ES2336359T3 - Sustituto cartilaginoso y osteocondral que comprende una estructura multicapa y su utilizacion. - Google Patents

Abstract

Estructura multicapa (1) que incluye: - una primera capa superior (2) que se compone de una matriz orgánica que se compone de colágeno; y - una o varias capas inferiores (3, 4, ... 10) que se componen de una matriz compuesta que incluye hidroxilapatita y colágeno; donde dicha capa superior (2) está en contacto directo con una primera capa inferior (3); y donde dicha primera capa inferior (3) se compone de una matriz compuesta que incluye colágeno en una cantidad en peso comprendida entre el 95 y el 75% e hidroxilapatita en una cantidad en peso comprendida entre el 5 y el 25%.

Description

Sustituto cartilaginoso y osteocondral que comprende una estructura multicapa y su utilización.

La presente invención se refiere a una estructura multicapa que incluye una primera capa superior que se compone de una matriz orgánica formada por colágeno y al menos una capa inferior que se compone de una matriz compuesta que incluye hidroxilapatita y colágeno. Además, la presente invención se refiere a un sustituto cartilaginoso que incluye a dicha estructura multicapa así como también a un sustituto osteocondral que incluye a dicha estructura multicapa. Finalmente, la presente invención se refiere al empleo de dicha estructura multicapa para la preparación de dicho sustituto cartilaginoso y dicho sustituto osteocondral para el tratamiento de defectos cartilaginosos articulares y defectos osteocondrales o para la nueva formación de un tejido cartilaginoso y/o un tejido óseo subcondral.

Se sabe que el cartílago articular (tejido cartilaginoso) es un tejido conjuntivo (también llamado conectivo) vicoelástico formado por una estructura compleja, muy organizada, no vascular y carente de terminaciones nerviosas.

El cartílago articular está situado fuera de la plaqueta ósea subcondral cerca de las articulaciones.

El tejido cartilaginoso junto con el tejido óseo pertenecen a los tejidos esqueléticos de soporte o tejidos conectivos que poseen elevadas propiedades mecánicas.

El tejido cartilaginoso posee elevadas propiedades mecánicas-elásticas específicas que permiten reducir constantemente el roce inducido por las cargas sobre la superficie articular durante las normales actividades de desplazamiento del cuerpo humano. Asimismo, el tejido cartilaginoso está en condiciones de disipar los picos de solicitación mecánica sobre el hueso subcondral.

El tejido conectivo que circunda al componente cartilaginoso celular, es decir los condrocitos (2% del volumen total del cartílago) está sumergido dentro de una matriz/retículo extracelular que se compone de colágeno, proteoglicanos y glicoproteínas. Por ejemplo, el 2-40% del tejido conectivo incluye: 50-60% de colágeno, 23-35% de proteoglicanos y 10-15% de glicoproteínas.

Las moléculas colágenas están distribuidas uniformemente por todo el tejido y son responsables de su forma y resistencia mecánica.

Los proteoglicanos y las glicoproteínas se enlazan al colágeno atrapando el agua dentro de la matriz.

Traumas, enfermedades inflamatorias y degenerativas pueden inducir notables daños al cartílago articular que, en un porcentaje no despreciable, pueden evolucionar a enfermedades artrósicas crónicas. El tejido cartilaginoso que sufrió un daño, en particular un daño profundo, tiene una escasa habilidad de autoreparación en consideración de que la región anatómica está escasamente vascularizada y de la reducida habilidad de reproducción de las células condrocitas. El resultado del proceso de autoreparación del cartílago a menudo es una formación de tejido fibroso que ciertamente no puede ser comparado, en términos de prestaciones mecánicas y características fisiológicas, a un normal cartílago hialino. Por consiguiente, la alteración del equilibrio viscoelástico y mecánico puede conducir a consecuencias patológicas de consideración con un posterior perjuicio de la función articular y con presentación de dolor, no obstante el proceso degenerativo cartilaginoso en la mayor parte de los casos es un fenómeno asintomático.

La situación evoluciona de forma más compleja en el caso de lesiones donde se ve implicada la estructura ósea subcondral, cuando la total demolición de la capa cartilaginosa expone de modo directo el hueso a la solicitación mecánica de la articulación.

En conclusión, entre las condiciones patológicas que pueden inducir casi siempre a procesos degenerativos irreversibles pueden enumerarse, a título puramente ejemplificador: incorrectas alineaciones (condiciones de varismo y valgismo), necrosis avascular, osteoartritis y reumatismo articular.

Las técnicas quirúrgicas conocidas que se emplean en la actualidad para la reparación del tejido cartilaginoso lógicamente se aplican en función de las dimensiones y de la profundidad del defecto.

A continuación se describen de forma concisa algunas técnicas conocidas.

La técnica denominada cirugía mosaico-plástica, que consiste en el transplante de cilindros osteocondrales múltiples extraídos de una zona cartilaginosa sana de la articulación no sometida a una carga generalmente se la lleva a cabo mediante artroscopia. La cirugía mosaico-plástica puede ser adecuada únicamente en caso de defectos osteocondrales de pequeñas dimensiones, ya que tal práctica puede producir algunos efectos colaterales adversos en el sitio del donador.

La técnica inherente a transplantes de tejido ostecondral extraído de un donador. Esta técnica exhibe problemas relacionados a la posible transmisión viral, al rechazo y a la restringida disponibilidad de tejido en bancos de
tejidos.

La técnica inherente al transplante de condrocitos autologos extraídos de zonas cartilaginosas sanas no sometidas a una carga, cultivados in vitro y reinyectados por debajo de un injerto periostal o una membrana impermeable de origen polimérico.

Las técnicas de ingeniería de tejidos, donde los condrocitos cultivados son transportados a través de scaffolds tridimensionales a base de polímeros sintéticos o naturales.

Hasta ahora, dichas dos últimas técnicas permitieron lograr resultados morfofuncionales suficientemente satisfactorios de la estructura cartilaginosa presente en el complejo articular de la rodilla.

Se vuelve más compleja la reparación del defecto osteocondral, que a menudo representa una condición patológica de difícil solución para el cirujano, especialmente cuando el sujeto es un paciente joven. En esas condiciones, aparte de la restauración de la capa cartilaginosa, es importante la reconstrucción de la estructura ósea subcondral.

Para el tratamiento de grandes defectos osteocondrales, se han propuesto scaffolds tridimensionales que tienden a imitar todo el complejo osteocondral.

Dichos scaffolds tienen una estructura compleja, con composición, porosidad, arquitectura y propiedades mecánicas bien definidas. La superficie externa generalmente se compone de una capa polimérica que tiene una porosidad de dimensión macroscópica, mientras que la capa más interna se compone de un material compuesto que tiene una matriz polimérica que incorpora al componente mineral (Sherwood J. y otros Biomaterials 2002; 23(24):4739).

El documento WO 2005/018491 describe un implante de matriz acelular para defectos cartilaginosos/osteocondra-
les que comprende una matriz orgánica que incluye colágeno y una capa inferior que comprende una matriz de colágeno e hidroxilapatita, donde dichas dos capas están separadas por una capa selladora de fondo. La presencia de esta capa selladora de fondo produce el efecto de proteger el implante contra toda influencia de agentes no deseados y el de impedir la migración de condrocitos dentro del espacio subcondral. Además, produce el ulterior efecto de impedir la infiltración de vasos sanguíneos y células no deseadas y fragmentos celulares dentro del implante y también tiene el adicional efecto de impedir el crecimiento hacia dentro de fibrocartílagos dentro del área ósea.

Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de tener un dispositivo médico a emplear como sustituto cartilaginoso y sustituto osteocondral que no exhiba los inconvenientes de los dispositivos pertenecientes a la técnica conocida.

En particular, existe la necesidad de disponer un dispositivo médico que pueda ser ubicado en el complejo cartilaginoso y subcondral sometido a lesión y/o degeneración.

Un primer objetivo de la presente invención es el de proporcionar novedosos sustitutos condrales y oesteocondrales con una alta biocompatibilidad puesto que no dan lugar a ninguna respuesta inflamatoria y excluyen la habilidad de inducir una respuesta inmunitaria por parte del cuerpo humano.

Otro objetivo de la presente invención es el de proporcionar novedosos sustitutos en los cuales hay una matriz compuesta que incluye fibras de colágenos u otros tipos de polímeros naturales y/o sintéticos, sobre las cuales se nuclean cristales nanodimensionales (5-30 nm) de hidroxilapatita.

Otro objetivo de la presente invención es el de proporcionar una estructura multicapa, capaz de imitar tanto el componente cartilaginoso como el componente óseo subcondral.

Otro objetivo de la presente invención es el de proporcionar estructuras biomiméticas.

Otro objetivo de la presente invención es el de proporcionar estructuras osteoconductivas.

Otro objetivo de la presente invención es el de proporcionar estructuras degradables y biorreabsorbibles (con respecto sobre todo a la parte colagénica) y osteointegrable (con respecto sobre todo a la parte inorgánica de hidroxilapatita).

Otro objetivo de la presente invención es el de proporcionar un dispositivo médico capaz de actuar como soporte (scaffold) para la fijación y diferenciación in situ de las células mesenquimales indiferenciadas provenientes del complejo subcondral, de conformidad con el concepto de regeneración guiada de los tejidos (Baran ET y otros J. Master Sci Mater Med. febrero de 2004; 15(2):161-5).

Otro objetivo de la presente invención es el de proporcionar un dispositivo médico capaz de ser cargado ex-vivo con un concentrado proveniente de sangre medular, con un concentrado plaquetario (PRP), factores de crecimiento o en general con factores capaces de promover el trofismo y la diferenciación celular, tales como TGF, EGF, BMP y otros factores.

Otro objetivo de la presente invención es el de proporcionar un dispositivo médico capaz de ser cargado ex-vivo con células mesenquimales indiferenciadas o de ser mantenido en cultivo por un período de tiempo necesario para la multiplicación y/o diferenciación en células progenitoras de los osteoblastos y condrocitos.

Otro objetivo de la presente invención es el de proporcionar novedosos sustitutos/injertos osteocondrales y cartilaginosos que puedan ser: dimensionados y adaptados en función de las dimensiones del daño cartilaginoso u osteocondral; cargados con sustancias farmacológicamente activas tales como, por ejemplo, corticosteroides antiinflamatorios, FANS, inmunosupresores, antibióticos, antiblásticos, antiproliferativos, antivirales; aplicados con técnicas artroscópicas; fijados con la ayuda de suturas absorbibles y no absorbibles, colas quirúrgicas de origen biológico y sintético.

Esos y otros objetivos que se pondrán de manifiesto a partir de la descripción detallada que sigue han sido logrados por la parte Solicitante, que ha efectuado una estructura multicapa así como un sustituto cartilaginoso y osteocondral que incluye a dicha estructura multicapa, que tienen las características señaladas en la reivindicación independiente anexa.

Otras características y ventajas de la presente invención se pondrán mejor de manifiesto a partir de la descripción indicativa y, por ende, no limitativa de una realización preferida pero no exclusiva de un sustituto cartilaginoso y osteocondral, como se muestra en los dibujos anexos, en los cuales:

- la figura 1 muestra una vista diagramática en perspectiva de una estructura multicapa según una primera realización;

- la figura 2 muestra una vista diagramática en perspectiva de una estructura multicapa según una segunda realización;

- la figura 3 muestra una vista diagramática en perspectiva de una estructura multicapa según una tercera realización.

La estructura multicapa (1), objeto de la presente invención, incluye una primera capa superior (2) que presenta una superficie superior (2a) y una superficie inferior (2b).

Como se puede observar en la figura 1, dicha estructura multicapa (1) además incluye al menos una capa inferior (3) asociada con dicha capa superior (2).

En particular, la capa inferior (3) incluye una superficie superior (3a) asociada con dicha superficie inferior (2b) de dicha capa superior (2), y una superficie inferior (3b) opuesta a dicha superficie superior (3a).

En una realización preferida de la presente invención, mostrada en la figura 2, se han proporcionado dos capas inferiores (3 y 4). En esta situación, la capa inferior (3) cerca de la capa superior (2) presenta una respectiva superficie superior (3a) asociada con dicha superficie inferior (2b) de la capa superior (2) y una superficie inferior (3b) asociada con una superficie superior (5a) de la capa inferior denotada con 4.

De manera ventajosa, en esta situación la capa inferior (3) forma una capa intermedia dispuesta entre dicha capa superior (2) y dicha capa inferior denotada con 4.

El ámbito de la presente invención abarca estructuras multicapas (1) que incluyen una pluralidad de capas inferiores, por ejemplo en una cantidad mayor que dos y menor o igual que diez.

Por ejemplo, como se puede observar en la figura 3, la estructura multicapa (1) puede exhibir cuatro capas inferiores (3, 4, 5 y 6), cada una de las cuales muestra una respectiva superficie superior asociada con la superficie inferior de la capa adyacente.

La capa superior (2) se compone de una matriz orgánica compuesta por colágeno.

Las capas inferiores (3, 4, 5 y 6) se componen de una matriz compuesta que incluye colágeno e hidroxilapatita.

En el contexto de la presente invención, las cantidades de colágeno e hidroxilapatita están expresadas en porcentaje de peso.

En la realización mostrada en la figura 1, la capa inferior (3) se compone de una matriz compuesta que incluye colágeno en una cantidad comprendida entre el 95 y el 75% e hidroxilapatita en una cantidad comprendida entre el 5 y el 25%.

En la realización mostrada en la figura 2, la capa inferior (3) se compone de una matriz compuesta que incluye colágeno en una cantidad comprendida entre el 95 y el 75% e hidroxilapatita en una cantidad comprendida entre el 5 y el 25%, mientras que la capa inferior (4) se compone de un material compuesto que incluye colágeno en una cantidad comprendida entre el 75 y el 45% e hidroxilapatita en una cantidad comprendida entre el 25 y el 55%.

En la realización mostrada en la figura 3, la capa inferior (4) se compone de una matriz compuesta que incluye colágeno en una cantidad comprendida entre el 95 y el 75% e hidroxilapatita en una cantidad comprendida entre el 5 y el 25%, al menos una capa inferior (5) que se compone de una matriz compuesta que incluye colágeno en una cantidad comprendida entre el 75 y el 45% e hidroxilapatita en una cantidad comprendida entre el 25 y el 55% y al menos una capa inferior (6) que se compone de una matriz compuesta que incluye colágeno en una cantidad comprendida entre el 45 y el 25% e hidroxilapatita en una cantidad comprendida entre el 55 y el 75%.

La estructura multicapa (1) está caracterizada por la presencia de un gradiente de colágeno que se extiende desde la capa superior (2), en la cual hay 100% de colágeno hasta la capa inferior (3), en la cual hay una cantidad de colágeno comprendida entre el 90 y el 70%, hasta alcanzar la última capa inferior, por ejemplo la capa inferior denotada con 10, en la cual la cantidad de colágeno es menor que el 10%. Lógicamente, la cantidad de hidroxilapatita es complementaria a la cantidad de colágeno.

Por ejemplo, la capa superior (2) tiene un espesor comprendido entre 1 y 10 mm; preferentemente, de 2 a 8 mm; aún más preferentemente de 3 a 5 mm.

El espesor de las capas inferiores (de 3 a 10) puede ser el mismo o diferente, no habiendo ninguna restricción al respecto. El espesor de la capa inferior está comprendido entre 1 y 10 mm; preferentemente, de 2 a 8 mm; aún más preferentemente, de 3 a 5 mm.

En el contexto de la presente invención, con el término colágeno se entiende una proteína fibrosa de un tipo mucopolisacárido que representa el mayor componente de la matriz extracelular. El colágeno es reconocido como la unidad estructural más importante de los tejidos conectivos del cuerpo humano. Con el término colágeno, efectivamente se entiende una gran y heterogénea clase de moléculas que, aparte de funciones estructurales, pueden tener otras importantes funciones/papeles directos o indirectos fisiológicos, tales como adhesión y diferenciación celular durante el desarrollo de órganos y tejidos. Dentro de los organismos vertebrados, en la naturaleza hay al menos quince tipos de colágenos con diferentes funciones. La estructura molecular de tres hélices acomuna a todos los tipos de colágenos. La misma se compone de tres cadenas simples, denominadas cadenas \alpha, cada una de las cuales contiene una secuencia característica de aminoácidos. Esas tres cadenas simples están unidas entre sí dando lugar a la típica estructura de tres hélices. Esta conformación es estabilizada por la presencia de puentes de hidrógeno, además la triple hélice del colágeno es compacta y estable debido a una especial secuencia de aminoácidos. De cada tres aminoácidos uno es glicina y muchos de los aminoácidos restantes son prolina o hidroxiprolina. El colágeno de tipo I representa el tipo más abundante de colágeno que existe en la naturaleza y está presente en varios tejidos conectivos de adultos, tales como por ejemplo la dermis, el hueso, el tendón y la córnea. El colágeno empleado en la presente invención puede ser de tipo I, tipo II, tipo VI o mezclas de ellos y puede obtenerse de diferentes fuentes, por ejemplo por extracción de derivación bovina, porcina o equina.

Alternativamente, el colágeno utilizado puede ser de origen sintético, por ejemplo puede ser recombinante.

En el contexto de la presente invención, con el término hidroxilapatita generalmente se entiende tanto la hidroxilapatita Ca_{10} (PO4)_{6}(OH)_{2} con un alto y bajo grado de cristalinidad como la hidroxilapatita que tiene sustituciones químicas, puesto que el componente inorgánico/mineral del hueso es formado por iones de sodio, magnesio, carbonato y citrato.

La hidroxilapatita sintética representa el sustituto óseo más ampliamente utilizado en cirugía. Sin embargo, los resultados clínicos expresados como la calidad del hueso de nueva formación no siempre son satisfactorios. El inconveniente principalmente reside en el hecho que la hidroxilapatita sintética no tiene las mismas características que la hidroxilapatita humana, que desde un punto de vista bioquímico es formada con un proceso de mineralización sobre fibrillas de colágeno. A tal efecto, se ha empleado ampliamente un enfoque biomimético para sintetizar componentes inorgánicos minerales asociados con componentes orgánicos, tanto a base de colágeno u otros polímeros naturales como sintéticos, con una diferente composición química y estructura macromolecular. Las matrices macromoleculares principalmente actúan como moldes e inducen el depósito orientado del componente inorgánico impidiendo el crecimiento del cristalino que queda con dimensiones de 10-20 nm a lo largo del eje principal (una medida totalmente similar a aquella de la apatita natural humana). La interacción de la HA con el colágeno induce a una carbonatación espontánea en la posición B, que aumenta adicionalmente la habilidad biomimética y el grado de biodisponibilidad de la apatita. Las propiedades físico-químicas de los componentes orgánicos macromoleculares y de las hidroxilapatitas están influenciadas por las interacciones químicas y por la organización estructural entre los dos componentes que, aparte de conferir geometría y morfología, establecen las propiedades biomecánicas del dispositivo de la
invención.

En una realización preferida de la presente invención, para conferir propiedades mecánicas y viscoelásticas más elevadas, especialmente en la parte formada por la capa colagénica, por ejemplo en la capa superior (2) de la figura 1, 2 o 3, se han reticulado agentes, tales como glutaraldehído, formaldehído, éteres, bis-epóxidos y ácido hialurónico.

La estructura multicapa (1), mostrada a título ejemplificador en las adjuntadas figuras 1, 2 y 3, es obtenida a través de una asociación con una capa superior (2) formada por una matriz orgánica que se compone de colágeno y una o más capas inferiores formadas por una matriz compuesta que incluye hidroxilapatita y colágeno. La capa superior (2) y una capa inferior (3), por ejemplo con forma de gel, se ponen en contacto y, posteriormente, la estructura multicapa (1) se somete a una etapa de liofilización o secado.

\newpage

En una realización preferida, la estructura multicapa (1) puede ser asociada con:

1. Algunos componentes presentes en la estructura cartilaginosa y/o la estructura ósea, por ejemplo a través de impregnación o revestimiento externo con biopolímeros hidrofílicos, tales como ácido hialurónico y derivados (reticulados, esteres, sulfatados), keratán sulfato, condroitin sulfato.

2. Biopolímeros, por ejemplo proteoglicanos y glicosaminoglicanos normalmente contenidos en la matriz extracelular del tejido conectivo cartilaginoso y del tejido conectivo óseo respectivamente en una medida del 15% y 5%. Tal agregado permite mejorar las propiedades de biocompatibilidad y viscoelasticidad y, al mismo tiempo, permite reducir la acción compresiva de las cargas.

3. Polímeros naturales y sintéticos, tales como alginato de sodio, gellan, quitosan, gelatina, ácido poliláctico (PLLG), ácido poliglicólico (PGA), policaprolactona (PCL), polietileno glicol (PEG).

De manera ventajosa, en una realización de la presente invención, la estructura multicapa puede ser usada o asociada con técnicas de ingeniería de tejido que implica el uso de condrocitos autologos cultivados in vitro, el uso de células mesenquimales provenientes de médula ósea precultivadas y expandidas in vitro o prediferenciadas o completamente diferenciadas en sentido osteoblástico o condroblástico, células provenientes de médula ósea extraídas del paciente en la etapa interoperativa para ser usadas tal cual o concentradas.

De manera ventajosa, en otra realización de la presente invención, los sustitutos cartilaginosos y los sustitutos osteocondrales pueden ser usados para aplicaciones quirúrgicas en las cuales es necesario la reconstrucción de superficies cartilaginosas y superficies óseas, por ejemplo en las láminas epifisarias del cuerpo vertebral de la espina dorsal, donde la parte cartilaginosa se compone de cartílago hialino circundado por un anillo óseo.

De manera ventajosa, en otra realización de la presente invención, los sustitutos cartilaginosos y los sustitutos osteocondrales pueden ser usados en la región articular femoral, en la región articular del tobillo, en la región maxilofacial (en el caso de reconstrucción de la rama cóndilo-mandibular), en los defectos osteocondrales, en la cirugía de hombros y en todo tipo de cirugía ortopédica que exija la formación de un nuevo tejido óseo y tejido cartilaginoso para regenerar/reemplazar los originalmente existentes pero posteriormente dañados o tejidos extraídos por vía quirúrgica.

De manera ventajosa, en otra realización de la presente invención, las novedosas estructuras compuestas tridimensionales, multicapas, bioactivas y biomiméticas pueden ser usadas como sustitutos cartilaginosos y sustitutos osteocondrales. Tales estructuras, matrices tridimensionales o "scaffolds", quirúrgicamente dispuestas en el complejo cartilaginoso y subcondral que ha sufrido una lesión/degeneración estarán en condiciones de facilitar los procesos regenerativos (condrogenesis y osteogenesis) que llevan a la restauración de la anatomía, morfología y propiedades mecánicas de un normal tejido osteo-cartilaginoso de las superficies articulares.

La matriz compuesta de la estructura multicapa (1) presenta un "gradiente" hidroxilapatita/colágeno entre las diferentes capas inferiores (de 3 a 10), cada una conteniendo una diferente cantidad de colágeno e hidroxilapatita nucleada independientemente del espesor de cada capa.

A tal efecto, es posible proceder simultáneamente a la síntesis de los compuestos con un diferente contenido de fase apatítica, en función del tipo de gradiente que se desea (porcentaje). Se ha llevado a cabo un procedimiento de nucleación directa de la hidroxilapatita sobre las fibras colagénicas, establecido con anterioridad. Estas reacciones de la nucleación se producen en agua o SBF (fluido fisiológico sintético) y en condiciones de pH tales de permitirles a las fibras colagénicas incorporar los nanonúcleos de apatita.

Una vez obtenidos los compuestos, éstos vienen lavados varias veces para purificarlos de eventuales residuos ácidos o básicos debidos a la reacción, vienen filtrados con la ayuda de un tamiz de malla fina y rociados sobre una superficie desde la cual es posible quitarlos con facilidad. Luego, las capas individuales vienen estratificadas dentro de un molde y compactadas entre sí. La multicapa obtenida de este modo viene secada por liofilización de modo de obtener un material esponjoso pero resistente y compacto, con un deseado gradiente y un deseado espesor.

Por lo que concierne a la capa inferior, es decir al componente que durante una operación se pone íntimamente en contacto con la superficie ósea subcondral, es preferible obtener una estructura lo más similar posible al hueso humano. El colágeno y la hidroxilapatita y las correspondientes mezclas son conocidos. Por el contrario, no se conoce un método para la preparación de una matriz tridimensional compuesta orgánica-cerámica con propiedades similares al tejido óseo humano.

Una ventaja de la presente invención es la de proporcionar un sustituto tridimensional que tiene una capa inferior (hidroxilapatita nucleada sobre colágeno) con las mismas características morfológicas del hueso humano.

Tal ventaja es obtenida a través de un proceso de nucleación directa de una fase apatítica sobre fibrillas de colágeno, donde se hace reaccionar una solución de sales de calcio, que promueve la formación de hidroxilapatita, con polímeros naturales colagénicos similares en una suspensión ácida. En la mezcla de sales de calcio en solución acuosa, se hace gotear una solución acuosa de componente fosfórico, que previamente se ha agregado con la suspensión ácida de polímeros similares a colágenos. Posteriormente, el producto obtenido de esta manera es sometido a liofilización y/o filtración y secado. La estructura del polímero natural similar a colágeno transfiere a nivel molecular la información que permite reemplazar químicamente la hidroxilapatita, como sucede en el cuerpo humano, es decir entran sustituyentes, tales como fracciones de carbonato y fracciones iónicas tales como fosfato existentes en la mezcla de reacción. El producto obtenido a través de tal proceso posee las mismas características que las del tejido óseo humano gracias a la presencia de tales sustituyentes en la estructura del compuesto obtenido.

La nucleación directa actúa como un mecanismo de tendencia biológica formando nanocristales de hidroxilapatita crecidos orientados paralelos al eje a lo largo de las fibrillas de colágeno, como sucede en el cuerpo humano, y da lugar a un componente inorgánico con un bajo grado de cristalinidad, casi amorfo y, por consiguiente, muy soluble. Los cristales formados de este modo no se desarrollan sino que se quedan de dimensiones del orden de los nanometros. La nucleación de la hidroxilapatita en el colágeno incluye una carbonatación de la fase inorgánica, es decir incorporación de grupos CO_{3}^{2-} en el retículo de hidroxilapatita durante la nucleación del mismo sitio B en una proporción similar a la del tejido óseo natural calcificado. Además, la carbonatación puede ser asignada principalmente a la posición B. La interacción de la hidroxilapatita con el colágeno impide la carbonatación en la posición A bloqueando probablemente el acceso a los grupos -OH. Este desvío con respecto a la estequiometría sorprendentemente aumenta la similitud con el tejido óseo natural y, por ende, no sólo la microestructura sino también la composición del tejido artificial obtenido es exactamente igual a aquella del tejido óseo natural. La carbonatación en la posición B es ventajosa con respecto a la carbonatación en la posición A porque, como consecuencia, la bioactividad y la biodegradabilidad del tejido óseo artificial obtenido aumenta de modo considerable, las cuales son características esenciales para la calcificación puesto que permiten un continuo intercambio dinámico entre el fluido fisiológico y la célula que utiliza los iones para la formación ósea.

1

La presente invención utiliza un enfoque de tendencia biológica para sintetizar nanocristales de hidroxilapatita sobre fibrillas de colágeno autoensambladoras análogamente a los nanocristales de huesos naturales, explotando la habilidad de los grupos carboxilos de colágeno cargados negativamente de enlazar iones de calcio de la hidroxilapatita; siguiendo este enfoque, se ha comprobado claramente que los sistemas biológicos almacenan y procesan información a nivel molecular. Por este motivo, las moléculas colagénicas de tipo I sin telopéptidos y carentes de regiones glucosilatadas, capaces de autoagregarse en fibrillas sin agentes de reticulación, han sido utilizadas como materiales iniciales.

\vskip1.000000\baselineskip

Preparación de colágeno

El colágeno de tipo I ha sido hallado en el comercio como un producto estándar. Después del proceso de purificación, el colágeno de tipo I se ha disuelto en un volumen calculado de ácido acético hasta obtener una suspensión homogénea (1% de colágeno).

En una realización preferida, se han empleado sales de calcio en solución acuosa o SBF (fluido corporal sintético), que facilita la formación de hidroxilapatita, preferentemente seleccionadas del grupo que incluye hidróxido de calcio, nitrato de calcio, acetato de calcio, sulfato de calcio, carbonato de calcio. Aún más preferible, se ha empleado hidróxido de calcio. Además, se ha utilizado una suspensión ácida de polímero natural similar a colágeno, obtenida mediante tratamiento de colágeno animal extraído de un tendón de caballo, una cola de ratón, una cola de canguro o de polímero sintético similar a colágeno o de gelatinas químicamente reticuladas. Asimismo, el componente fosfatado empleado ha sido seleccionado entre ácido fosfórico en solución acuosa o SBF o una sal de amonio, calcio, sodio, potasio y magnesio en solución acuosa con un anión de fosfato PO_{4}^{(3-)}, fosfato de monohidrógeno HPO_{4}^{(2-)} o fosfato de dihidrógeno H_{2}PO_{4}^{(-)}. Aún más preferible, se emplea ácido fosfórico H_{3}PO_{4}. Las sales de calcio empleadas por la presente invención están en el intervalo comprendido entre 1 y 4 g/l (gramos/litro), el componente fosfático está en el intervalo comprendido entre 2 g/l y 4 g/l. Aún más preferible, las sales de calcio empleadas en la presente invención están en
el intervalo comprendido entre 2 y 3 g/l, el componente fosfático está en el intervalo comprendido entre 3 y 4 g/l.

La etapa de nucleación directa se produce con un pH preferentemente entre 9 y 12, aún más preferible entre 9 y 11 (al final de la reacción el pH debe estar comprendido entre 7 y 8,5 o aún mejor entre 7 y 7,5) y a una temperatura preferentemente comprendida entre 25 y 45ºC, mejor aún entre 35 y 40ºC.

En una realización preferida, en una solución acuosa o SBF de Ca(OH)_{2} (147 g de Ca(OH)_{2} en 300 ml (cc) de H_{2}O) se ha goteado una solución de ácido fosfórico (1,17 g de H_{3}PO_{4} en 200 ml (cc) de H_{2}O) y 50 g de colágeno en ácido acético. El pH durante el proceso estaba comprendido entre 7 y 10, la temperatura fue mantenida cerca de 25ºC, el tiempo de goteo de la solución de ácido fosfórico en la mezcla de sales de calcio en solución acuosa y suspensión ácida de colágeno fue mantenida entre 15 y 60 minutos y, por ende, la velocidad de goteo preferiblemente estuvo entre 0,0133 l/minuto y 0,0033 l/minuto, aún más preferentemente entre 0,0100 y 0,0060 l/minuto.

Posteriormente, los productos obtenidos, codificados HA/Col nuc. col. fueron sometidos a una etapa de liofilización o secado.

Luego, los compuestos han sido caracterizados por análisis de cristales con un difractómetro de rayos X (Rigaku Miniflex); para analizar la orientación, han sido registrados fotográficamente algunos gráficos de difracción con una distancia muestra-película de 70 mm utilizando una cámara plana (siempre con radiación Cu-K\alpha).

El análisis termogravimétrico ha sido llevado a cabo (Polyer STA 1660) utilizando un crisol de alúmina en aire y utilizando una velocidad de calentamiento de 10ºC/min.

\vskip1.000000\baselineskip

Análisis de los compuestos

Los compuestos preparados según el método de la presente invención por nucleación directa de hidroxilapatita en las fibrillas de colágeno tenían una composición nominal de hidroxilapatita/colágeno de 80/20 a 10/90 en términos de masa. Sin embargo, mediante análisis termogravimétrico se ha hallado que la efectiva composición era de 70/30 y 10/90 respectivamente. Esta discrepancia es debida al rendimiento de reacción que no alcanza el 100%. El contenido de agua en el compuesto es muy similar al del colágeno puro (10%). Este análisis se ha empleado con buenos resultados para obtener información acerca de las modificaciones de las relaciones estructurales entre fibrillas de colágeno y fase inorgánica en función del contenido de mineral. Previamente, tal análisis ha sido llevado a cabo sobre el tendón flexor de la pata de un pavo que se utiliza como patrón en el proceso de calcificación.

En efecto, los gráficos TG-DTG se ven modificados con respecto a los de los compuestos de hidroxilapatita/colágeno, que muestran una interacción de la fase inorgánica con las fibras de colágeno. Esta clase de interacción puede ser comparada al proceso de calcificación que ocurre de modo natural. La comparación es llevada a cabo con un gráfico TG-DTG correspondiente a un tendón calcificado de un pavo, empleado como patrón teórico de hueso. La gran similitud está evidenciada porque en ambos casos el pico DTG a 450-500ºC tiende a desaparecer formando una "espalda ensanchada". Se puede suponer que, cuando se lleva a cabo una nucleación directa de hidroxilapatita sobre colágeno, el compuesto se comporta como un tejido calcificado naturalmente.

El cristalograma XRD muestra un gráfico típico de hidroxilapatita con una muy baja cristalinidad, el tamaño de los cristales estimado a lo largo del eje es de aproximadamente 12-15 nm. La nucleación se produce según el típico proceso del hueso natural, en el cual la nanodimensión de los cristales es responsable de la ampliación de la reflexión en el gráfico. Además, puesto que la reacción ha sido llevada a cabo a aproximadamente 25ºC, se está ampliamente dentro de los límites para formar nanocristales de hidroxilapatita monocristalina. Tales nanocristales crecen dentro de las fibras de colágeno con su eje (c) preferentemente orientado paralelo a la dirección de orientación de las fibras. En efecto, el gráfico de difracción del amplio ángulo de los rayos X es obtenido a partir de una muestra que se compone de algunas fibrillas calcificadas.

El micrográfico TEM muestra nanonúcleos formados dentro de las fibrillas de colágeno que crecen paralelas a las fibrillas.

Tales técnicas analíticas han evidenciado fuertes interacciones entre los dos componentes de colágeno e hidroxilapatita y una completa analogía del compuesto con el tejido natural calcificado.

Además, el análisis bajo el microscopio óptico muestra la diferente morfología cristalina del compuesto hidroxilapatita/colágeno obtenido por nucleación directa y posteriormente liofilizado por aquel secado por aire. Los compuestos liofilizados muestran una red tridimensional caracterizada por una distribución de poros muy anchos similar a la del algodón y de la lana. Cuando la muestra se seca sobre un filtro de aire, por el contrario, se forma una red de dos dimensiones y la estructura se presenta como una trama de una gasa.

El tejido óseo artificial según la presente invención puede ser obtenido con diferentes cantidades de hidroxilapatita/colágeno y con varias formulaciones y es adecuado para diferentes aplicaciones clínicas. Tal tejido óseo artificial puede ser empleado como un constituyente de la/s capa/s HA-colágeno inferior/es del sustituto cartilaginoso/osteocartilaginoso de la presente invención y también como un material protésico, para reemplazar o rellenar el hueso, como una membrana reconstructiva o tejido hemostático en ortopedia, odontoterapia, cirugía maxilofacial.

De manera ventajosa, los sustitutos mencionados arriba pueden ser empleados como un sustituto osteocondral para defectos cartilaginosos de grado Outerbridge 3 y 4 o para defectos cartilaginosos de grado Outerbridge 4 profundo.

\newpage

Parte experimental

Ahora se describirá la parte experimental haciendo referencia a las figuras e imágenes anexas, que muestran algunos ejemplos de realización no limitativos, donde:

- la figura 4 muestra la estructura colagénica del prototipo A' sin el agregado de ningún reticulador en la etapa de preparación. El prototipo A' es simplemente una muestra sin el agregado de ningún reticulador en la etapa de preparación. En la figura 4 se muestra: con (1) un detalle de la estructura porosa de la capa colagénica, con (2) una gran ampliación de la estructura porosa de la capa colagénica, con (3) una interfaz capa colagénica-gradiente HA/colágeno;

- la figura 5 muestra la porosidad de una capa colagénica B' con el agregado de ácido hialurónico en la etapa de preparación. El prototipo B' es una muestra con el agregado de ácido hialurónico en la etapa de preparación. En la figura 5 se muestra: con (1) un detalle de la estructura porosa de la capa colagénica, con (2) una gran ampliación de la estructura porosa de la capa colagénica, con (3) una interfaz superficie de colágeno-gradiente HA/colágeno;

- la figura 6 muestra la estructura porosa de una muestra C' sometida a reticulación a través del agregado de 1,4-butanediol-diglicidil éter (BDDGE). En la figura 6 se muestra: con (1) un detalle de la estructura porosa con orientación en una dirección vertical, con (2) un detalle con una gran amplificación de la estructura porosa con una orientación en la dirección vertical de las paredes de los poros, con (3) un detalle de la interfaz gradiente HA/colágeno;

- la figura 7 muestra la estructura colagénica porosa del prototipo D' sometido a reticulación a través de tratamiento de vapores de glutaraldehído. En la figura 7 se muestra: con (1) un detalle con una gran amplificación de la estructura porosa de la capa colagénica, con (2) una interfaz capa colagénica-gradiente HA/colágeno;

- la figura 8 muestra una ilustración diagramática del cóndilo derecho de un caballo. En la figura 8 se muestra: con (A) una lesión lateral condral más microabrasiones con posicionamiento de dispositivo con 2 gradientes (sustituto cartilaginoso, configuración I), con (B) una lesión medial osteocondral más sangrado con posicionamiento de scaffold con 3 gradientes (sustituto osteocartilaginoso, configuración II);

- la figura 9 muestra una ilustración diagramática del cóndilo izquierdo de un caballo. En la figura 9 se muestra: con (C) una lesión medial osteocondral más sangrado con posicionamiento de scaffold con 3 gradientes (sustituto osteocargilaginoso); con (D) una lesión lateral condral más microabrasiones con posicionamiento del dispositivo con 2 gradientes (sustituto cartilaginoso);

- la figura 10 muestra una región anatómica abierta y cortada;

- la figura 11 muestra la exposición de las superficies del cóndilo;

- la figura 12 muestra una lesión en la superficie cartilaginosa con exposición del hueso subcondral;

- la figura 13 muestra un ejemplo de posicionamiento del dispositivo;

- la figura 14 muestra un análisis histológico después de 8 semanas (tinción de hematoxilina/eosina). La figura 14 muestra la presencia de tejido fibroso sólo en correspondencia del gradiente 1 de colágeno. En la zona más profunda, en correspondencia del gradiente 3 con un componente preponderante hidroxilapatita, se nota la presencia de un hueso de nueva formación;

- la figura 15 muestra una segunda observación (2nd look) artroscópica;

- la figura 16 muestra una segunda observación en el animal n. 1. La figura 16 muestra un recrecimiento del tejido conectivo en las lesiones condrales laterales (A y D) y en las lesiones mediales osteocondrales (B y C);

- la figura 17 (de A a H) muestra un análisis histológico con una tinción de azul toluidino según diferentes amplificaciones del implante condral (animal 1).

El sustituto condral u osteocondral (scaffold) de la presente invención ha sido modificado químicamente de modo de volver toda la estructura general más elástica y más hidrofílica, por lo tanto menos sujeta a delaminación en correspondencia de la interfaz entre la superficie inferior (2b) de la capa superior (2) y la superficie superior (3a) de la capa inferior (3) durante la manipulación que realiza el operador.

El fenómeno de delaminación de las capas es un inconveniente que sucede cuando se hidrata el sustituto, después de haber sido preparado. La delaminación representa un problema que debe ser resuelto.

Una estructura multicapa (1) presenta una capa superior (2) que se compone de colágeno de tipo I y una capa inferior (3) que se compone de hidroxilapatita/colágeno tipo I (40%-60%).

\newpage

\global\parskip0.930000\baselineskip

Otra estructura multicapa (1) presenta una capa superior (2) que se compone de colágeno tipo I y una capa inferior (3) que se compone de hidroxilapatita/colágeno tipo I (40%-60%) y una capa inferior (4) que se compone de hidroxilapatita/colágeno (70%-30%).

Para cada una de las dos configuraciones multicapa, se han preparado cuatro prototipos, cuyas características químicas y geométricas después de la liofilización se muestran en las figuras 1 y 2.

Cada prototipo ha sido liofilizado (cuando fueron llevados a la temperatura de -40ºC, una vez totalmente congelados, fueron sometidos a una depresión de aproximadamente 7.10^{-2} Pirani (1 Pirani = 1.10^{-3} mBares), luego calentados hasta 30ºC manteniendo el mismo grado de depresión) en una caja Petri y subdivididos en cuatro porciones de 12 cm^{2} cada uno utilizando un cuchillo afilado. Todos los prototipos han sido empaquetados en envases individuales y esterilizados mediante radiación de rayos \gamma a 25 kGy.

Una porción estéril fue sometida a las siguientes pruebas:

- manipulación en seco;

- humectabilidad;

- microscopia óptica;

- análisis estructural con SEM (microscópico electrónico de exploración);

Una porción estéril fue sometida a pruebas in vitro e in vivo y a pruebas de manipulación in vivo sobre oveja y sobre cartílago de nudillo de un cadáver de caballo. Finalmente, se ha mantenido una fracción para llevar a cabo otras pruebas y análisis químicos.

Las muestras B y C resultaron, para sus finalidades, ser las más adecuadas tanto por sus buenas propiedades de elasticidad como por el alto grado de hidrofilicidad.

- el flujo elástico a la manipulación es una propiedad que facilita su uso.

- la hidrofilicidad es un parámetro muy importante porque facilita la migración, dentro del scaffold, de las células mesenquimales-estaminales provenientes de la médula ósea; ello, por consiguiente, permite, dentro del scaffold, la diferenciación celular y la regeneración de los tejidos a reparar.

En estado seco se observa una buena compactabilidad del prototipo, se pone de manifiesto una mayor elasticidad y flujo por compresión para los prototipos B y C tanto para las versiones I como para las versiones II. Para el prototipo D, que presenta una tinción tendiente al amarillo probablemente debido al tratamiento con vapor de glutaraldehído, se nota una cierta rigidez.

Las pruebas de humectabilidad han sido llevadas a cabo en agua por goteo, manipulando y rehidratando cada porción de scaffold y observándolo por una semana. Para todas las versiones se ha observado una cierta estabilidad hasta dos días. Los prototipos B y C han mostrado una rápida habilidad de hidratación y una mayor tumefacción que los prototipos A y D. La versión D mostró una mayor rigidez.

El tercer día de observación, la estabilidad disminuyó sensiblemente para el prototipo A con una pérdida de fibra y una delaminación parcial en correspondencia de la orilla del gradiente, mientras que en los prototipos B y C se vio una pequeña pérdida de fibra. La versión D, cuando fue sometida a manipulación, mantuvo intacta su geometría inicial.

El séptimo día, en el prototipo A se notó una casi total delaminación de las capas, mientras que los prototipos B y C mostraron una pérdida de fibras colagénicas con delaminación parcial. El prototipo D mantuvo su geometría inicial.

Microscopia óptica y ESEM

En secciones sagitales de 2 mm de cada configuración se llevaron a cabo observaciones con microscopio óptico de 12x. Las imágenes ESEM han sido adquiridas a 25 y 100x.

La figura 4 muestra una serie de imágenes de una única microscopia electrónica de exploración, relativa a todos los prototipos de la configuración I del scaffold.

En la figura 4, la estructura colagénica del prototipo A' muestra una porosidad bastante regular (1), pero con una mayor amplificación las paredes de los poros se presentan más escabrosas (2). Se pone de manifiesto la interfaz gradiente colágeno-hidroxilapatita/colágeno 40/60 (3).

\global\parskip1.000000\baselineskip

La figura 5 muestra la porosidad de la capa colágenica del prototipo B', que es regular y bastante compacta con respecto al prototipo A'. Esta compactabilidad se debe entender probablemente como una alteración debida, en gran medida, a la acción del cuchillo durante el corte del scaffold antes bien que a una acción del ácido hialurónico sobre la estructura (1). Con una mayor amplificación se aprecia la conservación de la regularidad de los poros, con una conservación similar a la regularidad superficial de las paredes internas (2). No se observan orientaciones particulares de los poros. Por el contrario, aparecen a la vista una mayor uniformidad y compactabilidad de las estructuras individuales en correspondencia de la interfaz colágeno-gradiente HA/colágeno (3).

En la figura 6 se exhibe la observación del prototipo C'. El elemento interesante que emerge de las observaciones del prototipo C' es la estructura porosa del colágeno orientado en una dirección vertical (1). Se observan estructuras laminares anchas que podrían facilitar y orientar la migración y la diferenciación en una dirección condrocital de las células progenitoras o de los condrocitos eventualmente cargados sobre el scaffold (2). También en este caso las interfaces colágeno-gradiente HA/colágeno parecen estar bien conectadas (3).

En la figura 7 la observación de la estructura porosa colagénica del prototipo D' está dada con una gran amplificación. A partir de la figura 7, se observa una mayor compactabilidad con respecto al resto de los prototipos (1). La porosidad es de dimensiones claramente menores que en las estructuras analizadas con anterioridad. También en este caso la interfaz entre las dos capas es mucho más compacta confiriendo una reducida altura del scaffold (2).

El agregado de plastificantes o agentes de reticulación durante la etapa de preparación del scaffold permite conferir una mayor estabilidad a su estructura.

El requerimiento de estabilidad para un scaffold a base de colágeno, que puede ser dimensionado o no, representa el elemento determinante.

En esta etapa de desarrollo, como agente capaz de aumentar las propiedades hidrofílicas y plásticas del manufacturado se han empleado ácido hialurónico con un peso molecular medio, un agente de reticulación perteneciente a la familia de los bis-epóxidos (diglicidil éter) y vapores glutaraldehído o sus derivados.

Los resultados preliminares obtenidos a través de pruebas de "manipulación" y observaciones ESEM demuestran que el mejor modo para la estabilización del colágeno se logra por reticulación con 1,4-butanediol-diglicidil éter (BDDGE). A continuación se describe una parte experimental que se refiere a pruebas in vivo e in vitro, llevadas a cabo para controlar el comportamiento del scaffold osteocondral de la presente invención.

La finalidad de los experimentos era la de controlar el comportamiento in vivo de una configuración de scaffold condral y osteocondral con una configuración con dos (sustituto cartilaginoso) y tres gradientes (sustituto osteocartilaginoso) respectivamente, sometidos a una reticulación con BDDGE (1,4-butanediol-diglicidil éter) en la etapa de preparación.

Los modelos de animales seleccionados fueron:

1) implante en un ratón desnudo de la configuración de tres gradientes del scaffold (scaffold osteocondral) cargada con células progenitoras estromales de oveja (BMSC) derivadas de médula ósea;

2) implante de las dos configuraciones del scaffold como consecuencia de una lesión cartilaginosa y osteocartilaginosa en el cóndilo femoral de un caballo.

\vskip1.000000\baselineskip

1) Implante del scaffold cargado con BMSC

La finalidad del presente estudio era la de controlar la nueva formación de hueso y cartílago del scaffold de tres fases o con una configuración II (gradiente 1 colágeno tipo I, gradiente 2 relación colágeno tipo I/hidroxilapatita 70%/30%, gradiente 3 relación colágeno tipo I/hidroxilapatita 30%/70% cargado con células progenitoras estromales de oveja (BMSC) provenientes de una extracción de sangre medular. El scaffold fue implantado en un sitio intramuscular (no esquelético o sitio heterotópico) en un ratón desnudo inmune-deprimido con la finalidad de controlar la diferenciación de tejido dentro de los gradientes del scaffold osteocondral.

1) Diferenciación celular en sentido óseo dentro del gradiente 3;

2) Diferenciación celular en sentido cartilaginoso en el gradiente 1 que se compone exclusivamente de colágeno.

\vskip1.000000\baselineskip

2) Implante del scaffold como consecuencia de una lesión cartilaginosa y osteocartilaginosa en un caballo

La finalidad del presente estudio in vivo era la de controlar en dos animales, después de la lesión cartilaginosa y osteocartilaginosa en la epifisis distal del tercer metacarpo (nudillo) de un caballo, el comportamiento de las configuraciones con 2 y 3 gradientes del scaffold preparado con un proceso de nucleación de nanopartículas de hidroxilapatita sobre fibras colagénicas sometidas a un proceso de reticulación mediante BDDGE (1,4-butanediol-diglicidil éter). Las dos formas del scaffold fueron representadas por: configuración I o scaffold de dos fases (2 gradientes) cuyo uso planeado es un scaffold sustituto cartilaginoso para el tratamiento de lesiones condrales y configuración II o scaffold de tres fases (3 gradientes) cuyo uso planeado es un scaffold sustituto osteocartilaginoso para el tratamiento de lesiones de gran magnitud o lesiones osteocondrales profundas.

Se llevaron a cabo las siguientes evaluaciones:

1) estabilidad del scaffold (fijación, permanencia en la sede del implante) a través de control artroscópico después de tres meses;

2) restablecimiento del manto cartilaginoso extraído con anterioridad, análisis radiológico e histológico de las biopsias tomadas a una distancia de al menos seis meses a partir de la fecha del implante.

\vskip1.000000\baselineskip

Procedimiento quirúrgico

Después de un período de 7 días de aclimatación y tratamiento farmacológico preoperatorio, los 2 animales fueron sometidos a un control radiográfico de las articulaciones para excluir la presencia de cualquier alteración patológica. Los caballos no recibieron alimento durante las 12 horas precedentes a la operación.

Al momento de la cirugía, los animales fueron anestesiados con una solución compuesta por 5% de glucosa glicérico de guayacol con 3 g de tiopental de sodio. El mantenimiento de la anestesia fue garantizado a través de halotano en una mezcla oxigenada.

Después de haber colocado los animales en decúbito lateral en ambos miembros anteriores, se ha bloqueado la circulación con un vaciado vascular del carpo. En condiciones estériles, sobre la cara dorsal del nudillo, en correspondencia del extremo distal del metacarpo III* (figura 10) se ha efectuado una miniartrotomía, lateralmente en una posición superior con respecto al tendón del músculo extensor dorsal del dígito. En el nudillo decúbito, la miniartrotomía fue ejecutada medial al mencionado tendón.

Colocando el nudillo de flexión quedaron expuestos la parte distal del cóndilo lateral (nudillo superior) y el cóndilo medial (nudillo decúbito) (figura 11). Por medio de una apropiada fresa motorizada se ha efectuado un defecto circular del cartílago articular, con una dimensión de 1,0 cm^{2} hasta la completa exposición del hueso subcondral por una profundidad de aproximadamente 5 mm en caso de lesión condral y de 8-10 mm en caso de lesión osteocondral. En ambos casos, se realizaron microabrasiones (figura 12). Las dimensiones de tales lesiones aseguran el alojamiento de scaffolds en sus configuraciones.

Los scaffolds fueron colocados dentro de los orificios y mantenidos en la sede por unos pocos segundos a través de una presión digital hasta haber alcanzado un abultamiento, que aseguró su fijación a las paredes de las lesiones (figura 13).

Al final de la operación, las suturas de las incisiones quirúrgicas fueron llevadas a cabo mediante niveles de la siguiente manera: suturas por puntos separados de la cápsula articular con ácido poliglicólico Nº 0, sutura continua del vendaje digital con ácido poliglicólico Nº 00 y sutura por puntos separados de la dermis con nylon Nº 0.

Luego el procedimiento fue repetido de manera idéntica sobre las restantes porciones metacarpales después de haber invertido el decúbito del caballo. En total para cada animal se han llevado a cabo 4 miniartrotomías y el implante de 4 scaffolds (dos scaffolds condrales, configuración I, y dos scaffolds osteocondrales, configuración II). Al final de la operación se aplicaron vendajes semirrígidos desde el casco hasta el carpo. Más adelante está descrito el modelo quirúrgico y de tratamiento para ambos animales.

En la figura 8 se exhibe un cóndilo izquierdo:

A. Lesión lateral condral más microabrasiones con posicionamiento de dispositivo de 2 gradientes (sustituto cartilaginoso, configuración I).

B. Lesión medial osteocondral más sangrado con posicionamiento de scaffold de 3 gradientes (sustituto osteocartilaginoso, configuración II).

En la figura 9 se exhibe un cóndilo derecho:

C. Lesión medial osteocondral más sangrado con posicionamiento de scaffold de 3 gradientes (sustituto osteocartilaginoso).

D. Lesión lateral condral más microabrasiones con posicionamiento de dispositivo de 2 gradientes (sustituto cartilaginoso).

Al final de la intervención quirúrgica, los animales fueron sometidos a un tratamiento antibiótico y farmacológico antiinflamatorio. Al despertar, se le permitió la inmediata normal deambulación con carga.

\vskip1.000000\baselineskip

Resultados 1) Implante del scaffold cargado con BMSC Análisis histológico después de 8 semanas

Los animales fueron sacrificados después de 8 semanas, quitando el sitio del implante cuidadosamente para su proceso mediante tinción con hematoxilina/eosina. Las observaciones microscópicas hicieron notar una nueva formación de hueso dentro del gradiente con un componente preponderante de hidroxilapatita (gradiente 3), mientras que no se ha observado ningún exceso de hueso en la porción colagénica (gradiente 1) destinado a una nueva formación cartilaginosa (figura 14).

Los datos demuestran que la hidroxilapatita puede jugar un papel de "imprimación", es decir está en condiciones de activar el proceso de diferenciación celular, en sentido óseo, en la capa más profunda, mientras que dentro de las capas más superficiales la composición colagénica del scaffold conduce la diferenciación celular en sentido cartila-
ginoso.

\vskip1.000000\baselineskip

2) Implante del scaffold como consecuencia de una lesión cartilaginosa y osteocartilaginosa en un caballo Segunda observación artroscópica

El control astroscópico fue llevado a cabo después de tres meses a contar desde la fecha de la primera operación. Las imágenes hicieron notar, dentro del sitio de la lesión condral y osteocondral de ambos miembros anteriores, una nueva formación de tejido conectivo que a la vista resultó ser de buena consistencia, sin embargo no se pudo distinguir de un tejido fibroso. En algunas zonas de la superficie de la operación, se evidenciaron vestigios del scaffold. A partir de las observaciones estroboscópicas llevadas a cabo en el animal n. 2 en correspondencia de la lesión lateral, no se evidenció una reacción de tipo inflamatorio y tampoco un desplazamiento del dispositivo (figura 15).

\vskip1.000000\baselineskip

Evaluaciones macroscópicas al momento de la eutanasia

Los animales fueron matados en un intervalo promedio de 214 \pm 11 días. Los animales fueron sacrificados a través de una inyección intravenosa de una solución Tanax, mediante administración previa de anestesia general.

Para cada animal, se removieron 20 cm de ambos miembros en una porción proximal con respecto a la articulación (nudillo) donde se realizaron las operaciones quirúrgicas.

Se expusieron cuidadosamente ambos cóndilos de las articulaciones preservando la superficie de la operación en las zonas mediales y laterales. Se evaluó microscópicamente el tejido de nueva formación en las zonas de implante de los scaffolds. En las áreas de implante en las zonas mediales (scaffold osteocartilaginoso), se evidenció una buena nueva formación de tejido conectivo vivaz, con cicatrización del tejido hasta el nivel de cartílago sano. En la superficie del cartílago articular, correspondiente al implante cartilaginoso (cóndilos laterales), se ha observado la misma situación que en el cóndilo medial con formación del tejido conectivo hasta la completa recomposición del orificio
(figura 16).

En la figura 14 se exhibe el análisis histológico después de 8 semanas (tinción de hematoxilina/eosina). En correspondencia del gradiente 1 de sólo colágeno se encontró la presencia de tejido fibroso. En la parte más profunda, en correspondencia del gradiente 3 con componente preponderante hidroxilapatita, se nota la presencia de hueso de nueva formación.

La figura 15 se refiere a la segunda observación artroscópica.

La figura 16 se refiere a la segunda observación artroscópica del animal n. 1. El recrecimiento del tejido conectivo en las lesiones condrales laterales A y D y en las lesiones mediales osteocondrales B y C.

La figura 17 se refiere al análisis histológico con una tinción de azul toluidino con diferentes amplificaciones del implante condral (animal 1).

Las imágenes histológicas exhibidas (figuras 17 de A a H) se refieren al animal n. 1, lesión lateral correspondiente al implante condral.

Las zonas de operación fueron extraídas cuidadosamente, recolectando también una porción de cartílago sano que circundaba la lesión.

Cada fracción recogida fue dividida en dos partes y se realizó un corte en el dispositivo microtome desde el centro hasta la periferia y se ha teñido con azul toluidino para las observaciones microscópicas.

Las observaciones microscópicas hicieron notar una gran formación de hueso en la parte inferior y más profunda del scaffold condral. La capa colagénica superficial fue colonizada por tejido fibrocartilaginoso distinguible del tejido cartilaginoso sano y no ha sido hallada presencia de tejido óseo en exceso en su interior.

La muestra analizada, de aproximadamente 1 cm^{3}, ha sido seleccionada a nivel de implante e incluye el área circunstante del cartílago articular. La muestra ha sido decalcificada e incluida en parafina. Las secciones han sido cortadas en correspondencia de un espesor de aproximadamente 10 \mum y teñidas con azul toluidino.

Las fotografías se refieren a los dos extremos del implante, es decir las zonas de interés en correspondencia de la interfaz cartílago articular sano-implante.

Es posible notar las zonas residuales de cartílago articular adyacentes a un tejido de nueva formación a partir del aspecto aparente de fibrocartílagos.

El mismo implante parece estar formado superficialmente con fibrocartílago y tejido conectivo fibroso sin ningún vestigio de tejido atribuible morfológicamente a un tejido articular y profundo de tejido óseo.

El tejido óseo de nueva formación (visible en A y B) se presenta bien integrado con el hueso circunstante, el tejido cartilaginoso presenta una línea de demarcación evidente (flecha) que marca el paso del cartílago articular existente al fibrocartílago de nueva formación.

Claims (19)

1. Estructura multicapa (1) que incluye:

- una primera capa superior (2) que se compone de una matriz orgánica que se compone de colágeno; y

- una o varias capas inferiores (3, 4, ... 10) que se componen de una matriz compuesta que incluye hidroxilapatita y colágeno;

donde dicha capa superior (2) está en contacto directo con una primera capa inferior (3); y

donde dicha primera capa inferior (3) se compone de una matriz compuesta que incluye colágeno en una cantidad en peso comprendida entre el 95 y el 75% e hidroxilapatita en una cantidad en peso comprendida entre el 5 y el
25%.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Estructura multicapa según la reivindicación 1, que además comprende una segunda capa inferior (4) formada por una matriz compuesta que incluye colágeno en una cantidad en peso comprendida entre el 75 y el 45% e hidroxilapatita en una cantidad en peso comprendida entre el 25 y el 55%.

3. Estructura multicapa según la reivindicación 2, que además comprende una tercera capa inferior (5) formada por una matriz compuesta que incluye colágeno en una cantidad en peso comprendida entre el 45 y el 25% e hidroxilapatita en una cantidad en peso comprendida entre el 55 y el 75%.

4. Estructura multicapa según la reivindicación 2, que además comprende una última capa inferior (10) formada por una matriz compuesta que incluye colágeno en una cantidad en peso menor que el 5% e hidroxilapatita en una cantidad en peso complementaria para alcanzar el 100%.

5. Estructura multicapa según una cualquiera de las precedentes reivindicaciones de 1 a 4, donde hay un gradiente de colágeno que se extiende desde la capa superior (2), en la cual hay 100% de colágeno, hasta la primera capa inferior (3), en la cual hay una cantidad de colágeno que va del 95 al 75% hasta llegar a una última capa inferior (10), en la cual la cantidad de colágeno es menor que el 5%.

6. Estructura multicapa según una o varias de las reivindicaciones de 1 a 5, donde dicha hidroxilapatita en dicha matriz compuesta es nucleada directamente sobre fibras colagénicas.

7. Estructura multicapa según una o varias de las precedentes reivindicaciones, donde el colágeno es seleccionado a partir de: colágeno de tipo I, tipo II, tipo VI o sus mezclas.

8. Sustituto cartilaginoso que incluye una estructura multicapa según una o varias de las reivindicaciones de 1 a 7.

9. Sustituto osteocondral que incluye una estructura multicapa según una o varias de las reivindicaciones de 1 a 7.

10. Sustituto según la reivindicación 8 o 9, donde la estructura multicapa representa un scaffold para la fijación in situ y la diferenciación de las células mesenquimales.

11. Sustituto según la reivindicación 8 o 9, donde la estructura multicapa es cargada ex-vivo con un concentrado a partir de sangre modular, con un concentrado plaquetario (PRP), con factores de crecimiento o factores capaces de facilitar el trofismo y la diferenciación celular, tales como TGF, EGF, BMP y otros factores.

12. Sustituto según la reivindicación 8 o 9, donde la estructura multicapa es cargada ex-vivo con células mesenquimales que son indiferenciadas o mantenidas en cultivo por un período de tiempo requerido para la multiplicación y/o la diferenciación en células progenitoras de los osteoblastos y condrocitos.

13. Sustituto según la reivindicación 8 o 9, donde la estructura multicapa es cargada con sustancias farmacológicamente activas seleccionadas a partir de: corticosteroides antiinflamatorios, FANS, inmunosupresores, antibióticos, antiblásticos, antiproliferativos y antivirales.

14. Proceso para la preparación de una estructura multicapa según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7 que incluye al menos una etapa en la cual una primera capa superior (2) que se compone de una matriz orgánica compuesta por colágeno está asociada con al menos una capa inferior (3, 4, ..., 10) formada por una matriz compuesta que incluye hidroxilapatita y colágeno.

15. Sustituto según una o varias de las reivindicaciones de 8 a 13, donde la estructura multicapa es reticulada con ácido hialurónico, una de sus sales o un derivado del mismo; preferentemente, con un peso molecular comprendido entre 10.000 y 2.000.000 kd.

16. Sustituto según una o varias de las reivindicaciones de 8 a 13, donde la estructura multicapa es reticulada con BDDGE o un derivado de este último.

17. Sustituto según una o varias de las reivindicaciones de 8 a 13, donde la estructura multicapa es reticulada con glutaraldehído, un derivado de este último o con un reticulador seleccionado a partir de bis-epóxidos (diglicidil éter).

18. Sustituto según una o varias de las reivindicaciones de 8 a 17, en forma liofilizada o secada.

19. Sustituto según una o varias de las reivindicaciones de 8 a 17, en forma esterilizada.