ES2336575T3 - Polipeptidos de fusion glp-1 (peptido-1 similar al glucagon) con resistencia aumentada a la peptidasa. - Google Patents

Abstract

Péptido de fusión que comprende como componente (I) N-terminal: i). GLP-1 (7-37) de SEQ ID NO: 1 o una secuencia funcional que ejerce los efectos biológicos de GLP-1 como la hormona incretina, su acción antiapoptótica o sus propiedades neurotróficas y que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con GLP-1 (7-37), o ii). un péptido GLP-1 modificado que consiste en la secuencia de aminoácidos de fórmula II: (II)Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23- Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37 donde Xaa7 es L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, 3-hidroxi-histidina, homohistidina, N-acetil-histidina, a-fluorometil-histidina, a-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina o 4-piridlalanina; Xaa8 es Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Lys, Aib, ácido (1-aminociclopropil)carboxílico, ácido (1-aminociclobutil)carboxílico, ácido (1-aminociclopentil)carboxílico, ácido (1-aminociclohexil)carboxílico, ácido (1-aminocicloheptil)carboxílico o ácido (1-aminociclooctil)carboxílico; Xaa16 es Val o Leu; Xaa18 es Ser, Lys o Arg; Xaa19 es Tyr o Gln; Xaa20 es Leu o Met; Xaa22 es Gly, Glu o Aib; Xaa23 es Gln, Glu, Lys o Arg; Xaa25 es Ala o Val; Xaa26 es Lys, Glu o Arg; Xaa27 es Glu o Leu; Xaa30 es Ala, Glu o Arg; Xaa33 es Val o Lys; Xaa34 es Lys, Glu, Asn o Arg; Xaa35 es Gly o Aib; Xaa36 es Arg, Gly o Lys o amida o está ausente; Xaa37 es Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, amida o está ausente, y como componente (II) una secuencia peptídica C-terminal de al menos 9 aminoácidos y que contiene una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 22 (RRDFPEEVAI) o una secuencia que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 22, y que otorga una resistencia mejorada a la inactivación de DPP-IV del péptido de fusión, donde, el N-terminal del péptido de fusión es el componente (I) como tal, o una secuencia peptídica señal, que se fusiona a través de una secuencia de segmentación por proteasa al N-terminal del componente (I), o un péptido señal, que se fusiona sin la secuencia de segmentación por proteasa entre el N-terminal del componente (I), o una secuencia líder, que se fusiona a través de una secuencia de segmentación por proteasa al N-terminal del componente (I), siendo heterólogo al preproglucagón.

Description

Polipéptidos de fusión GLP-1 (péptido-1 similar al glucagón) con resistencia aumentada a la peptidasa.

La presente invención se refiere a nuevos péptidos de fusión GLP-1 que tienen terminales C extendidos, son resistentes a la inactivación por la endopeptidasa IV, pueden ser expresados a altos niveles en células animales transformadas y son útiles, por ejemplo, en el tratamiento de la diabetes de tipo 2.

El gen de glucagón es un gen bien estudiado, véase por ejemplo White, J.W. y col., 1986, Nucleic Acid Res. 14(12) 4719-4730. La molécula preproglucagón es una molécula precursora de alto peso molecular que se sintetiza en las células alfa pancreáticas y en el yeyuno y en las células L del colon. El preproglucagón es una prohormona de 180 aminoácidos de longitud y su secuencia contiene, además de glucagón, dos secuencias de estructura relacionada: péptido-1 similar al glucagón (GLP-1) y péptido-2 similar al glucagón (GLP-2). En la molécula preproglucagón, entre GLP-1 y GLP-2, se sitúa una secuencia de 17 aminoácidos (o mejor una secuencia de 15 aminoácidos más el sitio de segmentación RR C-terminal), el péptido interventor 2 (IP2). La secuencia IP2 (ubicada entre GLP-1 y -2 en la molécula precursora) normalmente es segmentada proteolíticamente después del aminoácido 37 de GLP-1. Por tanto, el módulo preproglucagón se segmenta en varios péptidos, dependiendo de la célula y el ambiente, incluyendo GLP-1 (1-37), un péptido de 37 aminoácidos en su forma no procesada. Generalmente, este procesamiento tiene lugar en el páncreas y el intestino. La secuencia de GLP-1 (1-37) puede además procesarse proteolíticamente en un GLP-1 (7-37) activo, forma procesada de 31 aminoácidos, o en GLP-1 (7-36) amida. En consecuencia, la designación GLP-1 (7-37) indica que el fragmento en cuestión comprende los residuos aminoácidos del (e incluyendo) número 7 a (e incluyendo) número 37 cuando se cuenta a partir del extremo N-terminal del péptido parental GLP-1. La secuencia de aminoácidos de GLP-1 (7-36) amida y de GLP-1 (7-37) es la dada en la fórmula I:

(I),His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu- Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-X

donde se muestra GLP-1 (7-36) amida cuando X es NH_{2} y GLP-1 (7-37) cuando X es Gly-OH.

El GLP-1 es una hormona intestinal y es el agente insulinotrópico endógeno más potente, con acciones que incluyen estimular la adenilato-ciclasa y la actividad proteína-quinasa en las células beta. Fisiológicamente, junto con el polipéptido inhibidor gástrico del intestino superior, funciona como una hormona de incretina, reduciendo el nivel de glucosa en sangre. En consecuencia, el GLP-1, secretado en respuesta a la ingesta de alimentos, tiene diversos efectos, por ejemplo en el estómago, hígado, páncreas y cerebro, que funcionan de común acuerdo para regular el azúcar en sangre. En consecuencia, el péptido similar al glucagón GLP-1 (7-36) amida, y su análogo no amidado GLP-1 (7-37) han atraído considerable interés gracias a sus potentes acciones en el metabolismo de los carbohidratos y a su aplicabilidad potencial en el tratamiento de la diabetes, incluyendo la diabetes de tipo 2. La diabetes de tipo 2 se caracteriza por su resistencia a la insulina, ya que las células no responden adecuadamente cuando está presente la insulina. Se trata de un problema más complejo que en caso de la diabetes de tipo 1. La diabetes de tipo 2 puede pasar desapercibida durante años en un paciente antes de su diagnóstico, ya que los síntomas son típicamente más leves (no aparece cetoacidosis) y pueden ser esporádicos. Sin embargo, se pueden derivar severas complicaciones de la diabetes de tipo 2 no advertida, incluyendo insuficiencia renal y enfermedad cardiaca coronaria. Esto lleva a una mayor morbilidad y mortalidad.

La vida media en suero del GLP-1 (7-36) amida o del GLP-1 (7-37) es corta. El péptido es segmentado por la dipeptidil-peptidasa IV (DPP-IV) entre los residuos 8 y 9. El péptido segmentado es inactivo. Así, el GLP-1, administrado exógenamente, tiene una vida extremadamente corta y una utilidad limitada en aplicaciones terapéuticas.

Se han llevado a cabo diversos intentos por sintetizar análogos estabilizados (contra DPP-IV) de GLP-1 (GLP-1 (7-37)) de origen natural. En particular, el residuo 8, el cual in vivo es Ala, fue reemplazado por otro residuo, por ejemplo Gly, Ser o Thr (Burcelin, R., y col. (1999) Metabolism 48, 252-258). El análogo Gly8 o G8 ha sido extensamente probado, tanto como molécula sintetizada como producido por líneas celulares genéticamente manipuladas para secretar el polipéptido mutante (Burcelin, R., y col. (1999) Annals of the New York Academy of Sciences 875: 277-285). Varias otras modificaciones se han introducido en GLP-1 (7-37) para incrementar su estabilidad in vivo sin comprometer su actividad biológica. Sin embargo, todos estos enfoques no lograron ningún resultado terapéutico significativo, debido a los considerables problemas implicados.

La WO 02/46227 describe proteínas de fusión GLP-1 que comprenden compuestos similares al glucagón-1 fusionados a proteínas para ampliar adecuadamente la vida media in vivo de los péptidos. En particular, la WO 02/46227 describe una proteína de fusión GLP-1 con albúmina o inmunoglobulina. Según la WO 02/46227, dichas proteínas se pueden utilizar para tratar la diabetes mellitus no insulinodependiente, así como una variedad de otras condiciones. Sin embargo, la WO 02/46227 no describe proteínas de fusión que comprendan como componente (I) GLP-1 N-terminal (7-35, 7-36 ó 7-37) o un derivado del mismo y como componente (II) una secuencia peptídica C-terminal que contenga una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO 22 (RRDFPEEVAI).

Del mismo modo, la US 2003/0221201 describe proteínas de fusión de transferrina y GLP-1. Similarmente, la US 2003/0195154 describe una proteína de fusión de GLP-1 y transtiretina como colaboradores de la fusión. Sin embargo, no se describen o sugieren más proteínas de fusión GLP-1 en la US 2003/0221201 o la US 2003/0195154, en particular ningún posible colaborador de fusión para GLP-1, capaz de estabilizar el GLP-1 in vivo.

La WO 99/46283 describe un conjugado peptídico farmacológicamente activo que comprende una secuencia peptídica farmacológicamente activa (X), como GLP-1, y una secuencia peptídica estabilizadora (Z) de 4 a 20 residuos aminoácido, que se enlazan de forma covalente a la secuencia peptídica farmacológicamente activa (X). La secuencia peptídica estabilizadora (Z) puede ser, por ejemplo, las secuencias Lys_{p}-Xaa_{q} o Xaa_{p}-Lys_{q}, en las que p y q son números enteros del rango 1 a 14, con la condición de que p+q se encuentre en el rango 3-15, y cada Xaa se selecciona independientemente de entre el grupo compuesto por Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Arg, His, Orn, ácido 2,4-diaminobutanoico, ácido 2,3-diaminopropanoico y Met, particularmente secuencias peptídicas cortas de fórmulas Lys_{3}-Glu_{3} o Glu_{3}-Lys_{3}. La WO 99/46283 no describe proteínas de fusión que comprendan como componente (I) GLP-1 N-terminal (7-35, 7-36 ó 7-37) o un derivado del mismo y como componente (II) una secuencia peptídica C-terminal que contenga una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO 22 (RRDFPEEVAI).

La WO 03/058203 describe un péptido GLP-1 acoplado a un C-terminal amplio que proporciona una estabilidad aumentada. Este C-terminal amplio comprende al menos 6 aminoácidos, preferentemente de 7 a 9 aminoácidos. La WO 03/058203 no describe proteínas de fusión a GLP-1 que comprendan una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO 22 (RRDFPEEVAI) como terminal-C amplio.

La US 2004/0146985 describe una proteína de fusión a GLP-1 (7-37) que contiene múltiples copias del péptido GLP-1 (7-37) para producir este agente terapéuticamente a gran escala. La US 2004/0146985 no describe una proteína de fusión a GLP-1 (7-37) que comprenda como componente (I) GLP-1 N-terminal (7-35, 7-36 ó 7-37) o un derivado del mismo y como componente (II) una secuencia peptídica C-terminal que contenga una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO 22 (RRDFPEEVAI).

La US 5.861.284 describe péptidos de fusión de GLP-1 (7-37) y una secuencia de aminoácidos procedente del factor de crecimiento de fibroblastos como terminal-C. La invención de la US 5.861.284 se dirige particularmente a la producción de péptidos exentos de cisteína, producidos por una proteína de fusión que comprende una proteína con cisteína en su extremo N-terminal y un péptido exento de cisteína ligado al extremo N-terminal y posteriormente la segmentación del péptido exento de cisteína. La US 5.861.284 no describe péptidos de fusión de GLP-1 (7-37) y una secuencia peptídica que contenga una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO 22 (RRDFPEEVAI).

Una revisión de Kieffer y col., (Endocrine Reviews (1999) Vol. 20, Nº 6, pp. 876-913) y una revisión de Drucker y col., (Mol. Endocrinol. (2003) Vol. 17, Nº 2, pp. 161-171) describen una secuencia de aminoácidos del proglucagón en la que en este péptido de origen natural se fusionan el péptido GLP-1, IP-2 y el péptido GLP-2. No se describen otros péptidos de fusión de GLP-1 (7-37, 7-36 ó 7-35).

Además, una revisión de Perry y col. (Current Alzheimer's Research, 2005, 2, 377-385) se refiere a la relación entre la vía del receptor GLP y la enfermedad de Alzheimer. No se describen en Perry y col., (2005) péptidos de fusión de GLP-1 de acuerdo con la presente invención.

La WO 98/08871 describe varios derivados de GLP-1, en particular un derivado de GLP-1 en el que al menos un aminoácido de GLP-1 tiene unido un sustituyente lipofílico. Sin embargo, la WO 98/08871 no describe péptidos de fusión a GLP-1 de GLP-1 (7-37, 7-36 ó 7-35) ni una extensión peptídica del C-terminal de GLP-1.

En la WO/9953064, Thorens, B. descubre una estrategia para crear un casete de expresión de GLP-1 multimérico que puede ser incorporado en una variedad de tipos de células que son líneas de células inmortalizadas públicamente disponibles y dividir cultivos de células primarias. Ejemplos incluyen neuroesferas responsivas EGF, células madre progenitoras neurales responsivas a bFGF del sistema nervioso central de mamíferos, mientras que un ejemplo de trabajo usa células BHK de riñón de hámster bebé. Se explica que las células transfectadas implantadas han sido usadas para tratar con éxito ratones diabéticos, permitiendo un control de glucosa equivalente sustancialmente a los controles de los no diabéticos. Sin embargo, estas técnicas no cumplen con los requisitos de un tratamiento que se administrará rutinariamente a pacientes con diabetes.

Otro enfoque para estabilizar el nivel de glucosa de forma exógena se basa en una nueva clase de medicinas conocidas como miméticos de incretina, bajo investigación para el tratamiento de la diabetes tipo 2. La exenatida (Byetta®) es una versión sintética de un compuesto natural encontrado en la saliva del lagarto monstruo de Gila. En pruebas clínicas, un mimético de incretina (exenatida) ha demostrado reducir el azúcar en sangre y mejorar los marcadores de la función de las células beta. Sin embargo, la exenatida muestra sólo ciertos efectos del péptido-1 similar al glucagón (GLP-1) de la hormona incretina humana.

En resumen, actualmente no existe una terapia efectiva para la diabetes tipo 2 disponible que permita reducir el nivel de glucosa en sangre en base al GLP-1, en otras palabras proporcionar una terapia que refleje el espectro completo de los efectos benéficos conocidos para GLP-1, por ejemplo su actividad en concentraciones fisiológicas para reducir eficazmente la velocidad de entrada de los nutrientes en la circulación mediante una reducción de la velocidad de vaciado gástrico en sujetos obesos o su actividad estimuladora de insulina. Por tanto, un objeto de la presente invención consiste en proporcionar moléculas peptídicas a base de GLP-1 que sean biológicamente activas y resistentes a la degradación proteolítica.

La presente invención se refiere a un péptido de fusión que comprende, como componente (I) N-terminal,

i).

el GLP-1 (7-37) de SEQ ID NO: 1 o una secuencia funcional que ejerce los efectos biológicos de GLP-1 como hormona incretina, su acción antiapoptótica o sus propiedades neurotróficas y que tiene al menos una identidad de secuencia del 80% con GLP-1 (7-37), o

ii).

un péptido GLP-1 modificado que consiste en la secuencia de aminoácidos de fórmula II:

\hskip1.3cm Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala- {}\hskip1.1cm Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37,

donde Xaa7 es L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, 3-hidroxi-histidina, homohistidina, N-acetil-histidina, a-fluorometil-histidina, a-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina o 4-piridilalanina; Xaa8 es Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Lys, Aib, ácido (1-aminociclopropil)carboxílico, ácido (1-aminociclobutil)carboxílico, ácido (1-aminociclopentil)carboxílico, ácido (1-aminociclohexil)carboxílico, ácido (1-aminocicloheptil)carboxílico o ácido (1-aminociclooctil)carboxílico; Xaa16 es Val o Leu; Xaa18 es Ser, Lys o Arg; Xaa19 es Tyr o Gln; Xaa20 es Leu o Met; Xaa22 es Gly, Glu o Aib; Xaa23 es Gln, Glu, Lys o Arg; Xaa25 es Ala o Val; Xaa26 es Lys, Glu o Arg; Xaa27 es Glu o Leu; Xaa30 es Ala, Glu o Arg; Xaa33 es Val o Lys; Xaa34 es Lys, Glu, Asn o Arg; Xaa35 es Gly o Aib; Xaa36 es Arg, Gly o Lys o amida o está ausente; Xaa37 es Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, amida o está ausente.

y, como componente (II), una secuencia peptídica C-terminal de al menos 9 aminoácidos que contiene una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 22 (RRDFPEEVAI) o una secuencia que tiene una identidad de secuencia del 80% con la SEQ ID NO: 22, y que otorga una resistencia mejorada a la inactivación de DPP-IV del péptido de fusión.

donde, el N-terminal del péptido de fusión es el componente (I) como tal, o una secuencia peptídica señal, que se fusiona vía una secuencia de segmentación de proteasa al N-terminal del componente (I), o un péptido señal, que se fusiona sin la secuencia de segmentación de proteasa entre el N-terminal del componente (I), o una secuencia líder, que se fusiona a través de una secuencia de segmentación de proteasa al N-terminal del componente (I), caracterizado porque el péptido señal y la secuencia líder son heterólogos al preproglucagón.

Preferentemente, la presente invención se refiere a un péptido de fusión tal como se define anteriormente en el que el componente (I) es GLP-1 (7-35) o GLP-1 (7-36).

La presente invención se basa en el descubrimiento de que el péptido de la invención resultante está protegido contra la degradación proteolítica in vivo, principalmente debido a la actividad endopeptidasa IV proteolítica. El péptido de la invención que tiene al menos dos componentes (I) y (II), tales como se han definudo anteriormente, exhibe la actividad biológica de GLP-1 y, simultáneamente, confiere estabilidad al GLP-1 como componente (I) debido a un alargamiento C-terminal.

El término "péptido de la invención" tal como se emplea aquí es un péptido de fusión como el aquí definido, una variante, un análogo, un fragmento o un derivado del mismo, incluyendo combinaciones, por ejemplo, un fragmento, análogo o variante derivatizada de un péptido de fusión. El término "péptido GLP-1" tal como se emplea aquí significa GLP-1 (7-35, 36 ó 37), en tanto que "péptido GLP-1 modificado" pretende significar cualquier análogo de GLP-1, un derivado de GLP-1, una variante de GLP-1 o un fragmento de GLP-1, incluyendo un fragmento, análogo o variante derivatizada de GLP-1(7-35, 36 ó 37), el cual puede aparecer en cualquier componente (I) y (III) del péptido de la invención. El término "péptido GLP-2" tal como se emplea aquí significa GLP-2 (1-33, 34 ó 35), en tanto que "péptido GLP-2 modificado" pretende significar cualquier análogo, fragmento o variante de GLP-2, un derivado de GLP-2 o un derivado de un análogo de GLP-2, incluyendo un fragmento, análogo o variante derivatizada de GLP-2 (1-33, 34 ó 35). Las variantes, análogos, fragmentos y derivados se catalogan como modificaciones de la secuencia no modificada, por ejemplo GLP-1 (7-35, 36 ó 37) o GLP-2 (1-33, 34 ó 35). Dentro del significado de la presente invención, cualquier variante, análogo, fragmento o derivado tiene que ser funcional, por ejemplo, tiene que ejercer el mismo efecto biológico o similares efectos biológicos que el péptido GLP-1 no modificado.

El péptido de la invención es un péptido de fusión tal como se ha definido anteriormente o una variante, análogo, fragmento o derivado del mismo, pudiendo contener el componente (I) una secuencia que tenga al menos un 80%, preferentemente al menos un 85% y en especial al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1. La SEQ ID NO: 1 representa la secuencia de aminoácidos nativa de GLP-1 (7-37) (31 aminoácidos de longitud), la cual es estrictamente conservada entre mamíferos.

El segundo componente (componente (II)) tal como se ha definido anteriormente del péptido de fusión de acuerdo con la invención contiene típicamente una secuencia peptídica que forma una estructura de giro-\beta. Una estructura de giro-\beta es un elemento de estructura secundaria típico de proteínas o péptidos. Está formado típicamente por cuatro aminoácidos, los cuales invierten la dirección de la dirección de la cadena del esqueleto peptídico o proteico. La secuencia de aminoácidos del componente (II) contiene al menos nueve aminoácidos y contiene por lo menos un residuo de prolina en su secuencia. Los residuos de prolina son aminoácidos comunes dentro del giro-\beta que forman la secuencia de aminoácidos tetramérica. El residuo de prolina está común y típicamente localizado en la posición 2 ó 3, preferentemente en la 2, de la secuencia de giro-\beta tetramérica que se presenta en el componente (II) del péptido de fusión.

Tal como se ha definido anteriormente, en el componente (II) del péptido de fusión de la invención se encuentra una secuencia peptídica que contiene una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 22 (RRDFPEEVAI) (todas las secuencias peptídicas dadas en el código de una letra) o una secuencia que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 22. La SEQ ID NO: 22 es una secuencia parcial de la secuencia de IP-2 (péptido interventor 2) de longitud completa, que contiene los 10 aminoácidos N-terminales de la secuencia de IP-2 de longitud completa de 15 aminoácidos de largo. IP-2 es un ejemplo preferente de una secuencia peptídica que contiene un giro-\beta. En consecuencia, otras secuencias preferentes más fuertes que están contenidas en el componente (II) son secuencias de aminoácidos parciales de mayor longitud que IP-2, tales como la secuencia de 14 aminoácidos N-terminal que se presenta en humanos (SEQ ID NO: 23 (RRDFPEEVAIVEEL) o su contraparte murina (SEQ ID NO: 24 (RRDFPEEVAIAEEL), o una secuencia que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con las SEQ ID Nos: 23 ó 24. Especialmente preferentes como elementos que están contenidos en el componente (II) del péptido de fusión son las secuencias IP-2 de longitud completa que tienen todas 15 aminoácidos de la secuencia de IP-2 de origen natural (SEQ ID NO: 2 (RRDFPEEVAIVEELG) humana, o la SEQ ID NO: 3 (RRDFPEEVAIAEELG) murina) o una secuencia que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con las SEQ ID Nos. 2 ó 3. Dentro del alcance de la presente invención también se encuentran todas las isoformas de mamífero de IP-2 (variantes naturales de IP-2 entre mamíferos). Se puede proporcionar más de una copia de una secuencia que está incluida en el componente (II), por ejemplo, 2, 3 o incluso más copias de IP-2 o un fragmento, variante o análogo o derivado de IP-2.

En consecuencia, es preferente un péptido de fusión de la invención que contiene una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 8 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIAEELG), es decir GLP-1 (7-37) enlazada sin ninguna secuencia enlazante por medio de su C-términal a IP-2 murino, o de acuerdo con la SEQ ID NO: 12 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIVEELG), es decir GLP-1 (7-37) enlazada sin ninguna secuencia enlazante por medio de su C-terminal a IP-2 humano. Se incluyen también variantes, análogos o fragmentos de la misma con una identidad de secuencia de al menos un 80% con las SEQ ID Nos. 8 y 12 o derivados de las mismas.

Sin limitarse a ninguna teoría particular, los inventores de la presente invención concluyen que la inestabilidad de GLP-1 (7-35, 36 ó 37), cuando se administra a cualquier paciente que lo necesite, se debe a su estructura tridimensional no protegida. Las proteasas pueden segmentar el péptido GLP-1 (7-35, 36 ó 37) y anular su actividad fisiológica rápidamente in vivo. Al enlazar una secuencia peptídica al C-terminal de GLP-1 (7-35, 36 ó 37), su estructura gana estabilidad hacia la degradación enzimática. La ganancia en estabilidad se incrementa extraordinariamente cuando la secuencia peptídica C-terminal adicional (que está contenida en el componente (II) del péptido de fusión de acuerdo con la invención) vuelve a doblarse debido a la presencia de un elemento estructural de giro-\beta formado por su estructura primaria y que proporciona rigidez al componente (II). Se descubre que el péptido de fusión de la invención, en virtud de su extensión de péptido C-términal que contiene preferentemente un elemento estructural de giro-\beta, tiene una mejor resistencia a la inactivación por DPP-IV. El péptido C-terminal no es segmentado de la secuencia de GLP-1 (7-35, 36 ó 37) antes de actuar sobre su receptor en las células diana o puede ser segmentado enzimáticamente para formar GLP-1 (7-35, 36 ó 37) in vivo. Sin tener en cuenta la forma exacta del péptido de la invención unido en el sitio del receptor de GLP-1, un péptido de la invención ejerce su función como un compuesto insulinotrópico activo.

Las secuencias peptídicas que se consideran adecuadas para ser contenidas en el componente (II) debido a su estructura primaria que forma un elemento de giro-\beta pueden identificarse fácilmente por métodos espectroscópicos adecuados, por ejemplo dicroísmo celular u otros métodos conocidos por el especialista.

El componente (II) y el componente (I) pueden enlazarse directamente o enlazarse por medio de una secuencia enlazante. Preferentemente, ambos componentes se enlazan directamente entre sí. En caso de que sean enlazados por medio de un enlazante (o espaciador), éste es preferentemente un enlazante peptídico o un enlazador orgánico. Un enlazador peptídico tiene típicamente una longitud de 1 a 10 aminoácidos, preferentemente 1 a 5, en especial de 1 a 3 aminoácidos; en algunos casos la secuencia enlazante puede ser todavía más larga, comprendiendo de 11 a 50 aminoácidos. Un enlazante peptídico puede estar compuesto de varias secuencias de aminoácidos. Preferentemente el enlazante peptídico introducirá cierta flexibilidad estructural entre los componentes a enlazar. La flexibilidad estructural se logra, por ejemplo, haciendo que el enlazante peptídico contenga varios residuos de glicina o prolina, preferentemente al menos un 30%, en especial al menos un 40% y en particular al menos un 60% de residuos de prolina y glicina dentro de la secuencia enlazante. Sin tener en cuenta la secuencia específica, preferentemente el enlazante peptídico es inmunológicamente inactivo.

En una realización preferente de la presente invención, un péptido de la invención, es decir un péptido de fusión o sus análogos, fragmentos, variantes o derivados, contiene un tercer componente (componente (III)) que se enlaza al C-terminal del componente (II). El acoplamiento puede ser directo o indirecto, por medio de una secuencia enlazante. Con respecto a la secuencia enlazante se hace referencia a la descripción anterior para un enlazante que conecta el componente (I) y el componente (II). En general, el componente (III) comprende al menos cuatro residuos aminoácidos, preferentemente al menos 10 residuos aminoácido adicionales, en especial al menos 20 o al menos 30. En términos funcionales, el componente (III) se proporciona para mejorar aún más la estabilidad del péptido de fusión de la invención. Se espera del componente (III) que no interfiera con la función biológica del péptido de fusión de la invención, la cual es aproximadamente comparable a la actividad biológica de GLP-1 (7-37).

Preferentemente, el componente (III) del péptido de fusión de la invención comprende al menos 4, en especial al menos 10, en particular al menos 20 residuos aminoácidos adicionales de la secuencia N-terminal de una isoforma de GLP-2 de cualquier organismo mamífero (otra variante de origen natural de GLP-2 entre mamíferos), por ejemplo isoformas murinas o humanas como las mostradas en las SEQ ID Nos: 4 y 5. El GLP-2 está presente en el proglucagón y también está implicado en el metabolismo de los carbohidratos. Al igual que con la secuencia biológicamente activa incluida en el componente (I) (péptido GLP-1), el componente (III) puede comprender también análogos, variantes o derivados de formas de origen natural de GLP-2. Como alternativa, el componente (III) puede comprender también al menos 4, preferentemente al menos 10, en especial al menos 20 residuos aminoácidos adicionales de la secuencia N-terminal de GLP-1 (7-37), incluyendo correspondientemente todas las formas de mamífero o, como se describe en la presente invención, todas las variantes, análogos o derivados del mismo. En términos generales, el componente (III) puede contener cualquier forma de un péptido GLP-1 o un péptido GLP-1 modificado, el cual se describe en la presente invención como adecuado para el componente (I) del péptido de fusión de la invención. En otra alternativa, el componente (III) también puede contener formas quiméricas de GLP-1 (7-37) y GLP-2. Se puede obtener una forma quimérica acoplando el GLP-1 (7-37) y el GLP-2 (o fragmentos, análogos, variantes o derivados de ambos) uno a otro e introduciendo posteriormente esta forma quimérica como componente (III) en el péptido de la invención. Preferentemente, la forma quimérica está compuesta por una secuencia parcial de GLP-1 (7-37) y una secuencia parcial de GLP-2 enlazadas conjuntamente. Por ejemplo, la forma quimérica puede incluir los 5 a 30 aminoácidos N-terminales de GLP-1 y los 5 a 30 aminoácidos C-terminales de GLP-2 o viceversa, por ejemplo los aminoácidos 7 u 8 a 22, 23, 24, 25, 26, 27 ó 28 de GLP-1 (7-37) y la secuencia de aminoácidos de la posición 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ó 24 a por ejemplo el C-terminal de GLP-2.

Cuando se emplean modificaciones de las formas de origen natural de GLP-2 o GLP-1 (7-37), respectivamente, como componente (III), el componente (III) contiene preferentemente la secuencia de las SEQ ID NOS: 4 ó 5 ó la SEQ ID NO: 1, respectivamente, o una secuencia que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOS: 4 ó 5 o la SEQ ID NO: 1. Derivados de estas secuencias preferentes, por ejemplo debido a modificaciones en la cadena lateral o a modificaciones en el esqueleto peptídico, etc. (que se describe aquí como pertenecientes a "derivados"), también están incluidos como componente (III) por la presente invención.

En otra realización, el componente (III) puede contener una pluralidad de secuencias como las descritas anteriormente. Por ejemplo, el componente (III) puede contener al menos dos, preferentemente 2, 3 ó 4 copias de GLP-1 (7-37) y/o GLP-2 o al menos dos copias de secuencias que tengan al menos un 80% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOS: 1, 4 ó 5. También el componente (III) puede contener más de una copia de una versión quimérica de GLP-1 (7-37) o GLP-2, como se describió anteriormente, por ejemplo formando eventualmente una combinación de version(es) quimérica(s) junto con GLP-1 (7-37) y/o GLP-2 o sus modificaciones con al menos un 80% de identidad de secuencia. Dentro del alcance de la presente invención se encuentran también dos o más componentes (III), preferentemente dos, los cuales pueden ser por ejemplo (1) enlazados por su N-terminal al C-terminal del componente (II) por medio de un enlazante o directamente. Cuando se proporcionan dos componentes (III), éstos pueden ser idénticos o diferentes.

En consecuencia, los péptidos de fusión de la invención que contienen tres componentes (I), (II) y (III) son particularmente preferentes. Cuatro realizaciones específicas que contienen todos estos componentes se seleccionan de entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 6 (N-GLP-1(7-37)-IP2(murino)-RR-GLP-1(7-37)-C, designada también aquí como CM1 murino), SEQ ID NO: 7 (N-GLP-1(7-37)-IP2(murino)-RR-GLP2-C, también designada aquí como CM2 murino), SEQ ID NO: 10 (N-GLP-1(7-37)-IP2(humano)-RR-GLP-1(7-37)-C, designada también como CM1 humana) y SEQ ID NO: 11 (N-GLP-1(7-37)-IP2(humano)-RR-GLP-2-C, designada aquí también como CM2 humana) o una secuencia que tenga al menos un 80% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOS: 6, 7, 10 u 11 o un derivado de la misma. Todas las secuencias 6, 7, 10 y 11 contienen un Enlazante-RR (dos residuos de arginina) en el C-terminal de IP2 (componente (II)), las cuales como alternativa pueden ser también descartadas. El componente (I) en cada una de las realizaciones de acuerdo con las SEQ ID NOS: 6, 7, 10 u 11 es GLP-1 (7-37), mientras que el componente (III) es GLP-1(7-37) o GLP-2.

Los péptidos de fusión de la invención o un componente de los mismos pueden presentarse en varias formas modificadas. Estas formas modificadas se describen a continuación y de forma más detallada.

El término "sales" se refiere en la presente invención tanto a sales de grupos carboxilo como a sales de adición de ácido de grupos amino de los péptidos de fusión descritos anteriormente o de sus análogos, fragmentos, derivados o variantes de los mismos. Las sales de un grupo carboxilo pueden formarse por medios conocidos en la técnica e incluyen sales inorgánicas, por ejemplo sales de sodio, de calcio, de amonio, férricas o de zinc y similares, y sales con bases orgánicas son aquellas formadas, por ejemplo, con aminas, tales como etanolamina, arginina o lisina, piperidina, procaína y similares. Las sales de adición de ácido incluyen, por ejemplo, sales con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico o ácido sulfúrico, y sales con ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético o ácido oxálico. Por supuesto, cualquiera de estas sales debe conservar la actividad biológica de los péptidos de la invención relevantes para la presente invención, es decir la capacidad de reducir la velocidad de entrada de los nutrientes en la circulación. Como se describirá más abajo, las formas de péptido sal pueden estar contenidas en una formulación farmacéutica.

Un "fragmento" de un péptido de fusión de acuerdo con la presente invención se refiere a cualquier subconjunto de las moléculas, es decir, un péptido más corto que conserva la actividad biológica deseada. Se pueden preparar fragmentos fácilmente eliminando aminoácidos de cualquier extremo de la molécula y probando el resultado para verificar sus propiedades como incretina. Se conocen proteasas para eliminar un aminoácido en un momento, ya sea del extremo N-terminal y/o C-terminal de un polipéptido y, por tanto, determinar los fragmentos que conservan la actividad biológica deseada implica únicamente una experimentación de rutina. En forma concluyente, los fragmentos pueden deberse a deleciones de aminoácidos en los terminales del péptido y/o ala colocación de aminoácidos dentro de la secuencia peptídica.

Una "variante" de acuerdo con la presente invención se refiere a una molécula que es sustancialmente similar ya sea a todo el péptido de fusión de la invención definido arriba o a un fragmento del mismo. Los péptidos variantes pueden prepararse convenientemente mediante síntesis química directa del péptido variante usando métodos bien conocidos en la técnica. Por supuesto, esta variante de un péptido de fusión de la invención podría tener una actividad anti-diabética similar, por ejemplo una actividad estimulante de insulina, que el péptido GLP-1 de origen natural correspondiente.

Como alternativa, pueden prepararse variantes de secuencias de aminoácidos de los péptidos de fusión definidos arriba mediante mutaciones en los ADN que codifican para los derivados sintetizados. Estas variantes incluyen, por ejemplo, deleciones de, o inserciones o sustituciones de, residuos dentro de la secuencia de aminoácidos. También puede llevarse a cabo cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la constructo final, siempre y cuando éste posea la actividad deseada. Obviamente, las mutaciones que se harán en el ADN que codifica para el péptido variante no deben alterar el marco de lectura y preferentemente no crearán regiones complementarias que pudieran producir estructuras de ARNm secundarias.

Un "análogo" de los péptidos de fusión definidos arriba se refiere a una molécula no natural que es sustancialmente similar a ya sea la molécula completa o a un fragmento activo de la misma. Este análogo podría exhibir la misma actividad que el péptido GLP-1 de origen natural correspondiente.

Los tipos de sustituciones que pueden realizarse en el péptido de fusión de la invención o en un componente del mismo pueden basarse en el análisis de las frecuencias de los cambios de aminoácidos entre una proteína/péptido homólogo de diferente especie. En base a este análisis, las sustituciones conservadores pueden ser definidas en la presente invención como intercambios dentro de uno de los siguientes cinco grupos:

I.

Residuos pequeños, alifáticos, no polares o ligeramente polares: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly; II. Residuos polares, cargados negativamente y sus amidas: Asp, Asn, Glu, Gln; III. Residuos polares, cargados positivamente: His, Arg, Lys; IV. Residuos grandes, alifáticos no polares: Met, Leu, Ile, Val, Cys; V. Residuos aromáticos grandes: Phe, Try, Trp.

Dentro de los grupos anteriores, se considera que las sustituciones siguientes son "altamente conservadoras": Asp/Gln; His/Arg/Lys; Phe/Tyr/Trp; Met/Leu/Ile/Val. Las sustituciones semi-conservadoras se definen como intercambios entre dos de los grupos (I)-(IV) anteriores, los cuales se limitan al supergrupo (A), que comprende los (I), (II) y (III) anteriores, o al supergrupo (B), que comprende los (IV) y (V) anteriores. Las sustituciones no están limitadas a los aminoácidos genéticamente codificados o incluso a los aminoácidos de origen natural.

En general, los análogos o variantes del péptido de fusión de la invención o sus componentes también pueden contener sustituciones de aminoácido, llevadas a cabo, por ejemplo, con la intención de mejorar la solubilidad (sustitución de aminoácidos hidrofóbicos por aminoácidos hidrofílicos). En una realización de variantes/análogos del péptido GLP-1 del péptido de fusión de la invención (que se presentan en el componente (I) y/o (III) del péptido de la invención) el péptido GLP-1 (modificado) se caracteriza por una o más sustitucion(es) en las posiciones 7, 8, 11, 12, 16, 22, 23, 24, 25, 27, 30, 33, 34, 35, 36 ó 37 del péptido GLP-1. Como ejemplo de la siguiente nomenclatura [Arg34-GLP-1 (7-37)] designa un análogo de GLP-1 en el que la lisina de origen natural en la posición 34 ha sido sustituida por arginina.

Específicamente, el componente (I) y/o (III) de un péptido de fusión de la invención puede comprender variantes y análogos de GLP-1(7-35, 36 ó 37) seleccionados entre Gln9-GLP-1(7-37), D-Gln9-GLP-1(7-37), acetil-Lys9-GLP-1(7-37), Thr16-Lys18-GLP-1(7-37) y Lys18-GLP-1(7-37), Arg34-GLP-1(7-37), Lys38-Arg26-GLP-1(7-38)-OH, Lys36-Arg26-GLP-1(7-36), Arg26,34-Lys38-GLP-1(7-38), Arg26,34-Lys38-GLP-1(7-38), Arg26,34-Lys38-GLP-1(7-38), Arg26,34-Lys38-GLP-1(7-38), Arg26,34-Lys38-GLP-1(7-38), Arg26-Lys38-GLP-1(7-38), Arg26-
Lys38-GLP-1(7-38), Arg26-Lys38-GLP-1(7-38), Arg34-Lys38-GLP-1(7-38), Ala37-Lys38-GLP-1(7-38) y Lys37-GLP-1(7-37).

En otra realización de la invención, el péptido de fusión de la invención contiene como componente (I) o (III) un péptido GLP-1 modificado que comprende la secuencia de aminoácidos de la siguiente fórmula II:

(II)Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa18-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23- Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37

en la que Xaa7 es L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, 3-hidroxi-histidina, homohistidina, N-acetil-histidina, a-fluorometil-histidina, a-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina o 4-piridilalanina; Xaa8 es Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Lys, Aib, ácido (1-aminociclopropil)carboxílico, ácido (1-aminociclobutil)carboxílico, ácido (1-aminociclopentil)carboxílico, ácido (1-aminociclohexil)carboxílico, ácido (1-aminocicloheptil)carboxílico o ácido (1-aminociclooctil)carboxílico, siendo Gly particularmente preferente; Xaa16 es Val o Leu; Xaa18 es Ser, Lys o Arg; Xaa19 es Tyr o Gln; Xaa20 es Leu o Met; Xaa22 es Gly, Glu o Aib; Xaa23 es Gln, Glu, Lys o Arg; Xaa25 es Ala o Val; Xaa26 es Lys, Glu o Arg; Xaa27 es Glu o Leu; Xaa30 es Ala, Glu o Arg; Xaa33 es Val o Lys; Xaa34 es Lys, Glu, Asn o Arg; Xaa35 es Gly o Aib; Xaa36 es Arg, Gly o Lys o amida o está ausente; Xaa37 es Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, amida o está ausente.

En otra realización de la invención, el componente (I) y/o (III) del péptido de fusión de la invención contiene un péptido GLP-1 modificado que comprende la secuencia de aminoácidos de la siguiente fórmula III:

(III)Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala- Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37

en la que Xaa7 es L-histidina, D-hisitidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, 3-hidroxi-histidina, homohistidina, N-acetil-histidina, a-fluorometil-histidina, a-metil-histidina, 3-piridil-alanina, 2-piridil-alanina o 4-piridil-alanina; Xaa8 es Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Lys, Aib, ácido (1-aminociclopropil)carboxílico, ácido (1-aminociclobutil)carboxílico, ácido (1-aminociclopentil)carboxílico, ácido (1-aminociclohexil)carboxílico, ácido (1-aminocicloheptil)carboxílico o ácido (1-aminociclooctil)carboxílico; Xaa18 es Ser, Lys o Arg; Xaa22 es Gly, Glu o Aib; Xaa23 es Gln, Glu, Lys o Arg; Xaa26 es Lys, Glu o Arg; Xaa30 es Ala, Glu o Arg; Xaa34 es Lys, Glu o Arg; Xaa35 es Gly o Aib; Xaa36 es Arg o Lys, amida o está ausente; Xaa37 es Gly, Ala, Glu o Lys, amida o está ausente.

En una realización particularmente preferente de la invención, el componente (I) y/o (III) del péptido de fusión de la invención contiene un péptido GLP-1 (modificado) que se selecciona de GLP-1 (7-35), GLP-1 (7-36), GLP-1 (7-36)-amida, GLP-1 (7-37). Son también preferentes los péptidos de la invención que comprenden en sus componentes (I) y/o (III) un péptido GLP-1 modificado que tiene un residuo Aib en la posición 8 o un residuo aminoácido en la posición 7 de dicho péptido GLP-1, seleccionado de entre el grupo que consiste en D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, hidroxi-histidina, homohistidina, N-acetil-histidina, a-fluorometil-histidina, a-metil-histidina, 3-piridil-alanina, 2-piridil-alanina y 4-piridil-alanina.

Ejemplos de producción de sustituciones de aminoácido en proteínas que pueden usarse para obtener análogos útiles para la presente invención incluyen cualquier etapa de método conocida, tal como las presentadas en las patentes de Estados Unidos. RE 33.653; 4.959.314; 4.588.585 y 4.737.462, de Mark y col.; 5.116.943 de Koths y col.; 4.965.195 de Namen y col.; y 5.017.691 de Lee, y col., y las proteínas sustituidas con lisina presentadas en la patente de Estados Unidos 4.904.584 (Shaw y col.).

La variante o análogo tal como se ha definido anteriormente y contenido en el componente (I), (II) y/o (III) tendrá una secuencia nuclear que es la misma que aquella de la secuencia "nativa", por ejemplo GLP-1(7-37) o GLP-2 o un fragmento biológicamente activo de la misma o cualquier isoforma IP2, que tenga una secuencia de aminoácidos con al menos un 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos nativa y conserve la actividad biológica de la misma. Con especial preferencia, esta secuencia tiene al menos un 90% de identidad o muy preferiblemente al menos un 95% de identidad con la secuencia nativa. Cuando se dice que un péptido particular tiene una identidad porcentual específica con un polipéptido de referencia de una longitud definida, la identidad porcentual es relativa al péptido de referencia. Así, un péptido que sea en un 50% idéntico a un polipéptido de referencia que tiene 100 aminoácidos de longitud puede ser un polipéptido de 50 aminoácidos que es completamente idéntico a una porción de 50 aminoácidos de longitud del polipéptido de referencia. Podría ser también un polipéptido de 100 aminoácidos de longitud que es en un 50% idéntico al polipéptido de referencia sobre su longitud completa. Por supuesto, otros polipéptidos satisfarán los mismos criterios. El término "identidad de secuencia" según se usa en la presente invención significa que las secuencias se comparan de la forma siguiente. Las secuencias se alinean usando la Versión 9 del programa Genetic Computing Group's GAP (programa de alineación global), usando la matriz por defecto (BLOSUM62) (valores -4 a +11) con una penalización por abertura de hueco de -12 (para el primer cero de un hueco) y una penalización por extensión de hueco de -4 (por cada cero consecutivo adicional en el hueco). Después de la alineación, la identidad porcentual se calcula mediante la expresión del número de coincidencias como porcentaje del número de aminoácidos en la secuencia reivindicada.

Los derivados de un péptido de fusión o un análogo, fragmento o variante del mismo también están incluidos en la presente invención. El término "derivados" de un péptido de fusión de la invención pretende incluir sólo aquellos péptidos de la invención modificados que no cambien un aminoácido por otro de los veinte aminoácidos de origen natural comunes. De manera similar, un aminoácido genéticamente codificado puede ser modificado al someterlo a reacción con un agente derivatizante orgánico que sea capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas de residuos o grupos amino o carboxi de residuos terminales (preferentemente mediante modificación covalente) o al introducir aminoácidos no naturales (fabricados mediante síntesis química, es decir, isómeros D de los aminoácidos codificados por el código genético, Aib (ácido a-aminoisobutírico), Abu (ácido a-aminobutírico), Tie (ter-butilglicina), p-alanina, ácido 3-aminometilbenzoico, ácido antranílico) o aminoácidos naturales que no sean codificados por el código genético, por ejemplo, hidroxiprolina, \gamma-carboxiglutamato, ornitina, fosfoserina, D-alanina y D-glutamina o por una modificación del esqueleto peptídico por disposiciones alternativas del esqueleto
peptídico.

A continuación se describe la modificación preferente de aminoácidos del péptido de fusión de la invención (el cual -como se definió arriba- también comprende variantes o análogos del péptido de fusión), que puede presentarse en un péptido de fusión de la invención en cualquier sitio (cualquier aminoácido), por ejemplo, colocado en el componente (I), (II) y/o (III).

Los residuos cisteinilo, cuando están presentes en cualquier forma de un péptido de fusión de la invención, por ejemplo en un análogo de un péptido de fusión de la invención, se someten a reacción de forma habitual con alfa-haloacetatos (y las aminas correspondientes), tales como ácido cloroacético o cloroacetamida, para producir derivados carboximetilo o carboxiamidometilo. Los residuos cisteinilo son también derivatizados por reacción con bromotrifluoroacetona, ácido alfa-bromo-beta-(5-imidazoil)propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, disulfuro de metil-2-piridilo, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol, orcloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.

Los residuos histidilo en un péptido de fusión de la invención pueden ser derivatizados por reacción con procarbonato de dietilo a pH 5,5-7,0 ya que este agente es relativamente específico para la cadena lateral histidilo. También es útil el bromuro de para-bromofenacilo; la reacción se lleva a cabo preferentemente en cacodilato de sodio 0,1 M a pH 6,0. En particular, el residuo de histidina N-terminal (His7) de GLP-1(7-37) tal como es contenido en el componente (I) y/o (III) del péptido de fusión de la invención es muy importante para la actividad insulinotrópica de los péptidos GLP-1, como se muestra en Suzuki y col. (Diabetes Res.; Clinical Practice 5 (Supp. 1): S30 (1988)). De manera similar, el péptido de fusión de la invención puede ser modificado en His7 de su GLP-1 como parte del componente (I) y/o (III) por grupos alquilo o acilo (C1-C6), o sustituyendo His por estructuras de anillo de C5-C6 funcionalmente equivalentes. Una modificación preferente consiste en la introducción de una porción hidrofóbica en el terminal amino de His7 o su cadena lateral histidilo.

Los residuos lisinilo y amino terminales de un péptido de fusión de la invención pueden someterse, por ejemplo, a reacción con anhídridos succínicos u otros anhídridos de ácidos carboxílicos. La derivatización con estos agentes tiene el efecto de invertir la carga de los residuos lisinilo. Mediante las modificaciones de acilo (C12-C18) del grupo épsilon-amino del(de los) residuo(s) de lisina en el péptido de fusión de la invención, se incrementa su vida media en la circulación. Los residuos arginilo pueden modificarse, por ejemplo, mediante la reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos fenilglioxal y ninhidrina. La derivatización de los residuos de arginina requiere que la reacción se lleve a cabo en condiciones alcalinas debido al alto pKa del grupo funcional guanidina. Más aún, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de la lisina, así como con el grupo épsilon-amino de la arginina.

La modificación específica de los residuos tirosilo de por sí ha sido estudiada extensamente. De forma común puede emplearse N-acetilimidazol y tetranitrometano para formar especies O-acetil-tirosilo y derivados e-nitro, respectivamente.

Los grupos laterales carboxilo (aspartilo o glutamilo) pueden modificarse selectivamente mediante la reacción con carbodiimidas (R'N-C-N-R') tales como 1-ciclohexil-3-[2-morfolinil-(4-etil)]carbodiimida o 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida.

Más aún, los residuos aspartilo y glutamilo pueden convertirse en residuos asparaginilo y glutaminilo mediante la reacción con iones amonio.

Los residuos glutaminilo y asparaginilo pueden ser desamidados a los residuos glutamilo y aspartilo correspondientes. Como alternativa, estos residuos pueden ser desamidados en condiciones levemente ácidas. Cualquier forma de estos residuos está dentro del alcance de esta invención. Los péptidos de fusión de la invención desamidados o componentes de los mismos pueden experimentar una susceptibilidad alterada a la proteolisis con enzimas proteasa o peptidasa, sugiriendo que la desamidación podría tener significancia fisiológica en cuanto a la segmentación proteolítica de un péptido de fusión de la invención. Se hace notar que los péptidos de fusión biosintéticos de la invención pueden degradarse en ciertas condiciones de almacenamiento, dando como resultado la desamidación en una o más posiciones del péptido de fusión de la invención. Los residuos metionina en los péptidos de fusión de la invención pueden ser susceptibles a la oxidación, principalmente al sulfóxido. Como los otros derivados mencionados arriba, pueden usarse tanto péptidos de la invención de desamida como/o péptidos de la invención de sulfóxido para exhibir actividad biológica completa.

Otros reactivos adecuados para derivatizar residuos que contienen aminoácidos alfa incluyen imidoésteres tales como picolinimidato de metilo; fosfato de piridoxal; piridoxal; cloroborohidruro; ácido trinitrobencenosulfónico; O-metilisourea; 2,4-pentanodiona y reacción catalizada por transaminasa con glioxilato.

Los residuos aminoácido terminales de un péptido de fusión de la invención con sus grupos carboxi (C-terminal) y sus grupos amina (N-terminal) (así como los grupos de cadena lateral de aminoácido carboxi o amida, véase arriba) pueden estar presentes en su forma protegida (por ejemplo el C-terminal por un grupo amida) y/o desprotegida, usando grupos protectores amino o carboxilo adecuados. Asimismo, se pueden proporcionar sales de adición de ácidos del péptido de fusión de la invención. Las sales de adición de ácidos comunes son sales de hidrácidos, es decir de HBr, Hl o en particular HCl.

La PEGilación de los grupos carboxilo de cadena lateral o terminal o del grupo épsilon-amino de lisina que se presenta en el péptido de fusión de la invención confiere resistencia a oxidación y también está dentro del alcance de la presente invención.

Otras modificaciones que resulten en derivados de los péptidos de fusión de la invención se basan en carbohidratos y/o lípidos que pueden acoplarse covalentemente al péptido de fusión de la invención. Se prefiere acoplar lípidos y/o carbohidratos a serina, treonina, asparagina, glutamina o tirosina o glutamato o aspartato vía sus porciones de cadena lateral reactivas. Como alternativa, carbohidratos y/o lípidos también pueden enlazarse a las porciones terminales del péptido de fusión de la invención. Más aún, un péptido de fusión de la invención puede ser acoplado a un péptido o porción de proteína funcionalmente diferente, el cual puede estabilizar también al péptido de fusión de la invención y/o puede servir para mejorar las propiedades de transporte de un péptido de fusión de la invención en los fluidos corporales, en particular en la sangre. Péptidos de fusión o proteínas adecuados pueden seleccionarse, por ejemplo, de entre albúmina, transferrina, etc., que se acoplan directamente (como el componente IV) al péptido de fusión de la invención o vía un péptido o secuencia enlazante orgánicos. Preferentemente, estos péptidos o proteínas se unen a uno de los terminales del péptido de la invención.

Para evitar el problema de degradación del péptido de fusión de la invención, se puede proporcionar un isómero retro-inverso del péptido de fusión de la invención compuesto por D-aminoácidos o compuesto al menos parcialmente de D-aminoácidos. El término "isómero retro-inverso" se refiere a un isómero de un péptido lineal en el cual la dirección de la secuencia está invertida y la quiralidad de cada residuo de aminoácido está invertida (véase, por ejemplo Jameson y col., Nature, 368, 744-746 (1994); Brady y col., Nature, 368, 692-693 (1994)). Con respecto al péptido parental, el péptido retro-inverso es ensamblado en el orden inverso de aminoácidos, típicamente con derivados de aminoácido F-moc. Típicamente, los péptidos crudos pueden purificarse mediante HPLC de fase inversa.

Otras modificaciones que pueden introducirse en los péptidos de fusión de la invención se refieren a modificaciones del esqueleto peptídico. Preferentemente, los péptidos de la invención modificados son miméticos de estructura. Su esqueleto es diferente al del de origen natural, mientras que sus estructuras de cadena lateral son idénticas a las de los péptidos de fusión de la invención o sus fragmentos, variantes, derivados o análogos. En general, los miméticos de estructura exhiben una modificación de uno o más de los miembros de la cadena esqueleto (NH, CH, CO), ya sea como sustitución (preferentemente) o como inserción. Los sustituyentes son, por ejemplo, (I) -O-, -S- o -CH_{2}- en lugar de -NH-; (II) -N-, Alquilo- o -BH- en lugar de -CHR- y (III) -CS-, -CH_{2}-, -SO_{n}-, -P=O(OH)- o -B(OH)- en lugar de -CO-. Un mimético de péptido de un péptido de fusión de la invención puede ser una combinación de cada una de estas modificaciones. En particular, las modificaciones de cada uno de los grupos I, II y III pueden combinarse. En un mimético de péptido, cada miembro de la cadena del esqueleto puede ser modificado o, como alternativa, sólo cierto número de miembros de la cadena pueden ser intercambiados por una porción de origen no natural. Preferentemente, todos los miembros de la cadena esqueleto de un péptido de fusión de la invención ya sea de -NH-, -CHR- o CO se intercambian por otro grupo de origen no natural. En caso de que el enlace de amida (-NH-CO)- del esqueleto del péptido de fusión de la invención sea sustituido (en la molécula completa o al menos en una sola posición), las porciones de sustitución preferentes son bioisostéricas, por ejemplo, enlaces amida retro-inversos (-CO-NH-), hidroxiletileno (-CH(OH)-CH_{2}), alqueno (CH_{2}=CH-), carba (CH_{2}-CH_{2}-) y/o -P=O(OH)-CH_{2}-). Como alternativa, el alargamiento de la cadena esqueleto por inserciones puede ocurrir en un mimético de estructura del péptido de fusión de la invención, por ejemplo mediante porciones que flanqueen el átomo C-alfa. En cada lado del átomo C-alfa, por ejemplo, se puede insertar -O-, -S-, -CH-, -NH-.

Son particularmente preferentes las estructuras de esqueleto peptídico de oligocarbamato de los péptidos de fusión de la invención. El enlace amida es sustituido por una porción carbamato. Los aminoalquilcarbonatos N-protegidos monoméricos son accesibles vía los aminoácidos o aminoalcoholes correspondientes. Se convierten en ésteres activos, por ejemplo, p-nitrofenil éster usando la porción F-moc o un grupo nitroatriloxicarbonilo fotosensible mediante síntesis en fase sólida.

Los péptidos de fusión de la invención están protegidos contra la segmentación proteolítica tal como se señaló más arriba. Están protegidos en particular contra la dipeptidil-aminopeptidasa-4 (DPP-IV). El término "protegido contra DPP-IV" tal como se emplea aquí se refiere a un péptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 1. Los péptidos de fusión de la invención así como sus derivados, análogos, fragmentos y variantes convierten el GLP-1 (7-35, 36 ó 37), como parte del componente (I) y/o (III) del péptido de la invención, en resistente a la peptidasa plasmática (DPP-IV).

La resistencia de un péptido a la degradación por dipeptidil-aminopeptidasa IV se determina por ejemplo por el siguiente ensayo de degradación: partes alícuotas de los péptidos se incuban a 37ºC con una parte alícuota de dipeptidil-aminopeptidasa IV purificada, durante 4-22 horas, en un tampón adecuado, a un pH 7-8 (no siendo el tampón albúmina). Las reacciones enzimáticas concluyen por la adición de ácido trifluoroacético y los productos de degradación del péptido se separan y se cuantifican usando HPLC o análisis LC-MS. Un método para llevar a cabo este análisis consiste en: las mezclas se aplican sobre una columna Zorbax300SB-C18 (poros de 30 nm, partículas de 5 \mum) de 150 x 2,1 mm y se eluyen a un caudal de 0,5 ml/min con una gradiente lineal de acetonitrilo en ácido trifluoroacético al 0,1% (0%-100% de acetonitrilo durante 30 min). Los péptidos y sus productos de degradación se pueden controlar mediante su absorbancia a 214 nm (enlaces peptídicos) o 280 nm (aminoácidos aromáticos) y se cuantifican mediante la integración de sus áreas máximas. El modelo de degradación puede determinarse usando LEMS, donde se pueden determinar los espectros MS del pico separado. El porcentaje compuesto intacto/degradado en un momento dado se usa para evaluar la estabilidad de los péptidos frente a DPP-IV.

Un péptido de fusión de la invención se define como estabilizado frente a DPP-IV cuando es 10 veces más estable que el GLP-1 (7-37), con respecto al porcentaje de compuesto intacto en un momento dado. Así, un péptido de fusión de la invención estabilizado frente a DPP-IV es preferentemente al menos 10, en especial al menos 20 veces más estable que el GLP-1 (7-37) como tal. La estabilidad puede evaluarse mediante cualquier método conocido por el especialista, por ejemplo mediante la adición de DPP-IV a una solución del péptido de fusión a ensayar y determinación de la degradación del péptido de fusión, por ejemplo con el tiempo, mediante por ejemplo un método espectroscópico, análisis Western-Blot, cribado de anticuerpos, etc. En paralelo, un péptido de fusión de la invención se define como un compuesto que ejerce el efecto de GLP-1 (7-37) por ejemplo al unirse a su receptor nativo (receptor GLP-1). Preferentemente, un péptido de fusión de la invención tiene una afinidad de unión al receptor de GLP-1 que corresponde a al menos un 10%, preferentemente al menos un 50% de afinidad de unión del péptido GLP-1 de origen natural. La afinidad de unión puede determinarse mediante cualquier método adecuado, por ejemplo por resonancia de plasmón superficial, etc. Además, preferentemente el péptido de fusión de la invención induce la formación de cAMP intracelular mediante su unión a su receptor extracelular, el cual transmite la señal a la célula.

Los péptidos de fusión de la invención pueden producirse sintéticamente, usando técnicas de síntesis de péptidos en fase sólida, similares a la manera de producir GLP-1 (7-36) amida y GLP-1 (7-37) en la técnica y pueden purificarse posteriormente a escala de laboratorio, por ejemplo, mediante una sola etapa de purificación en columna de HPLC de fase inversa o por métodos de cromatografía adecuados.

Sin embargo, se forma preferentemente en células manipuladas, ya sea en células microbianas o en líneas de células animales para producir el péptido de la invención. El péptido de fusión de la invención puede aislarse de las células a partir de las cuales se expresa, por ejemplo usando técnicas de separación convencionales. De esta manera, las células pueden cultivarse en condiciones adecuadas, por ejemplo incluyendo soporte y nutrientes, in vitro, y la proteína secretada, es decir, el péptido de fusión de la invención, se recupera del medio extracelular. Así, las secuencias manipuladas en las células incluyen preferentemente secuencias líder y secuencias de péptidos señal que dirigen la secreción del péptido de fusión de la invención. Preferentemente, las células expresan proteasas capaces de segmentar las secuencias líder y señal, ya sea endógenamente o vía secuencias genéticas manipuladas. En una alternativa, las secuencias genéticas manipuladas que codifican para un péptido de fusión de la invención no incluyen estas secuencias de péptidos líder y señal, con lo cual el péptido de fusión de la invención expresado intracelularmente no será secretado y será recuperado de las células mediante procesos que incluyen la lisis celular. En estos métodos, las secuencias de codificación pueden incluir marcadores de purificación que permitan la extracción eficiente del producto péptido del medio, marcadores que pueden ser segmentados para liberar el péptido de fusión de la invención aislado.

La invención proporciona además un ácido nucleico que codifica para el péptido de fusión de la invención, ya sea un péptido de fusión o un fragmento, análogo o variante del mismo. Cualquier ácido nucleico que codifique para un péptido de fusión de la invención forma parte de la presente invención. Debido a la degeneración del código genético, míltiples secuencias de ácido nucleico pueden codificar para un péptido de fusión de la invención. Una molécula de ácido nucleico dentro del alcance de la presente invención también puede contener el ácido nucleico que codifique para el péptido de fusión de la invención y, además, otras secuencias de nucleótidos (funcionales). En una realización preferente de la presente invención, esta (otra) molécula de ácido nucleico puede codificar (a) para la secuencia de aa GLP-1 completa (GLP-1 (1-37)) o la secuencia GLP-1 (7-35, 36 ó 37) funcional, (b) una secuencia de segmentación en el N-terminal de la secuencia de GLP-1 de acuerdo con (a) para cualquier proteasa, aguas arriba de (b), puede codificar para una secuencia líder. En otra realización preferente, aguas arriba de la secuencia de ácido nucleico que codifica para (b), la molécula de ácido nucleico puede comprender además (c) una secuencia que codifique para un péptido señal. Como alternativa, la molécula de ácido nucleico de la invención puede tener la secuencia (c) fusionada aguas arriba de (a) sin ninguna secuencia que codifique para una secuencia líder (b) en medio. Preferentemente, la secuencia líder y la secuencia de péptido señal son heterólogas al preproglucagón.

La invención proporciona además un vector que comprende un ácido nucleico (molécula) de la invención y otros componentes funcionales para la expresión del ácido nucleico (molécula) de la invención. Típicamente, el ácido nucleico (molécula) de la invención será fusionado a una secuencia promotora y, eventualmente combinado con otras secuencias reguladoras, por ejemplo una secuencia potenciadora. Para la replicación, el plásmido puede contener un origen de replicación. Para seleccionar las células transfectadas con el vector de la invención, se puede proporcionar en el vector uno o más genes de resistencia a antibióticos (por ejemplo a la kanamicina, ampicilina). El vector puede ser un plásmido que incluya un promotor de origen bacteriano y genes de resistencia a antibióticos y un promotor original, así como genes de resistencia a antibióticos para la replicación y expresión en células de mamífero. La invención proporciona además una célula huésped que comprende el ADN de la invención introducido exógenamente, capaz de traducir dicha proteína precursora. La célula huésped puede ser bien una célula huésped procariota o bien una célula huésped eucariota, por ejemplo una célula de mamífero. La célula huésped no es una célula embriónica humana o una célula germinal humana.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona el uso del péptido de fusión de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un animal, preferentemente un ser humano, mediante la administración de un péptido de la invención que comprende los componentes (I) y (II) y eventualmente el componente (III). También se proporciona el uso correspondiente de estos péptidos de la invención en la fabricación de un producto para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o condición asociada con el metabolismo de glucosa. Ejemplos no limitativos de trastornos de la glucosa incluyen: diabetes mellitus de tipo I o tipo II (NIDDM) o insulino-resistente, trastornos de peso y enfermedades o condiciones asociadas a los mismos, donde estos trastornos de peso o condiciones asociadas incluyen obesidad, condiciones asociadas al sobrepeso, desregulación de la saciedad, niveles de insulina en plasma reducidos, niveles de glucosa en sangre incrementados o masa de células beta pancreáticas reducida. Preferentemente, se describe en la presente invención el uso de los péptidos de fusión de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la diabetes tipo 2 (NIDDM). Como consecuencia, la presente invención se refiere a un uso del péptido de fusión de la invención, por ejemplo para reducir el peso de un sujeto, para reducir la saciedad de un sujeto, para incrementar de forma post-pandrial los niveles de insulina en plasma en un sujeto, para reducir el nivel de glucosa en sangre en ayunas en un sujeto, para incrementar la masa de células beta pancreáticas en un sujeto o para tratar la diabetes tipo I o II en un sujeto.

Los pacientes con otras enfermedades o trastornos pueden ser también tratados por los péptidos de fusión de la invención, es decir, péptidos de fusión o sus análogos, variantes o derivados. Los péptidos de fusión de la invención pueden usarse en la preparación de un medicamento para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos y enfermedades o condiciones asociadas a los mismos y en el tratamiento de trastornos y enfermedades o condiciones asociadas a la apoptosis. El uso del péptido de fusión de la invención en el tratamiento de estos trastornos es el resultado de lo siguiente: los receptores GLP-1, que se acoplan a la vía del segundo mensajero AMP cíclico, se expresan por todos los cerebros de roedores y humanos. La quimioarquitectura de la distribución de receptores en el cerebro no sólo se correlaciona con un papel central del GLP-1 en la regulación de la ingesta de alimentos y la respuesta al estrés aversivo. También se demostró que la unión de GLP-1 en su receptor de GLP-1 ejerce propiedades neurotróficas, y ofrecen protección contra la apoptosis inducida por glutamato y la lesión oxidativa en células neuronales cultivadas. Además, se demostró que el GLP-1 modificaba el procesamiento del precursor de la proteína-\beta amiloide en cultivos celulares y reduce de manera dosis-dependiente los niveles de péptido-\beta amiloide en el cerebro in vivo. Por tanto, el GLP-1 es conocido también como regulador del sistema nervioso central. Los péptidos de fusión de la invención que imitan la actividad biológica de GLP-1 fisiológicamente activo tienen relevancia terapéutica para el tratamiento de, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer (AD) y otras condiciones neurodegenerativas centrales y periféricas (por ejemplo, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), enfermedad de Alexander, enfermedad de Alper, Ataxia telangiectasia, enfermedad de Canavan, síndrome de Cockayne, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, esclerosis múltiple, enfermedad de Sandhoff, enfermedad de Pick, Ataxia espinocerebelar, enfermedad de Schilder y enfermedad de Parkinson).

Más aún, se ha demostrado que el GLP-1 fisiológicamente activo ejerce una acción anti-apoptótica en varias células, por ejemplo el GLP-1 es beneficioso en la conservación de masa y función de las células de islotes humanos recién aislados u otros tipos de células. Hasta el momento, el péptido de fusión de la invención biológicamente activo puede usarse para tratar trastornos que sean causados por la apoptosis celular o tisular.

El uso de un péptido de fusión de la invención puede ser para la fabricación de una composición que se administre exógenamente y comprenda el péptido de fusión de la invención aislado. La composición resultante se puede usar también en el tratamiento de los trastornos anteriores. Los trastornos descritos en la presente también pueden ser tratados mediante las células huésped, los ácidos nucleicos (moléculas) o los vectores de la invención o, en su lugar, las células huésped, los ácidos nucleicos (moléculas) o los vectores de la invención se pueden usar en la preparación de un medicamento para el tratamiento de estos trastornos.

La preparación de formulaciones que contienen secuencias del péptido de fusión de la invención como ingredientes activos es generalmente bien conocida en la técnica, como se pone de manifiesto en las patentes de Estados Unidos 4.608.251; 4.601.903; 4.599.231; 4.599.230; 4.596.792 y 4.578.770. Típicamente, estas formulaciones se preparan como inyectables, ya sea como soluciones o como suspensiones líquidas, que contienen preferentemente agua (formulación acuosa) o pueden ser emulsionadas. El término "formulación acuosa" se define como una formulación que comprende al menos un 50% p/p de agua. Asimismo, el término "solución acuosa" se define como una solución que comprende al menos un 50% p/p de agua y el término "suspensión acuosa" se define como una suspensión que comprende al menos un 50% p/p de agua.

Para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, o inyección en el sitio de aflicción, el ingrediente activo estará en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable que esté exenta de pirógenos y de pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Las composiciones farmacéuticas líquidas incluyen generalmente un vehículo líquido, tal como agua. Preferentemente, el vehículo líquido incluirá una solución salina fisiológica, dextrosa etanol u otra solución de sacáridos o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol o combinaciones de los mismos. Ejemplos adicionales son otros vehículos isotónicos tales como inyección de Ringer o Inyección de Ringer
Lactato.

Cuando la invención se refiere a una formulación farmacéutica que comprende una solución acuosa de un compuesto de acuerdo con la presente invención y un tampón, donde dicho compuesto está presente a una concentración de 0,1 mg/ml o más y donde dicha formulación tiene un pH de alrededor de 2,0 a aproximadamente 10,0, preferentemente alrededor de 7,0 a aproximadamente 8,5. Preferentemente, el pH de la formulación es de al menos 1 unidad de pH a partir del punto isoeléctrico del compuesto de acuerdo con la presente invención, en especial el pH de la formulación es al menos 2 unidades de pH a partir del punto isoeléctrico del compuesto de acuerdo con la presente
invención.

También pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en líquido antes de su inyección. La formulación farmacéutica puede ser una formulación liofilizada, a la cual el médico o el paciente añade los disolventes y/o diluyentes antes de su uso. En otras palabras, la formulación una vez preparada puede no ser de administración inmediata a un sujeto. Esto es, después de su preparación se envasa para su almacenamiento en un estado congelado o en una forma seca para su posterior reconstitución en una forma líquida u otra forma adecuada para la administración a un sujeto. En otra realización, la formulación farmacéutica es una formulación deshidratada (por ejemplo, liofilizada o secada por aspersión) lista para usarse sin ninguna disolución previa. Por "forma seca" se pretende que la formulación o composición farmacéutica líquida sea secada, ya sea mediante secado por congelación (es decir liofilización; véase, por ejemplo, Williams y Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38: 48-59), secado por aspersión (véase Masters (1991) in Spray-Drying Handbook (5ª ed.; Longman Scientific and Technical, Essez, U. K.), págs. 491-676; Broadhead y col., (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18: 1169-1206; and Mumenthaler y col., (1994) Pharm. Res. 11: 12-20), o secado con aire (Carpenter y Crowe (1988) Cryobiology 25: 459-470; y Roser (1991) Biopharm. 4: 47-53). La formación de agregados mediante un polipéptido durante el almacenamiento de una composición farmacéutica líquida puede afectar adversamente la actividad biológica de tal polipéptido, dando como resultado la pérdida de la eficacia terapéutica de la composición farmacéutica. Además, la formación de agregados puede causar otros problemas, tales como bloqueo de tubos, membranas o bombas cuando la composición farmacéutica que contiene los polipéptidos se administra mediante un sistema de infusión.

Es posible que otros ingredientes puedan estar presentes en la formulación farmacéutica peptídica de la presente invención. Estos ingredientes adicionales pueden incluir agentes humectantes, emulsionantes, antioxidantes, agentes volumétricos, agentes tampón de pH (por ejemplo tampones fosfato o citrato o maleato), conservantes, agentes tensioactivos, estabilizadores, modificadores de tonicidad, agentes quelantes, iones metálicos, vehículos oleaginosos, proteínas (por ejemplo seroalbúmina humana, gelatina o proteínas) y/o zwitteriones (por ejemplo un aminoácido tal como betaína, taurina, arginina, glicina, lisina e histidina).

Con respecto a los estabilizadores para las formulaciones de la invención, éstos pueden seleccionarse preferentemente de entre el grupo de polímeros de alto peso molecular o compuestos de bajo peso molecular. En otra realización de la invención el estabilizador se selecciona de entre polietilenglicol (por ejemplo PEG 3350), alcohol polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona, carboxi-hidroxicelulosa o derivados de los mismos (por ejemplo HPC, HPGSL, HPC-L y HPMC), ciclodextrinas, sustancias que contienen azufre tales como monotioglicerol, ácido tioglicólico y 2-metiltioetanol, y distintas sales (por ejemplo cloruro de sodio). Cada uno de estos estabilizadores específicos constituye una realización alternativa de la invención. Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender agentes estabilizadores adicionales que incrementen más la estabilidad de un polipéptido terapéutico activo de la presente invención. Los agentes estabilizadores de interés particular para la presente invención incluyen, pero no están limitados a, metionina y EDTA, los cuales protegen al polipéptido contra la oxidación por metionina, y un agente tensioactivo no iónico, el cual protege al polipéptido contra la agregación asociada a la congelación-descongelación o esfuerzo de cizalla mecánico.

Con respecto a agentes tensioactivos para las formulaciones de la invención, éstos pueden seleccionarse preferentemente de entre detergentes, aceite de ricino etoxilado, glicéridos poliglicolizados, monoglicéridos acetilados, ésteres de ácido graso de sorbitano, polímeros en bloques de polioxipropileno-polioxietileno (por ejemplo poloxámeros tales como Pluronic F68, poloxamer 188 y 407, TritonX-100), ésteres de ácido graso de polioxietilen-sorbitano, PEO en forma de estrella, polioxietileno y derivados de polietileno tales como derivados alquilados y alcoxilados (Tweens, por ejemplo, Twenn-20, Tween-40, Tween-80 y Brij-35), polioxietilenhidroxiestearato, monoglicéridos y derivados etoxilados de los mismos, diglicéridos o derivados polioxietilénicos de los mismos, alcoholes, glicerol, lecitinas y fosfolípidos (por ejemplo, fosfatidilserina, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, difosfatidilglicerol y esfingomielina), derivados de fosfolípidos (por ejemplo ácido dipalmitoilfosfatídico) y lisofosfolípidos (por ejemplo palmitoil-isofosfatidil-L-serina y ésteres 1-acil-sn-glicero-3-fosfato de etanolamina, colina, serina o treonina) y derivados alquilo, alcoxilo (alquil éster), alcoxi (alquil éter) de lisofosfatidilo y fosfatidilcolinas, por ejemplo derivados lauroílo y miristoílo de lisofosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina y modificaciones del grupo de cabeza polar, es decir colinas, etanolaminas, ácido fosfatídico, serinas, treoninas, glicerol, inositol y los DODAC, DOTMA, DCP, BISHOP cargados positivamente, lisofosfatidilserina y lisofosfatidiltreonina, y glicerofosfolípidos (por ejemplo cefalinas), gliceroglicolípidos (por ejemplo galactopiranósido), esfingoglicolípidos (por ejemplo ceramidas, gangliósidos), dodecilfosfocolina, lisolecitina de huevo de gallina, derivados de ácido fusídico (por ejemplo, tauro-dihidrofusidato de sodio, etc.), ácidos grasos de cadena larga y sales de los mismos C6-C12 (por ejemplo ácido oleico y ácido caprílico), acilcarnitinas y derivados, derivados N'X-acilado de lisina, arginina o histidina, o derivados acilados de cadena lateral de lisina o arginina derivados N-acilados de dipéptidos que comprenden cualquier combinación de lisina, arginina o histidina y un aminoácido neutro o ácido, derivado N-acilado de un tripéptido que comprende cualquier combinación de un aminoácido neutro y dos aminoácidos cargados, DSS (docusato sodio, número de registro CAS [577-11-7]), docusato calcio, no. de registro CAS [128-49-4]), docusato potasio, no. de registro CAS [7491-09-0]), SDS (dodecil sulfato de sodio o laurilsulfato de sodio), caprilato de sodio, ácido cólico o derivados del mismo, ácidos biliares y sales de los mismos y conjugados de glicina o taurina, ácido ursodesoxicólico, colato de sodio, desoxicolato de sodio, taurocolato de sodio, glicocolato de sodio, N-hexadecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propanosulfonato, agentes tensioactivos monovalentes aniónicos (alquil-aril-sulfonatos), agentes tensioactivos zwiteriónicos (por ejemplo, N-alquil-N,N-dimetilamonio-1-propanosulfonatos, 3-colamido-1-propildimetilamonio-1-propanosulfonato, agentes tensioactivos catiónicos (bases de amonio cuaternario) (por ejemplo bromuro de cetil-trimetilamonio, cloruro de cetilpiridinio), agentes tensioactivos no iónicos (por ejemplo dodecil-D-glucopiranósido), poloxaminas (por ejemplo Tetronic's), las cuales son copolímeros en bloque tetrafuncionales derivados de la adición secuencial de óxido de propileno y óxido de etileno a etilendiamina, o el agente tensioactivo puede seleccionarse del grupo de derivados de imidazolina o mezclas de los mismos. Cada uno de estos agentes tensioactivos específicos constituye una realización alternativa de la invención. El uso de agentes tensioactivos en composiciones farmacéuticas es bien conocido por los especialistas. Por conveniencia se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª edición,
1995.

Con respecto a los conservantes farmacéuticamente aceptables, éstos pueden seleccionarse preferentemente de entre el grupo que consiste en fenol, o-cresol, m-cresol, p-cresol, p-hidroxibenzoato de metilo, p-hidroxibenzoato de propilo, 2-fenoxietanol, p-hidroxibenzoato de butilo, 2-feniletanol, alcohol bencílico, etanol, clorobutanol y tiomerosal, bronopol, ácido benzoico, imidurea, clorohexidina, deshidroacetato de sodio, clorocresol, p-hidroxibenzoato de etilo, cloruro de benzetonio, clorfenesina (3p-clorfenoxipropano-1,2-diol) o mezclas de los mismos.

Con respecto a los agentes isotónicos, éstos pueden seleccionarse preferentemente de entre el grupo que consiste en sales (por ejemplo cloruro de sodio), azúcares o alcoholes de azúcares, aminoácidos (por ejemplo L-glicina, L-histidina, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptófano, treonina), alditol (por ejemplo glicerol (glicerina), 1,2-propanodiol (propilenglicol), 1,3-propanodiol, 1,3-butanodiol), polietilenglicol (por ejemplo PEG400) o mezclas de los mismos. Puede usarse cualquier azúcar tal como mono-, di- o polisacáridos o glucanos hidrosolubles, incluyendo por ejemplo fructosa, glucosa, manosa, sorbosa, xilosa, maltosa, lactosa, sacarosa, trehalosa, dextrano, pululano, dextrina, ciclodextrina, almidón soluble, hidroxietil almidón y carboximetilcelulosa de sodio. En una realización, el aditivo de azúcar es sacarosa. Un alcohol de azúcar se define como un hidrocarburo de C4-C8 que tiene al menos un grupo -OH e incluye, por ejemplo manitol, sorbitol, inositol, galacititol, dulcitol, xilitol y arabitol. En una realización, el aditivo de alcohol de azúcar es manitol. Los azúcares o alcoholes de azúcar mencionados arriba pueden usarse individualmente o en combinación. No hay un límite fijo para la cantidad usada, siempre y cuando el azúcar o alcohol de azúcar sea soluble en la preparación líquida y no afecte adversamente a los efectos estabilizadores logrados usando los métodos de la invención.

Con respecto a los agentes quelantes, éstos pueden seleccionarse preferentemente de entre sales de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido cítrico y ácido aspártico, y mezclas de los mismos.

Con respecto a los tampones, éstos se seleccionan preferentemente de entre el grupo que consiste en acetato de sodio, carbonato de sodio, citrato, glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, dihidrógenofosfato de sodio, hidrógenofosfato de sodio, fosfato de sodio y tris(hidroximetil)aminometano, hepes, bicina, tricina, ácido málico, succinato, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido aspártico o mezclas de los mismos. Cada uno de estos tampones específicos constituye una realización alternativa de la invención.

El uso de todos los aditivos mencionados arriba en las composiciones farmacéuticas que contienen el péptido de fusión (terapéutico) de la invención es bien conocido por los expertos, en particular en cuanto a los rangos de concentración de los mismos. Por conveniencia se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª edición, 1995.

Las formulaciones que contienen el péptido de fusión de la invención se administran convencionalmente de forma parenteral por inyección, por ejemplo de forma subcutánea, intradérmica, subdérmica o intramuscular. Una composición para la administración parenteral del péptido de la invención puede prepararse, por ejemplo, tal como se describe en WO 03/002136.

Formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios y, en algunos casos, formulaciones orales, bucales, sublinguales, intraperitoneales, intravaginales, anales e intracraneales. Para supositorios, los aglutinantes y soportes tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialquilenglicoles o triglicéridos; estos supositorios pueden formarse a partir de mezclas que contengan el ingrediente activo en un rango del 0,5% al 10%, preferentemente el 12%. Las formulaciones orales incluyen los excipientes empleados normalmente, tales como los grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, tabletas, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación prolongada o polvos y contienen un 10-95% de ingrediente activo, preferentemente un 25-70%.

Como se mencionó anteriormente, pueden emplearse métodos farmacéuticos adicionales para controlar la duración de la actividad. Las preparaciones de liberación controlada pueden obtenerse utilizando polímeros para formar complejos o absorbiendo un péptido de fusión de la presente invención. Puede controlarse el suministro del ingrediente activo (péptido de fusión) seleccionando las macromoléculas adecuadas (por ejemplo poliésteres, poliaminoácidos, polivinilpirrolidona, copolímeros etileno-acetato de vinilo, metilcelulosa, carboximetilcelulosa y sulfato de protamina), la concentración de las macromoléculas, así como los métodos de incorporación. Estas enseñanzas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences (véase arriba). Otro método posible para controlar la duración de acción mediante preparaciones de liberación controlada es el de incorporar un péptido de la presente invención en partículas de un material polimérico, por ejemplo poliésteres, poliaminoácidos, hidrogeles, ácido poliláctico o copolímeros de etileno-acetato de vinilo.

Los péptidos de fusión de la invención pueden formularse como formas neutras o de sal. Un péptido de fusión de la presente invención puede ser lo suficientemente ácido o lo suficientemente básico como para reaccionar con cualquiera de un número de bases orgánicas e inorgánicas y de ácidos orgánicos e inorgánicos, para formar una sal (de adición), por ejemplo formada con los grupos amino libres del péptido. Los ácidos comúnmente empleados para formar sales de adición de ácido son ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido yodhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico y similares y ácidos orgánicos tales como ácido tartárico, ácido p-toluensulfónico, ácido metanosulfónico, ácido oxálico, ácido mandélico, ácido p-bromofenilsulfónico, ácido carbónico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido benzoico. Los ejemplos de estas sales incluyen sulfato, pirosulfato, bisulfato, sulfito, bisulfito, fosfato, monohidrogenfosfato, dihidrogenfosfato, metafosfato, pirofosfato, cloruro, bromuro, yoduro, acetato, propionato, decanoato, caprilato, acrilato, formato, isobutirato, caproato, heptanoato, propiolato, oxalato, malonato, succinato, suberato, sebacato, fumarato, maleato, butin-1,4-dioato, hexin-1,6-dioato, benzoato, clorobenzoato, metilbenzoato, dinitrobenzoato, hidroxibenzoato, metoxibenzoato, ftalato, sulfonato, xilenosulfonato, fenilacetato, fenilpropionato, fenilbutirato, citrato, lactato, gama-hidroxibutirato, glicolato, tartrato, metanosulfonato, propanosulfonato. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivarse de bases inorgánicas tales como hidróxidos de sodio, de potasio, de amonio, de calcio o férricos, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína y similares. Las sales de adición de adición, sales carboxilato, alquil ésteres inferiores y amidas de los péptidos de la invención pueden formularse de acuerdo con WO 91/11457 (1991); EP 0 733 644 (1996); y U.S. 5.512.549 (1996).

Las formulaciones que contienen las secuencias de péptidos de fusión de la invención se administran de forma compatible con la formulación de dosis y en una cantidad que es terapéuticamente efectiva. La cantidad que se debe administrar dependerá del sujeto a tratar, incluyendo, por ejemplo, la gravedad de la enfermedad del paciente. Rangos de dosis adecuados son, por ejemplo, del orden de varios cientos de microgramos del ingrediente activo por dosis terapéutica, con un rango preferente de alrededor de 0,1 \mug a 2.000 \mug (aunque se contemplan cantidades más altas en el rango de 1-10 mg), tales como en el rango de alrededor de 0,5 \mug a 1.000 \mug, preferentemente en el rango de 1 \mug a 500 \mug y especialmente en el rango de alrededor de 10 \mug a 100 \mug.

Las formulaciones que contienen los péptidos de fusión de la invención y además, por ejemplo, excipientes adicionales tales como glicina y manitol u otros aditivos, pueden comercializarse en forma liofilizada como frascos. Se proporciona un vial de diluyente acompañante que permite al paciente reconstituir el producto hasta la concentración deseada antes de la administración de la dosis. Las formulaciones de la invención también pueden comercializarse en otras formas bien conocidas, tales como jeringas precargadas, etc.

La invención se ilustra además en los siguientes ejemplos.

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Ejemplos

Ejemplo 1

Creación de constructos genéticos

La secuencia de codificación para el ADNc de GLP-1 (7-37) se sintetizó sintéticamente, en una secuencia que incluye sitios HincII y EcoRI como se indica en la Figura 1a. Por otro lado, se sintetizó el ADNc ilustrado en la Figura 1b, incluyendo las secuencias de codificación para GLP-1 (7-37), IP2 y sitios de restricción para SfoI, EcoRI y XbaI, como se ilustra en la Figura 1b. Para dirigir GLP-1 a la vía secretora, se utilizó la secuencia señal heteróloga de estromelisina 3 (No. de Registro NM_005940). Por tanto, el ADNc que codifica para la señal de estromelisina y la secuencia líder fue amplificado por PCR de transcriptasa inversa a partir de ARN humano y usado con el constructo de la Figura 1a o Figura 1b para formar el constructo mostrado en la Figura 1c y Figura 1d, respectivamente.

El fragmento HincII/EcoRI del constructo de la Figura 1a se clonó en el sitio SfoI de la secuencia de la Figura 1d para formar el constructo de la Figura 1e. De forma similar, el fragmento EcoRI de la Figura 1d se clonó en el sitio EcoRI de un plásmido de expresión eucariota para producir el constructo mostrado en la Figura 1f. Para formar el constructo mostrado en la Figura 1g, el fragmento HincII/XbaI del constructo mostrado en la Figura 1b se clonó repetitivamente en el sitio SfoI/XbaI del constructo mostrado en la Figura 1d. La Figura 1h muestra una secuencia optimizada por codones sintetizada que codifica las secuencias líder y señal de estromelisina interrumpidas por una secuencia de intrones endógena acortada, fusionada a las secuencias que codifican para GLP-1 (7-37), IP2 y GLP-2 (1-35) humanos. La secuencia de ADN del constructo de la Figura 1h es la SEQ ID NO: 16, en tanto que la SEQ ID NO: 15 muestra también la secuencia del péptido traducido.

También se sintetizan las secuencias de las Figuras 1i y 1j. Éstas se usan después para formar el constructo de la Figura 1k, clonando el fragmento NaeI/BssHII de la Figura 1j en la secuencia linearizada NaeI/BssHII de la Figura 1h. La secuencia de ADN del constructo de la Figura 1k es la SEQ ID NO: 14, en tanto que la SEQ ID NO: 13 muestra también la secuencia del péptido traducido. El constructo de la Figura 1l se forma por digestión con BssHII y religación de la secuencia de la Figura 1h. La secuencia de ADN del constructo de la Figura 1l es la SEQ ID NO: 18, en tanto que la SEQ ID NO: 17 muestra también la secuencia del péptido traducido. El constructo de la Figura 1m se forma al clonar el fragmento AfeI/BssHII de la secuencia de la Figura 1i en la secuencia linearizada AfeI/BssHII de la Figura 1h. La secuencia de ADN del constructo de la Figura 1m es la SEQ ID NO: 20, en tanto que la SEQ ID NO: 19 muestra también la secuencia del péptido traducido.

Los constructos anteriores pueden ser elaborados por un experto en la materia empleando técnicas de rutina.

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Ejemplo 2

Transfección, selección clonal y expresión de GLP-1 de células de mamífero

Fuente de células: HEK293 (línea celular de riñón embrionario humano, #ACC 305, DSMZ Cell Culture Collection, Alemania), AtT20 (línea de células tumorales de glándula pituitaria LAF1 de ratón, #87021902, European Cell Culture Collection, Reino Unido), las células hTERT-MSC se obtuvieron del Prof. Kassem, University Hospital de Odense, Dinamarca.

Para la transfección de 10^{8} células se usó 0,5-2 \mug de ADN plasmídico con diferentes constructos de GLP-1. Los constructos se generaron como se describió en el Ejemplo 1. Las células HEK293 se transfectaron mediante un método estándar de coprecipitación con fosfato de calcio, tal como se describe en Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y col., 1994ff Harvard Mecical School Vol.2, Unidad 9.1). Las células AtT20 fueron transfectadas usando FuGene (Roche) tal como se describe en Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y col., 1994ff, Harvard Medical School Vol. 2., Unidad 9.4). La transfección de células hTERT-MSC se llevó a cabo usando la tecnología Nucleofector (Amaxa), método no viral que se basa en la combinación de parámetros eléctricos y soluciones específicas del tipo celular. Usando el dispositivo Nucleofetor (programa C17) y la solución de Nucleofector VPE-1001 se consiguieron rendimientos de transfección > 60%. 48 Horas después de la transfección, se llevó a cabo la selección de clones de células con integración estable de ADN en el cromosoma mediante la adición del agente selectivo blasticidina (2 \mug/ml) al medio de cultivo. 12-15 días más tarde, los clones de células transfectadas estables pudieron ser aislados y expandidos para su caracterización.

La expresión transitoria de distintos constructos de GLP-1 se midió en células hTERT-MSC y HEK293. Considerando que sólo un nivel de GLP-1 activo marginal pudo encontrarse en los constructos monoméricos de GLP-1 #103 y #317 (que tenían sólo una copia de GLP-1 (7-37), se puede encontrar una gran ganancia en la expresión en el constructo dimérico de GLP-1 #217 (que tiene GLP-1 (7-37) como componente (I) y como componente (III)) tanto en células hTERT-MSC como en HEK293. Los resultados se resumen en la Figura 2. Un alargamiento del constructo al constructo de GLP-1 #159 (que tiene cuatro copias de IP2 como componente (II)) resulta en ningún incremento significativo adicional (no mostrado). Después de la transfección de células hTERT-MSC con distintos constructos, se seleccionaron clones que expresaban establemente GLP-1. Los niveles de expresión se muestran en la Tabla 1.

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TABLA 1

1

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Ejemplo 3

Análisis Western Blot de péptidos GLP-1 secretados de células de mamífero

El sobrenadante de cultivo celular de células secretoras de GLP-1 se separó en una gradiente del 10%-20% de SDS PAGE (120V, 90 minutos) y se transfirió a una membrana de PVDF (Immobilon-P Membrane 0,45 \mum Millipore IPVH 00010) por Blotting semi-seco (2,0 mA/cm^{2}, 60 minutos). Después de la fijación y bloqueo con metanol (3% (p:v) BSA, 0,1% (v:v) Tween-20 en TBS) la membrana se sometió a inmunoblotting (inmunotransferencia) con 1 \mug/ml del anticuerpo anti-GLP-1 (HYB 147-12, Antibodyshop) a 4ºC o/n. Después de lavado e incubación con 0,02 \mug/ml de anticuerpo de detección (Anti-ratón IgG, HRP conjugado, Perkin Elmer PC 2855-1197) a temperatura ambiente durante 4 horas, la detección quimioluminiscente revelaba la ubicación de la proteína.

El análisis Western Blot se muestra en la Figura 3 (1:100 ng de GLP-1 (7-37) sintético disuelto en sobrenadante de células hTERT-MSC transfectadas en falso, 2: sobrenadante de células hTERT-MSC (clon 79TM217/13) que secretan GLP-1 dimérico del constructo #217, 3: sobrenadante de células AtT20 (clon 81-A-217/3) que secretan GLP-1 dimérico del constructo #217; M: marcador proteínico preteñido [kDa]). Los resultados muestran que los péptidos de la invención que contienen GLP-1 (7-37) y un apéndice C-terminal (2 y 3 en la Figura 3) son secretados a partir de las líneas celulares transfectadas y pueden ser detectados usando un anticuerpo anti-GLP-1, el cual se une a los epítopos moleculares medios de GLP-1 (7-37).

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Ejemplo 4

Estabilidad en plasma in vitro de los péptidos GLP-1 secretados de células humanas

Células HEK293 y hTERT-MSC fueron transfectadas transitoriamente con constructos que codificaban para la secuencia señal de estromelisina heteróloga, la cual está enlazada a variantes de GLP-1 que codifican para los siguientes péptidos:

1:

GLP-1(7-37)

2:

GLP-1(7-37)-IP2-extendido con 11 AA

3:

GLP1(7-37)-IP2-GLP1(7-37)

Se incubó el sobrenadante de cultivo celular que contiene péptidos GLP-1 secretados de células o GLP-1(7-37) sintético (Bachem) con plasma enriquecido con linfocitos humanos que tenía actividad dipeptidilpeptidasa, a 37ºC y un 5% de CO_{2}, durante 3 ó 4 horas. Se utilizó GLP-1(7-37) sintético en sobrenadante de células transfectadas en falso como control positivo para la actividad de DPP-IV, lo cual mostró ser inhibido por la adición de un inhibidor de DPP-IV (#DPP4, Biotrend). El GLP activo se midió usando el GLP-1 (Activo) ELISA (#EGLP-35K, Biotrend), usando un anticuerpo que se une al epitopo N-terminal de GLP-1(7-37), discriminando el péptido GLP-1(9-37) inactivo, degradado con DPP-IV.

Los resultados se muestran en las Figuras 4 (células HEK293) y 5 (células hTERT-MSC). Las células HEK293 y hTERT-MSC son ambas huéspedes efectivos para el constructo genético. La enumeración de los resultados para las células transfectadas de tipos 1 a 3 es como en el Ejemplo 3 (1:100 ng de GLP-1(7-37) sintético disuelto en sobrenadante de células hTERT-MSC transfectadas en falso, 2: sobrenadante de células hTERT-MSC (clon 79TM217/13) que secreta GLP-1 dimérico del constructo #217, 3: sobrenadante de células AtT20 (clon 81-A-217/3) que secreta GLP-1 dimérico del constructo #217). Mientras que el constructo 1 produce GLP-1 de tipo silvestre, que es inactivado por DPP-IV de forma similar al GLP-1 sintético, las formas de GLP-1 alargado en sus terminales de la invención (2 y 3 en la Figura 4, 3 en la Figura 5) son más resistentes a la degradación y conservan al menos un 40% de actividad. Los péptidos GLP-1 alargados en sus terminales se estabilizan significativamente en plasma humano in vitro. El péptido con la secuencia de GLP-1 dimérico (3) está casi completamente estabilizado a la degradación por DPP-IV
in vitro.

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Ejemplo 5

Análisis Western Blot de péptidos GLP-1

Se produjeron varios péptidos GLP-1 sintéticamente en fase sólida (syn) o recombinante usando E. coli (rec). Los péptidos GLP-1 (31 ng SEQ ID NO: 1 y 10 ng de cada SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8) fueron separados en un gradiente del 10%-20% de SDS PAGE (120V, 90 minutos) y transferidos a una membrana de PVDF (Immobilon-P Membrane 0,45 \mum Millipore IPVH 00010) mediante Blotting semi-seco (2,0 MA/cm^{2}, 60 minutos). Después de la fijación y bloqueo con metanol (3% (p:v) BSA, 0,1% (v:v) Tween-20 en TBS), la membrana fue sometida a inmunoblotting (inmunotransferencia) con 1 \mug/ml de anticuerpo anti-GLP-1 (HYB 147-12, Antibodyshop) a 4ºC o/n. Después de lavado e incubación con 0,02 \mug/ml de anticuerpo de detección (Anti-ratón IgG, HPR conjugado, Perkin Elmer PC 2855-1197) a temperatura ambiente durante 4 horas, la detección de quimioluminiscencia revela la ubicación de la proteína. La Figura 6 muestra un Western Blot para los péptidos indicados. Los siguientes valores pueden darse: SEQ ID NO: 1 (ID1syn) corresponde a GLP-1(7-37), 31 aa, 3,3 kD; SEQ ID NO: 8 (ID8 syn, CM3) corresponde a GLP-1(7-37)-IP2, 46 aa, 5,1 kD; SEQ ID NO: 7 (ID7rec, CM2) corresponde a GLP-1(7-37)-IP2-RR-GLP2, 83 aa, 9,4 kD; SEQ ID NO: 6 (ID6syn, CM1) corresponde a GLP-1(7-37)-IP2-RR-GLP1(7-37), 79 aa,
8,7 kD.

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Ejemplo 6

Estabilidad en plasma humano in vitro de los péptidos GLP-1^{CM}

Péptidos GLP-1 sintéticos (SEQ ID NO: 1_{syn}, SEQ ID NO: 6_{syn}, SEQ ID NO: 7_{rec}, SEQ ID NO: 8_{syn}) se incubaron a concentraciones de 20 ng/ml con plasma humano a 37ºC y un 5% de CO_{2} durante 3 horas. La actividad dipeptidilpeptidasa del plasma fue inhibida por un inhibidor de DPP-IV (#DPP4, Biotrend). El GLP activo se midió usando el GLP-1 (activo) ELISA (#EGLP-35K, Biotrend).

Por contraste con el GLP-1_{(7-37)} nativo (SEQ ID NO: 1), los péptidos GLP-1 alargados en sus C-terminales de la invención SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 se estabilizan significativamente en plasma humano in vitro (Figura 7). Como control (en el lado derecho), se muestran los resultados obtenidos para los experimentos con la adición de DPP-IV. La actividad de GLP-1 se conserva completamente en estos experimentos de control.

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Ejemplo 7

Bioensayo in vitro Producción de AMP cíclico

Células RIN-5F (tumor de células de los islotes de rata; ECACC No. 95090402) se cultivaron en placas de 24 pocillos durante 4 días alcanzando un 70% de confluencia. Las células fueron lavadas dos veces con DMEM (E15-009, PAA) antes de la adición de 0,5 ml de DMEM (E15-009, PAA) complementado con un 1% de HSA (Aventis), 0,2 mM de IBMX (858455, Sigma) y los péptidos de prueba. Después de una incubación de 20 minutos a 25ºC, las células se lavaron dos veces con PBS helado. El cAMP celular se extrajo mediante la adición de HCl 0,1N que contenía un 0,5% de Triton X-100. El AMP cíclico se cuantificó usando el cAMP (bajo pH) EIA (Cat. DE0355, R&D). Para la estimulación se emplearon 3\cdot10^{-8}M SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 6_{syn}, SEQ ID NO: 6_{rec}, SEQ ID NO: 7_{rec}, SEQ ID NO: 8_{syn}.

Los resultados se muestran en la Figura 8. Un 100% de producción de cAMP corresponde a la producción basal en ausencia de GLP-1. El GLP-1 se une a los receptores acoplados a la proteína G y estimula la producción de cAMP. Todas las moléculas probadas incrementan la producción de cAMP celular.

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Ejemplo 8

Bioactividad in vivo

Ratones diabéticos de tipo II de 11 semanas de edad (C57BL/Ks-Lepr^{db/db}, Harlan) fueron tratados con 5 \mug de péptido mediante inyección subcutánea dos veces al día a las 9 de la mañana y 5 de la tarde (n=5 por grupo). La glucosa en sangre se midió antes (día 0) y después del tratamiento con los péptidos GLP^{CM} (día 2, 4, 7, 10) a las 10 de la mañana después de un periodo de ayuno durante la noche. Los datos se presentaron en relación con los niveles de glucosa en sangre medidos el día 0.

Todos los péptidos de la invención ensayados (SEQ ID NO: 6 (sintético o recombinante) y SEQ ID NO: 7 (sintético o recombinante)) tienen un efecto anti-hiperglucémico. Los mejores resultados se obtuvieron con la SEQ ID NO: 6 (CM1) recombinante y la SEQ ID NO: 8 (CM3) sintética. En la Figura 9 (eje Y) se muestra el efecto relativo del tratamiento. La glucosa en sangre el día = 0 se estableció en 1. Los animales no tratados sufren de un incremento continuo del nivel de glucosa en sangre con el tiempo, mientras que los animales tratados con los péptidos de la invención muestran a groso modo una reducción continua del nivel de glucosa en sangre con el tiempo.

2

Secuencia ID No.: 1

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3

Secuencia ID No.: 2

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4

Secuencia ID No.: 3

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5

Secuencia ID No.: 4

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6

Secuencia ID No.: 5

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7

Secuencia ID No.: 6

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8

Secuencia ID No.: 7

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9

Secuencia ID No.: 8

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10

Secuencia ID No.: 9

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11

Secuencia ID No.: 10

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12

Secuencia ID No.: 11

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13

Secuencia ID No.: 12

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14

Secuencia ID No.: 13

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15

Secuencia ID No.: 14

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16

Secuencia ID No.: 15

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17

Secuencia ID No.: 16

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Secuencia ID No.: 17

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Secuencia ID No.: 18

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20

Secuencia ID No.: 19

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21

Secuencia ID No.: 20

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22

Secuencia ID No.: 21

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23

Secuencia ID No.: 22

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24

Secuencia ID No.: 23

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25

Secuencia ID No.: 24

Claims (27)

1. Péptido de fusión que comprende como componente (I) N-terminal:

i). GLP-1 (7-37) de SEQ ID NO: 1 o una secuencia funcional que ejerce los efectos biológicos de GLP-1 como la hormona incretina, su acción antiapoptótica o sus propiedades neurotróficas y que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con GLP-1 (7-37), o

ii). un péptido GLP-1 modificado que consiste en la secuencia de aminoácidos de fórmula II:

(II)Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23- Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37

donde Xaa7 es L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, 3-hidroxi-histidina, homohistidina, N-acetil-histidina, a-fluorometil-histidina, a-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina o 4-piridlalanina; Xaa8 es Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Lys, Aib, ácido (1-aminociclopropil)carboxílico, ácido (1-aminociclobutil)carboxílico, ácido (1-aminociclopentil)carboxílico, ácido (1-aminociclohexil)carboxílico, ácido (1-aminocicloheptil)carboxílico o ácido (1-aminociclooctil)carboxílico; Xaa16 es Val o Leu; Xaa18 es Ser, Lys o Arg; Xaa19 es Tyr o Gln; Xaa20 es Leu o Met; Xaa22 es Gly, Glu o Aib; Xaa23 es Gln, Glu, Lys o Arg; Xaa25 es Ala o Val; Xaa26 es Lys, Glu o Arg; Xaa27 es Glu o Leu; Xaa30 es Ala, Glu o Arg; Xaa33 es Val o Lys; Xaa34 es Lys, Glu, Asn o Arg; Xaa35 es Gly o Aib; Xaa36 es Arg, Gly o Lys o amida o está ausente; Xaa37 es Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, amida o está ausente,

y como componente (II) una secuencia peptídica C-terminal de al menos 9 aminoácidos y que contiene una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 22 (RRDFPEEVAI) o una secuencia que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 22, y que otorga una resistencia mejorada a la inactivación de DPP-IV del péptido de fusión,

donde, el N-terminal del péptido de fusión es el componente (I) como tal, o una secuencia peptídica señal, que se fusiona a través de una secuencia de segmentación por proteasa al N-terminal del componente (I), o un péptido señal, que se fusiona sin la secuencia de segmentación por proteasa entre el N-terminal del componente (I), o una secuencia líder, que se fusiona a través de una secuencia de segmentación por proteasa al N-terminal del componente (I), siendo heterólogo al preproglucagón.

2. Péptido de fusión según la reivindicación 1, caracterizado porque el componente (I) es un péptido GLP-1 modificado que comprende la secuencia de aminoácidos de fórmula III:

(III)Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala- Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37

en la que Xaa7 es L-histidina, D-hisitidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, 3-hidroxi-histidina, homohistidina, N-acetil-histidina, a-fluorometil-histidina, a-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina o 4-piridilalanina; Xaa8 es Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Lys, Aib, ácido (1-aminociclopropil)carboxílico, ácido (1-aminociclobutil)carboxílico, ácido (1-aminociclopentil)carboxílico, ácido (1-aminociclohexil)carboxílico, ácido (1-aminocicloheptil)carboxílico o ácido (1-aminociclooctil)carboxílico; Xaa18 es Ser, Lys o Arg; Xaa22 es Gly, Glu o Aib; Xaa23 es Gln, Glu, Lys o Arg; Xaa26 es Lys, Glu o Arg; Xaa30 es Ala, Glu o Arg; Xaa34 es Lys, Glu o Arg; Xaa35 es Gly o Aib; Xaa36 es Arg o Lys, amida o está ausente; Xaa37 es Gly, Ala, Glu o Lys, amida o está ausente.

3. Péptido de fusión según la reivindicación 1, caracterizado porque el componente I es GLP-1 (7-35) o GLP-1 (7-36).

4. Péptido de fusión según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el componente (II) es una secuencia peptídica que contiene una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO.: 23 (RRDFPEEVAIVEEL) o la SEQ ID NO. 24 (RRDFPEEVAIAEEL) o una secuencia que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOS.: 23 ó 24.

5. Péptido de fusión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 4, caracterizado porque el componente (II) es una secuencia peptídica que contiene una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO.: 2 (RRDFPEEVAIVEELG) ó la SEQ ID NO. 3 (RRDFPEEVAIAEELG) o una secuencia que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOS.: 2 ó 3.

6. Péptido de fusión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 5, caracterizado porque el componente (I) y el componente (II) están enlazados directamente o enlazados a través de una secuencia enlazante.

7. Péptido de fusión según la reivindicación 6, caracterizado porque la secuencia enlazante tiene una longitud de 1 a 10 aminoácidos.

8. Péptido de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el péptido de fusión contiene una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO.: 8:

(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIAEELG)

o con la SEQ ID NO: 12:

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIVEELG

o una secuencia que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOS. 8 ó 12.

9. Péptido de fusión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 8, caracterizado porque el péptido de fusión contiene otro componente (III) enlazado al C-terminal del componente (II).

10. Péptido de fusión según la reivindicación 9, caracterizado porque el componente (III) comprende al menos cuatro residuos de aminoácidos o preferentemente al menos 10 residuos de aminoácidos o especialmente al menos 20 residuos de aminoácidos.

11. Péptido de fusión según la reivindicación 9 ó 10, caracterizado porque el componente (III) comprende al menos 4, preferentemente al menos 10, especialmente al menos 20 residuos de aminoácidos de la secuencia N-terminal de GLP-2 como en el proglucagón o de GLP-1 (7-37).

12. Péptido de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque el componente (III) contiene la secuencia de las SEQ ID NOS.: 4 ó 5, o una secuencia que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOS. 4 ó 5.

13. Péptido de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, caracterizado porque el péptido de fusión contiene una secuencia peptídica seleccionada de entre un grupo que consiste en: SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 10 y SEQ ID NO. 11 o una secuencia que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con las SEQ ID NOS.: 6, 7, 10 u 11.

14. Péptido de fusión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 13, caracterizado porque al menos uno de los aminoácidos es derivatizado por una modificación covalente de una cadena lateral de un aminoácido de origen natural, mediante la modificación del NH_{2} o grupos carboxi terminales.

15. Péptido de fusión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 14, caracterizado porque el péptido de fusión comprende una proteína portadora, en particular transferrina o albúmina, como componente (IV).

16. Péptido de fusión según la reivindicación 14, caracterizado porque al menos uno de los aminoácidos es derivatizado por un grupo lipilo o carbohidrato.

17. Péptido de fusión según la reivindicación 14 ó 16, caracterizado porque el residuo His N-terminal de GLP-1 (GLP-1 (7)) está modificado químicamente en su terminal NH_{2} y/o en su cadena lateral histidilo, en particular por una porción hidrofóbica.

18. Método para producir un péptido de fusión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 17, mediante la síntesis de péptidos en estado sólido.

19. Péptido de fusión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 17 como medicamento para su uso en terapia humana o animal.

20. Ácido nucleico que codifica un péptido de fusión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 13 ó 15.

21. Vector que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 20.

22. Célula huésped que comprende ADN introducido exógenamente según la reivindicación 20, en particular un vector según la reivindicación 21, que es capaz de expresar dicho péptido de fusión, donde la célula huésped no es una célula madre embrionaria humana.

23. Método para producir un péptido de fusión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 13 ó 15, en el que un microorganismo transformado para incluir un ácido nucleico que codifica el péptido de fusión se fermenta y se recupera la proteína.

24. Método para producir una proteína según la reivindicación 23 en el que se cultivan células animales en condiciones en las cuales la proteína es exportada de las células.

25. Utilización de un péptido de fusión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 17, de un ácido nucleico según la reivindicación 20, de un vector según la reivindicación 21 o de una célula huésped según la reivindicación 22 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la diabetes mellitus de tipo I o de tipo II, la resistencia a la insulina, trastornos de peso y enfermedades o condiciones asociadas al mismo.

26. Utilización de un péptido de fusión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 17, de un ácido nucleico según la reivindicación 20, de un vector según la reivindicación 21 o de una célula huésped según la reivindicación 22 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos y enfermedades o condiciones asociadas a los mismos.

27. Utilización de un péptido de fusión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 17, de un ácido nucleico según la reivindicación 20, de un vector según la reivindicación 21 o de una célula huésped según la reivindicación 22 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de trastornos y enfermedades o condiciones asociadas a la apoptosis.