de diferentes dominios de BIIA1 y BIIA2. Los merozoitos libres se pre-incubaron durante 1 h a 20ºC con los antisueros anti-péptido y con el suero de control dirigido contra un péptido no relacionado, después de lo cual se inició la invasión por la adición de eritrocitos. Todos los antisueros contra los péptidos BIIA dieron lugar a inhibición significativa de invasión mientras que los sueros preinmunes y el antisuero de control no tuvieron un efecto significativo sobre la eficacia de la invasión (Figuras 5 y 6). Para BIIA1, el efecto más intenso del 65 \pm 10% de inhibición de la invasión se observó para el antisuero dirigido contra el péptido 1; para BIIA2, el efecto más intenso del 70 \pm 10% de inhibición de invasión se observó para el antisuero dirigido contra el péptido 4.

1.2.5. Mapeo de proteínas BIIA en geles 2-D

Para determinar si BIIA1 y BIIA2 se expusieron en el medio como proteínas solubles durante la invasión de eritrocitos, constituyendo por tanto parte del SPA que se ha mencionado anteriormente, se realizó inmunotransferencia de los sobrenadantes de invasión. BIIA1 y BIIA2 se localizaron en inmunotransferencias bidimensionales. 50 \mug de sobrenadante de invasión concentrado se separaron por iso-electroenfoque seguido de electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida. Las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF. Las partes cortadas de las membranas (de 45 a 90 kDa) se incubaron con antisueros anti-péptido BIIA1 contra péptidos 1 ó 3 (Figura 7, paneles A y C, respectivamente), así como con antisueros anti-péptido BIIA2 contra péptidos 4 y 6 (Figura 8, paneles A y C, respectivamente). Para ambas proteínas, los anticuerpos contra los péptidos 1 y 4 se unieron a los mismos puntos específicos (flechas) además de una tinción a-específica de proteínas que también estaban presentes en las transferencias de control. Éstas se habían preparado a partir de sobrenadantes de glóbulos rojos (GR) no infectados preparados en condiciones idénticas pero en ausencia de merozoitos (Figura 7 y 8, paneles B y D). Los puntos localizados por inmunotransferencia hicieron coincidir posteriormente con un gel de proteína 2-D teñido con plata de una muestra similar que se obtuvo de un experimento paralelo en el que se usaron parásitos que se marcaron metabólicamente con ^{35}S-Met antes de la invasión. La Figura 9 presenta el patrón obtenido después de la exposición a película que muestra exclusivamente proteínas de B. bovis ya que las proteínas eritrocitarias no tienen marcador incorporado. Usando software de formación de imágenes, los puntos detectados por inmunotransferencia con antisuero anti-péptido BIIA1 se pudieron hacer coincidir con una fila de puntos de \pm 70 kDa en la autorradiografía y en el gel teñido con plata (véase las flechas en la Figura 9). BIIA2 se representa por puntos de menor intensidad indicando una menor abundancia de la proteína nativa.

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Ejemplo II Clonación, expresión y caracterización de BIIA3

El ADN amplificado total de la biblioteca de ADNc de B. bovis descrita en \NAK 1.1.2 se exploró para el gen de BIIA3 con los siguientes cebadores:

cebador: 9: 5'-CCCGAATTCCATGATGGTGAAGTTCCACAC-3' (SEC ID Nº: 19)

cebador: 10: 5'-CCCGTCGACGTTGGCCCCCTTTCGGTGAT-3' (SEC ID Nº: 20).

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Se realizó PCR como se describe en \NAK 1.1.3.

El fragmento de PCR se secuenció directamente; la secuencia resultante se presenta en la SEC ID Nº: 9 (BIIA3).

El fragmento de PCR del ADNc de BIIA3 se clonó en el vector de expresión pET-32a, como se describe en \NAK 1.1.4. Los cebadores 9 y 10 proporcionaron sitios de restricción Eco Rl y Sal I.

La secuencia traducida por ordenador de la proteína BIIA3 se presenta en la SEC ID Nº: 10. La ORF de 1635 nucleótidos en el ADNc de BIIA3 codifica una proteína de 61,0 kDa.

Los péptidos se predijeron a partir de esta proteína para la inducción de anticuerpos específicos en animales de ensayo, como se describe en \NAK 1.1.5.

\newpage

Los péptidos seleccionados de la proteína BIIA3 son:

péptido: 7: números de aa 122-136 cisteína - GELKKLSDNIPTKMP,

péptido: 8: números de aa 385-399 cisteína - SGSARVETSLESSVP.

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Los péptidos se acoplaron a KLH y se usaron para generar anticuerpos policlonales de conejo como se describe en \NAK 1.1.5. Se evaluaron sueros de conejo por ELISA, como se describe en \NAK 1.1.6.

Los antisueros anti-péptido policlonales de conejo eran para detectar recBIIA3 (proteína BIIA3 fusionada con tiorredoxina expresada en E. coli) en transferencia de Western 1-D. Los resultados se ilustran en la Figura 10, panel A: Rec BIIA3 se reconoció por antisueros contra los péptidos tanto 7 como 8, mientras que los sueros preinmunes no reconocieron Rec BIIA3.

Se generó un antisuero policlonal contra BIIA3 (y contra BIIA1 y BIIA2) en vacas, como se describe en el Ejemplo III.

Este antisuero bovino también se usó en una transferencia de Western 1-D en recBIIA3. Los resultados se ilustran en la Figura 10, panel B: el suero de dos animales reconoció recBIIA3, mientras que el suero bovino pre-inmune no.

El antisuero bovino contra recBIIA3 también se usó en un gel 2-D de proteínas de B. bovis nativas como se describe en \NAK 1.1.8 y 1.1.9. Los resultados se muestran en la Figura 11.

El suero bovino preinmune reaccionó con varios puntos de origen de glóbulos rojos (panel A). Para el panel B se usó IgG inmune recBIIA3 purificada en columna de sepharose. Esto reconoció específicamente (grupos de) puntos de \sim 95 kDa, \sim 75 kDa y \sim 30 kDa (véase flechas). Aparentemente, también se reconocen formas procesadas y multiméricas de BIIA3 nativo.

Se demostró que el antisuero policlonal de conejo contra el péptido 7 tenía propiedades de inhibición de la invasión, véase la Figura 12. Se usó IgG purificada en sepharose G a tres concentraciones diferentes, conduciendo a una inhibición máxima del 65%. La IgG no inmune y PBS no dieron como resultado inhibición (columna de control).

También se usó antisuero policlonal de conejo dirigido contra el péptido 7 para determinar la localización subcelular de BIIA3 en merozoitos de B. bovis en el eritrocito infectado por inmunofluorescencia indirecta. La detección fue por microscopía multifotón.

Se fijaron frotis sanguíneos delgados en acetona durante 10 min y se secaron al aire. La incubación primaria con el suero de conejo anti péptido 7 (1:20) durante 30 min estaba seguida por tres etapas de lavado de 5 min con PBS. Después, los portaobjetos se incubaron con IgG de cabra anticonejo conjugado con Alexa 488 (20 \mug/ml, Molecular Probes Inc., Eugene, EEUU) durante 30 min y se lavaron con PBS. Posteriormente, para el marcado dual, los portaobjetos se incubaron con DAPI (0,5 \muM, Molecular Probes Inc.) durante 20 min y se lavaron. Se aplicó solución FluorSave® y los portaobjetos se dejaron durante una noche a temperatura ambiente, cubiertos, en una posición horizontal.

Se visualizaron señales fluorescentes usando un sistema confocal y multi-fotón Bio-Rad Radiance 2100MP equipado con un microscopio invertido Nikon TE300. La excitación de las sondas DAPI se consiguió por excitación multi-fotón a 780 nm usando un láser de titanio-zafiro de modo bloqueado (Tsunami, Spectra-Physics) bombeado por un láser de estado sólido de 10 W (Millenia Xs, Spectra-Physics), mientras que la sonda Alexa 488 se excitó por un láser de argón a 488 nm.

Los resultados de IFT multifotón mostraron que estaba presente tinción específica de BIIA3 en la región apical del parásito Babesia.

Ejemplo III Generación y uso de antisueros bovinos contra BIIA1, BIIA2 y BIIA3 recombinante

Se generaron productos de expresión recombinantes de BIIA1, BIIA2 y BIIA3 en E. coli como se describe en la sección 1.1.4. Las bacterias se sedimentaron y solubilizaron en HCl de guanidinio 6 M. El lisado celular total se centrifugó a 9000 rpm durante 10 min y el lisado soluble se unió a una suspensión de agarosa Ni-NTA en GuHCL. Las perlas se lavaron tres veces con urea 8 M y el antígeno específico se eluyó posteriormente con imidazol 250 mM en urea 3 M.

Cada dosis vacunal contenía 100 \mug de antígeno recBIIA purificado y se formuló con el adyuvante saponina en una dosis final de 2 ml. Las vacunas se aplicaron por vía intramuscular en el cuello de vacas inmunológicamente competentes, cada grupo tenía un número de 5 animales. 5 semanas después de la sensibilización se administró una vacunación de refuerzo con la misma formulación. 3 semanas después del refuerzo se tomó sangre y se preparó suero para el análisis.

La purificación de IgG específica de bovino se realizó incubando 5 ml de antisuero con 2 ml de GammaBind Plus® Sepharose (Amersham-Biosciences) durante 1 h a 20ºC en tampón de unión (Fosfato sódico 0,01 M pH 7,0, NaCl 0,15 M, EDTA 0,01 M). La columna se lavó con tampón de unión y se eluyeron 5 ml de IgG NaAc 0,5 M pH 3,0 y se neutralizó inmediatamente con TrisHCl pH 9,0. La IgG se concentró y se dializó frente a PBS pH 7,4.

Se realizó la inhibición de la invasión in vitro por IgG total purificada de antisueros bovinos generados contra BIIA1, BIIA2 y BIIA3 recombinantes (clonados de la cepa de Israel) como se ha descrito para los antisueros de conejo policlonales (\NAK 1.1.11 y 1.2.4) usado concentraciones de IgG bovina finales de 0,15 \mug/\mul o 0,75 \mug/\mul durante la preincubación. Todos los ensayos se realizaron dos veces usando anticuerpos de dos animales diferentes para cada antígeno. Los resultados mostrados en la Figura 13 presentan los datos combinados de los antisueros individuales por antígeno. Se indica la desviación típica. Para demostrar que la inhibición también es eficaz en la invasión de una cepa heteróloga de Babesia, se ensayó una línea clonal (C9.1) obtenida de un aislado mexicano (MO7) de B. bovis.

La eficacia de la inhibición de la invasión eritrocitaria por ambas cepas de Babesia es comparable. La eficacia de BIIA1 y BIIA2 (entre el 3 y el 12%) parecía incluso mayor que la de BIIA3 (23 - 25%).

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Leyenda de las figuras Figura 1:

Carril: 1: pET-BIIA1 antes de la inducción con IPTG.

Carril: 2: pET-BIIA1 4 h después de la inducción con IPTG.

Carril: 3: pET-Rab5 4 h después de la inducción.

Carriles: 4, 5, 6 incubados con anti-péptido 1;

Carriles: 7, 8, 9 incubados con anti-péptido 2;

Carriles: 10, 11, 12 incubados con anti-péptido 3.

Carriles: 4, 7, 10 contienen pET-BIIA1 4 h después de la inducción, incubados con sueros pre-inmunes;

Carriles: 5, 8, 11, igual que en los carriles 4, 7 y 10, pero incubados con sueros inmunes.

Carriles: 6, 9, 12 contienen pET-Rab5 4 h después de la inducción incubados con sueros inmunes.

Carril: 13: pET-BIIA1 4h después de la inducción e incubados con antisuero contra péptido ligado a KLH no relacionado con B. bovis.

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Figura 2:

Carril: 1: pET-BIIA2 antes de la inducción con IPTG.

Carril: 2: pET-BIIA2 4 h después de la inducción con IPTG.

Carril: 3: pET-Rab5 4 h después de la inducción.

Carriles: 4, 5, 6 incubados con anti-péptido 4;

Carriles: 7, 8, 9 incubados con anti-péptido 5;

Carriles: 10, 11, 12 incubados con anti-péptido 6.

Carriles: 4, 7, 10 contienen pET-BIIA2 4 h después de la inducción, incubados con sueros pre-inmunes de conejos;

Carriles: 6, 9, 12 contienen pET-Rab5 4 h después de la inducción, incubados con sueros inmunes.

Carril: 13 contiene pET-BIIA2 4 h después de la inducción e incubados con antisuero contra péptido unido a KLH no relacionado con B. bovis.

Figura 3:

Los paneles A, C y E presentan cultivos in vitro fijados con metanol de B. bovis incubados con antisueros de conejos preinmunes contra péptidos 1, 2 y 3 de BIIA1 respectivamente. Los paneles B, D, F son similares a A, C y E pero incubados con los sueros inmunes correspondientes. Con propósitos de reproducción se han invertido los colores.

Figura 4:

Los paneles A, C y E presentan cultivos in vitro fijados con metanol de B. bovis incubados con antisueros de conejo preinmunes contra el péptido 4, 5 y 6 de BIIA2 respectivamente. Los paneles B, D, F son similares a A, C y E pero incubados con los sueros inmunes correspondientes. Con propósitos de reproducción se han invertido los colores.

Figura 5:

Las columnas de control representan una pre-incubación con antisuero contra un péptido no relacionado que no dio inhibición. Los antisueros (barras abiertas), así como los sueros de conejo pre-inmunes (barras negras) contra los péptidos 1, 2 y 3 de BIIA1 se ensayaron dos veces por triplicado.

Figura 6:

Las columnas de control representan una pre-incubación con antisuero contra un péptido no relacionado que no dio inhibición. Los antisueros (barras abiertas) así como los sueros pre-inmunes (barras negras) contra los péptidos 4, 5 y 6 de BIIA2 se ensayaron dos veces por triplicado.

Figura 7:

Paneles A y C: inmuntransferencias 2-D con suero inmune contra los péptidos BIIA1 1 y 3 respectivamente. Los paneles B y D: inmunotransferencias 2-D con suero preinmune de conejos inmunizados con los péptidos 1 y 3 de BIIA2 respectivamente. Las flechas indican puntos específicos para antisueros contra péptido 1 así como péptido 3.

Figura 8:

Paneles A y C: inmunotransferencias 2-D con suero inmune contra péptidos BIIA2 4 y 6 respectivamente. Paneles B y D: inmunotransferencias 2-D con suero preinmune de conejos inmunizados con péptido 4 y 6 de BIIA2 respectivamente. Las flechas indican puntos específicos para antisueros contra péptido 4 así como péptido 6.

Figura 9:

Autorradiografía de un gel 2-D usado para las inmunotransferencias presentadas en las Figuras 7 y 8, que presentan solamente proteínas procedentes de B. bovis que se marcaron ^{35}S-Met por marcado metabólico antes de la invasión. Las flechas indican los puntos que se han identificado como BIIA1 por coincidencia con inmunotransferencias mostradas en la Figura 7 usando software de formación de imágenes.

Figura 10:

Transferencia de Western 1-D de recBIIA3 expresado en E. coli, reconocido por antisueros de conejo policlonales generados contra péptidos 7 y 8.

Panel A: antisueros anti-péptido de conejo: carril 1: anti-péptido 7, carril 3: anti-péptido 8, ambos en dilución sérica 1:2000.

Carriles 2 y 4: sueros pre-inmunes de ambos antisueros de conejos donantes de péptido.

Panel B: antisueros anti-recBIIA3 bovinos: carriles 1 y 2: IgG inmune purificada en 1: 200.000 de dos animales; carril 3, suero bovino preinmune.

Figura 11:

Transferencia de Western 2-D de proteínas de B. bovis nativas reconocidas por antisuero policlonal bovino dirigido contra recBIIA3.

Panel A: suero bovino preinmune.

Panel B: IgG inmune purificada por Sepharose G, a 0,8 \mug/ml. Las flechas indican reconocimiento de anticuerpo específico de BIIA3.

Figura 12:

Ensayo de inhibición de invasión de IgG inmune anti-péptido 7 policlonal de conejo, que inhibe la invasión del aislado de Israel de B. bovis en eritrocitos bovinos.

La inhibición por control (suero pre-inmune) se ajustó en el 100%.

Eje horizontal: concentración de IgG inmune purificada; eje vertical: % relativo de eficacia de inhibición de invasión, con desviación típica (n = 3).

Figura 13:

Ensayo de inhibición de invasión de IgG inmune policlonal bovina contra recBIIA1, recBIIA2 y recBIIA3 expresados en E. coli, que inhibe la invasión de aislados de B. bovis de Israel y de México en eritrocitos bovinos.

La inhibición por control (suero pre-inmune) se ajustó en el 100%.

Eje horizontal: concentración de IgG final en \mug/\mul; eje vertical: % relativo de eficacia de inhibición de la invasión, con desviación típica (n = 2 x 2).

<110> Universiteit Utrecht Holding B.V.

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<120> Vacuna contra Piroplásmidos

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<130> 2003-010

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\vskip0.400000\baselineskip

<160>20

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<170> PatentIn versión 3.2

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<210> 1

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<211> 1818

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<212> ADN

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<213> Babesia bovis

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1) .. (1818)

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<400> 1

1

2

3

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<210>2

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<211> 605

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<212> PRT

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<213> Babesia bovis

\newpage

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<400> 2

4

5

6

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<210> 3

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<211> 2349

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<212> ADN

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<213> Theileria annulata

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(2349)

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<400> 3

7

8

9

10

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<210> 4

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<211> 782

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<212> PRT

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<213> Theileria annulata

\newpage

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<400> 4

11

12

13

14

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<210> 5

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<211> 1968

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<212> ADN

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<213> Babesia bovis

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1968)

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<400> 5

15

16

17

18

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<210> 6

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<211> 655

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<212> PRT

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<213> Babesia bovis

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<400> 6

19

20

21

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<210> 7

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<211> 1047

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<212> ADN

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<213> Theileria annulata

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1047)

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<400> 7

22

23

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<210> 8

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<211> 348

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<212> PRT

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<213> Theileria annulata

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<400> 8

24

25

26

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<210> 9

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<211> 2259

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<212> ADN

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<213> Babesia bovis

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<220>

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<221> CDS

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<222> (552)..(2189)

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<400> 9

27

28

29

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<210> 10

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<211> 545

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<212> PRT

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<213> Babesia bovis

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (305)..(305)

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<223> El "Xaa" en la localización 305 indica Arg o Lys.

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<400> 10

30

31

32

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<210> 11

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> cebador 1

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<400> 11

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccacggctct ggaatctatg tc

\hfill

22

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<210> 12

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> cebador 2

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<400> 12

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\hskip-.1em\dddseqskip

caaaaggata cctatatttg gtac

\hfill

24

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<210> 13

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Cebador 3

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<400>13

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgtggtagat gaatctgcta gtatatc

\hfill

27

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<210> 14

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Cebador 4

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<400>14

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\hskip-.1em\dddseqskip

ctatgccacg gcattcagca acattta

\hfill

27

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<210> 15

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Cebador 5

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<400> 15

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cccggatcca tgcagttaca taacaaa

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27

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<210> 16

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Cebador 6

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<400> 16

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gggaagcttc tgagcaaagg aaatagg

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27

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<210> 17

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Cebador 7

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<400> 17

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cccgaattcg tggtagatga atctgct

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27

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<210> 18

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<211> 29

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Cebador 8

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<400> 18

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cccgtcgact gcctcgcccc aaatgttgt

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29

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<210> 19

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Cebador 9

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<400> 19

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cccgaattcc atgatggtga agttccacac

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30

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<210> 20

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<211> 29

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Cebador 10

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<400> 20

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cccgtcgacg ttggccccctttcggtgat

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29

Claims

1. Proteína de Piroplásmido, caracterizada por que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una similitud de al menos el 70% con la secuencia de aminoácidos ilustrada en la SEC ID Nº: 2, o un fragmento antigénico que contienen epítopo de dicha proteína.

2. Ácido nucleico, caracterizado por que dicho ácido nucleico codifica una proteína de acuerdo con la reivindicación 1 o un fragmento antigénico que contiene epítopo de dicha proteína.

3. Fragmento de ADNc que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2.

4. Molécula de ADN recombinante que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2 o un fragmento de ADNc de acuerdo con la reivindicación 3, estando dicho ácido nucleico o dicho fragmento de ADNc bajo el control de un promotor unido funcionalmente.

5. Microorganismo portador recombinante vivo que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2 o un fragmento de ADNc de acuerdo con la reivindicación 3, estando dicho ácido nucleico o dicho fragmento de ADNc bajo el control de un promotor unido funcionalmente o una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 4.

6. Célula hospedadora que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2 o un fragmento de ADNc de acuerdo con la reivindicación 3, estando dicho ácido nucleico o dicho fragmento de ADNc bajo el control de un promotor unido funcionalmente, una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 4, o un microorganismo portador recombinante vivo de acuerdo con la reivindicación 5.

7. Vacuna que comprende una proteína de acuerdo con la reivindicación 1 o un fragmento antigénico que contiene epítopo de dicha proteína, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2 o un fragmento de ADNc de acuerdo con la reivindicación 3, una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 4, un microorganismo portador recombinante vivo de acuerdo con la reivindicación 5, o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, o una combinación de los mismos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

8. Vacuna de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizada por que dicha vacuna comprende un adyuvante.

9. Vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-8, caracterizada por que dicha vacuna comprende un componente inmunoactivo adicional o un ácido nucleico que codifica dicho componente inmunoactivo adicional.

10. Vacuna, caracterizada por que dicha vacuna comprende un anticuerpo contra una proteína de acuerdo con la reivindicación 1 o un anticuerpo contra un fragmento antigénico que contiene epítopo de dicha proteína o una combinación de los mismos y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

11. Método para la preparación de una vacuna de acuerdo con la reivindicación 7, comprendiendo dicho método la mezcla de una proteína de acuerdo con la reivindicación 1, o un fragmento antigénico que contiene epítopo de dicha proteína, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2, un fragmento de ADNc de acuerdo con la reivindicación 3, una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 4, un microorganismo portador recombinante vivo de acuerdo con la reivindicación 5, o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, o una combinación de los mismos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

12. Uso de una proteína de acuerdo con la reivindicación 1 o un fragmento antigénico que contiene epítopo de dicha proteína para la fabricación de una vacuna para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una infección o sus signos clínicos provocados por un organismo Piroplásmido.

13. Uso de una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2, un fragmento de ADNc de acuerdo con la reivindicación 3, una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 4, un microorganismo portador recombinante vivo de acuerdo con la reivindicación 5 o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6 para la fabricación de una vacuna para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una infección o sus signos clínicos provocados por un organismo de Piroplásmido.

14. Ensayo in vitro de diagnóstico para la detección de un ácido nucleico asociado con un organismo Piroplásmido, caracterizado por que el ensayo comprende un ácido nucleico, siendo dicho ácido nucleico al menos el 70% similar a la secuencia de ácido nucleico ilustrada en la SEC ID Nº: 1, o un ácido nucleico que es complementario a dicho ácido nucleico, donde el ácido nucleico tiene una longitud de al menos 15 nucleótidos.

15. Ensayo in vitro de diagnóstico para la detección de anticuerpos contra un organismo Piroplásmido, caracterizado por que dicho ensayo comprende una proteína de acuerdo con la reivindicación 1, o un fragmento antigénico que contiene epítopo de dicha proteína, o una combinación de los mismos.

16. Ensayo in vitro de diagnóstico para la detección de material antigénico de un organismo Piroplásmido, caracterizado por que dicho ensayo comprende un anticuerpo contra una proteína de acuerdo con la reivindicación 1, o un anticuerpo contra un fragmento antigénico que contiene epítopo de dicha proteína, o una combinación de los mismos.