RS51319B - GLP-l (GLUKAGON-LIKE PEPTID-l) FUZIONI POLIPEPTIDI SA POVEĆANOM OTPORNOSTI NA PEPTIDAZE - Google Patents

Description

[0001]Ovaj se pronalazak odnosi na nove GLP-1 fuzione peptide koji imaju izdužene C terminuse, otporni su na inaktivisanje endopeptidazom IV, mogu da imaju visok nivo eksprimisanja u transformisanim animalnim ćelijama, te su npr. korisni u lečenju dijabetesa tipa 2.

[0002]Gen za glukagon dobro je izučen, vidi npr. White, J.W. et al., 1986 Nucleic Acid Res. 14(12) 4719-4730. Molekul preproglukagona kao prekursorski molekul visoke molekularne težine sintetizuje se u alfa ćelijama pankreasa i L ćelijama jejunuma i kolona. Preproglukagon je 180 aminokiselina dug prohormon i njegova sekvenca sadrži, pored glukagona, dv'e sekvence srodne strukture :-glukagonu nalik peptid-1 (GLP-1) i glukagonu nalik peptid-2 (GLP-2). U molekulu preproglukagona, izmeđuj GLP-1 i GLP-2 nalazi se sekvenca peptida od 17 aminokiselina (ili bolje sekvenca od 15 aminokiselina plus C-terminalno RR mesto cepanja), intervenioni peptid 2 (IP2). Sekvenca IP2 (smeštena između GLP-1 i -2 u molekulu prekursora) normalno se čepa proteolitički iza aminokiseline 37 od GLP-1. Preproglukagonski modul se prema tome čepa u različite peptide, zavisno o ćeliji i okolini, uključujući GLP-1 (1-37), peptid sa 37 aminokiselina u neprocesuisanom obliku. Opšte uzevši, ovo procesuisanje se dešava u pankreasu i crevu. Sekvenca GLP-1 (1-37) može da se dalje proteolitički procesuiše u aktivan GLP-1 (7-37), procesuisani oblik sa 31 aminokiselinom, ili GLP-1 (7-36) amid. Prema tome, oznaka GLP-1 (7-37) označava kako fragment u pitanju obuhvata aminokiselinske ostatke od (i uključno sa) broja 7 do (i uključno sa) broja 37 kada se broji od N-terminalnog kraja matičnog peptida, GLP-1. Sekvenca aminokiselina GLP-1 (7-36) amida i GLP-1 (7-37) data je u formuli I:

[0003]GLP-1 je hormon creva i najjači je endogeni inzulinotropični agens sa dejstvima koja uključuju stimulisanje aktivnosti adenilat ciklaze i protein kinaze u beta-ćeliji. Fiziološki, zajedno sa gastričnim inhibicionim polipeptidom iz gornjeg creva, funkcioniše kao inkretinski hormon snižavajući nivo glukoze u krvi. Prema tome, GLP-1, izlučen u odgovor na unos hrane, ima višestruka dejstva na npr. želudac, jetru, gušteraču i mozak koja zajedno rade kako bi se regulisao šećer u krvi. Posledično, glukagonu nalik peptid GLP-1 (7-36) amid i njegov neamidovani analog GLP-1 (7-37) privukli su značajan interes zbog njihovih snažnih dejstava na metabolizam ugljenih hidrata i njihove potencijalne primene u lečenju dijabetesa, uključujući dijabetes tipa 2. Dijabetes tipa 2 karakterizuje otpornost na inzulin, jer ćelije ne odgovaraju normalno kada je inzulin prisutan. To je problem komplcksniji od dijabetesa tipa 1. Dijabetes tipa 2 može da traje neprimećeno kod pacijenta godinama pre dijagnoze, jer su simptomi tipično blaži (nema ketoacidoze) i mogu da budu sporadični. Međutim, neprimećeni dijabetes tipa 2 može da rezultira ozbiljnim komplikacijama, uključujući zatajenje bubrega i koronarnu bolest srca. To vodi povećanom morbiditetu i mortalitetu.

[0004]GLP-1 (7-36) amid ili GLP-l(7-37) jc kratkoživući u serumu. Peptid se čepa pomoću dipeptidil peptidaze IV (DPP-IV) između ostataka 8 i 9. Pocepani peptid je inaktivan. Zbog toga je GLP-1, primenjen ekzogeno, izuzetno kratkoživući i ima ograničenu upotrebljivost u terapeutske svrhe.

[0005]Napravljeni su različiti pokušaji da se sintetizuju stabilisani (prema DPP-IV) analozi GLP-1 (GLP-1 (7-37)) kojeg se nalazi u prirodi. Naročito je 8. ostatak, koji je in vivo Ala, zamenjivan drugim ostatkom, na primer Gly, Ser ili Thr (Burcelin, R., et al. (1999) Metabolism 48, 252-258). Gly8 ili G8 analog je detaljno testiran, i kao sintetizovan molekul, i proizveden pomoću ćelijskih linija genetski izmenjenih da izlučuju mutantni polipeptid (Burcelin, R., et al (1999) Annals of theNevv York Academy of Sciences 875: 277-285). Razne druge modifikacije su uvedene u GLP-1 (7-37) da se poboljša njegova in vivo stabilnost bez smanjivanja njeove biološke aktivnosti. Međutim, svi ti pristupi nisu postigli bilo kakvu značajniju terapeutsku važnost zbog toga jer su uključivali znatne probleme.

[0006]WO 02/46227 otkriva GLP-1 fuzione proteine, obuhvatajući jedinjenja glukagonu nalik peptida-1 fuzionisana na proteine podesne da produljein vivopoluživot peptida. Naročito, WO 02/46227 opisuje fuzioni protein GLP-1 sa albuminom ili imunoglobulinom. Prema WO 02/46227 takvi proteini mogu da se koriste za lečenje diabetes mellitus-a nezavisnog o inzulinu, kao i raznih drugih obolenja. Međutim, WO 02/46227 ne otkriva fuzione proteine koji obuhvataju kao komponentu (I) N-terminalno GLP-1 (7-35, 7-36 ili 7-37) ili derivate od toga i kao komponentu (II) C-terminalno peptidnu sekvencu koja sadržava sekvencu prema SEQ ID NO 22 (RRDFPEEVAI).

[0007]Slično tome, US 2003/0221201 otkriva fuzione proteine transferina i GLP-1. Slično tome, US 2003/0195154 opisuje fuzioni protein GLP-1 i transtiretina kao fuzionih partnera. Međutim, u US 2003/0221201 ili US 2003/0195154 ne otkrivaju se niti predlažu daljnji GLP-1 fuzioni proteini, naročito ne i daljnji mogući fuzioni partneri za GLP-1, sposobni da stabilišu GLP-1in vivo.

[0008]WO 99/46283 opisuje farmakološki aktivan konjugat peptida koji obuhvata

farmakološki aktivnu peptidnu sekvencu (X), poput GLP-1, i stabilizujuću peptidnu sekvencu (Z) od 4 do 20 aminokiselinskih ostataka, koje su kovalentno vezane na farmakološki aktivnu peptidnu sekvencu (X). Stabilizujuća peptidna sekvenca (Z) mogu da budu npr. Lysp-Xaaq ili Xaap-Lysq sekvence, u čemu su p i q celi brojevi u rasponu od 1 do 14, uz uslov daje p+q u rasponu 3-15, i svaki Xaaje nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Arg, His, Orn, 2,4-diaminobutanoične kiseline, 2,3-diaminopropanoične kiseline i Met, osobito kratke peptidne sekvence formule Lys3-Glu3ili Glu3-Lys3. WO 99/46283 ne otkriva fuzione proteine koji obuhvataju kao komponentu (I) N-terminalno GLP-1 (7-35, 7-36 ili 7-37) ili derivat od toga i kao komponentu (II) C-terminalno peptidnu sekvencu koja sadržava sekvencu prema SEQ ID NO 22 (RRDFPEEVAI).

[0009]WO 03/058203 otkriva GLP-1 peptid spregnut sa produženim C-terminusom koji pruža povećanu stabilnost. Ovaj produženi C-terminus obuhvata najmanje 6 aminokiselina, poželjno 7 do 9 aminokiselina. WO 03/058203 ne otkriva GLP-1 fuzione proteine koji obuhvataju sekvencu prema SEQ ID NO 22 (RRDFPEEVAI) kao produženi C-terminus.

[0010]US 2004/0146985 opisuje GLP-1 (7-37) fuzioni protein koji sadržava više kopija GLP-1 (7-37) peptida za proizvodnju ovog terapeutskog agensa u većoj meri. US 2004/0146985 ne otkriva GLP-l(7-37) fuzioni protein koji obuhvata kao komponentu (I) N-terminalno GLP-1 (7-35, 7-36 ili 7-37) ili derivate od toga i kao komponentu (II) C-terminalno peptidnu sekvencu koja sadržava sekvencu prema SEQ ID NO 22

(RRDFPEEVAI).

[0011]US 5,861,284 otkriva fuzione peptide GLP-1 (7-37) i aminokiselinsku sekvencu dobivenu iz faktora rasta fibroblasta na C-terminusu. Pronalazak iz US 5,861,284 je naročito usmeren na proizvodnju peptida bez cisteina, proizvedenih putem fuzionog proteina koji obuhvata protein sa cisteinom na njegovom N-terminalnom delu i peptida bez cisteina ligiranog na njegov N-terminalni deo, te naknadnog odcepljivanja peptida bez cisteina. US 5,861,284 ne otkriva fuzione peptide od GLP-1 (7-37) i peptidne sekvence koja sadržava sekvencu prema SEQ ID NO 22 (RRDFPEEVAI).

[0012]Pregled od Kieffer et al. (Endocrine Revievvs (1999) Vol. 20, No. 6, stranice 876-913) i pregled od Drucker et al. (Mol. Endocrinol. (2003) Vol. 17, No. 2, stranice 161-171) otkrivaju aminokiselinsku sekvencu proglukagona pri čemu su u ovaj peptid kojeg se nalazi u prirodi fuzionisani GLP-1 peptid, IP-2 i GLP-2 peptid. Unutar toga nisu otkriveni drugi fuzioni peptidi GLP-1 (7-37, 7-36 ili 7-35).

[0013]Nadalje, pregled od Perry et al. (Current Alzheimer's Research, 2005, 2, 377-385) odnosi se na odnos između GLP receptorskog puta i Alzheimerove bolesti. Niti jedan fuzioni peptid GLP-1 prema ovom pronalasku nije otkriven u Perryet al.(2005).

[0014]WO 98/08871 otkriva raličite derivate GLP-1, posebno derivat GLP-1 u kojem najmanje jedna aminokiselina iz GLP-1 ima lipofilni supstituent. Međutim, WO 98/08871 ne otkriva niti GLP-1 fuzione peptide od GLP-1 (7-37, 7-36 ili 7-35) niti peptidni produžetak C-terminusa GLP-1.

[0015]U WO/9953064, Thorens, B. otkriva strategiju za stvaranje multimerne GLP-1 ekspresione kazete koja može da se ugradi u različite tipove ćelija koji su javno dostupni, imortalizovane ćelijske linije i primarne ćelijske kulture koje se dele. Primeri uključuju EGF-responsivne neurosfere, bFGF-responsivne neuralne progenitorske matične ćelije iz CNS-a sisara, dok radni primer koristi ćelije bubrega mladunčeta hrčka, BHK ćelije. Navodi se kako su implantirane transfektovane ćelije korištene kako bi se uspešno lečilo dijabetične miševe, omogućujući kontrolu glukoze značajno ekvivalentnu kontrolama bez dijabetesa. Međutim, te tehnike ne zadovoljavaju zahteve kako bi se lečenje rutinski primenjivalo na pacijentima s dijabetesom.

[0016]Još jedan pristup egzogenom stabilizovanju nivoa glukoze baziran na novoj klasi lekova poznatih kao mimetici inkretina, ispituje se za lečenje dijabetesa tipa 2. Eksenatid (Byetta®) je sintetska verzija prirodnog jedinjenja pronađenog u slini guštera gilsko čudovište. U kliničkim ispitivanjima, mimetik inkretina (eksenatid) pokazao je smanjivanje šećera u krvi i poboljšanja u markerima funkcije beta ćelija. Međutim, eksenatid pokazuje samo određene efekte humanog inkretinskog hormona glukagonu nalik peptida-1 (GLP-1).

[0017]U sažetku, trenutno nije dostupna delotvorna terapija za dijabetes tipa 2, koja omogućuje smanjenje nivoa glukoze u krvi na temelju GLP-1, drugim rečima moguće da se pruži terapija koja reflektira čitav spektar korisnih efekata poznatih za GLP-1, tj. njegovu aktivnost u fiziološkim koncentracijama kako bi se snažno smanjio ulazak nutrijenata u cirkulaciju smanjenjem brzine pražnjenja želuca u pretilih lica ili njegovu inzulin stimulišuću aktivnost. Prema tome, cilj je ovog pronalaska da se pruže peptidni molekuli bazirani na GLP-1 koji su biološki aktivni i otporni prema proteolitičkoj razgradnji.

[0018]Ovaj se pronalazak odnosi na fuzioni peptid koji obuhvata kao komponentu (I) N-terminalno, 1. (i) GLP-1 (7-37) sa SEQ ID NO: 1 ili funkcionalnu sekvencu koja pokazuje biološka dejstva GLP-1 kao inkretinskog hormona, njegovo antiapoptotičko delovanje ili njegova neurotrofične osobine i koja ima najmanje 80% identiteta sekvence sa GLP-1 (7-37), ili 2. (ii) a modifikovani GLP-1 peptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence formule II: Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaal 6-Ser-Xaal8-Xaal9-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37, u čemu Xaa7 je L-histidin, D-histidin, dezamino-histidin, 2-amino-histidin, 3-hidroksi-histidin, homohistidin, N-acetil-histidin, a-fluorometil-histidin, a-metil-histidin, 3-piridilalanin, 2-piridilalanin ili 4-piridilalanin; Xaa8 je Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Lys, Aib, (1-aminociklopropil) karboksilna kiselina, (1-aminociklobutil) karboksilna kiselina, (1-aminociklopentil) karboksilna kiselina, (1-aminocikloheksil) karboksilna kiselina, (1-aminocikloheptil) karboksilna kiselina ili (1-aminociklooktil) karboksilna kiselina; Xaal6 je Val ili Leu; Xaal8 je Ser, Lys ili Arg; Xaal9 je Tyr ili Gln ; Xaa20 je Leu ili Met; Xaa22 je Gly, Glu ili Aib; Xaa23 je Gin, Glu, Lys ili Arg ; Xaa25 je Ala ili Val ; Xaa26 je Lys, Glu ili Arg; Xaa27 je Glu ili Leu; Xaa30 je Ala, Glu ili Arg; Xaa33 je Val ili Lys; Xaa34 je Lys, Glu, Asn ili

Arg; Xaa35 je Gly ili Aib; Xaa36 je Arg, Gly ili Lys ili amid ili nedostaje; Xaa37 je

Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, amid ili nedostaje,

i kao komponentu (II) C-terminano peptidnu sekvencu od najmanje 9 aminokiselina i koja sadržava sekvencu prema SEQ ID NO: 22 (RRDFPEEVAI) ili sekvencu koja ima najmanje 80% identiteta sekvence sa SEQ ID NO: 22, i pruža poboljšanu otpornost prema inaktivisanju fuzionog peptida sa DPP-IV,

u čemu N-terminus fuzionog peptida jest komponenta (I) kao takva ili signalna peptidna sekvenca, koja je fuzionisana putem sekvence za cepanje proteazom na N-terminus komponente (I), ili signalni peptid, koji je fuzionisan bez sekvence za cepanje proteazom između njega i N-terminusa komponente (I), ili vodeća sekvenca, koja je fuzionisana putem sekvence za cepanje proteazom na N-terminus komponente (I), u čemu su signalni peptid i vodeća sekvenca heterologni preproglukagonu.

[0019] Poželjno, ovaj se pronalazak odnosi na fuzioni peptid kako je iznad definisan, u čemu komponenta (I) jest GLP-1 (7-35) ili GLP-1 (7-36).

[0020] Ovaj se pronalazak bazira na otkriću daje nastali peptid iz pronalaska zaštićen od proteolitičke razgradnje in vivo, uglavnom zbog proteolitičke aktivnosti endopeptidaze IV. Peptid iz pronalaska koji ima najmanje dve komponente (I) i (II) kako je iznad definisano pokazuje biološku aktivnost GLP-1 i, istovremeno, daje stabilnost GLP-1 kao njegova komponenta (I) putem elongacije C-terminalno.

[0021] Termin " peptid iz pronalaska" kako se ovde koristi predstavlja fuzioni peptid kako je ovde definisano, varijantu, analog, fragment ili derivat od toga, uključujući kombinacije npr. derivatizovanog fragmenta, analoga ili varijante fuzionog peptida. Termin "GLP-1 peptid" kako se ovde koristi znači GLP-l(7-35, 36 ili 37), dok "modifikovani GLP-1 peptid" podrazumeva bilo kakav analog GLP-1, derivat GLP-1, varijantu GLP-1 ili fragment GLP-1, uključujući derivatizovani fragment, analog ili varijantu GLP-1(7-35, 36 ili 37), koji mogu da se nađu kako u komponenti (I) tako i u (III) peptida iz pronalaska. Termin "GLP-2 peptid" kako se ovde koristi predstavlja GLP-2 (1-33, 34, ili 35), dok "modifikovani GLP-2 peptid" podrazumeva bilo kakav analog GLP-2, fragment ili varijantu, derivat GLP-2 ili derivat analoga GLP-2, uključujući derivatizovani fragment, analog ili varijantu GLP-2(l-33, 34 ili 35). Varijante, analozi, fragmenti i derivati kategorizovani su kao modifikacije nemodifikovane sekvence, npr. GLP-l(7-35, 36 ili 37) ili GLP-2(l-33, 34 ili 35). Unutar značenja ovog pronalaska bilo koji varijanta, analog, fragment ili derivat moraju da budu funkcionalni, npr. da pokazuju ista ili slična biološka dejstva kao nemodifikovani GLP-1 peptid.

[0022] Peptid iz pronalaska je fuzioni peptid kako je iznad definisano ili varijanta, analog, fragment ili derivat od toga, u čemu komponenta (I) može da sadržava sekvencu koja ima barem 80 %, još poželjnije barem 85 % i čak još poželjnije barem 90 % identiteta sekvence sa SEQ ID No.: 1. SEQ ID No. 1 predstavlja nativnu aminokiselinsku sekvencu GLP-l(7-37)

(duljine 31 aminokiseline), koja je strogo konzervisana među sisarima.

[0023] Druga komponenta (komponenta (II)) fuzionog peptida kako je iznad definisano prema ovom pronalasku tipično sadržava peptidnu sekvencu koja formira strukturu nalik na B-okret. Struktura B-okreta je tipični elemenat sekundarne structure. Tipično ga formiraju četiri aminokliseline, koje menjaju smer glavnog lanca peptida ili proteina. Aminokiselinska sekvenca komponente (II) sadržava najmanje devet aminokiselina i sadržava najmanje jedan prolinski ostatak u svojoj sekvenci. Prolinski ostaci su uobičajene aminokiseline unutar B-okreta i formiraju tetramernu aminokiselinsku sekvencu. Prolinski ostatak se najuobičajenije nalazi na položaju 2 ili 3, poželjno 2, tetrameme sekvence B-okreta koja se nalazi u komponenti (II) fuzionog peptida.

[0024] Kako je iznad definisano, u inventivnom fuzionom peptidu komponenta (II) jest peptidna sekvenca koja sadržava sekvencu prema SEQ ID No.: 22 (RRDFPEEVAI) (sve peptidne sekvence dane su u jednoslovnom kodu) ili sekvenca koja ima barem 80% identiteta sekvence sa SEQ ID No.: 22. SEQ ID No.: 22 jest delimična sekvenca IP-2 (intervenioni peptid 2) sekvence pune duljine, koja sadržava N-terminalnih 10 aminokiselina od 15 aminokiselina duge IP-2 sekvence pune duljine. IP-2 je poželjni primer peptidne sekvence koja sadržava B-okret. Prema tome, druge još poželjnije sekvence sadržane u komponenti (II) jesu dulje delimične aminokiselinske sekvence od IP-2, kao sekvenca od N-terminalnih 14 aminokiselina koja se nalazi u ljudi (SEQ ID No.: 23 (RRDFPEEVAIVEEL)) ili njena mišja verzija (SEQ ID No. 24 (RRDFPEEVAIAEEL)) ili sekvenca koja ima barem 80% identiteta sekvence sa SEQ ID Nos.: 23 ili 24. Najpoželjnije kao elementi sadržani u komponenti (II) fuzionog peptida su sekvence IP-2 pune duljine koje imaju svih 15 aminokiselina od sekvence IP-2 koju se nalazi u prirodi (SEQ ID No.: 2 (RRDFPEEVAIVEELG), humana, ili SEQ ID No. 3 (RRDFPEEVAIAEELG), mišja) ili sekvenca koja ima barem 80% identiteta sekvence sa SEQ ID No.: 2 ili 3. Unutar opsega ovog pronalaska su također i sve izoforme od IP2 sisara (prirodne varijante IP2 među sisarima). Može da se predvidi više od jedne kopije sekvence uključene u komponentu (II), npr. 2, 3 ili čak i više kopija od IP2 ili fragmenta, varijante ili analoga ili derivata od IP2.

[0025]Prema tome, inventivni fuzioni peptid poželjno sadržava sekvencu prema SEQ ID

No.: 8 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIAEELG), tj. GLP-1(7-37) vezan bez ikakve sekvence linkera putem svog C-terminusa na mišji IP2 ili prema

SEQ IDNo.: 12 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIVEELG),

tj. GLP-l(7-37) vezan bez ikakve sekvence linkera putem svog C-terminusa na humani IP2. Varijante, analozi ili fragmenti od toga koji imaju sekvencu sa najmanje 80 % identiteta sekvence sa SEQ ID No: 8 i 12 ili derivati od toga također su obuhvaćeni.

[0026]Nevezano na bilo koju teoriju, pronalažači ovog pronalaska zaključuju kako je uzrok nestabilnosti GLP-1 (7-35, 36 ili 37), ako se primeni na nekom pacijentu kod kojeg postoji potreba za tim, njegova nezaštićena 3-dimenzionalna struktura. Proteaze mogu da pocepaju GLP-1 (7-35, 36 ili 37) peptid i brzo ukinu njegovu fiziološku aktivnost in vivo. Vezanjem peptidne sekvence za C-terminus GLP-l(7-35, 36 ili 37), njegova struktura dobija stabilnost prema enzimatskoj razgradnji. Porast stabilnosti je izvanredno pojačan ako se dodatna C-terminalna peptidna sekvenca (sadržana u komponenti (II) fuzionog peptida prema pronalasku) smota zbog prisustva strukturalnog elementa B-okreta formiranog njegovom primarnom strukturom i tako pruži čvrstoću komponenti (II). Nađeno je kako inventivni fuzioni peptid, zbog njegovog C-terminalnog peptidnog produženja koje poželjno sadržava strukturalni elemenat B-okreta, ima poboljšqanu otpornost na inaktivisanje sa DPP-IV. C-terminalni peptid se ili ne odcepi od sekvence GLP-1 (7-35, 36 ili 37) pre delovanja na njegov receptor u ciljnim ćelijama ili može da se pocepa enzimatski da formira GLP-1 (7-35, 36 ili 37) in vivo. Bez obzira na tačnu formu peptida iz pronalaska vezanog na mestu GLP-1 receptora, peptid iz pronalaska pokazuje svoju funkciju kao aktivno inzulinotropičko jedinjenje.

[0027] Peptidne sekvence, za koje se smatra da su podesne da budu sadržane u komponenti (II) zbog primarne structure koja formira elemenat B-okreta, mogu lako da se identifikuju podesnim npr. spektroskopskim metodama, npr. cirkularnim dihroizmom, ili drugim metodama poznatima stručnjaku.

[0028]Komponenta (II) i komponenta (I) mogu da budu vezane direktno ili vezane putem sekvence linkera. Poželjno, obe komponente su direktno vezane jedna za drugu. U slučaju da su vezane putem linkera (ili spacera), linker je poželjno peptidni linker ili organski linker. Peptidni linker tipično ima duljinu od 1 do 10 aminokiselina, poželjno 1 do 5, još poželjnije 1 do 3 aminokiseline, u nekim slučajevima sekvenca linkera može da bude čak i dulja i sadržava 11 do 50 aminokislina. Peptidni linker može da bude sastavljen od različitih aminokiselinskih sekvenci. Poželjno, peptidni će linker da uvede nešto strukturalne fleksibilnosti između komponenti koje trebaju da budu vezane. Strukturalna fleksibilnost se postiže npr. time da peptidni linker sadržava različite glicinske ili prolinske ostatke, poželjno najmanje 30%, još poželjnije najmanje 40% i još više poželjno najmanje 60 % prolinskih i glicinskih ostataka unutar sekvence linkera. Bez obzira na specifičnu sekvencu peptidni linker je poželjno imunološki inaktivan.

[0029] U poželjnom izvođenju ovog pronalaska, peptid iz pronalaska, tj. fuzioni peptid ili njegovi analozi, fragmenti, varijante ili derivati, sadržavaju treću komponentu (komponentu (III)) koja je vezana na C-terminus komponente (II). Sprega može da bude direktna ili indirektna putem sekvence linkera. Što se tiče sekvence linkera upućujete se na opis iznad za linker koji spaja komponentu (I) i komponentu (II). Opšte uzevši, komponenta (III) obuhvata najmanje četiri aminokiselinska ostatka, poželjno barem 10 dodatnih aminokiselinskih ostataka, još poželjnije najmanje 20, ili najmanje 30. Sa obzirom na funkcionalnost, komponenta (III) je predviđena da dodatno poboljša stabilnost inventivnog fuzionog peptida. Očekuje se da komponenta (III) ne interferira sa biološkom funkcijom inventivnog fuzionog peptida koja je približno usporediva sa biološkom aktivnošću GLP-1 (7-37).

[0030] Poželjno, komponenta (III) inventivnog fuzionog peptida obuhvata najmanje 4, poželjno najmanje 10, još poželjnije najmanje 20 dodatnih aminokiselinskih ostataka od N-terminalne sekvence izoforme GLP-2 bilo kojeg organizma sisara (ostale varijante GLP-2 koje se prirodno nalaze među sisarima), npr. mišje ili humane izoforme kako je prikazano u SEQ ID No: 4 i 5. GLP-2 se nalazi u proglukagonu i također je uključen u metabolizam ugljenih hidrata. Kao i sa biološki aktivnom sekvencom uključenom u komponentu (I) (GLP-1 peptid), komponenta (III) može također da obuhvata analoge, varijante ili derivate formi GLP-2 kojih se nalazi u prirodi. Alternativno, komponenta (III) može također da obuhvata najmanje 4, poželjno najmanje 10, još poželjnije najmanje 20 dodatnih aminokiselinskih ostataka N-terminalne sekvence GLP-1(7-37), prema tome uključujući sve izoforme iz sisara ili - kako je ovde otkriveno - sve funkcionalne varijante, analoge ili derivate od toga. Opšte govoreći, komponenta (III) može da sadržava bilo koju formu GLP-1 peptida ili modifikovani GLP-1 peptid, stoje ovde otkriveno kao podesno za komponentu (I) inventivnog fuzionog peptida. U daljnjoj alternativi, komponenta (III) može također da sadržava himerne forme GLP-1 (7-37) i GLP-2. Himerna forma može da se napravi sprezanjem GLP-1 (7-37) i GLP-2 (ili fragmenta, analoga, varijanti ili derivata od oba) jedan s drugim i naknadnim uvođenjem te himerne forme kao komponente (III) u peptid iz pronalaska. Poželjno, himerna forma se sastoji od delimične sekvence GLP-1 (7-37) i delimične sekvence GLP-2 vezanih zajedno. Npr. himerna forma može da uključuje N-terminalnih 5 do 30 aminokiselina od GLP-1 i C-terminalnih 5 do 30 aminokiselina od GLP-2 ili obratno, npr. aminokiseline 7 ili 8 do 22, 23, 24, 25, 26, 27, ili 28 od GLP-1 (7-37) i aminokiselinsku sekvencu od položaja 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ili 24 do npr. C-terminusa od GLP-2.

[0031]Ako se modifikacije formi GLP-2 ili GLP-1 (7-37) kojih se nalazi u prirodi koriste kao komponenta (III), komponenta (III) poželjno sadržava sekvencu SEQ ID No.: 4. ili 5 ili SEQ ID No.: 1, odnosno sekvencu koja ima najmanje 80% identiteta sekvence sa SEQ ID No.: 4 ili 5 ili SEQ ID No.: 1. Derivati tih poželjnih sekvenci, npr. zbog modifikacija bočnog lanca ili modifikacija osnovnog peptidnog lanca itd. (kako je ovde otkriveno pripadno pod "derivati"), također su obuhvaćeni kao komponenta (III) ovog pronalaska.

[0032]U drugom izvođenju, komponenta (III) može da sadržava više sekvenci kako je iznad opisano. Npr. komponenta (III) može da sadržava najmanje dve, poželjno 2, 3, ili 4 kopije GLP-1 (7-37) i/ili GLP-2 ili najmanje dve kopije sekvenci koje imaju barem 80% identiteta sekvence sa SEQ ID No: 1, 4 ili 5. Komponenta (III) može također da sadržava više od jedne kopije himerne verzije GLP-1(7-37) ili GLP-2, kako je iznad otkriveno, koje npr. eventualno formiraju kombinaciju himerne(ih) verzije(a) zajedno sa GLP-1(7-37) i/ili GLP-2 ili njegovim modifikacijama sa barem 80 % identiteta sekvence. Unutar opsega ovog pronalaska također su dve ili više, poželjno dve komponente (III), koje mogu da npr. budu (1) vezane njihovim N-terminusom na C-terminus komponente (II) putem linkera ili direktno. Ako su predviđene dve kompnente (III), one mogu da budu identične ili različite.

[0033]Prema tome, inventivni fuzioni peptidi koji sadržavaju tri komponente (I), (II) i (III) naročito su poželjni. Četiri specifična izvođenja koja sadržavaju sve te komponente izabrana su iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID No. 6 (N-GLP-l(7-37)-IP2(mišji)-RR-GLP-l(7-37)-C, ovde također označen i kao mišji CM1), SEQ ID No. 7 (N-GLP-l(7-37)-IP2(mišji)-RR-GLP2-C, ovde također označen i kao mišji CM2), SEQ ID No. 10 (N-GLP-1(7-37)-IP2(humani)-RR-GLP-l(7-37)-C, također označen kao humani CM1), i SEQ ID No. 11 (N-GLP-l(7-37)-IP2(humani)-RR-GLP-2-C), ovde također označen i kao humani CM2) ili sekvence sa najmanje 80% identiteta sekvence sa SEQ ID No.: 6, 7, 10, ili 11 ili derivata od toga. Sve sekvence 6, 7, 10 i 11 sadržavaju RR-Linker (dva argininska ostatka) na C-terminusu IP2 (komponenta (II)), koji alternativno također može da se odbaci. Komponenta (I) u svakom od izvođenja prema SEQ ID No:6, 7, 10 ili 11 je GLP-1 (7-37), dok je komponenta (III) ili GLP-l(7-37), ili GLP-2.

[0034] Inventivni fuzioni peptid ili komponente od toga mogu da budu u različitim modifikovanim formama. Te su modifikovane forme otkrivene i detaljnije opisane u tekstu koji sledi.

[0035] Termin "soli" ovde se odnosi i na soli karboksilnih grupa i na kisele adicione soli amino grupa fuzionih peptida opisanih iznad ili analoga, fragmenata, derivata ili varijanti od toga. Soli karboksilne grupe mogu da se formiraju na načine poznate u struci i uključuju anorganske soli, na primer soli natrijuma, kalcijuma, amonijuma, gvožđa (III) ili cinka i slično, i soli sa organskim bazama kao one formirane, na primer, sa aminima, poput etanolamina, arginina ili lizina, piperidina, prokaina i slično. Kisele adicione soli uključuju, na primer, soli sa mineralnim kiselinama, kao na primer hlorovodoničnom kiselinom ili sumpornom kiselinom, i soli sa organskim kiselinama, kao na primer sirćetnom kiselinom ili oksalnom kiselinom. Naravno, bilo koja takva sol mora da zadrži biološku aktivnost peptida iz pronalaska bitnu za ovaj pronalazak, tj. sposobnost da redukuje brzinu ulaska nutrijenata u cirkulaciju. Kako je ispod opisano, forme soli peptida mogu da budu sadržane u farmaceutskoj formulaciji.

[0036] "Fragment" fuzionog peptida prema ovom pronalasku odnosi se na bilo koji podskup molekula, to jest, na kraći peptid koji zadržava željenu biološku aktivnost. Fragmenti mogu lako da se pripreme uklanjanjem aminokiselina sa oba kraja molekula i testiranjem nastalog na njegove osobine kao inkretina. Proteaze koje uklanjaju po jednu aminokiselinu bilo sa N-terminalnog i/ili C-terminalnog kraja polipeptida su poznate, pa određivanje fragmenata koji zadržavaju željenu biološku aktivnost uključuje samo rutinsko eksperimentisanje. U zaključku, fragmenti mogu da nastanu delecijama aminokiselina na krajevima peptida i/ili aminokiselina smeštenih unutar peptidne sekvence.

[0037] "Varijanta" prema ovom pronalasku odnosi se na molekul koji je značajno sličan bilo čitavom inventivnom fuzionom peptidu definisanom iznad ili fragmentu od toga. Varijantni peptidi mogu lako da se pripreme direktnom hemijskom sintezom varijantnog peptida, koristeći metode poznate u struci. Naravno, takva varijanta inventivnog fuzionog peptida ima sličnu antidijabetičku, tj. inzulin stimulišuću aktivnost kao i odgovarajući GLP-1 peptid iz prirode.

[0038] Alternativno, varijante aminokiselinske sekvence fuzionih peptida definisane iznad mogu da se pripreme mutacijama u DNK koje kodiraju sintetizovane derivate. Takve varijante uključuju, na primer, delecije ili insercije ili supstitucije ostataka unutar aminokiselinske sekvence. Bilo koja kombinacija delecije, insercije i supstitucije može također da se umetne u finalni konstrukt, uz uslov da finalni konstrukt poseduje željenu aktivnost. Očito, mutacije koje imaju da se urade u DNK koja kodira varijantni peptid ne smeju da promene okvir čitanja i poželjno neće stvoriti komplementarne regije koje mogu da stvore sekundarnu m-RNK strukturu.

[0039] "Analog" fuzionih peptida definisanih iznad odnosi se na neprirodan molekul koji je značajno sličan bilo čitavom molekulu, bilo aktivnom fragmentu od toga. Takav analog imao bi identičnu aktivnost kao i odgovarajući GLP-1 peptid iz prirode.

[0040] Tipovi supstitucija koje mogu da se naprave u fuzionom peptidu iz pronalaska ili u komponenti od toga mogu da se baziraju na analizi frekvencija promena aminokiselina između homolognih proteina/peptida iz različitih vrsta. Temeljeno na takvoj analizi, konzervativne supstitucije mogu ovde da se definišu kao izmene unutar jedne od sledećih pet grupa: I. Mali, alifatički, nepolarni ili blago polarni ostaci: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly; II. Polarni, negativno naelektrisani ostaci i njihovi amidi: Asp, Asn, Glu, Gln; III. Polarni, pozitivno naelektrisani ostaci: His, Arg, Lys; IV. Veliki, alifatički nepolarni ostaci:

Met, Leu, Ile, Val, Cys; V. Veliki aromatički ostaci: Phe, Try, Trp.

[0041]Unutar prethodnih grupa, sledeće se supstitucije smatraju "visoko konzervativnim": Asp/Gln; His/Arg/Lys; Phe/Tyr/Trp; Met/Leu/Ile/Val. Semikonzervativne supstitucije definisane su kao izmene između dve od grupa (I) - (IV) iznad koje su ograničene na supergrupu (A), koja obuhvata (I), (II), i (III) iznad, ili na supergrupu (B), koja obuhvata (IV) i (V) iznad. Supstitucije nisu ograničene na genski kodirane ili čak aminokiseline kojih se nalazi u prirodi.

[0042]Opšte govoreći, analozi ili varijante inventivnog fuzionog peptida ili njegovih komponenti mogu također da sadržavaju supstitucije aminokiselina, napravljene npr. sa namerom poboljšavanja rastvorljivosti (zamena hidrofobnih aminokiselina sa hidrofilnim aminokiselinama). U jednom izvođenju varijanti/analoga GLP-1 peptida inventivnog fuzionog peptida (smeštenom u komponenti (I) i/ili (III) peptida iz pronalaska) taj (modifikovani) GLP-1 peptid je karakterisan sa jednom ili više supstitucija na položajima 7, 8, 11, 12, 16, 22, 23, 24,25, 27, 30, 33, 34, 35, 36, ili 37 GLP-1 peptida. Kao primer za sledeću nomenklaturu [Arg34-GLP-1 (7-37)] označava analog GLP-1 u čemu je lizin prirodno smešten na položaju 34 supstituisan sa argininom.

[0043]Specifično, komponenta (I) i/ili (III) inventivnog fuzionog peptida može da obuhvata varijante i analoge GLP-l(7-35, 36 ili 37) izabrane između Gln9-GLP-1 (7-37), D-Gln9-GLP-1(7-37), acetil-Lys9-GLP-l (7-37), Thrl6-Lysl8-GLP-1 (7-37), i Lysl8-GLP-1 (7-37), Arg34-GLP-1 (7-37), Lys38-Arg26-GLP-1 (7-38)-OH, Lys36-Arg26-GLP-1(7-36), Arg26,34-Lys38-GLP-1 (7-38), Arg26,34-Lys38-GLP-l(7-38), Arg26,34-Lys38-GLP-1 (7-38), Arg26,34-Lys38-GLP-1 (7-38), Arg26,34-Lys38-GLP-1 (7-38), Arg26-Lys38-GLP-1(7-38), Arg26-Lys38-GLP-l(7-38), Arg26-Lys38-GLP-1 (7-38), Arg34-Lys38-GLP-1 (7-38), Ala37-Lys38-GLP-1 (7-38), i Lys37-GLP-1 (7-37).

[0044]U drugom izvođenju ovog pronalaska inventivni fuzioni peptid sadržava kao komponentu (I) ili (III) modifikovani GLP-1 peptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sledeće formule II:

U čemu Xaa7 je L-histidin, D-histidin, dezamino-histidin, 2-amino-histidin, 3-hidroksi-histidin, homohistidin, N-acetil-histidin, a-fluorometil-histidin, a-metil-histidin, 3-piridilalanin, 2-piridilalanin ili 4-piridilalanin; Xaa8 je Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Lys, Aib, (1-aminociklopropil) karboksilna kiselina, (1-aminociklobutil) karboksilna kiselina, (1-aminociklopentil) karboksilna kiselina, (1-aminocikloheksil) karboksilna kiselina, (1-aminocikloheptil) karboksilna kiselina ili (1-aminociklooktil) karboksilna kiselina, u čemu je Gly naročito poželjan; Xaal6 se Val ili Leu; Xaal8 je Ser, Lys ili Arg; Xaal9 je Tyr ili Gln ; Xaa20 je Leu ili Met; Xaa22 je Gly, Glu ili Aib; Xaa23 je Gln, Glu, Lys ili Arg ; Xaa25 je Ala ili Val; Xaa26 je Lys, Glu ili Arg; Xaa27 je Glu ili Leu; Xaa30 je Ala, Glu ili Arg; Xaa33 je Val ili Lys; Xaa34 je Lys, Glu, Asn ili Arg; Xaa35 je Gly ili Aib; Xaa36 je Arg, Gly ili Lys ili amide ili absent; Xaa37 je Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, amid ili nedostaje.

[0045]U drugoj izvedbi ovog pronalaska komponenta (I) i/ili (III) inventivnog fuzionog peptida sadržava modifikovani GLP-1 peptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu sledeće formule III:

u čemu Xaa7 je L-histidin, D-histidin, dezamino-histidin, 2-amino-histidin, -hidroksi-histidin, homohistidin, N-acetil-histidin, a-fluorometil-histidin, a-metil-histidin, 3-piridilalanin, 2-piridilalanin ili 4-piridilalanin; Xaa8 je Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Lys, Aib, (1-aminociklopropil) karboksilna kiselina, (1-aminociklobutil) karboksilna kiselina, (1-aminociklopentil) karboksilna kiselina, (1-aminocikloheksil) karboksilna kiselina, (1-aminocikloheptil) karboksilna kiselina, ili (1-aminociklooktil) karboksilna kiselina; Xaal8 je Ser, Lys ili Arg; Xaa22 je Gly, Glu ili Aib; Xaa23 je Gin, Glu, Lys ili Arg ; Xaa26 je Lys, Glu ili Arg; Xaa30 je Ala, Glu ili Arg; Xaa34 je Lys, Glu ili Arg; Xaa35 je Gly ili Aib; Xaa36 je Arg ili Lys, amid ili nedostaje; Xaa37 je Gly, Ala, Glu ili Lys, amid ili nedostaje.

[0046]U određenom poželjnom izvođenju pronalaska komponenta (I) i/ili (III) inventivnog fuzionog peptida sadržava (modifikovani) GLP-1 peptid, koji je izabran između GLP-1 (7-35), GLP-1 (7-36), GLP-1 (7-36)-amida, GLP-1 (7-37). Također su poželjni peptidi iz pronalaska koji u svojim komponentama (I) i/ili (III) obuhvataju modifikovani GLP-1 peptid sa Aib ostatkom na položaju 8 ili aminokiselinskim ostatkom na položaju 7 pomenutog GLP-1 peptida, koji je izabran iz grupe koja se sastoji od D-histidina, dezamino-histidina, 2-amino-histidina, hidroksi-histidina, homohistidina, N-acetil-histidina, a-fluorometil-histidina, a-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina i 4-piridilalanina.

[0047]Primeri stvaranja supstitucija aminokiselina u proteinima koji mogu da se iskoriste za dobivanje analoga za korištenje u ovom pronalasku uključuju bilo koji poznati metodni korak, kao što je predstavljeno u SAD patentima RE 33,653; 4,959,314; 4,588,585 i 4,737,462, od Mark et al; 5,116,943 od Koths et al; 4,965,195 od Namen et al; i 5,017,691 od Lee et al, i lizinom substituisani proteini predstavljeni u SAD patentu 4,904,584 (Shaw et al).

[0048]Varijanta ili analog, kako su gore definisani i sadržani u komponenti (I), (II) i/ili (III), imati će središnju sekvencu, koja je ista kao i ona "nativne" sekvence, npr. GLP-1 (7-37) ili GLP-2 ili biološki aktivnog fragmenta od toga ili bilo koje IP2 izoforme, koja ima aminokiselinsku sekvencu sa najmanje 80% identiteta nativne aminokiselinske sekvence i zadržava njenu biološku aktivnost. Još poželjnije, sa najmanje 90% identiteta, ili najpoželjnije sa najmanje 95% identiteta nativne sekvence. Kada se kaže da određeni peptid ima specifičan procenat identiteta prema referentnom polipeptidu definisane duljine, procenat identiteta odnosi se prema referentnom peptidu. Prema tome, peptid koji je 50% identičan referentnom polipeptidu koji je 100 aminokiselina dug može da bude polipeptid od 50 aminokiselina koji je potpuno identičan sa 50 aminokiselina dugim delom referentnog polipeptida. Može također da bude polipeptid dug 100 aminokiselina, koji je 50% identičan sa referentnim polipeptidom u svoj njegovoj duljini. Naravno, i drugi peptidi mogu da zadovoljavaju taj uslov. Termin "identitet sekvence" kako se ovde koristi označava da se sekvence porede kako sledi. Sekvence se poravnaju koristeći Version 9 GAP-a (program za globalno poravnanje) od Genetic Computing Group, koristeći zadani (BLOSUM62) matriks (vrednosti -4 do +11) sa kaznom za otvaranje razmaka (gap open penaltv) od -12 (za prvi položaj razmaka) i kaznu za produženje razmaka (gap extension penaltv) od -4 (za svaki dodatni uzastopni položaj razmaka). Nakon poravnanja, procenat identiteta se izračuna izrazivši broj podudaranja kao procenat broja aminokiselina u traženoj sekvenci.

[0049]Derivati fuzionog peptida ili analozi, fragmenti ili varijante od toga također su obuhvaćeni ovim pronalaskom. Termin "derivati" inventivnog fuzionog peptida uključuje samo one modifikovane peptide iz pronalaska koji nemaju jednu aminokiselinu zamenjenu drugom od dvadeset uobičajenih aminokiselina iz prirode. Prema tome, genski kodirana aminokiselina može da bude modifikovana reagovanjem sa organskim agensom za derivatizovanje koji može da reaguje sa izabranim bočnim lancima ostataka ili amino ili karboksi grupama terminalnih ostataka (poželjno modifikujući kovalentno) ili uvođenjem neprirodnih aminokiselinae (proizvedenih hemijskom sintezom, npr. D-izomeri aminokiselina kodiranih genskim kodom, Aib (a-aminoizomaslačna kiselina), Abu (a-aminomaslačna kiselina), Tie (tert-butilglian), p-alanin, 3-aminometil benzojeva kiselina, antranilična kiselina) ili prirodnih aminokiselina koje nisu kodirane genskim kodom, npr. hidroksiprolin, y-karboksiglutamat, ornitin, fosfoserin, D-alanin i D-glutamin ili modifikovanjem glavnog lanca peptida alternativnim smatanjem peptidne osnove.

[0050]U sledećoj poželjnoj izvedbi otkrivaju se modifikacije aminokiselina inventivnog fuzionog peptida (što - kako je iznad definisano - također obuhvata varijante ili analoge fuzionog peptida), koje mogu da se nađu u inventivnom fuzionom peptidu na bilo kojem položaju (bilo kojoj aminokiselini), npr. smeštenoj u komponenti (I), (II) i/ili (III).

[0051]Cisteinilni ostaci, ako su prisutni u bilo kojoj formi inventivnog fuzionog peptida, npr. analogu inventivnog fuzionog peptide, uobičajeno reaguju sa alfa-haloacetatima (i odgovarajućim aminima), poput hlorosirćetne kiseline ili hloroacetamida, da se dobiju karboksilmetil ili karboksiamidometil derivati. Cisteinilni ostaci se također derivatizuju reagovanjem sa bromotrifluoroacetonom, alfa-bromo-beta-(5-imidazoil) propanskom kiselinom, hloroacetil fosfatom, N-alkilmaleimidima, 3-nitro-2-piridil disulfidom, metil-2-piridil disulfidom, p-hloromerkuribenzoatom, 2-hloromerkuri-4-nitrofenolom ili hloro-7-nitrobenzo-2-oksa-l ,3-diazolom.

[0052]Histidinski ostaci u inventivnom fuzionom peptidu mogu da se derivatizuju reagovanjem sa dietilprokarbonatom uz pH 5.5-7.0 jer je taj agens relativno specifičan prema histidilnom bočnom lancu. Parabromofenacil bromid je također koristan; reakcija se poželjno izvodi u 0.1M natrijum kakodilatu uz pH 6.0. Naročito je N-terminalni histidinski ostatak (His7) GLP-1(7-37) kako je sadržan u komponenti (I) i/ili (III) inventivnog fuzionog peptida veoma važan za inzulinotropičnu aktivnost GLP-1 peptida kako je prikazano u Suzuki et. al.

(Diabetes Res.; Clinical Practice 5 (Supp. 1): S30 (1988)). Prema tome, inventivni fuzioni peptid može da se modifikuje na His7 njegovog GLP-1 kao deo komponente (I) i/ili (III) pomoću alkil ili acil (C1-C6) grupa, ili zamenom His sa funkcionalno ekvivalentnim C5-C6 prstenastim strukturama. Poželjno modifikovanje jest uvođenje hidrofobnog dela na amino terminusu His7 ili njegovom histidilnom bočnom lancu.

[0053]Lizinski i amino terminalni ostaci inventivnog fuzionog peptida mogu npr. da se reaguju sa anhidridima sukcinske ili neke druge karboksilne kiseline. Derivatizovanje sa tim agensima deluje tako da menja naelektrisanje lizinskih ostataka. Acilnim (C12-C18) modifikacijama epsilon-amino grupe lizinskog(ih) ostat(a)ka u inventivnom fuzionom peptidu, povećava se njihov poluživot u cirkulaciji. Argininski ostaci mogu npr. da se modifikuju reagovanjem sa jednim ili više konvencionalnih reagensa, među njima fenilglioksalom; i ninhidrinom. Derivatizovanje argininskih ostataka zahteva da se reakcija izvodi u alkalnim uslovima zbog visokog pKa gvanidinske funkcionalne grupe. Nadalje, ti reagensi mogu da reaguju sa grupama lizina, kao i sa epsilon-amino grupom arginina.

[0054]Specifična modifikacija tirozinskih ostataka per se detaljno je proučavana. Najčešće, mogu da se koriste N-acetilimidazol i tetranitrometan da formiraju O-acetil tirozil vrstu, odnosno e-nitro derivat.

[0055]Karboksilne bočne grupe (aspartil ili glutamil) mogu selektivno da se modifikuju reagovanjem sa karbodiimidima (R'N-C-N-R') poput l-cikloheksil-3-[2-morfolinil-(4-etil)] karbodiimida ili l-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil) karbodiimida.

[0056]Nadalje, aspartatni i glutamatni ostaci mogu da se konvertuju u asparaginske i glutaminske ostatke reagovanjem sa jonima amonijuma.

[0057]Glutaminski i asparaginski ostaci mogu da se deamiduju do odgovarajućih glutamatnih i aspartatnih ostataka. Alternativno, ovi ostaci mogu da se deamiduju pod blago kiselim uslovima. Sve forme tih ostataka ulaze u opseg ovog pronalaska. Deamidovani inventivni fuzioni peptid ili komponente od toga mogu da imaju promenjenu osetljivost na proteolizu sa proteaznim ili peptidaznim enzimima, sugerišući kako deamidovanje može da ima fiziološku važnost u usmeravanju proteolitičkog cepanja inventivnog fuzionog peptida. Uočeno je kako bio-sintetički inventivni fuzioni peptid može da se degradiše pod određenim uslovima čuvanja, što rezultuje deamidovanjem na još jednom položaju u inventivnom fuzionom peptidu. Metioninski ostaci u inventivnim fuzionim peptidima mogu da budu podložni oksidovanju. primarno do sulfoksida. Kao i drugi derivati pomenuti iznad, i dezamid inventivni peptidi i/ili sulfoksid inventivni peptidi mogu da se koriste kako bi pokazali punu biološku aktivnost.

[0058]Ostali podesni reagensi za derivatizovanje ostataka koji sadržavaju alfa-aminokiseline uključuju imidoestre poput metil pikolinimidata; piridoksal fosfata; piridoksala; hloroborohiđrida; trinitrobenzenesulfonične kiseline; O-metilizouree; 2,4-pentandiona; i transaminazom katalizovane reakcije sa glioksilatom.

[0059]Terminalni ostaci aminokiselina inventivnog fuzionog peptida sa njihovim karboksilnim (C-terminus) i njihovim amino (N-terminus) grupama (kao i karboksi ili amino grupe bočnih lanaca, vidi iznad) mogu da budu prisutni u njihovoj zaštićenoj (npr. C terminus sa amidnom grupom) i/ili nezaštićenoj formi, korištenjem amino ili karboksil zaštitnih grupa. Također, mogu de se osiguraju kisele adicione soli inventivnog fuzionog peptida. Česte adicione soli su soli hidrohaličnih kiselina, tj., HBr, Hl, ili još poželjnije, HC1.

[0060]PEGilovanje terminalnih ili karboksil grupa bočnih lanaca ili epsilon-amino grupe lizina koje se nalaze u inventivnom fuzioniom peptidu, pruža otpornost na oksidovanje i također je unutar opsega ovog pronalaska.

[0061]Ostale modifikacije kojima nastaju derivati inventivnih fuzionih peptida temelje se na ugljenim hidratima i/ili lipidima koji mogu da budu kovalentno spregnuti sa inventivnim fuzionim peptidom. Poželjno je da se spregne lipide i/ili ugljene hidrate sa serinom, treoninom, asparaginom, glutaminom ili tirozinom ili glutamatom ili aspartatom putem njihovih reaktivnih delova bočnih lanaca. Alternativno, ugljeni hidrati i/ili lipidi mogu također da se vežu na terminalne delove inventivnog fuzionog peptida. Nadalje, inventivni fuzioni peptid može da bude spregnut na funkcionalno različit peptidni ili proteinski deo, što također može da stabilizuje inventivni fuzioni peptid i/ili može da posluži u poboljšanju transportnih karakteristika inventivnog fuzionog peptida u telesnim tekućinama, naročito krvi. Podesni fuzioni peptidi ili proteini mogu da se izaberu između npr.albumina, transferina itd., koji su direktno spregnuti (kao komponenta IV) sa inventivnim fuzionim peptidom ili putem peptida ili sekvence organskog linkera. Poželjno, ovi su peptidi ili proteini vezani na jedan od krajeva inventivnog peptida.

[0062]Kako bi se zaobišao problem degradovanja inventivnog fuzionog peptida može da se osigura retro-inverzni izomer inventivnog fuzionog peptida sastavljen od D aminokiselina ili barem delimice sastavljen od D aminokiselina. Termin "retro-inverzni izomer" odnosi se na izomer linearnog peptida u kojem je smer sekvence obrnut i hiralnost svakog aminokiselinskog ostatka je invertovana (vidi, npr., Jameson et al., Nature, 368, 744-746

(1994); Brady et al., Nature, 368, 692-693 (1994)). U odnosu na izvorni peptid, retro-inverzni peptid je sastavljen od aminokiselina obrnutog redosleda, tipično sa F-moc aminokiselinskim derivatima. Tipično, sirovi peptidi mogu da se prečiste reverzno faznom HPLC.

[00631Ostale modifikacije koje mogu da se uvedu u inventivne fuzione peptide rotiraju peptidnu osnovu. Poželjno, modifikovani inventivni peptidi su konstrukcijski mimetici. Njihov osnovni lanac je drukčiji od osnovnog lanca kojeg se nalazi u prirodi, dok su njihove strukture bočnih lanaca identične sa inventivnim fuzionim peptidima ili njihovim varijantama, derivatima ili analozima. Opšte govoreći, konstrukcijski mimetici pokazuju modifikaciju jednog ili više članova osnovnog lanca (NH, CH, CO), bilo kao supstituciju (poželjno) ili kao inserciju. Substituenti su npr. (I) -0-, -S-, ili -CH2- umesto -NH-; (II) -N-, alkil-, ili -BH-umesto -CHR- i (III) -CS-, -CH2, -SOn-, -P=0(OH)-, ili -B(OH)- umesto - CO-. Peptidni mimetik inventivnog fuzionog peptida može da bude kombinacija svake od tih modifikacija. Naročito, mogu da se kombinuju modifikacije svake od grupa I, II i III. U peptidnom mimetiku svaki član osnovnog lanca može da bude modifikovan ili, alternativno, samo određen broj članova lanca može da se zameni za delove kojih se ne nalazi u prirodi. Poželjno, svi članovi osnovnog lanca inventivnog fuzionog peptida, bilo -NH-, -CHR- ili CO zamene se za drugu grupu koje se ne nalazi u prirodi. U slučaju amidne veze (-NH-CO-) inventivnog fuzionog peptida osnovni lanac je supstituisan (u ćelom molekulu ili barem na jednom jedinom položaju), poželjni suptistitucijski delovi su biosterični, npr. retro-inverzne amidne veze (-CO-NH-), hidroksil etilen (-CH(OH)-CH2-), alken (CH2=CH-), karba (CH2-CH2-) i/ili -P=0(OH)-CH2-). Alternativno, elongacija osnovnog lanca insercijama može da se desi u konstrukcijskom mimetiku inventivnog fuzionog peptida, npr. delovima koji okružuju alfa-C atom. Sa svake strane alfa-C atoma može da se insertuje npr. -O-, -S-, -CH-, -

NH-.

[0064] Naročito poželjne su oligokarbamatne strukture osnovnog peptidnog lanca inventivnih fuzionih peptida. Amidna veza je zamenjena karbamatnim delom. Monomerni N-zaštićeni amino alkil karbonati dostupni su putem odgovarajućih aminokiselina ili amino alkohola. Oni se konvertuju u aktivne estre, npr. p-nitro fenil ester koristeći F-moc deo ili fotosenzitivnu nitroariloksikarbonilnu grupu sintetizovanjem na čvrstoj fazi.

[0065] Inventivni fuzioni peptidi su zaštićeni od proteolitičkog cepanja kako je iznad istaknuto. Naročito su zaštićeni protiv dipeptidil aminopeptidaze-4 (DPP-IV). Termin "DPP-IV zaštićen" kako se ovde koristi odnosi se na fuzioni peptid prema patentnom zahtevu 1. Inventivni fuzioni peptidi kao i njihovi derivati, analozi, fragmenti i varijante čine GLP-1 (7-35, 36 ili 37) kao deo komponente (I) i/ili (III) inventivnog peptida otpornim na peptidazu iz plazme (DPP-IV).

[0066]Otpornost peptida na razgradnju dipeptidil aminopeptidazom IV odredi se npr. sledećim testom degradacije: Alikvoti peptida inkubiraju se na 37°C sa alikvotom prečišćene dipeptidil aminopeptidaze IV tokom 4-22 časa u podesnom puferu uz pH 7-8 (pri čemu pufer nije albumin). Enzimatske reakcije se završe dodatkom trifluorosirćetne kiseline, te se razdvoje produkti degradacije peptida i kvantifikuju koristeći HPLC ili LC-MS analizu. Jedna metoda za izvođenje te analize je: Smeše se stave na Zorbax300SB-C18 (30 nm pore, 5 um čestice) 150 x 2.1 mm stupac i eluiraju uz brzinu toka od 0.5 ml/min sa linearnim gradijentom acetonitrila u 0.1 % trifluorosirćetnoj kiselini (0%-100% acetonitrila tokom 30 min). Peptidi i produkti njihovog degradisanja mogu da se posmatraju putem njihove absorbancije pri 214 nm (peptidne veze) ili 280 nm (aromatske aminokiseline), i kvantifikuju se integrisanjem njihovih površina pod krivuljom. Uzorak degradisanja može da se odredi koristeći LEMS gde može da se odredi MS spektar razdvojenog signala. Procenat intaktno/degradisano jedinjenje u danom vremenu koristi se za procenu stabilnosti peptida prema DPP-IV.

[0067]Inventivni fuzioni peptid se definiše kao stabilizovan prema DPP-IV kada je 10 puta stabilniji od GLP-1 (7-37) temeljeno na procentu intaktnog jedinjenja u danom vremenu. Prema tome, inventivni fuzioni peptid stabilizovan prema DPP-IV je poželjno barem 10, još poželjnije barem 20 puta stabilniji od GLP-1 (7-37) kao takvog. Stabilnost može da se proceni bilo kojom metodom poznatom stručnjaku, npr. dodatkom DPP-IV rastvoru fuzionog peptida kojeg se testira i određivanjem degradisanja fuzionog peptida, npr. tokom vremena, pomoću npr. spektroskopske metode, Western-Blot analize, određivanja antitelima itd. Paralelno, inventivni fuzioni peptid je definisan kao jedinjenje koje pokazuje dejstvo GLP-l(7-37) npr. vezanjem na njegov nativni receptor (receptor GLP-1). Poželjno, inventivni fuzioni peptid ima afinitet vezanja za GLP-1 receptor koji odgovara najmanje 10%, poželjno najmanje 50% afiniteta vezanja GLP-1 peptida kojeg se nalazi u prirodi. Afinitet vezanja može da se odredi bilo kojom podesnom metodom, npr. rezonancom površinskih plazmona itd. Nadalje, poželjno je da inventivni fuzioni peptid potiče formiranje unutarćelijskog cAMP svojim vezanjem na svoj vanćelijski receptor, koji prenosi signal u ćeliju.

[0068]Fuzioni peptidi iz pronalaska mogu da se dobiju sintetski, koristeći tehnike sintetizovanja peptida na čvrstoj fazi, slično načinu proizvodnje GLP-1 (7-36) amida i GLP-1 (7-37) u struci i mogu zatim da se prečiste u laboratorijskom opsegu npr. jednim korakom prečišćivanja na stupcu za reverzno-faznu HPLC ili podesnim hromatografijskim metodama.

[0069] Međutim, poželjno se stvara u izmenjenim ćelijama, bilo u mikrobnim ćelijama ili u animalnim ćelijskim linijama, kako bi se proizveo inventivni fuzioni peptid. Inventivni fuzioni peptid može da se izoluje iz ćelija u kojima se ekprimiše, na primer koristeći konvencionalne tehnike razdvajanja. Tako ćelije mogu da rastu pod odgovarajućim uslovima, na primer uključujući nosač i nutrijente, in vitro, i izlučeni protein, tj. inventivni fuzioni peptid, dobije se iz izvanćelijskog medijuma. Sekvence ubačene u ćelije tako poželjno uključuju vodeće sekvence i signalne peptidne sekvence koje usmeravaju sekreciju inventivnog fuzionog peptida. Ćelije poželjno eksprimišu proteazu koja može da čepa vodeću i signalnu sekvencu, bilo endogenu ili od izmenjenih genskih sekvenci. Alternativno, izmenjene genske sekvence koje kodiraju inventivni fuzioni peptid ne uključuju takvu vodeću i signalnu peptidnu sekvencu, pri čemu unutarćelijski eksprimisan inventivni fuzioni peptid neće da bude izlučen, te se dobiva iz ćelija procesima koji uključuju Uzu ćelija. U takvim metodama kodirajuće sekvence mogu da uključuju dodatke za prečišćavanje koje omogućavaju delotvorno ekstraktovanje dobivenog peptida iz medijuma, pri čemu dodaci mogu da se pocepaju kako bi se oslobodio izolovani inventivni fuzioni peptid.

[0070] Pronalazak nadalje obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja kodira za inventivni fuzioni peptid, bilo daje fuzioni peptid ili fragment, analog ili varijanta od toga. Bilo koja nukleinska kiselina koja kodira za inventivni fuzioni peptid obuhvaćena je ovim pronalaskom. Zbog degeneracije genskog koda više sekvenci nukleinskih kiselina može da kodira za inventivni fuzioni peptid. Molekul nukleinske kiseline unutar opsega ovog pronalaska može također da sadržava nukleinsku kiselinu koja kodira za inventivni fuzioni peptid i, dodatno, daljnje (funkcionalne) nukleotidne sekvence. U poželjnom izvođenju ovog pronalaska takav (daljnji) molekul nukleinske kiseline može da kodira (a) celokupnu GLP-1 aminokiselinsku sekvencu (GLP-l(l-37) ili funkcionalnu GLP-1 (7-35, 36 ili 37) sekvencu, (b) sekvencu za cepanje na N-terminusu sekvence GLP-1 prema (a) za bilo koju proteazu, uzvodno od (b) može da kodira za vodeću sekvencu. U drugom poželjnom izvođenju, uzvodno od sekvence nukleinske kiseline koja kodira za (b) molekul nukleinske kiseline može dodatno da obuhvata (c) sekvencu koja kodira za signalni peptid. Alternativno, inventivni molekul nukleinske kiseline može da ima sekvencu (c) fuzionisanu uzvodno od (a) bez bilo kakve sekvence koja kodira za vodeću sekvencu (b) između. Poželjno, vodeća sekvenca i signalna peptidna sekvenca su heterologne u odnosu na preproglukagon.

[0071] Pronalazak nadalje obezbeđuje vektor koji obuhvata inventivnu nukleinsku kiselinu (molekul) i druge funkcionalne komponente za ekspresiju inventivne nukleinske kiseline (molekula). Tipično, inventivna će nukleinska kiselina (molekul) da bude fuzionisana na sekvencu promotora i, eventualno kombinovana sa drugim regulatornim sekvencama, npr. pojačivačkom sekvencom. Za replikaciju, plasmid može da sadržava izvorište replikacije. Kako bi se selektirale ćelije transfektovane sa inventivnim vektorom, jedan ili više gena za otpornost na antibiotike (npr. kanamicin, ampicilin) mogu da se osiguraju u vektoru. Vektor može da bude plazmid koji uključuje promoter bakterijskog porekla i gene za otpornost na antibiotike i promoter i gene za otpornost na antibiotike za replikaciju i ekspresiju u ćelijama sisara. Pronalazak nadalje obezbeđuje ćeliju domaćina koja obuhvata egzogeno unešenu DNK iz pronalaska sposobnu za translaciju pomenutog prekursorskog proteina. Ćelija domaćin može da bude bilo prokariotska ćelija domaćin ili eukariotska ćelija domaćin, npr. ćelija sisara. Ćelija domaćin nije humana embrionska ili humana zametna ćelija.

[0072] Prema daljnjem aspektu pronalaska obezbeđuje se korišćenje inventivnog fuzionog peptida za proizvodnju leka za lečenje animalnog organizma, poželjno ljudskog bića, primenom inventivnog peptida koji obuhvata komponente (I) i (II) i eventualno komponentu (III). Također je obezbeđeno odgovarajuće korišćenje takvih inventivnih peptida u proizvodnji produkta za lečenje ili prevenciju bolesti ili stanja povezanih sa metabolizmom glukoze. Neograničavajući primeri poremećaja metabolizma glukoze uključuju: dijabetes melitus tipa I ili tipa II (NIDDM), ili otpornost na inzulin, poremećaje težine i bolesti ili stanja povezana sa time, pri čemu takvi poremećaji težine ili povezana stanja uključuju gojaznost, stanja povezana sa prekomernom težinom, deregulisani apetit, redukovan nivo inzulina u plazmi, povećan nivo glukoze u krvi ili redukovanu masu beta ćelija pankreasa. Poželjno, ovde se otkriva korišćenje inventivnih fuzionih peptida za proizvodnju leka za lečenje dijabetesa tipa 2 (NIDDM). Posledično, ovaj se pronalazak odnosi na inventivni fuzioni peptid npr. za smanjenje težine pacijenta, za redukovanje apetita pacijenta, za povećanje nivoa inzulina u plazmi nakon obroka u pacijenta, za redukovanja nivoa glukoze u krvi u pacijenta na tašte, za povećanje mase beta ćelija pankreasa u pacijenta ili za lečenje dijabetesa tipa I ili II u pacijenta.

[0073]Pacijenti sa drugim bolestima ili poremećajima također mogu da se leče inventivnim

fuzionim peptidima, tj. fuzionim peptidima ili njihovim analozima, varijantama ili derivatima. Inventivni fuzioni peptidi mogu da se koriste za pripremu leka za lečenje neurodegenerativnih poremećaja i bolesti ili stanja povezanih sa time i za lečenje poremećaja i bolesti povezanih sa apoptozom. Korišćenje inventivnog fuzionog peptida za lečenje tih poremećaja rezultuje iz

sledećeg: GLP-1 receptori, spregnuti sa putem drugog glasnika cikličkog AMP, eksprimisani su širom mozga glodara i ljudi. Hemoarhitektura distribucije receptora u mozgu odgovara centralnoj ulozi GLP-1 u regulisanju unosa hrane i odgovoru na averzioni stres. Pokazano je također kako GLP-1 vezanjem za svoj GLP-1 receptor pokazuje neurotrofične osobine, i pruža zaštitu protiv glutamatom indukovane apoptoze i oksidativnih ozleda u kultivisanim neuronskim ćelijama. Nadalje, pokazano je da GLP-1 modifikuje procesiranje prekursora amiloidnogB-proteina u ćelijskoj kulturi i redukuje nivo amiloidnogB-peptida u mozgu in vivo u zavisnosti od doze. GLP-1 je prema tome također poznat kao regulator centralnog nervnog sistema. Inventivni fuzioni peptidi oponašajući biološku aktivnost fiziološki aktivnog GLP-1 imaju terapeutsku važnost u lečenju npr. Alzheimerove bolesti (AD) i drugih centralnih i perifernih neurodegenerativnih stanja (npr. amiotrofična lateralna skleroza (ALS), Alexanderova bolest, Alperova bolest, Ataxia telangiectasia, Canavanova bolest, Cockavne sindrom, Creutzfeldt-Jakobova bolest, multipla skleroza, Sandhoffova bolest, Pickova bolest, spinocerebelarna ataksija, Schilderova bolest i Parkinsonova bolest).

[0074] Nadalje, pokazano je kako fiziološki aktivan GLP-1 pokazuje antiapoptotčko dejstvo na različitim ćelijama, npr. GLP-1 je koristan u očuvanju mase i funkcije sveže izolovanih human Langerhansovih otoka ili drugih ćelijskih tipova. Utoliko biološki aktivan inventivni fuzioni peptid može da se koristi za lečenje poremećaja koji su uzrokovani apoptozom ćelija ili tkiva.

[0075] Korišćenje inventivnog fuzionog peptida može da bude za proizvodnju kompozicije koja se primenjuje egzogeno i obuhvata izolovani inventivni fuzioni peptid. Nastala kompozicija može također da se koristi za lečenje iznad pomenutih poremećaja. Ovde otkriveni poremećaji mogu također da se leče inventivnim ćelijama domaćinima, nukleinskom kiselinom (molekulima) ili vektorima, ili radije inventivne ćelije domaćina, nukleinska kiselina (molekuli) ili vektori mogu da se koriste za pripremu leka za lečenje tih poremećaja.

[0076] Priprema formulacija koje kao aktivne sastojke sadržavaju sekvence inventivnog fuzionog peptida opšte govoreći je lako razumljiva u struci, kako je pokazano u patentima SAD-a 4,608,251; 4,601,903 ; 4,599,231; 4,599,230; 4,596,792; i 4,578,770. Tipično, takve se formulacije pripreme kao injektibilne, bilo kao tečni rastvori ili suspenzije, koje poželjno sadržavaju vodu (vodene formulacije) ili mogu da se emulzifikuju. Termin "vodena formulacija" definisan je kao formulacija koja sadržava najmanje 50 % w/w vode. Slično tome, termin "vodeni rastvor" je definisan kao rastvor koji sadržava najmanje 50% w/w vode, a termin "vodena suspenzija" definisan je kao suspenzija koja sadržava najmanje 50 % w/w vode.

[0077]Za intravenozno, kožno ili subkutano injektiranje, ili injektiranje na mestu oboljenja, aktivni će sastojak da bude u formi parenteralno prihvatljivog vodenog rastvora koji ne sadržava pirogene i ima podesan pH, izotoničnost i stabilnost. Tečne farmaceutske kompozicije opšte govoreći uključuju tečni nosač poput vode. Poželjno, tečni nosač će da uključuje fiziološki rastvor soli, dekstroze u etanolu ili drugi rastvor saharida ili glikola poput etilen glikola, propilen glikola ili polietilen glikola ili mogu da budu uključene kombinacije od toga. Daljnji primeri predstavljaju druge izotonične nosače poput Ringerovog rastvora za injektiranje ili Ringerovog rastvora za injektiranje sa laktatom.

[0078]Ako se pronalazak odnosi na farmaceutsku formulaciju koja obuhvata vodeni rastvor jedinjenja prema ovom pronalasku i puffer, u čemu je pomenuto jedinjenje prisutno u koncentraciji od 0.1 mg/ml ili više, i pri čemu pomenuta formulacija ima pH od oko 2.0 do oko 10.0, poželjno od oko 7.0 do oko 8. 5. Poželjno, pH formulacije je najmanje 1 pH jedinicu od izoelektričke tačke jedinjenja prema ovom pronalasku, još poželjnije pH formulacije je najmanje 2 pH jedinice od izoelektričke tačke jedinjenja prema ovom pronalasku.

[0079]Čvrste forme podesne za rastvor u ili suspenziju u tečnosti mogu također da se pripreme pre injektiranja. Farmaceutska formulacija može da bude suvo zamrznuta formulacija, čemu lcčnik ili pacijent dodaje rastvarač i/ili diluente pre korišćenja. Drugim rečima, jednom pripremljena formulacija ne mora odmah da se primeni na pacijentu. Radije, nakon pripreme, pakuje se za čuvanje u zamrznutom stanju, ili u suvoj formi za kasnije rekonstituisanje u tečnu formu ili drugu formu podesnu za primenu na pacijentu. U drugom izvođenju farmaceutska formulacija je suva formulacija (npr. suvo zamrznuta ili osušena raspršivanjem) spremna za korišćenje bez ikakvog prethodnog rastvaranja. "Suva forma" označava daje tečna farmaceutska kompozicija ili formulacija osušena bilo zamrzavanjem do suva (tj. liofilizovanjem ; vidi, na primer, VViliams & Poli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38: 48-59), sušenjem raspršivanjem (vidi Masters (1991) u Spray-Drying Handbook (5th ed; Longman Scientific & Technical, Essez, U. K.), str. 491-676; Broadhead et al. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18: 1169-1206; i Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11: 12-20), ili sušenjem zrakom (Carpenter & Crowe (1988) Cryobiology 25: 459-470; i Roser (1991) Biopharm. 4: 47-53). Formiranje agregata polipeptida tokom skladištenja tečne farmaceutske kompozicije može loše da utiče na biološku aktivnost tog polipeptida, rezultujući gubitkom terapeutske delotvornosti farmaceutske kompozicije. Nadalje, formiranje agregata može da uzrokuje druge probleme poput blokiranja cevi, membrana ili pumpi kada se farmaceutska kompozicija koja sadržava polipeptid primenjuje korišćenjem infuzionog sistema.

[0080]Moguće je da i drugi sastojci budu prisutni u farmaceutskoj kompoziciji peptida iz ovog pronalaska. Takvi dodatni sastojci mogu da uključuju agense za vlaženje, emulgatore, antioksidante, sredstva za povećanje zapremine, pH puferska sredstva (npr. fosfatni ili citratni ili maleatni pufer), konzervanse, surfaktante, stabilizatore, modifikatore toniciteta, sredstva za heliranje, metalne jone, uljaste nosače, proteine (npr. humani serumski albumin, želatin ili proteine) i/ili zwitterjone (npr. aminokiseline poput betaina, taurina, arginina, glicina, lizina i histidina).

[0081]Sa obzirom na stabilizatore za inventivne formulacije oni poželjno mogu da se izaberu iz grupe polimera velike molekularne težine ili jedinjenja male molekularne težine. U daljnjem izvođenju ovog pronalaska stabilizator se izabere između polietilen glikola (npr. PEG 3350), polivinilalkohola (PVA), polivinilpirolidona, karboksi-hidroksiceluloze ili derivate od toga (npr. HPC, HPGSL, HPC-L i HPMC), ciklodekstrina, supstancija koje sadržavaju sumpor kao monotioglicerol, tioglikolična kiselina i 2-metiltioetanol, i različitih soli (npr. natrijum hlorida). Svaki od tih specifičnih stabilizatora sačinjava alternativno izvođenje pronalaska. Farmaceutske kompozicije mogu također da obuhvataju dodatna sredstva za stabilizovanje, koja nadalje poboljšavaju stabilnost terapeutski aktivnog polipeptida u njima. Sredstva za stabilizovanje od naročitog interesa za ovaj pronalazak uključuju, ali nisu time ograničena, metionin i EDTA, koji štite polipeptid od oksidovanja metionina, i nejonski surfaktant, koji štiti polipeptid od agregiranja povezanog sa zamrzavanjem-odmrzavanjem ili mehaničkog trganja.

[0082]Sa obzirom na surfaktanteza inventivne formulacije oni poželjno mogu da se izaberu između detergenta, etoksilovanog ricinusovog ulja, poliglikolizovanih glicerida, acetilovanih monoglicerida, sorbitanskih estra masnih kiselina, polioksipropilen-polioksietilenskih blok polimera (npr. poloksamera poput Pluronic F68, poloksamer 188 i 407, TritonX-100), polioksietilen sorbitanskih estra masnih kiselina, zvezdolikog PEO, polioksietilena i derivata polietilena poput alkilovanih i alkoksilovanih derivata (tvveenovi, npr. Tween-20, Tween-40, Tween-80 i Brij-35), polioksietilenhidroksistearata, monoglicerida ili etoksilovanih derivata od toga, diglicerida ili polioksietilenskih derivata od toga, alkohola, glicerola, lecitina i fosfolipida (npr. fosfatidil serin, fosfatidil holin, fosfatidil etanolamin, fosfatidil inozitol, difosfatidil glicerol i sfingomijelin), derivata fosfolipida (npr. dipalmitoil fosfatidna kiselina) i lizofosfolipida (npr. palmitoilizofosfatidil-L-serin i l-acil-sn-glicerol-3-fosfat estri etanolamina, holin, serina ili treonina) i alkil, alkoksil (alkil ester), alkoksi (alkil eter)-derivata lizofosfatidil i fosfatidil holina, npr. lauroil i miristoil derivati lizofosfatidilholina, dipalmitoilfosfatidilholina, i modifikacija grupe polarne glave, to jest holina, etanolamina, fosfatidilne kiseline, serina, treonina, glicerola, inozitola, i pozitivno naelektrisanih DODAC, DOTMA. DCP, BISHOP, lizofosfatidilserina i lizofosfatidiltreonina, i glicerofosfolipida (npr. kefalini), gliceroglikolipida (npr. galaktopiranzoid), sfingoglikolipida (npr. ceramidi, gangliozidi), dodecilfosfoholina, lizolecitina iz kokošjeg jaja, derivata fusidinske kiseline (npr. natrijum tauro-dihidrofusidat itd.), C6-C12 dugolančanih masnih kiselina i soli od toga (npr. oleinska kiselina i kaprilna kiselina), acilkamitina i derivata, N'X-acilovanih derivata lizina, arginina ili histidina, ili acilovanih derivata bočnog lanca lizina ili arginina, N-acilovanih derivata dipeptida koji obuhvataju bilo koju kombinaciju lizina, arginina ili histidina i neutralne ili kisele aminokiseline, N-acilovanih derivata tripeptida koji obuhvataju bilo koju kombinaciju neutralne aminokiseline i dve naelektrisane aminokiseline, DSS (dokusat natrijum, CAS registarski br. [577-11- 7]), dokusat kalcijum, CAS registarski br.

[128-49-4]), dokusat kalijum, CAS registarski br. [7491-09-0]), SDS (natrijum dodecil sulfat ili natrijum lauril sulfat), natrijum kaprilata, holne kiseline ili derivata od toga, žučnih kiselina i soli od toga i glicinskih ili taurinskih konjugata, ursodeoksiholne kiseline, natrijum holata, natrijum deoksiholata, natrijum tauroholata, natrijum glikoholata, N-heksadecil-N, N-dimetil-3-amonio-l-propansulfonata, anjonskih (alkil-aril-sulfonati) monovalentnih surfaktanta, zvvitterjonskih surfaktanta (npr. N-alkil-N, N-dimetilamonio-l-propansulfonati, 3-holamido-l-propildimetilamonio-l-propan-sulfonat), katjonskih surfaktanta (kvaterne amonijumske baze)

(npr. cetil-trimetilamonijum bromid, cetilpiridinijum hlorid), nejonskih surfaktanta (npr. dodecil-D-glukopiranozid), poloks-amina (npr. Tetronici), koji su tetrafunkcionalni blok

kopolimeri izvedeni iz uzastopnog dodavanja propilen oksida i etilen oksida na etilendiamin, ili surfaktant može da se izabere iz grupe derivata imidazolina, ili smeša od toga. Svaki od tih specifičnih surfaktanata sačinjava alternativno izvođenje ovog pronalaska. Korišćenje surfaktanta u farmaceutskim kompozicijama dobro je poznato stručnjaku. Zbog jednostavnosti pozivamo se na Remington: The Science and Practice of Pharmacv, 19. izdanje, 1995.

[0083]Sa obzirom na farmaceutski prihvatljive konzervanse, oni mogu poželjno da se izaberu iz grupe koja se sastoji od fenola, o-krezola, m-krezola, p-krezola, metil p-hidroksibenzoata, propil p-hidroksibenzoata, 2-fenoksietanola, butil p-hidroksibenzoata, 2-feniletanola, benzilnog alkohola, etanola, hlorobutanola, i tiomerosala, bronopola, benzojeve kiseline, imidouree, hloroheksidina, natrijum dehidroacetata, hlorokrezola, etil p-hidroksibenzoata, benzetonijum hlorida, hlorfenesina (3p-hlorfenoksipropan-l,2-diol) ili smeša od toga.

[0084]Sa obzirom na izotonične agense, oni mogu poželjno da se izaberu iz grupe koja se sastoji od soli (npr. natrijum hlorid), šećera ili alkohola šećera, aminokiseline (npr. L-glicin, L-histidin, arginin, lizin, isoleucin, aspartanska kiselina, triptofan, treonin), alditola (npr. glicerol (glicerin), 1,2-propandiol (propilenglikol), 1,3-propandiol, 1,3-butandiol), polietilenglikola (npr. PEG400) ili smeša od toga. Bilo koji šećer može da se koristi, poput mono-, di-, ili polisaharida, ili u vodi rastvorljivih glukana, uključujući na primer fruktozu, glukozu, manozu, sorbozu, ksilozu, maltozu, laktozu, saharozu, trehalozu, dekstran, pululan, dekstrin, ciklodekstrin, rastvorljivi škrob, hidroksietil škrob i karboksimetilcelulozu-Na. U jednom izvođenju šećerni aditiv je saharoza. Alkohol šećera je definisan kao C4-C8 ugljovodonik koji ima najmanje jednu -OH grupu i uključuje, na primer, manitol, sorbitol, inozitol, galacititol, dulcitol, ksilitol i arabitol. U jednom izvođenju alkohol šećera kao aditiv je manitol. Šećeri ili alkoholi šećera pomenuti iznad mogu da se koriste individualno ili u kombinaciji. Ne postoji čvrsta granica količine koja se koristi, sve dok je šećer ili alkohol šećera rastvorljiv u tečnom pripravku i ne utiče štetno na stabilišuća dejstva postignuta korištenjem metoda ovog pronalaska.

[0085]Sa obzirom na sredstva za heliranje, ona mogu poželjno da se izaberu između soli etilendiamintetrasirćetne kiseline (EDTA), limunske kiseline i aspartanske kiseline, i smeša od toga.

[0086]Sa obzirom na pufere, oni mogu poželjno da se izaberu iz grupe koja se sastoji od natrijum acetata, natrijum karbonata, citrata, glicilglicina, histidina, glicina, lizina, arginina, natrijum dihidrogenfosfata, dinatrijum hidrogenfosfata, natrijum fosfata i tris(hidroksimetil)aminometana, hepesa, bicina, tricina, jabučne kiseline, sukcinata, mjaleinske kiseline, fumarne kiseline, vinske kiseline, aspartanske kiseline ili smeša od toga. Svaki od tih specifičnih pufera sačinjava alternativno izvođenje ovog pronalaska.

[0087]Korišćenje svih pre pomenutih aditiva u farmaceutskim kompozicijama koje sadržavaju inventivni (terapeutski) fuzioni peptid dobro je poznato stručnjaku, naročito u odnosu na raspon koncentracija istih. Zbog jednostavnosti pozivamo se na Remington: The Science and Practice of Pharmacv, 19. izdanje, 1995.

[0088]Formulacije koje sadržavaju inventivni fuzioni peptid konvencionalno se primenjuju parenteralno, injekcijom, na primer, bilo subkutano, intradermalno, subdermalno ili intramuskularno. Kompozicija za parenteralnu primenu inventivnog peptida može, na primer, da se napravi kako je opisano u WO 03/002136.

[0089]Dodatne formulacije koje su podesne za druge načine primene uključuju supozitorijume i, u nekim slučajevima, oralne, bukalne, sublingvinalne, intraperitonealne, intravaginalne, analne i intrakranijalne formulacije. Za supozitorijume, tradicionalna veziva i nosači mogu da uključuju, na primer, polialkalen glikole ili trigliceride; takvi supozitorijumi mogu da se formiraju iz smeša koje sadržavaju aktivni sastojak u rasponu od 0.5% do 10%, poželjno 12%. Oralne formulacije uključuju normalno korištene ekcipijente poput, na primer, farmaceutske klase manitola, laktoze, škroba, magnezij um stearata, natrijum saharina, celuloze, magnezijum karbonata, i slično. Te su kompozicije u formi rastvora, suspenzija, tableta, pilula, kapsula, formulacija sa produljenim otpuštanjem ili prašaka i sadržavaju 10-95% aktivnog sastojka, poželjno 25-70%.

[0090]Kako je iznad pomenuto, mogu da se upotrebe dodatne farmaceutske metode da bi se kontroliralo trajanje dejstva. Pripravci sa kontroliranim otpuštanjem mogu da se postignu korišćenjem polimera kako bi se kompleksiralo ili apsorbovalo peptid iz pronalaska. Kontrolirana dostava aktivnog sastojka (fuzionog peptida) može da se postigne odabirom podesnih makromolekula (na primer poliestra, poliaminokiselina, polivinilpirolidona, kopolimera etilen vinilacetata, metilceluloze, karboksimetilceluloze i protamin sulfata), koncentracije makromolekula kao i metoda inkorporisanja. Takve su metode otkrivene u Remington's Pharmaceutical Sciences (vidi iznad). Još jedna moguća metoda za kontrolu trajanja dejstva pripravcima sa kontroliranim otpuštanjem, jest da se peptid iz ovog pronalaska inkorporira u čestice polimernog materijala poput poliestra, poliaminokiselina, hidrogelova, poli(mlečne kiseline) ili kopolimera etilen vinilacetata.

[0091]Inventivni fuzioni peptidi mogu da se formulišu kao neutralne ili forme soli. Fuzioni peptid iz ovog pronalaska može da bude dovoljno kiseo ili dovoljno bazičan da reaguje sa bilo kojom od brojnih organskih i anorganskih baza, i organskih i anorganskih kiselina, kako bi formirao (adicionu) so, npr. formiranu sa slobodnim amino grupama peptida. Kiseline koje se uobičajeno koriste da formiraju kisele adicione soli su anorganske kiseline poput hlorovodonične kiseline, bromovodonične kiseline, jodovodonične kiseline, sumporne kiseline, fosforne kiseline i slično, i organske kiseline poput vinske, p-toluensulfonske kiseline, metansulfonske kiseline, oksalne kiseline, bademove kiseline, p-bromofenil-sulfonske kiseline, ugljenična kiselina, ćilibarne kiseline, limunske kiseline, benzojeve kiseline. Primeri takvih soli uključuju sulfate, pirosulfate, bisulfate, sulfite, bisulfite, fosfate, monohidrogenfosfate, dihidrogenfosfate, metafosfate, pirofosfate, hloride, bromide, jodide, acetate, propionate, dekanoate, kaprilate, akrilate, formate, izobutirate, kaproate, heptanoate, propiolate, oksalate, malonate, sukcinate, suberate. sebacate, fumarate, maleate, butin-1,4-dioate, heksin-l,6-dioate, benzoate, hlorobenzoate, metilbenzoate, dinitrobenzoate, hidroksibenzoate, metoksibenzoate, ftalate, sulfonate, ksilensulfonate, fenilacetate, fenilpropionate, fenilbutirate, citrate, laktate, gama-hidroksibutirate, glikolate, tartarate, metansulfonate, propansulfonate. Soli formirane sa slobodnim karboksilnim grupama mogu također da se dobiju iz anorganskih baza poput, na primer, natrijum, kalijum, amonijum, kalcijum ili gvožđe hidroksida, i takvih organskih baza kao izopropilamin, trimetilamin, 2-etilamino etanol, histidin, prokain i slično. Kisele adicione soli, karboksilati, soli, niži alkil estri i amidi inventivnih peptida mogu da se formulišu prema WO 91/11457 (1991); EP 0 733 644 (1996); i U.S. 5,512,549(1996).

[0092]Formulacije koje sadržavaju sekvence inventivnog fuzionog peptida primenjuju se na način kompatibilan sa doznim formulacijama, i u količini koja je terapeutski delotvorna. Količina koja se primenjuje zavisi na pacijentu kog se leči, uključujući npr. težinu pacijentove bolesti. Podesni dozni rasponi su npr. reda nekoliko stotina mikrograma aktivnog sastojka po terapeutskoj dozi sa poželjnim rasponom od oko 0.1 ug do 2000 p.g (iako se razmišlja o većim količinama u rasponu 1-10 mg), kao u rasponu od oko 0.5 ug do 1000 p.g, poželjno u rasponu od 1 ug do 500 ug i naročito u rasponu od oko 10 ug do 100 u.g.

[0093]Formulacije koje sadržavaju inventivne fuzione peptide plus npr. dodatne

ekscipijente, npr., glicin i manitol ili druge aditive, mogu da se stave na tržište u liofilizovanoj formi kao fiole. Osigura se prateća fiola sa diluentom, omogućujući pacijentu da rekonstituiše produkat do željene koncentracije pre primene doze. Inventivne formulacije mogu također da se stave na tržište na druge poznate načine, poput prethodno napunjenih siringi itd.

[0094]Pronalazak je nadalje ilustrovan further u pratećim primerima.

Primeri

Primer 1

Stvaranje genskih konstrukata

[0095]Kodirajuća sekvenca za GLP-l(7-37) cDNA sintetizuje se umetno, u sekvenci koja uključuje HincII i EcoRI mesta kako je naznačeno u SI. la. Zasebno se sintetizuje cDNA ilustrovana na SI. lb, uključujući kodirajuće sekvence za GLP-1(7-37), IP2 i restrikciona mesta za Sfol, EcoRI i Xbal, kako je ilustrovano na SI. lb. Da bi se usmerilo GLP-1 u sekretorni put, upotrebi se heterologna signalna sekvenca stromelizina 3 (Acc:No. NM_005940). Prema tome cDNA koja kodira za signalnu i vodeću sekvencu stromelizina se umnoži pomoću PCR sa reverznom transkriptazom iz humane RNK, i koristi sa konstruktom sa SI. la ili SI. lb kako bi formirala konstrukt prikazan na SI. lc, odnosno SI. ld.

[0096]HincII/EcoRI fragment konstrukta sa SI. la uklonira se u Sfol mesto sekvence sa SI. ld da formira konstrukt na SI. le. Slično tome, EcoRI fragment na SI. ld uklonira se u EcoRI mesto eukariotskog ekspresionog plazmida, da se dobije konstrukt prikazan na SI. lf. Da se formira konstrukt prikazan na SI. lg, Hincl/Xbal fragment konstrukta prikazanog na SI. lb ponovljeno se uklonira u Sfol/Xbal mesto konstrukta prikazanog na SI. ld. Slika lh prikazuje sintetizovanu, kodon optimizovanu sekvencu koja kodira vodeću i signalnu sekvencu stromelizina prekinute sa skraćenom endogenom intronskom sekvencom, fuzioniranom na sekvence koje kodiraju humani GLP-1 (7-37), IP2 i GLP-2(l-35). DNK sekvenca konstrukta na SI. lh je SEQ ID No.:16, dok SEQ ID No.:15 također pokazuje sekvencu translatiranog peptida.

[0097]Također se sintetizuju sekvence na SI. li i lj. Te se tada koriste da formiraju konstrukt na SI. lk, kloniranjem Nael/BssHII fragmenta sa SI. lj u Nael/BssHII linearzovanu sekvencu sa si lh. DNK sekvenca konstrukta na SI. lk je SEQ ID No.: 14, dok SEQ ID No.:13 također pokazuje sekvencu translatiranog peptida.. Konstrukt na SI. 11 formira se digestijom sekvence sa SI. lh sa BssHl i religacijom. DNK sekvenca konstrukta na SI. 11 je SEQ ID No.: 18, dok SEQ ID No.: 17 također pokazuje sekvencu translatiranog peptida. Konstrukt na SI. lm se formira kloniranjem Afel/BssHII fragmenta sekvence sa SI. 1 u Afel/BssHII linearizovanu sekvencu sa SI. lh. DNK sekvenca konstrukta na SI. lm je SEQ ID No.: 20, dok SEQ ID No.: 19 također pokazuje sekvencu translatiranog peptida.

[0098] Iznad opisani konstrukti mogu da se naprave od strane stručnjaka koristeći rutinske tehnike.

Primer 2

Transfekcija, klonalna selekcija i ekspresija GLP-1 u ćelijama sisara

[0099] Izvor ćelija: HEK293 (ćelijska linija humanog embrionskog bubrega, # ACC 305, DSMZ Cei Culture Collection, Nemačka), AtT20 (mišja LAF1 ćelijska linija tumora hipofize, #87021902, European Cei Culture Collection, UK), hTERT-MSC ćelije su stvorene od strane Prof. Kassem, Universitv Hospital of Odense, Danska.

[0100] Za transfekciju 10<8>ćelija koristi se 0,5-2 ug plazmidne DNK sa različitim GLP-1 konstruktima. Konstrukti se naprave kako je opisano u Primeru 1. HEK293 ćelije se traansfeciraju standardnom metodom koprecipitacije sa kalcijum fosfatom kako je opisano u Current Protocols in Molcular Biologv (Ausubel et al. 1994, Harvard Medical School Vol2., Unit 9.1). AtT20 ćelije se transfeciraju koristeći FuGene (Roche) kako je opisano u Current Protocols in Molcular Biologv (Ausubel et. al. 1994, Harvard Medical School Vol 2., Unit 9.4). Transfekcija hTERT-MSC ćelija se izvede koristeći Nucleofector tehnologiju (Amaxa), neviralnu metodu koja je bazirana na kombinaciji električnih parametara i rastvora specifičnih za tip ćelija. Koristeći Nucleofector uređaj (program Cl 7) i Nucleofector srastvor VPE-1001 postiže se delotvornost transfekcije od >60%. 48 časova nakon transfekcije izvrši se selekcija ćelijskih klonova sa stabilnom integracijom DNK u kromosomu dodavanjem agensa za selekciju, blasticidina (2 ug/ml), u medijum za kulturu. Nakon 12-15 dana, stabilno transfecirani ćelijski klonovi mogu da se izoluju i umnože za karakterisanje.

[0101]Prolazna ekspresija različitih GLP-1 konstrukata meri se u hTERT-MSC i HEK293

ćelijama. Dok samo marginalni nivo aktivnog GLP-1 može da se nađe u monomerinim GLP-1 konstruktima #103 i #317 (imaju samo jednu kopiju GLP-1 (7-37)) enorman porast ekspresije može da se nađe u dimernom GLP-1 konstruktu #217 (ima GLP-1(7-3 7) kao komponentu (I) i kao komponentu (III)), kako u hTERT-MSC tako i u HEK293 ćelijama. Rezultati su sumirani na Slici 2. Elongacija konstrukta u GLP-1 konstrukt #159 (ima četiri kopije IP2 kao

komponentu (II)) ne rezultuje značajnijim daljnjim povećanjem (nije prikazano). Nakon transfekcije hTERT-MSC ćelija sa različitim konstruktima, selektiraju se klonovi koji stabilno eksprimiraju GLP-1. Nivoi ekspresije prikazani su u Tabeli 1 .

Primer 3

Western Blot analiza GLP-1 peptida, izlučenih iz ćelija sisara

[0102]Supernatant ćelijske kulture od ćelija koje luče GLP-1 razdvoji se u 10%-20% gradijentnoj SDS PAGE (120V, 90 minuta) i prenese na PVDF membranu (Immobilon-P membrana 0.45 um Milipore IPVH 00010) polusuvim blotiranjem (2.0 mA/cm2, 60 minuta). Nakon fiksiranja metanolom i blokiranja (3% (w:v) BSA, 0.1% (v:v) Tween-20 u TBS) membrana se imunoblotira sa 1 ug/ml anti-GLP-1 antitela (HYB 147-12, Antibodvshop) na 4°C preko noći. Nakon ispiranja i inkubacije sa 0.02 ug/ml detekcionog antitela (antimišji IgG, konjugiran sa peroksidazom iz hrena, Perkin Elmer PC 2855-1197) na sobnoj temperaturi tokom 4 časa, detektovanjc hemiluminescencije otkriva položaj proteina.

[0103]Western Blot analiza je prikazana na Slici 3 (1:100 ng sintetički GLP-1(7-37) rastvoren u supernatantu lažno transfektiranih hTERT-MSC ćelija, 2: supernatant hTERT-MSC ćelija (klon 79TM217/13) koje luče dimerni GLP-1 iz konstrukta #217; 3: supernatant AtT20 ćelija (klon 81-A-217/3) koje luče dimerni GLP-1 iz konstrukta #217; M: prethodno obojadisan proteinski marker [kDa]). Rezultati pokazuju kako se inventivni peptidi koji sadržavaju GLP-l(7-37) i C-terminalni dodatak (2 i 3 na SI. 3) luče iz transfektiranih ćelijskih linija i mogu da se detektuju koristeći anti-GLP-1 antitelo, koje se veže na epitope u središtu molekula GLP-1 (7-37).

Primer 4

In vitro stabilnost u plazmi GLP-1 peptida izlučenih iz humanih ćelija

[0104]HEK293 i hTERT-MSC ćelije se prolazno transfeciraju sa konstruktima koji kodiraju heterolognu signalnu sekvencu stromelizina, vezanu na GLP-1 varijante koje kodiraju sledeće peptide: 1. 1: GLP-1(7-37)

2. 2: GLP-1 (7-37)-IP2-produžen sa 11 aminokiselina

3. 3: GLPI (7-37)-IP2-GLPl (7-37)

Supernatant ćelijske kulture koji sadržava GLP-1 peptid izlučen iz ćelija ili sintetički GLP-1(7-37) (Bachem) inkubira se sa plazmom obogaćenom humanim limfocitima koja sadržava dipeptidilpeptidaznu aktivnost pri 37°C i 5% CO2, tokom 3 ili 4 časa. Sintetički GLP-l(7-37) u supernatantu od lažno transfeciranih ćelija koristi se kao pozitivna kontrola za DPP-IV aktivnost, za koju je pokazano da se inhibira dodatkom inhibitora DPP-IV (#DPP4, Biotrend). Aktivni GLP se izmeri koristeći GLP-1 (Active) ELISA (#EGLP-35K, Biotrend), pomoću antitela koje se veže na N-terminalni epitop GLP-1(7-37) razlikujući ga od DPP-N degradisanog, inaktivnog GLP-1(9-37) peptida.

[0105]Rezultati su prikazani na Slikama 4 (HEK293 ćelije) i 5 (hTERT-MSC ćelije). I HEK293 i hTERT-MSC ćelije su delotvorni domaćini za genski konstrukt. Numerisanje rezultata za transfektirane ćelije tipa 1 do 3 je kao u Primeru 3 (1: 100 ng sintetički GLP-1(7-37) rastvoren u supernatantu lažno transfektiranih hTERT-MSC ćelija, 2: supernatant hTERT-MSC ćelija (klon 79TM217/13) koje luče dimerni GLP-1 iz konstrukta #217, 3: supernatant AtT20 ćelija (klon 81-A-217/3) koje luče dimerni GLP-1 iz konstrukta #217). Dok konstrukt 1 stvara GLP-1 divljeg tipa koji se inaktiviše sa DPP-IV na sličan način kao i sintetički GLP-1, inventivne terminalno elongirane forme GLP-1 (2 i 3 na Slici 4, 3 na Slici 5) su otpornije na degradisanje i zadržavaju najmanje 40% aktivnosti. Terminalno produženi GLP-1 peptidi su značajno stabilizovani u humanoj plazmi in vitro. Peptid sa dimernom GLP-1 sekvencom (3) je gotovo potpuno stabilan prema DPP-IV degradisanju in vitro.

Primer 5

Western Blot analiza GLP-1 peptida

[0106]Različiti GLP-1 peptidi naprave se sintezom na čvrstoj fazi (syn) ili rekombinantno koristećiE. coli(rec). GLP-1 peptidi (31 ng SEQ ID No:l i 10 ng svake od SEQ ID No:6, SEQ ID No:7, SEQ ID No:8) razdvoje se u 10%-20% gradijentnoj SDS PAGE (120V, 90 minuta) i prenesu na PVDF membranu (Immobilon-P membrana 0,45 um Milipore IPVH 00010) polusuvim blotiranjem (2.0 mA/cm<2>, 60 minuta). Nakon fiksiranja metanolom i blokiranja (3% (w:v) BSA, 0.1% (v:v) Tween-20 u TBS) membrana se imunoblotira sa 1 ug/ml anti-GLP-1 antitela (HYB 147-12, Antibodvshop) na 4°C preko noći. Nakon ispiranja i inkubacije sa 0.02 ug/ml detekcionog antitela (antimišji IgG, konjugiran sa peroksidazom iz hrena, Perkin Elmer PC 2855-1197) na sobnoj temperaturi tokom 4 časa, detektovanje hemiluminescencije otkriva položaj proteina. SI. 6 prikazuje VVestern Blot za naznačene peptide. Mogu da se daju sledeće vrednosti: SEQ ID No.: 1 (IDlsvn) odgovara GLP-l(7-37), 31 aminokiselina, 3,3 kD; SEQ ID No.:8 (ID8 syn, CM3) odgovara GLP-1 (7-37)-IP2,46 aminokiselina, 5,1 kD; SEQ ID No.: 7 (ID7rec, CM2) odgovara GLP-1 (7-37)-IP2-RR-GLP2, 83 aminokiselina, 9,4 kD; SEQ ID No.: 6 (ID6syn, CM1) odgovara GLP-l(7-37)-IP2-RR-GLP 1(7-37), 79 aminokiselina, 8,7 kD.

Primer 6

In vitrostabilnost GLP-l<CIVI>peptide u humanoj plazmi

[0107] Sintetički GLP-1 peptidi (SEQ ID No:lsyn, SEQ ID No:6syn, SEQ ID No:7rec, SEQ ID No:8syn) inkubiraju se u koncentracijama od 20 ng/ml sa humanom plazmom pri 37°C I 5% CO2tokom 3 časa. Dipeptidilpeptidazna aktivnost plazme inhibiše se inhibitorom DPP-IV (#DPP4. Biotrend). Aktivni GLP se izmeri koristeći GLP-1 (Active) ELISA (#EGLP-35K, Biotrend).

[0108] U kontrastu sa nativnim GLP-1(7-37) (SEQ ID No:l) inventivni C-terminalno elongirani GLP-1 peptidi SEQ ID No:6. SEQ ID No:7 i SEQ ID No:8 su značajno stabilizovani u humanoj plazmi in vitro (SI. 7). Kao kontrola (na desnoj strani) prikazani su rezultati dobiveni za eksperimente sa dodatkom DPP-IV. GLP-1 aktivnost je potpuno zadržana u tim kontrolnim eksperimentima.

Primer 7

Bioesejin vitro

Produkcija cikličkog AMP

[0109)RIN-5F ćelije (tumor ćelija Langerhansovih otoka pacova; ECACC No. 95090402) uzgoje se u pločama sa 24 bunarčića tokom 4 dana da postignu 70% konfluentnost. Ćelije se dvaput isperu sa DMEM (E15-009, PAA) pre dodavanja 0.5 ml DMEM (E15-009, PAA) u kojeg su dodani 1% HSA (Aventis), 0.2 mM IBMX (858455, Sigma) i testni peptidi. Nakon 20 minuta inkubacije pri 25°C, ćelije se dvaput isperu sa ledeno hladnim PBS. Ćelijski cAMP ekstraktuje se dodavanjem 0.1N HC1 koja sadržava 0.5% Triton X-100. Ciklički AMP se kvantifikuje koristeći cAMP (niski pH) enzimski imunoesej, EIA (Cat. DE0355, R&D). Za stimulisanje se koristi 3* 10"8 M SEQ ID No:l, SEQ ID No:6syn, SEQ ID No:6rec, SEQ ID No:7rec, SEQ ID No:8syn.

[0110]Rezultati su prikazani na SI. 8. 100% produkcije cAMP odgovara bazalnoj produkciji u odsustvu GLP-1. GLP-1 se veže na receptore spregnute sa G proteinima i stimuliše produkciju cAMP. Svi testirani molekuli povećavaju ćelijsku produkciju cAMP.

Primer 8

Bioaktivnostin vivo

[0111]Miševi stari 11 sedmica sa dijabetesom tipa II (C57BL/Ks-Lepr<db/db>, Harlan) tretiraju se sa 5 (ig peptida subkutanim injektiranjem dvaput dnevno u 9 pre podne i 5 posle podne (n=5 po grupi). Izmeri se glukoza u krvi pre (dan 0) i posle tretmana sa GLP<CM>peptidima (dan 2, 4, 7, 10) u 10 pre podne nakon perioda posta preko noći. Podaci se prikažu u odnosu na nivo glukoze u krvi izmeren na dan 0.

[0112]Svi testirani inventivni peptidi (SEQ ID No.:6 (sintetički ili rekombinantni) i SEQ ID No.:7 (sintetički ili rekombinantni) imaju antihiperglikemijsko dejstvo. Najbolji rezultati se dobiju se rekombinantnim SEQ ID No.:6 (CM1) i sintetičkim SEQ ID No.:8 (CM3). Na SI. 9 (y-os) prikazanje relativni učinak tretmana. Glukoza u krvi na dan = 0 podešena je na 1. Netretirane životinje imaju kontinuirano povećanje nivoa glukoze u krvi tokom vremena, dok životinje tretirane sa inventivnim peptidima pokazujugrosso modokontinuirano smanjenje nivoa glukoze u krvi tokom vremena.

Claims (27)

1. Fuzioni peptidnaznačen timeda obuhvata kao komponentu (I) N-terminalno (i) GLP-1 (7-37) sa SEQ ID NO: 1 ili funkcionalnu sekvencu koja pokazuje biološka dejstva GLP-1 kao inkretinskog hormona, njegovo antiapoptotičko dejstvo ili njegove neurotrofičke osobine i koja ima najmanje 80% identiteta sekvence sa GLP-1 (7-37), ili (ii) modifikovani GLP-1 peptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence formule II: Xaa7-XaaB-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaal6-Ser-Xaal8-Xaal9-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37, u čemu Xaa7 je L-histidin, D-histidin, dezamino-histidin, 2-amino-histidin, 3-hidroksi-histidin, homohistidin, N-acetil-histidin, a-fluorometil-histidin, a-metil-histidin, 3-piridilalanin, 2-piridilalanin ili 4-piridilalanin; Xaa8 je Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Lys, Aib, (1-aminociklopropil) karboksilna kiselina, (1-aminociklobutil) karboksilna kiselina, (1-aminociklopentil) karboksilna kiselina, (1-aminocikloheksil) karboksilna kiselina, (1-aminocikloheptil) karboksilna kiselina ili (1-aminociklooktil) karboksilna kiselina; Xaal6 je Val ili Leu; Xaal8 je Ser, Lys ili Arg; Xaal9 je Tyr ili Gln; Xaa20 je Leu ili Met; Xaa22 je Gly, Glu ili Aib; Xaa23 je Gln, Glu, Lys ili Arg; Xaa25 je Ala ili Val; Xaa26 je Lys, Glu ili Arg; Xaa27 je Glu ili Leu; Xaa30 je Ala, Glu ili Arg; Xaa33 je Val ili Lys; Xaa34 je Lys, Glu, Asn ili Arg; Xaa35 je Gly ili Aib; Xaa36 je Arg, Gly ili Lys ili amid ili nedostaje; Xaa37 je Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, amid ili nedostaje, i kao komponentu (II) C-terminalno peptidnu sekvencu od najmanje 9 aminokiselina i koja sadržava sekvencu prema SEQ ID NO: 22 (RRDFPEEVAI) ili sekvencu koja ima najmanje 80% identiteta sekvence sa SEQ ID NO: 22, i daje poboljšanu otpornost na inaktivisanje fuzionog peptida sa DPP-IV, pri čemu N-terminus fuzionog peptida je komponenta (I) kao takva ili signalna peptidna sekvenca, fuzionisana putem sekvence za cepanje proteazom na N-terminus komponente (I), ili signalni peptid, fuzionisan bez sekvence za cepanje proteazom između njega i N-terminusa komponente (I), ili vodeća sekvenca, fuzionisana putem sekvence za cepanje proteazom na N-terminus komponente (I), heterologni preproglukagonu.

2. Fuzioni peptid prema patentnom zahtevu 1,naznačen timeda komponenta (I) je modifikovani GLP-1 peptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu formule III: Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaal8-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37, u čemu Xaa7 je L-histidin, D-histidin, dezamino-histidin, 2-amino-histidin, 3-hidroksi-histidin, homohistidin, N-acetil-histidin, a-fluorometil-histidin, a-metil-histidin, 3-piridilalanin, 2-piridilalanin ili 4-piridilalanin; Xaa8 je Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Lys, Aib, (1-aminociklopropil) karboksilna kiselina, (1-aminociklobutil) karboksilna kiselina, (1-aminociklopentil) karboksilna kiselina, (1-aminocikloheksil) karboksilna kiselina, (1-aminocikloheptil) karboksilna kiselina ili (1-aminociklooktil) karboksilna kiselina; Xaal8 je Ser, Lys ili Arg; Xaa22 je Gly, Glu ili Aib; Xaa23 je Gln, Glu, Lys ili Arg; Xaa26 je Lys, Glu ili Arg; Xaa30 je Ala, Glu ili Arg; Xaa34 je Lys, Glu ili Arg; Xaa35 je Gly ili Aib; Xaa36 je Arg ili Lys, amid ili nedostaje; Xaa37 je Gly, Ala, Glu ili Lys, amid ili nedostaje.

3. Fuzioni peptid prema patentnom zahtevu 1,naznačen timeda komponenta I jest GLP-1 (7-35) ili GLP-1 (7-36).

4. Fuzioni peptid prema patentnim zahtevima 1 do 3,naznačen timeda komponenta (II) jest peptidna sekvenca koja sadržava sekvencu prema SEQ ID No.: 23 (RRDFPEEVAIVEEL) ili SEQ ID No. 24 (RRDFPEEVAIAEEL) ili sekvencu koja ima najmanje 80% identiteta sekvence sa SEQ ID No.: 23 ili 24.

5. Fuzioni peptid prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva 1 do 4,naznačen timeda komponenta (II) jest peptidna sekvenca koja sadržava sekvencu prema SEQ ID No.: 2 (RRDFPEEVAIVEELG) ili SEQ ID No. 3 (RRDFPEEVAIAEELG) ili sekvencu sa najmanje 80% identiteta sekvence sa SEQ ID No.: 2 ili 3.

6. Fuzioni peptid prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva 1 do5, naznačen timeda su komponenta (I) i komponenta (II) vezane direktno ili vezane putem sekvence linkera.

7. Fuzioni peptid prema patentnom zahtevu 6,naznačen timeda linker sekvenca ima duljinu od 1 do 10 aminokiselina.

8. Fuzioni peptid prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 7,naznačen timeda fuzioni peptid sadržava sekvencu prema SEQ ID No.: 8 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIVEELG) ili sekvencu koja ima najmanje 80% identiteta sekvence sa SEQ ID No.: 8 ili 12.

9. Fuzioni peptid prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva 1 do 8,naznačen timeda fuzioni peptid sadržava drugu komponentu (III) vezanu na C-terminus komponente (II).

10. Fuzioni peptid prema patentnom zahtevu 9,naznačen timeda komponenta (III) obuhvata najmanje četiri aminokiselinska ostatka, ili poželjno obuhvata najmanje 10 aminokiselinskih ostataka, ili još poželjnije obuhvata najmanje 20 aminokiselinskih ostataka.

11. Fuzioni peptid prema patentnom zahtevu 9 ili 10,naznačen timeda komponenta (III) obuhvata najmanje 4, poželjno najmanje 10, još poželjnije najmanje 20 aminokiselinskih ostatakaN-terminalne sekvence od GLP-2 kao u proglukagonu ili od GLP-l(7-37).

12. Fuzioni peptid prema bilo kojem od patentnih zahteva 9 do 11,naznačen timeda komponenta (III) sadržava sekvencu SEQ ID No.: 4 ili 5 ili sekvencu koja ima najmanje 80% identiteta sekvence sa SEQ ID No.: 4 ili 5.

13. Fuzioni peptid prema bilo kojem od patentnih zahteva 9 do 12,naznačen timeda fuzioni peptid sadržava peptidnu sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 10 i SEQ ID No. 11 ili sekvencu koja ima najmanje 80% identiteta sekvence sa SEQ ID No.: 6, 7, 10, ili 11.

14. Fuzioni peptid prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva 1 do 13,naznačen timedaje najmanje jedna od aminokiselina derivatizovana kovalentnim modifikovanjem bočnog lanca aminokiseline koje se nalazi u prirodi, modifikovanjem NH2ili karboksi terminalnih grupa.

15. Fuzioni peptid prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva 1 do 14,naznačen timeda fuzioni peptid obuhvata proteinski nosač, određenije transferin ili albumin, kao komponentu (IV).

16.Fuzioni peptid prema patentnom zahtevu 14,naznačen timedaje najmanje jedna od aminokiselina derivatizovana lipidnom ili ugljenohidratnom grupom.

17. Fuzioni peptid prema patentnom zahtevu 14 ili 16,naznačen timedaje N-terminalni His ostatak GLP-1 (GLP-1 (7)) hemijski modifikovan na svojem NH2terminusu i/ili na svojem histidinskom bočnom lancu, sa hidrofobnim delom naročito.

18. Metoda produkcije fuzionog peptida prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva 1 do 17,naznačena timeda se vrši sintetizovanjem peptida na čvrstoj fazi.

19. Fuzioni peptid prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva 1 do 17naznačen timeda služi kao lek ua korišćenje u terapiji ljudi ili životinja.

20. Nukleinska kiselina koja kodira fuzioni peptidnaznačena timedaje u skladu sa bilo kojim od prethodnih patentnih zahteva 1 do 13 ili 15.

21. Vektor koji obuhvata nukleinsku kiselinunaznačen timedaje u skladu sa patentnim zahtevom 20.

22. Ćelija domaćin koja obuhvata egzogeno unešenu DNK prema patentnom zahtevu 20,naznačena timeda obuhvata naročito vektor prema patentnom zahtevu 21, koji je sposoban eksprimisati pomenuti fuzioni peptid, pri čemu ćelija domaćin nije humana embrionska matična ćelija.

23. Metoda produkcije fuzionog peptida prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva 1 do 13 ili 15naznačena timeda u njoj mikroorganizam transformisan kako bi uključivao nukleinsku kiselinu koja kodira fuzioni peptid fermentuje i dobiva se protein.

24. Metoda produkcije proteina prema patentnom zahtevu 23naznačena timeda njome animalne ćelije rastu u uslovima u kojima se protein eksportuje iz ćelija.

25. Korišćenje fuzionog peptida prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva 1 do 17, nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 20, vektora prema patentnom zahtevu 21 ili ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 22naznačeno timeda služi za proizvodnju leka za lečenje diabetes mellitus-a tipa I ili tipa II, otpornosti na inzulin, poremećaja težine i bolesti ili stanja povezanih sa time.

26. Korišćenje fuzionog peptida prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva 1 do 17, nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 20, vektora prema patentnom zahtevu 21 ili ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 22naznačeno timeda služi za proizvodnju leka za lečenje neurodegenerativnih poremećaja i bolesti ili stanja povezanih sa time.

27. Korišćenje fuzionog peptida prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva 1 do 17, nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 20, vektora prema patentnom zahtevu 21 ili ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 22naznačeno timeda služi za proizvodnju leka za lečenje poremećaja i bolesti ili stanja povezanih sa apoptozom.